JP3814728B2 - 染色体ｄｎａにおけるテロメア領域の伸長方法、テロメア伸長用発現ベクター、及び前記発現ベクターを用いた生物の寿命延長方法 - Google Patents
染色体ｄｎａにおけるテロメア領域の伸長方法、テロメア伸長用発現ベクター、及び前記発現ベクターを用いた生物の寿命延長方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法、及びこの方法を用いた寿命延長法に関し、詳しくは、蛋白質、とりわけＤＮＡポリメラーゼという酵素が、鋳型の遺伝情報を読み取る「複製」ではなく、「創造的に」、つまり新たな遺伝情報としてのＤＮＡを、細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端から伸長するように合成することができ、すなわち染色体ＤＮＡを伸長させることができ、しかも、当該伸長部分が、短い（４〜１５塩基対程度の）繰り返し配列を持つＤＮＡであるという発見に基づきなされた、染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法、及びこの方法を用いた寿命延長法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
周知の通り、生物はそれぞれの種においてほぼ決まった長さの寿命を持っている。例えばヒトは約８０年、イヌは約１０年、マウスは約２年、……などある。この寿命の長さは各生物種において多少のばらつきはあるものの、遺伝的にほぼ決定されている。換言すれば、例えば、乳を大量に出す牛がいたとしても、通常より１０倍長生きする牛は存在しない。また、イヌが１００年間生き続けるということも期待できない。そして、これらを可能にする技術、すなわち生物の寿命を延長させるという技術が従来において全くないというのも実情である。
【０００３】
ところで、生物の持つ染色体は二本鎖直鎖状ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）と、ヒストンなどの蛋白質とからなる。前記染色体ＤＮＡには、染色体として機能するための３つの領域を必須要素として持つ。その３つの領域とは、▲１▼セントロメア領域、▲２▼テロメア領域、及び▲３▼複製開始領域（ＡＲＳ）であり、いずれの領域が欠けても当該染色体ＤＮＡは不安定となり細胞分裂の過程において消失していく。そのうち、第２番目に挙げた「テロメア領域」は、当該染色体ＤＮＡにおける末端部分を構成しており、生体の老化や寿命に関与する。この点について以下に詳述する。すなわち、テロメア領域においては、種によって異なるが、４〜１５塩基対の特定の塩基配列が同じ向きに繰り返し並んでいる。例えば、ヒトの場合（５′）ＴＴＡＧＧＧ（３′）の６塩基対が同じ向きに約２，０００個繰り返す。つまり、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ、（ｎ＝２，０００）の形を持ち、この部分をテロメアと呼ぶ。そしてこの構造テロメアは染色体の両端に存在する。多くの細胞においては、テロメアのＤＮＡは細胞分裂を繰り返す度に次第に短くなり、この長さがある程度以下となればもはや分裂しなくなり、ここで寿命が決まると考えられている。
【０００４】
そこで、何らかの方法を用いてこのテロメアＤＮＡを発生の初期段階、例えば受精卵において、人為的に予め長くしておけば、その生物は本来よりも長い寿命を持つこととなる。
【０００５】
［発明の目的］
本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生物の発生の初期段階において、主として受精卵、場合によっては生殖細胞や培養株細胞に対して遺伝子操作の技術を用いることによりテロメアＤＮＡを修飾する方法を提供するところにあり、延いてはこれにより、各生物種が本来持っている寿命の長さを延長せしめ、よってその生物を産業上あるいは他の目的に対し、より長く利用する方法を提供するところにある。
【０００６】
要するに、本発明の目的は、寿命を決定すると考えられている染色体ＤＮＡの末端に存在するテロメアＤＮＡを人為的に伸長させる方法を提供するところにある。
【０００７】
［発明に至るまでの経緯］
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、蛋白質によるＤＮＡ（遺伝子）合成法に着目し、鋭意検討を重ねた。そして、その結果、従来の常識を根底から覆すような画期的な発明を見い出した。以下、この点について説明する。
【０００８】
すなわち、蛋白質、とりわけＤＮＡポリメラーゼは、以前よりＤＮＡを複製的に合成することが知られている。「複製的」とは、つまり既存の一本鎖ＤＮＡを鋳型（テンプレート）として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡを合成し、最終的に二本鎖とすることである。したがって、この反応においては、合成される塩基配列は、前記した鋳型により機械的に（一義的に）決定されることから、全く新規な塩基配列をもつＤＮＡを「創造」することは不可能である。しかしながら、そのようなＤＮＡポリメラーゼであっても、鋳型を全く必要とせずに非常に長い（１００〜５０，０００塩基対程度）二本鎖直線状ＤＮＡを作れることを発見した。
【０００９】
しかも驚くべきことに、鋳型非依存系で合成されたＤＮＡは、４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列が幾度にも繰り返されてなる「繰り返し配列」を含有し、さらには、上記した鋳型非依存系のＤＮＡ合成が細胞内において行なわれた場合には、前記「繰り返し配列」が細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端（即ちテロメアＤＮＡの末端）に付加されることが確認された。つまり、染色体ＤＮＡが、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型非依存合成で伸長されることが確認された。さらに本発明者らは、染色体ＤＮＡを伸長させれば当該生物の寿命が延長するのではないかと考え、またその寿命の延長が、染色体ＤＮＡの伸長の長さに比例して起こるのではないかと考え、これらを確認すべく実験を行なった結果、実に見事に、これらを裏付けるデータが得られ、そして本発明に至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、細胞内（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）に蛋白質を導入することからなり、これによって染色体ＤＮＡの端部を合成起点としてデオキシリボヌクレオチドを重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法である。
【００１１】
請求項２記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子とプロモーター領域の遺伝子と転写終了領域の遺伝子とが各々挿入されてなる発現ベクターを細胞（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）に導入することからなり、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これにより発現した前記蛋白質の存在下にて、デオキシリボヌクレオチドを染色体ＤＮＡの端部を合成起点として重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法である。
【００１２】
