JP2001521749A

JP2001521749A - 遺伝子標的化ベクターの効率良い構築

Info

Publication number: JP2001521749A
Application number: JP2000519094A
Authority: JP
Inventors: リチャードウォイチック，; デイビッドガーフィンケル，
Original assignee: アムジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2001-11-13
Also published as: CA2308016A1; AU7721398A; WO1999023239A1; EP1025252A1; US6090554A

Abstract

(57)【要約】本発明は、宿主細胞において相同組換えを介して遺伝子標的化構築物を産生するまたは入手する方法ならびにそれらの方法によって産生される標的化構築物に関する。本発明はまた、本発明の標的化構築物を使用して動物の細胞に導入された標的化変異を有するトランスジェニック動物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）特定の遺伝子の機能（それらの健康に関する機能を含む）を研究するために最
も有用であるアプローチの１つは、それら遺伝子内の変異の効果（すなわち、こ
の変異の表現型）を試験することである。このアプローチは、特定の遺伝子内の
変異をそれらの変異から生じる表現型または疾患状態と相関付ける工程を含む。
近年、このアプローチは、嚢胞性線維症（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５７：１０８３（１９９２））、肥満（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３
７２：４２５（１９９４））、多発性嚢胞腎疾患（Ｍｏｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２６４：１３２９（１９９４））、乳癌（Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６６：６６〜７１（１９９４）；Ｔａｖｔｉｇｉａｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
，１２：３３３〜３３７（１９９６））、および他の疾患のような疾患について
の遺伝子の同定を伴い、特に有益であった。これらの場合には、この関連する遺
伝子の機能は、それらのＤＮＡ配列からのみでは明らかではなく、むしろその遺
伝子の変異に関連する疾患状態によって規定された。

【０００２】動物の特定遺伝子の機能を理解するために特に生産的なアプローチは、口語的
に「標的化変異誘発」と称される遺伝子機能の破壊を含む。標的化変異誘発の１
つの一般型は、「遺伝子ノックアウト」を生成することである。代表的には、遺
伝子ノックアウトは、初期胚の段階で動物の生殖細胞系の遺伝子を破壊する工程
を含む。（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと
）。一旦、生殖細胞系で確立されると、生殖細胞系の変異を有するマウスの適切
な育種によって、ヘテロ接合体状態およびホモ接合体状態の両方でこの動物に対
する変異の効果を決定し得る。

【０００３】遺伝子機能を調査するために利用されるノックアウト技術の使用の多数の例の
中で、米国特許第５，６２５，１２２号および同第５，５３０，１７８号（Ｍａ
ｋ，Ｔ．）が存在し、これらは、それぞれ、リンパ球特異的チロシンキナーゼｐ
５６^lckおよびＬｙｔ−２をコードする破壊された遺伝子を有するマウスの産生を記載する。Ｓｉｌｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２０１（１９９２）は、
破壊されたα−カルシウムカルモジュリンキナーゼＩＩ遺伝子（αＣａＭＫＩＩ
遺伝子）を有するマウスを作製し、これは、異常不安応答および攻撃的行動を有
する動物を生じた。（Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：２９１（１９９４
）もまた参照のこと）。Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１１０８（１９
９５）は、塩基性ロイシンジッパー転写因子をコードするマウスのＣ／ＥＰＢα
遺伝子の破壊が変異動物において障害されたエネルギーホメオスタシスを生じる
ことを実証した。Ｋｎｕｄｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：９６０（１９９
５）は、マウスにおけるＢＡＸ遺伝子の破壊がリンパ球増殖および雄性生殖細胞
死を生じることを実証した。

【０００４】ノックアウト動物を産生する最も一般的なアプローチは、相同組換えを介して
、ＤＮＡ構築物（この標的遺伝子部分に相同なＤＮＡ配列と隣接する選択マーカ
ー遺伝子をコードする）を標的遺伝子（通常、胚性幹細胞）に挿入することによ
る標的遺伝子の破壊を含む。適切に設計された場合、このＤＮＡ構築物は、標的
遺伝子を組み込み、そして破壊し、それによってその遺伝子によりコードされる
活性遺伝子産物の発現を妨害する。

【０００５】相同組換えは、相同なＤＮＡ配列を介して２つの遺伝エレメント（染色体外、
染色体内、または染色体外エレメントと染色体座との間のいずれか）の間の組換
えを含み、これはこの遺伝子配列の間の物理的なＤＮＡの交換を生じる。相同組
換えは、哺乳動物細胞に限定されず、細菌細胞、酵母細胞、粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓ
ｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍおよび他の生物でもまた生じる。哺乳動物
細胞における相同組換えの概説については、Ｂｏｌｌａｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｇｅｎｅｔ．，２３：１９９〜２２５（１９８９）を参照のこと（本明細書中で
参考として援用される）。真菌細胞における相同組換えの概説については、本明
細書中で参考として援用されるＯｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｒｅｖｉｅｗｓ，４９：３３〜５８を参照のこと。

【０００６】前記により例証されるように、遺伝子ノックアウト技術はしばしばマウスで使
用され、そして多数の遺伝子の機能の同定およびいくつかの場合、疾患における
それらの役割を突き止めることを可能にしてきた。多くのことが、マウス遺伝学
の研究からヒト遺伝子の機能について学ばれ得る。なぜなら、ヒトにおける莫大
な大部分の遺伝子は、マウスにおける相同的な対応物を有するからである。種間
のこの高いレベルの相同性のために、現在、個々のヒト遺伝子の機能を規定し、
そしてマウスにおいて選択された遺伝子について標的化生殖細胞系変異を作製す
ることによって、健康および疾患においてそれらの役割を評価し得る。生じた変
異マウスの表現型は、ヒトでの表現型を規定するために使用され得る。

【０００７】マウス変異がヒト由来の遺伝子機能にそのような有用な洞察を提供し得るとい
う増加する認識によって、非常に多数の関心が、ヒトゲノムプロジェクトのよう
な種々のゲノムイニシアチブの部分として単離および特徴付けられつつあるこれ
らの遺伝子に対応するマウスの遺伝子内に変異を系統的に生成することに対して
発生している。大規模な変異誘発実験のためにこれらの手順を利用する際の問題
は、トランスジェニック動物および標的化された変異を生成するための技術が、
現在のところ非常に退屈で、高価で、そして労働集約的であることである。

【０００８】標的化変異の効率的な生成における最大の問題の１つは、標的化構築物の生成
である。標的化構築物は、代表的には、目的の領域を含むゲノムクローンを単離
し、制限マップを作製し、頻繁にはこのクローンに制限部位を操作し、そして手
動で切断しそしてフラグメントを貼り付けてこの構築物を操作することによって
、調製される。例えば、Ｍａｋ，Ｔ．の米国特許第５，６２５，１２２号および
同第５，５３０，１７８号；Ｊｏｙｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：１５３〜
１５６（１９８９）；Ｔｈｏｍａｓら、前出；Ｓｉｌｖａら、前出、Ｃｈｅｎら
、前出；Ｗａｎｇら、前出；およびＫｎｕｄｓｅｎら、前出を参照のこと。この
プロセスは、終えるまで少なくとも数週間、しばしば数ヶ月の間、１人の非常に
熟練した当業者を必要とし得る。したがって、種々の遺伝子の機能をさらに迅速
かつ効率的に評価し、そして健康および疾患におけるそれらの役割を理解するた
めには、詳細な制限マッピングおよび特定の他の複雑な分子操作工程を必要とし
ない標的化構築物の産生のためにさらに効率的な方法を開発する必要がある。

【０００９】（発明の要旨）本発明は、特定の細胞が相同組換えを媒介する能力を利用することによって遺
伝子標的化ベクターを調製するための非常に効率的な方法に関する。本発明はま
た、本発明の方法によって作製されるまたは入手可能な標的化構築物に関する。

【００１０】本発明の方法によって産生される標的化構築物は、遺伝子（またはそれらの調
節配列）を「ノックアウト」するため、または予め選択された遺伝子座への遺伝
子を「ノックイン」するためのいずれかのために設計され得る。遺伝子調節エレ
メント（例えば、プロモーターまたは他の転写調節エレメント）はまた、標的遺
伝子の発現を調節するように標的遺伝子の近位に「ノックイン」され得る。

【００１１】本発明に従う標的化構築物は、標的とされる遺伝子または遺伝子座の１つ以上
の部分に相同な標的化ＤＮＡ配列を含む。さらに、標的化構築物は、標的化ＤＮ
Ａ配列に隣接する破壊エレメント（例えば、マーカー遺伝子）を含む。この破壊
エレメントは、相同組換えを介して標的遺伝子または標的遺伝子座（本明細書中
、以下「標的」）に導入されたときに、その標的遺伝子の発現を破壊する。ある
いは、破壊エレメントの代わりに、転写調節配列または別の遺伝子もしくはそれ
らの部分は、相同な標的化配列に隣接し、それによって遺伝子または遺伝子座へ
のそれらの導入を可能にし得る。そのような代わりの構築物はまた、その発現を
許容するが標的遺伝子の機能を破壊しない方向においてマーカー遺伝子を含み得
る。

