CN111787791A - 用于防止特定染色体的传播的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于改变选择的性染色体中的基因表达的材料和方法。本发明的材料和方法可用于生产产生预定性别的子代的非人转基因动物和生成产生单性精液的非人转基因动物。

Description

用于防止特定染色体的传播的材料和方法

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及牲畜中的性别规范、防止Y染色体的传播以及与传播比率失真(TRD)和防止(或确保)其他染色体的传播相关的其他用途的领域。

背景技术

性别确定是牲畜中的重要问题。在许多畜牧产业中，产生特定性别(通常雌性)的后代的能力具有高的商业价值。例如，奶牛产业偏爱雌性后代。其他类型的牲畜操作也有偏爱，以便避免与绝育相关的问题，或以便确保更大的雄性后代，例如，在肉类工业中。

分离的高纯度携带X染色体或携带Y染色体的精细胞(sperm cells)群体可用于完成许多哺乳动物，比如，牛科动物、马科动物、羊属动物(ovids)、山羊、猪、狗、猫、骆驼、大象、公牛、水牛等的卵细胞或卵母细胞的体外或体内人工授精或受精。

基于携带X染色体和Y染色体的精细胞的大小、质量或密度的差异，已经设计了许多技术以直接地或间接地分离精子。然而，几乎所有这些方法都是基于精液的机械分选，并且有可能损坏精细胞，从而降低妊娠率并增加成本。此外，例如，由于精细胞中存在的DNA染色的量，由于染色程序而流逝的时间，以及受精的卵母细胞向囊胚形成的减缓进展，精子DNA的染色可对受精率有不利的影响。另外，精细胞选择的纯度可受到携带X和Y染色体的精细胞群体中荧光染料DNA染色模式的重叠范围的不利影响。

控制性别确定，即启动‘雄性’或‘雌性’级联(cascade)的基因是已知的并且经鉴定的。然而，使用这些基因的方法产生了次最优的结果，因为，例如，所得动物失去了许多与性别有关的特征，并且看起来比真正的强迫性性别更雌雄同体或具有混合的表型。

其他方法使用位点特异性核酸酶比如CRISPR攻击Y染色体并且阻止其传播。由于在一些情况下没有裂解或在其他情况下通过非同源端连接的裂解修复，这些方法因为它们中等的整体效率而具有实践问题，并且具有潜在的监管问题。

精子发生和胞质桥

在生产单性动物中造成困难的一个方面是这样的事实，在精子发生期间，胞质分裂是不完全的，并且由相同的未分化的精原细胞产生的生殖细胞仍通过细胞间桥彼此连接，细胞间桥一直保持到晚期精子发生。

在所有哺乳类物种中，精子发生主要发生在睾丸的生精小管中。其大致发生在“外部”，其中发育的最早阶段在小管的边缘附近，并且最后阶段在中心附近，成熟的精子释放至小管的中心。精子发生中的初始细胞是精原干细胞。这些干细胞能够自我更新并且分化成精原细胞。有几轮有丝分裂增殖，接着是其中染色体对分开的减数分裂I，并且然后接着是其中染色单体分离成单倍体精细胞的减数分裂II。重要的是，在整个该过程中，精子都通过胞质桥连接，RNA和蛋白质均通过胞质桥自由扩散。因此，精细胞共享横跨胞质桥的转录物和/或基因产物。

在精子发生的最后阶段，精细胞伸长，胞质桥断裂；尽管它们保持在残留体中。到此时，随着染色质被浓缩成精子头，转录被关闭。因此，精子(sperm)在它们的整代中功能上主要是二倍体的，即使在减数分裂II之后它们具有单倍体基因组。

贯穿大部分发育周期，共享的细胞质是障碍，因为在一个精细胞(spermatid)中产生的蛋白质可泄漏到另一个精细胞。因此，细胞功能上是二倍体的，并且装有RNA和RNA结合蛋白的细胞质颗粒以微管依赖性方式在精细胞之间移动。

传播比率失真(TRD)

在精子发生期间横跨胞质桥的转录物和基因产物的交换将提示插入Y染色体上的基因的任何转录物或基因产物将仅仅通过胞质桥传到携带X染色体的精子上。然而，存在来自自然孟德尔比率(Mendelian ratio)的遗传的失真，称为传播比率失真(TRD)。

研究最多的TRD实例是t-复合物应答器(TCR)系统。在该系统中，小鼠染色体17上自然发生的突变不影响卵子中的染色体传播，但是导致杂合雄性将该突变传递至其将近100％的后代。尽管涉及t-复合物的机制是复杂的，但是关键发现提供了，将TCR的非翻译区(UTR)附着至构建体防止了这种构建体通过胞质桥在精子之间共享。TCR系统的5’UTR和3’UTR包含将它们结合至细胞骨架结构的序列，防止它们移动穿过胞质桥。有几乎完美的利用TCR的TRD的事实说明，限制不仅在于RNA，而且还延伸至蛋白质，这可能是因为蛋白质本身中的膜插入序列。

在精子粘附分子1(Spam1)中也可看到通过与膜插入相结合的UTR的束缚，Spam1为负责穿透卵子的蛋白质，因为束缚至细胞骨架元素，其也不横跨胞质桥。

自然界中还有许多其他的TRD的实例，并且TRD不限于小鼠。有力的统计证据表明了牛中许多的TRD的位点，其中相比雌性，TRD更通常发生在雄性中。

跨物种的TRD的另一个实例是Slx/Sly冲突。该系统包括在性染色体上彼此竞争的一组同源基因。Slx促进了向更多雌性后代的倾斜；Sly促进了向更多雄性的倾斜¹。尽管这些倾斜基因的强度对于本申请的目的可能不足够强，但是Slx/Sly冲突表明性染色体不能免于该现象。

Gnat3和Tas1r3化学受体

TRD的另一个显著的实例是在化学受体味蛋白α-3链(Gnat3)和味觉受体1型成员3(Tas1r3)中发现的。这些跨膜蛋白涉及感知“鲜味”味道的能力，谷氨酸一钠最体现“鲜味”味道。缺少Gnat3和Tas1r3两者的精子永远不产生后代，但在雌性方面的传播不受到影响。研究表明，不能产生后代是由于精子进展性(progressivity)的丧失，即，精细胞正确地形成了，并且也可像其他精子一样移动，但是不能沿化学梯度游动，这意味着精子不能找到卵子。

重要的是，与仅在小鼠或Spam1中发现的t-复合物不同，对于其所需的另外的透明质酸酶似乎是物种特异性的，Gnat3/Tas1r3系统在跨物种中是极其充分保守的。在小鼠、人、猪和牛之间，5’UTR示出非常高的序列同源性。跨90个物种的多重序列比对示出，Gnat3/Tas1r3系统在所有胎盘哺乳动物中是高度保守的。相反，其他味觉受体中的UTR几乎没有跨物种的序列保守。

与TRD的先前实例一致，Tas1r3和Gnat3两者都是包括膜插入结构域的膜插入蛋白，并且在精子发生中表达非常晚，即仅在精细胞中表达。

例如，在牛中，直到当Gnat3位于线粒体束附近的精子轴丝时而获能，Gnat3似乎才在精子中有活性，推测感知化学信号并指导精子尾部的活化。

发明内容

本发明提供了用于防止和/或抑制特定染色体的传播或可替选地强迫特定染色体的传播的材料和方法。

在具体的实施方式中，提供的方法包括将序列插入至特定染色体，例如，Y染色体中，插入的序列防止Y染色体精子成功地使卵子受精。提供的方法利用了，例如，传播比率失真机制。

在其他实施方式中，插入需要该染色体通过使用失真响应器系统而传播的序列。

在具体的实施方式中，提供了用于产生单性X染色体或Y染色体精液的方法。

进一步提供了产生单性后代或子代的基因修饰的动物。

在一些实施方式中，提供了用于固定产生特定性别的精子的方法。在其他实施方式中，提供了用于删除产生特定性别的精子的方法。

在优选的实施方式中，提供了用于产生包括至少90％的X染色体精细胞的单性精液的材料和方法，该精液可用于产生雌性动物。

雌性动物也可为在至少一个性染色体上引入的转基因的载体，并且这种雌性载体可自然地繁殖以繁殖所需的性状。在这种繁殖方法中，可使用自然繁殖技术来产生子代，从而具有一个拷贝的所述转基因。可替选地，可从基本上产生雄性子代的载体雄性的胞质内精子转移产生子代，从而具有两个拷贝的所述转基因。

在进一步的实施方式中，提供了用于产生基本上产生雌性子代的雄性动物的转基因雌性动物。

在进一步优选的实施方式中，提供了用于产生包括至少90％的Y染色体精细胞的单性精液的材料和方法，该精液可用于产生雄性动物。

有利地，在一些方面中，使用本发明的材料和方法产生的动物不是基因修饰的。

还涵盖了用于完成本文所述方法的遗传构建体和工具。

附图说明

图1A示出包括包含两个U6启动子/Tas1R3 shRNA单元和两个U6启动子/Gnat3shRNA单元的依次排列的启动子/shRNA单元的构建体。图1B示出包括包含U6启动子和H1启动子/Tas1R3 shRNA单元以及U6启动子和H1启动子/Gnat3 shRNA单元的趋异取向的启动子/shRNA单元的构建体。

图2A示出了如图1A所示并且另外包括与“摆动的”Gnat3基因可操作地连接的Gnat3启动子的构建体。图2B示出了如图1B所示并且另外包括与“摆动的”Gnat3基因可操作地连接的Gnat3启动子的构建体。

图3示出了用对Slc26a8蛋白的抗体标记的野生型动物的生精小管的横截面，Slc26a8蛋白是仅在晚期精细胞中表达的膜插入蛋白(从(1)重现的)。

图4A示出了包括与Gnat3 5’UTR可操作地连接的Gnat3启动子和Slc26a8显性阴性基因的构建体。图4B示出了与图3A相似的构建体，但是具有loxP位点在侧翼的GFP基因以及构建体的5’和3’同源臂，通过施加融合3’至Slc26a8显性阴性基因的Cre重组酶去除GFP基因。图4C示出了将RNA转录物束缚至精细胞的细胞骨架结构的Gnat3 5’UTR。图4D-图4E示出了睾丸中(图4D，红色表示标志和Slc26a8显性阴性突变体，并且蓝色表示核)和精细胞中(图4E，其中绿色/黄色表示标志和Slc26a8显性阴性突变体，蓝色表示核，并且红色表示对精子中段染色的MitoTracker)的Slc26a8-标志染色。图4F示出了与野生型相比，SLC26a8显性阴性转基因小鼠中精子活力降低。

图5示出了包括TCR/Smok2b启动子序列、TCR/Smok2b 5’UTR、Slc26a8显性阴性基因、具有Smok2b内含子序列的TCR/Smok2b 3’UTR和聚腺苷酸(polyA)的构建体。

图6A示出了用于通过将RNA束缚至细胞骨架结构来防止和/或抑制精细胞中RNA转移的构建体(从(3)重现的)。图6B示出了用Smok特异性探针标记的野生型动物的生精小管的横截面(从(3)重现的)。图6C示出了表达用myc特异性探针标记的RNA束缚构建体的非人转基因动物的生精小管的横截面(从(3)重现的)。图6D示出了用myc特异性探针标记的野生型动物的生精小管的横截面(从(3)重现的)。图6E示出了生精小管的横截面示意图(从(3)重现的)。图6F示出了用抗myc抗体和抗微管蛋白抗体标记的转基因动物的和用抗myc抗体标记的野生型动物的生精小管的横截面的荧光显微镜图像(从(3)重现的)。图6G示出了用抗myc抗体标记的野生型和转基因动物的生精小管的纵切面(从(3)重现的)。

图7A示出了用于翻译延迟策略的构建体，以防止蛋白质表达，直到精细胞之间的胞质桥断裂之后(从(3)重现的)。图7B示出了表达用抗myc抗体标记的图6A的构建体的野生型动物和非人转基因动物的生精小管的横截面(从(3)重现的)。图7C示出了表达用荧光抗myc抗体标记的RNA束缚构建体的野生型动物和非人转基因动物的生精小管的横截面的荧光显微镜图像(从(3)重现的)。图7D示出了表达不同等位基因的两个染色体的示意图，该等位基因影响精子功能，导致各个染色体的差异传播和非孟德尔遗传(从(3)重现的)。

图8A示出了包括山羊Gnat3启动子以及与山羊SLC26a8显性阴性基因结合的5’UTR的元件的遗传构建体，用于防止和/或抑制山羊中任意染色体的传播。图8B示出了使其显性阴性的山羊Slc26a8基因的E至K突变。示出了用于小鼠SLC26a8(SEQ ID NO:5)、人SLC26a8(SEQ ID NO:6)、猪SLC26a8(SEQ ID NO:7)、山羊SLC26a8(SEQ ID NO:8)和牛SLC26a8(SEQID NO:9)的氨基酸序列的部分。

图9A示出了牛(SEQ ID NO:4的核苷酸201-1523)和小鼠(SEQ ID NO:2的核苷酸322-1635)之间的Gnat3启动子和5’UTR序列的成对序列比对。图9B示出了牛(SEQ ID NO:4的核苷酸201-1702)和人(SEQ ID NO:3的核苷酸130-1634)之间的Gnat3启动子和5’UTR序列的成对序列比对。图9C示出了山羊(SEQ ID NO:1的核苷酸1441-2803)和小鼠(SEQ IDNO:2的核苷酸322-1687)之间的Gnat3启动子和5’UTR序列的成对序列比对。