請求項３記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、請求項１、又は２記載の伸長方法において、前記蛋白質がＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする方法である。
【００１３】
請求項４記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、請求項３記載の伸長方法において、前記ＤＮＡポリメラーゼがセルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする方法である。
【００１４】
請求項５記載のテロメア伸長用発現ベクターは、染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させるために働く蛋白質が、プロモーター領域の活性化により細胞内にて発現するように設計された発現ベクターであり、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子、プロモーター領域の遺伝子及び転写終了領域の遺伝子が各々挿入されてなる発現ベクターである。
【００１５】
請求項６記載の発現ベクターは、請求項５記載のテロメア伸長用発現ベクターにおいて、前記蛋白質が、セルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種である発現ベクター。
【００１６】
請求項７記載の生物の寿命延長方法は、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子を生物Ａの細胞（生物より取り出した細胞、直接精製する場合は非ヒト）より精製するとともに、前記遺伝子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のちこの融合遺伝子を他の生物Ｂ（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）の細胞に導入し、この細胞を偽妊娠状態の仮親（非ヒト）の卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、移植後に得られたＦ１トランスジェニック生物に対し、あるいは少なくとも片方をＦ１トランスジェニック生物とする掛け合わせによって得たＦ２トランスジェニック生物に対し、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これによって当該細胞内にて前記蛋白質を発現せしめ、これとともに前記蛋白質の存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重合させて細胞内における既存染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させることからなる生物（非ヒト）の寿命延長方法である。
【００１７】
請求項８記載の寿命延長方法は、請求項７記載の生物の寿命延長方法において、前記蛋白質が、セルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種である寿命延長方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明で使用できる蛋白質としては、上掲したように、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、約２０℃以上、好ましくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃以上の温度でも失活しないものが好ましい。その一例としては、セルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）等のセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
上記ＤＮＡポリメラーゼは１種を単独で使用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用した混合系として用いることもできる。なお２種以上を併用する場合、同じ属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼ同士の併用でも良いし、異なる属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼ同士の併用でも良い。
【００２０】
デオキシリボヌクレオチドとしてはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが用いられ、それらの４種類または３種類を反応系に存在させれば反応は進行する。デオキシリボヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼとの反応における反応温度と時間は、ＤＮＡポリメラーゼが失活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上でポリメラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させることにより、反応を速やかに進行させることができる。たとえば、７４℃で数時間反応させてもよく、また通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応は初期に若干の遅延時間を経たのち開始され、やがて最大速度に達する。本発明の方法により合成されるＤＮＡは鋳型に依存せず、反応系に存在するＤＮＡポリメラーゼの情報に依存して合成されると考えられる。
【００２１】
なお、ＤＮＡポリメラーゼを用いたデオキシリボヌクレオチドの重合において、反応温度が２０℃未満の場合には反応速度が低下し、また９０℃を超える場合には酵素の安定性が低下するので好ましくない。また、ｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件から外れる条件、すなわち酸性下条件及び強アルカリ性条件下でも反応速度が低下するのでやはり好ましくない。上記の反応温度、及び反応系の液性（ｐＨ）に関しては、蛋白質の反応特性に依存する（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１９６５−１９７５（１９９３）参照）。
【００２２】
この新規ＤＮＡの合成は、使用するＤＮＡポリメラーゼによっては、たとえば８塩基対、（５′）ＴＡＧＡＴＡＴＣ（３′）の同方向繰り返し配列を何千と作ることができ、この構造はテロメアのＤＮＡと類似し、よってテロメアの機能を果たし生物の寿命を延長する。この新規ＤＮＡ合成は全体細胞においてその効果が出ることを期待されるため、本例では受精卵における新規ＤＮＡ合成を主として検討したが本発明は決して受精卵に限られるものではない。受精卵以外に使用可能な細胞としては、培養細胞、例えばマウスのＥＳ細胞などが挙げられる。
【００２３】
マウスの受精卵を例にとって述べると、まず、分割前の受精卵の前核の中へマイクロインジェクション法［分子遺伝学実験法、小関治男ら著、共立出版（株）、1983年発行］によりセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｖｅｎｔ（ベント） ＤＮＡポリメラーゼ、ニューイングランド・バイオレイブス、以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ」と略称）またはその遺伝子を発現ベクターに組み込んだ形として挿入する。これにより、このＤＮＡポリメラーゼは、受精卵の中において、その染色体ＤＮＡの末端に、新規ＤＮＡ合成を、主として（ＴＡＧＡＴＡＴＣ）ｎなる塩基配列の形にて行う。
