CN108441518A - 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于miR‑146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法。通过设计一种针对miRNA‑146a的海绵,这种海绵可以通过碱基互补配对反应在转录水平上实现对整个miR‑146a家族的长效抑制;通过对GV369载体的包装,获得带有miR‑146a海绵的高度纯化的慢病毒颗粒,将病毒转染至ASCs中,从而下调细胞整个miR‑146a家族的水平,最终对转染了miR‑146a海绵的ASCs中miR‑146a的表达水平进行了检测。该方法显著提高了ASCs的免疫抑制和成骨分化性能,且所制备的目的细胞具有正常的增殖能力。
Description
技术领域
本发明属于脂肪间充质干细胞领域,具体涉及一种基于miR-146a海绵的脂 肪间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
miRNA通过沉默RNA和转录后调节基因的表达,参与着生物体的生长发 育、组织生成、各项细胞活动及多种疾病的发生等重要过程,在基因表达调控 方面已成为决定性的调控因素之一。值得一提的是,一个特定的miRNA可能具 有数百个不同的mRNA靶标,而一个特定的mRNA靶标也可能受多个miRNA 的调控。
miRNA-146是一个典型的多功能基因,参与着众多生理、病理进程如炎性 反应的发生,也是首个被发现在免疫系统中具有免疫调节作用的miRNA。已有 研究发现miR-146a可以与BM-MSCs中COX-2的3’端靶向结合,进而抑制 COX-2的翻译,最终导致PGE2的分泌降低。miR-146a也参与软骨细胞的凋亡 进程,有研究也发现miR-146a可以负向调控Smad4基因的表达促进软骨细胞凋 亡和负向调控Smad2和Smad3基因的表达促进人胎儿股骨来源的骨干细胞成 骨分化。
目前对miRNA的研究方法主要是化学修饰的反义寡核苷酸、基因敲除和海 绵。其中,由于海绵能够有效地阻断具有共同种子区的miRNA家族且能够在宿 主细胞中长期稳定表达,其抑制效果甚至优于广泛使用的反义寡核苷酸抑制剂。
在组织修复过程中,过度的炎症反应是一个亟待解决的问题。间充质干细 胞(MSCs)因具有较强的自我更新能力及多向分化潜能在组织工程中备受关注。 近年来,MSCs的免疫抑制性能引起了研究者们的关注,尤其是免疫调控因子的 分泌使其具有免疫抑制性能,从而调控先天性和适应性免疫反应,最终避免持 续性炎性反应的发生。
现在使用较多的骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)由于来源较少、提取和分 离过程复杂等原因,使其发展和应用受到限制。自2001年Zuk博士等从吸脂术 抽出的脂肪组织中发现并成功提取出间充质干细胞之后,近年来ASCs(脂肪来 源间充质干细胞)的提取方法已经非常成熟,这为人们对干细胞的研究带来了 新的思路。相比于BMSCs,ASCs具有提取方便、分化潜力高、表达更丰富的 免疫调节因子等优点。
基于已有研究结果,我们考虑是否能通过调节miR-146a来调控ASCs的免 疫抑制和成骨分化性能,我们有希望给组织工程带来更好的种子细胞,以达到 更好的组织修复效果,这具有十分重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制 备方法,该基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞能提高人源ASCs免疫抑制 和成骨分化性能。
一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)miR-146a海绵的设计:按照碱基互补配对原则,设计miR-146a-5p的 反义序列,然后把所得反义序列的11~14位对应的碱基突变为“GAC”,再在 两个突变后的反义序列之间加入“CTTC”连接序列,最终构成6个拷贝的海绵 构件,即miR-146a海绵,该miR-146a海绵的核苷酸序列如Seq1所示;
(2)构建携带miR-146a海绵的重组质粒,然后采用三质粒共转染包装细 胞获取慢病毒保存液;
(3)慢病毒转染脂肪间充质干细胞:用完全培养基制备脂肪间充质干细胞 悬液,然后接种培养直至细胞汇合度达到30%(对于T25瓶,接种细胞数量为 30-50万);采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释;吸掉培养液中的上清液,再 更换培养基,加入miR-146asponge病毒稀释液,培养后进行细胞筛选,得基于 miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞;所述培养基为完全培养基、含聚凝胺的完 全培养基、Eni.S.溶液、含聚凝胺的Eni.S.溶液中的一种以上。
