CN103146752A

CN103146752A - 应用腺病毒载体介导rna干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法

Info

Publication number: CN103146752A
Application number: CN2013100418179A
Authority: CN
Inventors: 昝林森; 付常振; 成功; 王洪宝; 王虹
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: CN103146752B

Abstract

本发明公开了一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，该方法包括以下步骤：A1，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白1基因（SREBP1）；A2，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；A3，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；A4，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；A5，shRNA干扰效率的测定、筛选；A6，重组腺病毒载体的构建；A7，腺病毒包装、扩增、滴度测定；为应用RNA干扰技术研究秦川牛SREBP1基因的功能提供一种有效的方法。

Description

应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1（SREBP1）的方法

背景技术

固醇调节元件结合蛋白（Sterol regμlatory element binding proteins：SREBPs）是一种膜结合蛋白，属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，它主要通过促进糖酵解和脂肪生成而在能量平衡中发挥重要作用（Eberle et al.，2004；Shimomura et al.，1997；Wang et al.，1994）研究已经表明SREBPs家族是通过结合下游基因（包括SCD）启动子中的SRE（5’-TCACNCCAC-3’）序列来调控基因的转录（Shimano，2001）。SREBP-1c能够促进PPARγ的表达和内源性PPARγ的产生，并与PPARγ和CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein，C/EBPs）共同调控脂肪细胞分化（Kim et al.，1998）。过表达SREBP-1c增加了3T3-L1前体脂肪细胞中脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）等脂肪沉积相关基因的表达，从而促进脂肪细胞分化（Kim and Spiegelman，1996）。SREBP-1c（-/-）小鼠在正常饲喂条件下，肝脏中由多种mRNAs编码的脂肪酸合酶及甘油三酯合酶的含量减少，主要包括乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶（Liang et al.，2002）。研究还发现该基的不同突变体对大多不饱和脂肪酸含量和肌内脂肪熔点均有显著的影响（Hoashi et al.，2007）。同时该基还可能是影响中国肉牛生长发育的一个重要基因（Huang et al.，2011）。

RNAi（RNA interference，RNAi）是一种双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默，是研究基因功能的一种的重要手段。在大多数情况下，针对某一特定基因设计的shRNA并不能达到沉默该基因的效果（Elbashir et al.，2002a；Holen et al.，2002；KapadiaBrideau-Andersen and Chisari，2003；Lee et al.，2002；YuDeRuiter and Turner，2002），一般只有1/5能起到有效沉默目的基因的效果（KapadiaBrideau-Andersen and Chisari，2003；McManus et al.，2002）。

以下是发明人给出的参考文献：

1、Eberle，D，Hegarty，B，Bossard，P，Ferre，P，etal.（2004）.SREBP transcription factors:master regulators of lipid homeostasis.Biochimie86，839-848；Elbashir，SM，Harborth，J，Weber，K，Tuschl，T（2002a）.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Methods26，199-213。

2、Elbashir，SM，Harborth，J，Weber，K，Tuschl，T（2002b）.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Methods26，199-213。

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发明内容

本发明的目的在于，筛选得到靶向SREBP1基因的高干扰效率shRNA，并包装扩繁得到高滴度病毒，为应用RNA干扰技术研究秦川牛SREBP1基因的功能提供一种有效的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1步骤，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白基因1（SREBP1）；

A2步骤，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；

A3步骤，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；

A4步骤，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；

A5步骤，shRNA干扰效率的测定、筛选；

A6步骤，重组腺病毒载体的构建；

A7步骤，腺病毒包装、扩增、滴度测定。

其中：

A1步骤包括以下步骤：

步骤A11，设计、合成PCR扩增引物，并按以下方式操作：

根据GenBank收录的牛的SREBP1基因序列（Accession NO.NM_001113302）用Primer5.0软件设计PCR扩增引物、由生工生物工程（上海）有限公司合成，在上游引物加PmeI酶切位点，下游引物加NotI酶切位点，引物序列如下：

