【発明の詳細な説明】
組換え不能細胞において核酸の相同的組換えに基づく修飾を前成する方法
及びその修飾した核酸産物の使用
政府援助
本発明に至る研究の一部は全米科学財団補助金第MCB-9316625号の助成により
援助されたものである。従って、政府が本発明の権利を所有する。
発明の分野
本発明は、一般的には、組換え不能細胞において特異性を有する遺伝子を該細
胞において相同的組換えを一時的に可能にすることにより修飾する方法に関する
。本発明には、一時的組換え能を他の組換え不能細胞へ与える条件的複製シャト
ルベクターが含まれる。本発明には、修飾した遺伝子を含む独立起原のクローニ
ングベクター及び修飾した遺伝子を含む独立起原のクローニングベクターの使用
方法も含まれる。
発明の背景
生体内遺伝子の機能分析は、修飾したゲノムDNAを生殖系列へ導入してトラン
スジェニック動物をつくることを頻繁に必要とする[Jaenischら，Science 240:1
468(1985);Brinster，Cell 41:343(1985)]。イントロンと必須調節配列を含むゲ
ノムDNA配列は、単純なcDNA構築物が発現されない場合の生体内で発現されるこ
とがわかった[Brinsterら，Proc．Natl．Acad．Sci．85:836-840(1988)]。更に
、試験管内で操作されやすく生殖系列へ導入されやすいゲノムDNAのサイズは、
高レベルに重要である要素、導入遺伝子の組織特異的及び位置独立発現が遺伝子
自体から遠く離れて位置するので遺伝子の機能分析の結果の重要な決定因子であ
る[Dillonら，Trends Genet．9:134(1993);Kennison，Trends Genet．9:75(1993
);Wilsonら，Annu．Rev．Cell．Biol．6:679(1990)]。
一方、その大きなゲノム導入遺伝子の使用はいくつかの実用的問題がある。例
えば、導入遺伝子のサイズは、慣用のプラスミド又はコスミドにクローン化及び
安定に維持される配列の長さの拘束があるために現在制限されている。従って、
サイズの制限のために移入されるべき構築物を設計する場合に必須でないと思わ
れるDNA配列はたいてい省略される。更に、大きなDNAの試験管内操作はたいてい
機械的せん断をまねく[Petersonら，TIG 13:61-66]。
酵母人工染色体(YAC)は、大きなゲノムDNAを修飾しトランスジェニック動物を
つくるために用いることができる[Burkeら，Science 236:806;Petersonら，Tren
ds Genet.13:61(1997);Choiら，Nat．Genet.，4:117-223(1993)，Daviesら,Biot
echology 11:911-914(1993)，Matsuuraら，Hum．Mol．Genet.，5:451-459(1996)
，Petersonら，Proc．Natl．Acad．Sci.，93:6605-6609(1996);Schedlら，Cell
，86:71-82(1996)]。他のベクターは、コスミド、及びバクテリオファージP1を
含む哺乳動物DNAの大セグメントのクローニングのために開発された[Sternberg
ら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，87:103-107(1990)]。YACは、これらの代
替的大容量クローニングベクターよりある種の利点がある[Burkeら，Science，2
36:806-812(1987)]。最大挿入断片サイズはコスミドが35〜30kbであり、バクテ
リオファージP1が100kbであり、いずれもYACの最大挿入断片より非常に小さい。
しかしながら、YAC系にはYAC DNA、キメラ現象及びクローンの不安定性を操作す
る点での難しさを含むいくつかの重要な制限がある[Greenら，Genomics，11:658
(1991);Kouprinaら，Genomics 21:7(1994);Larionovら，Nature Genet．6:84(19
94)]。結果として、無傷YACでトランスジェニックマウスをつくることには依然
として興味をそそる仕事が残されている[Burkeら，Science 236:806;Petersonら
，Trends Genet．13:61(1997)]。
別のYACは、大きなゲノムDNA挿入断片ライブラリーを構築するために開発され
たE．coli稔性因子に基づくE．coliのクローニング系である。細菌人工染色体(B
AC)やP-1由来人工染色体(PAC)である[Mejiaら，Genome Res．7:179-186(1997);S
hizuyaら，Proc．Natl．Acad．Sci．89:8794-8797(1992);Ioannouら，Nat．Gene
t.，6:84-89(1994);Hosodaら，Nucleic Acids Res．18:3863(1990)]。BACはE．c
oli稔性プラスミド(F因子)に基づき、PACはバクテリオファージP1に基づいてい
る。プラスミド分子としてエシェリキア・コリ(Escherichia coli)で安定にクロ
ーン化される真核ゲノムからのDNA断片のサイズは、PAC及びBACの出現により増
大した。これらのベクターは、サイズが
300kbまでのゲノム断片を組換え不能ホストに安定に維持されることを可能にす
る非常に少ないコピー数(1〜2/細胞)で伝播させる(ヒトゲノムライブラリーのほ
とんどのクローンは100〜200kbサイズの範囲内に入る)。ホスト細胞は、非特異
的及び潜在的に有害な組換え因子を極少なく保つことを行わせる組換え不能であ
ることを必要とする。結果として、PACやBACのライブラリーは、YACライブラリ
ーに典型的な高割合のキメラ又は再配列クローンを相対的に含まない[Honacoら
，Trends Biotechnol 12:280-286(1994);Boyseuら，Genome Research，7:330-33
8(1997)]。更に、PAC又はBACからのDNAを単離及び配列決定することはYACより簡
便な手順を必要とし、PACやBACのクローニング効率はYACより高い[Shizuyaら，P
roc．Natl．Acad．Sci．89:8794-8797(1992);Ioannouら，Natl.Genet．6:84-89(
1994);Hosodaら，Nucleic Acids Res．18:3863(1990)]。そのような利点がBACや
PACを多くのゲノム内の物理的地図作成の重要な手段にした[Wooら，Nucleic Aci
ds Res.，22:4922(1994);Kimら，Proc．Natl．Acad．Sci．93:6297-6301(1996);
Wangら，Genomics 24:527(1994);Woosterら，Nature 378:789(1995)]。更に、PA
CやBACは古典的アルカリ性溶解によりホストゲノムバックグラウンドから容易に
単離される環状DNA分子である[Birnboimら，Nucleic Acids Res．7:1513-1523(1
979)]。
PAC又はBACクローンが含む問題のE．coliの機能確認は、一般的には、一時的
又は長期発現のためにDNAを真菌細胞へ移入ことを必要とする。トランスフェク
ションリポーター遺伝子、例えば、lacZをコードしている遺伝子が選択マーカー
、例えば、neoと共にBACに挿入される[Mejiaら，Genome Res．7:179-186(1997)]
。次に、トランスフェクトした細胞はX-Galを染色してDNAの取込みを証明するこ
とにより検出される。安定に形質転換された細胞を抗生物質G418により選択する
。
しかしながら、PACやBACは350kbまでのクローニング容量を有するが、突然変
異を問題の遺伝子へ導入するために相同的組換えを行うことは証明されていない
[Petersonら，TIG 13:61-66]。実際に、BAC又はPACはゲノム研究において重要な
大ゲノムDNA源になるか、BAC又はPACを修飾するために有効な方法はまだない。
更に、トランスジェニックマウスにおける無傷BAC又はPACの生殖系列伝
