CN105940106A - 用于使隐性基因显性的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于使隐性基因显性的材料和方法。这是通过对抑制隐性基因表达的天然机制进行干扰和/或通过对天然显性基因的表达进行干扰实现的。在优选实施方案中，本发明的方法既包括减少对隐性基因表达的抑制还包括增加对显性基因的抑制。

Description

用于使隐性基因显性的材料和方法
交叉引用相关申请
本申请要求于2013年11月9日申请的美国临时申请序列号61/902176的优先权，其在此以引证的方式全部并入本文。
用于此申请的序列表标记为SeqList-07Novl4-ST25.txt，其在2014年11月7日创建并且为22KB。序列表的全部内容在此以引证的方式全部并入本文。
背景技术
隐性基因是等位基因，其导致了仅见于纯合基因型(具有两个相同等位基因副本的生物体)并且在杂合基因型中从不可见的表型。因此，如果遗传特征是隐性的，动物需要继承待表达特征的基因的两个副本。
微核糖核酸(miRNAs)是在植物和动物中发现的小的非编码RNA分子，其在基因表达的转录和转录后的调节中发挥功能。它们由具有相似于靶标的相近序列的短义和反义序列组成(每条约24个碱基对)。当它们转录为单链RNA，形成发夹环，并且通过RNA诱导沉默复合体(RISC)处理为功能性微RNA。通过真核细胞核DNA编码，miRNA通过与mRNA分子内的互补序列碱基配对发挥功能，通常会通过表达抑制或靶标退化导致基因沉默。
动物miRNA通常只呈现对它们的mRNA目标的局部互补性。动物miRNA的5’端的长度为约6-8个核苷酸的“种子”区域被认为是靶特异性的重要决定因素。
发明简述
本发明提供了使隐性基因显性的材料和方法。这是通过对抑制隐性基因表达的天然机制进行干扰和/或通过对天然显性基因的表达进行干扰实现的。在优选实施方案中，本发明的方法包括减少对隐性基因表达的抑制和增加对显性基因的抑制。
在本文具体举例的实施方案中，隐性基因的天然抑制是通过改变隐性基因的序列减少的，使得通常会抑制基因表达的miRNA不再结合到隐性mRNA，因此不抑制基因的表达。
在优选实施方案中，对编码隐性基因的多核苷酸的改变不会导致对编码蛋白质的氨基酸序列的改变或者，如果有变化，是不会对蛋白质的功能性产生不利影响的微小的变化。在序列中的这种改变可以通过如利用遗传密码和相关的第三碱基“摆动”的简并实现。在另一个实施方案中，在一个物种(目标物种)中的隐性基因的基因可以由编码在另一物种中的相同蛋白质的基因替换，其中天然基因已经显著地与在目标物种中miRNA不匹配。
在本发明的进一步的实施方案中，通过引入靶向用于由显性基因表达的蛋白质的RNA的miRNA抑制显性基因的表达。在优选实施方案中，将相同基因的多种miRNA合并至3'端非编码区(UTR)，从而显著增强先前显性基因的敲除。因此，在本发明的一个实施方案中，在多顺反子串中提供了多种靶向单个显性基因的miRNA。
本发明还提供了用于使隐性基因显性的表达构建体和载体。
本发明还提供了根据本发明的方法所产生的动物。
附图说明
图1示出了根据本发明的方法用于供使用的构建体的质粒载体。
序列说明
SEQ ID NO：1示出了根据本发明的方法用于供使用的构建体的质粒载体。
发明详述
本发明提供了用于定制动物特征的材料和方法，其中本发明采用了在动物和靶向基因修饰中特征的遗传性质知识。在一个实施方案中，本发明的方法利用精原干细胞(SSC)的转移以允许产生定制特征的精子。在另一实施方案中，本发明的方法可以利用体细胞核移植(SCNT)。
根据本发明，特征的定制是通过使隐性基因显性的方法实现的。这是通过对抑制隐性基因的表达的天然机制进行干扰和/或通过对天然显性基因的表达进行抑制实现的。在优选实施方案中，本发明的方法包括减少对隐性基因表达的抑制和增加对显性基因的抑制。
在本文中具体举例的实施方案中，隐性基因的天然抑制是通过改变隐性基因的序列减少的，使得通常会抑制基因表达的miRNA不再结合到隐性基因的mRNA，因此不抑制基因的表达。
在优选实施方案中，对编码隐性基因的多核苷酸的改变不会导致对编码蛋白质的氨基酸序列的改变或者，如果有变化，是不会对蛋白质的功能性产生不利影响的微小变化。在序列中的这种改变可以通过如利用遗传密码和相关的第三碱基“摆动”的简并来实现。在另一实施方案中，在一个物种(目标物种)中隐性基因的基因可以由编码在另一物种中的相同蛋白质的基因替换，其中天然基因已经显著地与目标物种中miRNA不匹配。
在本发明的进一步的实施方案中，显性基因的表达是通过引入靶向用于由显性基因表达的蛋白质的RNA的miRNA抑制的。在优选实施方案中，将相同基因的多种miRNA合并至3'端非编码区(UTR)，从而显著增强先前显性基因的敲除。因此，在本发明的一个实施方案中，在多顺反子串中提供多种靶向单个显性基因的miRNA。
在一个实施方案中，本发明提供了用于降低动物中天然显性核酸序列的显性和提高天然隐性核酸序列的显性的方法，其中所述方法包括：
获得一个或多个具有显性作用的内源性核酸分子的雄性动物的精原干细胞(SSCs)；
提供包括抑制显性作用的内源性核酸分子的外源性多顺反子抑制性RNA核酸序列的改性构建体，并且还提供隐性作用的核酸分子的外源性核酸序列，其中在至少一个密码子中的碱基突变已经引入或存在(相对于在该物种中的野生型序列)以防止或减少抑制性RNA的分子的结合；和
将改性构建体引入进至少一个SSCs，从而获得至少一个包括抑制显性作用的内源性核酸分子的核酸分子和表达先前隐性作用的具有不同于表达天然隐性基因的野生型多核苷酸序列的核酸分子的第二核酸分子的SSC；并且
将一个或多个改性SSCs引入进雄性受体动物的生殖器官；而且可选地
采集供体来源，具有受精能力的由雄性受体产生的单倍体雄配子。
本发明的校正方法还可以使用体细胞核移植(SCNT)来实施。任何体细胞包括例如皮肤成纤维细胞可以从目标动物分离。隐性突变在该细胞中通过本文例举的用于SSC的相同的方法校正。所公知的体细胞核转移技术(克隆)然后用于创建与目标动物基因相同的动物，但是具有校正的隐性突变。
在优选实施方案中，改性构建体包括编码多顺反子抑制性RNA分子的核酸序列，其中所述多顺反子RNA分子包括多种抑制性RNA分子，其中所述抑制性RNA分子抑制有显性作用的内源性核酸序列。在一个实施方案中，改性构建体包括隐性作用的核酸分子的外源性核酸序列，其中在至少一个密码子中的碱基突变可以引入以防止，或减少抑制性RNA分子的结合。
在一个实施方案中，编码多顺反子抑制性RNA分子的核酸序列和编码突变的核酸序列，隐性作用的核酸的miRNA-抗性反转(version)存在于构建体中。
在一个实施方案中，编码多顺反子抑制性RNA分子的核酸序列和编码突变的核酸序列，隐性作用的核酸的抑制性RNA-抗性反转(version)存在于不同构建体中。
