CN109295058B - 抑制miR-34家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请针对miR‑34家族分子miR‑34a、miR‑34b和miR‑34c，设计了与之具有完全配对序列和非完全配对序列的寡核苷酸元件，并进一步设计了包含该寡核苷酸元件的寡核苷酸序列，统称miR‑34海绵。本申请还设计了包含该miR‑34海绵的核酸构建体。该miR‑34海绵或该核酸构建体在生物体体内细胞或体外培养细胞中表达，能有效地结合细胞中的miR‑34家族分子，抑制这些miR‑34家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，可以作为一种试剂工具，用于研究miR‑34调控肿瘤发生发展、生物个体发育等的分子机制研究。该miR‑34海绵也可以用来制备用于抑制miR‑34家族分子的药剂。因此，本申请还提供了包含该miR‑34海绵或该核酸构建体的试剂盒或药物组合物。

Description

抑制miR-34家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种能抑制miR-34家族分子的功能的microRNA海绵、包含该microRNA海绵的核酸构建体及其应用。
背景技术
MicroRNA(简称miRNA或MiR)是一类由19-25个核苷酸组成的短的非编码RNA片段。它作为生物体内广泛存在的转录后调控因子，在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤发生、肿瘤迁移、器官形成、器官衰老、疾病发生等各种生物学事件中发挥着重要的调控作用。microRNA的产生机制相对保守。首先，编码microRNA的基因在核内转录成pri-miRNA。然后，pri-miRNA在Drosha RNase III酶及辅助因子DGCR8的作用下，剪切为约70个核苷酸长度、具有茎环结构的microRNA前体，即pre-miRNA。然后，pre-miRNA在依赖Ran-GTP的核质/胞质转运蛋白Exportin 5的作用下，从核内运输到胞质中，在细胞质中由Dicer酶将pre-miRNA剪切成大约21个核苷酸长度的双链microRNA。起初，成熟microRNA与其互补序列形成双螺旋结构。随后，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称RISC复合物。该复合物结合到目标靶mRNA上，在大多数情况下该复合物中的单链microRNA与靶mRNA的3'UTR发生不完全互补配对，从而阻断该靶mRNA的翻译过程或导致该靶mRNA的剪切和降解。
miR-34是哺乳动物一个保守的microRNA基因家族，表达3个同源的microRNA分子，即miR-34a、miR-34b和miR-34c。miR-34家族分子在多种肿瘤如结直肠癌、肺癌以及个体发育中具有重要的调控作用。因而，开发针对miR-34家族分子的miR-34海绵，有望用于抑制micR-34家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，可以作为一种工具用于研究miR-34调控肿瘤发生发展、生物个体发育等的分子机制研究，或者用于基于阻断miR-34生物学功能的医疗用途。
发明内容
为抑制miR-34家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，本发明提供一种抑制miR-34家族分子的microRNA海绵，并提供了包含该microRNA海绵的核酸构建体，以及包含该microRNA海绵或该核酸构建体的试剂或药物组合物。
因此，在一个方面，本发明提供一种抑制miR-34家族分子的microRNA海绵，该microRNA海绵包含以下寡核苷酸元件：CAGCTAA序列-CTAT序列-CACTGCC序列，其中所述CACTGCC序列和所述CAGCTAA序列与miR-34家族分子完全配对，所述CTAT序列与miR-34家族分子不完全配对。
在一个实施方案中，miR-34海绵包含1个寡核苷酸元件，具有以下核苷酸序列(其中下划线部分表示CTAT序列)：
5’-CAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.1)。
在一些实施方案中，miR-34海绵包含2-20个该寡核苷酸元件，相邻的寡核苷酸之间由间隔序列ACGCG隔开。
在一些优选的实施方案中，miR-34海绵包含2-6个寡核苷酸元件，具有以下核苷酸序列(其中黑体部分表示间隔序列ACGCG)：