達は報告されていない。BAC又はPACのこれらと他の欠点が機能研究の潜在的使用
を非常に制限している。従って、トランスジェニック動物における選択遺伝子の
生殖系列伝達のためのクローニングベクターの改良が求められている。特に、容
易に操作及び単離されるが相対的に再配列クローンを含まないライブラリーに安
定に保存される100キロベースより大きいDNAを含む容量をもつクローニングベク
ターが求められている。更に、そのクローニングベクターを作成する方法を与え
ることが求められている。また、遺伝子ターゲッティングのような現在の技術を
改良するためにそのベクターを応用することが求められている。
遺伝子ターゲッティングは、ゲノム内に部位特異的突然変異をつくるために酵
母からマウスまで種々の系において用いられている。遺伝子ターゲッティングは
、生体内タンパク質の機能を研究するために有用であるだけでなく、ヒト疾患の
動物モデルをつくるために、及び遺伝子治療に有用である。細胞へ導入したDNA
と細胞の内在染色体DNA間の相同的組換えの技術を必要とする。しかしながら、
脊椎動物系においては、相同的組換えの割合は、ランダム組込みに比べて非常に
小さい。相対的に高割合の相同的組換えを可能にしかつ生殖系列を占める能力を
維持する唯一の細胞系はマウス129胚性幹細胞(ES細胞)である。この特殊な細胞
を用いて、標的突然変異をもつマウスがつくられる(Gene Targeting，apractica
l approach Ed.，A．Joyner，IRL Press:オックスフォード,ニューヨーク,東京)
。しかしながら、ES細胞における遺伝子座の相同的組換えの割合はなお非常に低
く(＜1％＞、手順は集中的な仕事であり、標的突然変異マウスをつくるコストは
非常に高い。更に、マウス以外の脊椎動物に有効なES細胞がないので、生殖系列
における遺伝子ターゲッティングは他の脊椎動物には可能ではない。
脊椎動物細胞における遺伝子ターゲッティングの主要な制限は、依然としてタ
ーゲッティングが低頻度であることである。ターゲッティング頻度に影響する重
要な因子は相同の全長である。Deng & Capecchi(MCB，12:3365-3371)には、遺伝
子ターゲッティング頻度が2.8〜14.6kbの長さの相同について相同全長の対数に
直線的に依存することが示されている。曲線が14.6kbの相同でプラトーにならな
かったので、大きな長さの相同をターゲッティングベクターへ組込むことによ
り相同的組換え率が高くなると思われる。Fujitaniら[Genetics，140:797-809(1
995)]により開発された数学的モデルを用いて評価が行なわれ、100kbの同一起原
をもつDNA(即ち、同じ株のマウスからのDNA)の全相同性におけるES細胞での遺伝
子ターゲッティング率は10％であった。これは、対応する割合がわずか0.03％し
か得られない従来の14.6kbのターゲッティングベクターより劇的な改良である。
更に、現在の戦略のための援助、即ち、遺伝子ターゲッティング率に大きなDNA
構築物を用いることは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium
tuberculosis)、結核の原因微生物による実験に由来する。脊椎動物細胞のよう
に、TBにおける遺伝子ターゲッティングは、主に相同的組換えよりランダム組込
みが優位であるために非常に低率である。40〜50kbの線状ターゲッティング構築
物を用いて6％のターゲッティング頻度が得られるが、小さい（＜10kb）ターゲ
ッティング構築物においてはターゲッティング因子は全く得られないことが示さ
れた[Balasubramanianら，J．of Bacteriology 178:273-279(1996)]。従って、
多くの生物系において効率のよい遺伝子ターゲッティングを可能にする大きな遺
伝子ターゲッティング構築物を構築することが求められている。
本明細書中の文献の引用は、その文献が本出願に対する“従来の技術”として
有効であることを認めるものとして解釈すべきでない。
発明の要約
本発明は、試験管内及び生体内遺伝子発現のための独立起原のクローニングベ
クターを修飾する新規で効率のよい方法を提供する。広範囲の実施態様において
は、本発明は、組換え不能ホスト細胞、即ち、相同的組換えを独立して支持する
ことができない細胞に含まれる具体的なヌクレオチド配列について相同的組換え
を選択的に行う方法を提供する。本方法は、組換え不能ホスト細胞が相同的組換
えを支持するために誘導される場合に具体的なヌクレオチド配列に選択的に組込
む核酸を含む組換えカセットを用いる。本方法は、組換えカセットを組換え不能
ホスト細胞へ導入する工程、及び組換え不能ホスト細胞を誘導して相同的組換え
を一時的に支持し、よって核酸を具体的なヌクレオチド配列へ組込ませる工程を
含む。好適実施態様においては、相同的組換えを支持するホスト細胞の特徴を示
す選択されないヌクレオチド配列の再配列や欠失は、HindIII、EcoRI、XhoI、又
はAvrIIのような制限酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化地図分析により
明らかではない。より好適な実施態様においては、選択されないヌクレオチド配
列の再配列や欠失は、２種以上の制限酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化
地図分析により明らかではない。
本発明の具体的な態様においては、組換え不能ホスト細胞は、ホスト細胞がRe
cA-であることから独立して相同的組換えを支持することができない。本発明の
態様においては、ホスト細胞を誘導して相同的組換えを一時的に支持する工程は
、ホスト細胞においてRecA様タンパク質の一時的発現を誘導する工程を含んでい
る。好適実施態様においては、RecA様タンパク質の一時的発現を誘導する工程は
条件的複製シャトルベクターで行なわれる。より好適な実施態様においては、条
件的複製シャトルベクターは、許容温度で複製するが非許容温度で複製しない温
度感受性シャトルベクター(TSSV)である。
このタイプの具体的な実施態様においては、RecA様タンパク質の一時的発現を
誘導する工程は、ホスト細胞をTSSVで許容温度において形質転換する工程、及び
ホスト細胞を非許容温度で増殖する工程を含んでいる。TSSVは、ホスト細胞中で
発現するRecA様タンパク質をコードし、組換えカセットに含まれる核酸とホスト
細胞に含まれる具体的なヌクレオチド配列間の相同的組換えを支持する。RecA様
タンパク質をコードしているTSSVは、ホスト細胞を非許容温度で増殖する場合に
希釈される。このタイプの具体的な実施態様においては、許容温度は30℃であり
、非許容温度は43℃である。
本発明のより複雑な形においては、相同的組換えを受けるように選択された具
体的なヌクレオチド配列はホスト細胞が含む独立起原のクローニングベクター(I
OBCV)に含まれ、独立起原のクローニングベクターのみもホスト細胞と組合わせ
た独立起原のクローニングベクターも独立して相同的組換えを支持することがで
きない。このタイプの具体的な実施態様においては、独立起原のクローニングベ
クターとホスト細胞は共にRecA-であり、ホスト細胞を誘導して相同的組換えを
一時的に支持する工程はRecA様タンパク質の一時的発現を誘導してホスト細胞に
おける相同的組換えを支持する工程を含んでいる。具体的な実施態様にお
いては、独立起原のクローニングベクターは細菌又はバクテリオファージ由来人
工染色体(BBPAC)であり、ホスト細胞はホスト細菌である。
好適実施態様においては、RecA様タンパク質の一時的発現を誘導する工程はRe
cA様タンパク質をコードしている条件的複製シャトルベクターで行なわれる。更
に好適な実施態様においては、条件的複製シャトルベクターは許容温度で複製す
るが非許容温度で複製しない温度感受性シャトルベクター(TSSV)である。このタ
イプの具体的な実施態様においては、許容温度は30℃であり、非許容温度は43℃
である。