SREBP1-PmeI-F：AGCTTTgtttaaacTGACTGCGCCATGGACGAGC；

REBP1-NotI–R：AAGGAAAAAAgcggccgcTGATACGGAGACC（小写字母为外加酶切位点）。

步骤A12，PCR扩增SREBP1基因，并按以下方式操作：

用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶PCR扩增SREBP1基因，PCR反应体系为：cDNA模板1.2μl，上下游引物各0.6μl，25mM MgSO₄1.2μl，2Mm dNTP2μl，10×PCR Buffer2μl，ddH₂O12μl，KOD-Plus-（1U/μl）1μl，总反应体系20μl；PCR反应条件为：95℃，3min，33个循环（95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s）72℃，5min，取3μl的PCR产物电泳检测并胶回收目的基因片段，-20℃保存备用。

步骤A13，PCR产物与

19-T Simple Vector连接，并按以下方式操作：

取回收产物5μl，加入1μl普通Taq聚合酶混合物（MIX），72℃加“A”反应10min，

19-T Simple Vector是一种高效PCR产物T-A克隆的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成，它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，再在pUC19载体的多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。而KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶的PCR产物末端已被平滑化，故用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶扩增得到的PCR产物需要有一步加“A”反应，方可与

19-T Simple Vector进行T-A克隆）将加“A”产物与19-T Simple Vector于16℃过夜连接，转化感受态E.coliDH5α，挑取单克隆菌落扩繁，取5ml菌液提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

A2步骤，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建：

用PmeI和NotI分别双酶切

19-T-SREBP1质粒和psiCHECK-Ⅱ质粒，胶回收SREBP1基因和psiCHECK-Ⅱ酶切片段，多功能酶标仪测定回收产物浓度，用T₄DNA连接酶将二者回收产物16℃过夜连接，取连接产物10μl转化100μl感受态E.coliDH5α，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl LB培养基，37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

A3步骤，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成：

根据GenBank公布的牛的SREBP1基因序列，设计6对条shRNA及1对阴性对照单链DNA寡核苷酸序列，每对单链DNA寡核苷酸序列两端分别添加BamHI和XhoI酶切位点，其中正义链中间添加发夹环序列“TCAAGAG”，3'端加终止信号“TTTTTT”，得到shRNA的正、反义单链模板，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

A4步骤，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建包括：

A41步骤，单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；

A42步骤，构建Entry载体；

其中：

A41步骤，单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链：

将合成的单链DNA寡核昔酸序列用1×TE溶解成终浓度1μg/μl，退火体系为：正反义链单链寡核苷酸各1μl，KOD-Plus-Ver.210×PCR buffer5μl，1×TE缓冲液43μl，总共50μl；95℃水浴10min，自然冷却至室温，-20℃保存备用。

A42步骤，构建Entry载体：

用BamHI和XhoI双酶切pENTR/CMV-GFP/U6质粒并胶回收，然后将A41步中的退火产物分别与胶回收产物16℃过夜连接，取10μl连接产物转化100μl感受态E.coliDH5α，冰浴30分钟，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μlLB液体培养液，以37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒并用BamHI和XhoI双酶切鉴定。

A5步骤，shRNA干扰效率的测定、筛选：

培养的293A细胞融合度约90%时，以每孔约为2×10⁵个细胞传代于24孔板上，第二天细胞融合度约为80%-90%，然后将6条pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒和1条pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒分别与psiCHECK-Ⅱ-SREBP1质粒共转染293A细胞，转染48小时按照Promega公司

Reporter Assay System的说明与步骤收集细胞并多功能酶标仪测量化学发光，计算每条shRNA的干扰效率。

A6步骤，重组腺病毒载体的构建：

将筛选出的高干扰效率的pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒与pAd/PL-DEST骨架质粒用LR Clonase-II重组酶体外重组，取重组产物5μl转化100μl感受态E.coliDH5α，挑选单克隆菌落在含有氨苄抗性的液体培养基中培养并用含氯霉素抗性的液体培养基复筛，不能在含氯霉素抗性培养基中生长的初步定为阳性重组质粒，即：pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA，测序验证；以上构建的所有质粒均需要测序验证。

A7步骤，腺病毒包装、扩增、滴度测定，包括：

步骤A71：腺病毒包装：

用OMEGA无内毒素质粒小量提取试剂盒I抽提重组腺病毒质粒pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC，取5ug质粒用PacI酶切并胶回收大片段，用TurboFect^TM in vitro Transfection Rengent转染试剂以2μg每孔（6孔板）转染融合度为80%～90％的293A细胞包装病毒；转染10～12d细胞变圆，出现明显的病变反应，待约有50％细胞从培养瓶底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80℃/37℃反复冻融并涡旋振荡2次，将细胞悬液3000r/min离心5min，收集上清液，即为第1代病毒悬液；

