CN1402612A - 非人哺乳动物中性别决定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在非人哺乳动物中控制性别比例的一些方法。这些方法涉及产生转基因动物，所述转基因动物基因组中已整合进特定的转移基因，其中至少一个转移基因选择性抑制那些具有特定性别的染色体类型的精子之功能。还提供了使用该方法产生的动物以及转移基因构建体。

Description

非人哺乳动物中性别决定的方法

                              方法

本发明涉及产生非人动物的方法，其中特定的性别染色体类型之精子的功能被抑制。通常，用导入特定转移基因构建体的方法产生转基因动物来实现。还提供了合适的转移基因构建体。

受孕时受孕精子的性染色体组成确定了哺乳动物的遗传性别。如果该精子携带X染色体，胚胎发育为雌性；如果该精子携带Y染色体，胚胎发育为雄性。这与精子可方便地经体外操作而不失去活力的事实一起，产生了多年研究的方法，用于分离携带X和Y染色体的精子(X和Y精子)。

产生单一性别幼仔的能力对农业产业有很大益处，例如：

1.产猪者在低屠宰重量市场能够利用公猪较快生长速率优势或者在高屠宰重量市场只产生母猪，因而避免了公猪的感染问题和阉割的需要。单一性别的完成也使生产更有效。屠宰场和加工厂将从更均一的动物受益。饲养者最终会意识到为公猪和母猪的流水线销售选择性产生雄性或雌性幼仔的效率。估计仅在英国每年产生单一性别幼仔的能力的价值都超过一千万英镑。

2.典型地每年奶农用其小母牛替代其牧群中大约40％的母牛。未选中保留在牧群(所有雄性和20％雌性)中的小牛出售用于肉类生产(主要是小菜牛)。因而精液的性别决定(semen sexing)将保证产生正确数目的小母牛替代，同时确保使用牛遗传学生殖的其它所有后代都是雄性。

3.在牛和羊产业中，优选雄性因为其生长特征优于雌性，屠宰厂和加工厂将再一次从更均一的动物中受益。

精液的性别决定也应用于人类，从而可使得冒着产生伴性遗传疾病后代风险的夫妇使用选定的X精子人工授精以拥有女儿。这比许多夫妇目前的羊膜穿刺术和选择性流产的系统优越。

基于物理分离X和Y精子的技术多年来已提出了精液性别决定系统的许多权利要求(见Hossam et al，Arch Androl 40：3-14(1998)；Johnson，Dtsch Tierarztl Wochenschr，103：288-291(1996)；Windsor etal，Reprod Fertil Dev，k 5：155-171(1993)；见综述)。在该领域已经提出了许多专利申请。例如US 4362246、WO84/01265、US-A-4448767、WO90/13303、US5135759、WO90/13315、EP-B-0475936、WO91/17188、US4999283和EP-A-0251710。然而，证明只有荧光激活细胞分选术(FACS)是真正的精液性别决定系统。FACS涉及使用荧光染料，其渗透到精子细胞核中并结合核DNA。当所分离的染色精子用紫外光照射时，其发出荧光并且荧光的量与精子中DNA的数量成正比。因为X染色体比Y染色体长，携带X染色体的精子比那些携带Y染色体的含有更多DNA。基于此，FACS能够区分两种精子细胞类型，并产生非常高纯度(90％)的分离的精子库。

尽管使用FACS分离的精子在牛产业中接近商业化。在养猪业中目前其使用仍有限。这是因为分选速率太低而在产生性别决定的AI剂量中没用。目前在猪中每个AI剂量需要30亿精子，并且最大分选速率是每小时一千万。这意味着FACS性别决定的精液在猪中只能与体外授精和胚胎转移联合使用，任何一个上述方法在猪中都不是常规技术，然而，两个小组以该方法产生了猪仔，两者都与美国Beltsvile州USDA的Larry Johnson(他是FACS技术的先驱(RAth et al，Theriogenology，47：795-800(1997)；Abeydeera Day，1998 UMC AnimSci Dept Rep，40-42))合作。两组都使用了IVF和手术胚胎转移。这些小组的结果显示：尽管转移了约30个胚胎，目前仅约4个存活至足月。

FACS技术的另一问题是在操作中使用DNA结合染料和UV激光器，两者都潜在地损害精子DNA。尽管FACS从业者宣称使用该技术出生的动物是正常的，在该过程中引入新突变非常有可能。使用FACS分离的精液授精后受孕率明显降低就支持这样的观点。