序列的简要说明

SEQ ID NO:1示出了包括山羊Gnat3启动子以及与山羊SLC26a8显性阴性基因结合的5’UTR的元件的遗传构建体的核苷酸序列，用于防止和/或抑制山羊中任意染色体的传播。这些元件依次是：核苷酸1-23CRISPR位点、24-1079左臂(与山羊Y染色体匹配)、1080-1087NotI位点、1088-1121FRT位点、1122-2811山羊Gnat3启动子和5’UTR(束缚区)、具有使显性阴性的E至K突变的2812-5750山羊Slc26a8、5751-5996Spam1 3’UTR、5997-7166兔β珠蛋白聚腺苷酸序列(包括最后一个内含子)、7167-7200FRT位点、7201-7206限制酶切位点、7207-8343右臂(与山羊Y染色体匹配)和8344-8366CRISPR位点。

SEQ ID NO:2示出了小鼠Gnat3的启动子和5’UTR区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3示出了人Gnat3的启动子和5’UTR区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4示出了牛Gnat3的启动子和5’UTR区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5示出了小鼠SLC26a8的氨基酸序列的部分。

SEQ ID NO:6示出了人SLC26a8的氨基酸序列的部分。

SEQ ID NO:7示出了猪SLC26a8的氨基酸序列的部分。

SEQ ID NO:8示出了山羊SLC26a8的氨基酸序列的部分。

SEQ ID NO:9示出了牛SLC26a8的氨基酸序列的部分。

发明详述

本发明提供了用于防止和/或抑制特定染色体的传播和产生特定性别的非人转基因动物的材料和方法。在一些实施方式中，本发明的材料和方法用于防止和/或抑制性染色体的传播。在其他实施方式中，本发明的材料和方法用于防止和/或抑制常染色体的传播。

防止和/或抑制特定染色体的传播功能上等同于要求或强迫染色体对的另一染色体的传播。即，如果防止或抑制了Y染色体的传播，结果就是传播了X染色体，其功能上等同于要求X染色体的传播。

在一些实施方式中，提供了用于强迫特定染色体的传播的材料和方法，其中特定染色体可为性染色体或常染色体。

重要的是，本发明的材料和方法可用于防止或强迫常染色体的传播。在一些实施方式中，使用本文公开的材料和方法实现了防止常染色体上有害基因或等位基因的传播。在一些实施方式中，使用本发明的材料和方法实现了强迫常染色体上有利基因或等位基因的传播。在一些实施方式中，使用本发明的材料和方法实现强迫常染色体上基因工程基因或等位基因的传播。如本文使用的，“有害”基因或等位基因指的是赋予危害或伤害活性以抑制细胞或生物体的生长和/或发育的基因或等位基因。如本文使用的，“有利”基因或等位基因指的是赋予有益或有利活性以促进细胞或生物体的生长和/或发育的基因或等位基因。

在具体的实施方式中，本发明提供了用于产生转基因动物，特别是非人类哺乳动物的材料和方法，该转基因动物具有改变的产生特定性别子代的趋势。

术语“子代”指的是直接后代或后辈(descendant)，即后代的后代，其取决于所产生动物的性别。

在一些实施方式中，本发明的方法通过将核酸构建体引入至哺乳动物的生殖细胞系的染色体中进行，其中核酸构建体携带在发育中的精细胞中的减数分裂后表达的转基因。转基因的表达被设计为改变精子的生育能力，从而使非人类转基因哺乳动物具有改变的在随后的世代中产生携带特定染色体的子代的趋势。

当将核酸构建体引入至性染色体中时，转基因的表达可以防止和/或抑制各个性染色体向随后的世代的传播。

与体内的所有其他细胞不同，精细胞具有单倍体基因组，并且因此仅有X染色体或Y染色体，但不同时具有两者。因此，通过将基因插入至X染色体或Y染色体中，可决定各个精子的命运，而不影响其他精子的命运。

有利地，本发明的非人转基因动物能够确保产生特定性别的后代，而无需进一步的遗传或细胞生物学操作。例如，可以在自然繁殖或人工授精方案中使用产生单性后代的雄性。此外，当使用雄性非人类转基因哺乳动物来产生单性后代时，基因修饰不传给随后世代，即随后世代不被遗传修饰。

本发明的方法可涉及生产雄性动物和雌性动物两者。例如，当该方法产生在性染色体上具有转基因的产精子的动物时，在减数分裂后携带转基因的配子将具有改变的生育能力，即改变的完成卵子受精的能力。因此，这种非人转基因动物在后代的第一代中将具有非自然的概率来培育特定性别的子代，该概率取决于转基因的性质以及表达转基因的精子失能的程度。

当使用该方法生产产卵动物时，在第一代中具有特定性别后代的概率不受到影响，因为这种动物不生产精子。因此，如果转基因在两个性染色体中的一个上，则取决于自然概率，其将被传递给近似一半的后代，无论是雄性还是雌性。如果转基因在两个性染色体上，所有后代都将获得转基因。然而，如果将转基因设计为影响精子生育能力，则在来自产卵哺乳动物的第一代子代中具有特定性别的概率将不受到影响。

从转基因母亲接受转基因的雌性动物将携带该品系，但是因为它们不产生精子，所以它们的直接后代也不受到影响。然而，接受转基因的雄性动物将具有基本上单性的后代，达到这种程度以致于在减数分裂之后获得携带转基因的染色体的任何精子都失能。因为雌性动物具有无限期地携带该品系的能力，所以当将转基因引入至雌性动物的品系中时，可影响任何随后世代的雄性精子生产者。

在一些实施方式中，将本发明的遗传构建体插入至Y染色体中，当表达时该遗传构建体防止和/或抑制携带各自Y染色体的精子的存活、活力、进展性和/或受精能力。有利地，携带所述构建体的非人转基因动物将不产生携带Y染色体的精子。这种转基因动物的单性精液可用于自然繁殖或体外受精，以专门生产雌性后代。

在其他实施方式中，将本发明的遗传构建体插入至X染色体中，当表达时该遗传构建体增强或促进、提升或改善携带各自X染色体的精子的存活、活力、进展性和/或受精能力。有利地，携带所述构建体的非人转基因动物将具有增强的生产携带X染色体的精子的能力，并且因此可生产高纯度的单性精液以主要产生雌性后代。

本领域已知的适用于生产非人转基因动物的任何技术可用于实施本发明。生产非人转基因动物的特别地优选的方法包括但不限于美国专利号9,670,458中描述的精原干细胞(SCC)转移，其以其整体在此并入。

用于生产非人转基因动物的技术是本领域众所周知的，并且其包括但不限于原核显微注射、病毒感染以及胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞的转化。进一步包括的是下述技术：使用精原干细胞的位点特异性敲入、使用转座因子的xogenous^TM移动DNA技术、黄单胞菌转录激活子样核酸酶(TAL-效应子核酸酶或TALEN)及其组合。专利号9,670,458公开了产生转基因精子的方法。

在一些实施方式中，表达构建体的侧翼为同源臂。

例如，将转基因靶向X染色体或Y染色体可通过在转基因的侧翼具有来自靶X染色体或Y染色体的几千个碱基对的DNA来实现。转基因构建体与X染色体或Y染色体之间的序列同一性分别促进转基因构建体同源重组和整合至X染色体或Y染色体中。

在某些实施方式中，外源核酸分子包含指导位点特异性同源重组的侧翼核酸序列。使用侧翼DNA序列以允许同源重组至所需的基因座中是本领域已知的。目前，优选的是在载体中在编码序列(或通过同源重组插入至染色体的位置中的本发明的任何其他序列)的两侧存在对应于染色体插入位点的多达数千个碱基或更多的侧翼DNA，以确保用外源DNA精确替换染色体序列。

每个侧翼同源臂可为低的约500个碱基对(bp)、约600bp或约750bp至高的约2千个碱基对(kb)、约3kb或约5kb。例如，每个同源臂可为约500bp至1kb、约500bp至约1.5kb、约500bp至约2kb、约500bp至约2.5kb、约500bp至约3kb、约500bp至约3.5kb、约500bp至约4kb、约500bp至约4.5kb、约500bp至约5kb、约600bp至约1.5kb、约600bp至约2kb、约600bp至约2.5kb、约600bp至约3kb、约5600bp至约3.5kb、约600np至约4kb、约600bp至约4.5kb、约600bp至约5kb、约750bp至约1.5kb、约750bp至约2kb、约750bp至约2.5kb、约750bp至约3kb、约750bp至约3.5kb、约750bp至约4kb、约750bp至约4.5kb、约750bp至约5kb。

在一些实施方式中，细胞可包含多个拷贝的感兴趣的构建体。

在本发明的一些实施方式中，优选地将包括转基因的表达构建体在转录活性位点插入至性染色体中。牛科动物中Y染色体上的转录活性位点的实例例如包括但不限于染色质域Y样(CDY)基因、PRMAY以及ZNF280BY和ZNF280AY常染色体衍生的Y染色体基因家族的成员。

本发明的材料和方法能够确保产生不将特定染色体传递给后代的非人转基因动物。

还提供了产生非人转基因动物的方法，其优选地将特定染色体传递给动物的后代，其中特定染色体可为性染色体或常染色体。

在优选的实施方式中，本发明提供了生产非人转基因动物的材料和方法，通过将转基因引入至动物的生殖细胞系中，非人转基因动物具有改变的产生特定性别的子代的趋势。

在更优选的实施方式中，本发明提供了生产产生单性精液的非人转基因动物的材料和方法。在最优选的实施方式中，本发明的材料和方法提供了产生仅产生雌性后代的单性精液的非人转基因动物。

在优选的实施方式中，本发明的材料和方法在非人转基因动物中产生了传播比率失真(TRD)。在具体的实施方式中，通过在精子发育期间限制天然发生的RNA和蛋白质穿过精细胞之间存在的胞质桥的转移而完成本发明的TRD。

在优选的实施方式中，通过本发明提供的方法限制了例如精细胞之间的RNA运输。在其他实施方式中，该方法使用膜插入限制了精子之间的蛋白质运输。在一些实施方式中，该方法限制了精细胞之间的RNA和蛋白质运输。

在一些实施方式中，通过使用特定的UTR束缚和/或通过将膜插入序列插入至蛋白质中，限制了RNA和蛋白质在精细胞之间通过胞质桥的运输。

在本发明的实施方式中，将感兴趣的蛋白质靶向特定细胞位置的任何信号序列都可用于限制所述蛋白质在精细胞之间的运输。

在优选的实施方式中，特定的非翻译区(UTR)衍生的序列用于将RNA束缚至精细胞的细胞质结构。

在其他优选的实施方式中，本发明的构建体包括包含膜插入序列的蛋白质。在一些实施方式中，当插入至例如Y染色体中时，本发明的序列导致进展性，即精子找到卵子的能力的破坏；影响精子活力，即精子移动的能力；或影响受精，即精子穿透卵子并且使卵子受精的能力；或阻止存活，即诱导精细胞的细胞死亡。

在优选的实施方式中，本发明的构建体在精细胞中表达束缚转录物，该束缚转录物导致精细胞的进展性、活力和受精能力中的任何或所有的破坏和/或诱导精细胞死亡。

在其他实施方式中，束缚转录物在精细胞中的表达导致精细胞的进展性、活力和受精能力中的任何或所有的提升、增强或改善。

在优选的实施方式中，本发明的方法通过将表达转录物的构建体引入至所述染色体中来防止和/或抑制性染色体向后代的传播，该转录物包括束缚RNA的UTR，所述束缚RNA的UTR将所述转录物束缚至携带性染色体的精细胞的细胞骨架结构并且将转基因的表达限制至包含束缚转录物的精子。

在优选的实施方式中，束缚转录物的核酸编码破坏进展性、精子活力和/或精子穿透卵子并且使卵子受精的能力和/或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质。

如果本发明的转录物编码破坏进展性、活力和受精能力中的任何或所有和/或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质，则包含转录物的精子将不能使卵子受精，并且携带各自转录物的染色体将不传给后代。

如果本发明的转录物编码促进或增强进展性、活力或受精能力中的任何或所有的至少一种蛋白质，则包含转录物的精子将具有改善的使卵子受精的能力，并且携带各自转录物的染色体将传给后代。

在一些实施方式中，通过将束缚RNA的UTR附着至从常染色体表达的转录物而防止和/或抑制了常染色体的传播，该转录物被束缚至细胞骨架结构，并且防止和/或抑制其横跨胞质桥至附着的精细胞中。因此，束缚转录物仅在包含感兴趣的常染色体的精子中表达。

如果细胞骨架束缚的转录物编码破坏进展性、活力或受精能力中的任何或所有，或精细胞的所有这些和/或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质，则包含携带束缚转录物的常染色体的精子在进展性、活力或受精能力中的任何或所有方面遭到破坏或将死亡。

如果细胞骨架束缚的转录物编码提升、增强或改善精细胞的进展性、活力或受精能力中的任何或所有的至少一种蛋白质，则包含携带束缚转录物的常染色体的精子在进展性、活力或受精能力中的任何或所有方面得到改善。

在优选的实施方式中，束缚转录物是从Y染色体核酸分子表达的。在其他实施方式中，束缚转录物是从X染色体核酸分子表达的。

在本发明的一些实施方式中，由本从发明的构建体翻译的转录物编码的蛋白质产物被防止和/或抑制在精细胞之间通过胞质桥移动，因为蛋白质天然地包括至少一个膜插入序列或结构域，或因为编码蛋白质的转录物已被基因工程改造使得表达的蛋白质包括至少一个膜插入序列或结构域。

在一些实施方式中，表达编码包括膜插入序列的至少一种蛋白质的转录物的本发明的构建体存在于性染色体上。在其他实施方式中，表达编码包括膜插入序列的蛋白质的转录物的本发明的构建体存在于常染色体上。