优选的,步骤(2)所述携带miR-146a海绵的重组质粒包括miR-146a海绵 基因序列、泛素基因序列、绿色荧光蛋白基因序列和嘌呤霉素基因序列。
优选的,步骤(2)中选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装。
优选的,步骤(2)所述三个质粒分别为携带miR-146a海绵的重组质粒、 辅助质粒Helper 1.0和Helper 2.0载体。
优选的,步骤(2)所述包装细胞为293T细胞。
优选的,步骤(3)所述脂肪间充质干细胞悬液的密度为(3-5)×104cells/ml。
优选的,步骤(3)所述培养的温度为CO2浓度为5%、湿度为95%、温 度为37℃的培养箱。
优选的,步骤(3)中更换培养基后使聚凝胺的最终浓度保持为5μg/ml。
优选的,步骤(3)中加入病毒稀释液的体积应该保持复感染指数(MOI值) 为50,病毒稀释液体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。
由以上所述的制备方法制得的一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞。
本发明中的miR-146a海绵可以长效降低细胞质中游离miR-146a家族水平。 其中,该miR-146a海绵发挥抑制细胞质中游离miR-146a家族水平的功能要借 助慢病毒作为载体递送至细胞中实现。能使ASCs中免疫调节因子和趋化因子表 达上调,使ASCs中成骨分化性能得到上调。所述的ASCs是指人源ASCs。
本发明构造了一种针对miRNA-146a的海绵作为细胞中miRNA-146a家族的 抑制剂,该抑制剂可通过碱基互补配对结合细胞质中游离的miR-146a,从而在 转录水平上实现对整个miR-146a家族的长效抑制。其制备的具有优异的生物学 性能的目的细胞是由海绵介导慢病毒转染的手段所得。慢病毒作为递送海绵序 列的载体使得转染效率高且外源靶基因长期稳定表达在宿主细胞中。携带 miRNA-146a海绵的工具载体质粒包括6个串联的目的基因序列(miR-146a海 绵),荧光蛋白基因序列以及抗性基因序列。目的基因序列用于降低细胞质中游 离的miR-146a家族水平,荧光蛋白基因序列用于定性和定量检测转染效率,抗 性基因序列用于筛选阳性细胞。制备的目的细胞具有优异的免疫抑制和成骨分 化性能的ASCs。
本发明首先用基因工程的方法构建了载有micro RNA-146a海绵的慢病毒, 用慢病毒转染ASCs,使ASCs中的micro RNA-146a下调,进一步通过qRT-PCR 等方法检测了microRNA-146a表达水平下调之后的脂肪干细胞中的基因表达情 况。结果表明免疫调控相关基因显著上调,说明miR-146a的下调提高ASCs免 疫抑制性能。此外micro RNA-146a表达水平下调使得ASCs成骨分化性能也发 生了显著变化,进一步证实了miR-146a在调节ASCs成骨分化性能中的作用。 通过调节miR-146a的水平来提高ASCs的免疫调控和成骨分化性能,可以为组 织工程提供更好的种子细胞,有望更好地实现组织修复。
与现有技术相比,本发明具有如下的优点:
1、相较于目前常用的骨髓间充质干细胞,本发明使用的脂肪间充质干细胞 具有提取简单、来源充足、干性强、表达更丰富的免疫调节因子等优点,成为 组织工程中最受欢迎的种子细胞之一。
2、本发明基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞具有优异的免疫抑制和 成骨分化性能,且具有正常的增殖能力,对于骨组织修复和再生具有重要的意 义。
3、本发明采用海绵能够有效下调具有共同种子区的miRNA家族的表达。 同时,海绵的表达可以长期有效地下调特定miRNA的表达,其下调效果优于之 前广泛使用的反义寡核苷酸抑制剂。
附图说明
图1为携带miR-146a海绵的重组质粒的结构图。
图2为N.C.miR组ASCs转染荧光图。
图3为miR-146a海绵组ASCs转染荧光图。
图4为转染效率图。
图5为相对的miR-146a表达水平图。
图6为细胞活性图。
图7为ASCs免疫相关基因表达检测图。
图8为ASCs成骨标记基因ALP的表达检测图。
图9为ASCs成骨标记基因RUNX2的表达检测图。
图10为ASCs成骨标记基因COL-1的表达检测图。
图11为ASCs成骨标记基因OPN的表达检测图。
图12为N.C.miR组ASCs在培养14天后ALP染色图片。