步骤A72：腺病毒扩增、滴度测定：

取第1代病毒原液侵染融合度为80%-90％的293A细胞，侵染2~3d后，细胞出现病变，开始脱落，待脱落达50%左右，按前述方法反复冻融细胞2次，离心收集上清液，即为第2代病毒悬液；用第2代病毒悬液再次侵染293A细胞，重复步骤A71中的侵染、冻融、收集，以提高病毒滴度和大量扩增重组腺病毒，将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定腺病毒滴度。

本发明首先是高效shRNA的筛选，将shRNA表达载体分别与SREBP1基因表达载体共转染293A细胞，48小时后收集细胞，用多功能酶标仪测定干扰效率，筛选出高干扰效率的shRNA，由于psiCHECK-Ⅱ载体同时含有海肾荧光素酶基因和萤火虫荧光素酶基因，使得该方法能够准确的测量出每条shRNA的干扰效率，另外，在psiCHECK-Ⅱ质粒海肾荧光素酶基因和多克隆位点中间存在一个终止密码子，从而使克隆到多克隆位点的靶序列只能转录形成mRNA而不会翻译产生氨基酸序列，这样就避免了目的基因翻译的氨基酸序列对海肾荧光素酶表达的影响，可以将干扰效率定量化，不受人的主观判断影响，使结果更稳定可靠。将筛选出的高干扰效率shRNA表达载体与腺病毒骨架载体重组，并在293A细胞中包装扩繁成腺病毒，为应用RNA干扰技术研究秦川牛SREBP1基因的功能提供一种有效的方法。

附图说明

图1是秦川牛SREBP1基因PCR扩增检测

图2是

19-T-SREBP1质粒PmeI和NotI双酶切。

图3是psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1质粒PmeI和NotI双酶切鉴定。

图4是pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒BamHI和XhoI双酶切鉴定；

图5是shRNA干扰效率柱状图。

图6是重组腺病毒的包装与扩增（40×）。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

在以下的实施例中，如无特殊说明，采用的材料均为本领域公知的材料。

第一步：克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白基因1（SREBP1）

1.1设计、合成PCR扩增引物：

根据GenBank收录的牛的SREBP1基因序列（Accession NO.NM_001113302）用Primer5.0软件设计一对引物，在上游引物加PmeI酶切位点，下游引物加NotI酶切位点，

引物序列如下：

SREBP1-PmeI-F：AGCTTTgtttaaacTGACTGCGCCATGGACGAGC；

SREBP1-NotIR：AAGGAAAAAAgcggccgcTGATACGGAGACC（小写字母为外加酶切位点），送生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2PCR扩增SREBP1基因：

引物使用前分别用1×TE溶液稀释成10pmol/μl，用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶PCR扩增SREBP1基因，PCR反应体系为：cDNA模板1.2μl，上下游引物各0.6μl，25mM MgSO₄1.2μl，2Mm dNTP2μl，10×PCR Buffer2μl，ddH₂O12μl，KOD-Plus-（1U/μl）1μl，总反应体系20μl；PCR反应条件为：95℃，3min，33个循环（95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s），72℃，5min，取3μlPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收目的基因片段，-20℃保存备用。

1.3PCR产物与

19-T Simple Vector连接：

取回收产物5μl加入1μl普通Taq聚合酶混合物（MIX），72℃加“A”反应10min，将加“A”产物与

19-T Simple Vector16℃过夜连接，连接体系为：

10μl连接产物全量加入到100μl感受态E.coliDH5α，冰中放置30分钟，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl的LB液体培养基，37℃振荡培养60min，在含有X-Gal、IPTG氨苄的LB琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落，挑选白色菌落，在5mL含氨苄霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，使用菌液PCR法确认载体中插入片段的长度，用西安润德生物技术有限公司生产的普通PCR反应2×MIX，具体为：2×MIX7.5，引物SREBP1-PmeI-F和SREBP1-NotIR各0.3μl，菌液1μl，ddH₂O：6.9μl，总共15μl；

PCR反应条件是95℃，3min，35个循环（95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s），72℃，5min；取3μl的PCR产物电泳检测，选择电泳结果正确的菌液用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取质粒，然后用PmeI和NotI双酶切检测并测序验证。