【００２４】
その結果、このマウスにおいては、全ての体細胞の染色体ＤＮＡ末端にこの新規合成ＤＮＡが付加されたこととなり、かつこの部分がテロメアＤＮＡとして機能することとなり、よってこのマウスの寿命が延びる。
【００２５】
ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を発現ベクターに組み込む方法（上掲）に関し、詳しく述べる。まず、ＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを生物より遺伝子クローニングの常法技術［分子遺伝学実験法，小関治男ら著，共立出版（株），１９８３年発行］により得る。このとき、その生物は、導入しようとする生物とは異なる生物のものが好ましい。なぜならば、同じ生物のものであれば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現等に関する調節がＤＮＡを導入された細胞、つまり宿主により完全に制御される可能性がかなりあるからである。例えば、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮＡを例にとって説明する。
【００２６】
このＤＮＡの構造をその転写の方向より上流から、プロモーター領域、構造遺伝子、転写終了領域と呼ぶことにする。そして、マウスの細胞にＤＮＡを導入することを例として考える。まず、プロモーター領域は、転写開始点（一般に、キャップサイトと呼ぶ）ぎりぎりの上流部位までを取り除き、常時発現プロモーターまたは誘導可プロモーター、例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と置換し、その内部に存在するステロイドホルモン（例えば、デキサメタゾン）依存性プロモーターにより、導入された遺伝子、つまりＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの発現を調節することができる。次に、この遺伝子の下流に関しては、その翻訳停止コドンの下流直後を宿主または宿主関連生物から得られた転写停止信号を含むＤＮＡ断片を挿入するとよい。例えば、サルのウイルスであるシミアンウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０，ＳＶ４０）の早期遺伝子（ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）の翻訳停止コドン下流直後から２００〜５００塩基対のＤＮＡを用いれば十分である。なお、ある種の細胞においては、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子本体にあるイントロン１は取り除いておいた方がよく発現することがある。
【００２７】
以上の構造を持つ一つながりのＤＮＡを燐酸カルシウム法やエレクトロポレーション法等の方法にて細胞に導入する。このとき、この遺伝子が導入された細胞のみを拾い出すために、同時にネオマイシン耐性遺伝子を発現ベクターに挿入したものを混ぜておく。その後、Ｇ４１８を入れた細胞培養培地にてしばらく培養すれば、当該遺伝子が導入された細胞のみを選択的に得ることができる。このような細胞（例えば、マウスのＥＳ細胞）を偽妊娠状態の仮親の卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、所定の妊娠期間を経て産み出されたマウス個体においては、当該遺伝子を持つ細胞はその個体の体細胞と生殖細胞においてキメラの形で分布しているわけであるから、適切な交配により、個体の全細胞において当該遺伝子をヘテロ接合体の形で持つ動物が得られるから、ヘテロ接合体同士をかけ合わせてホモ接合体の形を持つ動物が得られる。無論、前述のキメラのままで次の段階へ行ってもよい。
【００２８】
次に、導入された遺伝子の誘導を行う。例えば、ＭＭＴＶのＬＴＲを持つ場合、当該遺伝子を持つ生物個体にステロイドホルモン（例えばデキサメタゾン）を経口、筋肉注射等の方法にて投与する。これにより、この遺伝子はＬＴＲ内のＤＮＡ要素によりその発現のスイッチが入り、ＬＴＲよりｍＲＮＡの転写が開始され、最終的に、導入されたＤＮＡポリメラーゼ蛋白質が細胞内に蓄積する。この蛋白質が宿主のＤＮＡポリメラーゼとある程度異なっていれば、それは宿主の調節をさほど受けることなくＤＮＡ合成を開始する。この時、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼは、細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端に対し、該末端を合成起点として４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列を幾度にも繰り返しながら付加していく。つまり、幾度にも繰り返される４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列により、テロメア領域が伸長していく。なお、本発明におけるテロメア領域の伸長は、大きく分けて次のような２つの形態をとる。すなわち、細胞内の既存テロメア領域の塩基配列を仮に、……（ＡＧＧＧＴ）ｎ（以下、「ＡＧＧＧＴ」なる配列を「Ｘ」と略称する）とする場合、本発明の方法により、
▲１▼当該テロメアＤＮＡと同じ繰返し配列（Ｘ）で以てテロメアが伸長される場合
▲２▼テロメアＤＮＡとは異なる繰返し配列（Ｙ）で以てテロメアが伸長される場合とがある。いずれの場合も寿命の延長が起こると考えられる。
【００２９】
ある生物の寿命を延長させることにより、その生物をより長い期間にわたって産業的、工業的に、あるいはその他の目的に利用することができる。具体的にいえば、次に記載する期間の延長等が挙げられる。すなわち、牛、馬、ヒトなどの労働可能期間の延長、牛の搾乳可能期間の延長、鶏の産卵可能期間の延長、犬、猫小鳥等の愛玩動物への愛玩期間の延長、羊の羊毛刈取り可能期間の延長等があげられ、さらには、出産可能期間が延びることから、絶滅の危機に瀕する動物の数を増やす目的にも利用することができる。
【００３０】
本発明で用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法としては今日において公知であり、当業者であれば容易に行うことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これらによっても得ることができる）。特開平２−６０５８５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平６−７１６０号公報
【００３１】
【実施例】
以下、本発明の一実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
真核細胞プロモーターとしてマウス乳腺腫ウイルスＬＴＲを持つ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮ２２４（図１参照）に対し、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を挿入した。このベクターには、後で挿入した遺伝子を取り除けるようにするためｌｏｘＰ配列が挿入されている。すなわち、全体の構造は、上流よりｌｏｘＰ配列、プロモーター配列、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ターミネーター配列、ｌｏｘＰ配列とする。また、プラスミド本体には選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ遺伝子）が挿入されている。完成したプラスミドをｐＮ５５４とした（図２参照）。