图13为miR-146a海绵组ASCs在培养14天后ALP染色图片。
图14为N.C.miR组ASCs在培养14天后茜素红染色图片。
图15为miR-146a海绵组ASCs在培养14天后茜素红染色图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法,按照试剂生产厂家的操作规范执行。
实施例1
miR-146a海绵的设计。采用靶基因拟似物过表达策略,针对miRBASE上 人miR-146a-5p序列。首先,按照碱基互补配对原则,设计针对miR-146a-5p的 反义序列(miR-146a-5p-SP-unit),然后把反义序列的11~14位对应的碱基突变 为“GAC”以增强两个突变后的反义序列的结合稳定性,再在两个突变后的反 义序列之间加入“CTTC”连接序列,最终构成6个拷贝的海绵构件(miR-146a-5p Sponges),即miR-146a海绵(核苷酸序列如Seq1所示)。再在该海绵构件的上 下游设计EcoRⅠ酶切位点,以便进行重组质粒的构建。
携带miR-146a海绵的重组质粒的构建。通过限制性核酸内切酶消化GV369 质粒,得到线性化的GV369质粒载体。通过PCR技术扩增目的基因(miR-146a 海绵)。在设计引物时,需要在两端添加同源重组序列,这样PCR扩增产物的5’ 和3’最末端的序列就会与线性化克隆载体(GV369质粒载体)两端的序列完 全一致。配制反应体系,使线性化载体和目的扩增产物进行重组,重组产物直 接转化,最后进行PCR鉴定,并将PCR序列正确的菌液扩大培养,并进行携带 目的基因质粒(GV 369)抽提,用于后续实验,得携带miR-146a海绵的重组质粒。 该重组质粒除了miR-146a海绵外,还包括Ubiquitin(泛素),用于过表达的启 动子;EGFP(绿色荧光蛋白),用于确认转染效率;Puromycin(嘌呤霉素),用 于阳性细胞的筛选(见图2)。
慢病毒构建与包装,采用三质粒共转染包装细胞293T细胞获取病毒颗粒。 选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装,其中包含三个质粒,分别为 携带目的基因或靶点序列的目的质粒(携带miR-146a海绵的重组质粒)、辅助质 粒Helper 1.0和Helper 2.0载体。采用以上三种质粒共转染293T细胞,在转染 完成后的48-72小时进行病毒收获(即未纯化的细胞上清液)。最后离心浓缩得 到高滴度的慢病毒保存液。
实施例2
慢病毒转染脂肪干细胞,将转染分为两步,包括转染预实验和正式转染, 预实验用于摸索转染的最佳条件,为正式转染做准备。
(一)转染预实验:用完全培养基制备密度为6-10×104cells/ml的人源脂肪 间充质干细胞悬液(将人源脂肪间充质干细胞培养于添加1vol%青霉素-链霉素、 1vol%谷氨酰胺及10vol%FBS的基础培养基中,放置于CO2浓度为5vol%、 湿度为95%、温度为37℃的培养箱中培养。待细胞融合度为80%时进行消化 传代。放置在CO2浓度为5vol%、湿度为95%、温度为37℃的培养箱中扩增, 采用代数5代之前的细胞进行后续实验),取100μl/well接种到96孔板中,共 16个孔。放置于CO2浓度为5vol%、湿度为95%、温度为37℃的培养箱中培 养一天后,此时细胞汇合度达30%。采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释滴度为MOI=10、20、50、100四种滴度。配制含50μg/ml Polybrene(聚凝胺)的完 全培养基P(M)、含50μg/ml Polybrene的Eni.S.溶液P(E)。吸掉96孔板中的上 清液,按照下表1加入相应体积的溶液,放回培养箱继续培养。当感染8-12小 时后换回完全培养基,过程中观察细胞形态,形态发生变化时可以提前到8小 时换液,保持细胞正常生长。继续培养,中途可根据细胞的生长状况进行换液, 保持细胞活性。感染72小时后,用倒置荧光显微镜观察荧光表达丰度。感染细 胞数占总细胞数的80%以上,且细胞生长不受影响的组所对应的感染条件可以 用于后续正式感染。根据细胞形态且转染效率为依据,采用MOI=50,P(M)=5 μg/ml的条件进行后续的正式转染实验。
表1
表1中M为完全培养基;P(M)为含50μg/ml Polybrene的完全培养基;Eni.S 为Eni.S.溶液;P(E)为含50μg/ml Polybrene的Eni.S.溶液;Virus为慢病毒稀释 液。
