WO2021010449A1 - Ｒｎａ分子、キメラ型ｎａ分子、二本鎖ｒｎａ分子、および二本鎖キメラ型ｎａ分子 - Google Patents

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小林　芳明
西郷　薫
幸和 名取
佐藤　淳
吉政 浅野
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Definitions

  • the present invention relates to RNA molecules, chimeric NA molecules, double-stranded RNA molecules, and double-stranded chimeric NA molecules for use in RNA interference methods.
  • the RNA interference method is a simple and efficient method for specifically suppressing the expression of a specific target gene in a cell.
  • An object of the present invention is to provide a novel RNA molecule, a novel chimeric NA molecule, a novel double-stranded RNA molecule, and a novel double-stranded chimeric NA molecule.
  • RNA interference method targeting a mutant allele having a single-base point mutation with respect to the wild-type allele of a certain gene, the 10th or 11th base corresponds to the position of the point mutation.
  • the RNA molecule By designing the RNA molecule to be the base of the mutant allele and using the double-stranded RNA molecule with this RNA molecule as the guide strand in the RNA interference method, the expression of the wild allele is not substantially suppressed. , Succeeded in mainly suppressing the expression of mutant alleles, and completed the present invention.
  • RNA interference method targeting a mutant allele having a point mutation of one base with respect to a wild-type allele of the gene.
  • RNA molecule that meets the following requirements: (1) Having a base sequence complementary to the coding region of the mutant allele except for the base specified in (2-1) below; (2) The 5th or 6th base counting from the base on the 5'side of the base sequence complementary to the mutant allele is a mismatch with the base of the mutant allele; (2-2) The 10th or 11th corresponds to the position of the point mutation, and the 10th or 11th base corresponds to the base possessed by the mutant allele; and (2-3) 6-8.
  • the 2'position of the pentose is modified with OCH 3 , halogen, or LNA.
  • the halogen may be F. If the base at the 5'end of the base sequence defined in (1) above is not adenine or uracil, it may be replaced with adenine or uracil. If the base at the 3'end of the base sequence defined in (1) above is not cytosine or guanine, it may be replaced with cytosine or guanine.
  • Any of the above RNA molecules may consist of 13-28 nucleotides. Any of the above RNA molecules may be a chimeric NA molecule in which one or more ribonucleotides are replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • a further embodiment of the present invention is a double-stranded RNA molecule in which any of the above RNA molecules is a guide strand and the RNA molecule having a sequence complementary to the RNA molecule is a passenger strand. is there.
  • the overhang site may have an overhang site at the 3'end of the guide chain and / or at the 3'end of the passenger chain.
  • the overhang site may consist of 1 to 3 nucleotides.
  • Any of the above double-stranded RNA molecules may be a double-stranded chimeric NA molecule in which one or more ribonucleotides are replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • a further embodiment of the present invention is a method for producing an RNA molecule for use as a guide strand in an RNA interference method, which comprises a step of producing any of the above RNA molecules.
  • the RNA molecule may be a chimeric NA molecule in which one or more ribonucleotides are replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • a further embodiment of the present invention is RNA interference targeting the mutant allele in a cell having a wild-type allele of the gene and a mutant allele of the gene having a point mutation of one base.
  • the method is an RNA interference method including a step of introducing any of the above RNA molecules, a chimeric NA molecule, a double-stranded RNA molecule or any of the above double-stranded chimeric NA molecules into the cell. ..
  • a further embodiment of the present invention has a wild allele of a tumor gene and a mutant allele of the tumor gene having a point mutation of one base, and the point mutation causes tumorigenesis.
  • a further embodiment of the present invention is the selection of RNA molecules, chimeric NA molecules, double-stranded RNA molecules or double-stranded chimeric NA molecules for use in RNA interference methods for suppressing a target gene.
  • This is a method for selecting an RNA molecule or a double-stranded chimeric NA molecule.
  • K-ras gene [2-1] in any of the RNA molecules described in [1-1], the gene is the K-ras gene and the wild-type allele. Is a K-ras (wt) allele, and the mutant allele is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele. ) It is an allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base specified in (2-1) is 5'-UCCUACCGCCAUCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecule 5'-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 2) 5'-UCCUACCGCCAGCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 3) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs in the RNA molecule.
  • the gene in any of the double-stranded RNA molecules described in [1-2], the gene is a K-ras gene and the wild-type allele is K-ras.
  • a (wt) allele wherein the mutant allele is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-UCCUACCGCCAUCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecule 5'-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 2) 5'-UCCUACCGCCAGCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 3) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the gene in any of the production methods described in [1-3], is a K-ras gene and the wild-type allele is K-ras (wt).
  • the allele is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base specified in (2-1) is 5'-UCCUACCGCCAUCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecule 5'-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 2) 5'-UCCUACCGCCAGCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 3) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs in the RNA molecule.
  • the gene is a K-ras gene and the wild-type allele is K-ras (wt).
  • Allele the allele of which is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-UCCUACCGCCAUCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecule 5'-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 2) 5'-UCCUACCGCCAGCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 3) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the tumor gene is the K-ras gene and the wild-type allele is K-ras (wt).
  • Allele the allele of which is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-UCCUACCGCCAUCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 1).
  • RNA molecule 5'-UCCUACGCCAACAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 2) 5'-UCCUACCGCCAGCAGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 3) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the gene is a K-ras gene and the wild-type allele is K-ras (wt).
  • the allele is a K-ras (c.35G> A) allele, a K-ras (c.35G> T) allele, or a K-ras (c.35G> C) allele.
  • N-ras gene [3-1] in any of the RNA molecules described in [1-1], the gene is the N-ras gene and the wild-type allele. Is an N-ras (wt) allele, and the mutant allele is an N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base specified in (2-1) is 5'-CCCAACACCACCUGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 146). 5'-GUACUCUUCUCAGCU-3'(SEQ ID NO: 147) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs in the RNA molecule.
  • the gene in any of the double-stranded RNA molecules described in [1-2], the gene is an N-ras gene and the wild-type allele is N-ras. It is a (wt) allele, and the mutant allele is an N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-CCCAACACCACCUGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 146). 5'-GUACUCUUCUCAGCU-3'(SEQ ID NO: 147) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the gene in any of the production methods described in [1-3], is an N-ras gene and the wild-type allele is N-ras (wt). Alleles, said mutant alleles are N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) alleles.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base specified in (2-1) is 5'-CCCAACACCACCUGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 146). 5'-GUACUCUUCUCAGCU-3'(SEQ ID NO: 147) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs in the RNA molecule.
  • the gene is an N-ras gene and the wild-type allele is N-ras (wt).
  • Allele the allele of which is an N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-CCCAACACCACCUGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 146). 5'-GUACUCUUCUCAGCU-3'(SEQ ID NO: 147) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the tumor gene is the N-ras gene and the wild-type allele is N-ras (wt).
  • Allele the allele of which is an N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) allele.
  • the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-CCCAACACCACCUGCUCCA-3'(SEQ ID NO: 146). 5'-GUACUCUUCUCAGCU-3'(SEQ ID NO: 147) It may have any of.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the gene is an N-ras gene and the wild-type allele is N-ras (wt). Alleles, said mutant alleles are N-ras (c.35G> A) or N-ras (c.182A> G) alleles.
  • the gene in any of the RNA molecules described in [1-1], the gene is a BRCA2 gene and the wild-type allele is BRCA2 ( wt) and the mutant allele is an A1114C mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the STK11 gene and the wild-type allele is STK11 (wt) and the mutation. Is the allele a C1062G variant allele; in any of the above RNA molecules, the gene is the PTEN gene, the wild-type allele is PTEN (wt), and the mutant allele is the C388G variant allele.
  • RNA molecules In any of the above RNA molecules, is the gene an APC gene, the wild-type allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T variant allele; any of the above RNA molecules? In, whether the gene is a GATA2 gene, the wild-type allele is GATA2 (wt), and the mutant allele is a C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene.
  • the gene in any of the RNA molecules above, the gene is the GNAQ gene and the wild-type allele is Is GNAQ (wt) and the mutant allele is an A626T mutant allele; or in any of the RNA molecules above, the gene is the IDH1 gene and the wild-type allele is IDH1 (wt).
  • the mutant allele is a G395A variant allele.
  • each base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-GGCUUCUGAUUGCUACAU-3'(SEQ ID NO: 148) 5'-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3'(SEQ ID NO: 149) 5'-ACACCAGUCGUCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 150) 5'-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3'(SEQ ID NO: 151) 5'-GAGGCCACAGGCAUGCAC-3'(SEQ ID NO: 152) 5'-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3'(SEQ ID NO: 153) 5'-CUCUGACCUUGGCCCCCU-3'(SEQ ID NO: 154) and 5'-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3'(SEQ ID NO: 155) May have.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucle
  • the gene in any of the double-stranded RNA molecules described in [1-2], the gene is the BRCA2 gene and the wild-type allele is BRCA2 (wt). Is the mutant allele an A1114C mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the STK11 gene, the wild-type allele is STK11 (wt), and the mutant allele is C1062G.
  • RNA molecules Is it a mutant allele; in any of the above RNA molecules, is the gene the PTEN gene, the wild allele is PTEN (wt), and the mutant allele is the C388G mutant allele; In any of the RNA molecules, whether the gene is an APC gene, the wild-type allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T mutant allele; Whether the gene is the GATA2 gene, the wild-type allele is GATA2 (wt), and the mutant allele is the C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene.
  • the mutant allele is a T818C mutant allele; in any of the above RNA molecules, the gene is the GNAQ gene and the wild-type allele is GNAQ (wt). ), And the mutant allele is an A626T mutant allele; or in any of the above RNA molecules, the gene is the IDH1 gene and the wild-type allele is IDH1 (wt). The mutant allele is a G395A variant allele.
  • each base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-GGCUUCUGAUUGCUACAU-3'(SEQ ID NO: 148) 5'-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3'(SEQ ID NO: 149) 5'-ACACCAGUCGUCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 150) 5'-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3'(SEQ ID NO: 151) 5'-GAGGCCACAGGCAUGCAC-3'(SEQ ID NO: 152) 5'-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3'(SEQ ID NO: 153) 5'-CUCUGACCUUGGCCCCCU-3'(SEQ ID NO: 154) and 5'-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3'(SEQ ID NO: 155) May have.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucle
  • the gene in any of the production methods described in [1-3], is a BRCA2 gene and the wild-type allergen is BRCA2 (wt). Whether the mutant allele is an A1114C mutant allele; in any of the above RNA molecules, the gene is the STK11 gene, the wild-type allele is STK11 (wt), and the mutant allele is the C1062G mutant allele. In any of the above RNA molecules, is the gene the PTEN gene, the wild-type allele is PTEN (wt), and the mutant allele is the C388G variant allele; any of the above.
  • RNA molecule is the gene an APC gene, the wild-type allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T variant allele; in any of the RNA molecules, the gene is GATA2. Whether the gene is GATA2 (wt) and the mutant allele is a C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene and the wild type. Whether the allele is MYD88 (wt) and the mutant allele is a T818C mutant allele; in any of the RNA molecules above, the gene is the GNAQ gene and the wild-type allele is GNAQ (wt).
  • the mutant allele is an A626T mutant allele; or in any of the above RNA molecules, the gene is the IDH1 gene, the wild-type allele is IDH1 (wt), and the mutant allele is It is a G395A variant allergen.
