CN102946908B - 显性等位基因表达抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明开发了容许野生型或期望的等位基因的表达、可仅选择性且有效地抑制特定的显性等位基因的表达的RNAi分子，其目的在于提供一种含有将该RNAi分子作为有效成分的显性等位基因表达抑制剂及其设计指南。所述显性等位基因表达抑制剂是以作为目标的显性等位基因的显性点突变作为基准点，并且将从该基准点至5’末端的碱基长度设定为规定的长度，且含有具有在从该基准点至下游侧的规定的位置导入一个与靶基因的序列不同的错配碱基的结构的RNAi分子。

Description

显性等位基因表达抑制剂

技术领域

本发明涉及一种包含可选择性且有效地抑制含有显性点突变的变异型等位基因的表达的RNAi分子的显性等位基因的表达抑制剂、包含该表达抑制剂的药物组合物及RNAi分子的设计方法。

背景技术

近年来，作为与化合物及抗体并列的新型医药或诊断药，在生物体内控制特定的基因的表达的功能性核酸备受关注，在世界各国中正进行面向其医疗应用的各种研究及开发。

对功能性核酸而言，已知有利用经由RNAi(RNA interference：RNA干扰)的基因沉默在转录后抑制靶基因的表达的siRNA(small interferingRNA，小干扰RNA)、shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)及miRNA(micro RNA，微小RNA)，或与转录因子等靶物质特异性结合来抑制其功能的核酸适体，与靶mRNA结合而抑制其翻译的反义核酸，含有作为陷阱序列的转录因子结合域等调节区域，并通过捕捉靶物质来抑制其转录因子引起的基因表达的陷阱DNA，特异性地阻碍靶基因的mRNA前体中的多聚腺苷酸化而使其不稳定化后，将其引入分解的U1接头等。这些均被期待作为下一代的医药或诊断药，其中，从其目标特异性、应用性的广度及作用效果的可靠性的方面考虑，利用siRNA或shRNA的RNAi作为可抑制期望的基因表达的强力的基因表达控制工具引人注目。

作为RNAi的应用的等位基因特异的基因沉默(allele-specific RNAi：ASP-RNAi)可以特异性地抑制期望的等位基因的表达，因此，不会对野生型等位基因的表达造成影响，可仅特异性地抑制引起疾病的变异等位基因的表达。因此，一般认为是疾病治疗法上极其有用的方法。

例如，作为常染色体显性遗传疾病之一已知的难治性的进行性骨化性纤维发育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva：FOP)是由作为原因基因的ALK2(Activin-like kinase 2：激活素样激酶2)基因上的第617位的G(鸟嘌呤)取代为A(腺嘌呤)的点突变或第1067位的G取代为A的点突变引起的。已知具有这些点突变的任一种的等位基因为显性，因此，即使为具有野生型ALK2基因的杂合体也会引发FOP(非专利文献1～3)。但是，未知抑制该疾病的发病及发展的有效方法。在起因于点突变的其它的许多常染色体显性遗传疾病中也发现与其相同的情况。在此，若可利用ASP-RNAi仅抑制具有点突变的变异型等位基因的表达且容许野生型等位基因的表达，则可以抑制以FOP为代表的常染色体显性遗传疾病的发病，另外，若为已发病的患者，则可以阻止其发展。

但是，在如上所述的具有点突变的变异型等位基因和野生型等位基因中，其基因间的碱基序列仅1～数个碱基不同。因此，为了实现这样的ASP-RNAi，特异性极高的siRNA或shRNA的开发不可或缺。另一方面，在siRNA等的设计中，必须将含有点突变位点的周边的碱基序列作为靶区域，因此，设计区域必然受到限制。因此，未必可应用公知的有效的siRNA的目标序列选择方法，其结果，存在通常无法设计特异性高、且有效的siRNA等的问题。

进而，即使开发特异性极高的siRNA等，也存在难以准确地利用ASP-RNAi辨别变异型等位基因和野生型等位基因，难以定量地评价各个表达抑制效果。

在非专利文献4中公开有一种利用了萤光素酶基因的报告系统。另外，提出一种使用该系统对变异型等位基因的表达抑制效果进行定量并基于得到的结果带来ASP-RNAi的siRNA的设计指南。通常，在正确地评价ASP-RNAi效果时，需要野生型等位基因和变异型等位基因的正确的辨别和准确的抑制，因此，需要在相同细胞内评价野生型等位基因和变异型等位基因的各自的表达抑制效果。但是，本文献中所使用的报告系统仅独立地检测变异型等位基因的表达抑制，未对siRNA对野生型等位基因造成的影响进行充分的验证。因此，使用本文献的报告系统得到的等位基因特异的siRNA的指南的精度和效果难以说是充分的。

另一方面，本发明人等在非专利文献5中开发了一种使用了底物特异性高的萤火虫萤光素酶(Photinus luciferase)基因和海肾萤光素酶(Renillaluciferase)基因的报告等位基因评价系统并将其公开。根据该系统，将在所述萤光素酶基因的3’UTR中插入了作为靶基因的变异型等位基因的序列和作为非靶基因的野生型等位基因的序列的表达载体与siRNA一起导入培养细胞，通过发光检测源自各个表达载体的萤光素酶活性，由此，可以将利用该siRNA的变异型等位基因和野生型等位基因的各个表达抑制效率在相同细胞内且特异性地定量。因此，通过利用该报告等位基因评价系统，可以进行ASP-RNAi效果的更正确的评价及更高的siRNA等的开发。

作为使用了所述报告等位基因评价系统的ASP-RNAi评价的具体实例，在非专利文献6中记载有：设计针对人朊病毒基因的变异型等位基因的siRNA及在shRNA的序列中人为地导入了1处错配变异的序列并将碱基长度及错配变异的位置进行各种改变的结果。通过该文献的方法，可得到比较显著的ASP-RNAi效果。但是，用于实验的基因仅为人朊病毒基因。通常RNAi的效果根据针对靶基因的靶碱基序列，即siRNA及shRNA包含的与靶基因相同的碱基序列，受到很大影响。因此，通过错配变异的导入，即使可提高ASP-RNAi效果，也难以说作为用于实验的其靶碱基序列特有的效果的可能性高、具有一般性。因此，未由非专利文献5的结果得出ASP-RNAi效果高的siRNA及shRNA的设计指南。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Shore EM.，et al.，2006，Nature Genetics，Vol.38：525-527

非专利文献2：Nakajima M.，et al.，2007，Journal of Human Genetics，Vol.52：473-475

非专利文献3：Furuya H.，et al.，2008，American Journal of MedicalGenetics Part A，Vol.146A：459-463

非专利文献4：Huang H.，et al.2009，Nucleic Acid Research，Vol.37：7560-7569

非专利文献5：Ohnishi Y.，et al.，2006，Journal of RNAi and GeneSilencing，Vol.2：154-160

非专利文献6：Ohnishi Y.，et al.，2008，PloS One，Vol.3，Issue 5：e2248

发明内容

发明要解决的课题

本发明开发了容许野生型或期望的等位基因的表达、可仅选择性且有效地抑制特定的显性等位基因的表达的RNAi分子，其目的在于提供RNAi分子的设计指南及一种含有将该RNAi分子作为有效成分显性等位基因的表达抑制剂。

本发明的目的在于提供一种治疗由于显性等位基因的表达而发病的遗传性疾病的治疗剂。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决所述课题重复进行了潜心研究，结果发现可选择性且有效地抑制特定的等位基因的表达的siRNA等的结构的一般规则。即，明确是以作为目标的显性等位基因的显性点突变作为基准点、并且将从该基准点至5’末端的碱基长度设定为规定的长度且具有在从该基准点至下游侧的规定的位置导入了一个与靶基因的序列不同的错配碱基的结构的RNAi分子选择性且有效地抑制显性等位基因的表达，另一方面，对于以野生型等位基因为代表的其它等位基因的表达，几乎不显示抑制效果。也明确具有这样的结构的RNAi分子不依赖于碱基序列，对于任何等位基因均可发挥其效果。因此，一般认为该结构可成为ASP-RNAi的新型指南。本发明是基于上述见解而完成的，提供以下发明。

(1)一种靶基因的显性等位基因表达抑制剂，含有RNAi分子，其中，所述RNAi分子含有RNAi有义链区域和由与所述RNA有义链区域互补的碱基序列构成的RNAi反义链区域，在此，所述RNAi有义链区域由与含有至少一个显性点突变的连续的16～30个碱基中的任一所述显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基序列构成以及从所述RNAi有义链区域上的任一显性点突变朝向上游侧第7～10位中的任一碱基构成RNAi分子中的5’末端碱基，且从所述任一显性点突变朝向下游侧第3～8位中的任一碱基具有与所述显性等位基因的有义链碱基序列上的碱基唯一不同的错配碱基。

(2)一种靶基因的显性等位基因表达抑制剂，含有与编码RNAi分子的DNA以可操作的方式连接的表达载体，其中，含有由RNAi有义链区域和由与所述RNA有义链区域互补的碱基序列构成的RNAi反义链区域，在此，所述RNAi分子由与含有至少一个显性点突变的连续的16～30个碱基中的任一所述显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基序列构成以及从所述RNAi有义链区域上的任一显性点突变朝向上游侧第7～10位中的任一碱基构成RNAi分子中的5’末端碱基，且从所述任一种显性点突变朝向下游侧第3～8位中的任一碱基具有与所述显性等位基因的有义链碱基序列上的碱基不同的错配碱基。

(3)如(1)或(2)所述的抑制剂，其中，构成5’末端碱基的碱基为从所述显性点突变朝向上游侧第7～9位中的任一碱基。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的抑制剂，其中，错配碱基为从所述显性点突变朝向下游侧第3～5位中的任一碱基。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为siRNA。

(6)如(1)～(4)中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为shRNA。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的抑制剂，其中，显性点突变为功能获得型。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的抑制剂，其中，所述显性点突变参与疾病的发病。

(9)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为恶性新生物。

(10)如(9)所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且靶基因为EGFR(表皮生长因子受体)基因。

(11)如(10)所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别由序列号81及82或序列号83及84所示的寡核苷酸对构成。

(12)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为进行性骨化性纤维发育不良，且靶基因为ALK2(激活素样激酶2)基因。

(13)如(12)所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号3及4、序列号5及6、序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号19及20、序列号21及22、序列号23及24、序列号25及26、序列号27及28、序列号29及30、序列号35及36、序列号37及38、序列号39及40、序列号41及42、序列号43及44、及序列号91及92所示的寡核苷酸对构成的组。

