CN108441518A - 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108441518A
CN108441518A CN201810278578.1A CN201810278578A CN108441518A CN 108441518 A CN108441518 A CN 108441518A CN 201810278578 A CN201810278578 A CN 201810278578A CN 108441518 A CN108441518 A CN 108441518A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
sponges
preparation
stem cell
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810278578.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王迎军
万双燕
付晓玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201810278578.1A priority Critical patent/CN108441518A/zh
Publication of CN108441518A publication Critical patent/CN108441518A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于miR‑146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法。通过设计一种针对miRNA‑146a的海绵，这种海绵可以通过碱基互补配对反应在转录水平上实现对整个miR‑146a家族的长效抑制；通过对GV369载体的包装，获得带有miR‑146a海绵的高度纯化的慢病毒颗粒，将病毒转染至ASCs中，从而下调细胞整个miR‑146a家族的水平，最终对转染了miR‑146a海绵的ASCs中miR‑146a的表达水平进行了检测。该方法显著提高了ASCs的免疫抑制和成骨分化性能，且所制备的目的细胞具有正常的增殖能力。

Description

一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于脂肪间充质干细胞领域，具体涉及一种基于miR-146a海绵的脂 肪间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
miRNA通过沉默RNA和转录后调节基因的表达，参与着生物体的生长发 育、组织生成、各项细胞活动及多种疾病的发生等重要过程，在基因表达调控 方面已成为决定性的调控因素之一。值得一提的是，一个特定的miRNA可能具 有数百个不同的mRNA靶标，而一个特定的mRNA靶标也可能受多个miRNA 的调控。
miRNA-146是一个典型的多功能基因，参与着众多生理、病理进程如炎性 反应的发生，也是首个被发现在免疫系统中具有免疫调节作用的miRNA。已有 研究发现miR-146a可以与BM-MSCs中COX-2的3’端靶向结合，进而抑制 COX-2的翻译，最终导致PGE2的分泌降低。miR-146a也参与软骨细胞的凋亡 进程，有研究也发现miR-146a可以负向调控Smad4基因的表达促进软骨细胞凋 亡和负向调控Smad2和Smad3基因的表达促进人胎儿股骨来源的骨干细胞成 骨分化。
目前对miRNA的研究方法主要是化学修饰的反义寡核苷酸、基因敲除和海 绵。其中，由于海绵能够有效地阻断具有共同种子区的miRNA家族且能够在宿 主细胞中长期稳定表达，其抑制效果甚至优于广泛使用的反义寡核苷酸抑制剂。
在组织修复过程中，过度的炎症反应是一个亟待解决的问题。间充质干细 胞(MSCs)因具有较强的自我更新能力及多向分化潜能在组织工程中备受关注。 近年来，MSCs的免疫抑制性能引起了研究者们的关注，尤其是免疫调控因子的 分泌使其具有免疫抑制性能，从而调控先天性和适应性免疫反应，最终避免持 续性炎性反应的发生。
现在使用较多的骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)由于来源较少、提取和分 离过程复杂等原因，使其发展和应用受到限制。自2001年Zuk博士等从吸脂术 抽出的脂肪组织中发现并成功提取出间充质干细胞之后，近年来ASCs(脂肪来 源间充质干细胞)的提取方法已经非常成熟，这为人们对干细胞的研究带来了 新的思路。相比于BMSCs，ASCs具有提取方便、分化潜力高、表达更丰富的 免疫调节因子等优点。