Figure BDA0001794932260000021
在具体的实施方案中，该miR-34家族分子为miR-34a、miR-34b和miR-34c中的一者或多者。
在优选的实施方案中，该miR-34家族分子存在于人类物种中。
在另外的实施方案中，该miR-34家族分子存在于与人类物种的miR-34家族分子具有相似序列的动物物种中。在具体的实施方案中，动物物种为小鼠、大鼠、鸡、爪蟾蜍、斑马鱼、海胆、冈比亚按蚊、意蜂、果蝇、线虫。
在第二方面，本发明提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含表达载体和与该表达载体有效连接的前述的miR-34海绵。
在一个优选的实施方案中，该表达载体为慢病毒载体。
在第三方面，本发明提供第一方面的miR-34海绵或第二方面的核酸构建体在制备用于抑制miR-34家族分子的试剂或药剂中的用途。
在第四方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含前述的miR-34海绵或前述的核酸构建体。
在第五方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含前述的miR-34海绵或前述的核酸构建体，以及药学上可接受的载体。
本发明的有益效果：
本发明针对miR-34家族分子miR-34a、miR-34b和miR-34c，设计了与之具有完全配对的序列和非完全配对的序列的寡核苷酸元件，并进一步设计了包含该寡核苷酸元件的寡核苷酸序列。该寡核苷酸元件和包含该寡核苷酸元件的寡核苷酸序列被称为miR-34海绵。本申请还设计了包含该miR-34海绵的核酸构建体。该miR-34海绵或该核酸构建体在生物体体内细胞或体外培养细胞中表达，能有效地结合细胞中的miR-34家族分子miR-34a、miR-34b和miR-34c，抑制这些miR-34家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能，可以作为一种试剂工具，用于研究miR-34调控肿瘤发生发展、生物个体发育等的分子机制研究。该miR-34海绵也可以用来制备用于抑制miR-34家族分子的药剂。
附图说明
1.图1显示了人类、小鼠等物种的miR-34家族分子miR-34a、miR-34b、miR-34c的种子序列，其中has代表人类、mmu代表小鼠、rno代表大鼠、gga代表鸡、xtr代表爪蟾蜍、dre代表斑马鱼、cin代表玻璃海鞘、spu代表紫海胆、ame代表意蜂、aga代表冈比亚按蚊、dme代表黑腹果蝇、dpu代表蚤状溞、cel代表秀丽隐杆线虫、lgi代表霸王莲花青螺。
2.图2显示了根据本发明的一个实施方案，miR-34海绵与miR-34a分子列完全配对结合的示意图。
3.图3显示了根据本发明一个实施方案，miR-34海绵-慢病毒载体核酸构建体的构建示意图。
4.图4显示了在本发明一个实施例中，miR-34海绵能有效抑制miR-34a对Luc-Sirt1-3’UTR、Luc-DLL1-3’UTR的靶向调节作用，其中Sirt1和DLL1为已被报道的miR-34的下游靶基因。
具体实施方式
以下通过实施例的方式对本发明进行进一步的详细描述。应当理解，这些描述仅出于说明本发明的目的，并不意在以任何方式限制本发明。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。如果有冲突，以本说明的定义为准。本文中使用的材料、方法和示例仅作说明用途，无意作为限制，除非特别指明。
本发明人基于人类、小鼠、大鼠、鸡、爪蟾蜍、斑马鱼、海鞘、海胆、意蜂、按蚊、果蝇、蚤状溞、线虫、青螺物种的miR-34家族分子miR-34a、miR-34b和miR-34c的共有序列(图1；参考文献Nature,2014June 5,510(7503))，设计了与之具有完全配对序列和非完全配对序列的寡核苷酸元件，并进一步设计了包含该寡核苷酸元件的寡核苷酸序列，得到本发明的miR-34海绵。miR-34海绵是一种miRNA海绵(miRNA sponge)，miRNA海绵是指能吸收目标miRNA的DNA序列，使目标miRNA不能与其天然靶基因结合而调节靶基因的表达，从而起到抑制目标miRNA的靶向调节作用。
参见图1，所有的miR-34家族分子均具有第一共有序列GGCAGUG和第二共有序列UUAGCUG。第一共有序列GGCAGUG对于前述物种的所有miR-34家族分子都是保守的，第二共有序列UUAGCUG对于前述物种的绝大多数miR-34家族分子都是保守的。