(14)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为亨廷顿病，且靶基因为亨廷顿基因。

(15)如(14)所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号55及56、序列号57及58、序列号59及60、序列号61及62、序列号63及64、序列号67及68，以及序列号69及70所示的寡核苷酸对构成的组。

(16)一种药物组合物，含有(1)～(15)中任一项所述的抑制剂作为有效成分。

(17)一种(16)所述的药物组合物，含有制药上可容许的载体。

(18)一种选择性地抑制靶基因的显性等位基因的表达的RNAi分子的设计方法，其中，包含：将存在于靶基因的显性等位基因的碱基序列上的一个显性点突变位点作为基准变异点进行设定的工序；将在显性等位基因的碱基序列上从所述基准变异点朝向上游侧第7～10位中的任一碱基确定为5’末端碱基的工序；以设定的5’末端碱基作为起点，从显性等位基因的有义链碱基序列中选择下游侧16～30个碱基长度作为RNAi有义链区域的工序；在选择的RNAi有义链区域内，在从所述基准变异点朝向下游侧第3～8位中的任一碱基中导入错配碱基的工序。

本说明书含有作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2010-139925号的说明书及/或附图中所记载的内容。

发明效果

根据本发明的显性等位基因表达抑制剂，不会对其它等位基因的表达造成大的影响，可仅选择性且有效地抑制目标显性等位基因的表达。

根据作为本发明的显性等位基因表达抑制剂的有效成分的RNAi分子的设计方法，可以以成为疾病的原因的显性点突变作为基准点进行设计，且可提供一种不会大幅影响该基准点的周边的碱基序列的应用性高的设计方法。

根据本发明的药物组合物，在遗传性疾病中，通过一边维持野生型等位基因的表达一边选择性地抑制成为疾病原因的显性等位基因的表达，可以治愈该疾病。

附图说明

图1表示RNAi分子的结构的概念图，分别表示(A)双链RNAi分子(siRNA)的情况及(2)单链RNAi分子(shRNA)的情况；

图2表示RNAi分子的设计方法的流程，虚线所示的错配碱基导入工序(0204)表示可以将该工序在基准变异点设定工序(0201)、5’末端碱基设定工序(0202)或RNAi有义链区域选择工序(0203)中的任一工序后进行；

图3表示ALK2-G356D-siRNA针对变异型ALK2-G356D的ASP-RNAi效果，A表示使用了各ALK2-G356D-siRNA时的辨别比(散点图，プロツト)及ASP得分(条形图)，另外，B表示显示野生型的非靶ALK2(WT-ALK2)片段和变异型的靶ALK2(MT-ALK2)片段的表达的萤光素酶表达量的相对值；

图4表示ALK2-R206H-siRNA针对变异型ALK2-R206H的ASP-RNAi效果，A表示使用了各ALK2-G356D-siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)，另外，B表示显示野生型的非靶ALK2序列(WT-ALK2)片段和变异型的靶ALK2序列(MT-ALK2)片段的表达的萤光素酶表达量的相对值；

图5表示在蛋白质水平的ALK2-R206H-siRNA及ALK2-G356D-siRNA针对全长的野生型及变异型ALK2的ASP-RNAi效果，A及C为蛋白质印迹的结果，B及D为分别将A及C的条带进行数值化的结果，A及B中的MT表示含有R206H的点突变的ALK2，C及D中的MT表示含有G356D的点突变的ALK2，图中，**表示发现统计学的显著性(p＜0.01)，另外，n.s表示未发现统计学的显著性(not statisticallysignificant)，SiControl为不诱导RNAi的对照siRNA(凯杰公司)；

图6表示HTT-siRNA针对变异型HTT的ASP-RNAi效果，A表示使用了各HTT-siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)，另外，B表示显示野生型的非靶HTT片段和变异型的HTT片段的表达的萤光素酶表达量的相对值；

图7表示在蛋白质水平的HTT-siRNA针对全长的野生型及变异型HTT的ASP-RNAi效果；

图8表示EGFR-siRNA针对变异型EGFR的ASP-RNAi效果，A表示使用了各EGFR-siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)，另外，B表示显示野生型EGFR(T790T)片段和变异型EGFR(T790M)片段的表达的萤光素酶表达量的相对值。

具体实施方式

1.显性等位基因表达抑制剂

1-1.概要

本发明的第1实施方式为显性等位基因的表达抑制剂。本发明的抑制剂的特征在于，含有RNAi分子及/或编码其的表达载体作为有效成分，该RNAi分子以显性等位基因作为靶，选择性地抑制其表达。

1-2.RNAi分子的构成

在本说明书中，“RNAi分子”是指在生物体内诱导RNA干扰，可以经由作为目标基因的转录产物的分解在转录后翻译前抑制(沉默)其基因的表达的分子。若为可经由RNAi机制抑制基因的表达的分子，则可以为单链分子或双链分子中的任一种。例如可以举出如siRNA之类的双链分子、如shRNA或miRNA之类的单链分子。关于RNA干扰，例如希望参照Bass B.L.，2000，Cell，101，235-238；Sharp P.A.，2001，Genes Dev.，15，485-490；ZamoreP.D.，2002，Science，296，1265-1269；Dernburg，A.F.&Karpen，GH.，2002，Cell，111，159-162。予以说明，在本说明书中，以下，将经由RNAi机制的转录后的基因沉默作为“基因的表达抑制”表示。

在本说明书中，RNAi分子由核酸构成。在此所谓的“核酸”是指天然型核酸、非天然型核酸及/或核酸类似物。

在本说明书中，“天然型核酸”是指以核苷酸作为构成单元，它们通过磷酸二酯键连接而成的存在于自然界的生物体高分子。通常，具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶中任一碱基的核糖核苷酸连接而成的RNA及/或具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶中的任一碱基的脱氧核糖核苷酸连接而成的DNA符合。在本发明的RNAi分子中，特别优选RNA为主要的构成成分。

在本说明书中，“非天然型核酸”是指含有非天然型核苷酸的或由其构成的核酸。在此，“非天然型核苷酸”是指人工构建或人工化学修饰的在自然界不存在的核苷酸，即包含具有与上述天然存在的核苷酸类似的性质及/或结构的核苷酸或具有与天然存在的核苷或碱基类似的性质及/或结构的核苷或碱基的核苷酸。例如可以举出：脱碱基核苷酸、阿拉伯核苷酸、2’-脱氧尿核苷、α-脱氧核糖核苷酸、β-L-脱氧核糖核苷酸、具有其它的糖修饰的核苷酸。进而，含有取代戊糖(2’-O-甲基核糖、2’-脱氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖、1’，2’-脱氧核糖)、阿拉伯糖、取代阿拉伯糖；取代己糖及具有α-端基异构体的糖修饰的核苷酸。另外，非天然型核苷酸也含有包含人工构建的碱基类似物或人工化学修饰的碱基(修饰碱基)的核苷酸。在对“碱基类似物”而言，例如可以举出：2-氧代(1H)-吡啶-3-基、5位取代-2-氧代(1H)-吡啶-3-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噁唑基)嘌呤-9-基等。对“修饰碱基”而言，例如可以举出：修饰的嘧啶(例如，5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶)、修饰的嘌呤(例如，6-甲基腺嘌呤、6-硫代鸟嘌呤)及其它的杂环碱基等。也可以含有甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸酯型DNA/RNA、磷酰胺酯型DNA/RNA、2’-O-甲基型DNA/RNA等化学修饰核酸及核酸类似物。

在本说明书中，“核酸类似物”是指具有与天然型核酸类似的结构及/或性质的人工构建的化合物。例如可以举出：肽核酸(PNA：Peptide NucleicAcid)、具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、交联化核酸(BNA/LNA：BridgedNucleic Acid，桥接核酸/Locked Nucleic Acid，锁核酸)、吗啉代核酸等。

另外，构成本发明的RNAi分子的核酸可以根据需要用核酸用标记物质标记磷酸基、糖及/或碱基。核酸用标记物质可以利用该领域中公知的所有物质。例如可以举出：放射性同位元素(例如，³²p、³H、¹⁴C)、DIG、生物素、荧光色素(例如，FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)或发光物质(例如。吖啶酯(アクリジニウムエスタ一))。

“等位基因(等位基因：allele)”也被称为等位基因(対立遺伝子)，是指作为原则构成存在于基因组上的相同的基因座的基因多型的各个基因。其中，若为相同基因的多型，则不必需要存在于相同的基因座，可以通过转座或重复而存在于其它基因座。在本发明中，除在基因组上先天性存在的等位基因以外，等位基因也包括通过变异而后天性获得的等位基因。进而，各等位基因不需要存在于构成个体的全部的细胞中，也可以仅存在于个体中的一部分细胞、组织或器官中。例如可以举出在一个体中，未存在于正常细胞中，仅存在于癌细胞中的变异型等位基因。

在本说明书中，“显性等位基因”是指在个体中基于其等位基因的性状作为表型而显现的基因。例如在二倍体的常染色体上的不同的2个等位基因的情况下，其性状在个体中出现的任一等位基因符合。不论该等位基因是否编码具有正常功能的蛋白质。例如，即使为一方编码功能异常的蛋白质、另一方编码正常功能的蛋白质的等位基因，通过功能异常的蛋白质引起的异常的功能胜过或阻碍正常功能的蛋白质的功能，结果，在该个体中的该蛋白质的功能也作为其异常的表型出现的情况下，编码功能异常的蛋白质的等位基因成为显性等位基因。作为这样的具体实例，可以举出成为常染色体显性遗传性疾病的原因的等位基因。

在本说明书，“点突变”是指与野生型等位基因的碱基序列进行比较时，在对应的碱基序列上所发现的单碱基取代。在此所谓的“野生型等位基因”是指在同种基因的等位基因组内，在自然界存在较多，且其编码的蛋白质具有该蛋白质原本的功能的基因。对点突变而言，通常存在作为嘌呤间或嘧啶间的取代的转换变异或作为嘌呤和嘧啶间的取代的颠换变异，但在本发明中，可以为任一变异。另外，本发明的点突变可以为先天性存在的变异及后天性获得的变异中的任一种。进而，点突变已知有通过其变异引起氨基酸的取代的错义变异、未产生对简并密码子的取代、即氨基酸取代的沉默变异、引起终止密码子的无义变异及剪接位点的变异，关于本发明的RNAi分子的点突变，优选错义变异、无义变异或剪接位点的变异。