在一个实施方案中，至少一个改性SSC的基因包括核酸分子，其包括编码多顺反子抑制性RNA分子的核酸序列和编码隐性作用核酸分子的突变的、抑制性RNA-抗性反转的核酸序列。
术语
如本文中所使用的，“安格斯(Angus)”是指具有任何安格斯祖先的任何牛科动物。
如本文中所用的，术语“隐性等位基因”是指它的通常含义，即是一种等位基因，其表型不在杂合体中表达。
如本文中所用的，术语“显性等位基因”，是指它的通常含义，即是一种等位基因，其表型在杂合体中表达。
如本文中所用的，术语“表达构建体”是指核酸序列的组合，其提供了可操作地连接的核酸序列的转录。本发明的表达构建体也通常包括在可预期的宿主细胞中是有功能的调控因子，在其中对表达构建体进行了表达。调控因子包括启动子，转录终止序列，翻译终止序列，增强子和聚腺苷酸化因子。
本发明的表达构建体可以包括可操作地连接到编码本发明的肽的多核苷酸序列的启动子序列。启动子可以使用本领域中已知的标准技术合并至多核苷酸中。启动子或多个启动子的多个副本可以用在本发明的表达构建体中。在优选实施方案中，启动子可以定位于距转录起始点与在其天然遗传环境中距转录起始点相同的距离。在这个距离中的一些变化是允许的，而启动子活性没有显著下降。转录起始点通常包括在表达构建体中。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所描述的组分的并列，其中所述组分相互关联，允许它们以其预期方式发挥功能。在一般情况下，可操作地连接的组分为邻接关系。可操作地连接到编码序列的序列(多个)是能够影响编码序列的复制，转录和/翻译的。例如，当所述启动子能够指导编码序列的转录时，编码序列可操作地连接到启动子。
“编码序列”或“编码区”是转录成mRNA和/或翻译成多肽的多核苷酸序列。例如，编码序列可以编码感兴趣的多肽。编码序列的边界是由在5'末端的翻译起始密码子和在3'末端的翻译终止密码子确定的。
如本文所使用的，术语“启动子”是指可操作地连接到待转录的核酸序列的DNA序列，例如编码所需分子的核酸序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游并且通过RNA聚合酶和其它转录因子提供了用于特异性结合的位点。在具体实施方案中，启动子通常位于待转录以产生所需分子的核酸序列的上游，并且通过RNA聚合酶和其它转录因子提供了用于特异性结合的位点。
除了启动子，可以包括一个或多个增强子序列，例如但不限于巨细胞病毒(CMV)早期增强子因子和SV40增强子因子。其它所包括的序列是内含子序列，例如β球蛋白内含子或通用内含子。转录终止序列和mRNA聚腺苷酸化(pA)序列，例如但不限于SV40-pA,β-球蛋白-pA，人类生长激素(hGH)pA及SCF-pA。
在一个实施方案中，表达构建体包括聚腺苷酸化序列，例如源自牛生长激素(BGH)和SV40的聚腺苷酸化序列。
术语“聚A”或“p(A)”或“pA”是指发出用于转录终止和mRNA聚腺苷酸化的信号的核酸序列。聚A序列的特征在于六核苷酸序AAUAAA。常用的聚腺苷酸化信号是SV40pA，人类生长激素(hGH)pA，β-肌动蛋白pA和β-球蛋白pA。序列的长度可以在32至450碱基范围内。可以使用多个pA信号。
术语“载体”用来指任何用来传输编码信息(例如本发明的多核苷酸)到宿主细胞的分子(例如核酸，质粒或病毒)。
术语“表达载体”和“转录载体”可以互换使用来指适合用于宿主细胞(例如，受试者的细胞)并且包含指导和/或控制外源性核酸序列的表达的核酸序列的载体。
表达包括但不限于过程，例如转录，翻译和RNA剪接，如果存在内含子。根据本发明，有用的载体包括质粒，病毒，细菌人工染色体(BACs)，酵母人工染色体(YACs)等。特定病毒载体说明性地包括这些源自腺病毒，腺相关病毒和慢病毒的载体。
术语“分离”分子(例如分离的核酸分子)是指当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的分子。
术语“重组体”用来表示核酸构建体，在其中连接两个或多个核酸并且其并未在自然界中发现是连接的。
如本文中所用的，术语“核酸”是指具有多于一个的，以包括单链的、双链的寡核苷酸或多核苷酸的任何一种形式的核苷酸的RNA或DNA分子。
术语“核苷酸序列”是用来指在以核酸的单链形式的寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的顺序。
术语“表达”是指核酸序列的转录以产生相应的mRNA和/或mRNA的翻译以产生相应的蛋白质。
表达构建体可以重组或合成地生成或通过使用公知的方法合成DNA来生成。
如本文所用的，术语“调控因子”是指控制可操作地连接的核酸序列的表达的某些方面的核苷酸序列。示例性调控因子说明性地包括增强子，内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、聚腺苷酸化信号(pA)、启动子、转录终止序列和上游调控结构域，其有助于核酸序列的复制，转录，转录后的处理。本领域的普通技术人员能够选择和使用这些和其它调控因子用于表达构建体而不超出常规实验。
在一个实施方案中，本发明的构建体包括内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，表达构建体包括kozak共有序列。
“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物的生成的DNA区域，不论这种调节序列是否相邻于编码和/或转录的序列。因此，基因包括但不一定限于启动子序列，终止子，如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点的翻译调节序列，增强子，沉默子，绝缘子，边界单元，复制起点，基质附着位点和轨迹控制区域。
“靶标位点”或“靶标序列”是指定义为可结合分子结合到、为结合提供充足条件的部分核酸的核酸序列。
“外源性”分子指通常不出现在细胞内的分子，但是可以通过一个或多个基因的、生物的或其他方法引入到细胞。“通常出现在细胞内”是相对于细胞特殊的生长阶段和环境条件。因此，例如仅在肌肉的胚胎发育过程中存在的分子相对于成年肌肉细胞是外源性分子。类似地，由热休克诱导的分子相对于非热休克诱导细胞是外源性分子。外源性分子可以包括，如对于任何多肽或其片段的编码序列，有故障的内源性分子的功能版本或正常功能的内源性分子的故障版本。外源性分子也可以是与内源性分子相同类型的分子，但是可以源自不同于获得内源性分子的物种。例如，人类核酸序列可以引入到源于仓鼠或小鼠的细胞系。
“内源性”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如内源性核酸可以包括染色体，线粒体，叶绿体或其他细胞器的基因组，或天然存在的游离核酸。额外的内源性分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是在其中连接两个或多个亚基分子的分子，优选共价分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的示例包括但不限于融合蛋白(例如在ZFPDNA-结合结构域和切割结构域之间的融合)和融合核酸(例如编码如上描述的融合蛋白的核酸)。