(二)正式转染:以5×104cells/ml的接种密度将人源脂肪间充质干细胞接 种到T25培养瓶中,保证一天后细胞汇合度达到30%。细胞培养一天后,按照 预实验条件,更换培养基,加入2.2ml完全培养基,250μl含50μg/ml Polybrene 的完全培养基P(M),加入使得MOI为50的N.C.miR病毒稀释液或miR-146a sponge病毒稀释液相应体积,其中,病毒稀释液体积=(MOI×细胞数目)/病毒 滴度,使Polybrene最终浓度为5μg/ml。最后,按照预实验的换液时间,更换为 完全培养基,继续培养,根据细胞生长状况适时换液,培养到第五天,在荧光 显微镜下观察感染效果,并加入浓度为5μl/ml的puromycin进行细胞筛选,收 获成功转染的细胞(miR-146a海绵组ASCs),为后面实验做准备。
实施例3
对于判断慢病毒转染效率,通过倒置荧光显微镜观察荧光表达丰度,用于 定性判断转染效率。本实施例所得N.C.miR组和miR-146a海绵组ASCs的转染 荧光图,由图可知大部分细胞都成功转染了对照海绵和miR-146a海绵且获得对 嘌呤霉素的抗性(见图3和图4)。通用流式细胞仪用于定量判断转染效率。具 体步骤如下:消化转染的脂肪间充质干细胞,离心,并收集在1ml离心管中。 用1×PBS洗涤以清除培养基,用4wt%多聚甲醛固定半小时,1×PBS洗涤,2wt% BSA封闭半小时,1×PBS洗涤,以上步骤用1×PBS洗涤后要吹打并离心,离心 速度为2000rpm,时间为5分钟。用1×PBS重悬细胞,重悬后细胞密度大约是103cells/μl,向加入96孔板中加入200μl进行流式分析。其中,本实验有三个组, 分别为未转染细胞(Mock)、转染N.C.miR细胞(N.C.miR组)和转染miR-146a 海绵细胞(miR-146asponge)。本实施例所得N.C.miR组和miR-146a海绵组的 转染效率图,由图可知两组细胞的转染效率分别为85.95%和85.96%(见图5)。 定性和定量结果证实通过慢病毒可以高效地将对照海绵和miR-146a海绵转染进 入细胞质中。
实施例4
对于验证miR-146a的表达采用定量PCR反应进行检测分析。N.C.miR细 胞和miR-146a细胞以10×104/well的密度接种量接种于24孔板中。培养2天后 提取总RNA并进行逆转录与定量PCR反应。
(一)引物的设计和合成。
(二)总RNA抽提与纯化。收集细胞,并用1×PBS洗涤,每孔加入1ml Trizol 溶液,吸抽几次使细胞充分裂解,将细胞和Trizol的混合液移入1ml EP管,静 置5min。每个EP管中加入200μl氯仿,用力上下振荡30s,使水相和有机相 充分接触,室温静置2min,出现分层。4℃下,1.4×104g离心15min,可见溶 液分为三层,RNA位于上层水相,吸取上层清液,移至另一个新的1ml EP管。 加入等体积的异丙醇,轻柔地充分混匀,室温静置10min。4℃下,1.4×104g 离心10min,RNA沉淀在EP管底部侧壁,去上清。加入75%乙醇洗涤,离心, 重复一次洗涤过程,风干。加入DEPC水,吹打多次直至沉淀溶解。总RNA纯 度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测 定仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无 蛋白质污染。总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20 min,用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA三个条 带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
(三)逆转录。在去RNase的PCR管中加入1μl的RNA,加入DEPC水 使得总体积为12μl,将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以打开RNA二级结构, 随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构。在另一去RNase的 PCR管中加入2μl 10mM dNTP、0.5μl RNaseinhibitor、0.5μl miR-146逆转录 引物、0.5μl U6逆转录引物、4μl 5×buffer和0.5μl M-MLV溶液。将上述配制 溶液与RNA混匀后42℃孵育60min,85℃孵育10min灭活逆转录酶。反应 结束后得到的cDNA放置于-80℃保存或稀释20倍后立即用于PCR反应。