在进一步的实施方式中，提供了使用特定UTR序列以延迟精细胞中蛋白质的翻译直到精细胞之间不再存在细胞质桥的方法。例如，本发明的构建体包括衍生自Smok1基因的UTR序列。Smok1是编码促进传播比率失真的t-复合物应答器(TCR)系统的基因。

在其他实施方式中，本发明的构建体编码具有膜插入序列的至少一种蛋白质，该至少一种蛋白质导致精细胞的进展性、活力和受精能力中的任何或所有的破坏或导致精细胞死亡。在这些实施方式中，包括具有膜插入序列的蛋白质的精细胞被防止使卵子受精和/或被抑制使卵子受精，并且携带编码具有膜插入序列的蛋白质的转录物的染色体将不会传递给子代。

在其他实施方式中，本发明的构建体编码包括膜插入序列的至少一种蛋白质，该至少一种蛋白质导致提升、增强和/或改善精细胞的进展性、活力和受精能力中的任何或所有。在这些实施方式中，包括具有膜插入序列的蛋白质的精细胞在它们使卵子受精的能力方面得到增强或改善，并且携带编码具有膜插入序列的蛋白质的转录物的染色体将优先传递给子代。

在一些实施方式中，包括膜插入序列的蛋白质是显性阴性蛋白质，其造成精子的存活、活力和进展性的失败，或由精子穿透卵子的失败。在一些实施方式中，包括膜插入序列的蛋白质是造成胚胎形成失败的蛋白质。在优选的实施方式中，显性阴性蛋白质是能够确保和/或促进精子的存活、活力、进展性和/或卵子穿透的显性阴性形式的蛋白质。

在优选的实施方式中，包括膜插入序列的蛋白质仅在晚期精细胞中表达。在进一步优选的实施方式中，具有膜插入序列的蛋白质是精子活力所需的Slc26a8蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是Septl2，其为精子头和尾形成所需的微管复合蛋白。

本发明的束缚RNA的UTR可存在于编码转基因的构建体的5’侧或3’侧上，或5’侧和3’侧的两个侧上。本发明的束缚RNA的UTR可包括能够将转录物束缚至精细胞的任何膜结构并且从而能够防止和/或抑制转录物沿着胞质桥向连接的精细胞移位的任何序列。

在本发明的优选的实施方式中，UTR衍生自由Smok基因编码的t-复合物应答器(TCR)。

在其他实施方式中，UTR衍生自Gnat3基因。

在一些实施方式中，UTR衍生自Tas1r3基因。

在一些实施方式中，UTR衍生自精子粘附分子1(Spam 1)基因。

在其他实施方式中，UTR衍生自Slx基因。在仍其他实施方式中，UTR衍生自Slc基因。

在仍其他实施方式中，基于衍生自经历了传播比率失真的任何蛋白质的序列，UTR被基因工程改造。技术人员可容易设计来自不同来源的UTR，以与本文提供的材料和方法一起使用，以实践采用UTR的本发明的方法。

在一些实施方式中，由UTR束缚转录物编码的蛋白质是显性阴性蛋白质，其造成精子的存活、活力和/或进展性的失败或精子穿透卵子的失败。

在一些实施方式中，由UTR束缚转录物编码的蛋白质是造成胚胎形成失败的蛋白质。

在一些实施方式中，由UTR束缚转录物编码的蛋白质是包括膜插入序列的蛋白质。在一些实施方式中，由UTR束缚转录物编码的蛋白质是显性阴性蛋白质，其造成精子的存活、活力和/或进展性的失败或精子的卵子穿透失败；或是造成胚胎形成失败的蛋白质。

在一些实施方式中，包括膜插入序列的蛋白质包含至少一个天然膜插入序列。在其他实施方式中，包括膜插入序列的蛋白质包含至少一个通过基因工程添加的膜插入序列。

在一些实施方式中，本发明提供了在性染色体上插入核酸序列的材料和方法，该核酸序列破坏其他染色体上的基因。

在一些实施方式中，本发明的构建体包括抑制性RNA序列，其抑制涉及精子的存活、活力和/或进展性的至少一个基因的表达。例如，在一些实施方式中，产生了小的干扰RNA(siRNA)，该siRNA有效地敲低涉及精子的存活、活力和/或进展性的至少一个基因的表达。

在一些实施方式中，本发明的构建体包括短发夹RNA(shRNA)或微RNA(miR)序列，并且将构建体插入至非人类动物的性染色体中，其中构建体的表达抑制从存在于非性染色体上的基因转录的RNA。

在优选的实施方式中，短发夹RNA(shRNA)或微RNA(miR)序列靶向涉及精子的存活、活力和/或进展性的至少一个基因。

在一些实施方式中，本发明的构建体包插入至miR盒中的siRNA序列，该miR盒/siRNA序列有效地敲低涉及精子的存活、活力和/或进展性的至少一个基因的表达。在优选的实施方式中，miR盒包括至少一个序列，其允许将miR盒引入至在晚期精子发生中表达的基因的3’UTR区中，从而将敲低效应靶向至精子发生的晚期。

在一些实施方式中，本发明的核酸构建体包括用于能够确保精细胞的进展性、活力和/或穿透能力的至少一种蛋白质的至少一种小干扰RNA(siRNA)；其中将至少一种siRNA插入至微RNA(miR)盒中，该miR盒包括与在晚期精子发生中表达的基因的3’UTR区的序列同源的至少一个序列。

在优选的实施方式中，本发明的构建体的shRNA靶向其产物对于精子的进展性是必需的一个或多个基因，例如，涉及精子沿着化学梯度移动以定位卵子的基因。在更优选的实施方式中，shRNA靶向编码Gnat3和Tas1r3化学受体的基因。Tas1r3和Gnat3两者都是膜插入蛋白，并且在精子发生中表达很晚，即仅在精细胞中表达。

在一些实施方式中，本发明的构建体包括在RNA聚合酶III(pol III)启动子的控制下靶向Tas1r3基因的至少一种shRNA，其中将构建体插入至靶染色体中，以防止和/或抑制携带所述靶染色体的精子使卵子受精，并且从而防止和/或抑制所述靶染色体向后代的传播。在优选的实施方式中，本发明的构建体包括靶向Gnat3基因的shRNA，该构建体在polIII启动子的控制下插入至靶染色体中，以预防和/或抑制所述靶染色体的传播。

在一些实施方式中，本发明的构建体包括在pol III启动子的控制下靶向Gnat3基因的至少一种shRNA，将该构建体插入至靶染色体中，以防止携带所述靶染色体的精子使卵子受精，并且从而防止和/或抑制所述靶染色体向后代的传播。

在优选的实施方式中，本发明的构建体包括靶向Tas1r3基因的至少一种shRNA和靶向Gnat3基因的至少一种shRNA，该构建体在pol III启动子的控制下插入至靶染色体中，以防止和/或抑制所述靶染色体的传播。

在一些实施方式中，在pol III启动子的控制下靶向Tas1r3的至少一种shRNA和靶向Gnat3的至少一种shRNA位于多个构建体上。

在优选的实施方式中，在pol III启动子的控制下靶向Tas1r3的至少一种shRNA和靶向Gnat3的至少一种shRNA位于单个构建体中。

在一些实施方式中，一个以上的Tas1r3 shRNA单元和一个以上的Gant3 shRNA单元位于本发明的构建体上的序列中。

在其他实施方式中，一个以上的Tas1r3 shRNA单元和一个以上的Gant3 shRNA单元彼此趋异取向位于本发明的构建体上。进一步考虑了构建体上多个shRNA单元的任何分组，并且技术人员可容易地设计这种包括多个shRNA的构建体。

在优选的实施方式中，shRNA可存在于本发明的构建体上的任何多聚体，包括但不限于一个、两个、三个或更多个shRNA靶向多聚体中。

在一些实施方式中，shRNA单元被终止子序列隔开，特别是在包括依次定位，即在相同方向上转录的多个shRNA单元的构建体中。

在其他实施方式中，当shRNA单元面向彼此趋异取向时，即每个shRNA单元的3’端彼此面对时，终止子序列是可选的。

在某些实施方式中，构建体包括在几个shRNA单元之间和/或在构建体的5’端和3’端的多个克隆位点。

在某些实施方式中，pol III启动子包括但不限于U6启动子和H1启动子。

在一些实施方式中，将包括在pol III启动子的控制下靶向Tas1r3基因的至少一种shRNA和/或靶向Gnat3的至少一种shRNA的遗传构建体插入至性染色体中，以防止和/或抑制所述性染色体向后代的传播。

在其他实施方式中，将包括在pol III启动子的控制下靶向Tas1r3基因的至少一种shRNA和/或靶向Gnat3的至少一种shRNA的遗传构建体插入至常染色体中，以防止和/或抑制所述常染色体向后代的传播。

在优选的实施方式中，将包括在pol III启动子的控制下靶向Tas1r3基因的至少一种shRNA和/或靶向Gnat3的至少一种shRNA的遗传构建体插入至Y染色体中，以防止和/或抑制所述Y染色体向后代的传播，从而产生仅产生单性别的精液，即仅成为雌性后代的父亲的精液的非人转基因动物。

有利地，使用本发明的材料和方法生产的产单性精液的非人转基因动物不将转基因传给它们的后代，即后代是未被基因修饰的，并且使用本发明的这种非人转基因动物生产单性别后代不涉及任何进一步的基因操作或细胞生物学操作，但是后代可通过自然繁殖技术获得。

在一些实施方式中，包括至少一种Tas1r3 shRNA和/或至少一种Gnat3shRNA的构建体不包含束缚RNA的序列或蛋白质插入序列。在这种实施方式中，从构建体表达的RNA和蛋白质可在通过胞质桥连接的精细胞之间交换，并且携带构建体的精细胞以及不携带构建体的那些可受到从构建体表达的RNA和蛋白质的不利影响。

本发明进一步提供了通过下述拯救携带缺少束缚RNA的序列或蛋白质插入序列的构建体的精细胞的材料和方法：插入在它们天然启动子下使用Tas1R3基因和/或Gnat3基因但具有摆动的“第三碱基”的表达盒，因此从相同构建体表达的shRNA不再识别Tas1r3和Gnat3基因序列。在这些实施方式中，仅那些携带构建体的精细胞是能生育的，因为摆动的Tas1r3基因和/或Gnat3基因不受针对Tas1r3和/或Gnat3共表达的shRNA的抑制。

在一些实施方式中，提供了核酸分子，其包括用于能够确保精细胞的进展性、活力或穿透能力的蛋白质的至少一种短发夹RNA(shRNA)；其中至少一种shRNA可操作地连接至选自U6启动子和H1启动子的pol III启动子。

在进一步的实施方式中，至少一种shRNA针对Tas1R3蛋白和/或Gnat3蛋白。

在优选的实施方式中，核酸进一步包括可操作地连接至Gnat3启动子的编码Gnat3蛋白的22个外源核酸序列，其中编码Gnat3蛋白的核酸序列包括第三碱基摆动，使得针对Gnat3的shRNA不结合编码Gnat3蛋白的所述核酸序列。

在进一步优选的实施方式中，外源Gnat3序列包括UTR束缚转录物和/或编码的Gnat3蛋白包含蛋白膜插入序列，以将拯救限于携带本发明的外源构建体的那些精细胞。

在一些实施方式中，本发明的构建体包括“摆动的”Gnat3基因和/或“摆动的”Tas1r3基因，并且进一步包括至少一个pol III启动子驱动的Tas1r3 shRNA和/或至少一个Gnat3 shRNA，依次排列在构建体上，shRNA单元之间有终止子序列；或趋异排列在构建体上，shRNA单元之间有或没有终止子序列。

有利地，使用本发明的这种shRNA/摆动的构建体产生的非人转基因动物从包含“摆动的”Tas1r3基因和/或Gnat3基因的精细胞表达Tas1r3蛋白和/或Gnat3蛋白，并且这种精细胞能够使卵子受精。

相比之下，不包含含有摆动的Tas1r3基因和/或Gnat3基因的构建体和仅包含穿过胞质桥的Tas1r3 shRNA和/或Gnat3 shRNA的精细胞将经历内源Tas1r3 mRNA和/或Gnat3mRNA表达的抑制，并且将不能使卵子受精。

在一些实施方式中，将Sept-4的shRNA和/或Sept12的shRNA插入至本发明的构建体中。

在一些实施方式中，将CATSPER1至CATSPER4的shRNA插入至本发明的构建体中。

在进一步实施方式中，将CATSPERB、CATSPERD和CATSPERG的shRNA插入至本发明的构建体中。

在一些实施方式中，本发明的非人转基因动物在常染色体上包括本发明的构建体，该常染色体例如携带非期望的突变等位基因，并且如果构建体包括包含UTR束缚的转录物或编码具有膜插入序列的蛋白质的转基因，并且转基因编码的蛋白质导致破坏精细胞的进展性、活力或受精能力中的任何或所有或诱导精细胞死亡，则包含携带这种构建体的常染色体的精子将不传递给后代。有利地，使用这种构建体产生的雄性非人转基因动物将仅成为不包含非期望的突变等位基因的后代的父亲。

此外，将本发明的遗传构建体引入至包含突变等位基因的选定常染色体中可通过在待插入常染色体中的构建体侧翼的同源臂的一个中提供突变等位基因序列来实现。技术人员可基于非期望的等位基因上的突变的大小和特征，确定用于在常染色体的突变体等位基因的位置或附近同源重组和插入构建体的同源臂的长度和含量。因此，基于例如美国专利号9,670,458的教导(其通过引用并入)，将容易地认识到如何设计在构建序列侧翼的同源臂。