【００３３】
マウス培養細胞（ＥＳ細胞）の中に、制限酵素（ＮｄｅＩ）によって直線化したプラスミドｐＮ５５４を０．２μｇ／ｍｌの濃度にて導入した。この導入は、エレクトロポレーション（ジーンパルサー、バイオ・ラッド社製、５００μＦ、２００Ｖ）を用いて行なった。その後、Ｇ４１８を１５０μｇ／ｍｌ含む培地にて約７日間培養を継続し、Ｇ４１８耐性のコロニーを入手した。この細胞より、集合キメラ法［A. Nagg, Production of completely ES cell-deriued fetuses in gene targeting. A. L. Joyner 著、pp147-179, IRL Press, 1993年発行］を用いた方法によりトランスジェニックマウスを得た。得られたトランスジェニックマウス同士の交配によりマウスの産仔を得、その産仔マウス同士の交配により導入遺伝子をホモ接合体の形として持つマウスを非キメラの個体として得た。
【００３４】
途中の遺伝子の態様はサザン・ブロット法［分子遺伝学実験法、小関治男ら著、共立出版（株）、1983年発行］を用いて尾から得られたＤＮＡにて確認した。導入遺伝子をホモ接合体として持つ成体マウスにおいて、デキサメサゾンを経口投与することにより、この導入遺伝子のプロモーターを活性化し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させた。この過程によりマウスの生殖前駆細胞において、染色体末端にテロメア様ＤＮＡ配列が付加されるが、このことを確認すべく次のような実験を行なった。すなわち、サザン・ブロット法により、染色体末端部のＤＮＡ断片の延長を見た。つまり、全４０個ある染色体のＤＮＡのその全てに、しかもその両末端に、（ＴＡＧＡＴＡＴＣ）ｎからなる８塩基対の繰返し配列が約５０００塩基対の長さに亙って伸びていることをサザン・ブロット法により確認できた。
【００３５】
次に、このマウスより得られた子供同士を交配することにより、染色体末端にテロメア様ＤＮＡ配列を持つ状態が全細胞に存在するような個体（マウス）を得た。このマウス（Ｍ１）においてはテロメアが伸長されているため（一般的に、マウスの場合、通常のテロメアの長さは約４，０００塩基対であり、本実施例で伸長させたテロメア様ＤＮＡ配列の長さは、前述したように５，０００塩基対であるから、結局、このマウスの塩基配列の全長は、約９，０００塩基対となっている。）、本来約２年の寿命であるべきマウスにおいて約１年の寿命延長が生じた。すなわち約３年間生きた。
【００３６】
このマウスの老衰死後において、尾よりＤＮＡを得て、サザン・ブロット法によりテロメア領域の長さを調べた結果、当初約９，０００塩基対の長さに亙って伸びていた繰り返し配列が約１００塩基対に減少していることが分かった。
【００３７】
実施例２
実施例１と同様にして、繰返し塩基配列の種類、及び長さが、上記実施例１の場合と異なるテロメアを備えたマウス（Ｍ２、Ｍ３）を得た。伸長部分の長さ、及び伸長に係わった繰返し塩基配列を、サザン・ブロット法により各々調べた。これにより、次のような結果が得られた。
【００３８】
（Ｍ２）繰返し単位；（ＴＴＧＧＧＧ）、伸長部分の長さ；約１，０００塩基対
（Ｍ３）繰返し単位；（ＴＴＧＧＧＧ）、伸長部分の長さ；約２，５００塩基対繰返し単位（ＴＴＧＧＧＧ）を持つマウス（Ｍ２）と（Ｍ３）は、次のようにして得たマウスである。すなわち、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子をプラスミドに挿入する代わりに、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）のＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子をプラスミドに挿入し、それ以外は実施例１と同様にして得たマウスである。
【００３９】
なお、同じＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を使用したにもかかわらず、Ｍ２とＭ３との間でテロメアの伸長部分の長さが互いに相違しているのは、当該構造遺伝子を挿入したプラスミドの染色体上における位置の違いによるものであり、これによるＤＮＡポリメラーゼの発現量の違いによるものである。
【００４０】
実施例１と実施例２で得られた各マウス（Ｍ１〜Ｍ３）の、「新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さ」と「寿命の延長」との関係を探るべく、グラフを作成した（図３参照）。この図より、寿命の延長の程度（長さ）は、新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さに比例していることが分かる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、生物の発生の初期段階において、テロメアＤＮＡを修飾することができた（すなわち、染色体ＤＮＡの末端に存在するテロメアＤＮＡを人為的に伸長させることができた）。これにより、各生物種が本来持っている寿命の長さが延長され、その生物を産業上あるいは他の目的に対し、より長く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】構造遺伝子を挿入したベクターを示す図である。
【図２】プラスミドの構造を示す図である。
【図３】「新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さ」と「寿命の延長」との関係を表した図表である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法、及びこの方法を用いた寿命延長法に関し、詳しくは、蛋白質、とりわけＤＮＡポリメラーゼという酵素が、鋳型の遺伝情報を読み取る「複製」ではなく、「創造的に」、つまり新たな遺伝情報としてのＤＮＡを、細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端から伸長するように合成することができ、すなわち染色体ＤＮＡを伸長させることができ、しかも、当該伸長部分が、短い（４〜１５塩基対程度の）繰り返し配列を持つＤＮＡであるという発見に基づきなされた、染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法、及びこの方法を用いた寿命延長法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
周知の通り、生物はそれぞれの種においてほぼ決まった長さの寿命を持っている。例えばヒトは約８０年、イヌは約１０年、マウスは約２年、……などある。この寿命の長さは各生物種において多少のばらつきはあるものの、遺伝的にほぼ決定されている。換言すれば、例えば、乳を大量に出す牛がいたとしても、通常より１０倍長生きする牛は存在しない。また、イヌが１００年間生き続けるということも期待できない。そして、これらを可能にする技術、すなわち生物の寿命を延長させるという技術が従来において全くないというのも実情である。
【０００３】