由于FACS能够产生高度富集的携带X和Y染色体的精子群，也用其作为寻找更有效的精液性别决定方案的工具。几个小组(例如Howes et al，J Reprod Fertil，110：195-204(1997)；Hendriksen et al，MoleReprod Dev，45：342-350(1996))使用二维蛋白质凝胶电泳寻找携带X和Y染色体的精子之表面抗原的差异。该差异能够提供基于抗体的精液快速分选技术的基础。然而尽管有一项专利申请公开了该方法(WO90/13315)，但没有任何学术团体能够证明携带X和Y染色体的精子表面蛋白间可重复的差异。射出的精液的运用使这些研究复杂化，因为精子在通过附睾和暴露于生殖质膜时表面被广泛修饰。

因此，始终存在持续需要提供产生携带所选性染色体的精液的可靠的方法。此处我们提供这样一种方法，其基于转移基因方案。对于精液的性别决定我们建议该新方法，我们命名其为新精液性别决定(NSS)。这样我们产生了公猪，其产生仅携带X染色体或者仅携带Y染色体的活的精子，并且因而只产生雌性或雄性的后代。按照以上描述，传统的精液分离系统在猪中从未提供切实可行的精液性别决定的解决方法。然而，转基因方法至少有两个潜在问题。

1.如果产生了一头公猪，其只能产生X精子，该公猪如何繁殖而不用产生新的转基因动物；并且

2.精子细胞在合胞体(syncitium)中发育，其邻近细胞通过胞质桥相连。这意味着mRNA和蛋白质通过这些桥能够在X和Y精子间共享。这样，尽管精子细胞在遗传上是单倍体，广泛认为它们是功能上二倍体(见Braun et al，Nature，337，：373-376(1989)；Caldwell etal，PNAS USA，88：2407-2411(1991))。

这样，首先，本发明提供了在非人哺乳动物中控制性别比例的方法，其包括将至少一种选择性抑制那些有特定的性染色体类型的精子功能之转移基因整合到所述非人哺乳动物基因组的步骤。

使用灭活精子功能的转移基因。这能通过几种方式实现，例如，转移基因可包括编码反义分子(其干扰精子功能的正常表达)的序列，或者能编码表达酶(例如RNase)，其阻止精子功能的正常表达。转移基因可被插入到X或Y染色体，因而得以产生仅产生雄性或雌性后代的转基因雄性。

适当地，使用仅在所述细胞中表达的合适的启动子，例如鱼精蛋白1基因的启动子，或者在cKIT基因的第16个内含子中的睾丸特异启动子(Albanesi，et al，Development，122：1291-1302 91996)转移基因的表达局限于精子减数分裂后期。这将保证转移基因仅在睾丸中正确细胞表达而不在别处。

在一个优选的实施方案中，转移基因的表达用位点特异性重组开关例如cre/lox系统(见Sauer 1998，Methods 14，381-392)或FLP/FRT系统(见Dymecki Tomasiewicz 1998，Dev Biol 201，57-65)进一步控制，二者都用于在转基因小鼠中控制转移基因表达。其它可能的重组开关可包括来自噬菌体Mu的Gin系统，其用以促进植物原生质体中位点特异性重组(Maeser Kahmann 1991，Mol Gen Genet 230，170-176)，以及反向介导系统例如沙门氏菌的Hin系统(见JohnsonSimon 1985，Cell 41 781-791)的改进。任何在哺乳动物细胞中起作用的位点特异重组系统均满足此目的。

而且，使用可被外源试剂激活的启动子能够控制位点特异性重组系统本身的表达。这样，在一选定时间施用一外源试剂能够控制精子灭活性转移基因最终的表达。这意味着在施用外源试剂前，转基因雄性将产生正常的精子，并且该方法允许转基因雄性的正常繁殖。并且即使转移基因插入到Y染色体也能确保其置换。该可控启动子的实例包括那些源于四环素可诱导系统(见Forster et al 1999，Nucleic AcidsRes 27 708-710)、蜕皮激素基因(见No et al 1996，Proc Acad Sci USA93 3346-3351)、RU486-可诱导系统(见Wang et al 1997，NatureBiotechnol 15 239-243)、锌诱导的金属硫蛋白基因(见Suppola et al1999，Biochem J 338 311-316)和CYP1A1基因(见Campbell et al 1996，J Cell Sci 109 2619-2625)。任何在哺乳动物细胞中能被外源试剂诱导的启动子都满足该目的。

