CN1531394A - 方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于控制非人哺乳动物性别决定的方法，包括用于生产转基因哺乳动物的构建体，以及非人转基因哺乳动物本身。

Description

方法

本发明涉及新的猪遗传构建体，以及它们在转基因猪生产中的应用。该构建体允许控制后代动物的性别。

在哺乳动物中，个体的性别可以在三个生物层次上被描述：遗传或染色体性别、生殖腺性别、表型性别。染色体性别在受精时决定。雄性是异配性别，具有包含一条X染色体和一条Y染色体的基因组，而雌性是同配性别，具有包含两条X染色体的基因组。生殖腺性别指的是个体存在睾丸(testes)或卵巢。生殖腺性别建立在性别决定过程中的器官发生阶段，借此生殖腺被指向睾丸或卵巢的发育命运。表型性别指的是动物是否具有外部的雄性或雌性特有的身体形态，并且动物是否由性别分化发育过程形成的。在正常情况下，三个层次的生物学性别紧密相关，从而产生功能的、具有生殖能力的、明确的雄性和雌性动物。

Y染色体上的SRY基因是已知的在雄性哺乳动物中起动睾丸决定的基因，对于睾丸决定具有主导性的促进效果，等价于遗传学上定义的睾丸决定因子(TDF)(Sinclair，A.H.等人，1990，Nature346：240-4；Gubbay，J.等人，1990，Nature 346：245-50.Koopman，P.等人，1991，Nature 351：117-21)。SRY基因定位于Y染色体上一个普遍存在于真兽亚纲、后兽亚纲(有袋类)和原兽亚纲(protherian)哺乳动物的古老部位。各物种间SRY的序列保守性很差(Tucker PK和BL，1993，Nature 364：715-717)。SRY基因是DNA结合蛋白家族中的一元，其特征是具有高迁移组结构域的区域或HMG盒。人SRY基因和小鼠SRY基因唯一的同源性位于HMG盒。

在小鼠中SRY的表达与它在性别决定中的角色相一致。SRY是由前支持细胞在胚胎期的10.5天(e10.5)和12.5天(Hacker 95)表达，是生殖腺发育中第一个在不同性别中差异表达的基因(雌性缺乏此基因)。性别决定过程中的基因表达研究已经在其它物种中完成，包括绵羊、猪、和人(Payen，E.等人，1996，Int J Dev Biol40(3)：567-75；Daneau I，等人1996，Biol Reprod.55：47-53；Parma，P.等人，1999，Biol Reprod 61(3)：741-8；Hanley N.A.等人，1999，Mech Dev 91(1-2)：403-407)，虽然基因表达的时程有所改变，但似乎事件的相对顺序与在小鼠中见到的类似。

目前关于SRY基因的表达控制知之甚少。人和小鼠SRY 5’端侧翼区域的序列比较揭示出很少的同源性(Hacker，A.等人，1995，Development 121：1603-16 14)，并且从其它物种能获得的序列信息很有限(Daneau I，等人，1995，Biol Reprod.52(3)：591-599；Daneau 1，等人，1996，Biol Reprod.55(1)：47-53；Margarit，E.等人，1998，Biochem Biophys Res Commun.245(2)：370-377)。转基因的证据表明在未分化的生殖嵴中SRY表达所需的反式激活核内蛋白被发现在XY和XX细胞中等量，这是因为，在SRY开放阅读框存在的情况下，SRY启动子能对雄性和雌性组织都有作用(koopman，P.等人，1991，Nature 351’117-21)。

对人性别决定过程的遗传研究也表明染色体8、9和17上的位点。染色体17上的基因被表明是SOX-9(Foster，J.W，等人1994，Nature.372：525-30；Wagner T，等人，1994，Cell.79(6)：1111-20)。SOX9编码与SRY相关的HMG盒蛋白质，所述蛋白质含有一功能性反式激活结构域。在人群中，SOX8的单倍缺失，例如一个等位基因丢失3’反式激活结构域，会导致性别转换以及骨骼发育的异常(Sudbeck P，等人，1996，Nat Genet.13(2)：230-232)。在小鼠中SOX9表现出一种性别依赖的生殖腺表达，在发育的睾丸中，其表达紧随SRY表达的起始而增加，同时在发育的卵巢中则减少。

