CN101857902A - 一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法，其包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3：pDsRed1-C1-LPL载体的构建；A4：shRNA有效序列的筛选；由于采用红光和绿光两种不同荧光分别标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以同时筛选多条序列。

Description

一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法。

背景技术

RNA干扰是通过双链RNA(dsRNA)介导的遗传干涉现象，它能够特异、有效地降解mRNA，从而引起基因的沉默。自2001年《Nature》杂志上首次报道在哺乳动物细胞中通过siRNA成功诱导了靶基因的特异性表达沉默后，RNA干扰技术就开始作为一项特异性基因沉默工具在哺乳动物细胞上广泛应用。2003年Rubinson等报道用病毒系统在原代培养的细胞、干细胞及转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。目前，RNAi已发展成为调控生物基因表达的遗传学工具，广泛应用于功能依赖性遗传筛选、基因功能研究等后基因组计划研究中，并有望成为潜在的基因治疗工具。

调控脂质代谢的酶有很多种，其中脂蛋白脂酶是关键酶之一。脂蛋白脂酶(Lipoprotein Lipase，LPL，EC 3.1.1.34)是由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞和巨噬细胞等实质细胞合成和分泌的一种酰基甘油水解酶，广泛分布于脂肪、肌肉、心脏、肺、乳腺、脑、胎盘和肾脏等组织，其中在脂肪组织和骨骼肌中含量较高，但是在肝脏不表达。LPL合成后在肝素作用下释放进入血液循环，在毛细血管内皮的腔表面与载脂蛋白结合发挥作用，能催化水解极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中的甘油三酯(TG)，生成小分子量的脂肪酸和单酰甘油，以供各种组织贮存和利用。

在动物细胞中应用RNA干扰技术的另一关键在于有效siRNA序列的筛选。但是截至目前，筛选有效的RNAi的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法。

本发明的方法包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；根据GenBank公布的西农萨能羊LPL序列，设计三条LPL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔，使单链DNA寡核苷酸内部形成发夹结构，每对单链DNA寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA的正、反义链模板；

A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建：A21：单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链DNA寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火条件是：95℃×4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列，分别标记为：ds435、ds876、ds1150；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22：构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切pENTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds435、所述ds876和所述ds1150分别与pENTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4℃连接过夜，得到连接产物；A23：连接产物转化；取10μL所述连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，置冰浴12分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育；A24：筛选穿梭载体克隆；

A3：pDsRed1-C1-LPL载体的构建：A31：构建pDsRed1-C1-LPL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM-T载体连接，16℃恒温过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取10μL反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pGM-T-LPL，10.0μL；ddH2O，6.6μL；总体积20.0μL；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段；A32：构建pDsRed1-C1-LPL表达载体；

A4：shRNA有效序列的筛选：A41：去内毒素质粒提取；A42：细胞的复苏；A43细胞传代培养：A44：细胞转染。

所述的方法，所述连接反应体系为如下：pENTR/U6，2μL；ds oligos，5nM，1μL；5×退火缓冲液，4μL；T4DNA连接酶，1μL；不含DNase/Rnase的水，12μL；总体积20.0μL

所述的方法，所述步骤A24具体执行以下操作：(1)穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定：ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体pENTR/U6的黏性末端互补，经连接反应后，形成环形质粒；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于4mL的含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时，取菌液2mL提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产物以1.2％的琼脂糖凝胶电泳观察；(2)穿梭载体克隆的测序鉴定：取(1)中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送测序公司以ABI 377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物U6或M13。

所述的方法，所述步骤A32具体执行以下操作：(1)配制pDsRed1-C1酶切反应体系并进行37℃水浴反应过夜；(2)酶切反应结束后，取全部反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收pDsRed1-C1载体酶切后的线性化片段；(3)将载体片段与目的基因片段连接，16℃反应过夜；(4)将pDsRed1-C1-LPL转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。

所述的方法，所述酶切反应体系为：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pDsRed1-C1-LPL，5.0μL；ddH2O，11.6μL；总体积20.0μL。