此外，转移基因的作用能被定向到特定的细胞区室，例如核、顶体或鞭毛中。该方法把减数分离后转移基因的晚期表达与转移基因产物靶向到特定细胞室结合起来，预期将克服合胞体问题。能够以几种方法实现该种靶向。例如认为反义RNA的作用在核内；使用核定位序列能将蛋白质(例如RNase)定向到核内。核的参与使得通过胞质桥在合胞体中邻近细胞间传递转移基因的精子灭活效应尤其不可能。

如上述产生的转基因公猪后代携带一激活的转移基因，从不遗传该转移基因，这样转移基因不进入食物链。

因此该系统传递：

1.转基因(NSS)公猪，其产生正常比例的X和Y精子(并且因而能够通过正常繁殖产生下一代转基因公猪)，直到外源激活的启动子联合重组开关来活化该转移基因。开关的重组元件意味着可控启动子只需激活一次。

2.一旦开关被激活，来源于携带了插入到性染色体的转移基因之精子细胞的精子将成为无活力的，并且因而不能使卵母细胞受精。用该方法，NSS公猪将仅产生一种性染色体组分的活的精子，并且取决于转移基因携带在X或Y染色体上，产生雄性或者雌性的后代。

3.既然携带转移基因的精子是失活的，激活的转基因公猪的后代本身不是转基因的，因此只要清楚验明NSS公猪品系本身，并且死后被焚烧，该转移基因绝不会进入人的食物链。

NSS成分

1.晚精子发生启动子(P_LATE)

需要该启动子以保证转移基因的表达局限于减数分裂后的雄性生殖细胞。在其它组织中的表达可能是有害的，并且在减数分裂前生殖细胞中的表达将导致不育。此处能够使用任何在减数分裂后雄性生殖细胞中独特性转录的基因的启动子，例如鱼精蛋白1(Prm1)或在cKIT基因的第十六个内含子中的睾丸特异启动子。用在减数分裂后生殖细胞中非常晚表达的启动子有可能得到最好的结果。该阶段合胞体桥将断裂，因此给该方法更少阻碍。

2.侧翼为位点特异性重组酶位点的终止表达序列

使用终止表达序列，例如多聚腺苷酸信号在开始就阻止了精子功能性抑制物转移基因的表达。这允许转基因NSS公猪正常繁殖，直到需要其仅产生单一性别的后代。终止表达序列的侧翼是重组位点(例如lox P位点)，其提供了位点特异性重组酶(例如Cre重组酶)的位点。重组酶的表达催化终止表达序列的缺失，这样精子功能性抑制物转移基因得以在减数分裂后的雄性生殖细胞中表达。

3.精子功能性抑制物(SFI)

其包括转移基因的编码区或反义区。其必定干扰精子的功能并灭活任何表达转移基因的细胞。理想地，SFI仅在精子细胞中有作用，因此转移基因在其它组织中任何不恰当表达的有害后果最小。候选者包括参与精子基本功能(例如代谢、卵识别和结合或移动等)的反义或核酶策略。其它方法包括表达一种灭活精子的蛋白，例如普通RNase(该表达将损害精细胞中所有mRNA，进而破坏所有精子功能)，或一种表面抗原(该表达将产生抗原性差异的X和Y精子，并且基于此实现精子性别决定)。

4.核定位序列

来源于一个精母细胞的四个精子细胞仍然通过胞质桥相连的事实，使减数分裂后雄性生殖细胞的基因表达复杂化。相连的细胞称为合胞体。因为来源于减数分裂后表达的基因的mRNA或蛋白质可通过细胞质桥在合胞体的单个细胞间传递，这意味着单倍体生殖细胞可认为是功能上的二倍体。潜在地这可使NSS方法无效和无用。然而，如果将一序列加到导向所编码蛋白到特定细胞区室例如细胞核(核定位序列)、顶体或鞭毛的SFI转移基因的5’末端，那么mRNA和蛋白质很可能留在携带该基因的细胞内。

5.外源可控启动子(P_EC)

这得以用特定诱导物精确控制位点特异性重组酶的表达。理想地，这应该是在哺乳动物中未发现的启动子/诱导物的联合，以使其不恰当或偶然诱导cre重组酶表达的机会最小。可控启动子的例子包括那些来源于四环素可诱导系统、蜕皮激素基因、RU486-可诱导系统、金属硫蛋白基因和CYP1A1基因。