定位于染色体9上的参与性别决定、性反转和生殖腺发育不会的基因已经在分子水平上被鉴定，被命名为DMRT1(Raymond C.S.，等人，1998，Nature.391：691-695；Veitia，R.等人，1997，Genomics 41(2)：271-4)。这一鉴定涉及使用果蝇双性别(Dsx)和C.elegans Mab-3基因以及人表达序列标签(ESTs)进行同源搜索(Raymond C.S.等人，1998，Nature.391：691-695)。DMRT1在几个方面让人感兴趣。它是参与性别决定的第一个表现出在各门中序列保守的分子。鸟类中DMRT1的同源物在鸡的Z(性别)染色体中被发现，在雄性和雌性鸡胚胎的生殖嵴中差异表达(Raymond，C.S.，等人，1999，Dev Biol.215(2)：208-220；Smith，C.A.等人，1999，Nature 402：601-602)。另外，爬虫类的DMRT1同源物被报道在雄性或雌性胚胎发育中差异表达(Smith，C.A.等人，1999，Nature 402：601-602)。DMRT1是(除SRY外)深度卷入哺乳动物性别决定的基因中唯一表现出严格的生殖腺表达模式的基因(Raymond，C.S.，等人，1999，Dev Biol.215(2)：208-220)。DMRT1启动子作用的特点目前了解得很少。DMRT1的表达可能发生在SRY的表达之前，并因此可能控制SRY表达的开始(Raymond C.S.，等人，1999，Dev Biol.215(2)208-220)，或者DMRT1的表达在SRY表达之后，即可能被SRY的表达所控制(Smith，C.A.等人，1999，Nature402：601-602)。

自从动物被驯化以后，通过对种畜(seed stock)的多代选择，人类已经改变了家养动物的表型特征。这导致了量化的产品参数的提高，例如身体尺寸、肌肉质量、以及乳制品生产。虽然指导后代的性别将非常有利，但是这一点却被证明很难被选择。产生性别选择系统的努力集中在根据精子的性染色体内容来分离精子(精子雌雄分离)，或利用胚胎技术将一个既定性别的胚胎移植给受体(胚胎雌雄分离)。

产生单一性别幼崽的能力将极大的有益于农业。例如：

1.养猪者能够在低屠宰重量市场(low slaughter weightmarket)利用公猪的快速生长率，而在高屠宰重量市场(highslaughter weight market)只生产母猪，从而避免猪过多(roartaint)问题和阉割的必要。单一性别的完成将使生产更加有效。屠宰场和操作员将受益于更加单一的动物。最终育种员将了解选择性产生雄性或雌性幼崽在公猪和母猪流水线销售(line sale)上的效率。据估计，产生单一性别幼崽的能力仅在英国其价值每年就能超过1000万英镑。

2.牛奶场的农民通常每年用雌性小牛仔替换掉他们牧养的母牛的40％。未被选中留在牧群中的小牛仔(所有的雄性和20％的雌性)将被出卖用作肉制品(主要是小牛肉)。例如，精子雌雄分离能保证正确数量的取代小母牛的产生，同时用牛遗传工程保证所有其它后代都是雄性种畜。

3.在牛肉和羊羔工业，雄性因为比雌性具有更好的品质因而更受欢迎。又一次提到，屠宰场和操作员将受益于更加单一的动物。

精子雌雄分离也可用于人类，允许可能生产受性连锁遗传疾病影响的后代的夫妇通过使用X精子受精来获得女儿。对于许多夫妇而言这比目前的羊水检测系统和选择性堕胎更为有利。

这几年已经开发许多基于物理上分离X和Y精子技术的精子雌雄分离方法(见Hossain等人1998 Arch Androl 40 3-14；Johnson1996 Dtsch Tierarztl Wochenschr 103 288-291；Windsor等人，1993 Reprod Fertil Dev 5 155-171，见综述)。这一领域已经提出了许多专利中请(例如US 4 362 246，WO84/01265，1984，WO-A-90/13303，US 5 135 759，WO 90/13315，EP-b-0475936和WO91/17188)。然而迄今只有荧光激活细胞分类(FACS)被证明是一种可靠的精子雌雄分离系统(见Johnson 1996 Dtsch TierarztlWochenschr 103 288-291)。FACS涉及使用能够渗透入精子细胞核并与核DNA结合的荧光染料。当分离的被染色的精子被紫外光照射时，它们会发出荧光，荧光的数量正比于精子中DNA的数量。因为X染色体比Y染色体长，携带X染色体的精子比携带Y染色体的精子含有更多的DNA。在这些基础上FACS能够区分出两种精子细胞类型，并产生非常高纯度(＞90％)的分离的精子库。