  • each base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-GGCUUCUGAUUGCUACAU-3'(SEQ ID NO: 148) 5'-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3'(SEQ ID NO: 149) 5'-ACACCAGUCGUCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 150) 5'-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3'(SEQ ID NO: 151) 5'-GAGGCCACAGGCAUGCAC-3'(SEQ ID NO: 152) 5'-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3'(SEQ ID NO: 153) 5'-CUCUGACCUUGGCCCCCU-3'(SEQ ID NO: 154) and 5'-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3'(SEQ ID NO: 155) May have.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucle
  • the gene in any of the RNA interference methods described in [1-4], is a BRCA2 gene and the wild-type allele is BRCA2 (wt).
  • the mutant allele is an A1114C mutant allele; in any of the above RNA molecules, the gene is the STK11 gene, the wild-type allele is STK11 (wt), and the mutant allele is the C1062G variant. Is it an allele; in any of the above RNA molecules, whether the gene is a PTEN gene, the wild-type allele is PTEN (wt), and the mutant allele is a C388G mutant allele; any of the above.
  • the gene is an APC gene, the wild-type allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T variant allele; in any of the RNA molecules, the gene is Whether the GATA2 gene and the wild-type allele is GATA2 (wt) and the mutant allele is a C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene and the wild Whether the type allele is MYD88 (wt) and the mutant allele is a T818C variant allele; in any of the RNA molecules above, the gene is the GNAQ gene and the wild-type allele is GNAQ (wt).
  • the mutant allele an A626T mutant allele; or in any of the above RNA molecules, the gene is the IDH1 gene and the wild-type allele is IDH1 (wt) and the mutant allele. Is a G395A variant allergen.
  • each base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-GGCUUCUGAUUGCUACAU-3'(SEQ ID NO: 148) 5'-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3'(SEQ ID NO: 149) 5'-ACACCAGUCGUCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 150) 5'-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3'(SEQ ID NO: 151) 5'-GAGGCCACAGGCAUGCAC-3'(SEQ ID NO: 152) 5'-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3'(SEQ ID NO: 153) 5'-CUCUGACCUUGGCCCCCU-3'(SEQ ID NO: 154) and 5'-AUAAGCAUGACGACCUAUG-3'(SEQ ID NO: 155) May have.
  • one or more ribonucleotides in the double-stranded RNA molecule may be replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucle
  • the tumor gene is the BRCA2 gene and the wild allele is BRCA2 (wt).
  • the mutant allele is an A1114C mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the STK11 gene, the wild allele is STK11 (wt), and the mutant allele is the C1062G variant. Is it an allele; in any of the above RNA molecules, is the gene the PTEN gene, the wild allele is PTEN (wt), and the mutant allele is the C388G mutant allele; any of the above.
  • the gene is an APC gene, the wild allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is Whether the GATA2 gene and the wild allele is GATA2 (wt) and the mutant allele is a C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene and the wild Whether the type allele is MYD88 (wt) and the mutant allele is a T818C mutant allele; in any of the RNA molecules above, the gene is the GNAQ gene and the wild allele is GNAQ (wt).
  • the mutant allele is an A626T mutant allele; or in any of the RNA molecules, the gene is the IDH1 gene and the wild allele is IDH1 (wt) and the mutant allele. Is a G395A variant allele.
  • each base sequence complementary to the coding region of the mutant allele containing the base defined in (2-1) is 5'-GGCUUCUGAUUGCUACAU-3'(SEQ ID NO: 148) 5'-CCUCGAUGUCGAAGAGGUC-3'(SEQ ID NO: 149) 5'-ACACCAGUCGUCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 150) 5'-GGUACUUCUCGCUUGGUUU-3'(SEQ ID NO: 151) 5'-GAGGCCACAGGCAUGCAC-3'(SEQ ID NO: 152) 5'-GAUGGGGAUCAGUCGCUUC-3'(SEQ ID NO: 153) 5'-CUCUGACCUUGGCCCCCU-3'(SEQ ID NO: 154) and 5'-AUAA
  • the gene in any of the selection methods described in [1-6], is a BRCA2 gene and the wild-type allele is BRCA2 (wt). Whether the mutant allele is an A1114C mutant allele; in any of the above RNA molecules, the gene is the STK11 gene, the wild-type allele is STK11 (wt), and the mutant allele is the C1062G mutant allele. In any of the above RNA molecules, is the gene the PTEN gene, the wild-type allele is PTEN (wt), and the mutant allele is the C388G variant allele; any of the above.
  • RNA molecule is the gene an APC gene, the wild-type allele is APC (wt), and the mutant allele is a C4348T variant allele; in any of the RNA molecules, the gene is GATA2. Whether the gene is GATA2 (wt) and the mutant allele is a C953T mutant allele; in any of the RNA molecules, the gene is the MYD88 gene and the wild type. Whether the allele is MYD88 (wt) and the mutant allele is a T818C mutant allele; in any of the RNA molecules above, the gene is the GNAQ gene and the wild-type allele is GNAQ (wt).
  • the 11th siRNA targeting the K-ras gene is associated with the position of a point mutation, the base at the 5'end of the guide strand of the siRNA is replaced with guanine to uracil, and the passenger strand is used.
  • the 11th siRNA targeting the K-ras gene is associated with the position of a point mutation, the base at the 5'end of the guide strand of the siRNA is replaced with guanine to uracil, and the passenger strand is used.
  • the 11th siRNA targeting the K-ras gene is associated with the position of the point mutation, the base at the 5'end of the guide strand of the siRNA is replaced from guanine to uracil, and the passenger strand is subjected to.
  • the 5'-terminal base is replaced with uracil to guanine, and in the 6th to 8th ribonucleotides of the siRNA guide strand, the 2'position of the pentacarbon sugar is replaced with OCH 3 , and the siRNA guide strand 3-7.
  • the A mutant allele-specific siRNA of the K-ras gene is a wild-type allele, a T-mutant K-ras (c.35G> T) allele and a C-mutant K-ras (c). .35G> C) It is a graph which shows the result of having investigated the expression suppression ability with respect to an allele. It is a graph which shows the result of having investigated the expression-suppressing ability of the T mutant allele-specific siRNA of the K-ras gene against the wild-type allele, the A mutant allele, and the C mutant allele in one example of the present invention.
  • a point mutation at the 35th nucleotide of the cDNA of the N-ras gene is targeted, and the 11th siRNA is an A mutant N-ras (c.35G> A) allele (hereinafter, A variant).
  • the 5'end base of the siRNA guide strand is replaced with cytosine to uracil, and the 5'end base of the passenger chain is replaced with adenine to guanine.
  • the 2'position of the pentacarbon sugar was replaced with OCH 3 , and the 5th base of the guide strand of the siRNA was mismatched with the base of the A mutant N35 allele. It is a graph which shows the result of having examined the expression
  • a point mutation in the 182nd nucleotide of the cDNA of the N-ras gene is targeted, and the 11th siRNA is an A mutant N-ras (c.182A> G) allele (hereinafter, G variant).
  • G variant N-ras (c.182A> G) allele
  • the 5'-terminal base of the siRNA guide strand is replaced with guanine to uracil
  • the 5'-terminal base of the passenger chain is replaced with guanine to guanine.
  • the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly expresses from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the A1114C mutant allele of the BRCA2 gene. It is a graph which shows the result which shows that it suppresses.
  • the results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the C1062G mutant allele of the STK11 gene. It is a graph. The results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the C388G mutant allele of the PTEN gene. It is a graph.
  • the results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the C4348T mutant allele of the APC gene. It is a graph. The results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the C953T mutant allele of the GATA2 gene. It is a graph.
  • the results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the T818C mutant allele of the MYD88 gene. It is a graph.
  • the results show that the siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the A626T mutant allele of the GNAQ gene. It is a graph.
  • siRNA having the sequence of the present disclosure hardly suppresses the expression from the wild-type allele and strongly suppresses the expression from the mutant allele with respect to the wild-type allele and the G395A mutant allele of the IDH1 gene. It is a graph.
  • siRNA that specifically suppresses expression from a mutant allele with respect to expression from an exogenous reporter in cultured cells is similar to expression from an endogenous gene. It is a graph which shows the result which shows having specificity. It is a graph which shows the result which shows that siKRAS-A can suppress the growth of a tumor cell in vivo in one Example of this invention.
  • the target gene is not particularly limited as long as the RNA molecule of the present disclosure can be designed, but it is preferably an oncogene in which normal cells become cancerous by a point mutation.
  • the number of nucleotides constituting the RNA molecule is not particularly limited, but may be 13 or more and 100 or less, 13 or more and 50 or less, 13 or more and 28 or less, and 15 or more and 25 or less. The number may be 17 or more and 21 or less, but more preferably 19 or more and 21 or less.
  • RNA molecule is referred to as a chimeric NA molecule, but in the present disclosure, the RNA molecule will be described including the chimeric NA molecule.
  • the 5th or 6th base is mismatched with the base of the mutant allele, but other than that. It has a base sequence complementary to the coding region of the mutant allele in the portion.
  • This RNA molecule may have a sequence other than the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele, for example, it may have a sequence complementary to the complementary base sequence, thereby self. It may be annealed and function as a siRNA.
  • Bonac nucleic acid can be exemplified as such a single-stranded RNA. Alternatively, 1 to 3 nucleotides may be bound to the 3'end, and the base sequence thereof is not particularly limited.
  • RNA molecule may be replaced with adenine or uracil or thymine. If the base on the 3'side of the complementary base sequence is not cytosine or guanine, it may be replaced with cytosine or guanine.
  • this RNA molecule may have a chemical substance other than nucleic acid for delivery, for enhancing membrane permeability, or for improving blood retention.
  • the RNA molecule may be conjugated to GalNAc or PEG.
  • the RNA molecule may consist of a sequence other than the base sequence complementary to the coding region of the mutant allele.
  • the RNA molecule has a base sequence complementary to the mutant allele except for the 5th or 6th base, but preferably has 90% or more complementarity, and 95% or more complementarity. More preferably, it has 98% or more complementarity, and most preferably 100% complementarity.
  • the 5th or 6th base is not particularly limited as long as it does not match the mutant allele, and if it is a base other than the base of the mutant allele at that location, A, U, C, G, T, I or , Other artificial nucleic acids / nucleic acid analogs may be used.
  • the 10th or 11th corresponds to the position of the point mutation, and the base is possessed by the mutant allele. It is a base corresponding to a base. That is, when the mutated bases of the mutant allele are adenine, cytosine, guanine and thymine, the 10th or 11th RNA molecule is adenine, cytosine, guanine and uracil (or thymine), respectively.
  • RNA in which the 2'position of pentose is replaced with -OCH 3 (hereinafter referred to as 2'-O-methyl RNA) has the structure of the following general formula.
  • halogen is not particularly limited, but fluorine is preferable because of its small molecular size. Nucleotides other than these locations may be partially or wholly modified, but it is preferred that all nucleotides are unmodified.
  • the modification of the nucleotide is not particularly limited, but the 2'position of the pentose contained therein is H, OR, R, halogen, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , CN, COOR, and LNA (in the formula).
  • R represents C 1 -C 6 alkyl, alkenyl, alkynyl, or aryl; halogen, F, Cl, can be exemplified be substituted by a group selected from the group consisting of Br or I).
  • the IC50 for the target gene of the RNA molecule is preferably 1 nM or less, more preferably 500 pM or less, and even more preferably 200 pM or less.