“显性点突变”是指对该等位基因引起显性性状的点突变或与显性突变连锁的相同转录产物内的点突变。对与显性突变连锁的相同转录产物内的点突变而言，例如与以引起显性性状的三核苷酸重复疾病为代表的异常伸长的三核苷酸重复的重复序列等显性突变连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点符合。在本发明中，显性点突变的特性没有特别限制。例如，若为引起显性性状的点突变，则可以举出：功能获得型变异(gain of function mutation)或功能丧失型变异(loss of function mutation)。功能获得型变异含有引起蛋白质表达量的上升(过表达：overexpression)或活性上升(组成型活化：constitutive active或功能亢进型：hyper active)的性状的超效等位基因变异(hypermorph mutation)、引起显示新型功能活性的性状的新突变基因变异(neomorph mutation)及与源自野生型等位基因的蛋白质拮抗或对其抑制、抑制野生型等位基因的性状表达的反效等位基因变异(antimorph mutation：dominant negative)。另外，对功能丧失型变异而言，可以举出等位基因完全丧失了性状表达能力的无效等位基因变异(amorph mutation)及引起等位基因的性状表达能力的降低的亚效等位基因变异(hypomorph mutation)。其中，在功能丧失型变异的情况，限于其效果为显性的变异。优选为功能获得型的显性点突变。另外，只要是与显性突变连锁的相同转录产物内的点突变，就没有特别限制，例如，可以为SNP中的简并变异那样的未引起氨基酸取代的变异。在目标的显性等位基因的碱基序列上，显性点突变可以存在一个或多个。

在本实施方式中，目标基因的种类及该基因所源自的生物种没有特别限定。若为含有显性点突变的显性等位基因，则所有编码蛋白质的基因可以成为本实施方式的抑制剂的靶。另外，生物种可以为动物、植物中的任一种，包括它们的所有种类。若是动物，则优选为脊椎动物，更优选为鱼类、鸟类或哺乳动物。在鱼类中，进一步优选为水产资源用鱼种(例如，鲑鱼科、鲈鱼科、鳕鱼科、鲱鱼科、比目鱼科、鲽鱼科、竹荚鱼科、玉筋鱼科、真鲷科及平鲉科(メバル科)的鱼种)。在鸟类中，进一步优选为食用种(例如，鸡、鹅、鸭、野鸭、杂种鸭、火鸡、鹌鹑、驼鸟等)。在哺乳动物中，进一步优选为家畜(猪、公牛、绵羊、山羊、马)、实验用动物(啮齿类、兔、狗、猴子)、比赛用的马、宠物(狗、猫、兔、猴子、啮齿类)或人。进一步优选的生物种为人。另一方面，若为植物，则优选为种子植物，更优选为被子植物，进一步优选为食用植物种(例如属于稻科、豆科、茄科、牵牛花科、蔷薇科、十字花科、藜科、伞形科、蓼科、葫芦科、菊科、百合科、天南星科、葡萄科、芸香科、壳斗科、棕榈科等的食用的植物种)、纤维资源用植物种(例如，棉花、麻等)、木材资源用植物种(例如，杉、扁柏、冷杉、铁衫、松、紫杉树、樱花树、枫树、橡树、栎、山毛榉、榆树、榉、核桃树、ホウ、桂树、柚木树、柳安木、黑檀树、桃花心木、白杨、桉树等)。

上述显性点突变所参与的性状也没有特别限定，优选为欲抑制其表达的性状。例如可以举出参与疾病的发病的变异、参与异常形态的变异等。在此所谓的疾病例如上述的常染色体显性变异疾病，即其变异由点突变引起的疾病或后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的点突变引起的疾病。更具体而言，若为人常染色体显性变异疾病，则例如可以举出：以亨廷顿基因的变异作为原因的亨廷顿病、以ALK2(激活素样激酶2)基因的变异作为原因的进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、以甲状腺素运载蛋白基因的变异作为原因的家族性淀粉样多发性神经病、以LDL受体(LDL-R)基因的变异作为原因的家族性高胆固醇血症(FH)、以HNF-4α基因(MODY1)、葡萄糖激酶基因(MODY2)及HNF-1α基因(MODY3)的各变异作为原因的青少年发病的成人型糖尿病(MODY)、以纤维蛋白1基因的变异作为原因的马凡氏(Marfan)综合征、以肌强直素激酶基因的变异作为原因的显性进行性肌营养不良症、以骨胶原1型基因的变异作为原因的显性成骨不全症、以视紫质基因或外周蛋白/RDS基因的变异作为原因的显性视网膜色素变性症、以水通道蛋白(AQP0)基因的变异作为原因的显性先天性白内障、以TSC1或TSC2基因的变异作为原因的结节性硬化症、以PKD1基因或PKD2基因的变异作为原因的显性多发性囊胞肾(ADPKD)、以角蛋白基因、兜甲蛋白基因、桥粒芯糖蛋白1基因或桥粒斑蛋白(desmoplakin)基因的变异作为原因的遗传性掌跖角化症、以APC基因的变异作为原因的家族性大肠息肉病、以Rb基因的变异作为原因的视网膜母细胞瘤、以NF1基因的变异作为原因的神经纤维瘤等。另外，对后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的点突变引起的疾病而言，可以举出：新生物(肿瘤)、特别是恶性新生物(恶性肿瘤，所谓的癌)。作为更具体的例子，有以表皮生长因子受体(EGFR)基因的变异作为原因的非小细胞肺癌(NSCLC)、以K-ras基因的变异作为原因的胰腺癌或大肠癌、以RET基因的变异作为原因的甲状腺髓样癌。

1-3.RNAi分子的结构

将本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子的结构中的概念图示于图1。如该图所示，RNAi分子含有双链分子(图1A)或单链分子(图1B)。

(RNAi分子的共同构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为单链分子或双链分子中的任一种的情况下，也含有RNAi有义链区域(0101)、RNAi反义链区域(0102)及错配碱基(0103)作为必需的构成要素。以下，对RNAi分子的共同的构成要素进行说明。

“RNAi有义链区域”(0101)为除后述的错配碱基之外与显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基序列，在该碱基序列内含有至少一种显性等位基因的显性点突变(0104)。其中，如上所述，本实施方式的RNAi分子主要由RNA构成，因此，相当于显性等位基因的有义链碱基序列上的T(胸腺嘧啶)的碱基原则上变为U(尿嘧啶)。另外，与显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基长度为连续的16～30个碱基、18～25个碱基或19～23个碱基。RNAi有义链区域至少在显性点突变位点(0104)中与对应于上述显性等位基因的野生型等位基因的碱基序列不同。RNAi有义链区域若含有至少一种显性等位基因的有义链碱基序列中所含的显性点突变，则可以在上述碱基长度的范围内与有义链碱基序列上的任一序列一致。

RNAi分子的特征在于，在RNAi有义链区域中，从上述RNAi有义链区域上的任一显性点突变(以后，将该显性点突变称为“基准变异点”)(0104)朝向上游侧第7～10位的碱基相当于RNAi有义链区域的5’末端碱基。换言之，RNAi有义链区域中的基准变异点的位置从5’末端开始为第8～11位。在RNAi有义链区域含有两个以上显性点突变的情况下，基准变异点可以为其中的任一个。在本实施方式的RNAi分子为双链分子(图1A)的情况下，RNAi有义链区域的上述5’末端碱基与含有RNAi有义链区域的一方的链(多核苷酸链)的5’末端碱基一致(图1A)。另外，在本实施方式的RNAi分子为单链分子(图1B)的情况下，RNAi有义链区域的5’末端碱基与该单链分子的5’末端碱基一致(图1B)。从该RNAi有义链区域中的基准变异点至5’末端碱基的距离为本实施方式的RNAi分子的构成上必需的构成主要条件。

“RNAi反义链区域”(0102)为与上述RNAi有义链区域(0101)完全互补的碱基序列。因此，在该碱基序列中含有与上述基准变异点互补的碱基及与后述的错配碱基互补的碱基。另外，与RNAi有义链区域的A(腺嘌呤)互补的碱基为U。

对RNAi反义链区域而言，在本实施方式的RNAi分子为双链分子(图1A)的情况下，含有在与含有RNAi有义链区域的多核苷酸链不同的其它多核苷酸链中，但在单链分子(图1B)的情况下，含有在与RNAi有义链区域相同的多核苷酸链中。

“错配碱基”(0103)为与上述显性等位基因的有义链碱基序列上的碱基唯一不一致、即错配的RNAi有义链区域上的碱基，且与显性等位基因的反义链碱基序列上的对应的碱基均无法进行碱基配对的碱基。例如，若显性等位基因的反义链碱基序列上的对应的碱基为A(此时，显性等位基因的有义链碱基序列上的原本的碱基为T)，则错配碱基为无法与A进行碱基配对的A、G(鸟嘌呤)或C(胞嘧啶)。若显性等位基因的反义链碱基序列上的对应的碱基为T(此时，显性等位基因的有义链碱基序列上的原本的碱基为A)，则错配碱基为无法与T进行碱基配对的U或C。另外，若显性等位基因的反义链碱基序列上的对应的碱基为G(此时，显性等位基因的有义链碱基序列上的原本的碱基为C)，则错配碱基为无法与G进行碱基配对的G或A。进而，若显性等位基因的反义链碱基序列上的对应的碱基为C(此时，显性等位基因的有义链碱基序列上的原本的碱基为G)，则错配碱基为无法与C进行碱基配对的C、A或U。

错配变异存在于RNAi有义链区域上的规定的位置。该规定的位置为将上述基准变异点设为第0位时朝向下游侧第3～8位、优选第3～5位及第7～8位、更优选第3～5位中的任一碱基。其中，错配碱基不会位于RNAi有义链区域的3’末端。

(双链RNAi分子的构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为siRNA那样的双链分子的情况下，如上述图1A所示，除作为上述RNAi分子共同构成要素的RNAi有义链区域(0101)、RNAi反义链区域(0102)及错配碱基(0103)之外，可以进一步在各自的多肽链的3’末端含有3’末端附加碱基(0105)。“3’末端附加碱基”(0105)由TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU(尿嘧啶-尿嘧啶)的2碱基构成。附加了该碱基的RNAi分子可以提高RNAi抑制效率(Tuschl T et al.，1999，Genes Dev，13(24)：3191-7)。