虽然在养牛业中使用FACS分离的精子接近于商业化，但是它在猪的育种业上的使用目前受到限制。这是因为分类速度太慢而不能有效的产生有性的人工受精剂量。对猪而言，目前每次的人工受精剂量需要30亿个精子，最大的分类速度在每小时1000万个细胞级别上。这就意味着FACS分离的精子在猪中只能与体外受精和胚胎移植结合使用，而这两种方法对猪而言都不是常规方法(这也严重限制了胚胎雌雄分离技术在猪上的应用)。然而有两个小组已经用这种方法产生了猪的幼崽，都是与位于美国Beltsville农业部的FACS技术先驱Larry Johnson合作(Rath等人1997 Theriogenology 47，795-800；Abeydeera and Day 1998 UMC Anim Sci Dept Rep 40-42)。两个小组都使用IVF和胚胎移植手术。这些小组的结果表明，虽然有30个胚胎被移植了，但只有大约4个存活到分娩。这一结果也表明对猪进行胚胎雌雄分离在现在并不是经济可行的选择。

对于FACS的另一个考虑是，在这一过程中使用的DNA结合染料和紫外激光都是对精子DNA的潜在损害。虽然FACS的实践者宣称使用这一技术降生的动物是正常的，但是很有可能在这一过程中介入了新的突变。使用FACS分离的精子受精之后的受胎率严重降低支持了这一观点。因而，精子雌雄分离和胚胎雌雄分离用来预先决定猪幼崽的性别并不具有实践的可能性。

基因调节和转移方法在产生转基因动物方面已经发生了重要的技术和观念发展。总体而言，取自不同物种的基因启动子序列已经被证明在适当地控制转基因表达上是有用的(Overbeek，P.A.等人，1985，PNAS USA 82：7815-7819；Lira，S.A.等人，1988，PNASUSA 85：4755-4759)。诱导表达转基因更为困难，虽然重金属诱导金属硫蛋白启动子已经被开发(Palmiter，R.D.等人，1982，Nature 300：611-615)。这一情况现在改变了，细菌Lac阻遏子已经被改造用于真核表达系统(Fieck A，等人，1992，Nuc Acid Res20(7)：1785-1791)。虽然酵母GAL4 DNA结合区域、单纯疱疹病毒VP16转录激活区域和孕酮受体配体结合区域已经被用来与孕酮类似物RU486结合使用，以发展用于转基因小鼠中转基因表达的诱导激活系统(Wang，Y.等人，1997，Nature Biotech.15：239-243)。此外，可诱导的CYP1A1启动子已经在转基因小鼠身上用于紧密调节转基因的表达，其使用3-甲基氯蒽烯作诱导物(见Campbell等人1996，Journal of Cell Science 109，2619-2625)。人单纯疱疹病毒VP 16转录激活区域(也叫做TIF)已经被置于细菌四环素启动子的控制之下，以便通过调节四环素的浓度而成功的控制体内转基因的表达(Furth，P.A.，等人，1994，PNAS 91：9302-9306；Baron，U.等人，1997，Nucl.Acids Res 15(14)：2723-2729)，或者处于昆虫激素系统的控制之下(NO，D.等人，1996，PNAS 93：3346-51)。进一步的发展是在转基因小鼠中使用细菌重组酶系统，例如cre-lox系统(Lasko，M.等人，1992，PNAS USA 89：6232-6236；Orban，R.C.，等人，1992，PNAS USA 89：6861-865)。Cre重组酶也被置于四环素反应启动子的控制之下，以便允许短暂的控制转基因表达(St-Onge，L.等人，1996，Res.24(19)，3875-3877)。

在此，我们推荐一种利用转基因技术来控制非人哺乳动物表型性别的新系统。虽然这一系统会导致动物不育，但它们的确具有以上列出的一些优势。这些包括如下：

1.同样表型性别的动物将很一致，为屠宰场提供了便利。

2.同样表型性别的动物几乎在同时达到市场重量，为生产者提供了便利。

3.繁殖表型雌性排除了阉割雄性的必要，提供了动物福利的好处。

因而，第一方面，本发明提供一个提供非人哺乳动物单一性别后代的方法，它包括将第一转基因亲本动物和第二转基因亲本动物进行杂交，其中所述第二转基因亲本动物已经在它的基因组中整合有一条或多条能够改变/修改整合到所述第一转基因亲本动物基因组的转基因的表达模式的DNA序列，这一转基因涉及性别表型的决定。