  • RNA molecule When this RNA molecule is used as it is in the RNA interference method as it is, it is preferable that its 5'end is phosphorylated or can be phosphorylated in situ or in vivo.
  • the design method of this RNA molecule includes the following steps.
  • the mutated base of the mutant allele is set as the 10th or 11th base counting from the base on the 5'side, and a base sequence of a predetermined length having a sequence complementary to the base sequence of the mutant allele is determined. Perform the process. Next, a step of converting the 5th or 6th base counting from the 5'-side base into a mismatched base is performed. Then, it is assumed that the 6-8th or 7-8th nucleotides counting from the base on the 5'side are modified with OCH 3 , halogen, or LNA at the 2'position of the pentoses they have. ..
  • the base on the 5'side of the complementary base sequence is not adenine or uracil
  • a step of substituting with adenine or uracil or thymine may be performed.
  • the base on the 3'side of the complementary base sequence is not cytosine or guanine
  • a step of substituting with cytosine or guanine may be performed.
  • a step of adding 1-3 bases to the 3'side may be performed.
  • a program may be created to allow a computer to perform this design method, or the program may be stored in a computer-readable recording medium. Nucleotides having a base sequence designed in this manner can be chemically synthesized according to a conventional method.
  • the second RNA molecule has a sequence complementary to the first RNA molecule and forms a double strand with the first RNA molecule under physiological conditions, but preferably has 90% or more complementarity. , 95% or more complementarity is more preferable, 98% or more complementarity is further preferable, and 100% complementarity is most preferable.
  • the chain length of the passenger strand is not particularly limited and may be considerably shorter than that of the first RNA molecule. For example, it may be less than half of the first RNA molecule, but it is preferably the same length. If the passenger strand is shorter than the first RNA molecule, the first RNA molecule will have a single-strand portion, which may be in a single-strand state, but a third complementary to the first RNA molecule. RNA molecules may be bound. When the second RNA molecule and the third RNA molecule bind to the entire first RNA molecule, it is in the same state as if one passenger strand contains a nick and is separated into two.
  • Both ends of the double-stranded RNA molecule may be blunt-ended, but have overhangs at the 3'end of the first RNA molecule, which is the guide strand, and / or at the 3'end of the second RNA molecule, which is the passenger strand. You may.
  • the number of nucleotides in the overhang is not particularly limited, but is preferably 1 to 3.
  • Both the guide chain and passenger chain nucleotide chains may be double-stranded chimeric NA molecules in which one or more ribonucleotides are replaced with deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids, or nucleic acid analogs.
  • the nucleotides that make up the passenger chain may be modified, but are preferably unmodified.
  • the modification of the nucleotide is not particularly limited, but the 2'position of the pentose contained therein is H, OR, R, halogen, SH, SR 1 , NH 2 , NHR, NR 2 , CN, COOR, and LNA (formula).
  • R C 1 -C 6 alkyl, alkenyl, alkynyl or aryl, is; halogen, F, Cl, can be exemplified be substituted by a group selected from the group consisting of Br or I).
  • Passenger chains can also be easily designed and easily manufactured according to well-known technology.
  • the guide chain and the passenger chain may be bonded by a linker.
  • the constituent material of the linker is not particularly limited, but may be a peptide, PEG, or the like.
  • This RNA interference method introduces a first RNA molecule containing a chimeric NA molecule or the above-mentioned double-stranded RNA molecule containing a double-stranded chimeric NA molecule into cells having a wild-type allele and a mutant allele. Includes steps.
  • the RNA interference method can be easily performed according to a well-known technique.
  • the expression of a target gene can be reduced by introducing a first RNA molecule or a double-stranded RNA molecule into a cultured cell expressing the target gene, or a human or non-human organism. it can.
  • the expression of the wild-type allele of the target gene is not substantially suppressed, and the expression from the mutant allele is mainly performed. It can be suppressed.
  • the expression of the wild-type allele may be suppressed to the extent that the wild-type allele functions and brings about a normal phenotype.
  • Expression of the mutant allele may be suppressed to the extent that the mutant allele does not function and results in an abnormal phenotype. This allows, for example, if the mutant allele has a dominant mutation, the cell can function normally without expressing the phenotype due to the mutation.
  • the target disease is not particularly limited, but one embodiment of the present invention is also referred to as a tumor gene (proto-oncogene, tumor suppressor gene, cancer suppressor gene, etc.).
  • a tumor gene proto-oncogene, tumor suppressor gene, cancer suppressor gene, etc.
  • the RNA molecule containing the above-mentioned chimeric NA molecule or the double-stranded RNA molecule containing the double-stranded chimeric NA molecule is used as an active ingredient.
  • the administration method is not particularly limited, but injection is preferable, and intravenous injection is more preferable.
  • a pH regulator, a buffer, a stabilizer, an isotonic agent, a local anesthetic, or the like may be added to the therapeutic agent.
  • the dose is not particularly limited, and the efficacy of the contained ingredients, the form of administration, the route of administration, the type of disease, the nature of the subject (weight, age, medical condition and the use of other drugs, etc.), and the judgment of the attending physician. It is appropriately selected according to such factors.
  • the disease when the siRNA of the present disclosure serves as a therapeutic agent is not particularly limited as long as the disease is caused by the expression of a mutant gene, but it is preferably a tumor as described above.
  • K-ras gene, N-ras gene, BRCA gene, STK11 gene, PTEN gene, APC gene, GATA2 gene, MYD88 gene, GNAQ gene, and IDH1 gene are targeted for suppression, respectively.
  • Mutations in the STK11 gene such as colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, leukemia, etc., depending on the mutation in the ras gene, colon cancer, thyroid cancer, skin cancer, etc. in the mutation of the N-ras gene, breast cancer, ovarian cancer, etc.
  • PTEN erroneous tumor syndromes such as cervical malignant adenomatous, Peutz-Jeghers syndrome, gastric cancer, breast cancer, ovarian cancer, Cowden syndrome, Lhermitte-Duclos disease, Banyan-Riley-Ruvalcaba syndrome, Proteus syndrome, etc.
  • FAP familial adenomatous polyposis
  • liver cancer depending on the mutation of the APC gene
  • MonoMAC syndrome and acute meganuclear blast leukemia depending on the mutation of the GATA2 gene
  • lymphoma depending on the mutation of the MYD88 gene.
  • RNA interference method When the RNA interference method is performed in vitro, a wild-type allele of the gene and a mutant allele having a single-base point mutation are used as the target gene, and the expression of the wild-type allele is suppressed above a predetermined level. However, select a molecule that suppresses the expression of the mutant allele above a predetermined level. This makes it possible to obtain a molecule that suppresses the expression of the mutant allele and does not suppress the expression of the wild-type allele.
  • the numerical value of the predetermined level is not particularly limited, but 50% is preferable, 70% is more preferable, and 90% is further preferable.
  • the siRNA disclosed herein does not suppress expression from wild-type alleles, but specifically expression from mutant alleles, relative to expression from exogenous reporters in cultured cells. Indicates to suppress.
  • (Method) HeLa cells cultured in DMEM containing 10% FBS were seeded on a 24-well plate at a density of 1x10 5 cells / mL, and 100 ng of each reporter and 100 ng of internal standard plasmid (pGL3) and double-stranded siRNA were added to 2 ⁇ L. Cotransfected with lipofectamine 2000. The concentration of double-stranded siRNA is shown in each figure. In addition, siGY441 was introduced as the control siRNA.
  • the K-ras gene was used as the target gene for expression suppression.
  • Example 1A-1 In this example, the 10th or 11th siRNA is mutated from G to A in the A mutant K-ras (c.35G> A) allele (in cDNA (GENE ID: 3845), the 35th base is mutated from G to A) (hereinafter , A mutant K-ras (c.35G>) compared to wild K-ras allele (hereinafter referred to as wild allele) by corresponding to the position of the point mutation of (A mutant allele).
  • a mutant K-ras compared to wild K-ras allele (hereinafter referred to as wild allele) by corresponding to the position of the point mutation of (A mutant allele).
  • DNA having the same base sequence as the wild-type K-ras (wt) allele and the A mutant K-ras (c.35G> A) allele is chemically synthesized and expressed.
  • a wild-type K reporter and an A mutant K reporter were prepared by inserting into the 3'-UTR of the luciferase gene of the vector (psiCHECK). The sequences of the parts incorporated into the vector are shown below.
  • siRNA a double-stranded RNA having the following sequence was chemically synthesized.
  • the siRNAs K (35) 9A, K (35) 10A, and K (35) 11A are point A mutant K-ras (c.35G> A) alleles at positions 9, 10, and 11, respectively. Corresponds to the location of the mutation. In the sequence below, the base pairs corresponding to the position of the point mutation are surrounded by ⁇ .
  • FIG. 1 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • K (35) 9A had a strong expression-suppressing effect on both the A mutant allele and the wild-type allele.
  • the expression-suppressing effect of K (35) 10A and K (35) 11A was slightly weakened, the expression of the A mutant allele was more strongly suppressed than that of the wild-type allele.
  • the 11th siRNA corresponds to the position of the point mutation in the A mutant allele, and then the base at the 5'end of the guide strand of the siRNA is replaced with uracil from guanine to 5'of the passenger strand. It is shown that by using siRNA in which the terminal base is replaced with uracil to guanine, the ability to suppress the expression of RNA molecule against A mutant allele is strengthened, and its specificity is further improved.
  • a wild-type K reporter and an A mutant K reporter were used as reporters for investigating the gene expression inhibitory effect
  • double-stranded RNA having the following sequence was chemically synthesized as siRNA, and K (35) 11A was used as a control. ..
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation and the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain are surrounded by ⁇ .
  • FIG. 2 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • K (35) 11A strongly suppressed the expression of the A mutant allele rather than the wild-type allele, whereas K (35) 11Arev had a stronger expression-suppressing effect on both, and A was stronger than the wild-type allele. The expression of the mutant allele is further suppressed.
  • the 11th siRNA corresponds to the point mutation position of the A mutant allele
  • the 5'end base of the guide strand of the siRNA is replaced with uracil from guanine
  • the 5'end base of the passenger strand is replaced.
  • the 2'position of the pentacarbon sugar is replaced with OCH 3 in the 6th to 8th ribonucleotides of the siRNA guide strand to express the RNA molecule for the A mutant allele. It is shown that the inhibitory ability is strengthened and its specificity is further improved.
  • a wild-type K reporter and an A mutant K reporter were used as reporters for examining the gene expression inhibitory effect, a double-stranded RNA having the following sequence was chemically synthesized as siRNA, and K (35) 11Arev was used as a control. ..
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation and the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and passenger chain are surrounded by ⁇ , and the 2'position of the pentose is OCH.
  • the nucleotide substituted with 3 is marked with a shadow.
  • FIG. 3 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • K (35) 11Arev strongly suppressed the expression of the A mutant allele rather than the wild-type allele, but K (35) 11ArevOM (6-8) had a stronger expression-suppressing effect on both.
  • the expression of the A mutant allele is more strongly suppressed than that of the wild-type allele.
  • Another control, K (35) 11ArevOM (2-5), in which the 2'position of the pentose is replaced by OCH 3 in the 2nd to 5th ribonucleotides of the guide strand, is for both.
  • the expression-suppressing effect was considerably weakened.