(单链RNAi分子的构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为shRNA那样的单链分子的情况下，如上述图1B所示，除作为上述RNAi分子共同构成要素的RNAi有义链区域(0101)、RNAi反义链区域(0102)及错配碱基(0103)之外，进一步含有连接RNAi有义链区域(0101)和RNAi反义链区域(0102)的短的间隔序列(0106)。间隔序列可以设为由通常3～24个碱基、优选4～15个碱基构成的不会进行自碱基配对的任意的碱基序列。因此，在RNAi分子为单链的情况下，作为分子整体，由35个碱基(16×2+3)～84个碱基(30×2+24)构成。在RNAi分子内，RNAi有义链区域和RNAi反义链区域互相进行碱基配对，位于其间的间隔序列形成环结构，由此，分子整体形成发夹型的茎环结构。具有上述结构的单链RNAi分子被导入于细胞内时，在细胞质内通过被称为Dicer的内切核酸酶的作用加工成双链siRNA，其中RNAi反义链区域被并入RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合体)复合体之后，可以利用与上述的双链RNAi分子同样的RNAi机制抑制靶基因的转录后翻译前表达。

1-4.表达载体的构成

在本说明书中，“表达载体”是指本实施方式的抑制剂中所含的有效成分，即以可以表达编码上述RNAi分子的DNA的方式插入表达用载体内的载体。

在RNAi分子为siRNA那样的双链分子的情况下，本实施方式的表达载体可以将编码各个RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的DNA片段插入不同的两个表达用载体，另外，也可以独立地作为表达控制的DNA片段插入一个表达用载体内。另一方面，在RNAi分子为shRNA那样的单链分子的情况下，编码该单链RNA分子的DNA片段插入表达用载体内的规定的位置即可。

在本说明书中，“表达用载体”是指本实施方式的表达载体中的骨架部分，即在本实施方式的表达载体中实施方式1的编码RNAi分子的DNA片段以外的部分。表达用载体的种类没有特别限定，优选质粒或病毒。它们根据导入的宿主适宜选择即可。例如在导入的宿主为人的情况下，可以使用以腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺伴随病毒等病毒或者非病毒载体为基础的载体那样的公知的表达载体。另外，在导入的宿主为植物的情况下，可以利用pBI系或者pRI系的双元载体等质粒或花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)、烟草花叶病毒(TMV)等病毒。进而，在导入的宿主为大肠杆菌的情况下，例如可以利用pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系(stratagene公司)等的质粒。此外，也可以利用从各生命科学制造商市售的各种各样的各种宿主用表达载体。

上述表达用载体可以含有启动子、增强子或者终止子那样的调节区域、或选择标记基因那样的标记区域。各自的种类没有特别限定。根据导入表达载体的宿主适宜选择该领域中公知的载体即可。

作为在大肠杆菌中可操作的启动子，例如可以举出：lac、trp或者tac启动子或源自噬菌体的T7、T3、SP6、PR或者PL启动子等。作为在酵母中可操作的启动子，例如可以举出：源自酵母糖酵解基因的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1、ADH2-4c启动子等。作为在植物细胞中可操作的启动子，例如可以举出：花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子(Pnos)、源自玉米的泛素蛋白启动子、源自水稻的肌动蛋白启动子、源自烟草的PR蛋白质启动子等。作为在昆虫细胞中可操作的启动子，例如可以举出：多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾多角体碱性蛋白启动子、杆状病毒极早期基因1启动子、杆状病毒39K晚早期(遅延型初期)基因启动子等。而且，作为在以人为代表的动物细胞内可操作的启动子，可优选使用RNA聚合酶II(PolII)系的启动子或RNA聚合酶III(Pol III)系的启动子。优选为Pol III系的启动子，特别优选为U6及H1等启动子。另外，在任一宿主的情况下，也可以使用仅在生物体内的特定的位点上诱导表达的位点特异的启动子。予以说明，在不同的两个表达用载体中分别插入编码RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的DNA片段的情况下，为了各RNA链以同程度的量表达，启动子优选使用相同的启动子或具有同程度的表达活性的不同的启动子。

1-5.RNAi分子的设计和制造

对本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子的设计方法进行说明。如图2所示，本设计方法含有基准变异点设定工序(0201)、5’末端碱基设定工序(0202)、RNAi有义链区域选择工序(0203)、错配碱基导入工序(0204)及RNAi反义链区域设定工序(0205)。基准变异点设定工序、5’末端碱基设定工序RNAi、有义链区域选择工序及RNAi反义链区域设定工序以该顺序进行，但错配碱基导入工序可以在基准变异点设定工序、5’末端碱基设定工序或RNAi有义链区域选择工序中的任一工序后进行。以下，对各个工序进行说明。

“基准变异点设定工序”(0201)为在靶基因的显性等位基因中，将存在于该碱基序列中的一个显性点突变位点确定为基准变异点的工序。在显性等位基因中显性点突变位点仅为1碱基的情况下，该碱基为基准变异点。另外，在显性等位基因中显性点突变位点存在2碱基以上的情况下，以任一碱基作为基准变异点选择即可。优选为通过该选择而必然确定的RNAi有义链区域内的GC含量为20～80％、优选为30～70％、更优选为40～60％那样的显性点突变位点。

“5’末端碱基设定工序”(0202)为将从显性等位基因的碱基序列上的基准变异点朝向上游侧第7～10位的碱基确定为RNAi有义链区域的5’末端碱基的工序。如上所述，对在本工序中确定的5’末端碱基而言，在双链RNAi分子的情况下，为含有RNAi有义链区域的多核苷酸链侧的5’末端碱基，或单链RNAi分子的情况下，为该分子的5’末端碱基。因此，通过本工序确定RNAi分子的一方向的端部。

所谓“RNAi有义链区域选择工序”(0203)，以在上述5’末端碱基设定工序中确定为5’末端碱基的显性等位基因的碱基序列上的碱基为起点，从显性等位基因的有义链碱基序列中选择下游16～30个碱基的碱基序列作为RNAi有义链区域。通过本工序确定RNAi分子所针对的显性等位基因的靶区域。予以说明，对应于作为DNA序列的显性等位基因的碱基序列上的T的碱基优选在RNAi有义链区域的碱基序列中预先取代为U。

“错配碱基导入工序”(0204)为在设定的RNAi有义链区域内导入错配碱基的工序。对错配碱基而言，选择一个从基准变异点朝向下游侧第3～8位的碱基，取代为与显性等位基因的有义链碱基序列的相当的碱基不同的碱基。优选为第3～5位及第7～8位，更优选为第3～5位的碱基。此时，注意选择取代后的碱基为无法与显性等位基因的反义链碱基序列的对应的碱基进行碱基配对的碱基。例如若显性等位基因的反义链的对应的碱基为A，则使其为A、G或C即可，若反义链的对应的碱基为T，则使其为U或C即可，若反义链的对应的碱基为G，则使其为G或A即可，若反义链的对应的碱基为C，则使其为C、U或A即可。

“RNAi反义链区域设定工序”(0205)为将与经设定的RNAi有义链区域的碱基序列互补的碱基序列作为RNAi反义链区域进行设定的工序。由此，确定双链RNAi分子的基本结构。

即使本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为单链RNAi分子及双链RNAi分子的任一种，以上的工序也为共同的工序。接着，对于各个双链RNAi分子及单链RNAi分子，作为特有的工序，以下，对3’末端附加工序及间隔连接工序进行说明。

“3’末端附加工序”为对于双链RNAi分子特有的任选的工序。本工序的特征在于，在上述设计的RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的各个3’末端上附加TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU(尿嘧啶-尿嘧啶)。

“间隔连接工序”为对于单链RNAi分子特有的必需的工序。本工序为将上述中设计的RNAi有义链区域的3’末端和RNAi反义链区域的5’末端分别与间隔序列的3’末端和5’末端连接而制成单链分子的工序。间隔序列可以为由3～24个碱基、优选4～15个碱基构成的任意的碱基序列。优选为在间隔序列内不会形成碱基配对的碱基序列。

本实施方式的RNAi分子可以基于通过上述的方法设计的碱基序列通过化学的合成法来合成。对RNAi分子的化学合成而言，各生命科学制造商(例如，西格玛奥德里奇公司、BEX公司、宝生物公司、英杰公司等)进行有受托制造服务，也可以利用这些服务。

另外，对本实施方式的RNAi分子而言，将通过上述的方法设计的碱基序列暂时转换为DNA序列，基于该序列将化学合成DNA而成的物质进行克隆后，利用该领域中公知的体外RNA转录法作为RNA进行制备。体外RNA转录法例如参照Sambrook，J.et.al.，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual Second Ed.，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约即可。另外，可以以Ui-Tei等的方法(Nucleic Acids Res.，32：936-948，2004)、Reynolds等的方法(Nat.Biotechnol.，22：326-330，2004)、Amarzguioui等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，316：1050-1058，2004)作为参考。

1-6.表达载体的制备

本实施方式的抑制剂中所含的表达载体的制备方法基本上可以依据该领域中公知的方法，例如Sambrook，J.et.al.，(1989)Molecular Cloning：aLaboratory Manual Second Ed.，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约中记载的方法进行制备。

若举出具体的例子，则首先，依据上述的“1-5.RNAi分子的设计和制造”的项目中说明的方法，确定RNAi分子的碱基序列。接下来，基于与其对应的DNA序列，通过化学合成法等分别合成有义链DNA及反义链DNA。此时，优选在各链的两末端附加适当的限制位点或在各链退火后形成适当的粘性末端。对DNA合成而言，生命科学相关制造商各公司进行有受托合成服务，也可以利用该服务。将合成后的两链进行混合并退火，制备双链DNA片段后，在末端附加限制位点的情况下，根据需要用限制酶切断。进而，根据需要用T4多核苷酸激酶等将各链的5’末端进行磷酸化。接下来，将上述制备的双链DNA片段与表达用载体的启动子下游的对应的限制位点连接。对DNA片段而言，暂时与适当的克隆载体连接而进行克隆化后，可以将从其中切出的DNA片段与表达用载体连接。

1-7.效果

根据本实施方式的显性等位基因表达抑制剂、有效成分的RNAi分子的等位基因间的碱基序列的不同即使仅为1碱基，也几乎或不太会对非靶等位基因的表达造成影响，可以选择性且有效地抑制靶等位基因的表达。

根据本实施方式的抑制剂，在导入于细胞内时，在以RNAi分子作为有效成分的情况下，其RNAi分子可以直接与目标的显性等位基因作用并利用RNAi沉默机制抑制其表达，另外，在以表达载体为有效成分的情况下，在该表达载体中所含的DNA中所编码的RNAi分子进行表达后，可以与目标的显性等位基因作用并利用RNAi沉默机制抑制其表达。因此，在抑制剂含有RNAi分子的情况下，可以在短时间内对给药后的细胞等赋予ASP-RNAi效果。另一方面，在抑制剂含有表达载体的情况下，只要在给药后的细胞内维持表达载体，则可以继续赋予ASP-RNAi效果。因此，通过将这些组合使用，可以有效地抑制显性等位基因的表达。