実施態様においては、RecA様タンパク質は誘導プロモーターにより制御され、
RecA様タンパク質の一時的発現はホスト細胞における誘導プロモーターの一時的
誘導により達成される。他の実施態様においては、RecA様タンパク質は構成的プ
ロモーターにより制御され、一時的発現はTSSVにより誘導される。
好適実施態様においては、TSSVは、組換えカッセト及び第１毒性物質に対して
TSSVを含むホスト細胞に耐性を与える第１遺伝子を含んでいる。更に、第１遺伝
子は逆選択される。組換えカセット、RecA様タンパク質遺伝子、及び第１遺伝子
は共にTSSV上に共に結合され、核酸が具体的なヌクレオチド配列を組込んでいる
(即ち、分割される)場合にはRecA様タンパク質遺伝子と第１遺伝子は共に結合し
たままであり、RecA様タンパク質遺伝子も第１遺伝子も組込まれた核酸に結合し
ていない。
このタイプの具体的な実施態様においては、独立起原のクローニングベクター
はBBPACであり、ホスト細胞は細菌である。BBPACは、更に、第２毒性物質に対し
てホスト細胞に耐性を与える第２遺伝子を含む。ホスト細胞へ組換えカッセトを
導入する工程は、ホスト細胞をTSSVで形質転換することにより行なわれる。RecA
様タンパク質の一時的発現を誘導して相同的組換えを支持する工程は、（i）第
１毒性物質と第２毒性物質の存在下にホスト細胞を許容温度でインキュベートし
、TSSVとBBPACを含む形質転換ホスト細胞を選択し、RecA様タンパク質が発現し
、第１相同的組換え因子が組換えカセットと具体的なヌクレオチド配列間で生じ
てTSSVとBBPAC間でレプリコン複合体を形成し、TSSVが遊離しているか又はレプ
リコン複合体の一部である工程;（ii）第１毒性物質と第２毒性物質の存
在下に形質転換ホスト細胞を非許容温度でインキュベートし、TSSVレプリコン複
合体を含むホスト細胞を選択し、遊離TSSVは複製することができない工程;（iii
）TSSVとBBPAC間のレプリコン複合体を含むホスト細胞をサザン分析により選択
する工程;（iv）第２毒性物質の存在下にTSSVとBBPAC間のレプリコン複合体を含
むホスト細胞を非許容温度でインキュベートし、第２相同的組換え因子が組換え
カセットと具体的なヌクレオチド配列間で生じ、そこで核酸を具体的なヌクレオ
チド配列に組込み、分割されたホスト細胞、即ち、分割されたBBPACを含むホス
ト細胞を形成する工程;及び(v)第２毒性物質の存在下に分割されたBBPACを含む
ホスト細胞、及び逆選択物質をインキュベートし、逆選択物質が第１遺伝子を含
むホスト細胞に毒性であり、RecA様タンパク質遺伝子を含むホスト細胞が除去さ
れる工程を含む。他の実施態様は、更に、核酸のDNA相同体、核酸のmRNA相同体
、及び/又は核酸がコードしているタンパク質に結合する標識プローブとコロニ
ーハイブリダイズすることにより分割されたBBPACを含むホスト細胞を選択する
工程を含んでいる。具体的な実施態様においては、許容温度は30℃であり、非許
容温度は43℃である。好適実施態様においては、第２毒性物質及び逆選択物質の
存在下に分割されたBBPACを含むホスト細胞をインキュベートする工程は37℃で
行なわれる。
好適実施態様は、更に、選択的に組込まれる第１ゲノム断片の5’の特定の核
酸を具体的なヌクレオチド配列に入れ、第２ゲノム断片の3’の特定の核酸を入
れることにより組換えカセットを作成する工程を含む。第１ゲノム断片は、第２
ゲノム断片に対応する5’→具体的なヌクレオチド配列の領域である具体的なヌ
クレオチド配列の領域に対応する。従って、第１ゲノム断片と第２ゲノム断片は
共に具体的なヌクレオチド配列の一部を含んでいる。その実施態様においては、
第１ゲノム断片と第２ゲノム断片は共に250塩基対以上の具体的なヌクレオチド
配列を含んでいる。好適実施態様においては、第１及び第２ゲノム断片はほぼ同
じサイズである。他の実施態様においては、第１ゲノム断片と第２ゲノム断片は
共に500塩基対以上の具体的なヌクレオチド配列を含んでいる。他の実施態様に
おいては、第１ゲノム断片と第２ゲノム断片は共に1000塩基対以上の具体的なヌ
クレオチド配列を含んでいる。具体的な実施態様においては、組換えカセット
はビルディングベクターに作成され、組換えカッセトは続いてTSSVに移入される
。具体的な実施態様においては、第１遺伝子はテトラサイクリン耐性を与え、逆
選択物質はフザリン酸である。好適実施態様においては、RecA様タンパク質はre
cAである。更に好適な実施態様においては、TSSVはATCC No.97968をもつpSVI.Re
cAである。
本発明の関連態様においては、RecA様タンパク質は誘導プロモーターによって
制御され、RecA様タンパク質の一時的発現はホスト細胞における誘導プロモータ
ーの一時的誘導により達成される。このタイプの実施態様においては、独立起原
のクローニングベクターはBBPACであり、組換え不能ホスト細胞はE．coli細菌で
ある。好適実施態様においては、RecA様タンパク質はrecAである。
本発明は、また、RecA様タンパク質をコードしている条件的複製シャトルベク
ターを提供する。その実施態様においては、RecA様タンパク質は誘導プロモータ
ーによって制御される。好適実施態様においては、条件的複製シャトルベクター
は温度感受性シャトルベクター(TSSV)である。TSSVのRecA様タンパク質は、構成
的プロモーターか又は誘導プロモーターにより制御される。実施態様においては
、TSSVは逆選択される遺伝子を含んでいる。このタイプの個々の実施態様におい
ては、TSSVはテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を含んでいる。他の実施態様
においては、TSSVはrecAであるRecA様タンパク質を含んでいる。他の実施態様に
おいては、TSSVはテトラサイクリン耐性とrecAであるRecA様タンパク質を含んで
いる。他の実施態様においては、TSSVはテトラサイクリン耐性とrecAであるRecA
様タンパク質を含んでいる。好適実施態様においては、TSSVはATCC No.97968号
をもつpSV1.RecAである。
本発明は、また、RecAホスト細胞において、RecA様タンパク質をコードしてい
る条件的複製シャトルベクターで相同的組換えを受けた具体的なヌクレオチド配
列を含む独立起原のクローニングベクターを提供する。その実施態様においては
、具体的ななヌクレオチドは独立起原のクローニングベクターが含むマウス亜鉛
フィンガー遺伝子、RU49をコードしている遺伝子の一部である。好適実施態様に
おいては、独立起原のクローニングベクターはRecAホスト細胞において、RecA様
タンパク質をコードしている温度感受性シャトルベクターによる相同的
組換えを受ける。他の実施態様においては、独立起原のクローニングベクターは
BBPAC、更に好ましくはBACである。このタイプの個々の実施態様においては、独
立起原のクローニングベクターはATCC No.97968号をもつpSV1.RecAである温度感
受性ベクターによる相同的組換えを受ける。
本発明は、また、トランスジェニック動物をつくるために、遺伝子ターゲッテ
ィングを行うために、又は遺伝子治療を行うために本発明の修飾した独立起原の
クローニングベクターを使用する方法を提供する。独立起原のクローニングベク
ター又はIOBCV由来の直線化核酸挿入断片が、例えば、真核細胞又は動物へ導入
される。
その実施態様においては、真核細胞は受精接合体である。他の実施態様におい
ては、真核細胞はマウスES細胞である。遺伝子ターゲッティングは、具体的な遺
伝子を修飾するために、又は遺伝子を全部破壊してノックアウト動物を形成する
ために行なわれる。
本発明のこの態様においては、独立起原のクローニングベクターは、RecA-全
細胞において、RecA様タンパク質を含む条件的複製シャトルベクターによる相同
的組換えを受けた核酸を含んでいる。好適実施態様においては、独立起原のクロ
ーニングベクターはBBPACである。更に好適な実施態様においては、BBPACはTSSV