所述的方法，所述步骤A41具体执行以下操作：(1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm，13400×g离心1分钟，吸除上清液；(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL已加入RNa seA的溶液P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；(4)向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；(5)向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀，12000rpm、13400×g离心10分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)将(5)中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm、13400×g离心2分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7)12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μl去蛋白液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(9)按照3倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入700μL所述漂洗液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液；(11)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm、13400×g离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除；(12)将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm、13400×g离心1分钟后将质粒溶液收集到离心管中。

所述的方法，所述步骤A42具体执行以下操作：(1)从液氮罐中取出1支冻存的HEK293细胞，立即放入38℃水浴锅中，至细胞完全融化；(2)将冻存管内容物转入10mL离心管中，加入4mL含10％FBS的DMEM，洗脱冻存时加入的DMSO；(3)1400rpm，离心8分钟，弃掉上清液；(4)加入2mL含10％FBS的DMEM，吹匀，转移入塑料培养瓶中，在所述离心管中再次加入2mL含10％FBS的DMEM，吹匀，将残余细胞转入所述塑料培养瓶中；(5)拧松培养瓶瓶盖，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

所述的方法，所述步骤A43具体执行以下操作：(1)将培养瓶内培养基吸弃，加入1mL培养基清洗后吸弃，以除去血清；(2)加入1mL 0.25％的ATV，置于镜下观察，当细胞饱满后吸弃ATV；(3)加入2mL含10％FBS的DMEM，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，将细胞悬液分装至2-3个新培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养。

所述的方法，所述步骤A44具体执行以下操作：将低血清Opti-MEM培养液及Li pofectamine 2000于室温条件下平衡；按2∶1比例将Lipofectamine 2000及质粒分别加入250μL低血清Opt i-MEM中，轻弹管壁使混匀，室温静置5min，将质粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入Lipofectamine 2000低血清Opti-MEM混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育20min；将转染复合物均匀、缓慢地加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入37℃细胞培养箱孵育。

本发明在构建重组腺病毒载体之前先在HEK 293细胞中验证所设计序列的干扰效果，以节省时间及成本，将干扰载体及靶基因表达载体分别用绿色荧光和红色荧光标记，共转染HEK 293细胞，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光及红色荧光的强度就可以判断干扰载体的转染效率及靶基因的干扰效率，由于采用红光和绿光两种不同荧光分别标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以同时筛选多条序列。

附图说明

图1为pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒凝胶电泳分析

图2为pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA酶切鉴定

图3为pGM-T-LPL双酶切鉴定

图4为pDsRed1-C1-LPL阳性转化子的PCR鉴定；

图5为pDsRed1-C1-LPL酶切鉴定；

图6为RNA干扰序列的筛选(200×)，其中A组、B组、C组、D组分别为shRNA-NC、shRNA-435、shRNA-1150、shRNA-876序列的干扰效果检测；1(A1、B1、C1、D1)、2(A2、B2、C2、D2)分别为pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA干扰载体与pDsRed1-C1-LPL靶基因表达载体共转染HEK 293细胞48小时后荧光显微镜下绿色荧光及红色荧光表达情况；3(A3、B3、C3、D3)为对照组，即单独转染pDsRed1-C1-LPL靶基因表达载体48小时后荧光显微镜下红色荧光表达情况。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

第一步：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；

根据GenBank公布的西农萨能羊LPL序列，利用在线s iRNA选择程序(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php)设计三条LPL-siRNA及1条阴性对照序列，即siRNA-435：GGCGGATGAATTTAACTAT(SEQID NO：1)；siRNA-876：CCGGTGCAATTCCAAAGAA(SEQ ID NO：2)；siRNA-1150：CCTGAAGTCTCCACAAATA(SEQ ID NO：3)；阴性对照siRNA-NC：ACTACCGTTGTTATAGGTG(SEQ ID NO：4)。在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG(含Sca I酶切位点，以便载体构建中进行鉴定)的发夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，即得到shRNA的正、反义链模板，见表1：