  • the 11th siRNA corresponds to the point mutation position of the A mutant allele
  • the 5'end base of the guide strand of the siRNA is replaced with uracil from guanine
  • the 5'end base of the passenger chain is replaced.
  • a wild-type K reporter and an A mutant K reporter were used as reporters for investigating the gene expression inhibitory effect, and as siRNA, based on K (35) 11Arev, the following sequence having a mismatch at the 3rd to 7th bases Double-stranded RNA was chemically synthesized and K (35) 11Arev was used as a control.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ .
  • FIG. 4 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • K (35) 11Arev strongly suppressed the expression of the A mutant allele rather than the wild-type allele
  • K (35) 11ArevM5 and K (35) 11ArevM6 had the ability to suppress the expression of RNA molecules against the wild-type allele.
  • K (35) 11ArevM5 and K (35) 11ArevM6 had the ability to suppress the expression of RNA molecules against the wild-type allele.
  • K (35) 11ArevM5 and K (35) 11ArevM6 had the ability to suppress the expression of RNA molecules against the wild-type allele.
  • the specificity for the A mutant allele was further improved.
  • the 11th siRNA corresponds to the position of the point mutation of the A mutant allele
  • the base at the 5'end of the guide strand of the siRNA is replaced with uracil from guanine
  • the base at the 5'end of the passenger strand was replaced with uracil to guanine
  • the 2'position of the pentacarbon sugar was replaced with OCH 3 in the 6th to 8th ribonucleotides of the siRNA guide strand.
  • the 6th to 8th ribonucleotides of the siRNA guide strand were replaced.
  • a wild-type K reporter and an A mutant K reporter were used as reporters for investigating the gene expression inhibitory effect, and as siRNA, based on K (35) 11Arev, the following sequence having a mismatch at the 3rd to 7th bases Double-stranded RNA was chemically synthesized and K (35) 11Arev was used as a control.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the pentose is used. Nucleotides with the 2'position of the sugar substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • FIG. 5 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • K (35) 11ArevOM (6-8) M5 and K (35) 11ArevOM (6-8) M6 have a very weak ability to suppress the expression of RNA molecules against wild-type alleles, resulting in specificity for A mutant alleles. The sex has improved further.
  • the A mutant allele-specific siRNA is not only a wild-type allele, but also a T-mutant K-ras (c.35G> T) allele (in the cDNA, the 35th base is mutated from G to T). ) And C mutant K-ras (c.35G> C) allele (in cDNA, the 35th base is mutated from G to C) has low expression inhibitory ability.
  • K-ras reporters As a reporter for investigating the gene expression inhibitory effect, the following K-ras reporters, wild-type K reporter, A mutant K reporter, and T mutant K-ras (c.35G> T) reporter (hereinafter, T mutation)
  • T mutation Using a C mutant K-ras (c.35G> C) reporter (hereinafter referred to as a C mutant K reporter) as a siRNA, K (35) 11ArevOM (6-8) M5 and K (35) 11ArevOM (6-8) M6 was used and K (35) 11Arev was used as a control.
  • K (35) 11ArevOM (6-8) M5 and K (35) 11ArevOM (6-8) M6 was used and K (35) 11Arev was used as a control.
  • the base pairs corresponding to the position of the point mutation are surrounded by ⁇ .
  • FIG. 6 shows the gene expression inhibitory effect on each reporter. All siRNAs had the strongest expression-suppressing effect on the A mutant K reporter, but K (35) 11ArevOM (6-8) M5 and K (35) 11ArevOM (6-8) M6 were T mutants. The expression-suppressing effect on the type K reporter and the C mutant type K reporter was weak.
  • Example 1A-7 In this example, it is shown that the T mutant allele-specific siRNA has a low ability to suppress the expression of not only the wild-type allele but also the A mutant allele and the C mutant allele.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the pentose is used. Nucleotides with the 2'position of the sugar substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • FIG. 7 shows the gene expression inhibitory effect on each reporter. All siRNAs had the strongest expression-suppressing effect on the T mutant K reporter, but K (35) 11TrevOM (6-8) M5 and K (35) 11TrevOM (6-8) M6 were particularly T-mutated. The expression-suppressing effect on the type K reporter and the C mutant type K reporter was weak.
  • Example 1A-8 In this example, it is shown that the C mutant allele-specific siRNA has a low ability to suppress the expression of not only the wild-type allele but also the A mutant allele and the T mutant allele.
  • K-ras reporters As a reporter for investigating the gene expression inhibitory effect, the following K-ras reporters, wild-type K reporter, A mutant K reporter, T mutant T mutant K reporter, and C mutant K reporter, were used as siRNA. , K (35) 11CrevOM (6-8) M5 and K (35) 11CrevOM (6-8) M6 were used, and K (35) 11Crev was used as a control.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the pentose is used. Nucleotides with the 2'position of the sugar substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • FIG. 8 shows the gene expression inhibitory effect on each reporter. All siRNAs had the strongest expression-suppressing effect on the C mutant K reporter, but K (35) 11CrevOM (6-8) M5 and K (35) 11CrevOM (6-8) M6 were particularly A mutants. The expression-suppressing effect on the type K reporter and the T mutant K reporter was weak. [Example 1B]
  • the N-ras gene was used as the target gene for expression suppression.
  • Example 1B-1 a point mutation at the 35th nucleotide of the N-ras gene cDNA is targeted, and the 11th siRNA is referred to as an A mutant N-ras (c.35G> A) allele (hereinafter referred to as an A mutant N35 allele).
  • the base at the 5'end of the guide strand of siRNA was replaced with uracil from citocin
  • the base at the 5'end of the passenger strand was replaced with guanine from adenin
  • 6 of the guide strand corresponds to the position of the point mutation (referred to as).
  • the wild type N allele when the 2'position of the pentacarbon sugar is replaced with OCH 3 and the 5th base of the guide strand of siRNA is mismatched with the base of the A mutant N35 allele, the wild type It is shown that the expression of the A mutant N35 allele is more specifically suppressed than the expression of the N-ras (wt) allele (hereinafter referred to as wild type N allele).
  • a DNA having the same base sequence as the wild-type N allele and the A mutant N35 allele was inserted into the 3'-UTR of the luciferase gene of the expression vector (psiCHECK), and the wild-type N35 reporter was used. And A mutant N reporter was prepared.
  • the sequences chemically synthesized and incorporated into the vector are shown below. In the sequence below, the base pairs corresponding to the position of the point mutation are surrounded by ⁇ .
  • N (35) 11G has a sequence complementary to the wild-type N allele.
  • N (35) 11A is a siRNA in which the 11th nucleotide is associated with the position of a point mutation in the A mutant N35 allele.
  • N (35) 11ArevOM (6-8) M5 maps the 11th nucleotide to the point mutation position of the A mutant N35 allele, replaces the 5'end base of the guide strand with cytosine to uracil, and is a passenger.
  • the base at the 5'end of the strand is replaced with cytosine from uracil, the 2'position of the pentacarbon sugar is replaced with OCH 3 in the 6th to 8th ribonucleotides of the guide strand, and the 5th of the guide strand of the siRNA. It is a siRNA in which the nucleotide of A mutant N35 allele is mismatched with the nucleotide of.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the pentose is used. Nucleotides with the 2'position of the sugar substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • FIG. 9 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • N (35) 11G effectively suppresses the expression of the wild-type N allele from the expression of the A mutant N35 allele
  • N (35) 11A is the A mutant from the expression of the wild-type N allele.
  • the expression of the N35 allele was effectively suppressed.
  • N (35) 11ArevOM (6-8) M5 has a very weak ability to suppress the expression of wild-type alleles and a strong ability to suppress the expression of the A mutant N35 allele, resulting in specificity for the A mutant N35 allele. Improved.
  • Example 1B-2 In this example, a point mutation in the cDNA 182nd nucleotide of the N-ras gene is targeted, and the 11th siRNA is referred to as an A mutant N-ras (c.182A> G) allele (hereinafter referred to as a G mutant N182 allele).
  • the base at the 5'end of the guide strand of siRNA was replaced with uracil from guanine
  • the nucleotide at the 5'end of the passenger strand was replaced with guanine from adenine to 6 of the guide strand.
  • the wild type N allele when the 2'position of the pentacarbon sugar is replaced with OCH 3 and the 5th base of the guide strand of siRNA is mismatched with the base of the G mutant N182 allele, the wild type It is shown that the expression of the G mutant N182 allele is more specifically suppressed than the expression of the N-ras (wt) allele (hereinafter referred to as wild type N allele).
  • a DNA having the same nucleotide sequence as the G mutant N182 allele was inserted into the 3'-UTR of the luciferase gene of the expression vector (psiCHECK) to prepare a G mutant N182 reporter.
  • the sequences chemically synthesized and incorporated into the vector are shown below.
  • N (182) 11A has a sequence complementary to the wild-type N allele.
  • N (182) 11G is a siRNA in which the 11th nucleotide is associated with the position of a point mutation in the G mutant N182 allele.
  • N (182) 11GrevOM (6-8) M5 maps the 11th nucleotide to the point mutation position of the A182 mutant N allele, replaces the 5'end base of the guide strand with guanine to uracil, and is a passenger.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the pentose is used. Nucleotides with the 2'position of the sugar substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • FIG. 10 shows the gene expression inhibitory effect of each siRNA.
  • N (182) 11A effectively suppressed the expression of the wild-type N182 allele from the expression of the G mutant N182 allele
  • N (182) 11G was the A mutant from the expression of the wild-type N182 allele.
  • the expression of the N182 allele was effectively suppressed.
  • N (182) 11ArevOM (6-8) M5 lost the ability to suppress the expression of wild-type alleles, and the ability to suppress the expression of the G mutant N182 allele was slightly weakened, resulting in improved specificity for the G mutant 182 allele. ..
  • Example 1C In this example, the wild allele of the BRCA2 gene and the A1114C mutant allele (in the cDNA (GENE ID: 675), the 1114th base is mutated from A to C), the wild allele of the STK11 gene and the C1062G mutant allele ( In the cDNA (GENE ID: 6794), the 1062nd base is mutated from C to G), the wild allele of the PTEN gene and the C388G mutant allele (in the cDNA (GENE ID: 5728), the 388th base is C to G).
  • APC gene wild allele and C4348T mutant allele in cDNA (GENE ID: 324), the 4348th base is mutated from C to T), GATA2 gene wild allele and C953T mutant allele (cDNA) In (GENE ID: 2624), the 953th base is mutated from C to T), the wild allele of the MYD88 gene and the T818C mutant allele (in the cDNA (GENE ID: 4615), the 818th base is mutated from T to C).
  • DNA having the same base sequence as each allele was chemically synthesized and inserted into the 3'-UTR of the luciferase gene of the expression vector (psiCHECK) to prepare a reporter.
  • the sequences of the parts incorporated into the vector are shown below.
  • siRNA double-stranded RNA having the following sequence was chemically synthesized, and a reporter assay was performed using these reporters and siRNA in the same manner as in Example 1A. The results of each are shown in FIG.
  • siBRCA2_wt was introduced as the control siRNA, and the measured value obtained by the double-stranded siRNA was shown in the graph of FIG. 11 with the measured value obtained by siBRCA2_wt as 100%.
  • wt is siRNA produced based on the sequence of the wild-type gene.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the 2'position of the pentose is placed.
  • Nucleotides substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • the siRNA corresponding to the wild-type sequence suppresses expression from both the wild-type and variant alleles, whereas the siRNA disclosed herein is from the wild-type allele. Expression is hardly suppressed, while expression from mutant alleles is strongly suppressed.