“补体”或“互补序列”是指核苷酸序列，其根据Watson-Crick碱基配对规则形成了具有另一核苷酸序列的氢键双螺旋结构。例如，对于5'-AAGGCT-3'互补碱基序列是3'-TTCCGA-5'。本发明包括与任何本发明中要求的核苷酸序列互补的序列。
构建体的设计和传送
在一个实施方案中，改性构建体还包括可选择标记。根据本发明，有用的选择标记的示例包括但不限于抗生素抗性，荧光细胞分选标记，磁性细胞分选标记，以及它们的任何组合。适当的选择标记基因在本领域中是已知的，包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性，新霉素抗性，G418抗性，和嘌呤霉素抗性)的蛋白质的核酸分子，编码有色或荧光或发光蛋白质(例如绿色荧光蛋白，增强型绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白和荧光素酶)的核酸分子，和编码介导增强的细胞生长和/或基因扩增(例如，二氢叶酸还原酶)蛋白质的核酸分子。表位标签包括，例如一个或多个FLAG，His,myc，Tap,HA或任何可检测到的氨基酸序列的副本。
选择标记可以由任何重组酶(例如搭载(piggyback)TM，Cre-loxp重组酶，和Flp重组酶)切除。用于切除核酸序列的搭载TM，Cre-loxp重组酶，Flp重组酶的载体设计在本领域中是公知的。
如果需要，载体可以任选地包含指导位点特异性同源重组的侧翼核酸序列。使用侧翼DNA序列以允许同源重组到所需要的基因位点在本领域中是公知的。目前优选对应于染色体插入位点高达几千个碱基或更多的侧翼DNA存在于载体中编码序列的两侧(或本发明的任何其它序列通过同源重组插入染色体位置中)以保证染色体序列与外源性DNA的精确替换。例如参见Deng等，1993年，Mol.Cell.Biol 13(4):2134-40；Deng等，1992年，Mol Cell Biol 12(8):3365-71；和Thomas等，1992年，MolCell Biol 12(7):2919-23。还应当指出的是本发明的细胞可以包含感兴趣的基因的多个副本。
在一个实施方案中，使用位点特异性核酸酶将改性构建体引入SSCs中。根据本发明有用的位点特异性核酸酶包括但不限于转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)，锌指核酸酶(ZFN)，和/或RNA介导的、基于成簇的规律间隔的短回文重复(CRlSPR)/Cas蛋白的DNA核酸内切酶。TAL-效应核酸酶是一类允许序列特异性DNA切割使其能够进行位点特异性基因编辑的核酸。
位点特异性基因组编辑的材料和方法在本领域中是公知的。在某些实施方案中，将位点特异性核酸引入到能够使双链在基因组靶位点附近或在基因组靶位点内断裂的宿主细胞，其极大地增加在切割点或在切割点附近的同源重组的频率。在某些实施方案中，对核酸酶的识别序列仅存在于宿主细胞基因组中的靶部位，从而最大限度地减少通过核酸结合和分裂的任何脱靶基因。
在一个实施方案中，位点特异性核酸酶识别靶序列。在一个实施方案中，将特异性核酸酶设计为从内源性核酸分子切割预先确定的核酸序列，其中预先确定序列位于靠近内源性显性作用核酸序列。
可以使用在本领域任何已知的方法将位点特异性核酸酶引入到SSCs中。在一个实施方案中，将位点特异性核酸酶直接引入SSCs。在另一实施方案中，本发明涉及施用编码位点特异性核酸酶的核酸分子到SSCs中。在一个实施方案中，编码SSCs的核酸分子是在表达载体中。在一个实施方案中，校正载体包括编码位点特异性核酸酶的核酸分子。
可以在施用校正载体到SSCs之前，期间(或同时)和/之后将位点特异性核酸酶引入SSCs。
目标动物
根据本发明可以使其隐性作用的核酸序列(多个)显性的动物可以是任何物种，包括但不限于哺乳类动物，其包括但不限于驯养动物和实验动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠；家畜如马、牛、猪、绵羊、山羊、鸭、鹅和鸡；灵长类如猿、黑猩猩、猩猩、人类和猴子；鱼；两栖类动物如青蛙和蝾螈；爬行动物，如蛇和蜥蜴；和其他动物，如狐狸、黄鼠狼、兔、貂、海狸、白鼬、水獭、紫貂、海豹、狼、龙猫、鹿、麝鼠和负鼠。
在某些实施方案中，动物是来自于马科，牛科，犬科，猫科和猪科的任何家族。在一个实施方案中，动物不是人类。在一个具体的实施方案中，动物是牛科动物。在优选实施方案中，牛科动物是黑安格斯品种。在某些实施方案中，本发明的牛科动物可以包括但不限于驯养的牛，野牛和水牛(例如，水牛和非洲水牛)。
核酸酶介导的位点特异性基因组编辑
位点特异性基因组编辑的方法在本领域是公知的。在一些实施方案中，本发明使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)、锌指核酸酶(ZFN)和/或RNA介导的、基于成簇的规律间隔的短回文重复(CRlSPR)/Cas蛋白的DNA核酸内切酶用于特异性基因组编辑，所有这些在本领域是公知的。参见Gaj等,ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-Based Methodsfor Genome Engineering,Trends in Biotechnology,July 2013,Vol.31,No.7,其全部内容以引证的方式并入本文。
TALENS(转录激活因子样效应物核酸酶)是核酸酶(例如Foki)切割结构域和来自TALE蛋白的DNA结合结构域的融合体。TALEs包含多个33-35氨基酸的重复结构域，其中每个识别一个碱基对。TALENS可以诱导双链断裂以激活DNA损伤应答途径和启用自定义改变。
ZFN(锌指核酸酶)是来自限制性内切酶(例如FokI)的非特异性的DNA切割结构域和锌指蛋白的融合体。ZFN二聚体诱导靶DNA双链断裂以刺激DNA损伤应答途径的。所设计的锌指结构域的结合特异性指示ZFN到特定基因组位点。ZFNickases(锌-指切口酶)是在两个核酸(例如FokI)切割结构域之一中包含失活突变的ZFN。ZFNickases仅使单链DNA断裂并在不激活突变的NHEJ途径的情况下诱导HDR。