若使用本实施方式的抑制剂，则通过加入于后述的药物组合物，可以治疗或减轻目前其治疗困难的显性等位基因引起的各种疾病，此外，也可以利用于动植物的品种改良等。

2.药物组合物

本发明的第2实施方式为含有上述实施方式1的抑制剂的药物组合物。

2-1.构成

本发明的药物组合物含有作为有效成分的RNAi分子及/或表达载体以及介质。对介质而言，例如可以举出：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类那样的溶剂。这样的介质优选进行杀菌，优选根据需要与血液等张地调整。

在本发明的药物组合物中，作为药物组合物中的有效成分的RNAi分子及/或表达载体的含量根据作为治疗对象的疾病的原因基因的种类、其基因的发病作用机制、RNAi分子的作用效果及稳定性、表达载体的表达量、药物组合物的剂型、使用的载体的种类及给药方法、给药的受治疗者的状态等各种条件而不同。这些基于该领域的公知技术适宜选择即可。对本发明的RNAi分子或表达载体的含量的具体实例而言，在利用注射液对不需要其它的医药的并用的人成人男子(体重60kg)给药的情况下，每给药单位的注射液含有约0.01％(w/v)～约20％(w/v)、优选约0.1％(w/v)～约10％(w/v)即可。具体而言，例如在1次1ml的注射剂中通常含有siRNA 1μg～200μg即可。另外，在得到本发明的药物组合物的药理效果的基础上，在需要本发明的核酸的大量给药的情况下，为了减轻对于受治疗者的负担，也可以分成数次进行给药。

本发明的药物组合物可以根据需要进一步含有制药上可容许的载体。“制药上可容许的载体”是指在制剂技术领域中通常使用的添加剂。例如可以举出：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂等。

作为赋形剂，作为例子可以举出：如单糖、二糖类、环糊精及多糖类之类的糖(更具体而言，没有限定，含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及纤维素)、金属盐(例如，氯化钠、磷酸钠或者磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、高岭土、硅酸或它们的组合。

作为粘合剂，作为例子可以举出：使用了玉米、小麦、稻米或者马铃薯的淀粉的淀粉糊、单糖浆、葡萄糖液、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、虫胶及/或聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为崩解剂，作为例子可以举出：上述淀粉及乳糖、羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、昆布糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、海藻酸或者海藻酸钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯或它们的盐。

作为填充剂，作为例子可以举出：上述糖及/或磷酸钙(例如，磷酸三钙或者磷酸氢钙)。

作为乳化剂，作为例子可以举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。

作为流动添加调节剂及润滑剂，作为例子可以举出：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二醇。

这样的载体是主要容易形成上述剂型，另外，用于维持剂型及药剂效果，根据需要适宜使用即可。除上述添加剂以外，也可以根据需要含有矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、增量剂、加湿剂、保湿剂、吸附剂、崩解抑制剂、包衣剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂等。

本发明的药物组合物也可以在不丧失上述RNAi分子所具有的药理效果的范围内含有其它的药剂。例如若在注射剂的情况下，则可以含有规定量的抗生素。

进而，实施方式的药物组合物可以在制药上可容许的范围内、且在不使实施方式1的抑制剂中的RNAi分子及/或表达载体失活的范围内制成含有其它的有效成分的所谓的复合制剂。

本实施方式的药物组合物的剂型只要为不使作为抑制剂中的有效成分的RNAi分子或表达载体以及其它的附加的有效成分失活的形态就没有特别限定。例如可以为液体、固体或半固体中的任一种。作为具体的剂型，例如可以举出：注射剂、悬浮剂、乳剂、洗眼剂、滴鼻剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、贴敷剂及栓剂等非口服剂型或液剂、散剂、颗粒剂、药片、胶囊剂、舌下剂、片剂等经口剂型。在含有以RNAi分子或表达载体作为有效成分的抑制剂的本实施方式的药物组合物的情况下，优选剂型为注射剂。

2-2.给药方法

本实施方式的药物组合物为了治疗目标疾病，可以对生物体给药制药上有效的量。作为给药的对象的生物体为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。

在本说明书中，“制药上有效的量”是指作为本发明的药物组合物中所含的抑制剂的有效成分的RNAi分子及/或表达载体在治疗作为对象的疾病或减轻症状方面需要的用量(具体而言，可以抑制作为疾病原因的显性等位基因的性状表达的用量)、且对于给药的生物体几乎或完全没有有害的副作用(例如，野生型等位基因的表达抑制等)的用量。其具体的量根据目标的基因的种类、显性等位基因中的显性点突变的位置、显性等位基因的性状表达效果、使用的剂型、受治疗者(在人的情况下为受试者)的信息及给药经路而不同。在对人进行给药的情况下，制药上有效的量的范围及优选的给药经路一般基于由细胞培养分析及动物实验得到的数据而策划制定。最终的给药量根据各个受试者通过医师的判断来确定并进行调整。此时，在所考虑的受试者的信息中含有病的进行度或重症度、全身的健康状态、年龄、体重、性别、饮食生活、对药物敏感性及治疗的耐性等。

本发明的RNAi分子可以为全身给药或局部给药中的任一种。可以根据疾病的种类、发病场所或进行度等而适宜选择。若发病场所为局部的疾病，则优选利用注射等在发病场所及其周边直接给药的局部给药。这是因为，可以对应治疗的场所(组织或器官)给药充分量的本发明的RNAi分子，另外，对其它的组织不易产生影响。另一方面，如在转移性癌那样无法确定治疗场所的情况或发病为全身性的疾病的情况下，没有限定，优选利用静脉注射等的全身给药。这是因为通过经由血流使本发明的RNAi分子遍布于全身，对在诊断中无法发现的病变部也可以给药。

本发明的RNAi分子可以用所含有的有效成分不会失活的所有的适当的方法进行给药。例如可以为非口服(例如，注射、气雾剂、涂布、洗眼、滴鼻)或口服中的任一种。优选为注射。

在利用注射给药的情况下，注入部位没有特别限定。只要由本发明的RNAi分子或表达载体生产的RNAi分子对于靶分子发挥其功能且可以实现药物组合物的目的，就可以为任一部位。例如可以举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肠内或舌下等。优选静脉内注射或动脉内注射等向血管内的注射。这是因为可如上述那样经由血流使本发明的药物组合物遍布于全身，另外，侵袭性也较低。

2-3.用法

本发明的药物组合物可用于治疗疾病。例如，通过在以常染色体显性遗传疾病那样的显性等位基因的表达作为原因的疾病中进行应用，可以选择性地抑制显性等位基因的表达，同时实现另一等位基因(例如，编码具有正常功能的蛋白质的野生型等位基因)的性状，因此，除目前其治疗困难的遗传病或癌等的治疗以外，可以用于动植物的品种改良等。因此，作为本实施方式的药物组合物的对象的疾病为抑制剂中所含的RNAi分子或表达载体表达的RNAi分子所基于的目标的显性等位基因的显性性状的疾病。作为这样的疾病的具体实例，例如可以举出：如亨廷顿病、进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、家族性淀粉样多发性神经病、家族性高胆固醇血症、青少年发病的成人型糖尿病(MODY)、马凡氏(Marfan)综合征、显性进行性肌营养不良症、显性成骨不全症、显性视网膜色素变性、显性先天性白内障、结节性硬化症、遗传性掌跖角化症、家族性大肠息肉病、显性多发性囊胞肾、视网膜母细胞瘤、神经纤维瘤之类的人常染色体显性变异疾病，此外，如非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、大肠癌、甲状腺髓样癌之类的恶性新生物。因此，本实施方式的药物组合物根据作为治疗对象的疾病，通过将含有针对作为其原因基因的显性等位基因的RNAi分子或编码其的DNA的表达载体用作有效成分，可以对各种各样的疾病进行应用。

实施例

<实施例1：针对ALK2基因的siRNA的ASP-RNAi效果的验证>

对针对作为人常染色体显性变异疾病已知的进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的原因基因即ALK2基因的siRNA(ALK2-siRNA)进行设计，对显性等位基因和野生型等位基因的各自中的ASP-RNAi效果进行验证。

(1)ALK2-siRNA的设计和制备

在FOP患者中，具有人ALK2基因(登记号NM_001105)中的第617号(将起始密码子的A设为第1位。以下相同)的碱基G取代为A(引起R206H氨基酸变异，即从开始蛋氨酸将第206位的赖氨酸取代为组氨酸的变异)或第1067位的碱基G取代为A(引起G356D氨基酸变异，即将第356位的甘氨酸取代为天门冬氨酸的变异)的点突变。因此，将各自的点突变确定为基准变异点，依据实施方式1所述的RNAi分子的设计方法设计各种ALK2-siRNA。表1表示以第617位(R206H氨基酸变异)作为基准变异点进行设计的ALK2-siRNA有义链及反义链的碱基序列，另外，表2表示以第1067位(G356D氨基酸变异)作为基准变异点进行设计的ALK2-siRNA有义链及反义链的碱基序列。其中，为了记载方便，各表中所示的碱基序列不包括由有义链及反义链的3’末端中的UU构成的突出端序列。

[表1]

[表2]

在各个表中，siRNA名称如下命名。若以“siR206H_8s(A5U)19-ss”为例子举出，则“siR206H”表示引起R206H的氨基酸取代的第617位的基准变异点的siRNA，“8s”表示在基准变异点(standard mutation point)的上游侧具有8碱基(8核苷酸)，如“(A5U)”之类的括弧表示错配碱基，且将基准变异点的下游侧第5位的A取代为U，接下来的数值“19”是指siRNA的总碱基数(总核苷酸数)，最后的“ss”表示为siRNA的有义链序列。同样，最后的“as”表示为siRNA的反义链序列。另外，没有括弧的siRNA是指不具有错配碱基。

在各表中的有义链碱基序列中，用黑体字表示基准变异点，用下划线文字表示错配碱基。

基于表1及2的碱基序列，进行siRNA的化学合成。合成委托给西格玛奥德里奇公司。对合成siRNA而言，将应形成对的有义链及反义链进行退火处理，将其用于实验。

(2)报告等位基因表达质粒的构建

为了进行上述(1)制备的ALK2-siRNA中的ASP-RNAi效果的评价及优选的ALK2-siRNA的选定，使用表达萤火虫萤光素酶(Photinus luciferase)基因的pGL3-TK(Ohnishi et al.，2005)和及表达海肾萤光素酶(Renillaluciferase)基因的phRL-TK质粒(普洛麦格公司)，进行作为siRNA的靶的显性变异型和非靶的正常型的报告等位基因表达质粒的构建。