表1LPL特异的编码shRNA的寡核苷酸序列

名称	序列及其在序列表中位置
		shRNA-435-senseshRNA-435-antisense	5′-GATCCGGCGGATGAATTTAACTATgagtactgATAGTTAAATTCATCCGCCTTTTTTC-3′(SEQ  ID NO：5)5′-TCGAGAAAAAACCGCCTACTTAAATTGATAcagtactcTATCAATTTAAGTAGGCGGG-3′(SEQ  ID NO：6)
shRNA-876-senseshRNA-876-antisense	5′-GATCCCCGGTGCAATTCCAAAGAAgagtactgTTCTTTGGAATTGCACCGGTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：7)5′-TCGAGAAAAAAGGCCACGTTAAGGTTTCTTcagtactcAAGAAACCTTAACGTGGCCG-3′(SEQ  ID NO：8)
		shRNA-1150-senseshRNA-1150-antisense	5′-GATCCCCTGAAGTCTCCACAAATAgagtactgTATTTGTGGAGACTTCAGGTTTTTTC-3′(SEQ  ID NO：9)5′-TCGAGAAAAAAGGACTTCAGAGGTGTTTATcagtactcATAAACACCTCTGAAGTCCG-3′(SEQ  ID NO：10)

名称	序列及其在序列表中位置
		shRNA-NC-senseshRNA-NC-antisense	5′-GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGgagtactgCACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTC-3′(SEQ I D NO：11)5′-TCGAGAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGcagtactcCACCTATAACAACGGTAGTG-3′(SEQ ID NO：12)

第二步：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；

2.1单链寡核苷酸退火反应生成双链；

先将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火反应体系为：退火条件是：95℃×4min，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列(dsoligos)，分别标记为：ds435、ds876、ds1150。再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，为进行连接反应准备，其余置-20℃保存。

200μM正义链        5μL

200μM反义链        5μL

10×退火缓冲液      2μL

不含DNase/Rnase的水 8μL

                                   

总体积              20.0μL

2.2连接反应-构建穿梭载体

用BamH I及Xho I双酶切pENTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将退火产物浓度为5nM的ds435、ds876、ds1150分别与pENTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接，连接反应体系为如下：

pENTR/U6                2μL

ds oligos(5nM)          1μL

5×退火缓冲液           4μL

T₄DNA连接酶             1μL

不含DNase/Rnase的水     12μL

                                  

总体积                  20.0μL

反应条件为4℃连接过夜，之后进行转化或置-20℃保存。

2.3连接产物转化

取10μL连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，快速置冰浴1-2分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟。将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育。

2.4筛选穿梭载体克隆

(1)穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定

ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体pENTR/U6的黏性末端互补，经连接反应后，形成环形质粒。于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于4mL的含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时，取菌液2mL提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产物以1.2％的琼脂糖凝胶电泳观察。

(2)穿梭载体克隆的测序鉴定

取双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京金思瑞生物技术有限公司以ABI 377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物U6(或M13)。

第三步：pDsRed1-C1-LPL载体的构建

3.1构建pDsRed1-C1-LPL克隆载体

将回收的目的基因片段与pGM-T载体连接，16℃保温过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取10μL反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：

10×H Buffer             2.0μL

Xho I                    0.7μL

Sal I                    0.7μL

pGEM-T-LL                10.0μL

ddH₂O                    6.6μL

                                          

Total                    20.0μL

37℃水浴反应过夜，取全部反应液在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段。

3.2构建pDsRed1-C1-LPL表达载体

由于目的基因片段两端带有Xho I与Sal I内切酶酶切位点，将pDsRed1-C1进行同样的双酶切反应，回收载体片段并与基因片段连接。

(1)配制pDsRed1-C1酶切反应体系并进行37℃水浴反应过夜；

10×H Buffer    2.0μL

Xho I           0.7μL

Sal I             0.7μL

pDsRed1-C1        5.0μL

ddH₂O             11.6μL

                                       

总体积            20.0μL

(2)酶切反应结束后，取全部反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收pDsRed1-C1载体酶切后的线性化片段；