  • siRNA that specifically suppresses expression from mutant alleles in cultured cells with respect to expression from exogenous reporters has similar specificity to expression of endogenous genes. Indicates to have.
  • BxPC-3 (35th base is G / G: wild-type homozygous) and AsPC-1 (35th base is A / A: A type mutation), which are cell lines derived from pancreatic adenocarcinoma. Homo-conjugated) and PANC-1 (35th base is G / A: A-type mutant heterozygous) cells are adherently cultured, and siGY441 (negative control) is applied to Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific).
  • siKRAS-62 (possive control: siRNA that suppresses all K-ras mRNAs), siKRAS-WT (wild-type K-ras-specific siRNA) and siKRAS-A (A mutant-specific siRNA: K (35) 11ArevOM ( Using 6-8) M6)
  • Transfection was performed once a day at a concentration of 50 nM each for 3 consecutive days.
  • mRNA was isolated from some cells, cDNA was prepared by reverse transcription reaction, and K-ras mRNA was quantified using a quantitative PCR method.
  • the expression level of siGY441 was set to 100, and the expression level when each siRNA was introduced was expressed as a relative value. The result is shown in FIG.
  • wt is a siRNA made based on the sequence of the wild-type gene.
  • the base pair corresponding to the position of the point mutation, the base pair substituted at the 5'end of the guide chain and the passenger chain, and the base pair having a mismatch are surrounded by ⁇ , and the 2'position of the pentose is placed.
  • Nucleotides substituted with OCH 3 are marked with shadows.
  • siKRAS-62 and siKRAS-WT strongly suppressed the expression in the wild-type homozygous BxPC-3, and siKRAS-62 in the A-mutant homozygous AsPC-1.
  • siKRAS-A strongly suppresses the expression
  • PANC-1 which is an A mutant heterozygous
  • siKRAS-62 strongly suppresses the expression
  • siKRAS-WT and siKRAS-A weakly suppress the expression, which are endogenous genes.
  • the genotype of each cell and the specificity of each siRNA corresponded to each other. In this way, each siRNA can suppress the expression of an endogenous gene expression with the same specificity as that of an exogenous gene expression such as a reporter.
  • siKRAS-A can suppress the growth of tumor cells in vivo.
  • Three nude mice (BALB / cAJcl-Foxn1 null ) were subcutaneously transplanted with 1.0x10 6 AsPC-1 cells at 5-6 locations, and the tumor volume was measured twice a week with a caliper. The growth potential of the tumor was evaluated. Since the tumor size on the 10th day after transplantation had increased about twice as much as that on the 3rd day after transplantation, it was judged that the tumor was in the growth phase, and 5 ⁇ g of siRNA was determined every other week from the 11th day after transplantation.
  • siKRAS-A A mixture of (siCont, siKRAS-WT, or siKRAS-A) and the transfection reagent in vivo JET PEI (Polyplus Transfection) was directly administered to each tumor using a 27 G needle. Only one type of siRNA was administered per individual. The results are shown in a graph in FIG. In the group to which siKRAS-A was administered, the tumor size was significantly smaller after 24 days after transplantation as compared with the group to which siCont and siKRAS-WT were administered. Thus, in cells that proliferate in a mutant K-ras-dependent manner, siKRAS-A can suppress the proliferation.
  • RNA molecule a novel chimeric NA molecule, a novel double-stranded RNA molecule, and a novel double-stranded chimeric NA molecule.

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Abstract

本発明は、新規なＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子を提供することを目的とする。すなわち、本発明の一実施態様は、点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法のためのＲＮＡ分子であって、 （１）変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有する； （２）変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５'側の塩基から数えて （２－１）５番目または６番目の塩基が変異型アレルの塩基に対してミスマッチである； （２－２）１０番目または１１番目は点突然変異の位置に対応する；及び （２－３）６－８番目または７－８番目において、五炭糖の２'位がＯＣＨ３等で修飾されている、ＲＮＡ分子とする。このＲＮＡ分子において、リボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドなどに置換されていてもよく、相補鎖とともに、二本鎖ＲＮＡを形成していてもよい。

Description

ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子
　本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いるための、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、および二本鎖キメラ型ＮＡ分子に関する。
　ＲＮＡ干渉法は、細胞内で、特定のターゲット遺伝子の発現を特異的に抑制するための簡便で効率的な方法である。
　しかし、当初予測されたよりも、本来のターゲットではない遺伝子（オフターゲット）に対しても、その遺伝子発現を抑制することが知られてきた（Jackson, A.L. et al., (2003) Nature Biotechnology vol.21, p.635-7）。特に、ターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアフィニティが強くなれば、オフターゲット効果も大きくなることが明らかになっている（Ui-Tei, K. et al., (2008) Nucleic Acids Res. vol.36, p.7100-7109）。
　本発明は、新規なＲＮＡ分子、新規なキメラ型ＮＡ分子、新規な二本鎖ＲＮＡ分子、および新規な二本鎖キメラ型ＮＡ分子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、オフターゲット効果の低いＲＮＡ配列を特定するために、鋭意努力していたところ、５番目または６番目の塩基にミスマッチを有し、６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて五炭糖の２’位を修飾することにより、１０番目または１１番目の塩基について、特にオフターゲット効果が低くなることを見出した。このことから、ある遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において、１０番目または１１番目の塩基が点突然変異の位置に対応し、変異型アレルの有する塩基であるようにＲＮＡ分子を設計し、このＲＮＡ分子をガイド鎖とする二本鎖ＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉法に用いることにより、野生型アレルの発現を事実上抑制しないで、変異型アレルの発現を主に抑制することに成功し、本発明の完成に至った。
［１］一般的な遺伝子
［１－１］　本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子であって、以下の要件を満たすＲＮＡ分子である：
（１）下記（２－１）で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること； 
（２）前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて
（２－１）５番目または６番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること；
（２－２）１０番目または１１番目は前記点突然変異の位置に対応し、１０番目または１１番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること；及び
（２－３）６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されていること。前記ハロゲンがＦであってもよい。上記（１）で規定された塩基配列の５’末端の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルに置換してもよい。上記（１）で規定された塩基配列の３’ 末端の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１３～２８個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれのＲＮＡ分子も、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
［１－２］　本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのＲＮＡ分子がガイド鎖であって、前記ＲＮＡ分子に相補的な配列を有するＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子である。ガイド鎖の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端にオーバーハング部位を有してもよい前記オーバーハング部位が１～３個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記いずれの二本鎖ＲＮＡ分子においても、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
［１－３］　本発明のさらなる実施態様は、ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、上記いずれかのＲＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法である。ＲＮＡ分子は、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
［１－４］　本発明のさらなる実施態様は、遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、前記変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法であって、上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子を、前記細胞に導入する工程を含む、ＲＮＡ干渉法である。
［１－５］　本発明のさらなる実施態様は、腫瘍遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、前記点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子を有効成分とする、治療薬である。
［１－６］　本発明のさらなる実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、上記ＲＮＡ干渉法を、複数の上記いずれかのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または上記いずれかの二本鎖キメラ型ＮＡ分子のそれぞれを用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、を含む、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法である。
［２］Ｋ－ｒａｓ遺伝子
［２－１］　本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－２］　本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－３］　本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－４］　本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－５］　本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号１）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号２）
５’－ＵＣＣＵＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡ－３’ （配列番号３）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［２－６］　本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである。
［３］Ｎ－ｒａｓ遺伝子
［３－１］　本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－２］　本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－３］　本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－４］　本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－５］　本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が
５’－ＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＣＡ－３’（配列番号１４６）
５’－ＧＵＡＣＵＣＵＵＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号１４７）
のいずれかを有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［３－６］　本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＮ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＮ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＮ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）またはＮ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレルである。
［４］そのほかの遺伝子
［４－１］　本発明のさらなる実施態様は、［１－１］に記載のいずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－２］　本発明のさらなる実施態様は、［１－２］に記載のいずれかの二本鎖ＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－３］　本発明のさらなる実施態様は、［１－３］に記載のいずれかの製造方法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－４］　本発明のさらなる実施態様は、［１－４］に記載のいずれかのＲＮＡ干渉法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－５］　本発明のさらなる実施態様は、［１－５］に記載のいずれかの治療薬において、前記腫瘍遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　前記ガイド鎖において、前記（２－１）で規定した塩基を含めた前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列が、それぞれ、
５’－ＧＧＣＵＵＣＵＧＡＵＵＵＧＣＵＡＣＡＵ－３’（配列番号１４８）
５’－ＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＡＡＧＡＧＧＵＣ－３’（配列番号１４９）
５’－ＡＣＡＣＣＡＧＵＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣ－３’（配列番号１５０）
５’－ＧＧＵＡＣＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＧＵＵＵ－３’（配列番号１５１）
５’－ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＵＵＧＣＡＣ－３’（配列番号１５２）
５’－ＧＡＵＧＧＧＧＡＵＣＡＧＵＣＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１５３）
５’－ＣＵＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＣＣＣＣＣＵ－３’（配列番号１５４）および
５’－ＡＵＡＡＧＣＡＵＧＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧ－３’（配列番号１５５）
を有してもよい。また、前記二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されていてもよい。
［４－６］　本発明のさらなる実施態様は、［１－６］に記載のいずれかの選択方法において、前記遺伝子がＢＲＣＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＢＲＣＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ１１１４Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＳＴＫ１１遺伝子であって、前記野生型アレルがＳＴＫ１１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ１０６２Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子であって、前記野生型アレルがＰＴＥＮ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ３８８Ｇ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＡＰＣ遺伝子であって、前記野生型アレルがＡＰＣ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ４３４８Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＡＴＡ２遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＡＴＡ２（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＣ９５３Ｔ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＭＹＤ８８遺伝子であって、前記野生型アレルがＭＹＤ８８（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＴ８１８Ｃ変異型アレルであるか；上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＧＮＡＱ遺伝子であって、前記野生型アレルがＧＮＡＱ（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＡ６２６Ｔ変異型アレルであるか；または、上記いずれかのＲＮＡ分子において、前記遺伝子がＩＤＨ１遺伝子であって、前記野生型アレルがＩＤＨ１（ｗｔ）であって、前記変異アレルがＧ３９５Ａ変異型アレルである。
　＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１９年７月１６日付で出願した日本国特許出願２０１９－１３０９６６に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの９～１１番目を点突然変異の位置に対応させた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したｓｉＲＮＡを用いた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換した時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３～７番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例においてＫ－ｒａｓ遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡの１１番目を点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３～７番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＡ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル及びＣ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＴ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ａ変異型アレル及びＣ変異型アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｋ－ｒａｓ遺伝子のＣ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡの、野生型アレル、Ａ変異型アレル及びＴ変異型アレルに対する発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ３５番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（以下、Ａ変異型Ｎ３５アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ１８２番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレル（以下、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型Ｎ１８２アレルの塩基に対してミスマッチさせた時のｓｉＲＮＡの発現抑制能を調べた結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、ＢＲＣＡ２遺伝子の野生型アレルとＡ１１１４Ｃ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＳＴＫ１１遺伝子の野生型アレルとＣ１０６２Ｇ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＰＴＥＮ遺伝子の野生型アレルとＣ３８８Ｇ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＡＰＣ遺伝子の野生型アレルとＣ４３４８Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＧＡＴＡ２遺伝子の野生型アレルとＣ９５３Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＭＹＤ８８遺伝子の野生型アレルとＴ８１８Ｃ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＧＮＡＱ遺伝子の野生型アレルとＡ６２６Ｔ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 ＩＤＨ１遺伝子の野生型アレルとＧ３９５Ａ変異型アレルに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対して変異型アレルからの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが、内在性遺伝子の発現に対しても、同様の特異性を有することを示す結果を表すグラフである。 本発明の一実施例において、ｓｉＫＲＡＳ－Ａがin vivoで腫瘍細胞の増殖を抑制できることを示す結果を表すグラフである。
　本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝ＲＮＡ分子＝＝
　本発明の一実施態様は、遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子である。対象となる遺伝子は、本開示のＲＮＡ分子を設計できるものであれば、特に限定されないが、点突然変異によって正常細胞ががん化するがん遺伝子であることが好ましい。ＲＮＡ分子を構成するヌクレオチドの個数は特に限定されないが、１３個以上１００個以下でもよく、１３個以上５０個以下でもよく、１３個以上２８個以下でもよく、１５個以上２５個以下でもよく、１７個以上２１個以下でもよいが、１９個以上２１個以下であることがさらに好ましい。また、１個または複数個（２個以上１８個以下であってもよく、２個以上１５個以下であってもよく、２個以上１２個以下であってもよく、２個以上９個以下であってもよく、２個以上６個以下であってもよく、２個以上３個以下であってもよい。）のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、またはイノシンやモルフォリノなどの核酸類縁体に置換されていてもよい。本明細書では、このようなＲＮＡ分子を、キメラ型ＮＡ分子と呼ぶが、本開示では、ＲＮＡ分子はキメラ型ＮＡ分子を含めて説明されるものとする。
　このＲＮＡ分子は、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、５番目または６番目の塩基が変異型アレルの塩基に対してミスマッチしているが、それ以外の部分に変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有する。このＲＮＡ分子が変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列以外の配列を有してもよく、例えば、当該相補的な塩基配列に相補的な配列を有してもよく、それによって、セルフアニーリングし、ｓｉＲＮＡとして機能してもよい。そのような一本鎖ＲＮＡとして、ボナック核酸が例示できる。あるいは、３’末端に１～３個のヌクレオチドが結合していてもよく、その塩基配列は特に限定されない。相補的な塩基配列の最も５’側の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルまたはチミンで置換してもよい。また、相補的な塩基配列の最も３’側の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換してもよい。これらの操作によって、このＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能する際に、遺伝子発現の抑制機能を向上させることができる。また、このＲＮＡ分子は、デリバリーのため、膜透過性を高めるため、あるいは血中滞留性を向上させるため、核酸以外の化学物質を有していてもよい。例えば、ＲＮＡ分子がＧａｌＮＡcやＰＥＧとコンジュゲートしていてもよい。また、５番目または６番目の塩基を除いて、ＲＮＡ分子が変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列以外の配列からなっていてもよい。なお、ＲＮＡ分子は、５番目または６番目の塩基を除き変異型アレルと相補的な塩基配列を有するが、９０％以上の相補性を有することが好ましく、９５％以上の相補性を有することがより好ましく、９８％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。５番目または６番目の塩基は、変異型アレルとミスマッチしていれば特に限定されず、その場所の変異型アレルの塩基以外の塩基であれば、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉや、そのほかの人工核酸・核酸類似体でも構わない。
　また、このＲＮＡ分子において、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、１０番目または１１番目は点突然変異の位置に対応し、その塩基は変異型アレルが有する塩基に対応する塩基である。すなわち、変異型アレルの有する変異した塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミンである場合、ＲＮＡ分子の１０番目または１１番目は、それぞれアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル（またはチミン）である。
　また、このＲＮＡ分子において、変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて、６－８番目または７－８番目のヌクレオチドのもつ五炭糖の２’位は、ＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾（すなわち、置換）されている。例えば、五炭糖の２’位が、－ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ（以下、２’－Ｏ－メチルＲＮＡと称する）は、下記一般式の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ハロゲンの種類は特に限定されないが、分子の大きさが小さいことから、フッ素が好ましい。これらの場所以外のヌクレオチドについては、一部または全部が修飾されていてもよいが、全てのヌクレオチドが修飾されていないことが好ましい。ヌクレオチドの修飾は特に限定されないが、それが有する五炭糖の２’位が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ、及びＬＮＡ（式中、ＲはＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール；ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）からなる群から選ばれた基により置換されていることが例示できる。
　ＲＮＡ分子のターゲット遺伝子に対するＩＣ５０は、１ｎＭ以下であることが好ましく、５００ｐＭ以下であることがより好ましく、２００ｐＭ以下であることがさらに好ましい。
　このＲＮＡ分子を１本鎖のままＲＮＡ干渉法に用いる場合、その５’末端がリン酸化されているか、in situまたはin vivoでリン酸化され得ることが好ましい。
　このＲＮＡ分子の設計方法は、以下の工程を含む。
　まず、変異型アレルの有する変異した塩基を、最も５’側の塩基から数えて１０番目または１１番目として、変異型アレルの塩基配列に相補的な配列を有する所定の長さの塩基配列を決める工程を行う。次に、最も５’側の塩基から数えて５番目または６番目の塩基をミスマッチになる塩基にする工程を行う。そして、最も５’側の塩基から数えて６－８番目または７－８番目のヌクレオチドは、それらが有する五炭糖の２’位が、ＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されたものとする。ここで、相補的な塩基配列の最も５’側の塩基がアデニンまたはウラシルでない場合、アデニンまたはウラシルまたはチミンで置換する工程を行なってもよい。また、相補的な塩基配列の最も３’側の塩基がシトシンまたはグアニンでない場合、シトシンまたはグアニンに置換する工程を行なってもよい。最後に、３’側に、１-３個の塩基を付加する工程を行なってもよい。このようにして塩基配列を設計することができる。この設計方法をコンピュータに行わせるためのプログラムを作成してもよく、そのプログラムをコンピュータが読み取り可能な記録媒体に格納してもよい。このようにして設計した塩基配列を有するヌクレオチドは、定法に従って、化学合成できる。
＝＝二本鎖ＲＮＡ分子＝＝
　本発明の一実施態様は、前述のＲＮＡ分子（以下、第１のＲＮＡ分子と称する）がガイド鎖であって、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有する第２のＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子である。第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子に相補的な配列を有し、生理的条件で第１のＲＮＡ分子と２重鎖を形成するが、９０％以上の相補性を有することが好ましく、９５％以上の相補性を有することがより好ましく、９８％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。
　パッセンジャー鎖の鎖長は特に限定されず、第１のＲＮＡ分子よりかなり短くても構わず、例えば、第１のＲＮＡ分子の半分以下でもよいが、同じ長さであることが好ましい。パッセンジャー鎖が第１のＲＮＡ分子より短い場合、第１のＲＮＡ分子に一本鎖部分が生じるが、その部分は、一本鎖の状態でもよいが、第１のＲＮＡ分子に相補的な第３のＲＮＡ分子が結合していてもよい。第２のＲＮＡ分子と第３のＲＮＡ分子が、第１のＲＮＡ分子全体に結合する場合、１本のパッセンジャー鎖にニックが入っていて二本に別れているのと同じ状態になる。
　二本鎖ＲＮＡ分子の両端は平滑末端でもよいが、ガイド鎖である第１のＲＮＡ分子の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖である第２のＲＮＡ分子の３’末端に、オーバーハングを有してもよい。オーバーハングのヌクレオチド数は特に限定されないが、１～３個であることが好ましい。
　ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のいずれのヌクレオチド鎖も、１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子であってもよい。
　パッセンジャー鎖を構成するヌクレオチドは、修飾されていてもよいが、修飾されていないことが好ましい。ヌクレオチドの修飾は特に限定されないが、それが有する五炭糖の２’位が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ、及びＬＮＡ（式中、ＲはＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール；ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）からなる群から選ばれた基により置換されていることが例示できる。
　パッセンジャー鎖も、周知技術に従って容易に設計し、容易に製造することができる。なお、ガイド鎖とパッセンジャー鎖は、リンカーで結合していてもよい。リンカーの構成材料は特に限定されないが、ペプチドやＰＥＧなどであってもよい。
＝＝ＲＮＡ干渉法＝＝
　本発明の一実施態様は、目的の遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法である。このＲＮＡ干渉法は、キメラ型ＮＡ分子を含む第１のＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む上述の二本鎖ＲＮＡ分子を、野生型アレルと変異型アレルを有する細胞に導入する工程を含む。
　ＲＮＡ干渉法は、周知技術に従って容易に行うことができる。例えば、ターゲット遺伝子を発現している培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の生物個体に対して、第１のＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を導入することで、ターゲット遺伝子の発現を低下させることができる。
　ＲＮＡ干渉法を行う際、上述の第１のＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を用いることによって、目的の遺伝子の野生型アレルの発現を事実上抑制しないで、変異型アレルからの発現を主に抑制することができる。ここで、野生型アレルの発現は、野生型アレルが機能し、正常な表現型をもたらす程度までであれば、抑制されても構わない。変異型アレルの発現は、変異型アレルが機能せず、異常な表現型をもたらさない程度まで、抑制されればよい。これによって、例えば、変異型アレルが優性突然変異を有する場合、変異による表現型を発現させないで、細胞を正常に機能させることが可能になる。
＝＝治療薬＝＝