【００１２】標的化構築物はまた、複製適合性または複製欠損ベクター（例えば、プラスミ
ド、ファージミド、コスミド、人工酵母染色体）ならびにウイルス（例えば、バ
クテリオファージまたは哺乳動物ウイルス）を含む。複製非適合性ベクターの使
用は、ヘルパーウイルスまたはそのベクター中の複製欠損を補完する他のヘルパ
ーエレメントの同時使用を必要とし得る。

【００１３】本発明の実施のための宿主として好ましい細胞には、相同組換えを媒介する能
力を有する細胞が含まれる。すなわち、同じ遺伝エレメントまたは別々の遺伝エ
レメント上の相同ＤＮＡ配列間での組換えを許容する細胞である。好ましい細胞
として、酵母を含む真菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、粘菌（例えば、Ｄｉｃｔｙ
ｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、および細菌細胞が挙げられる。最
も好ましい細胞は酵母の細胞であり、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅである。

【００１４】酵母中で遺伝子標的化ベクターを調製するための好ましい方法は、本発明に基
づく相同組換えによる方法であって、以下の工程を包含する：ａ）標的化されるゲノム配列の少なくとも一部の機能的構成成分に対応する細菌
選択マーカーおよびゲノムＤＮＡフラグメント、酵母の選択マーカーを含有する
シャトルベクターを調製する工程；ｂ）マーカーカセットを含有する特異的に操作されたフラグメント（ＳＥＦ）を
調製する工程であって、このマーカーカセットは、工程ａ）の酵母の選択マーカ
ーと異なる第２の酵母の選択マーカー、および哺乳動物の幹細胞内における発現
が可能な選択マーカーを含有し、上記マーカーカセットは、標的化される遺伝子
の一部に対して相同な哺乳動物の遺伝子特異的隣接配列（標的化配列）のそれぞ
れの側面に隣接する；ｃ）酵母細胞を、工程ａ）のシャトルベクター、および工程ｂ）のＳＥＦで形質
転換し、そして上記シャトルベクターおよび上記ＳＥＦを相同組換えによって組
換え可能にし得る工程；ｄ）形質転換した酵母細胞を、酵母の選択マーカーの発現について選択する工程
；ならびに、ｅ）標的化ベクター産物を、工程ｄ）で選択した酵母細胞からのシャトルベクタ
ーとＳＥＦとの間の組換えによって単離する工程。

【００１５】好ましくは、ＳＥＦを含む哺乳動物遺伝子特異的隣接配列は、それぞれ少なく
とも２０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡを含有する。さらに好ましくは、遺伝子特異的
隣接配列が、それぞれ少なくとも４０ｂｐのＤＮＡを含む。ＳＥＦはまた、標的
化配列に隣接する選択マーカーを含有する選択マーカーカセットを含み得る。こ
のマーカー配列はまた、マーカーを含むクローンの選択を可能にするタンパク質
を発現すると共に、標的化された遺伝子がコードする活性遺伝子産物の発現を妨
げる作用をし得る破壊配列（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）として作
用し得る。

【００１６】あるいはＳＥＦは、転写制御配列、あるいは標的化される配列に隣接する他の
遺伝子の全てまたは一部を含み得る。好ましい実施態様において、選択マーカー
カセットは、さらに、転写制御配列が指向される標的化される遺伝子に作動可能
に連結されることが可能であるのに対して組換え標的化ベクターの選択が可能に
なるように、選択マーカー配列に対して３’に位置する転写制御エレメントを含
有し得る。好ましくは、転写終止配列は、マーカーからの転写読み込みおよび転
写調節配列を通る転写読み込みを妨げるように、選択マーカー配列と転写制御配
列との間に位置する。

【００１７】本発明の実施において使用されるゲノムＤＮＡフラグメント（標的化されるゲ
ノム領域に対応する）は、約１キロベース（ｋｂ）〜約１５ｋｂを含有し、そし
て標的化される遺伝子配列の少なくとも一部を含む。好ましくは、ゲノムフラグ
メントは、６ｋｂより大きい。好ましくは、ゲノムＤＮＡフラグメントは、標的
遺伝子内の標的化される特定部位の各々の端上に、約０．５〜約５ｋｂのＤＮＡ
を含む。

【００１８】本発明に従う第１および第２の酵母の選択マーカーは、Ｈｉｓ３、Ｕｒａ３、
およびＬｅｕ２からなる群から選択されるが、マーカーを発現する酵母の選択に
有効な他のマーカーは、当該分野で周知である。好ましくは、第１の酵母の選択
マーカーは、シャトルベクター内に見出され、そしてＳＥＦは、互いに異なる。

【００１９】本発明に従う、好ましい細菌の選択マーカーは、ｔｅｔ^rマーカー、ａｍｐ^rマ
ーカー、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｏｌ）耐性マーカー、
および当該分野で周知の他のマーカーからなる群から選択される。

【００２０】適切な哺乳動物細胞の選択マーカーは、選択培地中で哺乳動物細胞の増殖を許
容する生化学的マーカーであり得、そしてｎｅｏ^r、ハイグロマイシン耐性マーカー、サルモネラｈｉｓＤ、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラー
ゼ、および当該分野で周知の他のマーカーからなる群から選択され得る。他の適
切な哺乳動物細胞のマーカーは、物理的マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質
、ルシフェラーゼ、または他のマーカー）であり得、これらの発現は物理的手段
（例えば、蛍光発光または色生成）によって検出され得る（例えば、Ｃｈａｌｆ
ｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：８０２−８０５［１９９４］を参照のこと）
。

【００２１】物理的選択を可能にするマーカーは、本発明の方法の自動化を容易にする付加
利得を提供し、それにより、標的化構築物の生成においてさらに優れた処理能力
を提供する。

【００２２】本発明の他の実施態様において、第２の酵母の選択マーカーおよび哺乳動物細
胞の選択マーカーは、哺乳動物細胞および酵母の両方において選択機能を有する
同様のマーカーである。

【００２３】さらに本発明の他の局面は、本発明の方法の使用により作製される標的化構築
物、または入手可能な標的化構築物に関する。

【００２４】本発明はまた、遺伝子標的化構築物の調製方法に関し、この方法は、特異的に
操作されたフラグメント（ＳＥＦ）およびシャトルベクターを含有する、相同組
換え受容性細胞を培養する工程、相同配列を介してＳＥＦの組換えを許容する工
程、および得られる標的化ベクターを単離する工程、を包含する。

【００２５】本発明のさらに他の局面は、遺伝子標的化構築物を、相同組換え受容性酵母細
胞内で調製する方法であって、この方法は、標的化される遺伝子の全てまたは一
部を含有する第１のＤＮＡ構築物を調製する工程；標的化された遺伝子に挿入す
るためのＤＮＡを含有する、第２のＤＮＡ構築物を調製する工程（挿入するため
のＤＮＡは、標的化される遺伝子の一部に相同な遺伝子特異的配列の両方の側面
に隣接する）；第１および第２の構築物を、相同組換え受容性細胞に導入する工
程；第１および第２のＤＮＡ構築物を、それらの相同配列を介して組換え可能に
し、それにより標的化構築物を作製する工程；および、標的化構築物を単離する
工程、を包含する。

【００２６】また、本発明によって、本発明の標的化ベクターを使用して産生されたトラン
スジェニック動物、または標的化された変異を含むトランスジェニック動物が意
図され得る。

【００２７】（詳細な説明）その局面の１つにおいて、本発明は、特定の遺伝子座の破壊（すなわち、標的
化された変異）を、動物のゲノムに導入するための標的化構築物を生成する方法
に関する。本発明の標的化構築物はまた、ゲノム位置に他の機能的遺伝子を導入
する（「ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）」）か、あるいは遺伝子の機能または
発現を例えば、染色体座との作動可能な連結に外来プロモーターを配置するため
にノックインすることによって変化させるために使用され得る。この標的化構築
物を細胞の、標的化構築物内の相同配列と、ゲノム位置または目的の遺伝子内の
配列との間の相同組換えを媒介する能力を利用して、適切なゲノム領域に挿入す
る。

【００２８】標的化ベクターを構築するための従来の方法とは異なり、本発明の実施は、標
的化ベクターを調製するための詳細な制限マップ、または広範なＤＮＡ配列情報
を必要としない。なぜなら、このような詳細な情報は、本発明に従う標的化構築
物の調製においては必要ではなく、ベクターは以前に使用された方法より、より
迅速かつより効果的に生成され得る。

【００２９】遺伝子の標的化された変異誘発とは、適切な標的構築物を破壊される遺伝子部
位に導入することによって、単一細胞、選択された細胞、または全ての動物（ま
たは培養物）細胞の標的化された遺伝子にコードされるポリペプチドまたは正常
産物の構造の変化（例えば、部分的または完全な不活性化）をいう。