第二步:psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建

2.1用PmeI和NotI分别双酶切

19-T-SREBP1质粒和psiCHECK-Ⅱ质粒，酶切体系如下：

胶回收SREBP1基因和psiCHECK-Ⅱ酶切片段，多功能酶标仪测定回收产物浓度，用T₄DNA连接酶将回收产物连接，连接体系如下：

SREBP1	5μl
		psiCHECK-Ⅱ	2μl
T4DNA Ligase	1μl
		T4DNA Ligase Buffer	2μl
总共	10μl

16℃过夜连接，10μl连接产物全量转化100μl感受态E.coliDH5α，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板培养基上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定，筛选出SREBP1基因表达载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1，酶切体系如下：

psiCHECK-Ⅱ-SREBP1	3μl
		PmeI	1μl
NotI-HF	1μl
		NEBuffer4	1μl
ddH₂O	4μl
		总共	10μl

第三步：靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成

3.1根据GenBank（Accession NO.NM_001113302）公布的牛的SREBP1 基因序列，参考shRNA的设计原则（Elbashir et al.，2002b；Tuschl，2006），应用在线shRNA设计程序（http：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/-setOption.do?designOption-=shrna&pid-=-4452122476208466843和 http://www.thermoscientificbio.com/design-center/?redirect=true）共设计6条特异靶向SREBP1基因的shRNA，并根据靶序列在SREBP1基因CDS区的位置分别命名为shRNA-1027、shRNA-1053、shRNA-1717、shRNA-1730、shRNA-2533和shRNA-3142，并且将shRNA-2533的序列打乱设计成阴性对照序列即shRNA-NC，将设计的6条shRNA与shRNA-NC序列与牛的RNA数据库BLAST比对，确保shRNA序列的靶向性，不会靶向作用于其他无关基因，shRNA的详细信息见表1，将设计的shRNA送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1：

第四步：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建

4.1单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；

将合成的单链DNA寡核苷酸序列用1×TE稀释成浓度为1μg/μl，然后退火成双链寡核苷酸序列，退火体系为：

shRNA正义链单链	1μl
		shRNA反义链单链	1μl

[0100]

10×PCR buffer	5μl
		1×TE缓冲液	43μl
总共	50μl

95℃水浴10min，自然冷却至室温，-20℃保存备用。

4.2：构建Entry载体：

用BamHI和XhoI双酶切pENTR/CMV-GFP/U6质粒，酶切体系如下：

pENTR/CMV-GFP/U6	30μl
		BamHI	5μl
XhoI	5μl
		10×K Buffer	5μl
ddH₂O	5μl
		总共	50μl

胶回收质粒DNA大片段，然后将4.1步中退火产物分别与胶回收产物连接，连接体系如下：

退火产物	1μl
		pENTR/CMV-GFP/U6胶回收产物	2μl
T4DNA Ligase	1μl
		T4DNA Ligase Buffer	1μl
ddH₂O	5μl
		总共	10μl

16℃恒温过夜连接，10μl连接产物全量转化100μl感受态E.coliDH5α，冰浴30min，42℃水浴90s后，冰浴2分钟，加入890μl LB液体培养基，37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒并用BamHI和XhoI双酶切凝胶电泳鉴定，酶切体系如下：

pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA	2μl
		BamHI	1μl
XhoI	1μl
		10×K Buffer	1μl
ddH₂O	5μl
		总共	10μl

第五步：shRNA干扰效率的测定、筛选

5.1质粒准备

转染用6条pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒、

pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒和psiCHECK-Ⅱ-SREBP1质粒分别用OMEGA无内毒素质粒小量提取试剂盒提取，并用多功能酶标仪测定浓度，-20℃保存备用。

5.2细胞培养

5.2.1细胞复苏

（1）从液氮罐中取出1支冷冻储藏293A细胞，37℃水浴解冻；

（2）将细胞悬液转到15mL离心管中，1000r/min，离心5min，弃上清；

（3）加入3-5ml含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM，重悬细胞后，1000r/min，离心5min，弃上清，清洗细胞冻存液；

（4）用1mL含10%FBS的高糖DMEM重悬细胞，将细胞悬液转移到60mm培养皿中，在37℃，5%C0₂，饱和湿度条件下培养；

5.2.2细胞传代

（1）吸弃培养皿中的培养基，加2mL1×PBS洗涤一遍，然后加1ml0.25%胰酶，消化15-30s；

（2）加1mL含10%FBS的高糖DMEM终止消化，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，收集细胞悬液到15ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用1-5ml含10%FBS的高糖DMEM重悬细胞；