による相同的組換えを受ける。最適実施態様においては、BBPACはATCC No.97968
をもつpSV1.RecAであるTSSVによる相同的組換えを受ける。
具体的な実施態様は、BBPAC(又はBBPAC由来の直線化核酸挿入断片)を受精接合
体に前核注入する工程を含む核酸を動物へ導入してトランスジェニック動物をつ
くるためにBBPACを用いる方法である。実施態様においては、動物は哺乳動物で
ある。更に好適な実施態様においては、哺乳動物はマウスである。このタイプの
個々の実施態様においては、独立起原のクローニングベクターはBBPACであり、
受精接合体はC57BL/6マウス接合体である。このタイプの好適実施態様において
は、2ピコリットル(pl)の1μg/ml未満のBBPAC DNAが注入される。更に好適実施
態様においては、2plの0.6μg/mlのDNAが注入される。
本発明は、脊椎動物において遺伝子ターゲッティングを行うために本発明のBB
PACを用いる方法であって、BBPACを脊椎動物細胞へ導入する工程を含み、条
件的シャトルベクターによる相同的組換えを受けた核酸が脊椎動物細胞の内在染
色体DNAによる相同的組換えを受ける、前記方法が含まれる。このタイプの好適
実施態様においては、脊椎動物は哺乳動物細胞である。このタイプの更に好適な
実施態様においては、哺乳動物細胞はヒト細胞である。関連実施態様においては
、脊椎動物細胞は受精接合体であり、核酸は分断遺伝子を含んでいる。好適実施
態様においては、条件的シャトルベクターはTSSVである。更に好適な実施態様に
おいては、TSSVはATCC No.97968をもつpSV1.RecAである。
本発明は、BBPACのような独立起原のクローニングベクターに含まれる選択ヌ
クレオチド配列について相同的組換えを行うためのキットを含む。具体的な実施
態様においては、本キットは条件的シャトルベクター及びビルディングベクター
を含んでいる。このタイプの好適実施態様においては、本キットは、更に、シャ
トルベクターの制限地図及び/又は１種以上のビルディングベクターの制限地図
を含んでいる。更に好適な実施態様においては、本キットは、更に、相同的組換
えを行うキットの内容物を用いるためのプロトコールが含まれる。
本キットの具体的な実施態様は、pSV1.RecAのようなTSSV及びビルディングベ
クターを含む。その実施態様においては、ビルディングベクターはpBV.IRES.Lac
Z.PA.である。その他の実施態様においては、ビルディングベクターはpBV.EGFP1
である。その他の実施態様においては、ビルディングベクターはpBV.IRES.EGFP1
である。その他の実施態様においては、ビルディングベクターはpBV.pGK.Neo.PA
.である。
好適実施態様においては、2種以上のビルディングベクターがキットに含まれ
る。更に好適な実施態様においては、上記ビルディングベクターの４種全てがキ
ットに含まれる。1種以上のビルディングベクター又はTSSVの制限地図もキット
に含まれる。更に、本キットは、相同的組換えを行うキットの内容物を用いるた
めのプロトコールも含まれる。個々の実施態様においては、キットはpSV1.RecA
を含み、1種以上の上記ベクターはフザリン酸及び/又はクロロテトラサイクリン
を含む。
従って、本発明の主な目的は、組換え不能ホスト細胞において独立起原のクロ
ーニングベクターを容易にかつ特異的に修飾する方法を提供することである。
本発明の目的は、更に、独立起原のクローニングベクターが含む問題の遺伝子
の特異的修飾を可能にするためにRecA-ホスト細胞においてRecA様タンパク質を
一時的に発現する方法を提供することである。
本発明の目的は、更に、RecA-細胞において独立起原のクローニングベクター
が含む特異的遺伝子に欠失、置換、及び/又は点突然変異をつくる方法を提供す
ることである。
本発明の目的は、更に、RecA様タンパク質をコードし、両ベクターが組換え不
能ホスト細胞内に存在する場合に独立起原のクローニングベクターによる相同的
組換えを選択的に受ける組換えカセットにおいて特異的核酸を更に含む条件的複
製シャトルベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、RecA様タンパク質をコードしている温度依存性シャト
ルベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、RecA様タンパク質をコードし、両ベクターを組換え不
能ホスト細胞内に入れた場合に独立起原のクローニングベクターが含む問題の遺
伝子による相同的組換えを選択的に受けることができる組換えカセットにおいて
特異的核酸を更に含む温度依存性シャトルベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、ATCC No.97968をもつpSV1.RecAである温度感受性シャ
トルベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、IOBCが含む核酸を動物接合体に前核注入するために用
いられる修飾した独立起原のクローニングベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、胚性幹細胞へトランスフェクトされる修飾した独立起
原のクローニングベクターを提供することである。
本発明の目的は、更に、修飾した独立起原のクローニングベクターからの直線
化核酸挿入断片を動物の受精接合体へ導入する方法を提供することである。
本発明の目的は、更に、修飾した独立起原のクローニングベクターを胚性幹細
胞へ導入する方法を提供することである。
本発明の目的は、更に、大きな直線化BBPACを精製する方法を提供することで
ある。
本発明のこれらの及び他の態様は、下記の図面及び詳細な説明によってより良
く理解される。
図面の簡単な説明
図１は、標的BAC修飾戦略を示す図である。（I）シャトルベクターを構築する
のに２つのクローニング工程が必要である。組換えカセット(ゲノム断片A及びB;
及びIRES-LacZP-ポリAマーカー遺伝子)をまずビルディングベクターに構築し、
次に温度感受性pSV1.RecAシャトルベクターの中へサブクローン化する。（II）
レプリコン複合体形成:レプリコン複合体は相同A部位か又は相同B部位での相同
的組換えによって形成され、前者の場合のみ示される。（III）分割:分割したBA
Cをフザリン酸とクロラムフェニコールを含む平板上で増殖することにより選択
する。正しく分割したクローンを特定の挿入プローブ(例えば、PGKポリAプロー
ブ)とコロニーハイブリダイズすることにより同定する。
図２は、マウス亜鉛フィンガー遺伝子、RU49を含むBAC169の標的修飾を示す概
略図である。RU49を含むBAC169をマウス129株BACゲノムDNAライブラリー(Resear
ch Genetics)のスクリーニングにより入手した。図2Aは、BAC169を示す制限地図
である。いくつかのエキソンの位置を示す。相同A1(1kb PCR断片)と相同B1(1.6k
b Xba-Hind断片)の領域を示す。略号:XhoI(Xh)、EcoRI(R)、HindIII(H)、XbaI(X
)、NotI(Not)及びPmeI(Pme)。図2Bは、IRES LacZ PolyA挿入による修飾BAC169を
示す地図である(BAC169.ILPA)。PmeIエキストラ部位にマーカー遺伝子を挿入す
る(星印)。2つのPme-Not断片とPmeI断片のサイズを示す。マーカー遺伝子(4kb)
は欠失したゲノム領域(7kb)より小さいので、修飾BAC(128kb)の全サイズはもと
のBAC(131kb)より小さい。
図３は、BACレプリコン複合体と分割BACのサザンブロット分析を示す図である
。図3Aは、BAC169、相同B1までのレプリコン複合体、及び正しく分割したBACに
予想されるサザンブロット断片を示す概略図である。相同B1までの組換えを分析
する場合、EcoRI消化物を用い、相同B1をプローブとして用いる。相同A1まで組
換えを分析する場合、HindIII消化物を用い、相同A1をプローブとして用いる。