基于已有研究结果，我们考虑是否能通过调节miR-146a来调控ASCs的免 疫抑制和成骨分化性能，我们有希望给组织工程带来更好的种子细胞，以达到 更好的组织修复效果，这具有十分重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制 备方法，该基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞能提高人源ASCs免疫抑制 和成骨分化性能。
一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)miR-146a海绵的设计：按照碱基互补配对原则，设计miR-146a-5p的 反义序列，然后把所得反义序列的11～14位对应的碱基突变为“GAC”，再在 两个突变后的反义序列之间加入“CTTC”连接序列，最终构成6个拷贝的海绵 构件，即miR-146a海绵，该miR-146a海绵的核苷酸序列如Seq1所示；
(2)构建携带miR-146a海绵的重组质粒，然后采用三质粒共转染包装细 胞获取慢病毒保存液；
(3)慢病毒转染脂肪间充质干细胞：用完全培养基制备脂肪间充质干细胞 悬液，然后接种培养直至细胞汇合度达到30％(对于T25瓶，接种细胞数量为 30-50万)；采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释；吸掉培养液中的上清液，再 更换培养基，加入miR-146asponge病毒稀释液，培养后进行细胞筛选，得基于 miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞；所述培养基为完全培养基、含聚凝胺的完 全培养基、Eni.S.溶液、含聚凝胺的Eni.S.溶液中的一种以上。
优选的，步骤(2)所述携带miR-146a海绵的重组质粒包括miR-146a海绵 基因序列、泛素基因序列、绿色荧光蛋白基因序列和嘌呤霉素基因序列。
优选的，步骤(2)中选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装。
优选的，步骤(2)所述三个质粒分别为携带miR-146a海绵的重组质粒、 辅助质粒Helper 1.0和Helper 2.0载体。
优选的，步骤(2)所述包装细胞为293T细胞。
优选的，步骤(3)所述脂肪间充质干细胞悬液的密度为(3-5)×104cells/ml。
优选的，步骤(3)所述培养的温度为CO2浓度为5％、湿度为95％、温 度为37℃的培养箱。
优选的，步骤(3)中更换培养基后使聚凝胺的最终浓度保持为5μg/ml。
优选的，步骤(3)中加入病毒稀释液的体积应该保持复感染指数(MOI值) 为50，病毒稀释液体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。
由以上所述的制备方法制得的一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞。
本发明中的miR-146a海绵可以长效降低细胞质中游离miR-146a家族水平。 其中，该miR-146a海绵发挥抑制细胞质中游离miR-146a家族水平的功能要借 助慢病毒作为载体递送至细胞中实现。能使ASCs中免疫调节因子和趋化因子表 达上调，使ASCs中成骨分化性能得到上调。所述的ASCs是指人源ASCs。
本发明构造了一种针对miRNA-146a的海绵作为细胞中miRNA-146a家族的 抑制剂，该抑制剂可通过碱基互补配对结合细胞质中游离的miR-146a，从而在 转录水平上实现对整个miR-146a家族的长效抑制。其制备的具有优异的生物学 性能的目的细胞是由海绵介导慢病毒转染的手段所得。慢病毒作为递送海绵序 列的载体使得转染效率高且外源靶基因长期稳定表达在宿主细胞中。携带 miRNA-146a海绵的工具载体质粒包括6个串联的目的基因序列(miR-146a海 绵)，荧光蛋白基因序列以及抗性基因序列。目的基因序列用于降低细胞质中游 离的miR-146a家族水平，荧光蛋白基因序列用于定性和定量检测转染效率，抗 性基因序列用于筛选阳性细胞。制备的目的细胞具有优异的免疫抑制和成骨分 化性能的ASCs。
本发明首先用基因工程的方法构建了载有micro RNA-146a海绵的慢病毒， 用慢病毒转染ASCs，使ASCs中的micro RNA-146a下调，进一步通过qRT-PCR 等方法检测了microRNA-146a表达水平下调之后的脂肪干细胞中的基因表达情 况。结果表明免疫调控相关基因显著上调，说明miR-146a的下调提高ASCs免 疫抑制性能。此外micro RNA-146a表达水平下调使得ASCs成骨分化性能也发 生了显著变化，进一步证实了miR-146a在调节ASCs成骨分化性能中的作用。 通过调节miR-146a的水平来提高ASCs的免疫调控和成骨分化性能，可以为组 织工程提供更好的种子细胞，有望更好地实现组织修复。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
1、相较于目前常用的骨髓间充质干细胞，本发明使用的脂肪间充质干细胞 具有提取简单、来源充足、干性强、表达更丰富的免疫调节因子等优点，成为 组织工程中最受欢迎的种子细胞之一。