ところで、生物の持つ染色体は二本鎖直鎖状ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）と、ヒストンなどの蛋白質とからなる。前記染色体ＤＮＡには、染色体として機能するための３つの領域を必須要素として持つ。その３つの領域とは、▲１▼セントロメア領域、▲２▼テロメア領域、及び▲３▼複製開始領域（ＡＲＳ）であり、いずれの領域が欠けても当該染色体ＤＮＡは不安定となり細胞分裂の過程において消失していく。そのうち、第２番目に挙げた「テロメア領域」は、当該染色体ＤＮＡにおける末端部分を構成しており、生体の老化や寿命に関与する。この点について以下に詳述する。すなわち、テロメア領域においては、種によって異なるが、４〜１５塩基対の特定の塩基配列が同じ向きに繰り返し並んでいる。例えば、ヒトの場合（５′）ＴＴＡＧＧＧ（３′）の６塩基対が同じ向きに約２，０００個繰り返す。つまり、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ、（ｎ＝２，０００）の形を持ち、この部分をテロメアと呼ぶ。そしてこの構造テロメアは染色体の両端に存在する。多くの細胞においては、テロメアのＤＮＡは細胞分裂を繰り返す度に次第に短くなり、この長さがある程度以下となればもはや分裂しなくなり、ここで寿命が決まると考えられている。
【０００４】
そこで、何らかの方法を用いてこのテロメアＤＮＡを発生の初期段階、例えば受精卵において、人為的に予め長くしておけば、その生物は本来よりも長い寿命を持つこととなる。
【０００５】
［発明の目的］
本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生物の発生の初期段階において、主として受精卵、場合によっては生殖細胞や培養株細胞に対して遺伝子操作の技術を用いることによりテロメアＤＮＡを修飾する方法を提供するところにあり、延いてはこれにより、各生物種が本来持っている寿命の長さを延長せしめ、よってその生物を産業上あるいは他の目的に対し、より長く利用する方法を提供するところにある。
【０００６】
要するに、本発明の目的は、寿命を決定すると考えられている染色体ＤＮＡの末端に存在するテロメアＤＮＡを人為的に伸長させる方法を提供するところにある。
【０００７】
［発明に至るまでの経緯］
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、蛋白質によるＤＮＡ（遺伝子）合成法に着目し、鋭意検討を重ねた。そして、その結果、従来の常識を根底から覆すような画期的な発明を見い出した。以下、この点について説明する。
【０００８】
すなわち、蛋白質、とりわけＤＮＡポリメラーゼは、以前よりＤＮＡを複製的に合成することが知られている。「複製的」とは、つまり既存の一本鎖ＤＮＡを鋳型（テンプレート）として、それに相補的な塩基配列を持つＤＮＡを合成し、最終的に二本鎖とすることである。したがって、この反応においては、合成される塩基配列は、前記した鋳型により機械的に（一義的に）決定されることから、全く新規な塩基配列をもつＤＮＡを「創造」することは不可能である。しかしながら、そのようなＤＮＡポリメラーゼであっても、鋳型を全く必要とせずに非常に長い（１００〜５０，０００塩基対程度）二本鎖直線状ＤＮＡを作れることを発見した。
【０００９】
しかも驚くべきことに、鋳型非依存系で合成されたＤＮＡは、４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列が幾度にも繰り返されてなる「繰り返し配列」を含有し、さらには、上記した鋳型非依存系のＤＮＡ合成が細胞内において行なわれた場合には、前記「繰り返し配列」が細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端（即ちテロメアＤＮＡの末端）に付加されることが確認された。つまり、染色体ＤＮＡが、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型非依存合成で伸長されることが確認された。さらに本発明者らは、染色体ＤＮＡを伸長させれば当該生物の寿命が延長するのではないかと考え、またその寿命の延長が、染色体ＤＮＡの伸長の長さに比例して起こるのではないかと考え、これらを確認すべく実験を行なった結果、実に見事に、これらを裏付けるデータが得られ、そして本発明に至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、細胞内（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）に蛋白質を導入することからなり、これによって染色体ＤＮＡの端部を合成起点としてデオキシリボヌクレオチドを重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法である。
【００１１】
請求項２記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子とプロモーター領域の遺伝子と転写終了領域の遺伝子とが各々挿入されてなる発現ベクターを細胞（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）に導入することからなり、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これにより発現した前記蛋白質の存在下にて、デオキシリボヌクレオチドを染色体ＤＮＡの端部を合成起点として重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法である。
【００１２】
請求項３記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、請求項１、又は２記載の伸長方法において、前記蛋白質がＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする方法である。
【００１３】
請求項４記載の染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法は、請求項３記載の伸長方法において、前記ＤＮＡポリメラーゼがセルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする方法である。
【００１４】
請求項５記載のテロメア伸長用発現ベクターは、染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させるために働く蛋白質が、プロモーター領域の活性化により細胞内にて発現するように設計された発現ベクターであり、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子、プロモーター領域の遺伝子及び転写終了領域の遺伝子が各々挿入されてなる発現ベクターである。
【００１５】
請求項６記載の発現ベクターは、請求項５記載のテロメア伸長用発現ベクターにおいて、前記蛋白質が、セルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種である発現ベクター。
【００１６】
請求項７記載の生物の寿命延長方法は、蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子を生物Ａの細胞（生物より取り出した細胞、直接精製する場合は非ヒト）より精製するとともに、前記遺伝子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のちこの融合遺伝子を他の生物Ｂ（生物より取り出した細胞、直接導入する場合は非ヒト）の細胞に導入し、この細胞を偽妊娠状態の仮親（非ヒト）の卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、移植後に得られたＦ１トランスジェニック生物に対し、あるいは少なくとも片方をＦ１トランスジェニック生物とする掛け合わせによって得たＦ２トランスジェニック生物に対し、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これによって当該細胞内にて前記蛋白質を発現せしめ、これとともに前記蛋白質の存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重合させて細胞内における既存染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させることからなる生物（非ヒト）の寿命延長方法である。