本发明的寡核苷酸元件被设计为具有如下结构：第一完全配对序列-不完全配对序列-第二完全配对序列，其中第一完全配对序列与miR-34家族分子的第一共有序列互补，第二完全配对序列与miR-34家族分子的第二共有序列互补，不完全配对序列与miR-34家族分子不完全互补，以提高该寡核苷酸元件的物种适用性，可以适用于例如人类、小鼠、大鼠、鸡、爪蟾蜍、斑马鱼、海鞘、海胆、意蜂、按蚊、果蝇、蚤状溞、线虫、青螺物种，优选适用于人类、小鼠、大鼠物种。
因此，设计出与第一共有序列GGCAGUG反向互补的第一完全配对序列CACTGCC，设计出与第二共有序列UUAGCUG反向互补的第二完全配对序列CAGCTAA，并设计出不完全配对序列CTAT，得到寡核苷酸元件CAGCTAACTATCACTGCC，作为本发明的miR-34海绵的基础构件。在该寡核苷酸元件的3’端添加终止序列tttttt，得到本发明的包含1个该寡核苷酸元件的miR-34海绵：
5’-CAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.1)。
在另外的实施方案中，不完全配对序列可以选择ACTAT序列。
为了增加miR-34海绵的拷贝数以增加在细胞中miR-34海绵的表达水平，本发明的miR-34海绵还可被设计为包含多个该寡核苷酸元件。因此设计了间隔序列ACGCG将相邻的寡核苷酸元件串联在一起，也即将相邻的寡核苷酸元件隔开。考虑到miR-34海绵在细胞或动物体内的表达水平，以及miR-34海绵的潜在可能的细胞毒性作用，该寡核苷酸元件的个数宜在20个以下。因此，miR-34海绵还可以包含2-20个该寡核苷酸元件，优选地3-15个该寡核苷酸元件，更优选地5-10个该寡核苷酸元件，最优选地6个该寡核苷酸元件。在由间隔序列ACGCG串联该寡核苷酸元件得到的核苷酸序列的3’端添加终止序列tttttt，得到本发明的包含多个该寡核苷酸元件的miR-34海绵。例如，包含2-6个该寡核苷酸元件的miR-34海绵具有以下核苷酸序列：
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.2)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.4)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.5)；或
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明的miR-34海绵元件由于存在完全配对序列，能与miR-34家族分子miR-34a、miR-34b或miR-34c的共有序列结合，起到抑制miR-34家族分子的作用。同时，该miR-34海绵元件由于存在不完全配对序列，当与miR-34家族分子miR-34a、miR-34b或34c结合时，发生不完全互补配对而形成突出样结构，如图2所例示，这有利于miR-34海绵元件对miR-34家族分子的抑制效果。
为了使本发明的miR-34海绵能导入细胞或动物体内发挥作用，本发明还构建了包含本发明的miR-34海绵的的核酸构建体。该核酸构建体的构建包括使本发明的miR-34海绵与表达载体有效连接。本文所用的“有效连接”是指本发明的miR-34海绵与表达载体的连接使得所产生的核酸构建体能在细胞或动物体内转录本发明的miR-34海绵。在本发明的miR-34海绵序列的两端加上与表达载体相配的酶切位点，合成正向序列和反向序列，以与该表达载体有效连接。具体而言，该表达载体为慢病毒载体，其具有BamHI和EcoRI酶切位点。在本发明的miR-34海绵序列的两端加上与慢病毒载体相配的BamHI和EcoRI酶切位点，合成正向序列和反向序列。以上述SEQ ID NO.6所示的miR-34海绵为例，在其序列两端添加上BamHI和EcoRI酶切位点，合成正向序列和反向序列如下：
正向序列：
5’-gatccCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCttttttg-3’；
反向序列：
5’-aattcaaaaaaGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATA GTTAGCTGGg-3’。
应用分子克隆技术，将该正向序列及其反向序列通过核酸链退火反应形成互补的miR-34海绵粘性末端双链，并将该粘性末端双链连接到表达载体(例如慢病毒载体)的相应酶切位点之间，即得到本发明的核酸构建体(如图3所示)。该核酸构建体导入细胞内或动物体内后，可在细胞中表达本发明的miR-34海绵，后者能与细胞内或动物体内的miR-34家族分子如miR-34a、miR-34b、miR-34c形成不完全互补配对，从而抑制miR-34家族分子与其靶基因的结合。