図3Bは、相同B1レプリコン複合体を示す写真である。BACクローンのEcoRI消化物
及び対照を相同B1でプローブする。1-4は、4種のクローンを示す。組換えカセッ
トを含むBAC169とpSV1を対照として用いた。図3Cは、分
割BACの5'端の分析を示す写真である。分割BACクローン(1-8)をHindIIIで消化し
、相同A1でプローブした。対照は、相同B1レプリコン複合体(CI)、BAC169及び組
換えカセットを含むシャトルベクターである。図3Dは、分割BACの3'端の分析を
示す写真である。分割BACクローンをEcoRIで消化し、相同B1でプローブした以外
は上記と同じ手順を用いる。
図４は、ILPA挿入により修飾した169のパルスフィールドゲル電気泳動分析を
示す写真である。BAC169.ILPA(L1とL2)とBAC169の２つの独立したクローンのDNA
をアルカリ性溶解により調製してからNotI、PmeI及びXhoI(2.5mMスペルミジンで
補足した標準バッファー中)で消化した。消化したDNAをパルスフィールドゲル電
気泳動(Bio-RadのCHEF-DRII、5〜15s、14℃で15時間)で分離し、ニトロセルロー
スフィルター(Stratagene)にブロットした。同じフィルターを３種のプローブで
別個にプローブした。L1及びL2は、図3Cと図3Dの各々クローン１及び２に相当す
る独立したクローンであるlacZ1及びLacZ2である。図4Aは、BAC169プローブの使
用を示す写真であり、全ての制限断片を示した。図4Bは、pgkポリAプローブの使
用を示す写真であり、ILPA挿入断片に対してのみハイブリダイズした。図4Cは、
A2プローブの使用を示す写真であり、修飾領域の外の断片に対してハイブリダイ
ズした。マーカーの位置を示す。
図５は、BACトランスジェニックマウスの作製を示す写真である。図5Aは、前
核注入の精製した直線化BAC L1 128kb Not挿入断片を示す写真である。パルスフ
ィールドゲルをpgkポリAプローブでプローブする。数字は異なる画分を示す。無
傷断片の下の塗沫は分解及び未消化DNAを示す。図5Bは、lacZプローブによる創
始トランスジェニックマウスのサザンブロット分析を示す写真である。テイルDN
AをBamHIで消化し、サザンブロット分析を行った。負の対照は、Y3、Y7及びY9マ
ウスの同腹仔から構成した。正の対照は、lacZ導入遺伝子を含む従来のトランス
ジェニックマウスとした。図5C及び図5Dは、PCRを用いてトランスジェニックマ
ウスのBAC端の存在を求めた結果を示す写真である。ベクター配列に対応する各
端のDNAを増幅し、断片の中央で第３オリゴヌクレオチドでプローブする。適切
なサイズ断片を示す。負の対照は同腹仔である。正の対照はBAC169DNAとした。
図5Eは、Y7マウス系におけるlacZ導入遺伝子の生殖系列伝
達を示す写真である。8匹のマウスをもつ２匹の同腹仔からのテイルDNAを調製し
、BamHIで消化した。サザンブロット分析をlacZプローブで行った。
図６は、Y7 BACトランスジェニック系の脳におけるlacZ導入遺伝子の発現を示
す写真である。Y7トランスジェニックマウス(図6A)と野生型対照同腹仔(図6B)か
らのP6マウス脳の全組織標本を染色してY7小脳におけるlacZ発現を示した。Y7ト
ランスジェニックマウスからの厚い縦の切片(5mm)についてもlacZ発現を染色し
た。図6Cは低倍率を示し、図6Dは図6Cに示された矩形領域の高倍率を示す写真で
ある。小脳、歯状回及び直系の嗅球での発現を示す(即ち、SVZ、RMS及びOB)。略
号Ce、小脳;SC、上丘腕;DG、歯状回;VZ、脳室帯;SVZ、脳室下帯;LV、側脳室;RMS
、吻側遊走路;OB、嗅球;Co、皮質。
図７は、選択BAC内の問題の遺伝子の仮定の地図を示す図７A;正の選択マーカ
ー遺伝子を導入する第１標的修飾を示す図7B;及び遺伝子のプロモーターを欠失
させ短いアームを作成する第２修飾を示す図7Cを含む概略図である。
図８は、pSV1.RecAの制限地図である。この温度感受性シャトルベクターは、M
．O'Connorら[Science，244:1307-1312(1989)]が最初に構築したpMBO96に基づく
。
図９は、pBV.IRES.LacZ.PA.の制限地図である。このベクターは、Kimら[MCB，
12:3636-3643(1992)]が最初に構築したpwH10ベクターから変更した。
図10は、pBV.EGFP1の制限地図である。プラスミドは、pBluescript.KS(+)に基
づく。EGFP1はクローンテックから入手した。
図11は、pBV.IRES.EGFP1の制限地図である。プラスミドは、pBluescript.KSバ
ックボーンに基づく。EGFP1はクローンテックから入手した。
図12は、pBV.PGK.Neo.PAの制限地図である。ベクターはpBS.KSバックボーンに
基づく。pGK.Neo.PA配列をHindIIIとBamHIで消化することによりpKS.NTから切除
し、pBV.IRES.LacA.PA.のHindIII/Bam断片の中へサブクローン化した。
発明の詳細な説明
本発明は、組換え不能ホスト細胞において独立起原のクローニングベクター(I
OBCV)を直接修飾する簡便な方法であって、独立起原のクローニングベクターに
含まれる特定の遺伝子に欠失、置換、及び/又は点突然変異をつくる工程を含
む、前記方法を提供する。その修飾は著しい特異性で行なわれる。本発明の修飾
した独立起原のクローニングベクターは、修飾した異種遺伝子をホスト細胞へ導
入するために用いられる。その修飾ベクターの個々の使用は、生殖系列伝達した
独立起原のクローニングベクタートランスジェニック動物を作製するための使用
である。
独立起原のクローニングベクター標的修飾は、異種生物系における機能研究に
用いられる。独立起原のクローニングベクターを効率よく修飾しIOBCVトランス
ジェニック動物をつくる能力は、生体内遺伝子の機能分析の応用に重要である。
まず、修飾した独立起原のクローニングベクターは、マウスのようなトランスジ
ェニック動物において遺伝子又は遺伝子複合体の調節を研究するために用いられ
る。修飾した独立起原のクローニングベクターは生体内の遺伝子機能を研究する
ために用いられるので、ある遺伝子内の欠失、置換及び点突然変異は独立起原の
クローニングベクター内でつくられ、修飾遺伝子を含む独立起原のクローニング
ベクターは内在発現パターンで生体内に再導入される。更に、独立起原のクロー
ニングベクター標的修飾は他の遺伝子の発現パターンにおいて選択遺伝子の調節
要素の全てが以前の知識を含まずに選択遺伝子の標的発現をつくるために用いら
れる。このタイプの重要な応用は、組織/細胞型特異的遺伝子ターゲッティング
のcreレコミナーゼの標的発現である[Kuhnら，Science 269:1427(1995);Tsienら
，Cell 87:1317(1996)]。更に、修飾した独立起原のクローニングベクターは大
きなDNA構築物を特にES細胞及び生体内における遺伝子ターゲッティング用に作
成するために用いられる。
本発明の個々の実施態様においては、独立起原のクローニングベクターはE．c
oliホスト細胞中で修飾した細菌人工染色体(BAC)である。BAC標的修飾系は、従
来の酵母の修飾系よりいくつかの利点がある。第１に、修飾したBACが修飾後に
組換え不能状態に戻り、ホスト株において修飾BACの安定な維持を行わせる。第
２に、BAC DNAは比較的大量かつ高品質で非常に容易に精製され、前核注入を含
む生物実験に用いることができる。第３に、YACライブラリーよりBACライブラリ
ーを構築することが非常に容易であるので、動物、植物及び微生物の異なる種類
から得られる多くのBACライブラリーがある[Wooら，Nucleic Acids Res.，
22:4922(1994);Wangら，Genomics 24:527(1994);Woosterら，Nature 378:789(19
95)]。たいていのBACは、用量依存性及び組込み部位非依存性導入遺伝子発現を