【００１７】
請求項８記載の寿命延長方法は、請求項７記載の生物の寿命延長方法において、前記蛋白質が、セルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種である寿命延長方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明で使用できる蛋白質としては、上掲したように、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、約２０℃以上、好ましくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃以上の温度でも失活しないものが好ましい。その一例としては、セルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）等のセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
上記ＤＮＡポリメラーゼは１種を単独で使用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用した混合系として用いることもできる。なお２種以上を併用する場合、同じ属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼ同士の併用でも良いし、異なる属に属する細菌のＤＮＡポリメラーゼ同士の併用でも良い。
【００２０】
デオキシリボヌクレオチドとしてはｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが用いられ、それらの４種類または３種類を反応系に存在させれば反応は進行する。デオキシリボヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼとの反応における反応温度と時間は、ＤＮＡポリメラーゼが失活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上でポリメラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させることにより、反応を速やかに進行させることができる。たとえば、７４℃で数時間反応させてもよく、また通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応は初期に若干の遅延時間を経たのち開始され、やがて最大速度に達する。本発明の方法により合成されるＤＮＡは鋳型に依存せず、反応系に存在するＤＮＡポリメラーゼの情報に依存して合成されると考えられる。
【００２１】
なお、ＤＮＡポリメラーゼを用いたデオキシリボヌクレオチドの重合において、反応温度が２０℃未満の場合には反応速度が低下し、また９０℃を超える場合には酵素の安定性が低下するので好ましくない。また、ｐＨ約７または１０以下の弱アルカリ性条件から外れる条件、すなわち酸性下条件及び強アルカリ性条件下でも反応速度が低下するのでやはり好ましくない。上記の反応温度、及び反応系の液性（ｐＨ）に関しては、蛋白質の反応特性に依存する（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１９６５−１９７５（１９９３）参照）。
【００２２】
この新規ＤＮＡの合成は、使用するＤＮＡポリメラーゼによっては、たとえば８塩基対、（５′）ＴＡＧＡＴＡＴＣ（３′）の同方向繰り返し配列を何千と作ることができ、この構造はテロメアのＤＮＡと類似し、よってテロメアの機能を果たし生物の寿命を延長する。この新規ＤＮＡ合成は全体細胞においてその効果が出ることを期待されるため、本例では受精卵における新規ＤＮＡ合成を主として検討したが本発明は決して受精卵に限られるものではない。受精卵以外に使用可能な細胞としては、培養細胞、例えばマウスのＥＳ細胞などが挙げられる。
【００２３】
マウスの受精卵を例にとって述べると、まず、分割前の受精卵の前核の中へマイクロインジェクション法［分子遺伝学実験法、小関治男ら著、共立出版（株）、1983年発行］によりセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｖｅｎｔ（ベント） ＤＮＡポリメラーゼ、ニューイングランド・バイオレイブス、以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ」と略称）またはその遺伝子を発現ベクターに組み込んだ形として挿入する。これにより、このＤＮＡポリメラーゼは、受精卵の中において、その染色体ＤＮＡの末端に、新規ＤＮＡ合成を、主として（ＴＡＧＡＴＡＴＣ）ｎなる塩基配列の形にて行う。
【００２４】
その結果、このマウスにおいては、全ての体細胞の染色体ＤＮＡ末端にこの新規合成ＤＮＡが付加されたこととなり、かつこの部分がテロメアＤＮＡとして機能することとなり、よってこのマウスの寿命が延びる。
【００２５】
ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を発現ベクターに組み込む方法（上掲）に関し、詳しく述べる。まず、ＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを生物より遺伝子クローニングの常法技術［分子遺伝学実験法，小関治男ら著，共立出版（株），１９８３年発行］により得る。このとき、その生物は、導入しようとする生物とは異なる生物のものが好ましい。なぜならば、同じ生物のものであれば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現等に関する調節がＤＮＡを導入された細胞、つまり宿主により完全に制御される可能性がかなりあるからである。例えば、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮＡを例にとって説明する。
【００２６】
このＤＮＡの構造をその転写の方向より上流から、プロモーター領域、構造遺伝子、転写終了領域と呼ぶことにする。そして、マウスの細胞にＤＮＡを導入することを例として考える。まず、プロモーター領域は、転写開始点（一般に、キャップサイトと呼ぶ）ぎりぎりの上流部位までを取り除き、常時発現プロモーターまたは誘導可プロモーター、例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と置換し、その内部に存在するステロイドホルモン（例えば、デキサメタゾン）依存性プロモーターにより、導入された遺伝子、つまりＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの発現を調節することができる。次に、この遺伝子の下流に関しては、その翻訳停止コドンの下流直後を宿主または宿主関連生物から得られた転写停止信号を含むＤＮＡ断片を挿入するとよい。例えば、サルのウイルスであるシミアンウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０，ＳＶ４０）の早期遺伝子（ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）の翻訳停止コドン下流直後から２００〜５００塩基対のＤＮＡを用いれば十分である。なお、ある種の細胞においては、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子本体にあるイントロン１は取り除いておいた方がよく発現することがある。