ZFN被设计为由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域构成的双链断裂诱导剂。设计的ZFN由两种锌指阵列(ZFAs)组成，每个融合到非特异性内切核酸酶的单个亚基上，例如来自的FokI酶的核酸结构域，其在二聚作用下激活。通常，单个ZFA由3或4个锌指结构域组成，其中每个被设计为识别特定核苷酸三连体(GGC，GAT等)。在某些实施方案中，由两个“3-手指”ZFA组成的ZFN能够识别18碱基对靶位点；18碱基对识别序列一般是唯一的，即使是在例如人类和植物的大基因组中。通过引导两个FokI核酸酶单体的共定位和二聚，ZFNs产生在DNA靶位点创建双链断裂(DSB)的功能化位点特异性核酸内切酶。
锌指结合结构域可以被“设计”以结合到预期的核苷酸序列上。用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性实施例是设计和选择。设计的锌指蛋白是在自然界中未出现的蛋白质，其设计/组成主要依据合理的规则。设计的合理规则包括替换规则的应用和在现有ZFP设计和绑定数据的数据库储存信息中处理信息的计算机化算法。参见，例如，美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261。还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
CRISPR/Cas(CRISPR相关)(成簇的规律间隔的短回文重复)系统是包含多个短同向重复序列并提供获得性免疫给细菌和古细菌的位点。CRISPR系统回复用于外源DNA入侵的序列特异性沉默的crRNA和tracrRNA。三种类型的CRISPR系统存在：在II型系统、Cas9作为RNA诱导的DNA核酸内切酶以根据crRNA-tracrRNA靶识别切割DNA。
crRNA：CRISPR RNA碱基对与tracrRNA形成引导Cas9核酸内切酶到用于切割的互补DNA位点的双RNA结构。
双链断裂(DSB)是当两个DNA链被切割时发生的DNA损伤的一种形式。DSB可以是TALENS、ZFNs和CRISPR/Cas9作用的产物。
同源定向修复(HDR)是用于DSB修复的模板依赖性途径。通过供应含同源供体模板和位点特异性核酸酶，HDR在靶位点可靠地插入供体分子。这种方法使一个或多个转基因能够插入，以及使单核苷酸能够取代。
NHEJ(非同源末端连接)是将两个断裂的端部绑或连接在一起的DSB修复途径。NHEJ不使用同源模板进行修复，因此通常在断裂部位会导致引入小插入和缺失。
PAM(前间区序列邻近基序)是在crRNA上出现并能被Cas9特异性识别和需要，用于DNA切割的短核苷酸序列。
tracrRNA(反式激活嵌合RNA)是促进crRNA处理并被Cas9需要用于激活RNA诱导的切割的非编码RNA。
在一个实施方案中，位点特异性基因组编辑方法包括使宿主细胞与包含待整合到基因组靶位点的外源核酸的一个或多个整合的多核苷酸接触，并与能够在基因组靶位点附近或靶位点内引起双链断裂的一个或多个核酸酶接触。在基因组靶位点附近或靶位点内的切割极大地增加切割位置处或附近的同源重组的频率。
在某些实施方案中，位点特异性核酸酶在细胞染色质中切割DNA，并有利于外源序列(供体多核苷酸)的靶向整合。在用于靶向整合的某些实施方案中，一个或多个锌指或TALE DNA结合结构域被设计为在预定切割位点处或附近结合靶位点，且包含所述设计的锌指或TALE DNA结合结构域和切割结构域的融合蛋白在细胞中表达。一旦融合蛋白的锌指或TALE DNA结合部分结合到靶位点，DNA就优选通过双链断裂在靶位点附近被切割结构域切割。双链断裂的存在有助于本文中所述的外源序列通过NHEJ机制来整合。
外源(供体)的序列可以先于、同时或后于融合蛋白(多个)的表达而引入细胞。
“重组”是指两个多核苷酸之间遗传信息交换的过程。如本文中所使用的，“同源重组(HR)”指的是这样交换的特殊形式，该交换例如在细胞中双链断裂的修复过程中发生。该过程需要核苷酸序列的同源性，使用“供体”分子到“靶”分子(即经历双链断裂的分子)的模板修复，并多方面地被称为“非交叉基因转变”或“短道基因转变“，由于它导致从供体到靶标的遗传信息的转移。
“切割”是指DNA分子的共价主链的破裂。切割可以通过多种方法开始，包括但不限于酶或磷酸二酯键的化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可作为两个不同的单链切割事件的结果发生。DNA切割可以导致平末端或交错末端的产生：
“切割结构域”包括具有用于切割DNA的催化活性的一个或多个多肽序列。
“切割半结构域”是与第二多肽(相同的或不同的)结合形成具有切割活性(优选双链切割活性)的复合物的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明使用位点特异性核酸酶的外源核酸的无标记物基因组整合。在一个实施方案中，外源供体多核苷酸被引入到宿主细胞中，其中所述多核苷酸包含第一同源区域(HR1)和第二同源区域(HR2)位于其侧翼的感兴趣(D)的核酸。HR1和HR2分别与基因组靶位点(TS)的5'和3'区域共有同源。位点特异性核酸酶(N)也引入到宿主细胞中，其中所述核酸能够在靶位点内识别和切割独特序列。一旦双链通过位点特异性核酸酶在靶位点断裂，内源同源重组与不包含双链断裂的靶位点相比，机械地在切割靶位点以更高的频率整合感兴趣的核酸。
各种方法可用来识别在靶位点处或附近具有改变的基因组的那些细胞，而无需使用选择性标记物。在一些实施方案中，用这样的方法检测靶位点的任何变化，且包括但不限于PCR技术、测序方法、核酸酶消化，例如限制性图谱、Southern印迹以及它们的任何组合。
根据本发明有用的切割结构域可以从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。切割结构域从其衍生的示例性核酸内切酶可以包括但不限于限制性内切酶和归位内切核酸酶。如参见,2002-2003Catalogue,New EnglandBiolabs.Beverly,Mass.；和Belfort等.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(如S1核酸酶、绿豆芽核酸酶、胰脱氧核糖核酸酶I、微球菌核酸酶、酵母HO内切酶；参见Linn等(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。归位内切核酸酶和巨核酸酶的非限制性实施例包括已知的I-SceI、I-CeuI、PI-PSPI、PI-SCE、I-SceIV、I-Csml、Ⅰ-PANL、Ⅰ-Scell、Ⅰ-PPOL、I-SceIII、I-Crel、Ⅰ-Tevl、Ⅰ-TeVll和I-TevIII。参见美国专利5,420,032；美国专利6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等(1989)Gene 82:1 15-1 1 8；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1 125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和新英格兰生物学实验室目录。