（3）按照培养面积约1:4的比例传代到新的培养皿中或者以每孔约为2×10⁵个细胞传代到24孔板中。

5.3细胞转染

待6孔板中的细胞生长至80%~90％融合度时将6条pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA以及阴性对照pENTR/CMV-GFP/U6-NC分别与psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞，每组设3个重复，每孔转染体系如下：

pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA	600ng
		psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1	400ng
TurboFect^TMin vitro Transfection Rengent	2μl

用无血清DMEM补至100μl；转染方法参照Fermentas公司TurboFect^TMin vitro Transfection Rengent使用说明书；转染后48h，观察绿色荧光强度，观察转染效率和绿色荧光分布。

5.4化学发光检测、计算干扰效率

按照Promega公司

Reporter Assay System的说明与步骤收集细胞并多功能酶标仪测化学发光强度，以共同转染pENTR/CMV-GFP/U6-NC与psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1质粒作为阴性对照并规定干扰效率为零，计算其他shRNA的干扰效率，筛选高干扰效率的shRNA。

第六步：重组腺病毒载体的构建

将筛选出的高干扰效率的pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒和pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒在LR Clonase-II酶的作用下分别与pAd/PL-DEST骨架载体体外重组，重组体系与重组条件参考Invitrogen公司LR Clonase-II酶使用说明，取重组产物5μl转化100μl感受态E.coliDH5α，挑选单克隆菌落在含有氨苄抗性的液体培养基中培养并用含氯霉素抗性的液体培养基复筛，不能在含氯霉素抗性培养基中生长的初步定为阳性克隆即pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA重组质粒；以上构建的所有质粒据需要测序验证。

第七步：腺病毒包装、扩增、滴度测定

7.1腺病毒包装

用无内毒素质粒小量提取试剂盒抽提pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA和阴性对照 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC重组腺病毒质粒，测质粒浓度，-20℃保存备用；用PacI酶切线性化腺病毒重组质粒，酶切体系如下：

pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC	5μg
			pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA		5μg
PacI	5μl	5μl
			NEBuffer1	10μl	10μl

用ddH₂O补至100μl，37℃过夜反应，胶回收大片段，用TurboFect^TMin vitro Transfection Rengent转染试剂以2μg每孔（6孔板）转染融合度为80%-90％的293A细胞包装病毒，转染方法与步骤参照Fermentas公司TurboFect^TMin vitro Transfection Rengent使用说明书；转染后48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，以跟踪腺病毒的包装与增殖过程，此时有少量的绿色荧光星星点状分布；转染6d~8d，绿色荧光明显增多并出现葡萄串样聚集；转染10~12d，细胞变圆，出现明显的病变反应，待约有50％细胞从培养瓶底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80℃/37℃反复冻融并涡旋振荡2次，将细胞悬液3000r/min离心5min，收集上清液，即为第1代病毒悬液。

7.2腺病毒的扩增、滴度测定

取第1代病毒悬液1ml侵染在25cm²培养瓶中培养，融合度为80%-90％的293A细胞，侵染2~3d后，细胞出现病变，开始脱落，待脱落达50%左右，按前述方法反复冻融细胞2次，离心收集上清液，即为第2代病毒悬液。用第2代病毒悬液再次侵染293A细胞，重复“侵染一冻融一收集”，以提高病毒滴度和大量扩增重组腺病毒。

7.3腺病毒滴度测定

将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定腺病毒滴度，具体操作参考Lybarger（Lybarger et al.，1996）等及Hitt等（Hitt et al.，2000）。

第八步:结果验证

8.1SREBP1基因的克隆与psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1表达载体构建

8.1.1SREBP1基因的克隆及鉴定

PCR扩增SREBP1基因，PCR产物为3526bp，条带清晰与预期片段大小相符（见图1）；将PCR产物胶回收后克隆到

19-T Simple Vector，构建克隆载体

19-T-SREBP1；PmeI和NotI双酶切19-T-SREBP1质粒，琼脂糖凝胶电泳得到约3504bp和2692bp两条条带（见图2），结合测序结果显示

19-T-SREBP1克隆载体构建成功。

8.1.2psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建

PmeI和NotI双酶切psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1质粒，琼脂糖凝胶电泳得到约6200bp与3504bp两条带（图3），与预期结果一致，测序验证同样正确，说明该表达载体构建成功。