有利地，基于在常染色体对的一个常染色体上但不在另一染色体上表达的各种期望的和非期望的特征和性状，本发明的基本概念可适用于各种应用。

例如，在一对常染色体中的一个中差异地表达的任何特征或性状都可用于本发明的方法中，以在包含所述靶常染色体的精细胞中表达包含UTR束缚转录物的转录物和/或细胞骨架束缚蛋白，当在精细胞中表达时，束缚转录物和/或束缚蛋白造成精细胞的存活、活力和/或精子进展性的失败或精细胞的卵子穿透的失败，从而预防和/或抑制非期望的特征或性状向后代的传播。

将含有束缚UTR的转录物靶向至性染色体或常染色体可通过本领域已知的同源重组技术和/或基因编辑技术实现。同源重组技术和基因编辑技术的领域中的技术人员容易认识到对于在非期望的靶等位基因和野生型等位基因之间不同的核苷酸的阈值数量的要求，以便能够确保通过本发明的构建体特异性靶向所述靶等位基因。因此，本发明的方法可用于替代或编辑性状，其包括但不限于由缺失、插入或多核苷酸突变造成的性状。

用于将外源核酸分子引入至动物的性染色体中的方法是本领域已知的。先前已经鉴定了特别地位于X染色体和Y染色体上的基因(参见，例如，美国专利号：5,595,189；5,700,926和5,763,166，其通过引用并入本文)。

在优选的实施方式中，本发明提供了将遗传构建体插入至动物的性染色体中的方法，该插入的构建体包括至少一个基因，其可通过例如诱导细胞凋亡来破坏包含靶性染色体精子的精细胞。

为了影响发育中的精细胞中转基因的特异性表达，转基因的表达必须受精子特异性控制序列的控制。这种控制序列可通过转录控制机制或翻译控制机制影响精子中的特异性表达。

在优选的实施方式中，控制序列是精细胞特异性启动子，其仅在减数分裂后的精细胞中特异性影响转录。已经鉴定出了许多这种启动子，在本发明中可使用其中任何一种来实施本发明的方法并且影响减数分裂后精子中转基因的特异性表达。

用于本发明的启动子可为在晚期精子发生中有活性的任何启动子，但是优选仅在晚期精子发生中具有强表达的启动子，以避免在其他组织中的影响。因此，可使用特异性针对减数分裂后精子的基因的任何启动子。

在优选的实施方式中，启动子是特异性针对顶体、鞭毛或晚期表达的鞭毛马达的强表达基因的启动子。例如，实践本发明的合适的启动子包括但不限于下述启动子：精子线粒体维持基因Spata19启动子、精子尾部的外致密纤维3b(Odf3b)启动子、精子尾部的外致密纤维1(Odf1)启动子、精子尾部的外致密纤维3(Odf3)启动子、鱼精蛋白启动子、TNP-1启动子、精子线粒体相关的富含半胱氨酸的蛋白(smcp)启动子、cKIT基因第十六个内含子内的睾丸特异性启动子、味觉受体1型成员3(Tas1r3)启动子、味蛋白α-3链(Gnat3)启动子以及调节特异性针对顶体、鞭毛或晚期表达的鞭毛马达的基因的表达和/或在减数分裂后精子中强烈表达的基因的表达的任何其他启动子。此外，本领域技术人员可容易地认识到基于对这种启动子的要求的本公开，在未来技术中描述的启动子可用于实施本发明。

在一些实施方式中，驱动包含靶染色体的精子中凋亡诱导基因的表达的启动子是在精母细胞之间的物理相互连接消退时在精子发生发生的晚期中有活性的启动子，并且凋亡诱导基因的表达的影响限于其中表达各自凋亡诱导基因的精细胞。

在一些实施方式中，当本发明的方法包括固定包含不需要的染色体的精子时，可使用如上列举的类似的启动子。然而，因为在这些实施方式中低表达和限于精子发育后期的表达不太重要，所以可使用在成熟精原细胞中有活性的启动子，包括通用启动子。

在一些实施方式中，在本发明的这种实施方式中有用的通用启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β肌动蛋白启动子、泛素启动子、JeT启动子、SV40启动子、β球蛋白启动子、延伸因子1α(EF1-α)启动子、Mo-MLV-LTR启动子、Rosa26启动子及其任何组合。基于本申请的教导以及所公开的对在精子发育中的特定阶段期间的启动子功能的要求，用实验方法确定用于实践本发明方法的最佳启动子在技术人员的能力范围内。因此，本领域中鉴定为在精子发育中的特定阶段期间有活性的任何另外的启动子可用于实施本发明，并且在本领域技术人员的能力范围内。

在最优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的启动子是精细胞特异性启动子，其在精原细胞中高度活跃，在精子发育中的早期阶段不具有活性或具有最低限度的活性，并且在整个身体的任何其他组织中无活性。

在精细胞中从本发明的构建体，包括UTR束缚的转录物构建体和/或包括具有膜插入序列的蛋白质的构建体，表达的蛋白质包括在哺乳动物中造成弱精子症的任何蛋白质。

造成弱精子症并且可用于本发明的蛋白质包括但不限于SUN5的突变形式、包括Sept4和Septl2的几种Septin、包括CATSPER1和CATSPER2的突变形式的阳离子通道精子相关的(CATSPER)突变、突变体阴离子转运蛋白SLC26A8、突变体Spata16、突变体PLCZ1、突变体DPY19L2、突变体Gpx4、突变体Hook1、突变体Prrs21、突变体Oaz3、突变体Cntrob、突变体Ift88。可用于实施本发明的蛋白质具有内源膜插入序列或经基因工程改造以具有膜插入序列。

可用于本发明的更多的蛋白质包括Y连锁的泛素特异性肽酶9(USP9Y)、Y上的Dead箱(DBY)、Y连锁的泛素转录的三角形四肽重复基因(UTY)、赖氨酸特异性脱甲基酶5D(KDM5D)、Y连锁的真核翻译起始因子1A(EIF1AY)、核糖体蛋白S4 Y同种型2(RPSAY2)、染色体Y可读框15A和15B(CYORF15A和CYORF15B)、Y连锁的XK、Kell血型复合物亚基相关的(XKRY)、Y连锁的热休克转录因子(HSFY)、Y连锁的RNA结合基序蛋白(RBMY1)、Y连锁的PTPNl3样(PRY)、Y连锁的染色质域Y(CDY)、Y连锁的碱性蛋白Y2(BPY2)、无精子症缺失(DAZ)、Y连锁的假基因1硫酸软骨素蛋白聚糖4样(CSPG4LYP1)和Y连锁的高尔基体自身抗原高尔基体蛋白亚家族a2样1(GOLGA2LY1)。

在优选的实施方式中，本发明的转基因是显性阴性突变基因，其编码对野生型等位基因起拮抗作用的改变的基因产物。例如，本发明的显性阴性突变基因可为显性阴性SUN5、显性阴性突变Sept4、显性阴性Sept12、显性阴性CATSPER1、显性阴性CATSPER2、显性阴性SLC26A8、显性阴性Spata16、显性阴性PLCZ1、显性阴性DPY19L2和/或Gpx4的显性阴性形式、显性阴性形式的Hookl、显性阴性形式的Prrs21、显性阴性形式的Oaz3、显性阴性形式的Cntrob、显性阴性形式的Ift88。

对本发明的方法的实践有用的是涉及凋亡的任何基因，包括已经开发为通过施用活化剂而诱导凋亡的基因。

在一些实施方式中，本发明的方法包括在非期望的性染色体上表达转基因，以迫使包含所述非期望的性染色体的精细胞来细胞自杀或程序性细胞死亡。适于实践本发明方法的自杀转基因包括但不限于疱疹病毒胸苷激酶/阿昔洛韦或更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶、胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖转移酶系统、水痘-带状疱疹胸苷激酶系统、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)系统、羧肽酶A和羧肽酶G2系统、β-半乳糖苷酶系统、硝基还原酶系统、肝细胞色素P450-2B1系统、修饰的CYP4VB1蛋白系统、显性阴性MYC干扰蛋白系统、碱性磷酸酶系统、青霉素-V酰胺酶系统、胸苷酸激酶/叠氮胸苷系统、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9系统。该列表仅是示例性的，并且开发用于诱导靶细胞凋亡的任何自杀基因都可用于实践本发明的方法。

在进一步的实施方式中，其他增强转录、翻译和/或选择的元件，例如内含子、聚腺苷酸化序列、标记组等，可存在于本发明的转基因构建体中。本领域技术人员可容易地认识到这些元件的有利功能，并且可容易地在本发明的构建体中包括各自元件。

在优选的实施方式中，本发明提供了可用于产生单性精液的非人转基因动物。

如本文使用的单性精液意味着精液制剂由至少80％的包含期望的性染色体的精细胞构成。例如，单性精液可由至少80％的包含X染色体的精细胞构成或单性精液由至少80％的包含Y染色体的精细胞构成。单性精液可包含低的约80％的单一期望的性染色体的精细胞至高的约100％的单一期望的性染色体的精细胞。此外，单性精液包括约81％至约99％；约82％至约98％；约83％至约97％、约84％至约96％、约85％至约95％、约86％至约94％、约87％至约93％、约88％至约92％或约89％至约91％的包含单一期望的性染色体的精细胞。

在优选的实施方式中，本发明提供了产生单性精液，即包含至少80％的含有X染色体的精细胞或至少80％的含有Y染色体的精细胞的精液的非人转基因动物。

在具体的实施方式中，本发明提供了用于产生缺少特定染色体的高纯度精子的材料和方法。

术语“纯度”或“高纯度”的使用应理解为包含特定分化特征或期望的特征组合的分离的精细胞群体的百分比。例如，在基于包含X染色体而不是Y染色体而分离精细胞群体的情况下，具有至少60％纯度的包含X染色体的精细胞群体包括其中至少60％的个体精细胞包含X染色体，而40％的精细胞群体包含Y染色体的精细胞的群体。

高纯度精液组合物可具有低的约60％至高的约79％的包含单一期望的性染色体的精细胞。例如，高纯度精液可具有约61％至约78％、约62％至约77％、约63％至约76％、约64％至约75％、约65％至约74％、约66％至约73％、约67％至约74％、约68％至约73％、约69％至约72％、约70％至约71％的包含单一期望的性染色体的精细胞。

使用本发明的材料和方法产生的精液可用于在自然繁殖、雌性的人工授精、卵母细胞的体外受精或精细胞的胞浆内注射等期间使卵母细胞受精，以产生子代。术语“子代”指的是直接后代或后辈(descendant)，即后代的后代。

通过本发明的方法产生的精细胞可包括来自任何哺乳动物物种的雄性的精细胞，包括但不限于来自人和动物，比如牛科动物、马科动物、羊属动物、犬科动物、猫科动物、山羊、猪、灵长类动物以及鲜为人知的哺乳动物，比如大象、鹿、斑马、骆驼或条纹羚的精细胞。该动物清单旨在作为从其可常规地获得精细胞的多种动物的实例。

如本文使用的，术语“表达构建体”指的是核酸序列的组合，其提供可操作地连接的核酸序列的转录。本发明的表达构建体通常还包括在表达构建体待在其中表达的预期宿主细胞中起作用的调控元件。因此，本领域普通技术人员可选择用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和聚腺苷酸化元件。

如本文使用的，术语“可操作地连接”指的是所描述的组件的并列，其中组件是允许它们以它们预期方式起作用的关系。通常，可操作地连接的组件是邻接的关系。可操作地连接至编码序列的序列可能能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导编码序列的转录时，该编码序列可操作地连接至启动子。

“编码序列”或“编码区”是转录成mRNA和/或翻译成多肽的多核苷酸序列。例如，编码序列可编码感兴趣的多肽。编码序列的边界由在5’端的翻译起始密码子和在3’端的翻译终止密码子确定。

如本文使用的，术语“启动子”指的是可操作地连接至待转录的核酸序列，比如编码期望的分子的核酸序列的DNA序列。启动子通常被放置在待转录的核酸序列的上游，并且提供被RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。在具体的实施方式中，启动子通常被放置在被转录以产生期望的分子的核酸序列的上游，并且提供被RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。

除启动子外，可包括一个或多个增强子序列，比如，但不限于巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和SV40增强子元件。另外包括的序列是内含子序列，比如β珠蛋白内含子或通用内含子、转录终止序列和mRNA聚腺苷酸化(pA)序列，比如，但不限于SV40-pA、β-球蛋白-pA、人类生长激素(hGH)pA和SCF-pA。

如本文使用的，术语启动子的“趋异取向”指的是两个或多个启动子在核酸分子上的定位，使得从每个启动子起始的转录在核酸分子上以相反的方向进行。趋异取向的同义词是趋异偶联启动子和以相反方向取向的启动子。

术语“聚腺苷酸(polyA)”或“p(A)”或“pA”指的是发出转录终止和mRNA聚腺苷酸化信号的核酸序列。聚腺苷酸序列的特征在于六核苷酸基序AAUAAA。常用的聚腺苷酸化信号是SV40 pA、人生长激素(hGH)pA、β-肌动蛋白pA和β-珠蛋白pA。序列的长度可在32bp至450bp的范围内。可使用多个pA信号。

如本文使用的术语“核酸”指的是具有以包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸的任何形式的多于一个核苷酸的RNA分子或DNA分子。

术语“核苷酸序列”用于指的是在单链形式的核酸中，寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的顺序。

术语“表达”指的是核酸序列的转录以产生相应的mRNA和/或mRNA的翻译以产生相应的蛋白质。可使用众所周知的方法，重组产生或合成产生，或通过DNA合成产生本发明的表达构建体。

如本文使用的术语“调控元件”指的是控制可操作地连接的核酸序列的表达的一些方面的核苷酸序列。示例性的调控元件说明性地包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、聚腺苷酸化信号(pA)、启动子、转录终止序列和上游调节结构域，其有助于核酸序列的复制、转录、转录后加工。本领域普通技术人员仅仅用常规实验能够选择这些和其他调控元件并且在表达构建体中使用这些和其他调控元件。