本发明的miR-34海绵或者本发明的核酸构建体可以用来制备用于抑制miR-34家族分子的试剂或药剂，以抑制动物体内miR-34家族分子与其靶基因相互识别、配对的生物学功能。
在用本发明的miR-34海绵制备试剂的情况下，该试剂可呈试剂盒的形式，其中包含本发明的miR-34海绵。该试剂盒还包含各种适用的缓冲剂等物质以及使用说明书，这是本领域公知的。
该试剂盒可以应用于miR-34的生物学研究，如在体外的细胞学研究中，可以应用目前市面上已有细胞转染试剂将该试剂盒中的miR-34海绵转入到靶细胞中，研究miR-34家族分子的生物学功能被该miR-34海绵抑制后所引起的细胞生物学变化。该试剂盒也可以应用于有关于miR-34的动物实验研究，比如在小鼠动物实验中，可以通过静脉血注射或特定组织内注射，在体内环境下研究miR-34海绵抑制miR-34家族分子后所引起的生物学效应。
在用本发明的miR-34海绵制备药剂的情况下，该药剂可呈药物组合物的形式，其中包含本发明miR-34海绵或本发明核酸构建体，以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域常规使用的赋形剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、软膏剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。本发明的药物组合物可以制成各种剂型型式，例如片剂、包衣片剂、粉剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊、丸剂、液体剂、混悬剂、乳剂、咀嚼剂、软片剂等，这是本领域公知的。
尤其是，miR-34家族分子在特发性肺间质纤维化组织中高表达，研究发现miR-34家族分子的高表达抑制了c-Myc蛋白、cyclins蛋白的表达水平，最终导致肺泡上皮细胞的衰老，这可能与特发性肺间质纤维化的发病机理有关(参考：PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0158367)。因此，在潜在的应用中，该miR-34海绵制备药剂(药物组合物)可能应用于特发性肺间质纤维化病人，通过抑制miR-34家族分子的功能，从而达到对该疾病的治疗作用。
以下通过非限制性实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：miR-34海绵和包含miR-34海绵的核酸构建体的合成与制备
按如上所述，设计出SEQ ID NO.6所示的miR-34海绵。为将该miR-34海绵导入细胞或动物体内发挥作用，选用具有BamHI和EcoRI酶切位点的慢病毒载体plvx-shRNA1(Clonetech)设计了包含该miR-34海绵的核酸构建体。
具体地讲，在该miR-34海绵的两端加上与慢病毒载体相配的BamHI和EcoRI酶切位点，合成正向序列和反向序列如下：
正向序列：
5’-gatccCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCttttttg-3’；
反向序列：
5’-aattcaaaaaaGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATAGTTAGCTGGCGCGTGGCAGTGATA GTTAGCTGGg-3’。
委托商业性的基因合成公司来合成上述正向序列和反向序列。然后，由本发明人按以下操作完成包含miR-34海绵的核酸构建体的构建。
将上述正向序列和反向序列分别用超纯水溶解为100μM的浓度，按以下组分配成退火反应体系：
Figure BDA0001794932260000081
将退火反应体系加热到100℃，温育5分钟，然后自然冷却至室温。
将1μg plvx-shRNA1载体用BamHI和EcoRI酶切，并回收酶切后的载体为连接载体。
按以下组分配成配制连接反应体系：
Figure BDA0001794932260000082
将以上连接反应体系于16℃下温育30分钟。
将一支大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司)于冰上化开。取1μl的以上连接反应体系加入到50μl的细胞悬液中，冰上放置30分钟，然后在42℃下温育90秒，然后在冰上放置2分钟。