关于对应于含有显性点突变位点的显性等位基因的合成DNA寡核苷酸的设计、对报告质粒的插入、选定方法，依据非专利文献6。具体而言，分别合成由分别含有作为FOP的病因的ALK2基因的第617位或第1097位的显性点突变位点的39个碱基构成的DNA寡核苷酸的有义链及反义链(西格玛奥德里奇公司)。关于不具有点突变的正常型等位基因，也同样地进行DNA寡核苷酸合成。将各个具体的碱基序列示于表3。这些有义链及反义链含有在ALK2基因片段的有义链及反义链的两端构成限制酶切断位点的连接序列。表中，用黑体字表示基准变异点(在野生型中为与其对应的位置的碱基)，另外，用下划线表示连接序列。

[表3]

接着，进行合成的各链DNA寡核苷酸的退火处理。具体而言，以最终体积为10μL的方式将有义链及反义链的单链DNA寡核苷酸(最终浓度：分别为1μM)、10×退火缓冲液(英杰公司、最终浓度：1×)及灭菌水进行混合，在80℃下进行5分钟热处理后，在室温下放置30分钟，形成双链。

接下来，将双链DNA寡核苷酸插入经限制酶处理的上述2种质粒。具体而言，将pGL3-TK质粒和phRL-TK质粒用限制酶XbaI及NotI进行处理后，正常型等位基因插入pGL3-TK质粒中的各报告基因的3’非翻译区域(3’UTR)内，另外，显性变异型等位基因插入phRL-TK质粒中的各报告基因的3’非翻译区域(3’UTR)内，构建正常型ALK2报告等位基因表达质粒及显性变异型ALK2报告等位基因表达质粒。另外，也对于正常型及显性变异型等位基因同样地构建了替换了报告基因的报告等位基因表达质粒。

(3)细胞培养

将作为源自人的细胞系的HeLa细胞使用10％胎牛血清(FBS；英杰公司)及含有抗生素(100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素；和光公司)的DMEM培养液(和光公司)，在5％CO₂下、在37℃下进行培养。

(4)转染及报告分析

在基因导入的前一天，通过胰蛋白酶消化使HeLa细胞分散后，以细胞密度为1×10⁵细胞/cm²的方式进行调整并接种在96孔培养板上，用不含抗生素的DMEM培养液进行培养。24小时后，将3种质粒、即(a)作为正常型ALK2报告等位基因表达质粒的pGL3-TK骨架质粒(60ng/孔)、(b)作为变异型ALK2显性报告等位基因的各表达质粒的phRL-TK骨架质粒(20ng/孔)及(c)作为内部对照的未受到RNAi引起的表达抑制的β-半乳糖苷酶基因表达质粒即pSV-β-半乳糖苷酶对照用质粒(普洛麦格公司)(10ng/孔)与以ALK2显性变异型等位基因作为靶进行设计的表1或2所示的各种各样的ALK2-siRNA(终浓度20nM)同时导入上述HeLa细胞。作为阴性对照，使用终浓度20nM的不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)。这些核酸的导入使用脂质体2000(英杰公司)。转染法依据所附的方案。导入核酸24小时后，使用在双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase reporterassay system，普洛麦格公司)的试剂盒(双萤光素酶报告基因检测系统)中所附加的细胞裂解缓冲液(Passive lysis buffer)制备细胞提取液，将表达的各个报告等位基因(及2种萤光素酶)和对照的β-半乳糖苷酶的活性使用双萤光素酶报告基因检测系统(普洛麦格公司)及Beta-Glo检测系统(普洛麦格公司)分别进行测定。测定使用融合通用酶标分析仪“Fusion UniversalMicroplate Analyzer”(珀金埃尔默公司)。进而，关于报告，为了排除使用的2种萤光素酶活性的不同引起的测定差异的可能性，对各变异位点(R206H、G356D)也进行了替换了报告基因的实验。

(5)结果

对适于利用使用了上述报告等位基因表达质粒的报告分析对ALK2的各变异位点(R206H、G356D)进行设计而成的各种各样的ALK2-siRNA的ASP-RNAi效果及ASP-RNAi诱导的RNAi分子的结构的一般规则进行了研究。

各siRNA引起的表达抑制效果利用基于野生型ALK2及变异型ALK2的各个报告萤光素酶活性算出的辨别比及ASP得分进行评价。

在此，“辨别比”(DR：Discrimination Ratio)为由DR＝(正常型等位基因的表达量)/(变异型等位基因的表达量)的公式得到的正常型等位基因相对于变异型等位基因的表达比。辨别比是指该值越大，siRNA越辨别正常型等位基因和变异型等位基因。

另外，“ASP得分”(Allele-SPecificity score，等位基因特异性得分)为用本发明人等设计的评价法、利用下式得到的值。ASP得分反映对于变异型等位基因的“特异性”和“抑制效果”这两者。

ASP得分＝[(正常型等位基因的表达量)-(变异型等位基因的表达量)]×(正常型等位基因的表达量)

上述公式以与正常型等位基因的表达量的“差”反映对于RNAi分子的变异型等位基因的抑制效果的程度，而且，通过乘以“正常型等位基因的表达量”来追加正常型所受到的非特异的影响。上述辨别比的评价方法为有用的评价方法，无法追加对于在ASP-RNAi中为重要的要素的正常型等位基因的非特异的抑制的影响，换言之，无法追加RNAi对正常型等位基因造成的副作用。但是，根据ASP得分，可以进行反映对于变异型等位基因的“特异性”和“抑制效果”这两者的评价。例如在即使为辨别比的值高且可以特异性地辨别野生型和变异型等位基因的siRNA，也非常抑制野生型等位基因的表达的情况下，ASP得分为低值。

将结果示于图3及4。图3为使用了ALK2-G356D-siRNA时的RNAi的结果，图4为使用了ALK2-R206H-siRNA时的RNAi的结果。在图3及4中，A表示使用另外各siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)。另外，B表示基于野生型的非靶ALK2序列(WT-ALK2)和变异型的靶ALK2序列(MT-ALK2)的萤光素酶活性算出的表达量的相对值。

在图3中，将ALK2-G356D变异作为靶，将由从基准变异点朝向上游侧具有9个核苷酸、且不具有错配碱基的全长19个碱基构成的siG356D_9s19用作对照并在其中逐个改变导入的错配碱基的位置，对最适于ASP-RNAi的位置进行验证。siG356D_9s19的辨别比为1.64，ASP得分为0.02。该结果表示siG356D_9s19的野生型和变异型等位基因的辨别能力低，且也较强地抑制变异型等位基因与野生型等位基因的表达。另一方面，与作为对照的siG356D_9s19相比，在从基准变异点朝向下游侧第2～9位分别导入了错配碱基的siG356D_9s(C2G)19～siG356D_9s(U9A)19，在第3～8位导入了错配碱基的siG356D_9s(U3A)19～siG356D_9s(C8G)19中，可得到非常高的辨别比及ASP得分。这些结果表示在向基准变异点的下游第3～8位的位置导入了错配碱基的siRNA的野生型和变异型等位基因的辨别能力高，且较强地抑制变异型等位基因，另一方面，野生型等位基因的表达量的抑制能力几乎没有或非常低。即，这意味着ASP-RNAi效果高的非常有用的siRNA。由该结果明确错配碱基的位置优选从基准变异点的第3～8位。

为了确认上述结果的一般性，对以朝向上游侧具有10个核苷酸的全长19个碱基的siG356D_10s19作为对照且在其中于siG356D_9s19中发现有效果的位置(在向基准变异点的下游第3～7位上同样地导入了错配碱基的siRNA(siG356D_10s(U3A)19～siG356D_10s(A7U)19)验证其ASP-RNAi效果。其结果，对对照的siG356D_10s19而言，其辨别比为1.0，ASP得分为0.00，与siG356D_9s19大致为同程度，与此相对，对导入了错配碱基的siRNA而言，与对照相比，均可得到高的辨别比和ASP得分。

图4表示关于将ALK2-R206H变异作为目标、将siR206H_8s19用作对照、在其中于上述的siG356D_9s19中看到ASP-RNAi效果的位置(在此，基准变异点下游第4位和第5位)导入了错配碱基的siRNA的结果。对与G356D变异同样地在从基准变异点第4或5位的位置导入了错配碱基的针对ALK2的R206H变异的siRNA而言，与对照相比，可得到高的辨别比和ASP得分。另外，为了验证错配位点的碱基的不同引起的ASP-RNAi效果，将第5位的错配碱基变为U、G及C(图中，用siR206H_8s(A5U)19、siR206H_8s(A5G)19、siR206H_8s(A5C)19表示)。其结果表明在碱基间未确认到大的差异，只要是形成错配的碱基，就可以为任一碱基。进而，也判明在此使用许多siRNA从基准变异点朝向上游侧具有8个核苷酸，即使为8个，发现与使用了9个及10个的G356D的siRNA同样的效果。另外，验证了具有7个碱基的核苷酸的siR206H_7s(A5U)18和siR206H_7s(A5U)19，结果可得到同样高的辨别比和ASP得分。

由以上的结果表明，适于ASP-RNAi诱导的RNAi分子的结构的特征在于，有义链的5’末端位于从基准变异点向5’侧上游第7～10位，进而优选在从基准变异点朝向下游侧第3～8位上导入有错配碱基的基因。

<实施例2：使用了ALK2-siRNA时细胞内BMP信号传导通路的活性>

在实施例1中，选择针对变异型ALK2(R206H及G356D)显示有效的表达抑制效果的ALK2-siRNA，验证是否对于全长的变异型ALK2以蛋白质水平发现同样的效果。

(1)细胞培养

将作为小鼠的成肌细胞的C2C12细胞使用15％胎牛血清(FBS；英杰公司)及含抗生素(100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素；和光公司)的DMEM培养液(和光公司)分别进行培养。

(2)转染

在基因导入的前一天，通过胰蛋白酶消化使上述细胞分散后，以细胞密度为1×10⁵细胞/cm²的方式进行调整，接种于24孔培养板上，用不含抗生素的DMEM培养液进行培养。24小时后，在各孔上共导入2种质粒，即(1)附加有V5标签的完整长度的正常型ALK2基因(V5-WT-ALK2)和(2)疾病原因的R206H变异型ALK2基因表达质粒(V5-R206H-ALK2)或G356D变异型ALK2基因表达质粒(V5-G356D-ALK2)200ng/孔，以及(3)引起ALK2-RNAi诱导的通过上述分析进行了评价的siR206H_8s(A5C)19或siG356D_9s(U3A)1920nM/孔。基本的方法基于上述实施例1的“(4)转染及报告分析”的方法。也使用不诱导RNAi的siControl(凯杰公司)(终浓度20nM)作为比较对照进行同样的实验。进行核酸导入48小时后，使用细胞裂解液(50mM、Tris-HCl、p.H 7.5、0.1％Triton-X100)制备细胞提取液。