限制性核酸内切酶(限制性内切酶)存在于许多物种中，且能够序列特异性结合到DNA上(在识别位点)并在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性内切酶(例如IIS型)在从识别位点去除的位点切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的双链切割，在一个链上从其识别位点的第9个核苷酸切割而在另一个链上从其识别位点的第13个核苷酸切割。如参见美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；还有Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性内切酶的切割结构域(或切割半结构域)和一种或多种锌指结合结构域，其可以被设计或不设计。
识别序列是由双链断裂诱导剂特异性识别和/或结合的任何多核苷酸序列。识别位点序列的长度可以变化，并且包括例如至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多核苷酸长度的序列。
在一些实施方案中，识别序列是回文的，即在一条链上的序列读数与互补链相反的方向上的序列是相同的。在一些实施方案中，所述切割位点位于识别序列内。在其他实施方案中，所述切割位点位于识别序列之外。在一些实施方案中，切割产生平的末端。在其他实施方案中，切割产生单链突出端，即“粘性末端”，它可以是5'突出端或3'突出端。
在本文提供的方法的一些实施方案中，一个或多个核酸酶是位点特异性重组酶。位点特异性重组酶，也被称为重组酶，是催化其兼容重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽，并且包括天然多肽以及其衍生物、变体和/或保留活性的片段以及天然的多核苷酸、衍生物、变体和/或编码保存活性的重组酶的片段。识别位点的范围为约小至30个核苷酸到几百个核苷酸。任何用于重组酶的识别位点，包括天然存在的位点和变体，可以被使用。
在本文提供的方法的一些实施方案中，一个或多个核酸酶是转座酶。转座酶是介导转座子从基因组上一个位置到另一个位置转座的多肽。转座酶典型地诱导双链断裂以切除转座子，识别末端重复序列，并使切除的转座子的末端在一起。在一些系统中，其他蛋白质也需要在转座过程中使端部在一起。转座子和转座酶的实施例包括但不限于Ac/Ds、Dt/rdt、Mu-Ml/Mn和来自玉米的Spm(En)/dSpm元素、来自金鱼草的Tam元素、来自噬菌体的Mu转座子、细菌转座子(Tn)和插入序列(IS)、酵母(逆转录转座子)的Ty元素、来自拟南芥(逆转录转座子)的Tal元素、来自果蝇的P元素转座子(Gloor等,(1991)Science 253:11 10-1 1 17)，来自果蝇的Copia、Mariner和Minos元素、来自家蝇的Hermes元素、来自Trichplusia ni的PiggyBackTM元素、来自C.elegan的Tcl元素和来自小鼠的IAP元素(逆转录转座子)。
Cre-ToxP重组系统是用于在细胞或转基因动物的DNA中进行位点特异性缺失、插入、易位、倒位的位点特异性重组技术。Cre重组酶蛋白(由最初命名为“导致重组”的轨迹编码)包括四个亚基和两个结构域：较大的羧基(C端)结构域和较小的氨基(N端)结构域。loxP(PI以上的X轨迹)是在噬菌体PI上的位点并由34个bp组成。Cre重组酶介导的重组的结果取决于loxP位点的位置和取向，其可顺式或反式定位。在顺式定位的情况下，loxP位点的方向可以相同或相反。在反式定位的情况下，所涉及的DNA链可以是直链或环形。Cre重组介导的重组的结果在顺loxP位点的情况下可以是间插序列的切除(当loxP位点位于相同的方向)或倒位(当loxP位点位于相反的方向)，或在反式loxP位点的情况下将一个DNA插入另一个DNA分子中或两个分子(染色体)之间的易位。Cre-LoxP重组系统在本领域是公知的，如参见Andras Nagy,Crerecombinase:the universal reagent for genome tailoring,Genesis 26:99-109(2000)。
Lox-stop-Lox(LSL)盒可防止在不存在Cre介导的重组的情况下转基因的表达。在Cre重组酶存在的情况下，LoxP位点重组且停止盒被删除。Lox-stop-Lox(LSL)盒在本领域是公知的。参见Allen Institute for BrainScience,Mouse Brain Connectivity Altas,Technical White Paper:Transgenic Characterization Overview(2012)。
用于实施本发明方法的材料
本发明还提供用于在动物中代替显性作用的核酸序列的材料。在一个实施方案中，本发明提供包含改性构建体，位点特异性核酸酶，和任选地基因组包含显性作用核酸序列的雄性动物的一个或多个精原干细胞的组合物。
任选地，该组合物可能还包括对执行本发明的改性方法有用的任何材料。该试剂盒还可以包括，例如载体、培养基、防腐剂、稀释剂、用于检测可检测剂(例如选择标记物)的必要组分。
传送方法
本文中所述的核酸(包括编码位点特异性核酸酶或校正构建体的核酸分子)可使用任何合适的方法引入细胞。核酸酶也可以被直接引入细胞。例如，每个都包括编码上述多肽之一的序列的两个多核苷酸可被引入细胞，且当多肽被表达并且每个结合到其靶序列上时，在靶序列处或附近发生切割。或者，包含编码两个融合多肽序列的单个多核苷酸被引入细胞。多核苷酸可以是DNA、RNA或任何经修饰的形式或DNA和/或RNA的类似物。
在某些实施方案中，一种或多种蛋白质可以克隆到载体中来实现细胞转染。可使用的任何载体系统包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体，等等。参见美国专利6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,1 13；6,979,539:7,013,219；和7,163,824,其全部内容以引证的方式并入本文。
在某些实施方案中，核酸酶和外源序列在体内或离体的细胞中传送。用于传送多核苷酸到细胞中的非病毒载体传送系统包括DNA质粒、裸核酸和与例如脂质体或泊洛沙姆的传送载体络合的核酸。
用于传送核酸酶和核酸分子的基于病毒的传统系统包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和用于基因转移的单纯疱疹病毒载体。宿主基因组中的整合可能使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法，经常会导致插入的转基因的长期表达。此外，高的转染效率已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到。