　本開示のｓｉＲＮＡが治療薬として用いられるとき、その対象となる疾患は特に限定されないが、本発明の一実施態様は、腫瘍遺伝子（がん原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん抑制遺伝子などとも呼ばれることがある）の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、上述のキメラ型ＮＡ分子を含むＲＮＡ分子、または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を含む二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分とする。
　投与方法は特に限定されないが、注射であることが好ましく、静脈内注射であることがより好ましい。この場合、治療薬には、有効成分に加え、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加してもよい。
　用量は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。
＝＝治療薬の対象となる疾患＝＝
　本開示のｓｉＲＮＡが治療薬となるときの疾患は特に限定されず、その疾患が変異遺伝子の発現で生じるものであればよいが、上述したように腫瘍であることが好ましい。後述する実施例においては、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、Ｎ－ｒａｓ遺伝子、BRCA遺伝子、ＳＴＫ１１遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＭＹＤ８８遺伝子、ＧＮＡＱ遺伝子、ＩＤＨ１遺伝子を抑制対象としており、それぞれ、Ｋ－ｒａｓ遺伝子の変異によっては大腸癌、肺癌、膵癌、白血病など、Ｎ－ｒａｓ遺伝子の変異によっては大腸癌、甲状腺癌、皮膚癌など、BRCA遺伝子の変異によっては乳癌、卵巣癌など、ＳＴＫ１１遺伝子の変異によっては子宮頸部悪性腺腫、Peutz-Jeghers 症候群、胃癌、乳癌、卵巣癌など、ＰＴＥＮ遺伝子の変異によってはCowden症候群、Lhermitte-Duclos病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba症候群、Proteus症候群などのPTEN過誤腫症候群など、ＡＰＣ遺伝子の変異によっては家族性大腸腺腫症（FAP）、肝臓癌など、ＧＡＴＡ２遺伝子の変異によってはMonoMAC症候群、急性巨核芽球性白血病など、ＭＹＤ８８遺伝子の変異によってはリンパ腫など、ＧＮＡＱ遺伝子の変異によってはぶどう膜悪性黒色腫、Sturge-Weber症候群、GNAS遺伝子、BRCA遺伝子血管腫など、そしてＩＤＨ１遺伝子の変異によってはグリオーマなどが生じることが知られており、少なくともこれらの疾患の治療薬になりうる。
＝＝選択方法＝＝
　本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、複数の上述のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ干渉法をin vitroで行うことによって、特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、を含む。
　ＲＮＡ干渉法をin vitroで行う際に、対象遺伝子として、遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する変異型アレルとを用い、野生型アレルの発現は所定のレベル以上には抑制しないが、変異型アレルの発現は所定のレベル以上に抑制する分子を選択する。これによって、変異型アレルの発現を抑制し、野生型アレルの発現を抑制しない分子を得ることができる。ここで、所定レベルの数値は特に限定されないが、５０％が好ましく、７０％がより好ましく、９０％がさらに好ましい。
　in vitroにおいてＲＮＡ干渉を用いるアッセイ方法は技術常識であって、遺伝子の選択、細胞の選択、ＲＮＡ分子の細胞への導入などは、当業者には明らかである。
　本実施例では、本明細書に開示のｓｉＲＮＡが、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対し、野生型アレルからの発現を抑制しないが、変異型アレルからの発現を特異的に抑制することを示す。
（方法）
　１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養したＨｅＬａ細胞を、１ｘ１０５個／ｍＬの密度で２４ウエルプレートに播種し、１００ｎｇの各レポーター及び１００ｎｇの内部標準用プラスミド（ｐＧＬ３）と二重鎖ｓｉＲＮＡとを、２μＬのlipofectamine2000とともにコトランスフェクトした。二重鎖ｓｉＲＮＡの濃度は、各図に示した。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとしてはｓｉＧＹ４４１を導入した。２４時間後に細胞を回収し、dual-luciferase reporter assay system（Promega社）を用いて、firefly luciferase及びRenilla luciferaseの活性を測定し、firefly luciferaseの測定値を用いて、Renilla luciferaseの測定値を標準化した。また、二重鎖ｓｉＲＮＡで得られた測定値は、ｓｉＧＹ４４１で得られた測定値を１００％として、グラフに表した。
［実施例１Ａ］
　本実施例では、発現抑制のターゲット遺伝子として、Ｋ－ｒａｓ遺伝子を用いた。
（実施例１Ａ－１）
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの１０番目または１１番目をＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：３８４５）において、３５番目の塩基がＧからＡに変異）（以下、Ａ変異型アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させることで、野生型Ｋ－ｒａｓアレル（以下、野生型アレルと称する）に比較してＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能の特異性が向上することを示す。
　まず、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル及びＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを作製した。それぞれ、ベクターに組み込んだ部分の配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　次に、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成した。ｓｉＲＮＡであるＫ（３５）９Ａ、Ｋ（３５）１０Ａ、及びＫ（３５）１１Ａは、それぞれ９番目、１０番目、及び１１番目がＡ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレルの点突然変異の位置に対応している。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対が□で囲われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　図１に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｋ（３５）９Ａは、Ａ変異型アレル、野生型アレルの両方に対して、強い発現抑制効果を有していた。Ｋ（３５）１０Ａ及びＫ（３５）１１Ａは、発現抑制効果が少し弱くなったものの、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。
（実施例１Ａ－２）
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させた上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換したｓｉＲＮＡを用いることで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対とが□で囲われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　図２に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｋ（３５）１１Ａは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現をさらに強く抑制している。
（実施例１Ａ－３）
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換することで、Ａ変異型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が強くなり、その特異性がさらに向上することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　図３に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）は、両方に対して発現抑制効果が強くなり、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制している。もう一つのコントロールであるＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（２－５）（ガイド鎖の２番目から５番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３に置換されている）は、両方に対する発現抑制効果がかなり弱くなった。
（実施例１Ａ－４）
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖをベースにして、３～７番目の塩基にミスマッチを有する下記配列の２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　図４に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖは、野生型アレルよりＡ変異型アレルの方の発現を強く抑制していたが、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＭ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＭ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
（実施例１Ａ－５）
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型アレルの点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからグアニンに置換した上で、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換ｓｉＲＮＡのガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目または６番目の塩基をＡ変異型アレルの塩基に対してミスマッチさせると、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｋレポーター及びＡ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１Ａｒｅｖをベースにして、３～７番目の塩基にミスマッチを有する下記配列の２重鎖ＲＮＡを化学合成し、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　図５に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、野生型アレルに対するＲＮＡ分子の発現抑制能が非常に弱くなり、その結果、Ａ変異型アレルに対する特異性がさらに向上した。
（実施例１Ａ－６）
　本実施例では、Ａ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＴに変異）及びＣ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレル（ｃＤＮＡにおいて、３５番目の塩基がＧからＣに変異）に対する発現抑制能が低いことを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、下記のＫ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）レポーター（以下、Ｔ変異型Ｋレポーターと称する）、Ｃ変異型Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）レポーター（以下、Ｃ変異型Ｋレポーターと称する）を用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ａｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対が□で囲われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　図６に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
　いずれのｓｉＲＮＡも、Ａ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
（実施例１Ａ－７）
　本実施例では、Ｔ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡは、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＣ変異型アレルに対する発現抑制能が低いことを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、Ｋ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｔ変異型Ｋレポーター、Ｃ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ｔｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　図７に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
　いずれのｓｉＲＮＡも、Ｔ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＴｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ｔ変異型Ｋレポーター及びＣ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
（実施例１Ａ－８）
　本実施例では、Ｃ変異型アレル特異的なｓｉＲＮＡが、野生型アレルだけでなく、Ａ変異型アレル及びＴ変異型アレルの発現抑制能は低いことを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、下記のＫ－ｒａｓレポーターである、野生型Ｋレポーター、Ａ変異型Ｋレポーター、Ｔ変異型Ｔ変異型Ｋレポーター、Ｃ変異型Ｋレポーターを用い、ｓｉＲＮＡとして、Ｋ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６を用い、コントロールとしてＫ（３５）１１Ｃｒｅｖを用いた。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　図８に、各レポーターに対する遺伝子発現抑制効果を示す。
　いずれのｓｉＲＮＡも、Ｃ変異型Ｋレポーターに対して最も発現抑制効果が強かったが、特にＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５及びＫ（３５）１１ＣｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６は、Ａ変異型Ｋレポーター及びＴ変異型Ｋレポーターに対する発現抑制効果が弱かった。
［実施例１Ｂ］
　本実施例では、発現抑制のターゲット遺伝子として、Ｎ－ｒａｓ遺伝子を用いた。
（実施例１Ｂ－１）
　本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ３５番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル（以下、Ａ変異型Ｎ３５アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、野生型Ｎアレル及びＡ変異型Ｎ３５アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、野生型Ｎ３５レポーター及びＡ変異型Ｎレポーターを作製した。化学合成し、ベクターに組み込んだ配列を以下に示す。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対が□で囲われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成した。Ｎ（３５）１１Ｇは、野生型Ｎアレルに相補的な配列を有する。Ｎ（３５）１１Ａは、１１番目のヌクレオチドをＡ変異型Ｎ３５アレルの点突然変異の位置に対応させたｓｉＲＮＡである。Ｎ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、１１番目のヌクレオチドをＡ変異型Ｎ３５アレルの点突然変異の位置に対応させ、ガイド鎖の５’末端の塩基をシトシンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をウラシルからシトシンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＡ変異型Ｎ３５アレルの塩基に対してミスマッチさせたｓｉＲＮＡである。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　図９に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｎ（３５）１１Ｇは、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現より野生型Ｎアレルの発現を効果的に抑制し、Ｎ（３５）１１Ａは、それとは逆に、野生型Ｎアレルの発現よりＡ変異型Ｎ３５アレルの発現を効果的に抑制した。Ｎ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、野生型アレルの発現抑制能が非常に弱くなり、Ａ変異型Ｎ３５アレルの発現抑制能が強くなった結果、Ａ変異型Ｎ３５アレルに対する特異性が向上した。
（実施例１Ｂ－２）
　本実施例では、Ｎ－ｒａｓ遺伝子のｃＤＮＡ１８２番目のヌクレオチドにおける点突然変異を対象とし、ｓｉＲＮＡの１１番目をＡ変異型Ｎ－ｒａｓ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）アレル（以下、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと称する）の点突然変異の位置に対応させ、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型Ｎ１８２アレルの塩基に対してミスマッチさせると、野生型Ｎ－ｒａｓ（ｗｔ）アレル（以下、野生型Ｎアレルと称する）の発現より、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現をより特異的に抑制することを示す。
　遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、Ｇ変異型Ｎ１８２レポーターを作製した。化学合成し、ベクターに組み込んだ配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成した。Ｎ（１８２）１１Ａは、野生型Ｎアレルに相補的な配列を有する。Ｎ（１８２）１１Ｇは、１１番目のヌクレオチドをＧ変異型Ｎ１８２アレルの点突然変異の位置に対応させたｓｉＲＮＡである。Ｎ（１８２）１１ＧｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、１１番目のヌクレオチドをＡ１８２変異型Ｎアレルの点突然変異の位置に対応させ、ガイド鎖の５’末端の塩基をグアニンからウラシルに置換し、パッセンジャー鎖の５’末端の塩基をアデニンからグアニンに置換し、ガイド鎖の６番目から８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換し、かつｓｉＲＮＡのガイド鎖の５番目の塩基をＧ変異型１８２Ｎアレルの塩基に対してミスマッチさせたｓｉＲＮＡである。なお、下記配列で、点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　図１０に、各ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を示す。