得るために必要な調節要素全てが含まれる[Dillonら，Trends Genet．9:134(199
3);Wilsonら，Annu．Rev．Cell．Biol．6:679(1990);Bradleyら，Nature Genet
．14:121(1997)]。BAC標的修飾はこれらの要素を分析するために連続的に適用さ
れる。更に、その修飾BACはトランスジェニック動物をつくるために用いられる
。BAC(又はPAC)は、動物細胞ゲノムに安定に組込まれる。トランスジェニック動
物は、機能研究のために、又は所望の遺伝子産物を生成するために、例えば、ト
ランスジェニック哺乳動物の乳中のヒトタンパク質を生産するために用いられる
[Drohanら，1996年12月31日発行の米国特許第5,589,604号]。また、その修飾し
たBAC又はPACは、遺伝子治療において特定の遺伝子を送達するために用いられる
。下記の実施例においては、修飾BACをマウス被検動物に巧みに挿入し、生体内
異種遺伝子発現を証明した。
本発明の方法は非常に普遍的である。独立起原のクローニングベクター標的修
飾はBACについて示されるが、組換え不能E．coliにおいて増殖されるPAC、P1及
び他のベクターを含む一般のBBPACに応用しやすい。更に、本明細書に例示され
たBAC修飾は哺乳動物人工染色体に適切である。例えば、Harringtonら[Nature G
enetics，15:345-355(1997)]はヒト人工染色体の成分としてBAC由来DNAを用いた
。従って、そのヒト人工染色体の使用は本発明によって教示されたBAC修飾が含
まれる。
本発明によれば、当該技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換
えDNA技術が用いられる。そのような技術は文献に十分に説明されている。例え
ば、Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual
，sec．Ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor
，New York(本明細書では“Sambrookら，1989”);DNA Cloning:A Practical App
roach，Vol．I & II(D.N．Glover ed．1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J．
Gait ed．1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D．Hames & S.J.Higgins eds.(
1985)];Transcription And Translation[B.D．Hames & S.J．Higgins，eds.(198
4)];Animal Cell Culture[R.I．Freshney，ed.(1986)];
Immobibized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)];B．Perbal,A Practical G
uide To Molecular Cloning(1984);F.M．Ausubelら(eds.)，Current Protocols
in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)を参照されたい。
本明細書に用いられる“IOBCV”は、独立起原のクローニングベクターである
。そのクローニングベクターの例は下記に定義されるBBPACである。IOBCVは、一
般的には、問題の遺伝子であるか又はそれを含む核酸挿入断片を含む。
“ベクター”はレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ又はコスミドであ
り、他のDNAセグメントが結合されて結合したセグメントの複製を生じる。“レ
プリコン”は、生体内、即ち、それ自体の制御によって複製が可能なDNA複製の
自律単位として機能する遺伝要素(例えば、プラスミド、染色体、ウイルス)であ
る。
本明細書に用いられる“細菌又はバクテリオファージ由来人工染色体”又は“
BBPAC”は、E．coli要素のクローニング系、P1由来人工染色体(PAC)又はλコス
ミドである細菌人工染色体(BAC)のような細菌又はバクテリオファージに由来す
るベクターを示す。実施態様においては、BBPACは500〜700キロベースのゲノム
配列をコードしている。他の実施態様においては、BBPACは500キロベースまでの
ゲノム配列をコードしている。好適実施態様においては、BBPACは120〜180キロ
ベースのゲノム配列をコードしている。具体的な実施態様においては、BBPACは1
30キロベースのゲノム配列をコードしている。遺伝子ターゲッティングに用いら
れるBBPACは“BBPACターゲッティング構築物”と呼ばれ、遺伝子ターゲッティン
グ構築物を含む核酸挿入物を含む。
本明細書に用いられる“遺伝子ターゲッティング構築物”は“ターゲッティン
グ構築物”と同じ意味で用いられ、細胞へ導入された場合に細胞の内在染色体DN
Aで相同的組換えを受ける核酸である。核酸を細胞へ導入して内在染色体DNAに含
まれる具体的な遺伝子の修飾を誘導する。具体的な例においては、その遺伝子を
破壊してノックアウト動物をつくる。
本明細書に用いられる組換え不能ホスト細胞は、ホスト細胞がrecA自体を含む
RecA様タンパク質を発現することができない場合の“RecA-”であり、相同的
組換えを支持することができる。最も簡単な例では、RecA様タンパク質をコード
している遺伝子はRecA-ホスト細胞において欠失している。また、RecAホスト細
胞は機能を損なうrecA遺伝子に突然変異を含む。
“RecA様タンパク質”は、特定のRecA様タンパク質である本明細書に用いられ
るrecAタンパク質自体が含まれる以外は当該技術において一般に認められる意味
をもつように定義される。RecA様タンパク質は相同的組換えに関係するタンパク
質であり、recAに相同性である[Clarkら，Critical Reviews in Microbiology 2
0:125-142(1994)]。recAタンパク質は、原核相同的組換えにおける中心酵素であ
る。相同DNA分子間の対合やストランドエクスチェンジを触媒し、DNA修復や遺伝
子組換えの双方に機能する[McKeeら，Chromosoma 7:479-488(1996)]。多くのRec
A様タンパク質が真核生物及び酵母に見られる[Reissら，Proc．Natl．Acad．Sci
．93:3094-3098(1996)]。酵母中の２種のRecA様タンパク質はRad51及びDmclであ
る[上記McKeeら(1996)]。Rad51は真核細胞においてRecA様タンパク質を高度に保
存する[Peakmanら，Proc．Natl．Acad．Sci．93:10222-10227(1996)]。
本明細書に用いられる“問題の遺伝子”は、ホスト細胞ゲノム又は好ましくは
組換えカセットに含まれる特定の核酸で相同的組換えを受けるように選択された
独立起原のクローニングベクターに含まれる遺伝子である。問題の遺伝子は、こ
の目的のためにホスト細胞又は独立起原のクローニングベクターに特異的に入れ
られるか又はホスト細胞又は独立起原のクローニングベクターによって既に含ま
れている。
本明細書に用いられる“マーカー”は指標であり、その有無が具体的な核酸の
有無、好ましくは特定の核酸を含む及び/又はそれに結合する大きなDNAの対応す
る有無を区別するために用いられる。好適実施態様においては、マーカーはタン
パク質又はそのタンパク質をコードしている遺伝子であるので、特に“マーカー
タンパク質”又は“マーカー遺伝子”と呼ばれる。“マーカー２(マーカータン
パク質又はマーカー遺伝子)という用語は、非常に広く用いられることを意味し
、緑色蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質、ルシフェラーゼのような酵素が