6.位点特异性重组酶

位点特异重组酶(例如Cre)的表达将导致终止表达序列通过重组发生位点(例如lox P)的缺失和在减数分裂后雄性生殖细胞中SFI转移基因的表达。可选择的位点特异重组系统包括FLP/FRT系统、来自噬菌体Mu的Gin系统、或反向介导系统例如沙门氏菌的Hin系统。

7.靶向转移基因的X或Y特异序列

如果转移基因靶向到Y染色体，那么在位点特异重组酶诱导后，携带Y染色体的所有精子细胞将是不育的。此处转基因雄性只能生育雌性子代。同样地，在位点特异重组酶诱导后，在X染色体上携带转移基因的雄性只能生育雄性子代。在转移基因两侧带有来自靶染色体的几千碱基对的DNA将得到靶向。这促进了胚胎干细胞中转基因构建体与靶染色体之间的同源重组。同源重组需要转基因构建体与靶染色体DNA序列间100％的一致。这意味着转基因构建体中的靶染色体DNA来源于胚胎干细胞系是必要的。为了我们的目的，此处我们将NSS转基因构建体整合到X染色体以证明该系统。

如果得不到猪的胚胎干细胞，使用基因打靶策略和核转移(或通过传统转移基因发生)及筛选X或Y染色体的插入，仍能得到NSS。

如果需要只产生雄性后代的动物，系统可以更简单。此处转移基因仅包括驱动SFI转移基因(如上所述)的只在减数分裂后雄性生殖细胞中表达的启动子。用来自X染色体的几千碱基对的DNA和同源重组将其靶向到X染色体。此处一旦精子发生开始，转基因雄性就表达转移基因，并且只产生携带Y染色体的致育精子。这样只有雄性后代产生。那么在其一个X染色体上携带单拷贝转移基因的雌性能用于通过正常生殖产生新的转基因雄性。该携带者雌性之平均50％的雄性后代将是转基因NSS公猪。

在该简单系统中，重要的是牢记基因打靶中必须用雌性胚胎干细胞或全能组织细胞。如果使用了雄性细胞，转移基因将在嵌合的或转基因的后代中表达，并且只产生携带Y染色体的致育精子。这样不再遗传转移基因，并且不能建立转基因系。然而，如果雌性细胞用于打靶，就产生在其一个X染色体上携带转移基因的转基因雌性。当这些雌性与非-转基因雄性交配时，其一半雄性子代将是NSS雄性，其一半雌性子代将是雌性携带者。这使得通过建立携带雌性系来连续产生NSS雄性。

现参考以下实施例描述本发明，其绝不解释为对本发明领域的限制。实施例1

1.证明胞质桥问题可以克服。

研发了如下系统以表明有可能确保SFI的作用只发生在转移基因已插到其一种性染色体上的精子细胞中，并证明潜在的胞质桥问题是可克服的。检验了两种方法；使用核定位序列(nls)和使用反义序列的方法。

a)nls方法

构建了这样的构建体：将小鼠鱼精蛋白1启动子(见ZambrowiczPaliter 1994 Biol Reprod 50，65-72)与来自pSKT(Stratagene)的nls-LacZ基因融合。预期在一个染色体(半合子)的单一位点内携带该构建体的转基因雄性小鼠在其睾丸精子细胞中表达Lac Z基因。用X-Gal染色睾丸组化切片显示了这一点(见Ave et al 1997 TransgenicRes 6，37-40)。

如果nls如预期的起作用，并介导β半乳糖苷酶到表达LacZ基因的细胞核中，那么只有50％的精子细胞染成兰色，证明该方法可以克服胞质桥问题。

还构建了其它构建体以检验nls序列介导转基因产物到精细胞核，进而避免胞质桥限制的能力。例如使用编码绿色或黄色荧光蛋白的基因作为报告基因，或者使用在cKIT基因第16个内含子中的睾丸特异的启动子。

b)反义方法

该方法涉及使用两种转移基因。第一个与实施例1a(有义)一样；第二个是鱼精蛋白1启动子和反向Lac Z基因(反义)之间的融合。后一构建体在表达时将产生反义Lac Z。转移基因根据其整合位点表达不同。此处为每个转移基因建立数个转基因小鼠品系，并且使用Northern杂交或RT-PCR和参考基因(例如β肌动蛋白)确定睾丸中转移基因的表达水平。用该方法我们将鉴定有义和反义系，其中有义构建体的表达至少比反义低10倍。然而，有义构建体的LacZ表达不得不用组织化学方法才检测到。培育有义转基因系为纯合子，然后再与半合子反义系交配。