例如在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和体外基因治疗程序，腺相关病毒(“AAV”)载体也用于转导具有靶核酸的细胞。(参见如,West等,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建在许多出版物中描述，包括美国专利5,173,414；Tratschin等Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hennonat&Muzyczka,PNAS81:6466-6470(1984)；和Samulski等J.Virol.63:03822-3828(1989)。
重组腺相关病毒载体(rAVV)是有希望替代基于缺陷的和非致病性细小病毒腺相关2型病毒的基因传送系统。所有载体都衍生自仅保持AAV145bp反向末端重复序列位于转基因表达盒侧面的质粒。由于融入转导细胞的基因组，有效的基因转移和稳定的转基因传送是这种载体系统的主要特征。(Wagner等Lancet 351:91 17 1702-3(1998),Kearns等Gene Ther.9:748-55(1996))。
体内或体外核酸的非病毒传送方法包括电穿孔、脂转染、显微注射、生物射弹、病毒颗粒、脂质体(参见Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等BioconjugateChem.5:382-389(1994)；Remy等Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利4,1 86,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028,和4,946,787)、免疫脂质体、聚阳离子或脂质核酸结合物、裸DNA、人工病毒体、病毒载体系统(例如WO2007/014275中所述的用于传送包含ZFs的蛋白质的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯疱疹病毒载体)和增强DNA摄取的制剂。
脂转染在例如美国专利5,049,386；美国专利4,946,787；和美国专利4,897,355中描述，且脂转染试剂是市售的(例如TransfectamTM.和LipofectinTM)。适合于多核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424，WO 91/16024。传送可以到细胞(体外施用)或靶组织(体内施用)。
另外示例性的核酸传送系统包括由Amaxa Biosystems公司(德国科隆)、Maxcyte公司(马里兰州罗克维尔)和BTX分子递送系统(麻州霍利斯顿)和Copernicus Therapeutics公司提供的核酸传送系统(参见如美国专利6,008,336)。
显微注射：直接显微注射DNA引入到包括卵或胚胎细胞的各种细胞，也被有效地用于转化许多物种。在小鼠中，体外培养的多能胚胎干细胞(ES)的存在已经用来产生转化小鼠。ES细胞可在培养基中转化，然后显微注射到小鼠胚泡中，它们融入发育中的胚胎并最终产生生殖系嵌合体。通过兄弟姐妹的杂合杂交，可以得到携带所需基因的纯合动物。
精原干细胞转移
用于实施精原干细胞转移的方法在本领域中是公知的。
在一个实施方案中，根据本发明有用的SSC转移的方法，包括：雄性供体动物提供精原干细胞(SSCs)；
将供体SSCs引入不育雄性受体动物的生殖器官，从而雄性不育受体产生供体来源的、有受精能力的单倍体雄配子；且可选地，收集不育雄性受体产生的供体来源的、有受精能力的单倍体雄性配子。
在某些实施方案中，所述SSC转移法使用无菌、杂种雄性受体动物或已经基因修饰以具有遗传雄性不育的不育雄性受体动物。
在一个实施方案中，受体雄性动物是转基因的，使得其具有完整的精子隔室，但不能产生精子。
在某些实施方案中，不育受体动物可通过缺失或失活的基因突变产生，包括但不限于无精子症缺失(DAZL)；在精核中与DNA包装相关的鱼精蛋白的基因(例如PRML、PRM2)；Y染色体的无精子因子(AZF)区域的基因(这些基因包括但不限于USP9Y)；雄性减数分裂相关的基因(这些基因包括但不限于含有蛋白1(HORMAD1)的HORIVIA结构域)。在另一个实施方案中，不育受体动物可以通过支持细胞单一综合征相关遗传突变来产生(这些基因突变包括在USP9Y上的突变)。
在一个具体实施方案中，受体雄性动物是转基因的，使得其不表达功能性无精子症缺失(DAZL)蛋白。在一个具体的实施方案中，受体雄性动物是转基因的，使得DAZL基因被删除。
在一个具体的实施方案中，受体雄性动物是转基因的，使得DAZL基因不编码功能性DAZL蛋白。
如本文中所使用的，失活突变是指导致由DNA分子编码蛋白质的功能减少至少30％的任何突变(DNA分子基因的改变)。在一个实施方案中，本发明提供了用于实现精原干细胞(SSN)转移的方法，其中该方法包括：
雄性供体动物提供精原干细胞(SSCs)；
将供体SSCs引入不育、杂交的雄性受体动物的生殖器官，从而不育、杂交的雄性受体动物产生供体来源的、有受精能力的、单倍体雄配子；且可选择地，
收集不育、杂交的雄性受体动物产生的供体来源的、有受精能力的、单倍体雄配子。
如本文所用的术语“杂交动物”是指与两种不同物种亲子杂交的动物。杂交雄性动物通常是不育的、不能产生有受精能力的、单倍体雄性配子。杂交动物的实施例包括但不限于骡(马和驴之间的杂交)、狮虎(狮子和老虎之间的杂交)、yattles(牦牛和水牛之间的杂交)、犏牛(牦牛和公牛之间的杂交)、薮猫和豹猫/家猫之间杂交的杂交动物。
在另一个实施方案中，根据本发明有用的SSC的转移的方法，包括：雄性供体动物提供精原干细胞(SSCs)；
将供体SSCs引入转基因、不育雄性受体动物的生殖器官，从而雄性受体产生供体来源、有受精能力的、单倍体雄性配子，其中不育雄性受体动物是转基因的，使得其具有完整的精子隔室，但不能产生精子；且可选地，
收集不育雄性受体产生的供体来源、有受精能力的、单倍体雄性配子。
在另一个实施方案中，本发明提供用于实现精原干细胞(SSC)转移的方法，其中该方法包括：
雄性供体动物提供精原干细胞(SSCs)；
将供体SSCs引入转基因雄性受体动物的生殖器官，从而受体产生供体来源、有受精能力的、单倍体雄性配子，其中不育雄性受体动物是转基因的，使得受体动物产生的天然雄性配子表达至少一种可检测的生物标记标签；可选择地
基于可检测的生物标记标签从受体动物产生的供体来源雄性配子中区分出受体动物产生的天然雄性配子；且可选择地
收集受体动物产生的供体来源、有受精能力的、单倍体雄性配子。