向上述50μl的该细胞悬液加950μl新鲜配制的细菌悬浮培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)，在37℃下培养1小时。然后，将细胞悬液离心(5000转/分钟，3分钟)，细胞沉淀于管底部，取出800μl培养基。用管中剩余的200μl培养基重悬细胞沉淀，取50-200μl所得的细胞悬液均匀涂在带氨苄抗性的细菌培养板(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂糖，50μg/ml氨苄青霉素)上，37℃下培养12小时。挑取细菌培养板中的单克隆细菌，于3ml带氨苄抗性(50μg/ml)的细菌液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)中37℃下培养5小时。
将所得的菌液在4℃下保存，并送交商业性的基因测序公司测序。取完整插入miR-34海绵序列的克隆菌液1μl加入200ml细菌液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，50μg/ml氨苄青霉素)中，于37℃细菌培养箱中培养12小时。应用质粒抽提试剂盒(Axygen公司)抽提质粒，冻存于-80℃备用。所得质粒即为根据本发明的核酸构建体，如图3所示。
实施例2：miR-34海绵的功能验证
Sirt1和DLL1是已经报道过的miR-34的下游靶基因。在本实施例中，将这三个基因的mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)克隆到荧光素酶报告基因(Luciferase Reporter)载体中，得到Luc-Sirt1-3’UTR和Luc-DLL1-3’UTR构建物。将这些构建物分别与miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-34a/Con-sponge、miR-34b/Con-sponge、miR-34b/Con-sponge、miR-34a/miR-34海绵、miR-34b/miR-34海绵或miR-34c/miR-34海绵共同转染293细胞(ATCC生物资源中心)，同时设置对照组，进行miR-34海绵的功能验证，其中Con-sponge表示空海绵对照，即用于构建miR-34海绵的Plvx-shRNA1载体。具体实验设计如下表1-3所示。
表1：针对miR-34a的功能验证实验设计
分组 Control miR-34a miR-34a/Con-sponge miR-34a/miR-34-sponge
3’UTR 10ng 10ng 10ng 10ng
Plvx-shRNA1 90ng 60ng 60ng 0ng
miR-34a 0ng 30ng 30ng 30ng
miR-34-sponge 0ng 0ng 0ng 60ng
表2：针对miR-34b的功能验证实验设计
分组 Control miR-34b miR-34b/Con-sponge miR-34b/miR-34-sponge
3’UTR 10ng 10ng 10ng 10ng
Plvx-shRNA1 90ng 60ng 60ng 0ng
miR-34b 0ng 30ng 30ng 30ng
miR-34-sponge 0ng 0ng 0ng 60ng
表3：针对miR-34c的功能验证实验设计
Figure BDA0001794932260000091
Figure BDA0001794932260000101
将293细胞按1×104/孔的密度接种于96孔平底板(DMEM(hyclone)+10％胎牛血清(hyclone))中培养过夜。第二天，使用
Figure BDA0001794932260000102
2000DNA Transfection Reagent(Invitrogen)按照生产商说明书转染293细胞。
转染细胞48小时后，收集样本检测细胞中荧光素酶的活性。荧光素酶的活性的检测方法应用双荧光素酶检测试剂盒(E1910，Peomega公司)，按照该试剂盒的双荧光素酶报道基因测定方案(Dual-Luciferase Reporter Assay Protocol)进行。