(3)将载体片段与目的基因片段连接，16℃反应过夜；

(4)将pDsRed1-C1-LPL转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定，酶切反应体系如上所述。

第四步：shRNA有效序列的筛选；

4.1挑取pDsRed1-C1-LPL  阳性单克隆及4个pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA干扰载体(包括阴性对照)分别接种于4mL LB培养基中(10μg/mL kan)，37℃、200rpm摇菌过夜，按1∶50比例转摇至10mL LB培养基中，37℃、230rpm摇菌16h，提取去内毒素质粒。具体操作步骤如下：

溶液P1在使用前先加入RNaseA，混匀，置于2-8℃保存，第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液中加入无水乙醇。

(1)柱平衡步骤：向吸附柱中加入500μL的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，尽量使用当天处理过的柱子。

(2)取5-15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm(13400×g)离心1min，尽量吸除上清；优选的，菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率；

(3)溶液P1中加入RNaseA，向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；

注意：务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低；

(4)向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。需要指出的是注意，上述步骤中要温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏；如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量；

(5)向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm(13400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。需要注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀；如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清；

(6)将上一步收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm(13400×g)离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，另外，如果过滤柱中有残余的液体说明步骤(5)吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清；

(7)12000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(8)向吸附柱中加入500μl去蛋白液，12,000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(9)向吸附柱中加入700μL漂洗液，漂洗液使用前应按照3倍体积加入无水乙醇，12000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；优选的，加入漂洗液后，室温静置2-5min，可更好地去除杂质；

(10)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液；

(11)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。优选的，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(12)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm(13400×g)离心1min后将质粒溶液收集到离心管中；优选的，为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤(12)；洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响；若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；洗脱缓冲液体积不应少于100μL，体积过小影响回收效率，且DNA产物应保存在-20℃，防止降解。

4.2细胞的复苏；

(1)从液氮罐中取出1支冻存的HEK293细胞，立即放入38℃水浴锅中，至细胞完全融化为止；

(2)将冻存管内容物转入10mL离心管中，加入4mL含10％FBS的DMEM，洗脱冻存时加入的DMSO；

(3)1200rpm，离心10min，弃掉上清；

(4)加入2.5mL含10％FBS的DMEM，吹匀，转移入是塑料培养瓶中，在离心管中再次加入2.5mL含10％FBS的DMEM，吹匀，将残余细胞转入同一塑料培养瓶中；

(5)拧松培养瓶瓶盖，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

4.3细胞传代培养

(1)将培养瓶内培养基吸弃，加入1mL培养基清洗后吸弃，以除去血清；

(2)加入1mL 0.25％的ATV，置于镜下观察，当细胞饱满后吸弃ATV；

(3)加入2mL含10％FBS的DMEM，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，将细胞悬液分装至2-3个新培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养。

4.4细胞转染

转染前一天，接种生长状况良好的293细胞于六孔细胞培养板中，每孔细胞数大约5×105个；次日，待细胞生长至90％融合度时将构建好的4个pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA干扰载体分别与含目标基因的pDsRed1-C1-LPL质粒共转染293细胞，同时设空白对照、单独转染仅含目标基因质粒的对照，整个筛选重复进行3次；转染体系为pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒3μg，pDsRed1-C1-LPL质粒1μg，转染过程参照Invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂使用说明书；转染48h后，在荧光显微镜下观察荧光的表达情况。

转染过程如下：将低血清Opti-MEM培养液及Lipofectamine 2000于室温条件下平衡；10μL的Lipofectamine2000及5μg质粒(按2∶1比例，即2μL Lipofectamine2000：1μg质粒DNA)分别加入250μL低血清Opti-MEM中，轻弹管壁使混匀，室温静置5min，将质粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入Lipofectamine2000低血清Opti-MEM混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育20min；将转染复合物均匀、缓慢地加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入37℃细胞培养箱孵育；转染后6-8h更换新鲜培养液。