在一个实施方式中，本发明的构建体包括内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方式中，表达构建体包括kozak共有序列。

术语“核苷酸”指的是具有一个或多个以酯键连接至糖部分的磷酸基团的核苷。示例性核苷酸包括一磷酸核苷、二磷酸核苷和三磷酸核苷。本文中可互换地使用术语“多核苷酸”和“核酸分子”并且指的是通过5’和3’碳原子之间的磷酸二酯键连接在一起的核苷酸的聚合物。术语“核酸”或“核酸序列”涵盖基因组的或合成来源的寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或这些的任何片段、DNA或RNA，其可为单链或双链的并且可以代表有义链或反义链、肽核酸(PNA)或任何天然或合成来源的DNA样或RNA样材料。如本领域技术人员将理解的，当核酸是RNA时，脱氧核苷酸A、G、C和T分别被核糖核苷酸A、G、C和U替换。

如本文使用的，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”通常指的是核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”通常指的是脱氧核糖核苷酸的聚合物。可天然合成DNA和RNA分子(例如，分别通过DNA复制或DNA的转录)。RNA分子可被转录后修饰。也可化学合成DNA和RNA分子。DNA和RNA分子可为单链的(即，分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如，双链的，即分别为dsRNA和dsDNA)。然而，基于本发明的性质，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”还可指的是主要包括(即，大于80％或优选地大于90％)核糖核苷酸，但是任选地包括至少一种非核糖核苷酸分子，例如，至少一种脱氧核糖核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物的聚合物。

术语“摆动的”基因序列通常指的是仅编码三核苷酸的氨基酸的第三碱基已改变的核酸序列，使得由三核苷酸编码的氨基酸没有改变，并且，因此，编码的蛋白质序列没有改变，但是编码蛋白质的核酸序列是不同的。编码氨基酸的核酸序列的第三核苷酸的交换可防止和/或抑制例如siRNA和/或shRNA与核酸序列的结合，并且因此可防止和/或抑制siRNA和/或shRNA介导的基因表达的抑制。

术语“膜插入序列”或“膜插入结构域”通常指的是有助于将蛋白质或蛋白质的一部分插入至细胞膜中的蛋白质序列或结构域，其中细胞膜可为质膜或细胞内细胞器的膜。确定哪些蛋白质序列是膜插入序列，并且因此可用于本发明的实践在本领域普通技术人员的能力范围内。

术语“非翻译区”或UTR通常指的是未翻译成蛋白质的任何核酸序列。在本发明的构建体的上下文中，UTR包括介导RNA束缚至细胞的细胞骨架结构的UTR。例如，本发明的UTR可将转录物束缚至其中存在含有UTR的转录物的细胞的任何细胞骨架结构。确定哪些UTR序列将转录物束缚至细胞的细胞骨架结构以及所述UTR将转录物束缚至哪些细胞骨架结构在本领域普通技术人员的能力范围内。将任何转录物束缚在精细胞中存在的任何细胞骨架结构上的任何UTR可用于实践本发明。

实施例

实施例1：确定抑制TAS1R3和GNAT3表达的siRNA。

对于分别位于小鼠染色体4和5上的TAS1R3和GNAT3缺失的杂合的小鼠，从不将缺少这两个基因的精子传给它们的后代。这些基因对于精子进展性，即找到卵子是必需的。这表明这些基因的RNA不像大多数RNA那样通过胞质桥或细胞内通道在发育中的精子之间共享，并且所得蛋白质也不像大多数蛋白质那样在发育中的精子之间共享。

为了实现其中不传递任意染色体的转基因动物的目标，必须使用插入在所述染色体上其他位置的遗传构建体抑制TAS1R3和GNAT3。通常，基因的抑制可使用显性阴性方法或siRNA。使用本领域已知的标准技术确定针对TAS1R3和GNAT3的有效siRNA，并且产生包括在POL III启动子下的TA1R3和GNAT3 siRNA的构建体。这些小鼠用于确定防止和/或抑制携带构建体的染色体的传播。

实施例2：Gnat3/Tas1r3双基因敲除小鼠。

为了确定味觉化学受体Gnat3和Tas1r3对传播比率失真的影响，先前已经产生了敲除Gant3和Tas1r3基因之一或两者的小鼠¹。表1示出单基因敲除和双基因敲除对雌性和雄性传播的影响¹。尽管在雌性传播中预测的传播百分比和观察到的传播百分比大致相同，但是考虑到不同的杂交繁殖中25％和50％的预测的雄性传播，Gnat3和Tas1r3的双基因敲除导致0％的雄性传播。这些结果证实了缺少Gnat3和Tas1r3两者的精子不能找到卵子，并且因此不能受精。

表1.传播比率失真

从(1)重现的

实施例3：Pol III启动子Tas1R3/Gnat3 shRNA进展性传播比率失真(TRD)小鼠。

为了防止和/或抑制任意染色体的传播，设计了敲低Tas1R3基因或Gnat3基因或两者的表达的遗传构建体，该构建体可插入至任何染色体中，并且将防止和/或抑制携带具有遗传构建体的染色体的精子成功受精。在一个实施例中，构建体包括驱动Tas1R3和Gnat3的shRNA的U6 pol III启动子。pol III启动子可包括但不限于U6启动子和H1启动子。优选地，在单个构建体中使用Tas1R3和Gnat3各自的两个shRNA，以便确保>90％的敲低。从U6启动子表达的shRNA的使用是本领域已知的，并且已经显示在活小鼠中是成功的。重要的是，本领域还已知shRNA在精子发生中仍起作用。产生了第一构建体，其包括依次排列的启动子/shRNA单元，所述启动子/shRNA单元包括两个单元的可操作地连接至Tas1R3 shRNA的U6启动子和终止子和两个单元的可操作地连接至Gnat3 shRNA的U6启动子和终止子；以及位于每个U6启动子/shRNA单元之间的多个克隆位点和在构建体每个末端的多个克隆位点(图1A)。该构建体也可使用H1启动子产生，以替换至少一个U6启动子或替换所有的U6启动子。

产生了第二构建体，其包括可操作连接至Tas1R3 shRNA和Gnat3shRNA的U6启动子或H1启动子的趋异取向的启动子/shRNA单元(图1B)。在该构建体中，两个Tas1R3 shRNA分别可操作地连接至U6启动子或H1启动子，使得来自U6启动子或H1启动子的转录朝向彼此进行，并且Tas1R3 shRNA用作彼此的终止子序列。类似地，两个Gnat3 shRNA分别可操作地连接至U6启动子或H1启动子，使得来自U6启动子或H1启动子的转录朝向彼此进行，并且Gnat3shRNA用作彼此的终止子序列。

将描述的构建体插入至任意染色体中允许防止和/或抑制由包含这种染色体的精子介导的受精事件，因此防止和/或抑制所述染色体向后代的传播。

来自图1B的构建体用于通过在FVB/N菌株背景上进行前核注射，将该构建体插入至单个随机常染色体中，来产生转基因小鼠。由单一雄性创始者培育的多个野生型雌性的多窝中出生了总共66只活的小鼠后代。结果显示，在66只后代中的62只对于靶向防止传播的染色体是阴性的，证明了94％(62/66)的传播比率失真(TRD，表2)。使用对于插入序列特异性的两个定量PCR引物组和用于基因组DNA的对照组进行转基因的测试，以证明阴性结果不是由于DNA的缺失或PCR的失败。

表2.Pol III启动子Tas1r3/Gnat3 shRNA进展性小鼠后代的传播比率失真

合起来，结果表明，亲本转基因小鼠中的Tas1r3/Gnat3 shRNA成功地防止了靶向的染色体向后代的传播。轻微的瑕疵(94％而不是100％)可能是因为随机的插入位点，而不是方法学固有的。

实施例4：拯救的Pol III启动子Tas1R3/Gnat3 shRNA进展性传播比率失真(TRD)小鼠。

为了防止和/或抑制与横跨胞质桥的shRNA相关的任何影响，产生了包括遗传构建体的非人转基因动物，该遗传构建体包括例如用于Tas1r3和Gnat3或两者的shRNA，并且另外包括包含通过将第三碱基摆动引入至Tas1r3基因和/或Gnat3基因的编码序列中而对各自shRNA产生抗性的Tas1r3基因和/或Gnat3基因的拯救元件。

因此，可以通过插入在它们的天然启动子下使用Tas1R3基因或Gnat3基因但是具有摆动的第三碱基的表达盒，因此shRNA不再识别Tas1R3和Gnat3基因序列，来完成Tas1R3和/或Gnat3的拯救。在该情况下，只有那些携带构建体的精子将是能生育的，因为摆动的Tas1R3基因和Gnat3基因免于受shRNA的抑制。

在一种遗传构建体中，使用Gnat3是因为Gnat3的启动子和5’UTR跨物种是非常保守的，在小鼠、人和牛之间具有～80％的同一性。

图2A中示出了包括编码Gnat3 mRNA的核酸序列的遗传构建体，其中改变了内源Gnat3 mRNA序列上包括shRNA的结合位点的核苷酸，以防止和/或抑制外源Gnat3 shRNA结合和抑制共表达的外源Gnat3 mRNA。在该系统中，Gnat3 shRNA仅结合和抑制内源Gnat3mRNA，而不能结合或抑制外源地添加的摆动的Gnat 3mRNA。外源Gnat3序列包括束缚RNA的UTR，并且编码的Gnat3蛋白包括蛋白膜插入序列，以将拯救限于携带外源构建体的那些精细胞。

产生了构建体，其包括可操作地连接至摆动的Gnat3基因和聚腺苷酸序列的Gnat3启动子(图2A)。产生了另一种构建体，其包括可操作地连接至摆动的Gnat3基因和SV40聚腺苷酸序列的Gnat3启动子(图2B)。

每个Gnat3启动子-摆动的Gnat3基因构建体与图1A的依次排列的U6启动子/Tas1R3 shRNA和U6启动子/Gnat3 shRNA的构建体或图1B的趋异连接的U6启动子或H1启动子/Tas1R3 shRNA和U6启动子或H1启动子/Gnat3shRNA构建体结合。

有利地，使用图2A和图2B的构建体产生的转基因小鼠可将从包括摆动的Gnat3基因的构建体表达Gnat3蛋白，因为从结合的构建体共表达的Gnat3 shRNA不能结合从摆动的Gnat3基因序列转录的mRNA，并且因此不抑制由摆动的Gnat3基因编码的Gnat3蛋白的表达。

包括但不限于U6启动子和H1启动子的本发明的构建体的Pol III启动子是可互换的，使得附图的构建体中的每个U6启动子可用例如H1启动子替换并且每个H1启动子可用例如U6启动子替换。此外，构建体可在每个启动子/shRNA元件之间以及在启动子/shRNA元件与Gnat3启动子-摆动的Gnat3元件之间包含多个克隆位点。

另外，可保留Gnat3基因的3’端以维持其中存在的小内含子，以改进翻译。

实施例5：具有插入Y染色体中的重组位点的小鼠。

为了将遗传构建体插入至Y染色体中，生成了将特定重组位点在期望的位点引入至小鼠基因组的Y染色体中的构建体。这些小鼠可用于通过核前注射引入本发明的任何构建体以及整合酶，并且产生其中特异性不传递Y染色体的动物。

用于快速位点特异性整合的技术是本领域中已知的，并且例如商业上由AppliedStemCell提供。

基于以下标准选择整合至Y染色体中的位点：(1)位点的转录活性，即在单细胞胚胎阶段期间开放染色质和(2)转录活性，即在晚期精子发生期间开放染色质。

使用的一个位点是Dby(也称为Ddx3y)附近的位点，其基因的RNA以高丰度出现在雄性胚泡中和精原细胞中。重要的是，Dby仅在雄性胚泡而不在雌性胚泡中表达，因此，Dyb不可能通过精子携带至胚泡。

实施例6：Gnat3启动子和UTR与SLC26a8显性阴性基因结合。

Slc26a8是精子中囊性纤维化传导调节因子(CFTR)所需的辅助因子，但不是CFTR表达的其他位点。Slc26a8是仅在晚期精细胞中表达的膜插入蛋白，并且是精子活力所需的(2)(参见，例如，图3，从(2)重现的)。在缺少Slc26a8的情况下，因为能量产生的问题，精子不能移动。已知显性阴性的Slc26a8造成人不育。产生的构建体包括可操作连接至Gnat3 5’UTR的Gnat3启动子、Slc28a8显性阴性基因和包含内含子的t-复合物应答器(TCR)3’UTR，随后是SV40聚腺苷酸(图4A)。产生的进一步的构建体包括可操作连接至Gnat3 5’UTR的Gnat3启动子、Slc28a8显性阴性基因和聚腺苷酸，随后是围绕CMV启动子-GFP盒的loxP位点，并且整个构建体嵌入在构建体的同源臂5’和3’之间，以确保能够将构建体引入至染色体中以产生非人转基因动物(图4B)。在CMV启动子-GFP盒周围包括loxP位点允许通过施用如本领域中已知的Cre重组酶去除该盒。

来自图4A的构建体用于在FVB/N菌株背景上通过前核注射，将该构建体插入至单个随机常染色体中，来产生转基因小鼠。由单一雄性创始者培育的两种野生型雌性两窝出生了总共17只活的小鼠后代。结果显示，在17只后代中的16只对于靶向防止传播的染色体是阴性的，证明了94％(16/17)的传播比率失真(TRD，表3)。使用对于构建体特异性的两个定量PCR引物组和用于基因组DNA的对照组进行转基因的测试，以证明阴性结果不是由于DNA的缺失或PCR的失败。Gnat3 RNA束缚在图4C中示出，并且SLC26a8蛋白束缚在图4D-图E中示出。使用RNAScope，使用对由构建体产生的RNA特异性的探针，检测图4C中的RNA束缚(探针仅与构建体匹配和杂交，并且不与内源SLC26a8匹配和杂交)。使用连接至构建体蛋白质的末端的3X标志检测了图4D中的蛋白质束缚；这也在图4E中示出了成熟的精子内的定位，定位至SLC26a8突变的有害作用的中间扭结特征。