含まれ、更に、その有無が単に薬剤耐性タンパク質を含む細胞を検出する手段と
し
てはみなされない薬剤耐性タンパク質;及び/又はそのタンパク質をコードしてい
るhe遺伝子が含まれる。しかしながら、薬剤耐性タンパク質及び/又はその対応
する遺伝子は薬剤耐性遺伝子を含む細胞の優先的な増殖を可能にする(又は薬剤
耐性遺伝子を含まない細胞の逆選択を可能にする)ので、マーカーの本定義内に
包含することを意味するあるタイプの選択可能な区別を与える。
“マーカータンパク質をコードしている遺伝子”という用語は、“マーカータ
ンパク質遺伝子”という用語と同じ意味で本明細書に用いられ、マーカータンパ
ク質をコードしている核酸を示す。
“カセット”は、特定の制限部位をベクターに挿入することができるDNAセグ
メントを意味する。DNAセグメントは問題のポリペプチドをコードし、カセット
と制限部位は転写及び翻訳に適切なリーディングフレームにカセットの挿入を行
わせるように設計される。本発明は、挿入、欠失又は突然変異配列によって中断
される２つの相同断片を含む組換えカセットを提供する。
“異種”DNAは、細胞、又は細胞の染色体部位に天然に位置しないDNAを意味す
る。好ましくは、異種DNAは細胞に対して外来の遺伝子が含まれる。
“核酸分子”は、一本鎖か又は二本鎖らせんのリボヌクレオシド(アデニン、
グアノシン、ウリジン又はシチジン;“RNA分子”)又はデオキシリボヌクレオシ
ド(デオキシアデニン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシ
シチジン;“DNA分子”)のリン酸エステル高分子、又はそのホスホエステル類似
体、例えば、ホスホロチオエート及びチオエステルを意味する。二本鎖DNA-DNA
、DNA-RNA及びRNA-RNAらせんが可能である。核酸分子、特にDNA又はRNA分子とい
う用語は、その分子の一次構造と二次構造のみを意味し、具体的な三次構造まで
限定しない。従って、この用語は、特に、線状又は環状DNA分子(例えば、制限断
片)に見られる二本鎖DNA、プラスミド、及び染色体が含まれる。具体的な二本鎖
DNAの構造を述べるにあたり、配列は非転写DNA鎖(即ち、mRNAに相同な配列をも
つ鎖)に沿って5’→3’方向でのみ配列を示すという慣例に従って本明細書に記
載される。“組換えDNA分子”は分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
“相同的組換え”は、第１ベクターによって含まれる修飾又は外来DNA配列を
第２ベクターに含まれる他のDNA配列、又は細胞の染色体に挿入することを意味
する。第１ベクターは、相同的組換えに特異的な染色休部位を標的にする。特異
的な相同的組換えについては、第１ベクターは、第２ベクター又は染色体の配列
に対して十分に長い相同領域を含み、第２ベクター、又は染色体への第１ベクタ
ーからのDNAの相補的結合及び組込みを可能にする。長い領域の相同性、及び高
程度の配列類似性は、相同的組換えの効率を高めるものである。
DNA“コーディング配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に試験
管内又は生体内の細胞においてポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖DNA配
列である。コーディング配列の境界は、5’(アミノ)末端の出発コドン及び3’(
カルボキシル)末端の翻訳停止コドンにより求められる。コーディング配列は、
原核配列、真核mRNAからのcDNA、真核(例えば、哺乳動物)DNAからのゲノムDNA配
列、及び合成DNA配列さえ含まれるがこれらに限定されない。コーディング配列
が真核細胞中での発現が企図される場合、ポリアデニル化シグナルと転写終結配
列は通常3’→コーディング配列に位置する。
転写及び翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の
DNA調節配列であり、ホスト細胞中でコーディング配列を発現する。真核細胞に
おけるポリアデニル化シグナルは調節配列である。
“プロモーター配列”は、細胞中でRNAポリメラーゼを結合しかつ下流(3’方
向)コーディング配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明
の定義のために、プロモーター配列は、3’末端が転写開始部位であり、上流(5
’方向)に伸びてバックフラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始する
ことが必要な最少数の塩基又は要素を含む。プロモーター配列の範囲内に転写開
始部位(例えば、ヌクレアーゼS1でマッピングすることにより便利に区切られる)
、及びRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン(共通配列)が
見られる。
コーディング配列は、RNAポリメラーゼがそのコーディング配列をmRNAに転写
し、それをtrans-RNAスプライシングし、そのコーディング配列がコードしてい
るタンパク質に翻訳される場合に細胞中で転写及び翻訳制御配列の“制御下”に
ある。
“シグナル配列”は、細胞の表面上で発現されるタンパク質のコーディング配
列の最初に含まれる。この配列は、ポリペプチドを移すためにホスト細胞を特定
するシグナルペプチド、N末端→成熟ポリペプチドをコードする。本明細書に用
いられる“トランスロケーションシグナル配列”は、この種のシグナル配列を意
味する。真核細胞及び原核細胞の末変性の種々のタンパク質と関連があるトラン
スロケーションシグナル配列が見られる。
ゲノムDNA又はcDNAのいずれも問題の遺伝子を含む具体的なヌクレオチド配列
は、供給源、特にヒトcDNA又はゲノムライブラリーから単離される。本教示の観
点から及び本教示と共に、当該技術において周知の方法が上記のように供給源か
らその遺伝子を得るために用いられる(例えば、上記Sambrookら，1989)。
従って、動物細胞は、選択した遺伝子の分子クローニングの核酸供給源として
役立つことができる。DNAはクローン化DNA(例えば、DNA“ライブラリー”)から
当該技術において既知の標準操作により得られ、好ましくは化学合成、cDNAクロ
ーニング、又は所望の細胞から精製されたゲノムDNA、又はその断片のクローニ
ングによりタンパク質の高レベルの発現により組織から調製されたcDNAライブラ
リーから得られる(例えば、上記Sambrookら，1989;Glover，D.M.(ed.)，1985，D
NA Cloning:A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，オックスフォード,英国v
ol．I,II)。ゲノムDNAに由来するクローンは、コード領域のほかに調節領域及び
イントロンDNA領域を含んでもよく、cDNAに由来するクローンはイントロン配列
を含まない。
本発明は、通常は相同的組換えを独立して支持することができない細胞におい
て相同的組換えを選択的に行う方法を提供する。組換え不能細胞を一時的に誘導
して相同的組換えを支持する場合に具体的なヌクレオチド配列に選択的に組込む
組換えカセットに特定の核酸が挿入される。更に詳細には、本発明は、問題の遺
伝子の具体的なヌクレオチド配列へ特定の核酸を組込むことを可能にする。本発
明によって提供された方法は、相同的組換えを本来支持するホスト細胞を含む他
の系の特徴を示す非特異的ヌクレオチド配列の再配列や欠失を最少にする。
ある場合には、特定の核酸は問題の遺伝子と全く異なるタンパク質をコードす
ることができ、プロモーターの組織特異性、例えば、トランスジェニック動物を
つくるための使用、又は遺伝子治療プロトコールのための使用に問題の遺伝子が
選択される。その実施態様においては、プレプロエンケファリンプロモーターが
トランスジェニックマウスにおいて脳発現及びシナプス調節を与えることがわか
ったので、ラットプレプロエンケファリン遺伝子は問題の遺伝子として用いられ