【００２７】
以上の構造を持つ一つながりのＤＮＡを燐酸カルシウム法やエレクトロポレーション法等の方法にて細胞に導入する。このとき、この遺伝子が導入された細胞のみを拾い出すために、同時にネオマイシン耐性遺伝子を発現ベクターに挿入したものを混ぜておく。その後、Ｇ４１８を入れた細胞培養培地にてしばらく培養すれば、当該遺伝子が導入された細胞のみを選択的に得ることができる。このような細胞（例えば、マウスのＥＳ細胞）を偽妊娠状態の仮親の卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、所定の妊娠期間を経て産み出されたマウス個体においては、当該遺伝子を持つ細胞はその個体の体細胞と生殖細胞においてキメラの形で分布しているわけであるから、適切な交配により、個体の全細胞において当該遺伝子をヘテロ接合体の形で持つ動物が得られるから、ヘテロ接合体同士をかけ合わせてホモ接合体の形を持つ動物が得られる。無論、前述のキメラのままで次の段階へ行ってもよい。
【００２８】
次に、導入された遺伝子の誘導を行う。例えば、ＭＭＴＶのＬＴＲを持つ場合、当該遺伝子を持つ生物個体にステロイドホルモン（例えばデキサメタゾン）を経口、筋肉注射等の方法にて投与する。これにより、この遺伝子はＬＴＲ内のＤＮＡ要素によりその発現のスイッチが入り、ＬＴＲよりｍＲＮＡの転写が開始され、最終的に、導入されたＤＮＡポリメラーゼ蛋白質が細胞内に蓄積する。この蛋白質が宿主のＤＮＡポリメラーゼとある程度異なっていれば、それは宿主の調節をさほど受けることなくＤＮＡ合成を開始する。この時、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼは、細胞内における既存の染色体ＤＮＡの末端に対し、該末端を合成起点として４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列を幾度にも繰り返しながら付加していく。つまり、幾度にも繰り返される４〜１５塩基対程度の短かい塩基配列により、テロメア領域が伸長していく。なお、本発明におけるテロメア領域の伸長は、大きく分けて次のような２つの形態をとる。すなわち、細胞内の既存テロメア領域の塩基配列を仮に、……（ＡＧＧＧＴ）ｎ（以下、「ＡＧＧＧＴ」なる配列を「Ｘ」と略称する）とする場合、本発明の方法により、
▲１▼当該テロメアＤＮＡと同じ繰返し配列（Ｘ）で以てテロメアが伸長される場合
▲２▼テロメアＤＮＡとは異なる繰返し配列（Ｙ）で以てテロメアが伸長される場合とがある。いずれの場合も寿命の延長が起こると考えられる。
【００２９】
ある生物の寿命を延長させることにより、その生物をより長い期間にわたって産業的、工業的に、あるいはその他の目的に利用することができる。具体的にいえば、次に記載する期間の延長等が挙げられる。すなわち、牛、馬、ヒトなどの労働可能期間の延長、牛の搾乳可能期間の延長、鶏の産卵可能期間の延長、犬、猫小鳥等の愛玩動物への愛玩期間の延長、羊の羊毛刈取り可能期間の延長等があげられ、さらには、出産可能期間が延びることから、絶滅の危機に瀕する動物の数を増やす目的にも利用することができる。
【００３０】
本発明で用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法としては今日において公知であり、当業者であれば容易に行うことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これらによっても得ることができる）。特開平２−６０５８５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平６−７１６０号公報
【００３１】
【実施例】
以下、本発明の一実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
真核細胞プロモーターとしてマウス乳腺腫ウイルスＬＴＲを持つ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮ２２４（図１参照）に対し、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を挿入した。このベクターには、後で挿入した遺伝子を取り除けるようにするためｌｏｘＰ配列が挿入されている。すなわち、全体の構造は、上流よりｌｏｘＰ配列、プロモーター配列、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ターミネーター配列、ｌｏｘＰ配列とする。また、プラスミド本体には選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ遺伝子）が挿入されている。完成したプラスミドをｐＮ５５４とした（図２参照）。
【００３３】
マウス培養細胞（ＥＳ細胞）の中に、制限酵素（ＮｄｅＩ）によって直線化したプラスミドｐＮ５５４を０．２μｇ／ｍｌの濃度にて導入した。この導入は、エレクトロポレーション（ジーンパルサー、バイオ・ラッド社製、５００μＦ、２００Ｖ）を用いて行なった。その後、Ｇ４１８を１５０μｇ／ｍｌ含む培地にて約７日間培養を継続し、Ｇ４１８耐性のコロニーを入手した。この細胞より、集合キメラ法［A. Nagg, Production of completely ES cell-deriued fetuses in gene targeting. A. L. Joyner 著、pp147-179, IRL Press, 1993年発行］を用いた方法によりトランスジェニックマウスを得た。得られたトランスジェニックマウス同士の交配によりマウスの産仔を得、その産仔マウス同士の交配により導入遺伝子をホモ接合体の形として持つマウスを非キメラの個体として得た。
【００３４】
途中の遺伝子の態様はサザン・ブロット法［分子遺伝学実験法、小関治男ら著、共立出版（株）、1983年発行］を用いて尾から得られたＤＮＡにて確認した。導入遺伝子をホモ接合体として持つ成体マウスにおいて、デキサメサゾンを経口投与することにより、この導入遺伝子のプロモーターを活性化し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させた。この過程によりマウスの生殖前駆細胞において、染色体末端にテロメア様ＤＮＡ配列が付加されるが、このことを確認すべく次のような実験を行なった。すなわち、サザン・ブロット法により、染色体末端部のＤＮＡ断片の延長を見た。つまり、全４０個ある染色体のＤＮＡのその全てに、しかもその両末端に、（ＴＡＧＡＴＡＴＣ）ｎからなる８塩基対の繰返し配列が約５０００塩基対の長さに亙って伸びていることをサザン・ブロット法により確認できた。
【００３５】
次に、このマウスより得られた子供同士を交配することにより、染色体末端にテロメア様ＤＮＡ配列を持つ状態が全細胞に存在するような個体（マウス）を得た。このマウス（Ｍ１）においてはテロメアが伸長されているため（一般的に、マウスの場合、通常のテロメアの長さは約４，０００塩基対であり、本実施例で伸長させたテロメア様ＤＮＡ配列の長さは、前述したように５，０００塩基対であるから、結局、このマウスの塩基配列の全長は、約９，０００塩基対となっている。）、本来約２年の寿命であるべきマウスにおいて約１年の寿命延長が生じた。すなわち約３年間生きた。
【００３６】