表3.Gnat3启动子和UTR组合SLC26a8显性阴性基因小鼠后代的传播比率失真

由独立的生育专家对从具有SLC26a8显性阴性基因的转基因小鼠的附睾提取的精子评估了活力精子的比例。如在图4F中示出，与野生型相比，在具有SLC26a8显性阴性基因的转基因小鼠中观察到精子活力的显著降低。还观察到具有SLC26a8显性阴性基因的转基因小鼠的精细胞在中段具有特征性的结构缺陷。

合起来，结果表明，亲本小鼠中的Gnat3-SLC26a8显性阴性转基因通过RNA和蛋白质束缚成功地防止了靶向的染色体向后代的传播。

实施例7：T-复合物应答器(TCR)启动子5’和3’UTR组合Slc26a8显性阴性基因。

因为TCR系统是研究最深入的传播比率失真模型，使用TCR启动子和TCR 5’UTR和3’UTR来测试当引入至转基因动物中时，束缚系统是否起作用。用于TCR的基因Smok1不存在于非啮齿动物中。因此，使用了Smok2b基因，野生型小鼠中的Smok1基因由其衍生，并且与Smok1基因具有高的序列同一性。

生成的构建体包括以下Smok2b/TCR元件：起始密码子的上游～2kb启动子序列、～500bp 5’UTR和～350bp 3’UTR，有～500bp内含子天然出现在3’UTR中。Slc26a8显性阴性基因可操作地连接至～2kb Smok2b/TCR启动子序列，并且聚腺苷酸位点在3’UTR之后(图5)。另外，在构建体的每个末端以及3’UTR和聚腺苷酸位点之间引入多个克隆位点。

实施例8：Odf1启动子和TCR 5’UTR和3’UTR组合Slc26a8显性阴性基因。

因为Odf1在精子发生的非常晚期极其强烈地表达，并且其启动子应该保留有效束缚所需的任何定时效应。产生了与图5的构建体类似，但是包括Odf1启动子而不是TCR启动子的构建体。该构建体允许确定束缚作用是否在UTR或启动子中。

实施例9：通过RNA束缚至细胞骨架结构来防止和/或抑制RNA转移。

包括编码t-复合物应答器(TCR)蛋白的Smok基因元件的遗传构建体，当引入至非人转基因动物的染色体中时，防止和/或抑制转录物通过胞质桥转移至邻近的精细胞(3)。使用的构建体包括TCR启动子、可操作地连接至TCR基因的873bp的特异性5’UTR和myc标签。用针对TCR和myc标签的抗体染色的野生型和转基因动物的输精管的组织学横截面证明了野生型动物的生精小管的所有精细胞中普遍存在TCR，但是myc标签的存在限于转基因动物的生精小管中存在的特定精细胞(图6，从(3)重现的)。

实施例10：延迟翻译直到精细胞之间的胞质桥不再存在。

包括编码t-复合物应答器(TCR)蛋白的Smok基因元件的遗传构建体，当引入至非人转基因动物的染色体中时，证明了myc标签限于特定精细胞(3)。使用的构建体包含TCR启动子、可操作地连接至TCR基因的943bp的特异性5’UTR和myc标签。当用针对myc标签的抗体染色时，野生型和转基因动物的输精管的组织学横截面证明了myc标签的存在限于在转基因动物的生精小管中存在的特定精细胞，而野生型动物中不存在myc标签(图7，从(3)重现的)。

构建了包括Gnat3 5’UTR而不是TCR 5’UTR的进一步遗传构建体。有利地，使用包括TCR 5’UTR和Gnat3 5’UTR两者的构建体出现了翻译的延迟。

统计分析：值显示为所示的平均值±平均值的标准误差。使用非参数Mann-Whitney U检验分析组之间的差异。如果P值<.05，则认为实验是统计学上显著的。使用Prism 5.0软件执行16s rDNA数据以外的计算。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，通过引用以其整体，包括所有附图和表格，并入本文，至它们与本说明书的明确教导不发生矛盾的程度。

应当理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，并且鉴于其各种修饰或改变将被提示给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围内。

实施例11：山羊Gnat3启动子和5’UTR结合山羊SLC26a8显性阴性基因。

产生包括山羊Gnat3启动子和5’UTR的元件结合山羊SLC26a8显性负性基因的遗传构建体，以防止和/或抑制山羊中任意染色体的传播。如图8A和SEQ ID NO.1中示出，构建体依次地包括：核苷酸1-23CRISPR位点、24-1079左臂(与山羊Y染色体匹配)、1080-1087NotI位点、1088-1121FRT位点、1122-2811山羊Gnat3启动子和5’UTR(束缚区)、具有使显性阴性的E至K突变的2812-5750山羊Slc26a8、5751-5996Spam1 3’UTR、5997-7166兔β珠蛋白聚腺苷酸序列(包括最后一个内含子)、7167-7200FRT位点、7201-7206限制酶切位点、7207-8343右臂(与山羊Y染色体匹配)和8344-8366CRISPR位点。图8B通过多序列比对示出在小鼠、人、猪、山羊和牛之中，由此鉴定的E至K SLC26a8氨基酸突变是保守的。不希望受到任何理论的约束，推测由此鉴定的E至K突变使得在所有胎盘哺乳动物中SLC26a8为显性阴性的。

将该构建体插入至任意山羊染色体中允许防止和/或抑制由包含这种染色体的山羊精子介导的受精事件，因此防止和/或抑制所述染色体向山羊的后代的传播。

实施例12：来自小鼠、人、牛和山羊的Gnat3 5’UTR序列的比对。

进行来自山羊(SEQ ID NO.1的核苷酸1122-2811)、小鼠(SEQ ID NO.2)、人(SEQID NO.3)和牛(SEQ ID NO.4)的Gnat3 5’UTR序列的序列比对。成对比对在图9A(牛-小鼠比对)、图9B(牛-人比对)和图9C(山羊-小鼠比对)中示出。出乎意料地和值得注意地，Gnat35’UTR序列在牛、小鼠、人和山羊之间显示出很高的序列同源性，在牛-人成对比对中具有高达79％的同一性(图9B)。该发现是意想不到的，因为非编码区通常跨物种不是很保守。不希望受到任何理论的约束，推测Gnat3 5’UTR序列在应用本发明的方法的所有胎盘哺乳动物中是高度保守的。

参考文献

1.Mosinger B,Redding KM,Parker MR,Yevshayeva V,Yee KK,Dyomina K,Li Y,Margolskee RF.Genetic loss or pharmacological blockade of testes-expressedtaste gene causes male sterility.Proc Natl Acad Sci U S A.2013Jul23；110(30):12319-24.doi:10.1073/pnas.1302827110.Epub 2013Jul 1.PubMed PMID:23818598；PubMed Central PMCID:PMC3725061。

2.Product information:anti-SLC26A8 antibody produced in rabbit.Sigma-Aldrich.Catalog number HPA038081。

3.Veron N,Bauer H,Weisse AY,Luder G,Werber M,Herrmann BG.Retention ofgene products in syncytial spermatids promotes non-Mendelian inheritance asrevealed by the t complex responder.Genes Dev 2009；23:2705-10。

序列表

<110> Ag遗传学股份有限公司

<120> 用于防止特定染色体的传播的材料和方法

<130> 18612-20009.42

<140> 还未分配

<141> 2019-02-26

<150> PCT/US2019/019655

<151> 2019-02-26

<150> US 62/635,270

<151> 2018-02-26

<160> 9

<170> Windows版本4.0的FastSEQ

<210> 1

<211> 8366

<212> DNA

<213> 山羊(Capra hircus)

<400> 1

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ccttctatga gaactataac agatccttga gttcggtggc atctgtaact ttgctaactg 3420

ggattattca gctgtctatg ggcatgttag gttttggctt cattgtcact tacattccgg 3480

aggctgcaat cagtggttac ctggctgcca cagccctgca cattatgctg tcccagttga 3540

cctgcatctt cggagttatg atcagttaca attctggtcc catcgccttc ttctacaaca 3600

taattaacta ctgtttaggt ctccctaaag ctaattccac cagcatctta ctatttctaa 3660

ccactattgt tgctctgaga atcaacaaat gtatcagaat ttccttcaat cagtatccca 3720

ttgaatttcc catggaaatt tttctgatcc ttggctttgc tgcattttca aacaaggtaa 3780

acatggccac ggaaaacagc ctgatgctca ttgagatgat accttacagc ttcctgtttc 3840

ctgtaacgcc agatatgagc aatcttactg aagttcttgc agaatcgttc tccttagctt 3900

tagtgagctc gtttttgctc atatttctgg gcaagaagat tgccagtttc cataactatg 3960

acgtcaattc caaccaggat ttaatagcca ttggcctttg caatgtcgtc agttcatttt 4020

tcagatctta tgtgtttact ggtgctgttg ccaggaccat tattcaggat aaaactggag 4080

gaagacaaca gtttgcatct ctggtaggcg caggcctcat gctgctcctg atgatgaaga 4140

tggcacactt tttctacaaa ctgccaaacg ctatagtggc tggtattatc ctgagtaacg 4200

tcctacccta ccttgaagtt gtttacaccc tacccagtct gtggaggcag aaccagtatg 4260

actgtctcat ttggatggtg acgttcatgt ctgcaatttt actgggactg gatattggac 4320

tagtcgttgc agtaactttt gccttcttca tcatcactgt tcagtcacac agaactaaga 4380

ttctcctcct gggtcagatc cctaacacca atatttatag aagcttccaa gactatcggg 4440

aggttgcaaa cattccaggg gtgaagatct tccagtgctg caacgccatc acatttgtca 4500

atgtccacta cctcaagcgc aaggtgttag aggagattga aatggtaaag atgcctctta 4560

cagacgagga aatttatacc ctgttcagtc caaatgaaga gggcgcacag cgaggaaaga 4620

tttgccggtg ttactgcaac tgtgatgaac cagagccatc gcccagggtt atttacacag 4680

aacgatatga agttcaacgg ggccgagagt cctccttcat taacctggtc cgctgctcac 4740

gttttgagag cgtggacaca ggccaaagta tgtctgaaga ccaagtaccg tacataacat 4800

cttcctcgtc tcagagaaac ccaaactatg aggaggtgga gaaagtctgg ctttctgatg 4860

acccctccag gagcatgacg atcacactcc ctgaggcttc taatactcag gtcagggcta 4920

caaaactcct gccttactca acttcaactg ttctacccag cgtccacacc atcatcttgg 4980

acttctccat ggtacatctt gtggacgcac aggctttggt cgtattaagg cagatgttct 5040

gtgctttcca aaacgtcaac atcttggtgc tcattgcagg gtgtcactct tttgtggtca 5100

ggtcacttga gaagaatgat ttctttgacg ctggcatcac taaggcccag ctgttcctca 5160

ccctccacga cgctgtgctg tttgctttgt caaggaagct gccagagtcc tcggagttaa 5220

gtgtggacga atcaaagacc gtcatacagg aaaccttctc agagacagac aagaaagaag 5280

aatcaagaca taaaacaagc agaagtttta tagaagcccc cagaagtaaa agtccagcct 5340

tctccttact cccagaccca gagatggagg aggaatcaga cttggatctg tattccacga 5400

tacagatgtc taaagaccat gggctggatc tggacctaga cctggatcgt gaggtggagc 5460

ctgagtcaga gctggagcct gaatctgagc tggatcaaga gacagagctc gagcctgacc 5520

cagaggccag tcacaagcca actaggcaga agtactggtc tctgtttagg gctataattc 5580

ccagatcccc aactcacact caggctagga cacagtcggt agacaggagg catcaaaatg 5640

tgaaaccata tacatccaag gctgacacca gtgaggagat cgattataaa gatcatgatg 5700

gcgattataa agatcatgat attgattata aagatgatga tgataaatag attttctcta 5760

cccacagcgt ttgatgtatt attattatta tttttgcagg cctcagtaat ttgggattat 5820

gaatgggatt ctattttacc aaagtaattc aatttttata atcaagattc tatttttgag 5880

tttcaaagag aaattatata ttcttctacc aaagattgat tacaagcaag gctacttagg 5940

gattagtttt ggtttaaaga gaatgaagac tgaataaaat aaaatcacta gaaaattgat 6000

cctgagaact tcagggtgag tttggggacc cttgattgtt ctttcttttt cgctattgta 6060

aaattcatgt tatatggagg gggcaaagtt ttcagggtgt tgtttagaat gggaagatgt 6120

cccttgtatc accatggacc ctcatgataa ttttgtttct ttcactttct actctgttga 6180

caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa ctttttcgtt aaactttagc 6240

ttgcatttgt aacgaatttt taaattcact tttgtttatt tgtcagattg taagtacttt 6300

ctctaatcac ttttttttca aggcaatcag ggtatattat attgtacttc agcacagttt 6360

tagagaacaa ttgttataat taaatgataa ggtagaatat ttctgcatat aaattctggc 6420

tggcgtggaa atattcttat tggtagaaac aactacaccc tggtcatcat cctgcctttc 6480

tctttatggt tacaatgata tacactgttt gagatgagga taaaatactc tgagtccaaa 6540

ccgggcccct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctctt tcctacagct cctgggcaac 6600

gtgctggttg ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcactcctca ggtgcaggct 6660

gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc aatgccctgg ctcacaaata ccactgagat 6720

ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct 6780

ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca 6840

ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag 6900

agtttggcaa catatgccca tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt 6960

catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact 7020

tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa 7080

ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata 7140

gctgtccctc ttctcttatg gagatcgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc 7200

ggtacctcac tttggtgtag tattcgggaa gtgcacaaac gtcaaaatct gacagacatg 7260

cggagctgga gcccaactcc acttcaaatc gctcagtctc agtgacggcg tttgccgtta 7320

agtgcaacga ggagaccaat ctcctctgag gattgtgcca caattcccga aggtggggcg 7380

gttagcctcc cggcacagga aaaaaaaaaa aagcttaccg gaggaaaaaa aaggcggggg 7440

ggggacgggg ggtggagaca gaaacaagag ccattttcct ttacagttca aaacacaggc 7500

acttttatag agcgccggat ccgcacccat tagccgggtt agagacactc cacccgggtg 7560

gtggtggaca aaagagggcc taacagcccc caccccaaca aaaggacgaa gatatactta 7620

acaagctcca gccgctgaat ccctgaggag gtgcggaggg gtggctcctc actgtttaat 7680

gtagggcctt ttacctcaaa aacaaactac gcgacagcga aaggaaatac aaagctcaac 7740

ccccagtacc ggaaaaaaaa ctgccacggc cgagctccgg cctgtagcct gagggaaaaa 7800

ggccctgctc ccaactccac acgttgcggc cctcttacct cttttcttcc gcgcggtggc 7860

gtttctctgt cgttagatgg gctccaggtg gaccgtttct cctgtttaac gtccgcttag 7920

tgctcccgca gctgcggttt caccttttag ggcctggtct cttcaccccg aatctgtcct 7980

agctgccaac accaatacta aaatgagccg ctaacgcggt agtctcccgt aaaggagaag 8040

gcaacacaag cagtcaagct cctgaaaggc ctgggagctg agtgacgctt gaaggggctg 8100

ggctccacaa aaccccttca gggcgggata cgaggccgct ggagttccag aaatcgcttg 8160

ccccggccct cttcaatatg gcggattcag caagccaaaa aaaaacggcc gaaccaccgg 8220

caaccgcgac ggcgcaaact cccaccagcc tcagcgccag tcggagcctc caatatgacg 8280

ccgcgccacg ccgctccgcc ccctcgaagt cccccctctc gactccgcct ccttatcctg 8340

cctccctcag ccataatcac tttggt 8366

<210> 2

<211> 1694

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 2

caaaaccacg tatatccctg tacaaaagca aggggtgtat ttataggggg caaatgacat 60

actatttcct gtcaatcctt tgctggaatg gaacatgcag gaatgtacat gtacatgtgt 120

gcaattcagc ctatgacaca tgtcaaagat gatttagtgt actaagtctt tcattctgag 180

gtggaagcct gtctcctggg ctgatcataa gtaatgtagc aagacagatc tccttccttt 240

gggactagct ctttgcatag taaaagcaat ggcaaatgag tggcacaaag ctttgcatat 300

gtacctctct gagtctttac tcaggatgct ttgactatgt ttagtcttta tcttcagctc 360

aacatattta atgtgcaaaa gtaaacaaag caggaatgag tacttagtct ggtggcccat 420

ttccttgttg tatgaatatt caaaattcca cctgctcaaa cttcacacat gatctctgca 480

aaacagcagt gacagcttga ttagatagtt ttattcaagt attttataat taaatgtact 540

aagacacact acagtgtaag acacacttgc tgttacaggc agatagctgt gtttataaga 600

agaatattgt ttgacagtct actaaatacc ttttgcttca gataaacaaa caaaaaaatg 660

tgtaaaaatc ttctcttccc ttgaggcagc caattttcaa aaatttttag gatgttagta 720

gggtaggtaa aaaattatgg aacatagttg ggtatattta gtattttgat tatcatctga 780

ttatctttga tatttttata tgcttccaaa acattggtcc ttattccgta agtatcaact 840

cagactgtgt acccccaaca caacagctgt tgcttaatgg ccctaaaatg ttaagtgctg 900

tccacattga acacagatca gtgtccatac aaagtaggcc ttcaattacc agtgatggat 960

tgactttcac acaggcagta aaagctcaat tcatagtgat taatcctatg agaataaaaa 1020

tccatgttaa gatactggac ctagaatttt acatttatag ctaaaaaaaa aatgtataaa 1080

tatgtaaatc atgtcctttg ttgctattat ttaaatgttt tctaatttat tgatatatta 1140

agagattctc aatatttgta ccaaccttag aataggcaaa atggaatttg aatagcatca 1200

tgcataatct ttttgaggct aaggggtaat tatgaagaat ctgaaaaaca aagtatttaa 1260

agttaaaaat gcaagtgttt ttgattaata gtaaatacaa taccaataat aaatattttc 1320

tgttggtaag aaacatttca cttgaattgc ccatcacaga ttttctttaa tttcaagatt 1380

ttgaatgctt tccatgtgtt ttgtgctaaa ctctcaggca ggtaagcatg attttgaagg 1440

cgggccagat gtgaccactt aatttaaaag cataatgagt ttcctcttaa gcttccattg 1500

gagttgcatg gtttttcctc ttgatcaggt gacagatgga ctagatcccc ttagtcaaag 1560

cagaattgag agcgcagggg tagctgctgc ctgttgtagc gagcaccgct catatgtcct 1620

atatctaaac tacagctgtg ctccgtgttt gaaaagtttg agcaaatcaa ctgcccagcc 1680

actaacatca aaag 1694

<210> 3

<211> 1634

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

caaatctcct tcctttggga caggcccttt gcattgtaaa agcaatacca catgatttgc 60

acaaatcctt gcctatccac cactgcacat ctttatacta tcataatatg gctttggaag 120

aacggaaccc aggaagtttt gactatgttt atgtatcttc agcctaatat ttttgatgtg 180

gaaaaagtaa acaaagcagg actatgtatt taatctggca gcctattttc ttgttgcatg 240

aatatgtaaa aactcacctg ttcaaacttt gcacatgatc ccacaagaag agcaccactg 300

acaggttggt ggattgactg tattctggca ttttctggtt aagcacattc acaaatccca 360

aaatgcacac tgaaagatgt gccacaggca accgactctg ttcataagga aaatattgat 420

tgactatcta ccaagcactt tatgcttcat ataaataaaa aattgtgcaa cataatctct 480

gccctcaatc ctgaagattt tcaagaagta catggtatct gttggggtag ttgaaagcta 540

tggaacttat ttaggtgtaa ttactgtttt tagtttgtag gaaaaaccaa attacctgct 600

gtttcaaaga acattggttt ttattccctt ggtaccaaat cagtaagagt ccctccagca 660

cagcagctgt tgcttaatgg ccctaaagag ttaatgcgct gcctaaattg aacatagttc 720

agtgtctaca ccaagtgggc cctcaattag tgttgatgga ttgactttct cacaggcggc 780

aaaagctcaa tttatagaga tggatcctat gacactaaaa tcaataattt aagaaaactg 840

tgttgaattt tatatttgta gcaatacaat atgtacaaat ataaaaacta tatgtatttg 900

tatccattgt taaaaaaaag attttttttg ttccctgaca gatgctaata gatgctcaat 960

agctttaagt aataatctaa gcataggtag accataaaag ttggataact tacatgtata 1020

tattctgatt gtgatatagg agtgattata aagaaattga agggccaaat atctgaagat 1080

aagatgtaag catcgctgat tagtaataat aacttttaat cacagtaata aaaattgccc 1140

agtagtgaga aacattctat ttgaattgct tattgtagat catctctagt gtatagattt 1200

tgacaacttt ctacattatt ttatactata aagcagataa gcctgttttc gaagatgtgc 1260

ccgaagcagt catttaattt gaaagcataa tgaacttcct ctctagcctc catcaggggg 1320

gtatggtttt accacctgat caggtgacag atgagaaagc atctccttag tcaaagcaga 1380

atcttagagc attagggaat ggactgctag gtacttcagc agagcattac tcttgcctcc 1440

tatgtccaaa ccacagctgt gctcaacatt tgaaaaatct gaacatataa actgacaagt 1500

atctaccacc acaagatggg aagtggaatt agttcagaga gcaaggagtc agccaaaaga 1560

tcaaaagaac tggagaaaaa gcttcaggag gatgctgagc gagatgcaag aaccgtaaag 1620

ctgctactat tagg 1634

<210> 4

<211> 1702

<212> DNA

<213> 家牛(Bos taurus)

<400> 4

attttaatgt ttgtgttctt ttgcattgct gttagtgtgg atggactctg tgttcatgag 60

tgagtataaa taaaccagct ggtgcaaatc ttgttccttt ggggcaggcc ctttgcattt 120

taaaagcaac atcacatgct ttgcatacct acctttccac atctttatac tatcataaca 180

tggcttgagc agatgaaatc cagaaagttt tgactatgct tatgtattga cagtctaata 240

ttctatgtga aaaaagtaaa cacagcagga ctatgtattg aatttggcag cctatttcct 300

tgttccatga atatgcaaaa atacacctgt tcagagtttg tccacgatcc cacaagaaca 360

gcactaacat gctgatggac tgactgtatt ctaatatttc cctgttaggc acgtccacaa 420

atcccaaaat gtgtactgag agatttgcct gctgccacag gtagccaact ctgcttaaaa 480

ggaaaacatc acttgactat ctaagtgctt tatgcttcat ataaacaaac aagcgaaaaa 540

attgtataac aaaatctctg tccccaaact tgcagattgt cgagaaggac atgatgtctg 600

ttggggtagt cgaaaggcat ggaacatatt taggtatatt tactattctt accttgcagg 660

aaaaaccaaa tgacctactg ttacaaagaa tattgctttt tattccctca gtaccaaatc 720

aataaaagtc cttccagcac aacagctgtt ccttaatggc cccaaagagt taatgccctg 780

cctgaatcaa acacattcca gtgtctccac caagcagacc ctcaattaat ggtgatgaat 840

taactttctc acaagtagta aaagctcaat ttatagaaat tgatcctatg agacaaaaat 900

aaataattta agagcactct gtgttgaatt atatgtttgg cagcatagca atgtgtatag 960

atttaagaac tatgtatata tatatttttt aatgaaaagg ttttctagtt atctgacaga 1020

tactaagagt gtctcaatca ttttgagtca taatctaagc atagcagaac tataaatctg 1080

ggtgattcaa tataaatatt ctgatagtga tatcacagtg attatgaaga atctgaagac 1140

tcacgtacct aaagataaga cacacgtttg ttcgttaata attataactt taaatcttgc 1200

aataaagatt gcctattagt gataaacact atttgaattg cccatttcag atctttagtg 1260

tacagatttt cataactttc tacattattg tatgctattc tttaaggaag atgaacaggt 1320

ttgaaggagt gccagaagta accacttaat ttgaaagtat aatgaatttt ctctttagct 1380

gccatagaac tgtgtggttt taccctttgt caggtgacag catctcttta gtcaaagcag 1440

agtcttcgaa aatgagggaa tgggctgttg ggtacttcag cagagcattg ctcttacatc 1500

ctatgtccaa accagagcac cagctgcgct ctacattcca aaaagtttga gcaaataaac 1560

tgacaagcat ctaacactac aagatgggaa ttggaattag ttcagagagc aaggagtcag 1620

ccaaaagatc aaaagaattg gagaaaaagc ttcaggaaga tgctgagcga gatgcaagaa 1680

ctgtcaagtt gctgttgtta gg 1702

<210> 5

<211> 60

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 5

Glu Gly Ile Thr Lys Ala Gln Leu Phe Leu Ser Leu His Asp Ala Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Leu Ser Arg Lys Phe Ser Glu Pro Ser Asp Leu Ser Met

20 25 30

Asp Glu Thr Glu Thr Val Ile Gly Glu Thr Tyr Ser Glu Ser Asp Lys

35 40 45

Asn Gly Asn Leu Ser Asn Leu Arg Leu Lys Thr Gly

50 55 60

<210> 6

<211> 57

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Ala Gly Ile Thr Lys Thr Gln Leu Phe Leu Ser Val His Asp Ala Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Leu Ser Arg Lys Val Ile Gly Ser Ser Glu Leu Ser Ile

20 25 30

Asp Glu Ser Glu Thr Val Ile Arg Glu Thr Tyr Ser Glu Thr Asp Lys

35 40 45

Asn Asp Asn Ser Arg Tyr Lys Met Ser

50 55

<210> 7

<211> 57

<212> PRT

<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 7

Ser Gly Ile Ser Lys Ala Gln Leu Phe Leu Thr Leu His Asp Ala Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Leu Ser Arg Lys Leu Pro Asp Ser Ser Glu Leu Ser Val

20 25 30

Asp Glu Ser Glu Thr Val Ile Gln Glu Thr Tyr Ser Glu Thr Glu Lys

35 40 45

Asn Gly Glu Ser Arg His Lys Met Lys

50 55

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213> 山羊(Capra hircus)

<400> 8

Ala Gly Ile Thr Lys Ala Gln Leu Phe Leu Thr Leu His Asp Ala Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Leu Ser Arg Lys Leu Pro Glu Ser Ser Glu Leu Ser Val

20 25 30

Asp Glu Ser Glu Thr Val Ile Gln Glu Thr Phe Ser Glu Thr Asp Lys

35 40 45

Lys Glu Glu Ser Arg His Lys Thr Ser

50 55

<210> 9

<211> 57

<212> PRT

<213> 家牛(Bos taurus)

<400> 9

Ala Gly Ile Thr Lys Ala Gln Leu Phe Leu Thr Leu His Asp Ala Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Leu Ser Arg Lys Leu Pro Glu Ser Ser Glu Leu Ser Val