(四)定量PCR。反应体系(20μl)组成为:5μl cDNA、0.5μl正引物、 0.5μl反引物、10μl 2×SYBR Green qPCR SuperMix和4μl dH2O。主要反应步骤 和条件为:50℃反应2min;预变性阶段:95℃反应2min;变性阶段:95℃ 反应15s;退火延伸阶段:60℃反应32s,在该阶段收集荧光信号。整个反应 过程进行40个循环,最终通过在60-95℃之间制备的熔解曲线分析检查片段产 物的特异性。利用qPCR技术分析miR-146a的表达水平,由图可知miR-146a海绵成功地下调了ASCs中miR-146a的表达(见图6)。
实施例5
对于判断miR-146a海绵对细胞活性及增殖情况的影响,采用细胞计数试剂 盒8(Cell Counting Kit-8,以下简称CCK-8)进行检测。N.C.miR细胞和miR-146a 细胞按5000每孔的接种量接种于48孔板中,取1、3、5、7四个时间节点的检 查细胞增殖情况。CCK-8法检测细胞增殖的基本操作流程如下:取CCK-8母 液按母液和完全培养基以1:10配制工作液。将孔板内培养基吸出,用无菌 1×PBS润洗两次,向每孔分别加入200μl的工作液,包裹上铝箔纸放回二氧化 碳培养箱中避光孵育60分钟。吸取100μl上清液转移到新的96孔板中,使用 多功能酶标仪读取450nm波长处的吸光值。由图可知,miR-146a Sponge组的O.D值与N.C.miR组的O.D值之间无明显差异,说明下调miR-146a的表达对细 胞增殖无明显影响(见图7)。
实施例6
对于判断miR-146a海绵对细胞免疫抑制和成骨分化性能的影响,采用定量 PCR反应对细胞免疫相关基因和成骨标记基因的表达进行检测分析。N.C.miR 处理的ASCs和miR-146a海绵处理的ASCs以10×104/wells的细胞密度接种于 24孔板中。培养2天、7天、14天和21天后提取总RNA并进行逆转录与定量 PCR反应。
(一)引物的设计和合成。
(二)RNA提取与纯化
使用PBS缓冲液润洗ASCs细胞,每孔加入1ml的Trizol试剂后静置, 放入-80℃冰箱中保存。将冻存起来的样品放到室温环境中解冻,大约10分钟 后反复吹打十次以上,转移到RNase free 1.5ml EP管中。加入200μl三氯甲烷, 剧烈震荡(上下颠倒)15秒,使氯仿充分混匀后静置10分钟,观察到EP管中 液体开始出现分层;将EP管置于4℃离心机中以转速为12000rpm离心15分 钟;观察到分层现象更加明显,取新的EP管,将上清液小心转至EP管中;加 入500μl异丙醇,混匀,并于冰上静置10分钟;将EP管置于4℃离心机中以 转速为12000rpm离心10分钟;离心后,观察到EP管底部有白色胶状沉淀物 质,即为提取的RNA,弃去上清液,向EP管中加入1ml DEPC水配制的浓度 为75%的乙醇;离心,将EP管置于4℃离心机中以转速为7500rpm离心5分 钟,重复此过程1次;弃去上清液,再加入1ml 100%乙醇,将EP管置于4℃ 离心机中以转速为7500rpm离心5分钟。干燥沉淀,加入10μl DEPC水溶液, 溶解,充分吹打。立即用于逆转录。
(三)逆转录。采用Primer Script RT试剂盒进行逆转录制备cDNA。首先, 使用Nanodrop 2000进行RNA核酸浓度测定。在空的cDNA管中加入上样量 为500ngRNA的体积,再加入适量DEPC水至3.5μl。将0.5μl gDNAEraser和 1μl 5×gDNAEraser Buffer加入到RNA样品中,离心混匀后,将cDNA管放置 逆转录机中,执行程序24。反转录反应条件为:42℃反应2min,85℃反应5s。 反应完成后,取出cDNA管置于冰上并向管中加入0.5μl PrimeScripc RT enzfine 1、2μl 5×Prime Scripc Buffer 2、0.5μl RT Prime mix和2μlRNase Free H2O,离 心混匀后,将cDNA管放置逆转录机中,执行程序17。反转录反应条件为::37℃ 反应15min,85℃反应5s。反应结束后,将得到的cDNA置于-80℃保存或稀 释10倍立即用于qPCR反应。
(四)PCR扩增反应。反应体系(10μl)组成为:1μl cDNA、3.4μl DEPC水、 0.2μl正引物、0.2μl反引物、0.2μl 50×ROX和5μl 2×SYBR Premix Taq。用配 套封口膜封住PCR板,离心。主要反应步骤和条件为:预变性阶段:95℃反 应2min;变性阶段:95℃反应15s;退火延伸阶段:60℃反应1min,在该阶 段收集荧光信号。整个反应过程进行40个循环,最终通过在55-95℃之间制备 的熔解曲线分析检查片段产物的特异性。由图可知,ASCs中miR-146a的下调 使得4种免疫调控基因COX-2、TSG-6、IL-1ra、IDO的表达均显著上调,,趋 化因子MCP-1的表达也得到上调(见图8)。