　Ｎ（１８２）１１Ａは、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現より野生型Ｎ１８２アレルの発現を効果的に抑制し、Ｎ（１８２）１１Ｇは、それとは逆に、野生型Ｎ１８２アレルの発現よりＡ変異型Ｎ１８２アレルの発現を効果的に抑制した。Ｎ（１８２）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ５は、野生型アレルの発現抑制能がなくなり、Ｇ変異型Ｎ１８２アレルの発現抑制能が若干弱くなった結果、Ｇ変異型１８２アレルに対する特異性が向上した。
［実施例１Ｃ］
　本実施例では、ＢＲＣＡ２遺伝子の野生型アレルとＡ１１１４Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：６７５）において、１１１４番目の塩基がＡからＣに変異）、ＳＴＫ１１遺伝子の野生型アレルとＣ１０６２Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：６７９４）において、１０６２番目の塩基がＣからＧに変異）、ＰＴＥＮ遺伝子の野生型アレルとＣ３８８Ｇ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：５７２８）において、３８８番目の塩基がＣからＧに変異）、ＡＰＣ遺伝子の野生型アレルとＣ４３４８Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：３２４）において、４３４８番目の塩基がＣからＴに変異）、ＧＡＴＡ２遺伝子の野生型アレルとＣ９５３Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：２６２４）において、９５３番目の塩基がＣからＴに変異）、ＭＹＤ８８遺伝子の野生型アレルとＴ８１８Ｃ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：４６１５）において、８１８番目の塩基がＴからＣに変異）、ＧＮＡＱ遺伝子の野生型アレルとＡ６２６Ｔ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：２７７６）において、６２６番目の塩基がＡからＴに変異）、ＩＤＨ１遺伝子の野生型アレルとＧ３９５Ａ変異型アレル（ｃＤＮＡ（ＧＥＮＥ　ＩＤ：３４１７）において、３９５番目の塩基がＧからＡに変異）の各ペアに対し、本開示の配列を有するｓｉＲＮＡが野生型アレルからの発現をほとんど抑制せず、変異型アレルからの発現を強く抑制することを示す。
　まず、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、各アレルと同じ塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、レポーターを作製した。それぞれ、ベクターに組み込んだ部分の配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　次に、ｓｉＲＮＡとして、下記配列を有する２重鎖ＲＮＡを化学合成し、これらのレポーターおよびｓｉＲＮＡを用いて、実施例１Ａと同様にレポーターアッセイを行った。図１１にそれぞれの結果を示す。なお、コントロールのｓｉＲＮＡとしてはｓｉＢＲＣＡ２＿ｗｔを導入し、二重鎖ｓｉＲＮＡで得られた測定値は、ｓｉＢＲＣＡ２＿ｗｔで得られた測定値を１００％として、図１１のグラフに表した。
　なお、下記配列で、ｗｔは、野生型遺伝子の配列に基づいて作られたｓｉＲＮＡである。点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　図１１のグラフから明らかであるように、野生型配列に対応するｓｉＲＮＡは、野生型アレルおよび変異型アレルの両方からの発現を抑制するが、本明細書に開示のｓｉＲＮＡは、野生型アレルからの発現はほとんど抑制しない一方、変異型アレルからの発現は強く抑制する。
　本実施例では、培養細胞中で、外来性のレポーターからの発現に対して変異型アレルからの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが、内在性遺伝子の発現に対しても、同様の特異性を有することを示す。
　まず、いずれもすい臓腺がん由来の細胞株である、ＢｘＰＣ－３（３５番目の塩基がＧ／Ｇ：野生型ホモ接合）、ＡｓＰＣ－１（３５番目の塩基がＡ／Ａ：Ａ型変異ホモ接合）、及びＰＡＮＣ－１（３５番目の塩基がＧ／Ａ：Ａ型変異ヘテロ接合）の各細胞を接着培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸを（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、ｓｉＧＹ４４１（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｓｉＫＲＡＳ－６２（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ：全てのＫ－ｒａｓ　ｍＲＮＡを抑制するｓｉＲＮＡ）、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴ（野生型Ｋーｒａｓ特異的ｓｉＲＮＡ）およびｓｉＫＲＡＳ－Ａ（Ａ変異型特異的ｓｉＲＮＡ：Ｋ（３５）１１ＡｒｅｖＯＭ（６－８）Ｍ６）を用いて、各５０ｎＭの濃度で、一日に一度、３日連続でＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。３回目のＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの翌日に、一部の細胞からｍＲＮＡを単離し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作成、定量的ＰＣＲ法を用いて、Ｋ－ｒａｓのｍＲＮＡを定量した。各細胞において、ｓｉＧＹ４４１の発現量を１００として、各ｓｉＲＮＡを導入したときの発現量を相対値で表した。その結果を図１２に示す。
　本実施例で用いた塩基配列を以下に記載した。下記配列で、ｗｔは、野生型遺伝子の配列に基づいて作られたｓｉＲＮＡである。点突然変異の位置に対応している塩基対と、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の５’末端の置換した塩基対と、ミスマッチを有する塩基対とが□で囲われ、五炭糖の２’位をＯＣＨ３に置換したヌクレオチドがシャドウでマークされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　グラフに示されているように、野生型ホモ接合であるＢｘＰＣ－３では、ｓｉＫＲＡＳ－６２とｓｉＫＲＡＳ－ＷＴが発現を強く抑制し、Ａ型変異ホモ接合であるＡｓＰＣ－１では、ｓｉＫＲＡＳ－６２とｓｉＫＲＡＳ－Ａが発現を強く抑制し、Ａ変異ヘテロ接合であるＰＡＮＣ－１では、ｓｉＫＲＡＳ－６２が発現を強く抑制し、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴとｓｉＫＲＡＳ－Ａが発現を弱く抑制しており、内在性遺伝子に対しても、各細胞の遺伝子型と各ｓｉＲＮＡの特異性とが対応していた。
　このように、各ｓｉＲＮＡは、内在性の遺伝子発現に対し、レポーターのような外因性の遺伝子発現と同様の特異性で発現抑制することができる。
　本実施例では、ｓｉＫＲＡＳ－Ａがin vivoで腫瘍細胞の増殖を抑制できることを示す。
　ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ-Ｆｏｘｎ１ｎｕｌｌ）３匹の皮下に、１．０ｘ１０６個のＡｓＰＣ－１細胞を５-６箇所ずつ移植し、毎週２回、腫瘍の体積をノギスで測定することにより、腫瘍の増殖能を評価した。移植後１０日目の腫瘍サイズは、移植３日目と比較して２倍程度に増加していたため、増殖フェーズに入っていると判断し、移植後１１日目から１週間おきに５μｇのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ、ｓｉＫＲＡＳ－ＷＴ、またはｓｉＫＲＡＳ－Ａ）とトランスフェクション試薬であるｉｎ　ｖｉｖｏ　ＪＥＴ　ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）の混合液を２７Ｇのニードルを用い、各腫瘍に対して直接投与した。なお、１個体につき１種類のｓｉＲＮＡのみを投与した。図１３に結果をグラフにして示した。
　ｓｉＫＲＡＳ－Ａを投与した群では、ｓｉＣｏｎｔやｓｉＫＲＡＳ－ＷＴの投与群と比較し、移植後２４日目以降、有意に腫瘍サイズが小さくなった。
　このように、変異Ｋ－ｒａｓ依存的に増殖する細胞において、ｓｉＫＲＡＳ－Ａはその増殖を抑制できる。
　本発明によって、新規なＲＮＡ分子、新規なキメラ型ＮＡ分子、新規な二本鎖ＲＮＡ分子、および新規な二本鎖キメラ型ＮＡ分子を提供することができるようになった。

Claims (17)

  1. 　遺伝子の野生型アレルに対して一塩基の点突然変異を有する変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子であって、以下の要件を満たすＲＮＡ分子である：
    （１）下記（２－１）で規定した塩基を除いて前記変異型アレルのコーディング領域と相補的な塩基配列を有すること；
    （２）前記変異型アレルと相補的な塩基配列の最も５’側の塩基から数えて
    （２－１）５番目または６番目の塩基が前記変異型アレルの塩基に対してミスマッチであること；
    （２－２）１０番目または１１番目は前記点突然変異の位置に対応し、１０番目または１１番目の塩基は前記変異型アレルが有する塩基に対応すること；及び
    （２－３）６－８番目または７－８番目のリボヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位がＯＣＨ３、ハロゲン、またはＬＮＡで修飾されていること。
  2. 　前記ハロゲンがＦである、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
  3. 　請求項１の（１）で規定された塩基配列の５’末端の塩基がシトシンまたはグアニンである場合、アデニンまたはウラシルに置換されている、請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
  4. 　請求項１の（１）で規定された塩基配列の３’ 末端の塩基がアデニンまたはウラシルである場合、シトシンまたはグアニンに置換されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
  5. 　１３～２８個のヌクレオチドからなる、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
  6. 　請求項１の（１）で規定された塩基配列の３’ 末端に、さらに、１～３個のヌクレオチドを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、キメラ型ＮＡ分子。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子がガイド鎖であって、前記ＲＮＡ分子に相補的な配列を有するＲＮＡ分子がパッセンジャー鎖である、二本鎖ＲＮＡ分子。
  9. 　ガイド鎖の３’末端及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端にオーバーハング部位を有する、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
  10. 　前記オーバーハング部位が１～３個のヌクレオチドからなる、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
  11. 　請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子において１個または複数個のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、人工核酸、または核酸類縁体に置換されている、二本鎖キメラ型ＮＡ分子。
  12. 　ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法。
  13. 　ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのキメラ型ＮＡ分子の製造方法であって、
    　請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子を製造する工程を含む、製造方法。
  14. 　遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記遺伝子の変異型アレルを有する細胞において、前記変異型アレルをターゲット遺伝子とするＲＮＡ干渉法であって、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子を、前記細胞に導入する工程を含む、ＲＮＡ干渉法。
  15. 　腫瘍遺伝子の野生型アレルと、一塩基の点突然変異を有する前記腫瘍遺伝子の変異型アレルを有し、前記点突然変異が腫瘍化の原因である腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ患者の治療薬であって、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子を有効成分とする、治療薬。
  16. 　ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法において用いるためのＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法であって、
    　請求項１１のＲＮＡ干渉法を、複数の請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項７に記載のキメラ型ＮＡ分子、請求項８～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子または請求項１１に記載の二本鎖キメラ型ＮＡ分子のそれぞれを用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
    　前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子を選択する工程と、
    を含む、ＲＮＡ分子、キメラ型ＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖キメラ型ＮＡ分子の選択方法。
  17. 　前記遺伝子がＫ－ｒａｓ遺伝子であって、前記野生型アレルがＫ－ｒａｓ（ｗｔ）アレルであって、前記変異アレルがＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）アレル、Ｋ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｔ）アレル、またはＫ－ｒａｓ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）アレルである、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022154123A1 (ja) * 2021-01-15 2022-07-21 国立大学法人 東京大学 Ｒｎａ分子、キメラ型ｎａ分子、二本鎖ｒｎａ分子、および二本鎖キメラ型ｎａ分子

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538677A (ja) * 2007-09-19 2010-12-16 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ＲＮＡｉにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのＳｉＲＮＡ配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型
JP2017502665A (ja) * 2013-12-17 2017-01-26 インコドゥヂュン シーオー．，エルティーディー オフターゲットを防ぐために変形したｒｎａ干渉誘導拡散およびその用途
WO2018098328A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rna agents with reduced off-target effect
JP2019088196A (ja) * 2017-11-10 2019-06-13 株式会社バイオシンクタンク Ｒｎａ分子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8946185B2 (en) * 2010-06-18 2015-02-03 Lsip, Llc Agent for suppressing expression of dominant allele

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538677A (ja) * 2007-09-19 2010-12-16 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ＲＮＡｉにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのＳｉＲＮＡ配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型
JP2017502665A (ja) * 2013-12-17 2017-01-26 インコドゥヂュン シーオー．，エルティーディー オフターゲットを防ぐために変形したｒｎａ干渉誘導拡散およびその用途
WO2018098328A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rna agents with reduced off-target effect
JP2019088196A (ja) * 2017-11-10 2019-06-13 株式会社バイオシンクタンク Ｒｎａ分子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IRIBE HANNA, MIYAMOTO KENGO, TAKAHASHI TOMOKO, KOBAYASHI YOSHIAKI, LEO JASTINA, AIDA MISAKO, UI-TEI KUMIKO: "Chemical modification of the siRNA seed region suppresses off-target effects by steric hindrance to base-pairing with targets", ACS OMEGA, vol. 2, no. 5, 2017, pages 2055 - 2064, XP055788985 *
JACKSON, A.L., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 21, 2003, pages 635 - 637
See also references of EP4000638A4
UI-TEI, K. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 36, 2008, pages 7100 - 7109

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022154123A1 (ja) * 2021-01-15 2022-07-21 国立大学法人 東京大学 Ｒｎａ分子、キメラ型ｎａ分子、二本鎖ｒｎａ分子、および二本鎖キメラ型ｎａ分子

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