具体地讲，细胞转染质粒48小时后，吸掉培养孔中培养基，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。向每孔细胞中加试剂盒中提供的PLB试剂20μl，将培养板放在水平震荡器上震荡15分钟，充分裂解细胞。从每个细胞培养孔中取10ul裂解液转移到黑色的96孔分析板中，向每个孔中加入试剂盒中提供的LAR-II底物100μl，在酶标仪(Synergy HT酶标仪)中检测并读取萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)活性值。然后，向每个孔中加入试剂盒中提供的Stop底物100μl，在酶标仪(Synergy HT酶标仪)中检测并读取海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)活性值。用以下公式计算样本的相对活性强度，以Luc/Rluc比率表示：
样本的相对活性强度(Luc/Rluc比率)＝(样本的Luc活性值/样本的Rluc活性值)/(对照的Luc活性值/对照的Rluc活性值)。
如图4所示，在针对miR-34a的功能验证实验中，miR-34a实验组和miR-34a/Con-sponge实验组的荧光素酶蛋白活性为对照组的荧光素酶蛋白活性的50％以下，说明miR-34a显著下调了Luc-Sirt1-3’UTR和Luc-DLL1-3’UTR的荧光素酶蛋白活性。相反，miR-34a/miR-34海绵实验组的荧光素酶蛋白活性与对照组的荧光素酶蛋白活性相近，说明miR-34海绵有效抑制了miR-34a对Luc-Sirt1-3’UTR和Luc-DLL1-3’UTR的靶向下调作用。在针对miR-34b的功能验证实验和针对miR-34c的功能验证实验中也观察到类似的结果。
因此，本发明的miR-34海绵能有效抑制miR-34家族分子miR-34a、miR-34b和miR-34c，适用于人类、小鼠、大鼠、鸡、爪蟾蜍、斑马鱼、海鞘、海胆、意蜂、按蚊、果蝇、蚤状溞、线虫、青螺物种。
以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Figure IDA0001794932320000011
Figure IDA0001794932320000021

Claims (8)

1.一种抑制miR-34家族分子的miR-34海绵，其特征在于，所述miR-34海绵包含具有以下结构的寡核苷酸元件：CAGCTAA序列-CTAT序列-CACTGCC序列，其中所述CACTGCC序列和所述CAGCTAA序列与miR-34家族分子完全配对，所述CTAT序列与miR-34家族分子不完全配对。
2.根据权利要求1所述的miR-34海绵，其特征在于，所述miR-34海绵包含1个所述寡核苷酸元件，具有以下核苷酸序列：
5’-CAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.1)。
3.根据权利要求1所述的miR-34海绵，其特征在于，所述miR-34海绵包含2-20个所述寡核苷酸元件，相邻的所述寡核苷酸之间由间隔序列ACGCG隔开。
4.根据权利要求3所述的miR-34海绵，其特征在于，所述miR-34海绵包含2-6个所述寡核苷酸元件，具有以下核苷酸序列：
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.2)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.4)；
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQ ID NO.5)；或
5’-CAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCACGCGCAGCTAACTATCACTGCCtttttt-3’(SEQID NO.6)。
5.一种核酸构建体，其特征在于，包含表达载体和与所述表达载体有效连接的根据权利要求1-4中任一项所述的miR-34海绵。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的miR-34海绵或根据权利要求5所述的核酸构建体在制备用于抑制miR-34家族分子的试剂或药剂中的用途。
7.一种试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1-4中任一项所述的miR-34海绵或根据权利要求5所述的核酸构建体。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-4中任一项所述的miR-34海绵或根据权利要求5所述的核酸构建体，以及药学上可接受的载体。
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