在一个具体的实施方案中，受体动物产生的天然雄性配子表达至少一种可检测的细胞表面生物标记(例如细胞表面抗原标签)。
在一个实施方案中，受体动物产生的天然雄性配子表达发光蛋白质。在一个实施方案中，受体动物产生的天然雄性配子是通过流式分选从受体动物产生的供体来源的雄性配子分离，例如荧光激活细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)。
在一个实施方案中，转基因受体雄性动物包括用于在天然雄配子细胞表面上表达的报告基因。在某些实施方案中，报告基因编码发光蛋白质。
如本文所用的术语“发光蛋白质”，是指能发射光的蛋白质。根据本发明有用的发光蛋白质包括但不限于荧光蛋白和磷光蛋白质，荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白和红色荧光蛋白。荧光蛋白是一类共享自给自足独特属性以在其自身多肽序列内形成来自三个氨基酸序列的可见波长发色团的蛋白质成员。包括荧光蛋白的各种发光蛋白质是公知的。根据本发明有用的荧光蛋白包括但不限于美国专利7,160,698、美国申请公开号2009/0221799、2009/0092960、2007/0204355、2007/0122851、2006/0183133、2005/0048609、2012/0238726、2012/0034643、2011/0269945、2011/0223636、2011/0152502、2011/0126305、2011/0099646、2010/0286370、2010/0233726、2010/0184116、2010/0087006、2010/0035287、2007/0021598、2005/0244921、2005/0221338、2004/0146972和2001/0003650公开的荧光蛋白，所有这些以引证的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，供体SSC被引入雄性受体动物的睾丸中。
在一个实施方案中，受体动物产生的雄性配子是精子。
在一个实施方案中，供体精原干细胞(SSCS)表现出有前景的遗传背景。在一个具体的实施方案中，供体动物来自牛的范畴，包括但不限于普通牛(国内牛)。
在某些实施方案中，受体动物可以是成年动物或未成年动物。在一个实施方案中，受体动物处于发育期。
在进一步的实施方案中，本发明还包括使用受体动物产生的供体来源、有受精能力的、单倍体雄性配子从有前景的动物物种中使卵受精的步骤。卵受精的方法在本领域是已知的，包括但不限于胞浆内单精子注射(ICSI)和圆形精子细胞注射(ROSI)。
受体杂交动物、受体动物和/或供体动物的亲代可以是任何动物物种，包括但不限于猫、小鼠、老鼠、狼、小狼、小狗、龙猫、鹿、麝鼠、狮子、老虎、猪、仓鼠、马匹、牛、羊、山羊、鸭、鹅、鸡、例如猿、黑猩猩、猩猩、猴子的灵长类动物和人类。
在某些实施方案中，受体杂交动物、受体动物和/或供体动物的一个或两个亲代可以是任何脊椎动物，包括鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物。在某些实施方案中，受体杂交动物、受体动物和/或供体动物的一个或两个亲代不是人类。
在某些实施方案中，受体杂交动物、受体动物和/或供体动物的一个或两个亲代可以来自马科、牛科、犬科、猫科以及猪科的任何家族。
哺乳动物精原干细胞(SSCS)自我更新并产生用于在整个雄性成年生活中分化成精子的子细胞。SSC可以通过本领域中已知的功能测定来识别，例如移植技术，其中供体睾丸细胞注射到不育受体的细精管中。
在一个实施方案中，供体精原干细胞可以冷冻保存和/或体外培养。冷冻精原干细胞可以在体外生长并在保存期间再次冷冻保存。
精原干细胞可以在含血清或无血清培养基中培养。在一个实施方案中，细胞培养基包含Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，和任选，胎牛血清。
在某些实施方案中，SSC培养基可以包含一种或多种成分，包括但不限于神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF2)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、表皮生长因子(EGF)、干细胞因子(SCF)、B27-minus维生素A、Flam'sF12营养混合物、2-巯基乙醇和L-谷氨酰胺。
移植精原干细胞到受体生殖器官(如，睾丸)的方法在本领域中是公知的。移植可以经显微注射通过直接注射到细精管，或经显微注射通过注射到输出小管，从而允许SSC到达受体的睾丸网。移植的精原干细胞粘附到受体细精管的管壁，然后分化和发育成精母细胞、精子细胞和精子，最后转移到附睾之后成熟。
用于将一个或多个SSC引入受体雄性的方法还包括注入到输精管和附睾或在胎儿或幼年睾丸上的操作，以最小创伤切断睾丸覆盖内的曲细精管的技术，这允许注射细胞进入小管的切割端。可替代地，仍处于发育的新生儿睾丸(或睾丸)都可以使用。
具体实施方式
以下是示出用于实践本发明的程序和实施方案的实施例。这些实施例不应被理解为限制。
实施例1
在一个实施方案中，本发明提供用于使隐性基因显性的方法，其使用与表达构建体结合的显性版本的以多顺反子miRNA为基础的抑制，该表达构建体携带先前隐性基因的miRNA抗性的版本因此使得这样的基因显性。
动物中的毛色是由单一颜料，黑色素，引起的。存在两类黑色素：产生金色或红色的褐黑素和产生深褐色或黑色颜色的真黑色素。黑色素这两种类型由酪氨酸合成，但他们的合成途径在产生多巴醌后发生分歧。控制特定的黑素细胞是否产生褐黑素和真黑色素的初级开关是黑皮素受体。
在黑安格斯牛中，黑色毛色是由黑皮素受体激活突变引起的。在这些牛中，黑皮素受体始终是“开”，导致黑色毛色的显性特征。根据本发明，使用多顺反子miRNA将黑皮素受体的黑安格斯类型淘汰，然后已被修改使其不再匹配所述miRNA的黑皮素受体的功能性复制被添加。
实施例2
SEQ ID NO：1和图1示出根据本发明的方法的用于构建体使用的质粒载体。NotI和BglII之间的13512bp段是能通过任意的各种方法整合到动物基因组序列的部分。
该构建体包含几个重要特征。
(1)组织特异性启动子(在这种情况下，酪氨酸酶启动子，但是这将根据所需的表达位置而改变)；
(2)产生白色毛色的PMEL的突变形式。除了突变，该序列已被改变，使得它不再受miRNA抑制；
(3)四种不同的小干扰RNA，并入miR30侧翼区域和环。需要注意的是，为了避免二级结构，来自四个不同物种的miR30序列已被使用(在这种情况下，人类、小鼠、狗和nelore牛)。任何显著不同的miR30可以被使用；然而，尽管它们属于不同组，但是人类miR30与猕猴、黑猩猩、大猩猩的几乎相同。小鼠序列与大鼠的几乎相同。狗序列与熊和大熊猫的几乎相同。nelore牛与黄牛和羊品种的几乎相同。最后，虽然在这里具体例举一组四个miR30，任何天然父系的miR可以使用。例如，17-92簇或25-93-106簇，可以使miR序列替换，但保留了5'，3'，和环结构；