(3)免疫印迹

使用蛋白定量试剂盒(同仁公司)并依据所附的方案对由上述各细胞制备的细胞提取液中的蛋白质浓度进行测定。将各样品10μg与4×样品缓冲液(0.25M Tris-HCl、40％甘油、8％SDS、0.04％溴苯酚蓝、8％β-巯基乙醇)进行混合，在100℃下进行5分钟加热处理。将热处理后的蛋白质样品利用使用了10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳法(CV 50V、30分钟；然后，CV 75V、2小时)进行展开，然后，在PVDF薄膜(Immobilon P；密理博公司)上进行电印迹(CC 100mA、45分钟)。将薄膜在室温下浸渍于封闭溶液(5％Difco脱脂乳(BD公司)、1×PBS(和光公司)、0.1％Tween-20)1小时，用1×PBS(和光公司)清洗后，与用PBS稀释了5,000倍的一次抗体小鼠单克隆抗V5抗体(英杰公司)进行反应(4℃、16小时)。接着，将薄膜用PBS-T(1×PBS(和光公司)、0.1％Tween-20)在室温下清洗数次，与作为二次抗体(1∶5,000稀释)的抗小鼠IgG过氧化物酶轭合抗体(西格玛公司)进行反应(室温、1小时)。用PBS-T在室温下清洗数次后，使用Immobilon Western化学发光HR  底物(Immobilon Western Chemilum HR Substrate，密理博公司)并依据所附的方案检测与抗体反应的蛋白质。蛋白质条带检测后，使用Re-Blot加浓溶液(Re-Blot Plus Strong Solution，密理博公司)除去薄膜上的抗体，用PBS-T清洗。与上述同样地实施封闭处理后，与一次抗体(1∶10,000稀释)小鼠单克隆抗α微管蛋白抗体(西格玛公司)反应(4℃、16小时)。之后的操作与上述同样地进行。在曝光膜上作为条带被检测到的蛋白质(图5A及C)用扫描仪采集图像之后，利用Scion Image(Scion公司)进行数字化，由此进行定量(图5B及D)。

(4)结果

将结果示于图5。在图A及C中，“未处理”的样品是从未进行转染的C2C12细胞中提取的蛋白质。如该图所示，siR206H_8s(A5C)19或siG356D_9s(U3A)19不会抑制正常型ALK2(WT)的表达，仅对于各变异型ALK2(MT)ALK2-R206H或ALK2-G356D显著且特异性地显示表达抑制效果，以蛋白质水平证实了可进行优选的ASP-RNAi诱导。

<实施例3：针对亨廷顿基因的siRNA的ASP-RNAi效果的验证>

为了抑制作为亨廷顿病(HD：Huntington’s disease)的原因基因的变异型亨廷顿(HTT：Huntingtin)基因的等位基因特异性表达，设计以存在于该基因转录序列内的单核苷酸多态性(SNP：Single nucleotide polymorphism)作为靶的siRNA(HTT-siRNA)，对针对2种等位基因设计的各种各样的HTT-siRNA的ASP-RNAi效果进行验证。

(1)HTT-siRNA的设计和制备

在HD患者中，具有存在于人HTT基因(登记号NM_002111.6)的外显子1内的CAG重复序列异常伸长的变异。由于该CAG重复序列也存在于正常型等位基因，因此，在将CAG重复序列直接设为RNAi的靶的情况下，不仅抑制靶等位基因的表达，而且也抑制正常型等位基因的表达。因此，将存在于该疾病原因基因的转录序列内的等位基因间显示杂合的SNP位点作为基准变异点，使用本发明的设计方法设计各种各样的HTT-siRNA，评价各个的RNAi效果。表4表示对于2个SNP位点(rs363099及rs362331)设计的HTT-siRNA(分别用siRs099及siRs331表示)的有义链及反义链的碱基序列。其中，为了记载方便，各表中所示的碱基序列不包括由有义链及反义链的3’末端中的UU构成的突出端序列。

[表4]

基于表3的碱基序列，通过与实施例1同样的方法进行siRNA的化学合成及退火处理。

(2)报告等位基因表达质粒的构建

为了进行上述(1)制备的HTT-siRNA的RNAi效果的评价及优选的HTT-siRNA的选定，与“实施例1(2)”中记载的方法同样，在等位基因间将杂合度高的SNP和其周边序列插入各萤光素酶基因的3’UTR，由此进行报告等位基因表达质粒的构建。

具体而言，分别化学合成由含有存在于HTT基因转录序列内的2个SNP位点(登记号rs363099及rs362331)的两SNP等位基因碱基分别作为基准变异点位点的41个碱基构成的DNA寡核苷酸(有义链及反义链)(委托给西格玛奥德里奇公司)。表5表示各DNA寡核苷酸的具体的序列。表中，用黑体字表示各有义链上的SNP位点，另外，标注下划线表示连接序列。

[表5]

接着，通过与上述“实施例1(2)”同样的方法进行合成的各链DNA寡核苷酸的退火处理及对质粒的插入操作，构建报告等位基因表达质粒。

(3)细胞培养

使用与上述“实施例1(3)”同样的方法培养HeLa细胞(源自人的细胞系)。

(4)转染及报告分析

使用与上述“实施例1(4)”同样的方法接种细胞后，转染上述的HTT-siRNA及报告等位基因表达质粒，测定萤光素酶活性后，进行对于各SNP的两碱基进行设计的各种各样的HTT-siRNA的评价。

(5)结果

对于存在于HTT基因的转录序列内的上述2处的SNP位点的等位的2个碱基(在此，各个SNP位点均具有C和T的等位基因；参照表5)选定优选的HTT-siRNA，同时，将各个SNP位点的两个碱基分别确定为基准变异点，对使错配位点等的结构的特征改变时的影响进行评价，对适于ASP-RNAi诱导的RNAi分子的结构的一般规则进行研究。

各siRNA引起的表达抑制效果与实施例1同样地利用基于一个HTT-SNP等位基因(设为C碱基等位基因)及另一HTT-SNP等位基因(设为T碱基等位基因)的各个报告萤光素酶活性而算出的辨别比及ASP得分进行评价。在本实施例中，对于上述2处SNP位点，分别将C碱基等位基因设为靶等位基因(即，看作变异型等位基因)。

将结果示于图6。A表示使用了各siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)。另外，B表示C碱基等位基因的HTT和T碱基等位基因的HTT的萤光素酶表达量。

关于rs362331，与实施例1同样地对以由从基准变异点朝向上游侧具有8个核苷酸、且未具有错配碱基的全长19个碱基构成的siRs331_8s19作为对照进行设计并在其中逐个改变导入的错配碱基的位置的siRNA的ASP-RNAi效果进行验证。对照的辨别比为2.89，ASP得分为0.04。与此相对，在从基准变异点向下游第4～8位上导入了错配碱基的siRNA(分别为siRs331_8s(G4C)19～siRs331_8s(G8C)19)与对照相比，均可得到高的辨别比和ASP得分。该结果不与实施例1的结果矛盾。

进而，关于其它的SNP位点(rs363099)，对以由从基准变异点朝向上游侧具有8个核苷酸、且不具有错配碱基的全长19个碱基构成的siRs099_8s19作为对照且在从基准变异点向下游第4及5位上导入了错配碱基的siRNA(分别为siRs099_8s(U4A)19及siRs099_8s(G5C)19)进行验证。其结果，在规定的位置导入了错配碱基的siRNA与对照相比，辨别比、ASP得分均高。

由以上的结果表示具有基于本发明的设计方法的结构的特征的siRNA不是基因特定的，且即使为SNP变异，也具有高的ASP-RNAi效果。

<实施例4：使用了HTT-siRNA的内源性变异型亨廷顿基因的ASP-RNAi效果>

(1)细胞培养

将源自HD患者的细胞系(C0221；由国立精神神经中心医院神经内科分配)使用10％胎牛血清(FBS；株式会社日本生物血清)、丙酮酸钠(110mg/L；和光公司)、D-葡萄糖(4500mg/L；和光公司)及含抗生素(100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素；GIBCO公司)的RPMI1640培养液(和光公司)在5％CO₂、37℃下进行培养。作为对照，关于HD，与上述同样地对源自健康人的细胞系(由国立精神神经中心医院神经内科分配)进行培养。

(2)利用电穿孔法的HTT-siRNA的导入

将上述(1)培养的2种细胞、即源自HD患者的细胞系(C0221淋巴样干细胞)和健康人细胞系分别通过离心(120G、5分钟)进行回收，将约1×10⁶个细胞用含有HTT-siRNA(终浓度5μM)的100μL的电穿孔缓冲液(AmaxaCell Line Nucleofector Solution V、Amaxa公司)进行悬浮。制备2个上述电穿孔用样品，依据所附的方案并利用电穿孔(程序：U-005，基因导入系统Nucleofector，Amaxa公司)进行核酸的导入。导入的核酸为不诱导RNAi的对照siRNA(凯杰公司)、siRs099_8s(G5C)19。