【００３０】標的化された変異誘発はまた、たとえ他の用途が可能であるとしても、遺伝子
の「ノックイン（ｋｎｏｃｋｉｎ）」をいう。ノックインとは、例えば、２つ
の遺伝子が機能的に同等であるかどうかを決定するために、１つの遺伝子を、他
の遺伝子の全てまたは一部に置き換えることを意味する（例えば、Ｈａｎｋｓら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：６７９（１９９５）を参照のこと、本明細書中で参
考として援用される）。例えば、プロモーターのような転写調節配列は、構造配
列に作動可能に連結されるように、ゲノム領域にノックインされ得る。

【００３１】最も多くの場合、標的化構築物は、破壊される遺伝子の少なくとも一部を含む
ように構築される。代表的には、活性遺伝子産物の発現を不可能にするために、
標的化構築物に含まれる遺伝子の部分を、分断化された遺伝子のリーディングフ
レームを破壊するマーカー配列（通常は選択マーカー）の挿入によって妨げる。
これは、高頻度で遺伝子のノックアウトまたは不活性化を引き起こす。例示的な
選択マーカーは、ｎｅｏ^r遺伝子である（そのマーカーが導入される細胞内で機能を有するプロモーター（例えば、細胞に抗生物質Ｇ４１８耐性遺伝子の発現を
付与するホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）の制御下）。

【００３２】本発明の以前は、このような構築物の調製は、代表的に、標的化ベクターを最
終的に生成するＤＮＡフラグメントを「切り取りおよび貼り付け」するために使
用される遺伝子フラグメント中の、都合のよい制限部位を同定するために、制限
マッピングを含んだ。しかしながら、制限マッピングはしばしば、都合のよい制
限部位が利用可能でないことがあるため、標的化構築物の種々の成分中に操作を
施さなければならないことを明らかにする。本発明に従って、詳細な制限マッピ
ングおよび配列情報は、標的化構築物を調製するために必要ではなく、このこと
は標的化構築物の調製において、時間および労力の有意な節約を生じる。

【００３３】このような標的化構築物が胚性幹細胞に導入される場合、これらは細胞中で、
その構築物および破壊されるゲノム領域中の両方の相同配列を介して標的化され
る遺伝子と組換えを生じ得る。相同組換え現象の結果はしばしば、マーカー配列
の標的化される遺伝子への挿入であり、それにより遺伝子を破壊する。同様に、
遺伝子にノックインするために設計された標的化構築物は、相同組換えによって
相同なゲノム部位で組換えを生じ得、そして全てまたは一部の遺伝子の遺伝子座
への導入を生じる。遺伝子をノックインするための技術は、Ｈａｎｋｓら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２６９：６７９（１９９５）に詳細に記載され、これは本明細書中
での参考として援用される。

【００３４】標的化構築物を動物の生殖系列に導入するために、初めに、標的化構築物は、
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と呼ばれる未分化状態にある分化全能性細胞に導入され
る。ここでは、その構築物は、ゲノムの相同配列を介して選択されたゲノム領域
で組換えを生じ得る。ＥＳ細胞は、導入される発生途上の胚と同じ種の胚または
胚盤胞由来である。発生過程の胚盤胞期の胚において哺乳動物に導入される場合
、ＥＳ細胞は、代表的に、内部細胞集団に組み込む能力、および個体の生殖系列
に寄与する能力について選択される。従って、この能力を有する任意のＥＳ細胞
株は、本発明の実施における使用に適切である。

【００３５】その細胞は、標的化構築物を導入するために、当業者に周知の方法を使用して
培養および調製される。（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編「Ｔｅｒａ
ｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ
ｓ，ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．［１９８７］；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＴｏｐｉｃｓｉｎＤｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３５７−３７１［１９８
６］；Ｈｏｇａｎら、「ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍ
ｂｒｙｏ」：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＮｅｗＹｏｒｋ［１９８６］；Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ
、５１：５０３［１９８７］；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０７３０［１９９１］；Ｄｏｒｉｎら、Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃＲｅｓ．、１：１０１［１９９２］；および、Ｖｅｉｓら、Ｃｅｌ
ｌ、７５：２２９［１９９３］（これらは全て本明細書中で参考として援用され
るを参照のこと）。標的化構築物は、当該分野に公知のいくつかの方法（エレク
トロポレーション、リン酸カルシウム共沈降（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏ
ｎ）、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、リポフェクションなど
）の任意の一つの方法によって、ＥＳ細胞に導入され得る。標的化構築物の標的
化される遺伝子への挿入は、代表的に、標的化構築物に含有されるマーカー遺伝
子を発現する細胞を選別することにより検出される。代表的に、マーカー遺伝子
は、標的化細胞型において機能を有するプロモーターの制御下にある（すなわち
、胚性幹細胞において機能するプロモーター）。次いで、マーカー配列を発現す
るＥＳ細胞は単離され、そして拡大される。

【００３６】次いで、破壊を有するＥＳ細胞は、初期マウス胚（例えば、胚盤胞）に導入さ
れる（例えば、本明細書中で参考として援用されるＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、前出、
Ｂｒａｄｌｅｙ、前出、およびＭｏｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４
８（１９９８）を参照のこと）。この目的のために使用する胚盤胞および他の初
期胚は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、前出、およびＢｒａｄｌｅｙら、前出
、中に記載される方法によって、妊娠中の動物の子宮を流す（ｆｌｕｓｈｉｎｇ
）ことによって得られる。胚盤胞を発生する適切な段階は種依存的ではあるが、
マウスでは、受精後約３．５日である。

【００３７】発生の的確な年齢／段階の任意の胚が、改変ＥＳ細胞の移植に適切であるが、
最も好ましい胚は雄性であり、そしてＥＳ細胞遺伝子によってコードされる毛色
マーカーまたは他の表現型マーカーとは異なる毛色マーカーまたは他の表現型マ
ーカーをコードする遺伝子を有する。この方法においては、子孫は、モザイクの
毛色（例えばアグーチ）、または他の表現型マーカー（ＥＳ細胞が発生途上胚に
組み込まれたことを示す）を捜すことによって、標的化された変異の存在が容易
にスクリーニングされ得る。従って、例えば、ＥＳ細胞系列が白い毛の遺伝子を
保有する場合、選択される宿主胚は黒またはアグーチの毛の遺伝子を保有するこ
とが好ましい。

【００３８】標的化構築物を有するＥＳ細胞を含有する胚を調製する別の方法は、「集合キ
メラ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｃｈｉｍｅｒａｓ）」を生成することである。
適切な発生段階（マウスでは受精後約２１／２日）の桑実胚が単離される。桑
実胚を刺激の弱い酸の溶液を用いて約３０秒間処理することによって透明帯が除
かれ得、それによって、桑実胚を含む細胞は「凝集塊（ｃｌｕｍｐ）」として曝
露される。次いで、特定のＥＳ細胞型（例えば、マウスのＲ１細胞系列）は桑実
胚細胞と共に培養され得、桑実胚とＥＳ細胞との集合キメラ胚が形成され得る（
Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．「ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ」、ＴｈｅＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈＳｅｒｉｅｓ、ＪＲＬＰｒｅｓｓＯｘｆｏ
ｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９３、本明
細書中で参考として援用される）。

【００３９】集合キメラ胚方法の改良点は、本質的にノックアウト構築物を含むＥＳ細胞の
みからなる胚を生成するために使用され得る。この技術において、ごく初期の段
階の接合体（例えば、マウスでは２細胞段階の接合体）は、穏やかな電気刺激を
与られる。この刺激は、接合体において細胞の核を融合するように作用し、それ
により、天然に存在する同じ発生段階の接合体の、２倍（またはそれ以上）のＤ
ＮＡを有する単一の核を生成する。これらの接合体細胞は、本来の発生途上胚か
ら排除され、そして胚外膜のような付属的な胚構造を形成するためだけに寄与す
る。従って、ＥＳ細胞が接合体細胞と共に培養される場合、発生途上胚は排他的
にＥＳ細胞から構成される（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．、前出を参照のこと）。

【００４０】ＥＳ細胞が集合キメラまたは胚盤胞に組み込まれた後、胚は偽妊娠養母の子宮
に移植され得る。任意の養母が使用され得るが、好ましい養母は、代表的には、
満足に養育する能力および繁殖する能力、ならびに子供の世話をする能力に対し
て選択される。このような養母は、代表的に、精管切除された同種の雄と対にす
ることにより調製される。偽妊娠段階の養母は移植を成功するために重要であり
、そして種に依存的である。マウスでは、この段階は偽妊娠約２〜３日である。

【００４１】養母になるために生まれる子孫は、モザイクコートカラーまたは他の表現型マ
ーカー（表現型選択ストラテジーが使用される）について、始めにスクリーニン
グされ得る。さらに、またはそのかわりに、子孫の尾組織から得られた染色体Ｄ
ＮＡは、サザンブロットおよび／またはＰＣＲを使用して標的化された変異の存
在についてスクリーニングされ得る。標的化された遺伝子座での相同組換えに対
して陽性である子孫は、代表的には宿主胚由来の野生型細胞および注入されたＥ
Ｓ細胞（すなわち、キメラ子孫）由来のヘテロ接合性細胞のモザイクである。キ
メラ子孫は、標的化された変異に対してヘテロ接合性である（すなわち、それら
すべての細胞がその変異に対してヘテロ接合性である）子孫を生ずるために、野
生型パートナーと交配される。