20 25 30

Asp Glu Ser Glu Thr Val Ile Gln Glu Thr Phe Ser Glu Thr Asp Lys

35 40 45

Lys Glu Glu Ser Arg His Lys Thr Asn

50 55

Claims (53)

1.一种用于产生生产单性精液的转基因雄性牛科动物的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中所述外源核酸序列包括非翻译区(UTR)，其将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构；

其中所述外源核酸序列编码抑制精细胞的进展性、活力和/或穿透能力或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质，并且所述至少一种蛋白质任选地包括束缚至所述精细胞的细胞骨架结构的膜缔合序列；以及

将所述遗传构建体引入至雄性牛科动物的细胞中的Y染色体或X染色体中。

2.一种用于产生生产单性精液的转基因雄性牛科动物的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中所述外源核酸序列包括可操作地连接至非翻译区(UTR)的插入至微RNA(miR)盒中的(i)短发夹RNA(shRNA)或(ii)一个小干扰RNA(siRNA)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构，其中插入至miR盒中的所述shRNA或所述siRNA抑制涉及所述精细胞的存活、活力、进展性和/或穿透能力的至少一个基因的表达；以及

将所述遗传构建体引入至雄性牛科动物的细胞中的Y染色体或X染色体中。

3.一种用于防止雄性非人类转基因哺乳动物中的特定染色体的传播的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中所述外源核酸序列包括非翻译区(UTR)，其将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构；

其中所述外源核酸序列编码抑制精细胞的进展性、活力和/或穿透能力或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质，并且所述至少一种蛋白质任选地包括束缚至所述精细胞的细胞骨架结构的膜缔合序列；以及

将所述构建体引入至所述非人类动物的细胞的所述特定染色体中。

4.一种用于防止雄性非人类转基因哺乳动物中的特定染色体的传播的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中外源核酸序列包括可操作地连接至非翻译区(UTR)的插入至微RNA(miR)盒中的(i)短发夹RNA(shRNA)或(ii)一个小干扰RNA(siRNA)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构，其中插入至miR盒中的所述shRNA或所述siRNA抑制涉及所述精细胞的存活、活力、进展性和/或穿透能力的至少一个基因的表达；以及

将所述构建体引入至所述非人类动物的细胞中的所述特定染色体中。

5.一种用于强迫雄性非人类转基因哺乳动物中的特定染色体的传播的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中所述外源核酸序列包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构；

其中所述外源核酸序列编码促进精细胞的进展性、活力和/或穿透能力或抑制精细胞死亡的至少一种蛋白质，并且所述至少一种蛋白质任选地包括束缚至所述精细胞的细胞骨架结构的膜缔合序列；以及

将所述构建体引入至所述非人类动物的细胞中的所述特定染色体中。

6.一种用于强迫雄性非人类转基因哺乳动物中的特定染色体的传播的方法，其包括：

提供包括可操作地连接至启动子的外源核酸序列的遗传构建体，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述外源核酸序列的表达；

其中所述外源核酸序列包括可操作地连接至非翻译区(UTR)的插入至微RNA(miR)盒中的(i)短发夹RNA(shRNA)或(ii)一个小干扰RNA(siRNA)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构，其中插入至miR盒中的所述shRNA或所述siRNA抑制表达涉及所述精细胞的存活、活力、进展性和/或穿透能力的蛋白质的至少一个内源基因；

其中所述遗传构建体进一步包括编码所述蛋白质的第二外源核酸序列，其中所述第二外源核酸序列编码包括第三碱基摆动，使得插入至miR盒中的所述shRNA或所述siRNA不抑制编码所述蛋白质的所述第二外源核酸序列的表达；以及

将所述构建体引入至所述非人类动物的细胞中的所述特定染色体中。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述特定染色体是性染色体或常染色体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述性染色体是Y染色体。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述性染色体是X染色体。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用位点特异性核酸酶同源重组，将所述遗传构建体引入至所述染色体中。

11.根据权利要求1、3或5中任一项所述的方法，其中所述膜缔合序列是膜插入序列。

12.根据权利要求1、3或5中任一项所述的方法，其中所述膜缔合序列是结合至包括膜插入序列的蛋白质或蛋白质复合物的结合结构域。

13.根据权利要求2、4或6中任一项所述的方法，其中所述启动子是RNA聚合酶III(polIII)启动子。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述polIII启动子选自U6启动子和H1启动子。

15.根据权利要求2、4、6、13或14中任一项所述的方法，其中所述外源核酸序列进一步包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至所述精细胞的细胞骨架结构。

16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述启动子在晚期精子发生期间激活表达。

17.根据权利要求16所述的方法，其中当在发育中的精细胞之间的胞质桥被破坏时，所述启动子激活表达。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述启动子选自用于Gnat3、Spergen-4、Spata19、精子尾部的外致密纤维3b(Odf3b)、精子尾部的外致密纤维1(Odf1)、精子尾部的外致密纤维3(Odf3)、鱼精蛋白、TNP-1、精子线粒体相关的富含半胱氨酸的蛋白(smcp)的启动子以及cKIT基因的第十六个内含子内的睾丸特异性启动子。

19.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述启动子是在晚期精子发生期间激活表达的通用启动子。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述通用启动子选自β肌动蛋白启动子、泛素启动子、JeT启动子、SV40启动子、β球蛋白启动子、延伸因子1α(EF1-α)启动子、Mo-MLV-LTR启动子、Rosa26启动子及上述的任何组合。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述启动子选自Gnat3启动子和t-复合物应答器启动子。

22.根据权利要求1、3、5、6-10和15-21中任一项所述的方法，其中所述UTR连接至编码所述至少一种蛋白质的所述核酸序列的5’侧。

23.根据权利要求1、3、5、6-10和15-21中任一项所述的方法，其中所述UTR连接至编码所述至少一种蛋白质的所述核酸序列的3’侧。

24.根据权利要求1、3、5、6-10和15-23中任一项所述的方法，其中所述UTR延迟所述至少一种蛋白质的翻译直到发育中的精细胞之间的所述胞质桥被破坏。

25.根据权利要求1、3、5、6-10和15-24中任一项所述的方法，其中所述UTR选自t-复合物应答器、Gnat3、Tas1r3和Spam1基因。

26.根据权利要求1、3、5、6-10和15-25中任一项所述的方法，其中所述启动子是Gnat3启动子并且所述UTR是Gnat3 5’UTR。

27.根据权利要求1-4和7-26中任一项所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是能够确保和/或促进精细胞的存活、进展性、活力或穿透能力的显性阴性形式的蛋白质。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是选自由下述组成的组中的显性阴性蛋白质：显性阴性SUN5、显性阴性突变Sept4、显性阴性Sept12、显性阴性CATSPER1、显性阴性CATSPER2、显性阴性SLC26A8、显性阴性Spata16、显性阴性PLCZ1、显性阴性DPY19L2和/或显性阴性形式的Gpx4、显性阴性形式的Hookl、显性阴性形式的Prrs21、显性阴性形式的Oaz3、显性阴性形式的Cntrob和显性阴性形式的Ift88。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是显性阴性Slc26a8蛋白质。

30.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞是精原干细胞，所述雄性非人类转基因哺乳动物是不育的杂种雄性受体动物，并且引入步骤包括：

提供来自雄性供体动物的所述精原干细胞；

将所述遗传构建体引入至所述精原干细胞中，其中所述核酸构建体被引入至所述特定染色体中；

将所述供体精原干细胞引入至所述不育的杂种雄性受体动物的生殖器官中，其中供体精原干细胞从所述不育的杂种雄性受体动物产生缺乏所述特定染色体的供体衍生的有能力受精的单倍体精细胞，其中所述杂种动物具有来自与所述供体动物相同属的至少一个血统；

任选地，收集由所述不育的杂种雄性受体动物产生的所述供体衍生的有能力受精的单倍体精细胞；以及

任选地，使用收集的供体衍生的有能力受精的单倍体精细胞使卵子受精。

31.一种遗传构建体，其包括可操作地连接至启动子的核酸序列，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述核酸序列的表达，其中所述核酸序列包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至精细胞的细胞骨架结构；以及

其中所述核酸序列编码抑制精细胞的进展性、活力和/或穿透能力或诱导精细胞死亡的至少一种蛋白质，并且所述至少一种蛋白质任选地包括束缚至所述精细胞的细胞骨架结构的膜插入序列。

32.一种遗传构建体，其包括可操作地连接至启动子的核酸序列，所述启动子在发育中的精细胞中的减数分裂后激活所述核酸序列的表达，其中所述核酸序列包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至精细胞的细胞骨架结构；以及

其中所述核酸序列编码促进精细胞的进展性、活力和/或穿透能力或抑制精细胞死亡的至少一种蛋白质，并且所述至少一种蛋白质任选地包括束缚至所述精细胞的细胞骨架结构的膜插入序列。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的遗传构建体，其中所述启动子选自用于Gnat3、Spergen-4、Spata19、精子尾部的外致密纤维3b(Odf3b)、精子尾部的外致密纤维1(Odf1)、精子尾部的外致密纤维3(Odf3)、鱼精蛋白、TNP-1、精子线粒体相关的富含半胱氨酸的蛋白(smcp)、t-复合物应答器的启动子以及cKIT基因的第十六个内含子内的睾丸特异性启动子。

34.根据权利要求33所述的遗传构建体，其中所述启动子选自Gnat3启动子和t-复合物应答器启动子。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的遗传构建体，其中所述UTR连接至编码所述至少一种蛋白质的所述核酸序列的5’侧。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的遗传构建体，其中所述UTR选自t-复合物应答器、Gnat3、Tas1r3和Spam1基因。

37.根据权利要求31-36中任一项所述的遗传构建体，其中所述启动子是Gnat3启动子并且所述UTR是Gnat3 5’UTR。

38.根据权利要求31-37中任一项所述的遗传构建体，其中所述至少一种蛋白质是显性阴性Slc26a8蛋白质。

39.一种遗传构建体，其包括可操作地连接至RNA聚合酶III(pol III)启动子的核酸序列，其中所述核酸序列任选地包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至精细胞的细胞骨架结构；以及

其中所述核酸序列包括抑制涉及所述精细胞的存活、活力、进展性和/或穿透能力的至少一种基因的表达的短发夹RNA(shRNA)。

40.一种遗传构建体，其包括可操作地连接至RNA聚合酶III(pol III)启动子的核酸序列，其中所述核酸序列任选地包括非翻译区(UTR)，所述非翻译区(UTR)将从所述核酸序列转录的转录物束缚至精细胞的细胞骨架结构；以及

其中所述核酸序列包括促进所述精细胞的存活、活力、进展性和/或穿透能力的短发夹RNA(shRNA)。

41.根据权利要求39或权利要求40所述的遗传构建体，其中所述pol III启动子选自U6启动子和H1启动子。

42.根据权利要求39-41中任一项所述的遗传构建体，其中所述至少一种蛋白质选自Tas1R3和Gnat3。

43.根据权利要求39-41中任一项所述的遗传构建体，其包括至少两种shRNA并且其中所述至少两种shRNA用于Tas1R3和Gnat3。

44.根据权利要求39-41中任一项所述的遗传构建体，其中所述shRNA是用于Gnat3的shRNA；所述核酸进一步包括编码可操作地连接至Gnat3启动子的Gnat3蛋白的核酸序列，其中编码所述Gnat3蛋白的所述核酸序列包括第三碱基摆动，使得用于Gnat3的所述shRNA不结合编码所述Gnat3蛋白的所述核酸序列。

45.根据权利要求31、33-39和41-44中任一项所述的遗传构建体，其中所述遗传构建体靶向至有害基因或等位基因，用于防止传播。

46.根据权利要求32-38和40-44中任一项所述的遗传构建体，其中所述遗传构建体靶向至有利基因或等位基因，用于强迫传播。

47.根据权利要求31-46中任一项所述的遗传构建体，其中所述遗传构建体插入性染色体或常染色体中。

48.一种核酸分子，其包括用于至少一种蛋白质的至少一种小干扰RNA(siRNA)，所述至少一种蛋白质能够确保精细胞的进展性、活力和/或穿透能力；其中所述至少一个siRNA被插入至微RNA(miR)盒中，所述miR盒包括与晚期精子发生中表达的基因的3’UTR区的序列同源的至少一个序列。

49.一种产生有能力受精的单倍体精细胞的方法，其包括：

提供来自雄性供体动物的精原干细胞；

提供根据权利要求31-47中任一项所述的遗传构建体；

将所述遗传构建体引入至从所述雄性供体动物获得的精原干细胞中，其中所述遗传构建体引入至性染色体中；

提供不育的杂种雄性受体动物，其中所述杂种动物具有来自与所述供体动物相同属的至少一个血统；

将所述供体精原干细胞引入至所述不育的杂种雄性受体动物的生殖器官中，所述不育的杂种雄性受体动物产生供体衍生的有能力受精的单倍体精细胞；以及

收集由所述不育的杂种雄性受体动物产生的所述供体衍生的有能力受精的单倍体精细胞。

50.根据权利要求3、4和10-30中任一项所述的方法，其中所述遗传构建体靶向至所述特定染色体中的有害基因或等位基因，用于防止所述特定染色体的传播。

51.根据权利要求4、5和10-30中任一项所述的方法，其中所述遗传构建体靶向至所述特定染色体中期望的基因或等位基因，用于强迫传播。

52.根据权利要求1、2、7、8和10-30中任一项所述的方法，其中所述遗传构建体靶向至对于所述Y染色体特异性的位点。

53.根据权利要求1、2、7和9-30中任一项所述的方法，其中所述遗传构建体靶向至对于所述X染色体特异性的位点。

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