8.2pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体构建

用BamHI和XhoI双酶切pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒，凝胶电泳检测有约为4639bp与61bp两条条带，而空载pENTR/CMV-GFP/U6质粒由于没有shRNA的插入，故双酶切后没有61bp的条带（图1）。结合测序结果，表明pENTR/CMV-GFP/U6-1027、pENTR/CMV-GFP/U6-1053、pENTR/CMV-GFP/U6-1717、pENTR/CMV-GFP/U6-1730、pENTR/CMV-GFP/U6-2533、pENTR/CMV-GFP/U6-3142和阴性对照pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒构建成功。

8.3有效shRNA序列的筛选

将6条pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒和阴性对照pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒与psiCHECK^TM-Ⅱ-SREBP1质粒分别共转染293A细胞，48h后，按照

Reporter Assay System说明收集细胞，测量化学发光强度并计算干扰效率，每条shRNA对应的干扰效率见图5；其中，pENTR/CMV-GFP/U6-1053干扰效果最好，干扰效率为87.4%，可以作为研究SREBP1基因RNA干扰的有效序列，而其他shRNA干扰效率相对较低，不能达到理想的干扰效果。

8.4pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

用LR Clonase-II重组酶将pENTR/CMV-GFP/U6-1053质粒和pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒分别与腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST体外重组，重组产物转化感受态DH5α，经氨苄霉素与氯霉素双筛选后得到重组质粒pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-1053与pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC，提取质粒并送公司测序，测序结果显示两个重组载体构建成功，可以进行腺病毒包装。

8.5腺病毒的包装、扩增及滴度测定

8.5.1腺病毒的包装

用PacI限制酶分别酶切线性化pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-1053与pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC重组质粒，将线性化片段分别回收并转染293A细胞；转染48h，荧光倒置显微镜观察，有少量的绿色荧光星星点点均匀分布（图6上方左图）；转染7d，绿色荧光量明显增多并出现葡萄串样聚集（图6上方右图）；转染10d，绿色荧光铺满全屏，待约50%细胞脱壁变圆，收集细胞（图6下方左图），即为第一代病毒悬液。

8.5.2腺病毒的扩增与滴度测定

将第1代病毒悬液重复“侵染一冻融一收集”获得高滴度的病毒，第6代腺病毒侵染293A细胞24小时，细胞大量变圆脱落（图6下方右图），侵染28小时约50%细胞脱壁变圆，收集病毒并测定病毒滴度；将第6代病毒用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定腺病毒的滴度，结果表达shRNA-1053和shRNA-NC的病毒滴度分别7×10⁸GFU/ml，9×10⁹GFU/ml。

应当理解的是，本实施例以具体操作步骤为例对本发明进行了详细的说明，而对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1步骤，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白1基因（SREBP1）；

A2步骤，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；

A3步骤，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；

A4步骤，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；

A5步骤，shRNA干扰效率的测定、筛选；

A6步骤，重组腺病毒载体的构建；

A7步骤，腺病毒包装、扩增、滴度测定；

其中：所述A1步骤包括：

步骤A11，设计、合成PCR扩增引物，具体执行以下操作：

根据GenBank收录的牛的SREBP1基因序列（Accession NO.NM_001113302）用Primer5.0软件设计PCR扩增引物，在上游引物加PmeI酶切位点，下游引物加NotI酶切位点，引物序列如下：

SREBP1-PmeI-F：AGCTTTgtttaaacTGACTGCGCCATGGACGAGC；

SREBP1-NotI-R：AAGGAAAAAAgcggccgcTGATACGGAGACC；

其中引物序列中的小写字母为外加酶切位点；

步骤A12，PCR扩增SREBP1基因，具体执行以下操作：

用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶PCR扩增SREBP1基因，PCR反应体系为：cDNA模板1.2μl，上下游引物各0.6μl，25mM MgSO₄1.2μl，2Mm dNTP2μl，10×PCR Buffer2μl，ddH₂O12μl，KOD-Plus-（1U/μl）1μl，总反应体系20μl；