【００４２】マイクロインジェクションを使用して、トランスジェニック哺乳動物（ウサギ
、ブタおよびラットを含む）を産生する方法は、Ｈａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３１５：６８０−６８３（１９８５）に記載される。

【００４３】標的化された変異に対してホモ接合性である動物が所望される場合、その動物
は、標的化された変異に対してヘテロ接合性の動物との交配により、調製され得
る。破壊に対してホモ接合性の哺乳動物は、この交配の産物である哺乳動物、な
らびに公知のヘテロ接合性である同種の哺乳動物、および野生型哺乳動物からの
等量のゲノムＤＮＡのサザン・ブロッティングにより同定され得る。あるいは、
その変異体座と同時隔離する特異的制限フラグメント長多型性が、検出され得る
。ゲノムＤＮＡにおける標的化構築物の存在についてサザン・ブロットをスクリ
ーニングするためのプローブは、下記に記載のように設計され得る。

【００４４】破壊した遺伝子を有する子孫を同定および特徴付ける他の手段もまた、利用可
能である。例えば、ノーザン・ブロットは、転写物の存在または非存在について
子孫の種々の組織から得られるｍＲＮＡをプローブするために使用され得る。標
的化された遺伝子によりコードされる転写物の長さの違いもまた、検出され得る
。さらに、標的化された遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体でウ
ェスタン・ブロットをプローブすることにより、その標的化された遺伝子の発現
レベルの評価に使用され得る。ウェスタン・ブロットのためのタンパク質は、こ
の遺伝子が通常発現される組織から単離され得る。最終的に、子孫からの種々の
細胞のインサイチュ分析（例えば、細胞の固定化および抗体または核酸のプロー
ブでの標識）および／またはＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取法）分析は、遺伝産
物の有無を捜すために適切な抗体を使用して行われ得る。

【００４５】前述の議論は、相同組換えを通してＤＮＡをゲノム遺伝子座へ誘導するための
標的化構築物の使用を記載するが、相同組換えの過程はまた、本発明に従って、
標的化構築物自体を調製するために使用され得る。

【００４６】一般に、本発明の方法は、少なくとも２つのＤＮＡ構築物、シャトルベクター
および特異的に操作されたフラグメント（ＳＥＦ）を調製する工程を包含する。
本発明に従うシャトルベクターは、酵母選択マーカー、細菌性選択マーカー、お
よび標的化されるゲノム部位の部分と対応するゲノムＤＮＡのフラグメントを含
有する。このフラグメントは、好ましくはエキソンの全てまたは一部に対応する
。あるいは、ゲノムＤＮＡのフラグメントは、イントロンの全てまたは部分の遺
伝子の５’または３’非コード領域の部分に対応し得る。

【００４７】特異的に操作されたフラグメントは、互いに異なる独特な隣接配列（標的化配
列）であって、標的化されるゲノム部位における配列に対応する配列を含む。Ｓ
ＥＦの隣接配列間に挿入されるものは、マーカーおよび破壊配列の両方として役
に立ち得るマーカー配列であり得る。あるいは、転写調節配列または転写調節配
列の５’に配置されたマーカー配列の組み合わせは、その隣接配列の間に挿入さ
れ得る。このシャトルベクターおよびＳＥＦは、シャトルベクターおよびＳＥＦ
における相同な配列間の組換えを媒介する酵母細胞へ導入され、シャトルベクタ
ーにおけるゲノムＤＮＡのフラグメントへ、独特の隣接ＤＮＡ間に挿入されたＤ
ＮＡを効果的に導入する。この結果生ずる標的化構築物は、上記のように、標的
化された変異を生成するために使用され得る。

【００４８】本発明の任意の局面に従う相同組換えに関与するＤＮＡ配列は、互いに１００
％相同（すなわち、同一）である必要はないが、概して、配列間の相同性が大き
ければ大きいほど、組換え効率は大きくなることを注意すべきである。

【００４９】酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｎｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、インビボでの遺
伝子工学に対して非常に有用である相同組換えを含む高度に発達した遺伝子系を
有する（例えば、Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４
９：３３（１９８５）を参照のこと）。酵母では、直鎖状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ
が、染色体の標的またはプラスミドの標的のいずれかと有効な相同組換えを起こ
し（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出）、これは野生型Ｅ．ｃｏｌｉの直鎖状ｄｓ
ＤＮＡの運命と対照的であり、細菌細胞へ導入される場合、分解される。本発明
は、標的変異の生成のための標的化構築物の産生の効率を増大させるために酵母
の相同組換え系を利用することに関する（例えば、変異をノックアウトする、ま
たはノックインする）。

【００５０】本発明に従って、酵母における相同組換えは、標的化構築物の調製がマウスま
たは他の哺乳動物のゲノムの任意のセグメントを本質的に標的化にするのを可能
にする。標的化構築物の作製に使用される伝統的な方法とは異なり、本発明の方
法は、詳細な制限酵素地図作成も、都合のよい制限部位も、制限部位の操作も要
求しないが、ｃＤＮＡの少なくとも一部、および標的遺伝子のエキソンの一部ま
たは標的化される遺伝子座の一部を少なくとも含むゲノムクローン（５’または
３’非翻訳配列またはイントロン配列を含む）、およびそのエキソンまたは遺伝
子座に関して制限された配列情報を要求する。このアプローチは、以下で、特定
の遺伝子および特定のマウス系統を参考にして例証する。しかし、本発明の方法
は、マウスおよび他の哺乳動物の、他の遺伝子および他の種に、容易に適合させ
得る。本発明の一般的方法は、図１に概要的に描写される。

【００５１】概観するために、少なくとも標的にされる遺伝子の一部分を含む１２９／ｓｖＤＮＡのゲノムライブラリーから得られた、マウス１２９／Ｓｖ（例えば、Ｋ
ｎｕｄｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：９６（１９９５）を参照のこと）の
ゲノムＤＮＡのフラグメントは、酵母およびＥ．ｃｏｌｉ中で選択を可能とする
選択マーカーを有する酵母／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターへ、クローン化され
る（例えば、ＵＲＡ３（酵母）およびａｍｐ^r（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択マーカー）。ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを調製する方法は、当該分野
において周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（それぞれ、第９章，９
．２〜９．５８頁および第８章８．２〜８．７９頁）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＮＹ（１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（第５章，５．０．１〜５．１１
．２）Ａｕｓｕｂｅｌら、編 JｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓＩｎｃ．（１９８７）において記載され、これらの関連する章は、本明細書中で参考
として援用される。ゲノムＤＮＡがクローン化されているシャトルベクターは、
標的化ベクターの組換えおよび生成のための標的として作用する両方の酵母細胞
において増殖し得、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて増殖および増幅し得、そしてそ
こから多量のベクターが得られ得る同時に、特異的に操作されたフラグメント（ＳＥＦ）は、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）により生ずる。このＳＥＦは、酵母（例えば、ＨＩＳ３）およびＥ
Ｓ細胞（例えば、ＥＳ細胞内でｎｅｏ遺伝子の発現を指向し得るプロモーターの
制御下のＰＧＫ−ｎｅｏ、ネオマイシン耐性遺伝子）（すなわち、Ｈｉｓ−ｎｅ
ｏセグメント）（マーカーカセット）における選択のためのマーカーを含み得る
。そのマーカーは、各端で約４０塩基（ｂｐ）の独特の配列が隣接する（その独特
の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応によって、または合成的に調製される）。その
独特の配列は、破壊されるべき遺伝子の領域に対応し、それを通じて相同組換え
が生じる。独特の隣接配列として使用するためのＤＮＡ配列の選択は、その遺伝
子もしくは標的化される遺伝子座のｃＤＮＡ配列、またはゲノム配列に基づいて
行われ得るが、しかし、公知の制限部位の存在を必要とせず、また独特のゲノム
ＤＮＡに制限部位が操作されることを必要としない。このＳＥＦはまた、酵母お
よびＥＳ細胞の両方において選択が可能な単一マーカー配列を包含し得る。独特
の隣接配列の長さは、約１０ｂｐ〜２００ｂｐまたはそれ以上に変化し得る。好
ましい長さは、約４０ｂｐ〜約２００ｂｐであるが、より長い配列は組換えの効
率を増大し得る。１ｋｂの長さは、相同組換えの効率に有利であり得る。

【００５２】他の例示的な選択マーカーは、ハイグロマイシン耐性を与える遺伝子、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａｈｉｓＤ遺伝子（細胞がヒスチジナールをヒスチジンへ転換
するのを可能にする）、ピューロマイシンＤ−アセチルトランスフェラーゼなど
をコードする遺伝子を包含する。使用されるマーカーは、上記に開示されたマー
カーに限られないが、当該分野において周知の他の種々の選択マーカーであって
、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、および／または哺乳動物細胞において選択するのに有用
なマーカーもまた含む。