第五步：结果验证；

5.1pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；

退火后得到的shRNA-435、shRNA-876，shRNA-1150及shRNA-NC双链寡核苷酸与pENTR/CMV-GFP/U6载体进行连接、转化、涂平板、挑单克隆、抽提质粒后，结果见图1；经过Sca I及EcoR V双酶切后出现2个片段，大小与预期结果相吻合，见图2；测序结果表明pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-435、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-876、pENTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-1150、pENTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-NC载体中插入的序列与所设计的序列完全一致，证明载体构建成功。

5.2pDsRed1-C1-LPL载体的构建；

5.2.1pGEM-T-LPL阳性转化子的菌液PCR筛选与双酶切鉴定；

利用本实验室保存的LPL基因的菌液，利用LPLF1和LPLR1引物进行菌液PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳，出现1437bp的目的基因片段，对阳性克隆提取质粒后，利用Sal I和Xho I内切酶进行双酶切分析，经1％琼脂糖凝胶电泳，见图3，获得1437bp的目的基因片段，回收目的片段并将其与pDsRed1-C1载体连接。

5.2.2pDsRed1-C1-LPL阳性转化子的菌落PCR筛选与双酶切鉴定；

连接至pDsRed1-C1载体上的LPL基因，利用pDsRedLPLF1和pDsRedLPLR1引物进行菌落PCR扩增后，经1％琼脂糖凝胶电泳出现1437bp的目的基因片段，结果见图4；提取质粒后进行双酶切分析，经1％琼脂糖凝胶电泳，获得目的基因片段，结果见图5，表明已成功构建pDsRed1-C1-LPL载体。

5.3shRNA序列的筛选；

将表达干扰序列的在pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体分别与含相应脂蛋白脂酶基因片段的载体(pDsRed1-C1-LPL)共转染293细胞48h后，在荧光显微镜下观察到各组中绿色荧光蛋白表达量基本相同，但与阴性对照相比pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-435、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-1150转染组红色荧光蛋白表达量有所降低，其中pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-876转染组降低最为明显；pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC组与不转染干扰载体的对照组基本相同，见图6；试验中红色荧光蛋白与脂蛋白脂酶基因部分功能域形成融合蛋白，因此红色荧光蛋白表达量降低说明设计的干扰序列对脂蛋白脂酶基因具有干扰效果。

应当理解的是，本说明书就具体操作步骤为例对本发明进行详细说明，而对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>西北农林科技大学

 

<120>一种脂蛋白酯酶基因有效shRNA的筛选方法

 

<130>

 

<160>12

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计siRNA-435

 

<400>1

ggcggatgaa tttaactat                                  19

 

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计siRNA-876

 

<400>2

ccggtgcaat tccaaagaa                                19

 

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计siRNA-1150

 

<400>3

cctgaagtct ccacaaata                                19

 

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计siRNA-NC

 

<400>4

actaccgttg ttataggtg                                              19

 

<210>5

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-435正义链模板

 

<400>5

gatccggcgg atgaatttaa ctatgagtac tgatagttaa attcatccgc cttttttc    58

 

<210>6

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-435反义链模板

 

<400>6

tcgagaaaaa accgcctact taaattgata cagtactcta tcaatttaag taggcggg         58

 

<210>7

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-876正义链模板

 

<400>7

gatccccggt gcaattccaa agaagagtac tgttctttgg aattgcaccg gttttttc         58

<210>8

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-876反义链模板

 

<400>8

tcgagaaaaa aggccacgtt aaggtttctt cagtactcaa gaaaccttaa cgtggccg         58

 

<210>9

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-1150正义链模板

 

<400>9

gatcccctga agtctccaca aatagagtac tgtatttgtg gagacttcag gttttttc         58

 

<210>10

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-1150反义链模板

 

<400>10

tcgagaaaaa aggacttcag aggtgtttat cagtactcat aaacacctct gaagtccg         58

 

<210>11

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-NC正义链模板

 

<400>11

gatccactac cgttgttata ggtggagtac tgcacctata acaacggtag tttttttc         58

 

<210>12

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>人工设计shRNA-NC反义链模板

 

<400>12

tcgagaaaaa aactaccgtt gttataggtg cagtactcca cctataacaa cggtagtg         58

Claims (9)