在本发明的上下文中，“改变/修改”表达包含各种可能性，包括阻止、增加或减少所考虑的序列的表达。另外，改变或修改表达能够发生在各种水平，包括转录、翻译和翻译后的修饰。阻止、减少和增加表达可以通过一次或多次重组事件的方式来达到，从而导致目标编码序列从动物基因组中去除。本分明的方法能够额外的包括提供第一和第二转基因亲本动物或其中之一的步骤。

在本发明方法这方面的一个实施方案中，方法包括：

(1)提供第一转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了涉及决定性别表型的第一DNA序列和阻止第一DNA序列表达的第二DNA序列；和

(2)提供第二转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了一段DNA序列，该序列包括生殖腺特异调节序列和一段编码序列，此编码序列在表达后会钝化、改变第一转基因亲本动物中的第二DNA序列的表达，或去除该第二DNA序列。

在本发明方法这方面的进一步实施方案中，方法包括：

(1)提供第一转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了一段两翼带有重组位点的涉及决定性别表型的DNA序列；和

(2)提供第二转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了一段DNA序列，所述序列包括生殖腺特异调节序列和一段编码序列，此编码序列在表达后会在第一转基因亲本动物中DNA两翼重组位点间产生重组。

特别的是，本发明的方法利用基于重组的系统，该系统在转录水平发生作用，也就是重组位点置于基因阅读框之外。

因而，本发明提供用遗传的方法操纵动物发育和表型的基础。更具体的是，本发明提供从导致发育性别转化的染色体性别提供生殖腺性别和表型性别受控偶联的遗传基础。

在一种方法中，“锁和钥匙”遗传控制机制，即两系动物被遗传改造。有一系叫做“锁”系，包括在基因组中整合具有选择的转录锁定或非功能形式的开放阅读框的转基因。第二系叫做“钥匙”系，包括在基因组中整合一受到组织专一性启动子序列转录控制的转基因“钥匙”。两系个体的交配使两转基因处于同一基因组。结果是“钥匙”转基因以组织专一性的模式表达，并打开了“锁定的”转基因，后者在同样限定的细胞和组织内具有了转录活性，导致它预设的发育和表型效果。

遗传“锁定”机制包括重组酶系统，例如cre-lox重组酶系统。在属于修饰和控制家畜的性别表型的本发明以及随后的实施例中，指导专一于生殖腺发育的转基因表达通过使用组织专一性启动子得以完成，包括SRY启动子和DMRT1启动子。

作为一种替代的方法，“分子剪刀”遗传方法能被修改以在发育和细胞专一性的基因组中切除对于特定的发育过程重要的基因，例如性别决定。现在，一系动物被遗传改变，以至一特定的基因被鉴定并“标记”，例如“lox”序列。另一系动物被产生，包含一“分子剪刀”转基因，例如，该转基因由组织和发育专一性启动子严格转录控制的cre细菌重组酶组成。两系个体的交配会使“分子剪刀”以组织和发育专一的方式表达，导致此细胞群体中被标记的基因序列发生基因切除。在属于性别表型的发育修饰的本发明的上下文中，目标基因组序列可能包括SRY、SOX9、SF1或任何涉及性别决定的基因，而分子剪刀的组织专一性的表达可能由SRY启动子或DMRT1启动子提供。

可替代的是，位点专一性重组系统自身的表达可能通过使用被外部试剂激活的启动子来控制。在这种方式中，转基因的最终表达可以通过在所选的时间加入外部试剂来控制。这种可控制的启动子的例子包括来自四环素诱导系统(见Forster等人1999，Nucleic AcidsRes 27 708-710)、蜕皮激素基因(见No等人1996，Proc NatlAcad Sci USA 93 3346-3351)、RU486诱导系统(见Wang等人1997，Nature Biotechnol 15 239-243)、锌诱导的金属硫蛋白基因(见Suppola等人1999，Biochem J 338 311-316)、CYP1A1基因(见Campbell等人1996，J Cell Sci 109 2619-2625)和Tet诱导系统(见Huang，等人，Mol.Med.5(2)：129-37(1999))的启动子。在哺乳细胞中任何可以被外部试剂诱导的启动子都可以服务于这一目的。

用于本发明方法的转基因非人动物遗传工程所用的遗传构建体构成了本发明的第二个方面。这些构建体可能包含一条或多条涉及性别表型决定的DNA序列和可选的一条或多条能阻止一条或多条涉及性别表型决定的DNA序列表达的DNA序列。