2、本发明基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞具有优异的免疫抑制和 成骨分化性能，且具有正常的增殖能力，对于骨组织修复和再生具有重要的意 义。
3、本发明采用海绵能够有效下调具有共同种子区的miRNA家族的表达。 同时，海绵的表达可以长期有效地下调特定miRNA的表达，其下调效果优于之 前广泛使用的反义寡核苷酸抑制剂。
附图说明
图1为携带miR-146a海绵的重组质粒的结构图。
图2为N.C.miR组ASCs转染荧光图。
图3为miR-146a海绵组ASCs转染荧光图。
图4为转染效率图。
图5为相对的miR-146a表达水平图。
图6为细胞活性图。
图7为ASCs免疫相关基因表达检测图。
图8为ASCs成骨标记基因ALP的表达检测图。
图9为ASCs成骨标记基因RUNX2的表达检测图。
图10为ASCs成骨标记基因COL-1的表达检测图。
图11为ASCs成骨标记基因OPN的表达检测图。
图12为N.C.miR组ASCs在培养14天后ALP染色图片。
图13为miR-146a海绵组ASCs在培养14天后ALP染色图片。
图14为N.C.miR组ASCs在培养14天后茜素红染色图片。
图15为miR-146a海绵组ASCs在培养14天后茜素红染色图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，按照试剂生产厂家的操作规范执行。
实施例1
miR-146a海绵的设计。采用靶基因拟似物过表达策略，针对miRBASE上 人miR-146a-5p序列。首先，按照碱基互补配对原则，设计针对miR-146a-5p的 反义序列(miR-146a-5p-SP-unit)，然后把反义序列的11～14位对应的碱基突变 为“GAC”以增强两个突变后的反义序列的结合稳定性，再在两个突变后的反 义序列之间加入“CTTC”连接序列，最终构成6个拷贝的海绵构件(miR-146a-5p Sponges)，即miR-146a海绵(核苷酸序列如Seq1所示)。再在该海绵构件的上 下游设计EcoRⅠ酶切位点，以便进行重组质粒的构建。
携带miR-146a海绵的重组质粒的构建。通过限制性核酸内切酶消化GV369 质粒，得到线性化的GV369质粒载体。通过PCR技术扩增目的基因(miR-146a 海绵)。在设计引物时，需要在两端添加同源重组序列，这样PCR扩增产物的5’ 和3’最末端的序列就会与线性化克隆载体(GV369质粒载体)两端的序列完 全一致。配制反应体系，使线性化载体和目的扩增产物进行重组，重组产物直 接转化，最后进行PCR鉴定，并将PCR序列正确的菌液扩大培养，并进行携带 目的基因质粒(GV 369)抽提，用于后续实验，得携带miR-146a海绵的重组质粒。 该重组质粒除了miR-146a海绵外，还包括Ubiquitin(泛素)，用于过表达的启 动子；EGFP(绿色荧光蛋白)，用于确认转染效率；Puromycin(嘌呤霉素)，用 于阳性细胞的筛选(见图2)。
慢病毒构建与包装，采用三质粒共转染包装细胞293T细胞获取病毒颗粒。 选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装，其中包含三个质粒，分别为 携带目的基因或靶点序列的目的质粒(携带miR-146a海绵的重组质粒)、辅助质 粒Helper 1.0和Helper 2.0载体。采用以上三种质粒共转染293T细胞，在转染 完成后的48-72小时进行病毒收获(即未纯化的细胞上清液)。最后离心浓缩得 到高滴度的慢病毒保存液。
实施例2
慢病毒转染脂肪干细胞，将转染分为两步，包括转染预实验和正式转染， 预实验用于摸索转染的最佳条件，为正式转染做准备。
(一)转染预实验：用完全培养基制备密度为6-10×104cells/ml的人源脂肪 间充质干细胞悬液(将人源脂肪间充质干细胞培养于添加1vol％青霉素-链霉素、 1vol％谷氨酰胺及10vol％FBS的基础培养基中，放置于CO2浓度为5vol％、 湿度为95％、温度为37℃的培养箱中培养。待细胞融合度为80％时进行消化 传代。放置在CO2浓度为5vol％、湿度为95％、温度为37℃的培养箱中扩增， 采用代数5代之前的细胞进行后续实验)，取100μl/well接种到96孔板中，共 16个孔。放置于CO2浓度为5vol％、湿度为95％、温度为37℃的培养箱中培 养一天后，此时细胞汇合度达30％。采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释滴度为MOI＝10、20、50、100四种滴度。配制含50μg/ml Polybrene(聚凝胺)的完 全培养基P(M)、含50μg/ml Polybrene的Eni.S.溶液P(E)。吸掉96孔板中的上 清液，按照下表1加入相应体积的溶液，放回培养箱继续培养。当感染8-12小 时后换回完全培养基，过程中观察细胞形态，形态发生变化时可以提前到8小 时换液，保持细胞正常生长。继续培养，中途可根据细胞的生长状况进行换液， 保持细胞活性。感染72小时后，用倒置荧光显微镜观察荧光表达丰度。感染细 胞数占总细胞数的80％以上，且细胞生长不受影响的组所对应的感染条件可以 用于后续正式感染。根据细胞形态且转染效率为依据，采用MOI＝50，P(M)＝5 μg/ml的条件进行后续的正式转染实验。