このマウスの老衰死後において、尾よりＤＮＡを得て、サザン・ブロット法によりテロメア領域の長さを調べた結果、当初約９，０００塩基対の長さに亙って伸びていた繰り返し配列が約１００塩基対に減少していることが分かった。
【００３７】
実施例２
実施例１と同様にして、繰返し塩基配列の種類、及び長さが、上記実施例１の場合と異なるテロメアを備えたマウス（Ｍ２、Ｍ３）を得た。伸長部分の長さ、及び伸長に係わった繰返し塩基配列を、サザン・ブロット法により各々調べた。これにより、次のような結果が得られた。
【００３８】
（Ｍ２）繰返し単位；（ＴＴＧＧＧＧ）、伸長部分の長さ；約１，０００塩基対
（Ｍ３）繰返し単位；（ＴＴＧＧＧＧ）、伸長部分の長さ；約２，５００塩基対繰返し単位（ＴＴＧＧＧＧ）を持つマウス（Ｍ２）と（Ｍ３）は、次のようにして得たマウスである。すなわち、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子をプラスミドに挿入する代わりに、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）のＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子をプラスミドに挿入し、それ以外は実施例１と同様にして得たマウスである。
【００３９】
なお、同じＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を使用したにもかかわらず、Ｍ２とＭ３との間でテロメアの伸長部分の長さが互いに相違しているのは、当該構造遺伝子を挿入したプラスミドの染色体上における位置の違いによるものであり、これによるＤＮＡポリメラーゼの発現量の違いによるものである。
【００４０】
実施例１と実施例２で得られた各マウス（Ｍ１〜Ｍ３）の、「新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さ」と「寿命の延長」との関係を探るべく、グラフを作成した（図３参照）。この図より、寿命の延長の程度（長さ）は、新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さに比例していることが分かる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、生物の発生の初期段階において、テロメアＤＮＡを修飾することができた（すなわち、染色体ＤＮＡの末端に存在するテロメアＤＮＡを人為的に伸長させることができた）。これにより、各生物種が本来持っている寿命の長さが延長され、その生物を産業上あるいは他の目的に対し、より長く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】構造遺伝子を挿入したベクターを示す図である。
【図２】プラスミドの構造を示す図である。
【図３】「新たに伸長されたテロメア様ＤＮＡの長さ」と「寿命の延長」との関係を表した図表である。
Claims (4)
- ヒト以外の生物の細胞内にセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）またはその他のセルモコッカス属のＤＮＡポリメラーゼ、またはセルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）その他のセルマス属のＤＮＡポリメラーゼを導入することからなり、これによって染色体ＤＮＡの端部を合成起点としてデオキシリボヌクレオチドを重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法。
- セルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）またはその他のセルモコッカス属のＤＮＡポリメラーゼ、またはセルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）その他のセルマス属のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であるＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子とプロモーター領域の遺伝子と転写終了領域の遺伝子とが各々挿入されてなる発現ベクターをヒト以外の生物の細胞に導入することからなり、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これにより発現した前記ＤＮＡポリメラーゼの存在下にて、デオキシリボヌクレオチドを染色体ＤＮＡの端部を合成起点として重合させることを特徴とする染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域の伸長方法。
- 染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させるために働く、セルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）またはその他のセルモコッカス属のＤＮＡポリメラーゼ、またはセルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）その他のセルマス属のＤＮＡポリメラーゼが、プロモーター領域の活性化により細胞内にて発現するように設計された発現ベクターであり、前記ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であるＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子、プロモーター領域の遺伝子及び転写終了領域の遺伝子が各々挿入されてなることを特徴とするテロメア伸長用発現ベクター。
- セルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、セルモコッカス・セレル（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）またはその他のセルモコッカス属のＤＮＡポリメラーゼ、またはセルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）その他のセルマス属のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であるＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子を生物Ａの細胞より精製するとともに、前記遺伝子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のちこの融合遺伝子を他の、ヒト以外の生物Ｂの細胞に導入し、この細胞を偽妊娠状態の仮親の卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、移植後に得られたＦ１トランスジェニック生物に対し、あるいは少なくとも片方をＦ１トランスジェニック生物とする掛け合わせによって得たＦ２トランスジェニック生物に対し、ステロイドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモーター領域を活性化し、これによって当該細胞内にて前記ＤＮＡポリメラーゼを発現せしめ、これとともに前記ＤＮＡポリメラーゼの存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重合させて細胞内における既存染色体ＤＮＡのテロメア領域を伸長させることからなるヒト以外の生物の寿命延長方法。
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