包含这些构建体的宿主细胞形成了本发明的第三个方面。

本发明第一方面所定义的非人转基因哺乳亲本动物自身形成了本发明的第四方面。优选的，这样的动物是猪、绵羊或牛。

本发明将通过以下实施例来描述，这些实施例不应该被理解成是对本发明的任何限制。

实施例有关的图示如下：

图一是猪SRY启动子序列克隆的图解描述；

图二是猪DMRT1启动子序列克隆的图解描述；

图三表示转SRYp-GFP转基因的e11.5小鼠胚胎的PCR性别鉴定，并且将生殖嵴中荧光的存在和XY基因型联系起来。

图四展示在猪生殖嵴细胞中DMRT1p-GFP转基因的表达。

图五表示猪DMRT1启动子在组织培养物中的活性。

实施例1

SRY基因座的5’侧翼序列和SRYp-GFP转基因

为了从猪的SRY基因座中克隆6.4kb的基因组HindIII DNA片段(Sinclair，A.H.等人，1990，Nature，346：240-4)，采用锚式PCR方法，与前面报道的用于克隆含有猪SRY开放阅读框的1.7kbEcoRI的基因组片段的方法相似(Daneau，I.等人，1996，BiolReprod.55(1)：47-53)。简要地，用HindIII限制性切割公猪基因组DNA，并用0.8％琼脂糖凝胶进行大小分离。切下6至8kb的条带，并连接到用HindIII酶切的pBS质粒(Stratagene)中，以提供大小选择的质粒文库。然后，用来自猪SRY基因座3’端的特定的有义引物(第一个引物5’-CACACAAACTGCTTGATTTCG和嵌套引物5’-TTCCCGTGATTAGCCATTAAGTACG)(Daneau，I.等人，1996，BiolReprod.55(1)：47-53)和来自质粒序列的引物(第一个引物5’-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG和嵌套引物5’-TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCA)完成锚式PCR。热稳定的聚合酶校正混合物(Expand High Fidelity；Roche)用于扩增。第一轮PCR扩增使用95℃45秒，56℃45秒和70℃4分钟的参数，共40个循环；随后是使用相同循环程序的嵌套PCR扩增。该策略被证明能成功的扩增基因组HindIII片段的3’端，该3’端克隆到pGEM-T载体(Promega)，并测序。

锚式PCR不能成功的用于产生猪HindIII片段的5’端，因此使用反向(reverse)PCR。用HindIII限制性切割公猪基因组DNA，切下6至8kb的条带，然后在有利于片段环化的稀释条件下连接。根据基因组HindIII片段的3’端设计有义引物，根据前面报道的猪SRY基因座的EcoRI基因组片段的5’端设计反义引物(Daneau，I.等人，1996，Biol Reprod.55(1)：47-53)。用引物对5’-AAGCTGATGGTCTCTTGTCTCTGTA和5’-TTCCTTTCGGCCATTAGAGCACTCA完成第一轮PCR；然后用嵌套引物对5’-CTTTCCAGTGCATATATTCCAAAGC和5’-CGGATGTTATAGAGTTGAATGCTAG完成第二轮PCR。对每个扩增，参数为95℃45秒，66℃45秒和70℃4分钟，共40个循环。将大约4kb的被扩增的条带连接到pGEM-T载体中，并测序。

以获得的猪SRY HindIII片段的5’端序列，以及前面报道的猪SRY的编码序列(Daneau 96)为基础，完成PCR扩增策略，以获得用于启动子研究的5’端侧翼序列。设计一个有义引物5’-AAGCTTGGGGAAATCTGTTCAGTA和两个反义引物5’-GGGGAAATCTGTTCAGTAG和(嵌套)5’-TTGAAAAGGGGGAGGAAGC。公猪基因组DNA作为模板。第一轮PCR扩增(如上所述)完成后，在相同的条件下完成第二轮，半嵌套PCR扩增。使用热稳定聚合酶ExpandHigh Fidelity。然后将4.5kb的被扩增的条带连接到质粒载体pGEM-T中，测序表明其代表猪SRY5’侧翼序列，因为其3’端与前面报道的序列相同(Daneau，I.等人，1996，Biol Reprod.55(1)：47-53)。