表1
表1中M为完全培养基；P(M)为含50μg/ml Polybrene的完全培养基；Eni.S 为Eni.S.溶液；P(E)为含50μg/ml Polybrene的Eni.S.溶液；Virus为慢病毒稀释 液。
(二)正式转染：以5×104cells/ml的接种密度将人源脂肪间充质干细胞接 种到T25培养瓶中，保证一天后细胞汇合度达到30％。细胞培养一天后，按照 预实验条件，更换培养基，加入2.2ml完全培养基，250μl含50μg/ml Polybrene 的完全培养基P(M)，加入使得MOI为50的N.C.miR病毒稀释液或miR-146a sponge病毒稀释液相应体积，其中，病毒稀释液体积＝(MOI×细胞数目)/病毒 滴度，使Polybrene最终浓度为5μg/ml。最后，按照预实验的换液时间，更换为 完全培养基，继续培养，根据细胞生长状况适时换液，培养到第五天，在荧光 显微镜下观察感染效果，并加入浓度为5μl/ml的puromycin进行细胞筛选，收 获成功转染的细胞(miR-146a海绵组ASCs)，为后面实验做准备。
实施例3
对于判断慢病毒转染效率，通过倒置荧光显微镜观察荧光表达丰度，用于 定性判断转染效率。本实施例所得N.C.miR组和miR-146a海绵组ASCs的转染 荧光图，由图可知大部分细胞都成功转染了对照海绵和miR-146a海绵且获得对 嘌呤霉素的抗性(见图3和图4)。通用流式细胞仪用于定量判断转染效率。具 体步骤如下：消化转染的脂肪间充质干细胞，离心，并收集在1ml离心管中。 用1×PBS洗涤以清除培养基，用4wt％多聚甲醛固定半小时，1×PBS洗涤，2wt％ BSA封闭半小时，1×PBS洗涤，以上步骤用1×PBS洗涤后要吹打并离心，离心 速度为2000rpm，时间为5分钟。用1×PBS重悬细胞，重悬后细胞密度大约是103cells/μl，向加入96孔板中加入200μl进行流式分析。其中，本实验有三个组， 分别为未转染细胞(Mock)、转染N.C.miR细胞(N.C.miR组)和转染miR-146a 海绵细胞(miR-146asponge)。本实施例所得N.C.miR组和miR-146a海绵组的 转染效率图，由图可知两组细胞的转染效率分别为85.95％和85.96％(见图5)。 定性和定量结果证实通过慢病毒可以高效地将对照海绵和miR-146a海绵转染进 入细胞质中。
实施例4
对于验证miR-146a的表达采用定量PCR反应进行检测分析。N.C.miR细 胞和miR-146a细胞以10×104/well的密度接种量接种于24孔板中。培养2天后 提取总RNA并进行逆转录与定量PCR反应。
(一)引物的设计和合成。
(二)总RNA抽提与纯化。收集细胞，并用1×PBS洗涤，每孔加入1ml Trizol 溶液，吸抽几次使细胞充分裂解，将细胞和Trizol的混合液移入1ml EP管，静 置5min。每个EP管中加入200μl氯仿，用力上下振荡30s，使水相和有机相 充分接触，室温静置2min，出现分层。4℃下，1.4×104g离心15min，可见溶 液分为三层，RNA位于上层水相，吸取上层清液，移至另一个新的1ml EP管。 加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min。4℃下，1.4×104g 离心10min，RNA沉淀在EP管底部侧壁，去上清。加入75％乙醇洗涤，离心， 重复一次洗涤过程，风干。加入DEPC水，吹打多次直至沉淀溶解。总RNA纯 度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测 定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无 蛋白质污染。总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20 min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA三个条 带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
(三)逆转录。在去RNase的PCR管中加入1μl的RNA，加入DEPC水 使得总体积为12μl，将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构， 随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构。在另一去RNase的 PCR管中加入2μl 10mM dNTP、0.5μl RNaseinhibitor、0.5μl miR-146逆转录 引物、0.5μl U6逆转录引物、4μl 5×buffer和0.5μl M-MLV溶液。将上述配制 溶液与RNA混匀后42℃孵育60min，85℃孵育10min灭活逆转录酶。反应 结束后得到的cDNA放置于-80℃保存或稀释20倍后立即用于PCR反应。