【００５３】標的化されるゲノム領域の全てまたは部分を包含するシャトルベクターおよび
ＳＥＦは、酢酸リチウム形質変換またはエレクトロポレーションにより（または
当該分野において公知の他の方法により）、連続的にまたは同時にのいずれかで
、酵母株、例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ１
５００へ導入される。一旦、酵母細胞に入ると、ＳＥＦおよびシャトルベクター
は、それらの相同的な遺伝子配列（すなわち、シャトルベクター内のＳＥＦの隣
接配列およびゲノム配列）を通じて相同組換えにより組み換えられ得、それによ
り、１つまたは複数のマーカーをＳＥＦからシャトルベクターの相同なＤＮＡへ
挿入し、その結果、標的化構築物が生ずる。標的化構築物の配列は、標的化遺伝
子の配列に隣接するＨＩＳ３−ｎｅｏ遺伝子（またはマーカーがＳＥＦの構築に
おいて使用されたマーカーはどれも）が組み込まれた遺伝子を含み、そしてヒス
チジンが欠失した培地において構築物を含有する酵母の成長によりＨＩＳ３マー
カーについて選択することにより同定され得る。他のマーカーの選択のための培
地もまた、当該分野において公知である（前出）。次いで、標的化されたクロー
ンは、ＨＩＳ３およびプラスミドＵＲＡ３マーカーが、ウラシルが欠失した培地
においてレプリカ平板形質変換体により同時分離するか否かの決定によって同定
される。

【００５４】次いで、相同組換えにより生じたＳＥＦの組み込みを確認するために、標的化
されたプラスミドは、挿入物の各末端からプライマーを使用してＰＣＲにより分
析される。最終的に、その挿入物を含む標的ベクターは、十分な量の精製構築物
（例えば、プラスミド）ＤＮＡが最終分析およびＥＳ細胞への導入のために調製
され得るように、バクテリアへ往復（シャトル）される。このようにして、標的
化ベクターはかなり容易に、かつ迅速に作製され得、広範囲におよぶ遺伝子マッ
ピングおよび慣習的な方法により要求される適切な制限酵素部位の検索を不必要
とする。本発明の方法に従って標的化ベクターを構築および選択する容易さは、
特に特定の物理的に検出可能な（例えば、比色法、蛍光比色法など）マーカーが
標的ベクターの選択に使用される場合、容易に、それを自動化手順へ導くことに
注目すべきである。

【００５５】本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に記載される。

【００５６】実施例１は、Ｔｇ７３７遺伝子の使用により例示されるような相同組換えによ
り、酵母における標的化ベクターの生成を記載する。

【００５７】実施例２は、Ｈｉｓ−ｎｅｏＳＥＦの構築を記載する。

【００５８】実施例３は、標的化構築物のＥＳ細胞への導入を記載する。

【００５９】実施例４は、ロングレンジＰＣＲによりＥＳ細胞における相同組換えの検出の
ための方法を記載する。

【００６０】実施例５は、Ｔｇ７３７ノックアウトマウスの作製を記載する。

【００６１】実施例６は、Ｒａｌｙ遺伝子のための標的化ベクターの作製を記載する。

【００６２】（実施例１）（酵母における相同組換えによる標的化ベクターの作製）本発明の方法は、詳細な制限酵素地図ならびにイントロンエキソンの構造およ
び情報を必要としないが、本方法を、公知の制限酵素地図およびエキソン／イン
トロン構造を有する遺伝子を原理の証明として使用して試験した。この方法で使
用するために選択されたＴｇ７３７遺伝子は、Ｍｏｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６４：１３２９−１３３３，１９９４（本明細書中で参考として援用される）
によって同定され、そして制限酵素マッピングおよび部分的配列決定により特徴
付けられている。

【００６３】Ｔｇ７３７の５’領域の制限酵素地図は図２に示される。エキソン２を含む１
０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＡＴＧ翻訳開始コードを有する）を
、λ ＤａｓｈＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）中の１
２９／Ｓｖマウスゲノムクローンから、Ｅ．ｃｏｌｉ／酵母シャトルベクターｐ
ＲＳ４１６およびｐＲＳ４２６へ、それぞれサブクローニングした。（Ｓｉｋｏ
ｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：１９−２７（１９８９）；Ｃｈｒｉｓ
ｔｉａｎら、Ｇｅｎｅ，１１０：１１９−１２２，共に本明細書中で参考として
援用される）。しかし、他のシャトルベクターが使用され得る。シャトルベクタ
ーｐＲＳ４１６は、低コピー数動原体基部プラスミド（ＹＣｐ）であり、一方ｐ
ＲＳ４２６は多コピー２μ環状ベースのプラスミド（ＹＥｐ）である。この両ベ
クターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）に由来し、そしてＵＲ
Ａ３（酵母）およびａｍｐ^r（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択マーカーを有する。Ｔｇ７３７ゲノムＤＮＡの１０．５ｋｂフラグメントをこの場合使用したが、他の配列長
は、シャトルベクターへのサブクローニングのために使用され得る。好ましい長
さは、６キロベース（ｋｂ）以上である。１つの好ましい実施態様において、ゲ
ノムのフラグメントは、より短い隣接配列は使用され得るが、標的化されるエキ
ソン（または遺伝子座）の各端に隣接している配列の１ｋｂ以上の配列を有する
。

【００６４】同時に、特異的に操作されたフラグメント（ＳＥＦ）（Ｔｇ７３７−ＨＩＳ−
ＳＥＦ）を、ハイブリッド６０−６１マープライマーを使用するＰＣＲによって
生成した。代表的なＳＥＦは、破壊されるゲノム領域の５’末端および３’末端
に対応する４０ｂｐの独特の配列により各端に隣接される酵母（ｈｉｓ３遺伝
子）およびＥＳ細胞（ｎｅｏ’遺伝子）における選抜のためのマーカーを含む。
より特定的には、Ｔｇ７３７−ＨＩＳＳＥＦ（両端において４０ｂｐのＴｇ７
３７エキソン２配列が隣接されたＨＩＳ３遺伝子配列）は，以下の順方向プライ
マーおよび逆方向プライマー（ｈｉｓカセットからの配列は太字で与えられる）
を使用して生成した。

【００６５】順方向プライマー（ＲＷ６４１）：（配列番号１）ＣＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣ
ＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＴＡＣＡＣＴＣ逆方向プライマー（ＲＷ６４２）ＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＡＡＣ
ＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＣＧＧ（配列番号２）適切なＰＣＲ条件は、容易に決定されるが、本実施例の目的のための代表的な
条件は、以下である：全量５０μｌの２５ピコモルの各プライマー、１０μｇプ
ラスミド、ＦｉｓｈｅｒＴａｑポリメラーゼを、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈサ
ーモサイクラーにおいて９４℃で５分間；３０回（９５℃で３０秒間；５５℃で
１分間；７２℃で２分間）および７２℃で１０分間のサイクリング。

【００６６】ＳＥＦのエキソン配列とシャトルベクター内のエキソン（または遺伝子座）配
列との間の相同性は、完全（１００％）である必要はないが、８０％〜１００％
の相同性が好ましいことに、注意すべきである。（哺乳動物細胞における組換え
効率に対する多様な配列の効果の考察については、Ｂｏｌｌａｇら、上記参照、
およびバクテリアに関する同様の考察については、Ｓｅｅｄ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ，Ｒｅｓ．，１１：２４２７（１９８３）を参照のこと。）この場合に生成されたＳＥＦは、４０ｂｐのＴｇ７３７エキソン２配列と両端
において隣接したＨＩＳ３遺伝子配列からなった。この構築物とともに、酵母に
おいてＴｇ７３７−ＳＥＦとＴＲ７３７組換えシャトルベクターとの間の相同組
換えは、ＨＩＳ３配列（０．９ｋｂ）による１３ｂｐの置換によるＴｇ７３７エ
キソン２の破壊を導くはずである。

【００６７】標的化構築物を生成させるために、ヒスチジンが欠失した培地で増殖し得ない
酵母株ＤＧ１５００（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を
、上記記載の（アルカリ溶解によって調製した）Ｔｇ７３７組換えシャトルプラ
スミドおよびＴｇ７３７−ＨＩＳＳＥＦ（図４）で、Ｇｅｉｔｚら（１９９５
）の方法を使用して同時に形質転換させた。ＨｉｇｈＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈＬｉｔｈｉｕｍＡｃｅｔａｔｅ．
：「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＹｅａｓｔ，ＡＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．Ｊｏｎｓｔｏｎ，編，１２１−１３４頁
、これは本明細書中で参考として援用される。一旦、このシャトルベクターが細
胞内に入ると、プラスミドは相同的なゲノム配列を介してＳＥＦと組換えする。