为了构建用于体外和体内鉴定的报告转基因，4.5kb的猪SRY5’端侧翼序列被放在修饰的增强型绿色荧光蛋白报告序列(pEGFP-1；Clontech)的前面，形成转基因SRYp-GFP。pEGF-1载体被修饰，使转基因的两侧是NotI限制性位点，以便于在前核微注射前转基因的线形化。用于猪SRY启动子和DNA序列的克隆策略分别描述在FIG1和FIG3A中。

猪DMRT1编码和启动子序列以及DMRT1转基因

为了便于克隆与性别决定相关的猪睾丸编码序列，按照制造商方案在Lambda Zap克隆载体(Stratagene)中构建睾丸cDNA表达文库。以人和小鼠DMRT1编码序列为基础设计异源DNA引物(有义：5’-ATGGTCATCCAGGATATTCCTGC)；反义：5’-TGCTGTCACCAGCAGAGGGCAT，以及对成年猪睾丸RNA做RT-PCR，产生针对454bp猪DMRT1的同源cDNA探针。然后，用猪cDNA探针对lambda表达文库筛选DMRT1编码序列，并分离全长猪DMRT1克隆。根据制造商方案，这些序列在体内从lambda载体中剪切下来，产生质粒pBK-CMVp-pDMRT1cDNA。为了产生420bp的双链DNA探针，以外显子1序列为基础，设计引物(有义：5’-GGCTGCAGAGCAGAGGCT；反义：5’-TGCACTTCTTGCACTGGCA)并完成PCR扩增。这个探针被用于对猪基因组DNA文库(Clontech)筛选DMRT1 5’端非翻译和启动子序列。一个阳性杂交克隆提供了2.7kb的猪DMRT1基因的5’侧翼序列。位于5’侧翼序列的5’端和3’端的序列被用于设计引物以扩增该区域，并将PCR产物置于GFP报告子质粒中，以形成DMRT1p-GFP质粒。用于猪DMRT1启动子和DNA序列的克隆策略分别描述在FIG2和FIG3B中。

转基因小鼠的产生和交配

通过常规前核微注射产生转基因小鼠(Hogan，B.等人，1994，操作小鼠胚胎：实验室手册第二版.冷泉港出版社，纽约)，所用胚胎来自FVB/N纯系小鼠(Taketo，M.等人，1991PNAS USA 88：2065-2069)。用Sephaglas Bandprep试剂盒(Pharmacia)从1％琼脂糖凝胶中纯化由启动GFP的4.5kb猪SRY 5’侧翼序列组成的线形化转基因，在缓冲液(Tris 0.5mM，EDTA 0.1mM)中稀释到1ng/μl的浓度，然后在注射前过滤(Ultrafree-MC离心过滤器，Millipore)。转基因被注射到单细胞小鼠胚胎的前核中。鉴定了9个最初的转基因动物，建立了7个系。在这7个系中，用装有落射荧光和对GFP最优的滤光片的Leica MZ FLIII立体显微镜(OmegaOptical)显像时，3个显示出强烈的生殖嵴荧光。其余的4个系显示出弱的或不能检测到的生殖嵴荧光。用在发育中的相关天数的胚胎解剖标本，对一个转基因系(SRYp-GFP#4)的GFP生殖嵴表达进行详细分析。从e11.5的胚胎至e15.5的胚胎中一致地检测到胚胎生殖嵴中的荧光(图4)。在e10.5的胚胎生殖嵴中，不能一致地检测到荧光。在e11.5，大约一半的转基因胚胎显示出生殖嵴荧光；通过基于DNA分析的PCR显示出这些胚胎是XY(图5)。从e12.5到e15.5，通过组织化学明显看出发荧光的生殖腺是睾丸，并且荧光的细胞模式反映曲细精管索的模式。因此，一致地在雄性胚胎中可见生殖嵴荧光，而在雌性胚胎中缺少。

猪生殖嵴细胞系和转染研究

从表达猪SRY的e22-23的胚胎中取出的生殖嵴细胞产生猪细胞系(Daneau，I.等人，1996，Biol Reprod.55(1)：47-53)。用SV40大T抗原和新霉素抗性质粒共转染这些细胞。使用Lipofectamine试剂(Gibco)完成转染。被转化的细胞放在96孔板上，并用G418抗性筛选。一个产生的猪生殖嵴细胞系，叫做9Ell，被选择作共转染研究。用Effectene试剂(Qiagen)在24孔培养平板上完成瞬时转染。每个孔有200,000个细胞。以每孔50、100和200ng/孔，用启动GFP表达的2.7kb猪DMRT1基因的5’侧翼序列组成的报告子质粒(DMRT1p-GFP)转染。通过荧光激活细胞分选仪计数10,000个细胞以确定产生的荧光量。这些转染实验的结果显示在图6中，其中增加的荧光与增加的质粒浓度相关。