1.一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；根据GenBank公布的西农萨能羊LPL序列，设计三条LPL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔，使单链DNA寡核苷酸内部形成发夹结构，每对单链DNA寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA的正、反义链模板；

A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建：A21：单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链DNA寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火条件是：95℃×4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列，分别标记为：ds435、ds876、ds1150；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22：构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切pENTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds435、所述ds876和所述ds1150分别与pENTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4℃连接过夜，得到连接产物；A23：连接产物转化；取10μL所述连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，置冰浴12分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育；A24：筛选穿梭载体克隆；

A3：pDsRed1-C1-LPL载体的构建：A31：构建pDsRed1-C1-LPL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM-T载体连接，16℃恒温过夜，连接产物转化感受态E.coliDH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取10μL反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pGM-T-LPL，10.0μL；ddH₂O，6.6μL；总体积20.0μL；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段；A32：构建pDsRed1-C1-LPL表达载体；

A4：shRNA有效序列的筛选：A41：去内毒素质粒提取；A42：细胞的复苏；A43细胞传代培养：A44：细胞转染。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接反应体系为如下：pENTR/U6，2μL；ds oligos，5nM，1μL；5×退火缓冲液，4μL；T₄DNA连接酶，1μL；不含DNa se/Rna se的水，12μL；总体积20.0μL

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A24具体执行以下操作：(1)穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定：ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体pENTR/U6的黏性末端互补，经连接反应后，形成环形质粒；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于4mL的含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时，取菌液2mL提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产物以1.2％的琼脂糖凝胶电泳观察；(2)穿梭载体克隆的测序鉴定：取(1)中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送测序公司以ABI377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物U6或M13。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A32具体执行以下操作：(1)配制pDsRed1-C1酶切反应体系并进行37℃水浴反应过夜；(2)酶切反应结束后，取全部反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收pDsRed1-C1载体酶切后的线性化片段；(3)将载体片段与目的基因片段连接，16℃反应过夜；(4)将pDsRed1-C1-LPL转化至E.coliDH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切反应体系为：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pDsRed1-C1-LPL，5.0μL；ddH₂O，11.6μL；总体积20.0μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A41具体执行以下操作：(1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm，13400×g离心1分钟，吸除上清液；(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL已加入RNaseA的溶液P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀；(4)向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；(5)向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀，12000rpm、13400×g离心10分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)将(5)中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm、13400×g离心2分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7)12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μl去蛋白液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(9)按照3倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入700μL所述漂洗液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm、13400×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液；(11)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm、13400×g离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除；(12)将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm、13400×g离心1分钟后将质粒溶液收集到离心管中。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A42具体执行以下操作：(1)从液氮罐中取出1支冻存的HEK293细胞，立即放入38℃水浴锅中，至细胞完全融化；(2)将冻存管内容物转入10mL离心管中，加入4mL含10％FBS的DMEM，洗脱冻存时加入的DMSO；(3)1400rpm，离心8分钟，弃掉上清液；(4)加入2mL含10％FBS的DMEM，吹匀，转移入塑料培养瓶中，在所述离心管中再次加入2mL含10％FBS的DMEM，吹匀，将残余细胞转入所述塑料培养瓶中；(5)拧松培养瓶瓶盖，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A43具体执行以下操作：(1)将培养瓶内培养基吸弃，加入1mL培养基清洗后吸弃，以除去血清；(2)加入1mL 0.25％的ATV，置于镜下观察，当细胞饱满后吸弃ATV；(3)加入2mL含10％FBS的DMEM，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，将细胞悬液分装至2-3个新培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A44具体执行以下操作：将低血清Opti-MEM培养液及Lipofectamine 2000于室温条件下平衡；按2∶1比例将Lipofectamine 2000及质粒分别加入250μL低血清Opti-MEM中，轻弹管壁使混匀，室温静置5min，将质粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入Lipofectamine 2000低血清Opti-MEM混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育20min；将转染复合物均匀、缓慢地加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入37℃细胞培养箱孵育。

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