(四)定量PCR。反应体系(20μl)组成为：5μl cDNA、0.5μl正引物、 0.5μl反引物、10μl 2×SYBR Green qPCR SuperMix和4μl dH2O。主要反应步骤 和条件为：50℃反应2min；预变性阶段：95℃反应2min；变性阶段：95℃ 反应15s；退火延伸阶段：60℃反应32s，在该阶段收集荧光信号。整个反应 过程进行40个循环，最终通过在60-95℃之间制备的熔解曲线分析检查片段产 物的特异性。利用qPCR技术分析miR-146a的表达水平，由图可知miR-146a海绵成功地下调了ASCs中miR-146a的表达(见图6)。
实施例5
对于判断miR-146a海绵对细胞活性及增殖情况的影响，采用细胞计数试剂 盒8(Cell Counting Kit-8,以下简称CCK-8)进行检测。N.C.miR细胞和miR-146a 细胞按5000每孔的接种量接种于48孔板中，取1、3、5、7四个时间节点的检 查细胞增殖情况。CCK-8法检测细胞增殖的基本操作流程如下：取CCK-8母 液按母液和完全培养基以1：10配制工作液。将孔板内培养基吸出，用无菌 1×PBS润洗两次，向每孔分别加入200μl的工作液，包裹上铝箔纸放回二氧化 碳培养箱中避光孵育60分钟。吸取100μl上清液转移到新的96孔板中，使用 多功能酶标仪读取450nm波长处的吸光值。由图可知，miR-146a Sponge组的O.D值与N.C.miR组的O.D值之间无明显差异，说明下调miR-146a的表达对细 胞增殖无明显影响(见图7)。
实施例6
对于判断miR-146a海绵对细胞免疫抑制和成骨分化性能的影响，采用定量 PCR反应对细胞免疫相关基因和成骨标记基因的表达进行检测分析。N.C.miR 处理的ASCs和miR-146a海绵处理的ASCs以10×104/wells的细胞密度接种于 24孔板中。培养2天、7天、14天和21天后提取总RNA并进行逆转录与定量 PCR反应。
(一)引物的设计和合成。
(二)RNA提取与纯化
使用PBS缓冲液润洗ASCs细胞，每孔加入1ml的Trizol试剂后静置， 放入-80℃冰箱中保存。将冻存起来的样品放到室温环境中解冻，大约10分钟 后反复吹打十次以上，转移到RNase free 1.5ml EP管中。加入200μl三氯甲烷， 剧烈震荡(上下颠倒)15秒，使氯仿充分混匀后静置10分钟，观察到EP管中 液体开始出现分层；将EP管置于4℃离心机中以转速为12000rpm离心15分 钟；观察到分层现象更加明显，取新的EP管，将上清液小心转至EP管中；加 入500μl异丙醇，混匀，并于冰上静置10分钟；将EP管置于4℃离心机中以 转速为12000rpm离心10分钟；离心后，观察到EP管底部有白色胶状沉淀物 质，即为提取的RNA，弃去上清液，向EP管中加入1ml DEPC水配制的浓度 为75％的乙醇；离心，将EP管置于4℃离心机中以转速为7500rpm离心5分 钟，重复此过程1次；弃去上清液，再加入1ml 100％乙醇，将EP管置于4℃ 离心机中以转速为7500rpm离心5分钟。干燥沉淀，加入10μl DEPC水溶液， 溶解，充分吹打。立即用于逆转录。
(三)逆转录。采用Primer Script RT试剂盒进行逆转录制备cDNA。首先， 使用Nanodrop 2000进行RNA核酸浓度测定。在空的cDNA管中加入上样量 为500ngRNA的体积，再加入适量DEPC水至3.5μl。将0.5μl gDNAEraser和 1μl 5×gDNAEraser Buffer加入到RNA样品中，离心混匀后，将cDNA管放置 逆转录机中，执行程序24。反转录反应条件为：42℃反应2min，85℃反应5s。 反应完成后，取出cDNA管置于冰上并向管中加入0.5μl PrimeScripc RT enzfine 1、2μl 5×Prime Scripc Buffer 2、0.5μl RT Prime mix和2μlRNase Free H2O，离 心混匀后，将cDNA管放置逆转录机中，执行程序17。反转录反应条件为：：37℃ 反应15min，85℃反应5s。反应结束后，将得到的cDNA置于-80℃保存或稀 释10倍立即用于qPCR反应。