实施例2：XX基因型转变为雄性表型

在本实施例中，期望的效果是所有的后代都有雄性表型，即有雄性表型的XY动物和有雄性表型的XX动物。为了实现该结果，使用“锁和钥匙”的方法。在第一个例子中，被“锁住”的转基因由在SRY启动子的转录调控下的SRY开放阅读框组成，但所述SRY开放阅读框通过位于正常转录起始位点上游的LOX-STOP-LOX序列盒而沉默或被锁住。该转基因被用作产生能繁殖出纯合子，并在外表、功能和生殖上正常的转基因动物系。“钥匙”转基因包括在DMRT1启动子序列的转录调控下的Cre重组酶蛋白质。

这用于产生第二系转基因动物，该动物再次繁殖产生纯合子，在外表、功能和生殖上正常，但在两种性别的发育的性腺中都表达Cre重组酶。这两个系的交配导致在性别决定的时候，发育的性腺中表达Cre重组酶。Cre重组酶将导致LOX-STOP-LOX盒的剪切，激活生殖嵴细胞中的SRY转基因。在XY动物中，性别决定不会改变，产生雄性表型。在XX动物中，SRY的表达将产生睾丸决定，这反过来将导致性变转别而产生雄性表型。通过这种方式将产生全部是雄性表型的动物。

在相似的方式中，“锁住”的转基因可以由在SRY启动子的转录调控下的SOX9开放阅读框组成，但所述SOX9开放阅读框通过LOX-STOP-LOX序列盒而沉默或被锁住。在相似的方式中，“锁住”的转基因的启动子可以由非组织特异性的强启动子组成，如巨细胞病毒(CMV)启动子。图7A中展示该实施例。

实施例3：XY基因型转变为雌性表型

在本实施例中，期望的效果是所有的后代都有雌性表型，即有雌性表型的XX动物和有雌性表型的XY动物。在第一个例子中，通过使用“锁和钥匙”的方法实现该结果。被“锁住”的转基因由在DMRT1启动子序列的转录调控下的SRY基因的反义序列组成，但所述反义序列通过位于反义序列上游的LOX-STOP-LOX序列盒而沉默(或“锁住”)。该转基因被用作产生能繁殖出纯合子，并在外表、功能和生殖上正常的转基因动物系。该“钥匙”转基因包括在DMRT1启动子序列的转录控制下的Cre重组酶蛋白质。这用于产生第二系转基因动物，该动物繁殖产生纯合子，在外表、功能和生殖上正常，但在性别决定的时候，两种性别的发育的性腺中都表达Cre重组酶。这两个系的交配导致在性别决定的时候，两种性别的发育的性腺中表达Cre重组酶。Cre重组酶将导致LOX-STOP-LOX盒的剪切，激活生殖嵴细胞中的反义SRY转基因。在XX动物中，性别决定不会改变，产生同正常一样的雌性表型。在XY动物中，反义SRY的表达将使内源的SRY转录本失活，并功能上使睾丸决定失活，这反过来将导致性别转变而产生雌性表型。通过这种方式将产生全部是雌性表型的动物幼崽。

在相似的方式中，“锁住”的转基因的反义序列可以是反义SOX9或反义SF1。在相似的方式中，“锁住”的转基因的启动子可以是非组织特异性的强启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子。图7B中展示该实施例。

XY基因型转变成雌性表型的另一个方法是通过“分子剪刀”的方法。在一个动物系中，用在Y染色体上的SRY开放阅读框两侧的lox序列“标记”SRY基因的基因组位点。在另一个动物系中，由在DMRT1启动子序列的转录调控下的Cre重组酶蛋白质组成的“分子剪刀”转基因被引入，并繁殖出纯合子。这两个系的交配导致在性别决定的时候，两种性别的发育的性腺中表达Cre重组酶。在从这个杂交而产生的XX动物中，没有Cre重组酶的靶点，而产生正常的雌性表型。在从这个杂交而产生的XY动物中，Cre重组酶将剪切“标记”基因组位点，在本例中即为SRY基因，干扰睾丸决定而导致雌性表型。通过这种方式将产生全部是雌性表型的动物幼崽。

在相似的方式中，“标记”的基因组位点可以是SOX9基因。在相似的方式中，“分子剪刀”转基因由在SRY启动子序列调控下的Cre重组酶组成。图7C中展示该实施例。

Claims (29)