如果象预期的那样，反义方法通过抑制同一核内有义构建体的表达起作用，那么来自该杂交雄性睾丸的组化染色将揭示仅25％的精子细胞染色兰色。这再一次证明胞质桥问题可以克服。如果该方法不抑制有义基因表达，50％的精细胞将染成兰色，并且如果该方法不抑制有义基因表达，但是不能克服胞质桥问题，那么0％的精细胞染成兰色。

另外，使用编码绿色或黄色荧光蛋白作为报告基因，或者使用在cKIT基因第16个内含子中的睾丸特异启动子正在构建可选择的构建体。

c)鞭毛靶向

我们已构建了一转移基因，其包括驱动绿色荧光蛋白-微管蛋白基因融合体的在cKIT基因第16个内含子中的睾丸特异启动子。我们预期该融合蛋白靶向到精细胞伸长的鞭毛中。如果该方法有效，那么携带该转移基因的转基因小鼠睾丸中50％的伸长的精子会发荧光。然而，如果所有精细胞显示荧光鞭毛，那么显然至少使用所用启动子该方法不能克服胞质桥问题。

2.NSS原则的证明

本实施例涉及使用简易系统证明NSS受孕原则。完全NSS受孕依赖于重组开关，例如我们需要雄性，其产生仅有Y染色体和仅有X染色体的精子，仍然能够通过正常生殖保持品系。如果我们只靶向X染色体，那么我们不仅能产生只产生活的Y染色体精子的NSS雄性，我们还能维持转基因品系并且通过雌性携带者产生新的NSS雄性。

为证明此原则正在做几个构建体，这些涉及使用可选择的X染色体靶向序列和SFI。

a)需要在X染色体上表达的非必需基因区域以靶向转移基因到小鼠的X染色体。选择Smcx(见Agulnik et al 1999 Mamm Genome10，926-929)和Hprt(Konecki et al 1982 Nucleic Acids Res10，6763-6775；Hatada et al 1999 J Biol Chem 274，948-955)基因用于此目的。从小鼠129/5vEv株克隆大约5kb的各自基因区域。

b)对于SFI采用了两种方法；使用了利用nls靶向到核的蛋白质的方法，和使用了反义方法。所选的蛋白质是芽孢杆菌RNA酶(一种普通Rnase，其将破坏核中所有基因表达并因此终止精细胞成熟(见Goldman et al 1994 EMBO J 13，2976-2984))和HSV tk基因(已知其如果在生殖细胞减数分裂后表达可阻断精子的发育(见Braun et al1990 Biol Reprod 43，684-693))。至于反义方法，选择下列基因片段以构建反义构建体，其包括单个基因、或二、三、四个基因的融合；精子粘附分子(Spam 1，见Zheng和Martin-Deleon 1997 Mol ReprodDev 46，252-257)、fertilin β(Ftnb见Cho et al 1997 Dev Genet20，320-328)、睾丸特异性甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPD-S，见Welch etal 1992 Biol Reprod 46，869-878)和睾丸特异性葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH，见Erickson 1975 Biochem Biophys res Commun63，1000-1004)。所有这些小鼠基因仅在睾丸中减数分裂后的细胞中表达，因此是NSS方法理想的阻断目标。

Nls或者反义方法的所有转移基因将融合到小鼠鱼精蛋白1启动子并且从其表达。

包埋进适当的X染色体靶向序列的转移基因(包含启动适当SFI的鱼精蛋白启动子或者在cKIT基因第16个内含子中的睾丸特异启动子)将与适当的选择标记融合，并插到合适小鼠胚胎干细胞系的X染色体中(见Bronson and Smithies 1994 J Biol Chem 269，155-158)。在X染色体上携带转移基因的真正的转基因细胞随后将被注射到合适小鼠品系胚囊的囊胚腔中，并再次移植到合适假孕受体小鼠的子宫中，使用检测转移基因存在的方法(例如PCR或者Southern杂交)将鉴定胚系嵌合小鼠，并繁殖以产生转基因系。

预期雌性小鼠将与非转基因小鼠正常交配以维持转基因系。然而，当与非转基因雌性交配时，预期转基因雄性将只产生非转基因雄性。该结果提供了NSS受孕原则的证据。

Claims (34)