(四)PCR扩增反应。反应体系(10μl)组成为：1μl cDNA、3.4μl DEPC水、 0.2μl正引物、0.2μl反引物、0.2μl 50×ROX和5μl 2×SYBR Premix Taq。用配 套封口膜封住PCR板，离心。主要反应步骤和条件为：预变性阶段：95℃反 应2min；变性阶段：95℃反应15s；退火延伸阶段：60℃反应1min，在该阶 段收集荧光信号。整个反应过程进行40个循环，最终通过在55-95℃之间制备 的熔解曲线分析检查片段产物的特异性。由图可知，ASCs中miR-146a的下调 使得4种免疫调控基因COX-2、TSG-6、IL-1ra、IDO的表达均显著上调，，趋 化因子MCP-1的表达也得到上调(见图8)。ALP是成骨分化过程中早期的标志 因子，并且可以启动矿化过程及活性骨的形成。由图可知，ASCs中miR-146a 的下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因ALP的表达均显著上调(见图9)。RUNX2是三种哺乳动物RUNT同源区域转录因子基因之一，在骨 细胞中被视为特异性转录因子，在MSCs中被视为成骨分化过程中关键转录因 子之一，其表达对骨组织的形成和重建起着重要作用。由图可知，ASCs中 miR-146a的下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因RUNX2的表达 均显著上调(见图10)。COL-1是干细胞在成骨分化中期分泌的标志性物质之一， 同样也是骨基质中最主要的有机质组成部分。由图可知，ASCs中miR-146a的 下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因COL-1的表达均显著上调(见 图11)。骨桥蛋白(OPN)是成骨分化过程中后期的标志因子，并且可以促进骨 类似物钙结节的生成。由图可知，ASCs中miR-146a的下调使得ASCs在7天、 14天和21天成骨标记基因OPN的表达均显著上调(见图12)。
实施例7
对于判断miR-146a海绵对细胞成骨分化性能的影响，采用定量PCR反应对 细胞成骨相关基因进行测定，采用染色对细胞碱性磷酸酶活性和矿化基质进行 测定。
(一)碱性磷酸酶活性测定。在细胞培养14天后，弃去培养基，用PBS洗 两次后，用4％多聚甲醛室温下固定30分钟。弃去固定液，用PBS洗两次，每 孔加入300μlALP染液,室温孵育20分钟。弃去染色液，用超纯水浸洗数次直至 浮色除去，风干后用3D立体显微镜观察拍照。ALP染色根据反应过程中形成蓝 紫色的氮蓝四唑-甲瓒复合物作为定性判断依据，颜色越深说明细胞分泌的ALP 越多，成骨分化程度越高。由图可知，在基质成熟期(14天)miR-146a海绵组 蓝紫色染色区域面积更大、颜色更深，说明有更多的ALP蛋白分泌(见图13 和图14)。该结果与基因表达的检测结果有较好的一致性。
(二)矿化基质测定。采用茜素红染色对细胞成骨分化过程中产 生的矿化基质进行定性分析。称量0.576g茜素红S粉体，加入20-30 mL超纯水溶解粉末，其间用10％氨水调节pH值至4.2～6.4，后缓慢 涡旋加入超纯水至40mL，可得到浓度为0.5％左右的茜素红染液， 室温保存。在细胞培养14天取出培养孔板，弃去培养基，用PBS洗 两次后，每孔加入约500μL 4％多聚甲醛室温下固定30分钟。弃去 固定液，用超纯水洗两次，每孔加入约500μL浓度为0.5％茜素红染 色液，其间将孔板置于摇床上轻摇。15分钟后弃去染色液，用超纯水清洗数次直至所有浮色洗去。风干后置于倒置显微镜下观察并拍照。 茜素红可以与钙盐以鳌合的方式形成深红色复合物，从而作为ECM 中钙结节形成的定性评判标准。由图可知，在基质成熟阶段(14天)， N.C.miR组和miR-146a海绵组均观察到深红色的钙结节沉淀，而miR-146a海绵组形成的钙结节量较N.C.miR组要多(见图15)。这 一结果与基因表达的检测结果有较好的一致性，可证明miR-146a的 下调可以促进成骨分化过程及细胞外基质矿化过程。
统计学分析。数值以均值±标准差来表示，所有试验至少重复三次。 通过t检验进行相关性检验，P＜0.05，则认为有显著性差异。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacccatggagacagttctcacttcaacccatggagacagttctcacttcaacccatgga 60
gacagttctcacttcaacccatggagacagttctcacttcaacccatggagacagttctc 120
acttcaacccatggagacagttctcacttc 150

Claims (10)

1.一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤：
（1）miR-146a海绵的设计：按照碱基互补配对原则，设计miR-146a-5p的反义序列，然后把所得反义序列的11～14 位对应的碱基突变为“GAC”，再在两个突变后的反义序列之间加入“CTTC”连接序列，最终构成6个拷贝的海绵构件，即miR-146a海绵，该miR-146a海绵的核苷酸序列如Seq1所示；
（2）构建携带miR-146a海绵的重组质粒，然后采用三质粒共转染包装细胞获取慢病毒保存液；