1.一种在非人哺乳动物中提供单一性别后代的方法，包括将第一转基因亲本动物和第二转基因亲本动物杂交的步骤，其中所述第二转基因亲本动物已经在它的基因组中整合有一条或多条能够改变/修改整合到所述第一转基因亲本动物基因组的转基因的表达的DNA序列，所述转基因参与性别表型的决定。

2.权利要求1中所述的方法，包括：

(a)提供第一转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了参与性别表型决定的第一DNA序列和阻止第一DNA序列表达的第二DNA序列；以及

(b)提供第二转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了一段DNA序列，所述DNA序列包括生殖腺特异调节序列和编码序列，此编码序列表达后会钝化、改变第一转基因亲本动物中的第二DNA序列的表达，或去除该第二DNA序列。

3.权利要求1中所述的方法，包括：

(a)提供第一转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了一段侧翼带有重组位点并且参与性别表型决定的DNA序列；以及

(b)提供第二转基因亲本动物，它已经在其基因组中整合了DNA序列，所述DNA序列包括生殖腺特异调节序列和编码序列，此编码序列表达后会在第一转基因亲本动物中DNA序列侧翼的重组位点间发生重组。

4.权利要求2或3所述的方法，其中生殖腺特异调节序列是SRY或DMRT1启动子。

5.权利要求2至4中任一项所述的方法，其中参与性别决定的DNA序列是SRY、SOX9或SF1基因。

6.权利要求2、4或5中任一项所述的方法，其中第二DNA序列是“停止表达”序列。

7.权利要求6中所述的方法，其中“停止表达序列”是聚腺苷酸化信号。

8.权利要求2、4或5中任一项所述的方法，其中第DNA序列编码反义RNA分子。

9.权利要求6至8中任一项所述的方法，其中“停止表达序列”或反义序列侧翼具有位点特异性重组系统的靶序列。

10.权利要求9中所述的方法，其中靶序列是loxP或FRT位点，或者是源自lambda或mu噬菌体或细菌如沙门氏菌的位点特异性重组系统的靶序列。

11.权利要求9或10中所述的方法，其中“停止表达序列”或反义序列能够在位点特异性重组酶表达之后被删除，所述位点特异性重组酶作用于停止表达位点侧翼的侧翼序列。

12.权利要求11中的方法，其中位点特异性重组酶是cre、FLP或者来自lambda或mu噬菌体的或细菌如沙门氏菌的位点特异性重组系统。

13.权利要求11或12中所述的方法，其中位点特异性重组酶处于可控制的调节序列如启动子的控制之下，以便其表达可以如所期望的被激活。

14.权利要求13中所述的方法，其中表达可以在对动物使用特定的诱导物后被诱导，其中对动物使用特定的诱导物可以通过如添加入动物的饲料或静脉内注射来进行。

15.权利要求13或14所述的方法，其中调节序列是由来自于CYP1 A1或CYP 2B1基因的启动子提供的，或者由一个或多个tet-反应元件提供(TRE)，诱导通过使用PAH、TCDD、beta NF、PCBs、3-mc或强力霉素来完成。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中一个或两个转基因通过目标物种X或Y染色体上表达的但非必需的区域的序列分别被整合到X或Y染色体中。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中转基因被整合到胚胎干细胞的基因组。

18.权利要求17中所述的方法，其中选定的转基因胚胎干细胞系被注射到桑椹胚或胚泡，操作后的胚胎移植到合适的受体中。

19.权利要求18中所述的方法，其能产生能在其种系中传播转基因的嵌合动物。

20.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中转基因被整合进组织培养的全能细胞的基因组。

21.权利要求20中所述的方法，其中选定的转基因全能细胞被用作核移植程序中的核供体。

22.权利要求21中所述的方法，其中转基因重构的胚胎被移植到合适的受体中。

23.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中转基因在前核注射、脂质转染、电穿孔或转染之后被整合到受精卵的一个性染色体中。

24.权利要求23中所述的方法，其中操作后的胚胎被移植到合适的受体中。

25.权利要求24的方法，该方法能产生能在其种系中传播转基因的嵌合动物。

26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中非人哺乳动物是猪、牛、绵羊、山羊、兔或小鼠。

27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法产生的非人哺乳动物。

28.权利要求27中所述的非人哺乳动物的后代。

29.被权利要求1至16中的一个或多个特征所定义的转基因构建体。

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