1.一种在非人哺乳动物中控制性别比例的方法，其包括将至少一种选择性抑制这些有特定的性别染色体类型精子之功能的转移基因整合进所述非人哺乳动物基因组的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其中转移基因包含编码蛋白质的序列，当其表达时阻止精子的正常功能。

3.根据权利要求2的方法，其中序列编码Rnase或胸腺嘧啶激酶。

4.根据权利要求1的方法，其中转移基因包含这样的序列，其一经转录产生阻止精子正常功能的RNA分子。

5.根据权利要求4的方法，其中RNA分子是反义分子。

6.根据权利要求5的方法，其中反义RNA分子结合到mRNA，所述的RNA其存在于减数分裂后雄性生殖细胞中，并且其是从一种或多种对于精子功能关键的基因转录的。

7.根据权利要求6的方法，其中一种或多种基因选自fertilin B、精子粘附分子(spam-1)、甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

8.根据权利要求1-7之任意一项的方法，其中转移基因受调控序列例如启动子控制，其在雄性生殖细胞中在减数分裂后起作用。

9.根据权利要求8的方法，其中调控序列是来自鱼精蛋白1基因的启动子，或在cKIT基因第16个内含子中的睾丸特异启动子。

10.根据权利要求1-9之任意一项的方法，其中通过“终止表达”序列的存在阻断转移基因在前激活雄性中的表达。

11.根据权利要求10的方法，其中“终止表达序列”是聚腺苷酸化信号。

12.根据权利要求10或11的方法，其中“终止表达序列”侧翼为用于位点特异性重组系统的序列。

13.根据权利要求12的方法，其中序列是loxP或FRT位点、或来自噬菌体λ或噬菌体μ，或细菌例如沙门氏菌的位点特异性重组系统的序列。

14.根据权利要求12或13的方法，其中“终止表达序列”能够在位点特异重组酶表达后被删除，其在侧翼序列侧翼于终止表达位点的后起作用。

15.根据权利要求14的方法，其中位点特异重组酶是cre、FLP或来自噬菌体λ或噬菌体μ或者细菌如沙门氏菌的位点特异性重组系统。

16.根据权利要求14或15的方法，其中位点特异重组酶的表达受调控序列例如启动子的控制，其是可控的，因此可在需要时激活表达。

17.根据权利要求16的方法，其中在给动物施用，例如在其饲料中或通过静脉注射特异诱导物后，诱导表达。

18.根据权利要求16或17的方法，其中由来自CYP1 A1或CYP2B1基因的启动子提供调控序列，并且使用PAH、TCDD、betaNF、PCB或3-mc实现诱导。

19.根据权利要求1到18之任意一项的方法，其中用核定位序列将转移基因产物定向到细胞核。

20.根据权利要求1到18之任意一项的方法，其中转移基因产物被定向到顶体或鞭毛。

21.根据权利要求1到20之任意一项的方法，其中通过来自分别在靶物种中X或Y染色体上表达的但是非必需的区域之序列，将转移基因整合进X或Y染色体。

22.根据权利要求1到21之任意一项的方法，其中转移基因被整合进胚胎干细胞的基因组。

23.根据权利要求22的方法，其中所选择的转基因胚胎干细胞系被注射进桑葚胚或胚泡中，并将操作过的胚转移到合适的受体。

24.根据权利要求23的方法，其产生嵌合动物，所述嵌合动物能够在其生殖系中传递转移基因。

25.根据权利要求1到21之任意一项的方法，其中转移基因被整合进组织培养的全能细胞的基因组。

26.根据权利要求25的方法，其中所选转基因全能细胞在核转移程序中用作核供体。

27.根据权利要求26的方法，其中将转基因再建的胚胎转移到合适的受体。

28.根据权利要求1到21之任意一项的方法，其中在前核注射、脂质体转染、电穿孔或转染后将转移基因整合进受精卵的一个性染色体中。

29.根据权利要求28的方法，其中将操作过的胚转移到合适的受体。

30.根据权利要求29的方法，其产生嵌合动物，所述嵌合动物能在其生殖系中传递转移基因。

31.根据权利要求1到30之任意一项的方法，其中非人哺乳动物是猪、牛、绵羊、山羊、兔或鼠。

32.根据权利要求1到31之任意一项的方法产生的非人哺乳动物。

33.根据权利要求32的非人哺乳动物的后代。

34.权利要求1到20之任一或多个特征所定义的转基因构建体。