PCR反应条件为：

95℃，3min；

95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s，共33个循环；

72℃，5min；

取3μl PCR产物电泳检测并胶回收，-20℃保存备用；

步骤A13，PCR产物与

19-T Simple Vector连接，具体执行以下操作：

取回收产物5μl，加入1μl普通Taq聚合酶混合物（MIX），72℃条件下，加“A”反应10min，将加“A”产物与

19-T Simple Vector16℃于过夜连接，转化感受态E.coliDH5α，挑取单克隆菌落扩繁，取5ml菌液提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A2步骤具体执行以下操作：

用PmeI和NotI分别双酶切

19-T-SREBP1质粒和psiCHECK-Ⅱ质粒，胶回收SREBP1基因和psiCHECK-Ⅱ酶切片段，多功能酶标仪测定回收产物浓度，用T₄DNA连接酶将二者回收产物16℃过夜连接，取连接产物10μl转化100μl感受态E.coliDH5α，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：

根据GenBank公布的牛的SREBP1基因序列，设计6对条shRNA及1对阴性对照单链DNA寡核苷酸序列，每对单链DNA寡核苷酸序列两端分别添加BamHI和XhoI酶切位点，其中正义链中间添加发夹环序列“TCAAGAG”，3'端加终止信号“TTTTTT”，得到shRNA的正、反义单链模板并合成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A4步骤包括步骤A41，单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；步骤A42，构建Entry载体；其中：

所述步骤A41具体执行以下操作：将合成的单链DNA寡核昔酸序列用1×TE溶解成终浓度1μg/μl，退火体系为：正反义链单链寡核苷酸各1μl，KOD-Plus-Ver.210×PCR buffer5μl，1×TE缓冲液43μl，总共50μl；95℃水浴10min，自然冷却至室温，-20℃保存备用；

所述步骤A42具体执行以下操作：用BamHI和XhoI双酶切pENTR/CMV-GFP/U6质粒并胶回收，然后将A41的退火产物分别与胶回收产物16℃过夜连接，取10μl连接产物转化100μl感受态E.coliDH5α，冰浴30分钟，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl LB液体培养液，以37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒并用BamHI和XhoI双酶切鉴定。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A5步骤具体执行以下操作：

培养的293A细胞融合度90%时，以每孔为2×10⁵个细胞传代于24孔板上，第二天细胞融合度约为80%-90%，然后将6条pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒和1条pENTR/CMV-GFP/U6-NC质粒分别与psiCHECK-Ⅱ-SREBP1质粒共转染293A细胞，转染48小时按照Promega公司

ReporterAssay System的说明与步骤收集细胞并多功能酶标仪测量化学发光，计算每条shRNA的干扰效率。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A6具体执行以下操作：

将筛选出的高干扰效率的pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒与pAd/PL-DEST骨架质粒用LR Clonase-II重组酶体外重组，取重组产物5μl，转化100μl感受态E.coliDH5α，挑选单克隆菌落在含有氨苄抗性的液体培养基中培养并用含氯霉素抗性的液体培养基复筛，不能在含氯霉素抗性培养基中生长的初步定为阳性重组质粒，即：pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA，测序验证；以上构建的所有质粒均需要测序验证。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A7包括以下步骤：

步骤A71：腺病毒包装，具体执行以下操作；

用OMEGA无内毒素质粒小量提取试剂盒I抽提重组腺病毒质粒pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-NC，取5ug质粒用PacI酶切并胶回收大片段，用TurboFect^TM in vitro TransfectionRengent转染试剂以每孔2μg的量，转染融合度为80%-90％的在6孔板中培养的293A细胞包装病毒；转染后10~12d，细胞变圆，出现明显的病变反应，待有50％细胞从培养瓶底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80℃/37℃反复冻融并涡旋振荡2次，将细胞悬液以3000r/min离心5min，收集上清液，即为第1代病毒悬液；

步骤A72：腺病毒扩增、滴度测定，具体执行以下操作：

取第1代病毒原液侵染融合度为80%-90％的293A细胞，侵染2~3d后，细胞出现病变，开始脱落，待脱落达50%，将细胞悬液于-80℃/37℃反复冻融细胞2次，离心收集上清液，即为第2代病毒悬液；用第2代病毒悬液再次侵染293A细胞，重复步骤A71中的侵染、冻融、收集，以提高病毒滴度和大量扩增重组腺病毒，将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定腺病毒滴度。