(4)聚腺苷酸化序列，内含子和增强子。SV40在这里使用，但任何大数目是可用的。
应当理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，根据其各种修改或变化将对本领域的技术人员是显然的并包括在本申请的精神和范围内。
所有提及或本文引用的专利、专利申请、临时申请和出版物通过引证的方式全部并入本文，包括所有附图，表格和序列，在某种程度上它们不与本说明书的明确教导发生矛盾。

Claims (20)

1.一种用于使隐性基因显性的方法，其中所述方法包括：
a)使用抑制隐性基因表达的天然机制进行干扰；
b)使用天然显性基因的表达进行干扰；或a)和b)两者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法既包括减少对隐性基因表达的抑制，还包括增加对显性基因的抑制。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过改变隐性基因的多核苷酸序列减少对隐性基因的抑制，使得通常会抑制基因表达的miRNA不再结合到隐性mRNA上。
4.根据权利要求3所述的方法，其中对隐性基因的多核苷酸序列的改变不会导致对编码蛋白的氨基酸序列的改变或者，如果有改变，它不会对蛋白质的功能产生不利影响。
5.根据权利要求4所述的方法，其中一个或多个改变是基于遗传密码的简并。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将在一个物种中的隐性基因替换为在第二物种中编码相同蛋白质的基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其中通过引入miRNA抑制显性基因的表达，所述miRNA靶向显性基因表达的蛋白质的RNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将多个相同基因的miRNA合并到3'非编码区（UTR）。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在多顺反子串中提供了所述多个靶向单个显性基因的miRNA。
10.根据权利要求1所述的方法，采用了体细胞核转移（SCNT）。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述体细胞是皮肤成纤维细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
获得一个或多个雄性动物的精原干细胞(SSCs)，其具有显性作用的内源性核酸分子；
提供改性构建体，其包括抑制显性作用的内源性核酸分子的外源多顺反子抑制性RNA的核酸序列，还提供隐性作用的核酸分子的外源核酸序列，其中在至少一个密码子中的碱基突变已经引入或存在（相对于在该物种中的隐性作用的核酸分子的野生序列），使得防止或减少了抑制性RNA分子的结合，且
将改性构建体引入进至少一个SSCs，从而获得至少一个SSC，其包括抑制显性作用的内源性核酸分子的核酸分子和表达具有不同于表达天然隐性基因的野生多核苷酸序列的先前隐性作用的核酸分子的第二核酸分子；且
将一个或多个改性的SSCs引入进雄性受体动物的生殖器官；并且任选地
收集由雄性受体提供的供体来源的，具有受精能力的单倍体雄性配子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中抑制隐性基因表达的干扰通过以下方法实现，所述方法包括将可操作连接到启动子的外源性核酸分子引入到细胞中，其中外源性核酸序列对由天然存在的隐性作用的核酸序列编码的蛋白质进行编码，除了外源性分子的核酸序列不同于天然存在的序列从而减少了与内源性抑制性RNA分子的相互作用。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述外源性核酸分子对由天然存在的隐性作用的核酸序列编码的蛋白质进行编码，除了外源性分子的核酸序列不同于天然存在的序列从而减少了与内源性抑制性RNA分子的相互作用。
15.根据权利要求1所述的方法，其中对显性基因表达的干扰通过以下方法实现，所述方法包括将可操作连接到启动子的外源性、多顺反子抑制性RNA编码序列引入细胞，其中所述外源性抑制性RAN编码序列对多种抑制性RNA分子进行编码，所述抑制性RNA分子干扰动物的显性作用的内源性核酸分子的表达。
16.非人转基因动物细胞，包括：
编码蛋白质的显性作用的内源性核酸分子和隐性作用的内源性核酸分子；
可操作连接到启动子的外源性、多顺反子抑制性RNA编码序列，其中所述外源性抑制性RNA编码序列对多种抑制性RNA分子进行编码，所述抑制性RNA分子对动物的显性作用的内源性核酸分子的表达进行干扰和/或
可操作连接到启动子的外源性核酸分子，其中所述外源性核酸分子序列对由天然存在的隐性作用的核酸序列编码的蛋白质进行编码，除了外源性分子的核酸序列不同于天然存在的序列从而减少了与内源性抑制性RNA分子的相互作用。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞包括可操作连接到启动子的外源性、多顺反子抑制性RNA编码序列，其中所述外源抑制性RNA编码序列对多种抑制性RNA分子进行编码，所述抑制性RNA分子干扰动物的显性作用的内源性核酸分子的表达。
18.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞包括可操作连接到启动子的外源性核酸分子，其中所述外源性核酸序列对由天然存在的隐性作用的核酸序列编码的蛋白质进行编码，除了外源性分子的核酸序列不同于天然存在的序列从而减少了与内源性抑制性RNA分子的相互作用。
19.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞既包括可操作连接到启动子的外源性、多顺反子抑制性RNA编码序列，其中所述外源抑制性RNA编码序列对多种抑制性RNA分子进行编码，所述抑制性RNA分子干扰动物的显性作用的内源性核酸分子的表达；还包括可操作连接到启动子的外源性核酸分子，其中所述外源性核酸序列对由天然存在的隐性作用的核酸序列编码的蛋白质进行编码，除了外源性分子的核酸序列不同于天然存在的序列从而减少了与内源性抑制性RNA分子的相互作用。
20.根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是牛的细胞。
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