【００６８】Ｔｇ７３７組換えシャトルベクターおよびＴｇ７３７−ＳＥＦの組換えから生
じる標的化プラスミドを含むクローンを、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３マーカーが同
時分離するかを決定することにより同定した。この同時分離が、ＨＩＳ３マーカ
ー配列がシャトルベクター内に導入されたことを示唆する。これは、ｈｉｓ^-プレートからｕｒａ^-プレートへのレプリカプレート、およびＨＩＳ／ＵＲＡ陽性クローン（ヒスチジンおよびウラシル欠乏培地で増殖するクローン）を探索する
ことを含む。これらの、および他の選択手順は、当該分野で周知であり、そして
、例えば、ＧｕｉｄｅｔｏＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ編
、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１９４巻、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（本明細書に参考として援用する）に記載されている。こ
のプラスミドが、組込まれたＨＩＳマーカーを有さない場合（例えば、それが酵
母ゲノム内に組込まれた場合）、このプラスミドは、高い確率で有糸分裂の分離
を経て失われる。しかし、さらなる研究により、相同組換えの効率が９０％程度
であると示された。

【００６９】Ｈｏｆｆｍａｎら（Ｇｅｎｅ，５７：２６７−２７２（１９８７）（本明細書
に参考として援用する））の方法に従いＨＩＳ／ＵＲＡ陽性コロニーから、全酵
母ＤＮＡの少量調製物を作製し、プラスミドの増幅、精製、および解析のために
Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にシャトルさせた
。精製されたプラスミド（すなわち、標的化構築物）を、例えば、ＥｃｏＲＩ（
Ｒ）およびＰｓｔＩを用いた制限消化により解析した。組換えを介するエキソン
２の破壊前（−）および破壊後（＋）の、Ｔｇ７３７ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントを有するｐＲＳ４１６およびｐＲＳ４２６のＥｃｏＲＩ（Ｒ）およびＰｓｔ
Ｉ（Ｐ）消化物の比較を図４に示す。制限パターンにおいて予期される変化（矢
印）のみが、観察された（すなわち、野生型１．２ｋｂＥｃｏＲＩフラグメン
トの２．１ｋｂ変異フラグメントへの変換、および野生型１．０ｋｂＰｓｔＩ
フラグメントの０．１５ｋｂおよび１．７５ｋｂ変異フラグメントへの変換）。
このことは、その組込み事象が相同組換えのみにより起きたことを示した（注：
関連するＰｓｔＩ部位のみが地図に記されている）。

【００７０】組換えられた標的化プラスミドから前述のプライマーを用いた、Ｔｇ７３７エ
キソン２のＰＣＲ増幅により、非破壊のエキソン２を有するＤＮＡテンプレート
から増幅された９０ｂｐフラグメントに匹敵する、予期された１ｋｂフラグメン
トを得た。エキソン２特異的プライマーを用いた、全酵母ＤＮＡの少量調製物の
ＰＣＲ解析により、いくつかの場合において、同じサンプル中に、破壊されたエ
キソン２および非破壊のエキソン２の両方に対応する、２つのＰＣＲフラグメン
トが存在することが示された。このことは、酵母細胞内の組換えシャトルベクタ
ーの全てのコピーが、相同組換えを受けたわけではないという事実により説明し
得る。このことを、２つの独立した酵母クローン（ＩおよびＩＩ）から単離され
たＤＮＡを、細菌プラスミド中にエレクトロポレートし、各酵母クローン由来の
５つの独立した細菌クローンを選択し、そしてこれらのクローンから単離したプ
ラスミドを制限解析に供することにより確認した。このプラスミドの制限解析に
より、一方の酵母クローンに由来するの５つ全てのプラスミドは標的化されたプ
ラスミドであり、他方の酵母クローンに由来するプラスミドでは３つのみが標的
化された破壊を有することが明らかになった。この結果は、手順を進める前に、
細菌において標的化されたクローンを選択することが有効である（しかし必要で
はない）ことを示す。

【００７１】（実施例２）（Ｈｉｓ−ｎｅｏＳＥＦの生成）好ましくは、ＨＩＳ−ｎｅｏカセットを、テンプレートとして使用して、任意
のマウス遺伝子を本質的に破壊するＳＥＦを作製する。２．５ｋｂのＨＩＳ−ｎ
ｅｏカセットは、酵母内での標的化事象の選択のためのＨＩＳ３酵母遺伝子、お
よび続く、ＥＳ細胞内での標的化事象を選択するためのＰＧＫ−ｎｅｏ選択マー
カーを有す。しかし、他のマーカーを含む他のカセットは、単一のマーカーを含
んで使用し得る。この単一マーカーは、酵母およびＥＳ細胞の両方においての選
択に使用し得る。本明細書に記載のＨＩＳ−ｎｅｏカセットは、いくつかの固有
の制限部位を有するよう設計された。これら固有の制限部位は、ＥＳ細胞および
トランスジェニックマウス内での相同組換え事象を同定するプロセスにおいて役
立つ。

【００７２】ＨＩＳ−ｎｅｏマーカーカセット（図３）は、ＨＩＳ３遺伝子を含む０．９ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化したｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にサブクローン化
し、これによりｐＨｉｓプラスミドを作製することにより、調製した。Ｈｉｓ−
ｎｅｏカセットは、プラスミドｐＰＧＫ−ｎｅｏ^r−ｂｐＡから得られた、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモーター−ｎｅｏ^r−ウシ成長因子ｐｏｌｙＡを含む、１．６ｋｂのＣｌａＩ−Ｘｈｏフラグメントを、ｐＨｉｓプ
ラスミドのＣｌａＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入して完成させた（Ｓｏｒｉａｎｏら，
Ｃｅｌｌ，６４：６９３−７０２（１９９１）．を参照）。

【００７３】Ｔｇ７３７−ＨＩＳ−ｎｅｏＳＥＦ（２．６ｋｂ）を、ＨＩＳ−ｎｅｏカセ
ットをテンプレートとして使用したＰＣＲにより誘導した。ＰＣＲにより、この
ＳＥＦを作製するために、２つの６０−ｍｅｒのハイブリッドプライマーを使用
した；各プライマーの最初の４０ｂｐは、エキソン２の５’あるいは３’末端（
前述の、Ｔｇ７３７−ＨＩＳ−ＳＥＦ用のものと同じ）に対応し、そして最後の
２０ｂｐは、ＨＩＳ−ｎｅｏカセットの５’あるいは３’末端に対応する（上記
参照）。

【００７４】Ｔｇ７３７−ＨＩＳ−ｎｅｏＳＥＦ（Ｔｇ７３７エキソン２配列の４０ｂｐ
が両側に隣接しているＨＩＳ３−ＰＧＫ−ｎｅｏ−ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡ配列；Ｈ
ＩＳ−ｎｅｏによる中央１３ｂｐの置換により、その７３７エキソン２が破壊さ
れている）は、以下のプライマーを用いて作製した（ＨＩＳ−ｎｅｏの配列は太
字で示される）。

【００７５】順方向プライマー（７３７−ＨＩＳＳＥＦ（ＲＷ６４１）用と同じ）：（配
列番号１）対して、逆方向プライマー（ＲＷ６７８）：

【００７６】

【化１】使用したＰＣＲの条件は、先に記載される通りであった。

【００７７】Ｔｇ７３７−ＨＩＳ−ｎｅｏＳＥＦを、リチウムアセテート形質転換により
、前述のシャトルベクターのＴｇ７３７遺伝子の１０．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントをすでに保持する酵母（ＤＧ１５００）に導入した（図５参照）。
相同組換え体を、前述のＨＩＳマーカーを用いて選択し、そして選択したコロニ
ーから単離したプラスミドＤＮＡを、プラスミド精製のためにＥ．ｃｏｌｉ内に
エレクトロポレートした。

【００７８】組換え標的化プラスミドを、制限マッピング（データは示さず）およびＰＣＲ
（下記実施例５を参照）により解析した。エキソン２および隣接のエキソン３（
図６）に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ解析により、野生型ゲノムクローン
から４．５ｋｂのフラグメントを増幅し、そしてＨＩＳ−ｎｅｏを破壊した、標
的化されたクローンから、７．０ｋｂの予期されるサイズのフラグメントを増幅
した（図６参照）。Ｔｇ７３７−ＨＩＳＳＥＦ（前述）を使用した、並行した
解析においては、５．５ｋｂの予期されるサイズのフラグメントが観察された。