ALP是成骨分化过程中早期的标志 因子,并且可以启动矿化过程及活性骨的形成。由图可知,ASCs中miR-146a 的下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因ALP的表达均显著上调(见图9)。RUNX2是三种哺乳动物RUNT同源区域转录因子基因之一,在骨 细胞中被视为特异性转录因子,在MSCs中被视为成骨分化过程中关键转录因 子之一,其表达对骨组织的形成和重建起着重要作用。由图可知,ASCs中 miR-146a的下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因RUNX2的表达 均显著上调(见图10)。COL-1是干细胞在成骨分化中期分泌的标志性物质之一, 同样也是骨基质中最主要的有机质组成部分。由图可知,ASCs中miR-146a的 下调使得ASCs在7天、14天和21天成骨标记基因COL-1的表达均显著上调(见 图11)。骨桥蛋白(OPN)是成骨分化过程中后期的标志因子,并且可以促进骨 类似物钙结节的生成。由图可知,ASCs中miR-146a的下调使得ASCs在7天、 14天和21天成骨标记基因OPN的表达均显著上调(见图12)。
实施例7
对于判断miR-146a海绵对细胞成骨分化性能的影响,采用定量PCR反应对 细胞成骨相关基因进行测定,采用染色对细胞碱性磷酸酶活性和矿化基质进行 测定。
(一)碱性磷酸酶活性测定。在细胞培养14天后,弃去培养基,用PBS洗 两次后,用4%多聚甲醛室温下固定30分钟。弃去固定液,用PBS洗两次,每 孔加入300μlALP染液,室温孵育20分钟。弃去染色液,用超纯水浸洗数次直至 浮色除去,风干后用3D立体显微镜观察拍照。ALP染色根据反应过程中形成蓝 紫色的氮蓝四唑-甲瓒复合物作为定性判断依据,颜色越深说明细胞分泌的ALP 越多,成骨分化程度越高。由图可知,在基质成熟期(14天)miR-146a海绵组 蓝紫色染色区域面积更大、颜色更深,说明有更多的ALP蛋白分泌(见图13 和图14)。该结果与基因表达的检测结果有较好的一致性。
(二)矿化基质测定。采用茜素红染色对细胞成骨分化过程中产 生的矿化基质进行定性分析。称量0.576g茜素红S粉体,加入20-30 mL超纯水溶解粉末,其间用10%氨水调节pH值至4.2~6.4,后缓慢 涡旋加入超纯水至40mL,可得到浓度为0.5%左右的茜素红染液, 室温保存。在细胞培养14天取出培养孔板,弃去培养基,用PBS洗 两次后,每孔加入约500μL 4%多聚甲醛室温下固定30分钟。弃去 固定液,用超纯水洗两次,每孔加入约500μL浓度为0.5%茜素红染 色液,其间将孔板置于摇床上轻摇。15分钟后弃去染色液,用超纯水清洗数次直至所有浮色洗去。风干后置于倒置显微镜下观察并拍照。 茜素红可以与钙盐以鳌合的方式形成深红色复合物,从而作为ECM 中钙结节形成的定性评判标准。由图可知,在基质成熟阶段(14天), N.C.miR组和miR-146a海绵组均观察到深红色的钙结节沉淀,而miR-146a海绵组形成的钙结节量较N.C.miR组要多(见图15)。这 一结果与基因表达的检测结果有较好的一致性,可证明miR-146a的 下调可以促进成骨分化过程及细胞外基质矿化过程。
统计学分析。数值以均值±标准差来表示,所有试验至少重复三次。 通过t检验进行相关性检验,P<0.05,则认为有显著性差异。
应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacccatggagacagttctcacttcaacccatggagacagttctcacttcaacccatgga 60
gacagttctcacttcaacccatggagacagttctcacttcaacccatggagacagttctc 120
acttcaacccatggagacagttctcacttc 150
Claims (10)
1.一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞的制备方法,其特征在于, 包括以下步骤:
(1)miR-146a海绵的设计:按照碱基互补配对原则,设计miR-146a-5p的反义序列,然后把所得反义序列的11~14 位对应的碱基突变为“GAC”,再在两个突变后的反义序列之间加入“CTTC”连接序列,最终构成6个拷贝的海绵构件,即miR-146a海绵,该miR-146a海绵的核苷酸序列如Seq1所示;
(2)构建携带miR-146a海绵的重组质粒,然后采用三质粒共转染包装细胞获取慢病毒保存液;