导入了核酸的上述2种C0221细胞及未处理的C0221细胞及健康人细胞系使用上述(1)的培养液用6孔培养板进行培养，48小时后进行回收。

(3)免疫印迹法

将上述(2)中回收的各细胞用含有1×蛋白酶抑制剂(Roche公司)的细胞裂解液(20mM Tris-HCl、pH 7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、1％TritonX-100)溶解，使用蛋白定量试剂盒(同仁公司)并依据所附的方案测定蛋白质浓度。将各样品20μg与4×样品缓冲液(0.25M Tris-HCl、40％甘油、8％SDS，0.04％溴苯酚蓝、8％β-巯基乙醇)进行混合，在100℃下进行5分钟加热处理。热处理后的蛋白质样品利用使用了改变型SDS-聚丙烯酰胺凝胶及Tricine缓冲液(Tris/Tricine/SDS缓冲液，伯乐公司)的电泳法(CV 50V、2小时；然后，CV 100V、约30小时)进行展开，然后，在PVDF薄膜(ImmobilonP；密理博公司)上进行电印迹(CC100mA、1小时)。具体的改变型SDS-聚丙烯酰胺凝胶的组成如下所述。(分离凝胶：5～20％丙烯酰胺浓度的阶段梯度凝胶(丙烯酰胺/N，N’-亚甲基双丙烯酰胺＝30∶0.135)、浓缩凝胶：4％丙烯酰胺凝胶((丙烯酰胺/N，N’-亚甲基双丙烯酰胺＝37.5∶1))。电印迹后的薄膜在室温下浸渍于封闭溶液(5％Difco脱脂乳(BD公司)、1×PBS(和光公司)、0.1％Tween-20)1小时，用1×PBS(和光公司)清洗后，与用PBS稀释了3,000倍的一次抗体小鼠单克隆抗亨廷顿抗体(clone 1HU-4C8：密理博公司)反应(4℃、16小时)。接着，薄膜用PBS-T(1×PBS(Wako公司)、0.1％Tween-20)在室温下清洗数次，与作为二次抗体(1∶5,000稀释)的抗小鼠IgG过氧化物酶轭合抗体(SIGMA公司)反应(室温、1小时)，用PBS-T在室温下清洗数次后，使用Immobilon Western化学发光HR底物(密理博公司)并依据所附的方案检测与抗体反应的蛋白质。蛋白质条带检测后，使用Re-Blot加浓溶液(密理博公司)除去薄膜上的抗体，用PBS-T清洗，与上述同样地实施封闭处理后，与一次抗体(1∶10,000稀释)小鼠单克隆抗α微管蛋白抗体(西格玛公司)反应(4℃、16小时)。之后的操作与实施例2同样地进行。

(4)结果

将结果示于图7。在健康人中，HTT蛋白质仅为正常型的条带，与此相对，在HD患者中，除正常型HTT蛋白质之外，确认到变异型HTT蛋白质的条带(源自C碱基等位基因)。对用本发明的设计方法制作的siRs099_8s(G5C)19对源自该HD患者的细胞进行了处理的样品而言，源自作为靶等位基因的C碱基等位基因的HTT蛋白质的条带消失。由该结果表明在实施例3中确认到ASP-RNAi效果的siRs099_8s(G5C)19即使在全长蛋白质水平也具有ASP-RNAi效果。另外，也证明了即使内源性变异型HTT基因的SNP型不同，通过导入与该SNP型对应的HTT-siRNA来诱导优选的ASP-RNAi，也可以保留正常的HTT蛋白质并仅特异性地表达抑制疾病原因的变异型HTT蛋白质。

<实施例5：针对EGFR基因的siRNA的ASP-RNAi效果的验证>

对特异性地抑制作为后天性产生的显性变异等位基因已知的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCLC)的原因基因即变异型EGFR(表皮生长因子受体)基因的表达的siRNA(EGFR-siRNA)进行设计，对各个显性等位基因和野生型等位基因中的ASP-RNAi效果进行验证。

上皮成长因子(EGF)等配体结合在EGFR的细胞外区中时，细胞内区的酪氨酸激酶被活化，通过自磷酸化作用使下游的细胞内信号传导通路工作。一般认为非小细胞肺癌通过在EGFR基因的特定的碱基上产生点突变或缺失，成为功能获得型而产生的(Paez G.J.et al.，Science，2004，304；1497-1500)。因此，只要本发明的EGFR-siRNA可仅特异性地抑制变异的EGFR基因的表达，则可成为对于非小细胞肺癌的有效的治疗剂。

(1)EGFR-siRNA的设计和制备

在非小细胞肺癌患者中，具有人EGFR基因(登记号NM_005228)中的第2369位(将起始密码子的A设为第1位。以下相同)的碱基C取代为T(T790M、即引起从开始蛋氨酸第790位的色氨酸取代为蛋氨酸的变异)的点突变。因此，将该点突变确定为基准变异点，依据实施方式1中记载的RNAi分子的设计方法设计3个EGFR-siRNA。表6表示设计的有义链及反义链的碱基序列。siT790M_8s18与实施例1同样地由在从上述基准变异点上游侧具有8个核苷酸、且不具有错配碱基的全长18个碱基构成。siT790M_8s(G4C)18及siT790M_8s(U6A)18为在siT790M_8s18中的基准点的下游第4位及第6位上导入了错配碱基的EGFR-siRNA。其中，为了记载方便，各表所示的碱基序列不包括由有义链及反义链的3’末端中的UU构成的突出端序列。

[表6]

基于表6的碱基序列，用与实施例1同样的方法进行siRNA的化学合成及退火处理。

(2)报告等位基因表达质粒的构建

为了选定上述(1)中制备的EGFR-siRNA的RNAi效果的评价，与“实施例1(2)”中记载的方法同样地进行显性变异型EGFR基因和正常型EGFR基因的报告等位基因表达质粒的构建。

具体而言，分别合成由分别含有成为非小细胞肺癌的病因的EGFR基因的第2369位的显性点突变位点的35个碱基构成的DNA寡核苷酸的有义链及反义链(西格玛奥德里奇公司)。关于不具有显性点突变位点的正常型等位基因，也同样地进行DNA寡核苷酸合成。将各个具体的碱基序列示于表7。

[表7]

接着，通过与上述“实施例1(2)”同样的方法进行合成的各链DNA寡核苷酸的退火处理及对质粒的插入操作，构建报告等位基因表达质粒。

(3)细胞培养

使用与上述“实施例1(3)”同样的方法，培养HeLa细胞(源自人的细胞系)。

(4)转染及报告分析

使用与上述“实施例1(4)”同样的方法接种细胞后，转染上述的EGFR-siRNA及报告等位基因表达质粒，测定萤光素酶活性后，进行设计的EGFR-siRNA的评价。

(5)结果

图8表示结果。A表示使用了各siRNA时的辨别比(散点图)及ASP得分(条形图)。另外，B表示野生型的EGFR序列(T790T(WT))和变异型的靶EGFR序列(T790M(MT))的萤光素酶表达量。

在从基准变异点向下游第4位和第6位上导入了错配碱基的siT790M_8s(G4C)18及siT790M_8s(U6A)18与作为对照的siT790M_8s18的辨别比及ASP得分相比，均可得到高的值。该结果不与实施例1及3的结果矛盾。

由以上的结果表示具有基于本发明的设计方法的结构的特征的siRNA对于各种基因具有高的ASP-RNAi效果。

将本说明书中引用的全部的出版物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (17)

1.一种靶基因的显性等位基因表达抑制剂，含有RNAi分子，其中，

所述RNAi分子包含由与含有至少一个显性点突变的连续的16～30个碱基中的任一所述显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基序列构成的RNAi有义链区域，和由与所述RNAi有义链区域互补的碱基序列构成的RNAi反义链区域，

从RNAi有义链区域上的任一显性点突变朝向上游侧第7～10位中的任一碱基构成RNAi分子中的5’末端碱基，且

从所述任一显性点突变朝向下游侧第3～8位中的任一碱基具有与所述显性等位基因的有义链碱基序列上的碱基不同的错配碱基，

所述RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号3及4、序列号5及6、序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号19及20、序列号21及22、序列号23及24、序列号25及26、序列号27及28、序列号29及30、序列号35及36、序列号37及38、序列号39及40、序列号41及42、序列号43及44、序列号55及56、序列号57及58、序列号59及60、序列号61及62、序列号63及64、序列号67及68、序列号69及70、序列号81及82、序列号83及84、序列号91及92所示的寡核苷酸对构成的组，

所述抑制剂由下式所表示的ASP得分高于所述RNAi分子中不具有错配碱基的对照，

ASP得分＝[(正常型等位基因的表达量)-(变异型等位基因的表达量)]×(正常型等位基因的表达量)。

2.一种靶基因的显性等位基因表达抑制剂，含有与编码RNAi分子的DNA以可操作的方式连接的表达载体，其中，

所述RNAi分子包含由与含有至少一个显性点突变的连续的16～30个碱基中的任一所述显性等位基因的有义链碱基序列一致的碱基序列构成的RNAi有义链区域，和由与所述RNAi有义链区域互补的碱基序列构成的RNAi反义链区域，

从RNAi有义链区域上的任一显性点突变朝向上游侧第7～10位中的任一碱基构成RNAi分子中的5’末端碱基，且

从所述任一显性点突变朝向下游侧第3～8位中的任一碱基具有与所述显性等位基因的有义链碱基序列上的碱基不同的错配碱基，

所述RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号3及4、序列号5及6、序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号19及20、序列号21及22、序列号23及24、序列号25及26、序列号27及28、序列号29及30、序列号35及36、序列号37及38、序列号39及40、序列号41及42、序列号43及44、序列号55及56、序列号57及58、序列号59及60、序列号61及62、序列号63及64、序列号67及68、序列号69及70、序列号81及82、序列号83及84、序列号91及92所示的寡核苷酸对构成的组，

所述抑制剂由下式所表示的ASP得分高于所述RNAi分子中不具有错配碱基的对照，

ASP得分＝[(正常型等位基因的表达量)-(变异型等位基因的表达量)]×(正常型等位基因的表达量)。

3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，构成5’末端碱基的碱基为从所述显性点突变朝向上游侧第7～9位中的任一碱基。

4.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，错配碱基为从所述显性点突变朝向下游侧第3～5位中的任一碱基。

5.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，RNAi分子为siRNA。

6.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，RNAi分子为shRNA。

7.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，显性点突变为功能获得型。

8.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，所述显性点突变参与疾病的发病。

9.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为恶性新生物。

10.如权利要求9所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且靶基因为EGFR(表皮生长因子受体)基因。

11.如权利要求10所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别由序列号81及82或序列号83及84所示的寡核苷酸对构成。

12.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为进行性骨化性纤维发育不良，且靶基因为ALK2(激活素样激酶2)基因。

13.如权利要求12所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号3及4、序列号5及6、序列号7及8、序列号9及10、序列号11及12、序列号13及14、序列号19及20、序列号21及22、序列号23及24、序列号25及26、序列号27及28、序列号29及30、序列号35及36、序列号37及38、序列号39及40、序列号41及42、序列号43及44、及序列号91及92所示的寡核苷酸对构成的组。

14.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为亨廷顿病，且靶基因为亨廷顿基因。

15.如权利要求14所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链及反义链分别选自由序列号55及56、序列号57及58、序列号59及60、序列号61及62、序列号63及64、序列号67及68，以及序列号69及70所示的寡核苷酸对构成的组。

16.一种药物组合物，含有权利要求1～15中任一项所述的抑制剂作为有效成分。

17.如权利要求16所述的药物组合物，含有制药上可容许的载体。