【００７９】（実施例３）（ＥＳ細胞への標的化構築物の導入）ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションのために、Ｈｉｓ−ｎｅｏカセットおよ
びエキソン２特異的配列を含む標的化プラスミド由来のＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ
（ＳａｎｔａＣｌａｒｉｔａ，ＣＡ）カラムで精製し、そしてＳａｌＩ消化に
より直線化した。さらに、直線化ＤＮＡを、前述の方法（Ｔｈｏｍａｓら，前述
；Ｓｉｌｖａら，前述、Ｃｈｅｎら，前述；Ｗａｎｇら，前述；およびＫｎｕｄ
ｓｅｎら，前述。Ｆｕｎｇ−Ｌｅｕｎｇら，Ｃｅｌｌ，６５：４４３−４４９（
１９９１）、全て、本明細書で参考として援用する）を用いてエレクトロポレー
ションにより細胞内に導入した。さらに、エレクトロポレートした細胞を抗生物
質Ｇ４１８を含む培地にプレートし、そしてＧ４１８耐性コロニーを単離した。
ゲノムＤＮＡを、Ｇ４１８耐性コロニーから調製し、そしてサザンブロットハイ
ブリダイゼーションおよび下記のロングレンジ（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）ＰＣＲ
（実施例４参照）により、組込み事象の証拠について解析した。サザンブロッド
解析のために、Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞由来のゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化
し、そして図６にプローブとして記される０．８ｋｂフラグメントでプローブし
た。ＨＩＳ−ｎｅｏカセットのエキソン２への組込みにより、新規のＢａｍＨＩ
部位が導入された。この解析により、変異対立遺伝子は、対応する野生型の対立
遺伝子が２０ｋｂの長さであるのに対して、１３ｋｂの長さであることが示され
た。１００個のＧ４１８耐性ＥＳ細胞クローン中、６個に、標的化されたエキソ
ン２の破壊を含むことが見出された。この６／１００の標的化効率は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉにおけるクローニングにより産生された構築物を用いたＥＳ細胞における標
的化効率と比べ優位である。

【００８０】（実施例４）（ロングレンジＰＣＲによるＥＳ細胞における相同組換えの検出）ロングレンジＰＣＲを用いたＥＳ細胞における相同組換え事象を検出するスキ
ームが、開発された。この検出スキームは有用である。なぜなら、そのスキーム
が、特に未知遺伝子を標的化する場合に、組換え事象についてのＥＳ細胞クロー
ンのスクリーニングを容易にするからである。この目的のために、特別のＰＣＲ
プライマーを設計した：ゲノムフラグメントの５’部分の任意のプライマーと共
に使用し得る、ＨＩＳプライマー、およびそのフラグメントの３’部分プライマ
ーと共に使用する、ｎｅｏプライマー（図６中のＨＩＳおよびｎｅｏの矢印）。
ＨＩＳプライマー（ＲＷ７１６）：ＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＴＡＡＧ（配列番号４）ｎｅｏプライマー（ＲＷ７１７）：ＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣ（配列番号５）ロングレンジＰＣＲを、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍＥｘｐａｎ
ｄ^TM ＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ＃１６８１
８４２）を使用して、提供業者のプロトコールに従って行った。

【００８１】実施例３に記載されるように取得した、６つのノックアウトＥＳクローン由来
のゲノムＤＮＡのロングレンジＰＣＲ解析を行い、標的化ベクターがランダムに
組込まれた別のクローン（＃６）と比較した。これらのサンプルを、エキソン４
のプライマーと共にｎｅｏプライマーを使用して解析すると、標的化された組換
えがＴｇ７３７遺伝子座で起きたことが明らかになり、一方、クローン＃６にお
いてＰＣＲ産物が存在しないことにより、プラスミドの組込みがランダムで、そ
してＴｇ７３７遺伝子座の外側であるということが確認された。別の解析におい
て、同じセットのサンプルで、Ｔｇ７３７遺伝子のエキソン２およびエキソン４
に特異的なプライマーを使用して増幅させた。この解析により、通常の６．５ｋ
ｂのフラグメントに加え、挿入破壊されたゲノムＤＮＡに対応する９ｋｂのバン
ドが生じた。（このＥＳ細胞は、標的化による変異に対してヘテロ接合性である
から）。

【００８２】（実施例５）Ｔｇ７３７ノックアウトマウスの作製標的化された変異は、酵母内で作製されたベクターを使用して、ＥＳ細胞にお
いて発生させ得ることが明らかであったので、１つのＥＳクローン（実施例３に
記載されるよう取得された）由来の細胞を、以下に記載される標準的な方法に従
って、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞内への注入のために使用し、破壊されたＴｇ７３７
遺伝子を有するキメラマウスを作製した。（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，前出；Ｂｒ
ａｄｌｅｙら，前出；およびＭｏｎｓｏｕｒら，前出）。

【００８３】この実験より、計４つのキメラ動物を作製し、そしてａｇｏｕｔｉの毛色によ
り同定した。ａｇｏｕｔｉ動物由来のＤＮＡの解析は、前述のように解析され、
そしてその解析により、標的化された変異を含むことが見出された。これらのキ
メラ創始動物はそれぞれ、生殖系列における変異を樹立するために育種されてい
る。

【００８４】（実施例６）（Ｒａｌｙ遺伝子に対するノックアウト標的化ベクターの作製）Ｔｇ７３７遺伝子に関して記載される実験において、制限地図および遺伝子の
構造を知ることは、原理の証明を実証するために有用であった。しかし、そのよ
うな情報は、本発明に従って標的化ベクターを構築するために必要ではない。

【００８５】例証として、本発明の方法を、マウスのＲａｌｙ遺伝子をノックアウトするた
めの標的化構築物を調製するために使用した。Ｒａｌｙ遺伝子は、以前に単離さ
れ、そして特徴付けられた（Ｍｉｃｈａｕｄら，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．７：１２
０３−１２１３，（１９９３））。この遺伝子は、マウスの第２染色体のａｇｏ
ｕｔｉ遺伝子と密接に連結し、そしてａｇｏｕｔｉのＬｅｔｈａｌＹｅｌｌｏ
ｗ変異に直接的に関連する新規のＨｎ−ＲＮＰをコードしている（図７）。（Ｒ
ａｌｙという名は、それがＬｅｔｈａｌＹｅｌｌｏｗに関連しているＲＮＰ（ＲＮＰａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＬｅｔｈａｌＹｅｌｌｏｗ）であ
るということに由来する。）ＲａｌｙのｃＤＮＡは、クローン化され配列決定さ
れている（図８）（配列番号６）。

【００８６】詳細に前述されるように、酵母における相同組換えを使用して、Ｒａｌｙノッ
クアウトのための標的化ベクターを、ＲａｌｙのｃＤＮＡプローブ（Ｒａｌｙの
ｃＤＮＡの２３３〜４５７ヌクレオチドの位置を含む２２４ｂｐのＰＣＲ産物）
とポジティブにハイブリダイズする１２９／ＳｖマウスゲノムＢＡＣ４５Ｃ４（
ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）クローンから始
めて作製した。

【００８７】簡潔には、ＡＴＧを含むエキソンとハイブリダイズする、Ｒａｌｙ遺伝子の８
．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩゲノムフラグメントを、ＢＡＣクローンからｐＲＳ４
２６シャトルベクター（前述）内にサブクローン化して、ゲノム挿入の方向のみ
が異なる、プラスミドｐＲａｌｙ＃７およびｐＲａｌｙ＃２５を作製した。

【００８８】同時に、Ｒａｌｙ−ＳＥＦを、上記のＨＩＳ−ｎｅｏカセット（図４）をテン
プレートとして使用して、前述の通りのＰＣＲにより作製した。Ｒａｌｙ−ＨＩ
Ｓ−ｎｅｏＳＥＦ（ＲａｌｙのＡＴＧを含むエキソン内の１２４ｂｐをＨＩＳ
−ｎｅｏマーカーにより置換）を構築するために、以下のプライマーを使用した
。順方向プライマー（ＲＷ７０８）：（ＨＩＳ−ｎｅｏカセット由来の配列は太字
）

【００８９】

【化２】逆方向プライマー（ＲＷ７０９）：

【００９０】

【化３】Ｒａｌｙ−ＳＥＦ作製のための同じエキソン上の配列を同定するために、ゲノム
テンプレートおよびｃＤＮＡテンプレート上の、２０−ｍｅｒプライマーを用い
た従来のＰＣＲ解析を使用した。ＲａｌｙＳＥＦは、片側でＲａｌｙのｃＤＮ
Ａのヌクレオチド２５４〜２９３が隣接し、そしてその反対側でＲａｌｙのｃＤ
ＮＡのヌクレオチド４１８〜４５７が隣接するＨｉｓ−ｎｅｏカセットからなる
（図９参照）。Ｒａｌｙ−ＳＥＦの設計に基づくと、相同組換えによるＨＩＳ−
ｎｅｏマーカーの組込みにより、ＲａｌｙのＡＴＧを含むエキソン内で１２４ｂ
ｐが欠失する（図８を参照）。