（3）慢病毒转染脂肪间充质干细胞：用完全培养基制备脂肪间充质干细胞悬液，然后接种培养；采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释；吸掉培养液中的上清液，再更换培养基，加入miR-146a sponge病毒稀释液，培养后进行细胞筛选，得到基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞；所述培养基为完全培养基、含聚凝胺的完全培养基、Eni.S.溶液、含聚凝胺的Eni.S.溶液中的一种以上。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述携带miR-146a海绵的重组质粒包括miR-146a海绵基因序列、泛素基因序列、绿色荧光蛋白基因序列和嘌呤霉素基因序列。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装；所述包装细胞为293T细胞。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述三个质粒分别为携带miR-146a海绵的重组质粒、辅助质粒Helper 1.0和 Helper 2.0载体。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述脂肪间充质干细胞悬液的密度为（6-10）×104 cells/ml。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述接种培养是接种培养直至脂肪间充质干细胞汇合度达到30%。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述培养是置于CO2浓度为5 %、湿度为 95 %、温度为37 ℃的培养箱中培养。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中更换培养基后使聚凝胺的最终浓度保持为5μg/ml。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中加入病毒稀释液的体积应该保持复感染指数MOI值为50，其中病毒稀释液体积=（MOI×细胞数目）/病毒滴度。
10.由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞。
CN201810278578.1A 2018-03-31 2018-03-31 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法 Pending CN108441518A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810278578.1A CN108441518A (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810278578.1A CN108441518A (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108441518A true CN108441518A (zh) 2018-08-24

Family

ID=63197859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810278578.1A Pending CN108441518A (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108441518A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109295058A (zh) * 2018-09-10 2019-02-01 深圳市龙华区中心医院 抑制miR-34家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978396A (zh) * 2017-05-26 2017-07-25 黎洪棉 一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978396A (zh) * 2017-05-26 2017-07-25 黎洪棉 一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIOLA MATYSIAK: "MicroRNA-146a Negatively Regulates the Immunoregulatory Activity of Bone Marrow Stem Cells by Targeting Prostaglandin E2 Synthase-2", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