(3)慢病毒转染脂肪间充质干细胞:用完全培养基制备脂肪间充质干细胞悬液,然后接种培养;采用梯度稀释法将慢病毒保存液稀释;吸掉培养液中的上清液,再更换培养基,加入miR-146a sponge病毒稀释液,培养后进行细胞筛选,得到基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞;所述培养基为完全培养基、含聚凝胺的完全培养基、Eni.S.溶液、含聚凝胺的Eni.S.溶液中的一种以上。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述携带miR-146a海绵的重组质粒包括miR-146a海绵基因序列、泛素基因序列、绿色荧光蛋白基因序列和嘌呤霉素基因序列。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中选取二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装;所述包装细胞为293T细胞。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述三个质粒分别为携带miR-146a海绵的重组质粒、辅助质粒Helper 1.0和 Helper 2.0载体。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述脂肪间充质干细胞悬液的密度为(6-10)×104 cells/ml。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述接种培养是接种培养直至脂肪间充质干细胞汇合度达到30%。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述培养是置于CO2浓度为5 %、湿度为 95 %、温度为37 ℃的培养箱中培养。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中更换培养基后使聚凝胺的最终浓度保持为5μg/ml。
9.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中加入病毒稀释液的体积应该保持复感染指数MOI值为50,其中病毒稀释液体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。
10.由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的一种基于miR-146a海绵的脂肪间充质干细胞。
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
CN106978396A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-07-25 | 黎洪棉 | 一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法 |
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Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MARIOLA MATYSIAK: "MicroRNA-146a Negatively Regulates the Immunoregulatory Activity of Bone Marrow Stem Cells by Targeting Prostaglandin E2 Synthase-2", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
WEI KUANG, ET AL.: "Dysregulation of the miR-146a-Smad4 axis impairs osteogenesis of bone mesenchymal stem cells under inflammation", 《BONE RESEARCH》 * |
周琪: "《生物学实验指南丛书 干细胞实验指南》", 31 July 2015 * |
杨威利: "miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达", 《天津医药》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109295058A (zh) * | 2018-09-10 | 2019-02-01 | 深圳市龙华区中心医院 | 抑制miR-34家族分子的microRNA海绵、核酸构建体及应用 |
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