【００９１】酵母の形質転換を、前述のＲａｌｙシャトルベクターを用いて行い、そしてプ
ラスミドＤＮＡの単離および解析のために、ＲａｌｙＳＥＦおよびＨＩＳ陽性
酵母コロニー由来のＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ内に導入した（図１０）。組換え前
後での標的化プラスミドの制限解析により、所望の組換えが起きたことが確認さ
れたのみならず、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント内のＡＴＧを含むエキソンの位置
のマッピングが可能になった。酵母における組換え前（−）および組換え後（＋
）の組換えベクターからの標的化されたＲａｌｙフラグメントのＰＣＲ増幅を行
い、そしてその結果を図１１に図示した。６８０／１８３として記された、右の
２つのレーンは、標的化された部位由来のプライマー（６８０）および標的化ベ
クターの外側に位置する別のプライマー（１８３）を使用した、ｃＤＮＡおよび
ゲノム（ｇ）ＤＮＡからのＰＣＲに対応する。これら２つのプライマー（あるい
は、ｎｅｏプライマーと１８３プライマー）を、相同組換えについてＥＳ細胞ク
ローンを試験するために使用する。

【００９２】ＲａｌｙのｃＤＮＡおよびＲａｌｙのエキソンの一部あるいは全部を含むゲノ
ム１２９／ＳｖマウスゲノムＢＡＣクローンの配列のみから始めて、酵母系にお
けるその遺伝子のための標的化構築物を作製することが可能であることが、上記
のことから実証される。

【００９３】前述の例は、例証として示され、そして、添付の特許請求の範囲に示される。
発明の範囲を制限することを意図されるものではない。本明細書で引用された文
献は、参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、酵母で相同組換えを利用して、標的化構築物を生成する模式図を示す
。

【図２】図２は、Ｔｇ３７３遺伝子の制限マップおよびイントロン構造エキソンを示す
。

【図３】図３は、期待される制限パターンを示すアガロースゲルを含む、組換え標的化
プラスミドの制限分析を示す。

【図４】図４は、ＨＩＳ−ｎｅｏカセットを含む特異的に操作されたフラグメント（Ｓ
ＥＦ）を示す。

【図５】図５は、本発明の標的化ベクターを調製するための模式図を示す。ここで、特
異的に操作されたフラグメントは、エキソン特異的ＤＮＡ配列に隣接したＨＩＳ
−ｎｅｏカセットを含む。

【図６】図６は、Ｔｇ７３７遺伝子座に挿入した標的化ベクターの制限マップである。

【図７】図７は、野生型Ｒａｌｙ遺伝子座および隣接するａｇｏｕｔｉ遺伝子座を示し
、そしてＲａｌｙ遺伝子のコード部分を含む１７０ｋｂのＤＮＡフラグメントの
欠失を示す。

【図８】図８は、Ｒａｌｙ座のｃＤＮＡ配列を示す。

【図９】図９は、模式図的にＲａｌｙ遺伝子のノックアウトプラスミドの生成に関する
模式図的な概略である。

【図１０】図１０は、ＳＥＦが相同的に組換えするＲａｌｙＳＥＦおよびゲノムフラグ
メントの部分的な制限マップである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵母において遺伝子標的化ベクターを調製する方法であって
、以下の工程：ａ）第１酵母選択マーカー、細菌選択マーカーおよび少なくとも標的とされ
る遺伝子の部分を含むゲノムＤＮＡのフラグメントを含むシャトルベクターを調
製する工程；ｂ）マーカーカセットを含む特定の操作されたフラグメント（ＳＥＦ）を調
整する工程であって、ここで、該マーカーカセットが該第１酵母選択マーカーと
は異なり、哺乳動物胚性幹細胞中で発現し得る選択マーカーである第２酵母選択
マーカーを含み、該マーカーカセットが該標的とされる遺伝子の一部に相同であ
る哺乳動物遺伝子特異的な隣接配列の各端に隣接する工程；ｃ）工程ａ）のシャトルベクターおよび工程ｂ）のＳＥＦで酵母細胞を形質
転換し、そして該シャトルベクターおよび該ＳＥＦを相同組換えによって組換え
させる工程；ｄ）該第１選択マーカーおよび該第２酵母選択マーカーの発現について形質
転換された酵母細胞を選択する工程；ならびにｅ）工程ｄ）で選択した酵母細胞から該シャトルベクターおよび該ＳＥＦの
間での組換えによって産生される標的化ベクターを単離する工程、を包含する、方法
【請求項２】前記遺伝子特異的な隣接配列が各々、少なくとも約２０ヌク
レオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記遺伝子特異的な隣接配列が各々、４０ヌクレオチド〜約
４００ヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記ゲノムＤＮＡのフラグメントが約１〜約１５ｋｂを含む
、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記ゲノムＤＮＡのフラグメントが少なくとも約０．５〜約
５ｋｂのＤＮＡを前記標的とされる遺伝子の各端の部位に含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項６】前記ゲノムＤＮＡフラグメントが少なくとも１ｋｂのゲノム
ＤＮＡを標的とされる遺伝子の各端の部位に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記工程ａ）の第１酵母選択マーカーがＨｉｓ、Ｕｒａ３、
およびＬｅｕ２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記細菌選択マーカーがｔｅｔ^r、ａｍｐ^r、ｎｅｏ^r、クロラムフェノール抵抗性からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記第２酵母選択マーカーがＨｉｓ、Ｕｒａ３、およびＬｅ
ｕ２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記哺乳動物細胞選択マーカーがｎｅｏ^r、ハイグロマイシン抵抗性マーカーおよびサルモネラｈｉｓＤ、およびプロマイシンＮ−アセチ
ルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記第２酵母選択マーカーおよび哺乳動物細胞選択マーカ
ーが同じマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】マーカーカセットを含む標的化構築物であって、該マーカ
ーカセットが第１酵母選択マーカーおよび哺乳動物細胞選択マーカーを含み、該
カセットが標的とされる遺伝子に相同であるＤＮＡに各端で隣接しており、該標
的化構築物がさらに該第１酵母選択マーカーとは異なる第２酵母選択マーカーお
よび細菌選択マーカーを含む、標的化構築物。
【請求項１３】前記標的とされる遺伝子に相同であるＤＮＡが約１ｋｂ〜
約１５ｋｂを含む、請求項１２に記載の標的化構築物。
【請求項１４】前記標的とされる遺伝子と相同であるＤＮＡが約０．５ｋ
ｂ〜約５ｋｂのＤＮＡを標的とされるゲノム部位の各端に含む、請求項１２に記
載の標的化構築物。
【請求項１５】前記第１酵母選択マーカーがＨｉｓ、Ｕｒａ３、およびＬ
ｅｕ２からなる群から選択される、請求項１２または１３の標的化構築物。
【請求項１６】前記第２酵母選択マーカーがＨｉｓ、Ｕｒａ３、およびＬ
ｅｕ２からなる群から選択される、請求項１２、１３または１４に記載の標的化
構築物。
【請求項１７】前記哺乳動物細胞選択マーカーがｎｅｏ^r、ハイグロマイシン抵抗性マーカー、サルモネラｈｉｓＤ、およびプロマイシンＮ−アセチルト
ランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１２、１３または１４に記
載の標的化ベクター。
【請求項１８】前記哺乳動物細胞選択マーカーがｎｅｏ^r、ハイグロマイシン抵抗性マーカー、サルモネラｈｉｓＤ、およびプロマイシンＮ−アセチルト
ランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の標的化ベクタ
ー。
【請求項１９】前記細菌選択マーカーがａｍｐ^r、ｎｅｏ^r、ｔｅｔ^r、クロラムフェノール抵抗性からなる群から選択される、１２、１３、または１４に
記載の標的化ベクター。
【請求項２０】前記細菌選択マーカーがａｍｐ^r、ｎｅｏ^r、ｔｅｔ^r、クロラムフェノール抵抗性から選択される、請求項１５に記載の標的化ベクター。
【請求項２１】相同組換え適合性細胞において遺伝子標的化構築物を調製
する方法であって、該方法が、以下の工程；ａ）第１ＤＮＡ構築物を調製する工程であって、該第１ＤＮＡ構築物が標的
とされる遺伝子の全てまたは部分を含む、工程。ｂ）第２ＤＮＡ構築物を調製する工程であって、該第２ＤＮＡ構築物が哺乳
動物遺伝子における部位に挿入するためのＤＮＡを含み、該挿入配列のためのＤ
ＮＡ構築物が該標的とされる遺伝子の一部に相同である遺伝子特異的な配列の両
端に隣接する、工程；ｃ）相同組換えを媒介するのに適合性である宿主細胞に該第１および第２Ｄ
ＮＡ構築物を導入する工程；ｄ）該第１ＤＮＡ構築物および該第２ＤＮＡ構築物をそれらの相同配列を介
して組換えさせることにおいて標的化構築物を産生する工程；ならびにｅ）工程ｄ）で産生される標的化構築物を単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】前記遺伝子特異的な隣接配列が各々、少なくとも４０〜４
００ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記遺伝子特異的な隣接配列が各々、好ましくは約４０ヌ
クレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記ゲノムＤＮＡのフラグメントが約１ｋｂ〜約１５ｋｂ
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】前記ゲノムＤＮＡのフラグメントが前記標的とされる遺伝
子の各端の部位に約０．５ｋｂ〜約５ｋｂを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】前記ゲノムＤＮＡのフラグメントが前記標的とされる遺伝
子の各端の部位に少なくとも１ｋｂを含む、請求項１９に記載の方法。