WEI KUANG, ET AL.: "Dysregulation of the miR-146a-Smad4 axis impairs osteogenesis of bone mesenchymal stem cells under inflammation", 《BONE RESEARCH》 *
周琪: "《生物学实验指南丛书 干细胞实验指南》", 31 July 2015 *
杨威利: "miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达", 《天津医药》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109295058A (zh) * 2018-09-10 2019-02-01 深圳市龙华区中心医院 抑制miR-34家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107893076A (zh) CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA
CN104603267B (zh) 高产量地分离包括小rna的rna的方法
CN108721319B (zh) 抑制circ_CLASP2的试剂在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用及制剂
CN111454953B (zh) 一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂
CN108342362A (zh) 一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法
CN110551689B (zh) 一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用
CN107663539A (zh) 环状RNA circ‑PTGR1的用途
CN111154713B (zh) 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用
CN105950656A (zh) 一种快速获得基因敲除细胞株的方法
CN104726500A (zh) MicroRNA26b-3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用
CN108441518A (zh) 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法
CN105624162B (zh) 针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
CN104805122A (zh) Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法
CN108913695B (zh) Zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用
CN106947808B (zh) Tmem104基因在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用
CN107683335A (zh) 用于核酸分离的自动化方法
CN106811484B (zh) 一种牛pdhb基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法
CN106191058B (zh) 一种白血病相关的环状circRNA-011235基因及其用途
CN109971759B (zh) circ_ADARB1及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂
CN109652556B (zh) circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂
Choy et al. Deciphering noncoding RNA and chromatin interactions: multiplex chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (mChIA-PET)
CN112481218A (zh) 基于CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除猪miR-155基因的细胞系及构建方法
CN102181439A (zh) 细胞周期s期报告基因
CN101857902A (zh) 一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法
CN105002217A (zh) 用于制备永生化细胞的转座子载体、系统及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180824