る[Donovanら，Proc．Natl．Acad．Sci．89:2345-2349(1992)]。下記の実施例に
おいては、マウス亜鉛フィンガー遺伝子、RU49を問題の遺伝子として用いた。ま
た、問題の遺伝子の配列に意図的かつ特異的な修飾を生じるように、例えば、部
位特定突然変異誘発プロトコールで典型的に行なわれるような遺伝子産物のアミ
ノ酸配列の変化を誘導するために、特定の核酸が構築される。
本発明の態様においては、組換え不能ホスト細胞は、ホスト細胞がRecA-であ
るために相同的組換えを独立して支持することができない。しかしながら、当業
者が容易に理解するように、組換え不能の別の原因は本発明によって教示された
ものと同じである及び/又はその教示の観点から容易に明らかである方法によっ
て調整される。例えば、組換え不能はrecB、recC、recD、及びrecEを含む他のRe
cタンパク質のような別の組換えタンパク質の欠損のためであり[Clarkら，Criti
cal Reviews in Microbiol．20:125-142(1994)]、RecA様タンパク質について教
示した方法と同じ方法で操作される。
RecA-ホスト細胞の場合には、相同的組換えを一時的に支持するホスト細胞を
誘導する工程は、ホスト細胞中でRecA様タンパク質の一時的発現を誘導する工程
を含む。その誘導は、誘導プロモーターの制御下にある組換え不能ホストが含む
RecA様タンパク質を発現することにより行われる。
本発明の好適実施態様においては、RecA様タンパク質の一時的発現を誘導する
工程は、RecA様タンパク質をコードしている条件的複製シャトルベクターで行な
われる。条件的複製シャトルベクターは、ポリA温度感受性細菌株を含むもので
ある。好ましくは、許容温度で複製するが非許容温度で複製しない温度感受性ベ
クター(TSSV)である。
RecA様タンパク質の一時的発現を誘導する工程は、ホスト細胞をTSSVで許容温
度において形質転換する工程、及びホスト細胞を非許容温度で増殖する工程から
なる。TSSVは、ホスト細胞中で発現されるRecA様タンパク質をコードし、組
換えカセットに含まれる特定の核酸とホスト細胞中に含まれる具体的なヌクレオ
チド配列間の相同的組換えを支持する。RecA様タンパク質をコードしているTSSV
は、ホスト細胞が非許容温度で増殖される場合に希釈される。
本発明のより複雑な形においては、相同的組換えを受けるように選択された具
体的なヌクレオチド配列は、ホスト細胞によって構成される独立起原のクローニ
ングベクター(IOBCV)によって含まれ、独立起原のクローニングベクターのみも
ホスト細胞と組合わせた独立起原のクローニングベクターも独立して相同的組換
えを支持しない。このタイプの具体的な実施態様においては、独立起原のクロー
ニングベクターとホスト細胞は共にRecA - であり、ホスト細胞を誘導して相同的
組換えを一時的に支持する工程はRecA様タンパク質の一時的発現を誘導してホス
ト細胞における相同的組換えを支持する工程を含んでいる。独立起原のクローニ
ングベクターは下記に例示されるBACのようなBBPACであり、ホスト細胞はE．col
iのようなホスト細菌である。
本発明の方法に有用な独立起原のクローニングベクターは、多くの供給源から
得られる。例えば、ヒトライブラリーのE．coliの人工染色体が記載されている[
Shizuyaら，Proc．Natl．Acad．Sci．89:8794-8797(1992);Ioannouら，Current
Protocols in Human Genetics(ed.Dracopoliら)5.15.1-5.15.24 John Wiley & S
ons，ニューヨーク(1996);Kimら，Genomics 34:213-218(1996)]。PAC及びBACの
ライブラリーが構築されており[Monacoら，Trends Biotechol.，12:280-286(199
4)]、例えば、古典的アルカリ性溶解プラスミド調製プロトコール[birnboimら，
Nucleic Acids Res．7:1513-1523(1979)]、又はヌクレオボンドキット、煮沸プ
レップの使用、又はセシウム勾配(上記Maniatis)によりホストゲノムバックグラ
ウンドから容易に単離される。BAC、PAC、及びP1ライブラリーは様々な種に用い
られる(例えば、Research Genetics，Inc.，GenomeResearch，Inc.，テキサスA&
Mは家畜や重要な作物のBACライブラリーを作成するBACセンターがある)。また、
BACは哺乳動物人工染色体の成分として用いられる。
BACである独立起原のクローニングベクターは、cDNA又はゲノムDNAプローブを
用いて単離され、例えば、BACゲノムライブラリーをスクリーニングする。リ
サーチジェネティクスから入手したマウスゲノムBACライブラリーの使用を下記
に例示する。正のBACはたいてい数日で得られる。BACの選択遺伝子座に問題の遺
伝子を挿入するために、制限酵素部位の挿入領域がマッピングされる。詳細なマ
ッピングにはサブクローニングが必要であるが、通常は大体のマッピングで十分
であるのでたいてい不要である。容易に明らかであるように、他の独立起原のク
ローニングベクターゲノムライブラリーもスクリーニングされ、単離した独立起
原のクローニングベクターが同様の方法で操作される。
独立起原のクローニングベクターによってコードされた問題の遺伝子のヌクレ
オチド配列に選択的に組込むことができる組換えカセットを含むように本発明の
条件的複製シャトルベクターを構築する。その条件的複製シャトルベクターは、
PCR増幅RecA様遺伝子を特定の薬剤耐性遺伝子を含むか又は後に修飾されてそれ
を含む適切な条件的複製シャトルベクターに挿入することにより構築される。好
適実施態様においては、薬剤耐性遺伝子は、例えば、テトラサイクリンやフザリ
ン酸により逆選択される。また、薬剤耐性遺伝子のほかに条件的シャトルベクタ
ーは、ガラクトースに対する感受性を与える遺伝子のような逆選択遺伝子を含む
ことができる。
下記の実施例においては、E．coli K12 recA遺伝子(1.3kb)をpMBO96ベクター
のBamHIに挿入する。この場合、ベクターは既にテトラサイクリン耐性を与える
遺伝子を有し、更に、プラスミドを30度で複製するが43度では複製しないpSC101
温度感受性複製起点を含む。
条件的複製シャトルベクターのRecA様タンパク質は誘導プロモーター又は構成
的プロモーターによって制御される。具体的な実施態様においては、RecA様タン
パク質の一時的発現はホスト細胞における誘導プロモーターの一時的誘導により
達成される。他の実施態様においては、構成的プロモーターは内在E．colirecA
プロモーターである。
条件的複製シャトルベクターは、少なくとも１つのユニークなクローニング部
位を含む。上記の組換えカセットの構築にビルディングベクターが用いられる場
合、特定の核酸を含む組換えカセットをビルディングベクターから条件的複製シ
ャトルベクターへ移入するユニークな部位が保存される。例えば、ポリリンカー
は、組換えカセットを条件的複製シャトルベクターの中へクローン化することが
できる制限部位を更につくるために２つの特定の制限部位の間に挿入される。い
ずれの場合にもつくられた条件的複製シャトルベクターは、最低限、約350塩基
対(例えば、少なくといっても250〜600塩基対が十分である)以上の独立起原のク
ローニングベクターの問題の遺伝子を含むゲノム断片が5’端と3’端の双方に隣
接した特定の核酸(例えば、点突然変異、欠失又はマーカー遺伝子を含む)を含む
組換えカセットを含まなければならない。
ある場合には、組換えカセットを構築するためにビルディングベクターが用い
られる。各々が約350塩基対(例えば、少なくといっても250〜600塩基対が十分で
ある)を含む２つの小ゲノム断片をビルディングベクター(例えば、pBV1)の中へ
適切な順序と方向でクローン化して組換えカセットのフランキング領域を作成す
る。5’→ポリアデニン付加シグナル配列である、ブロモーター配列の5’→特定
核酸を含むDNAを２つのゲノム断片の間に適切な向きで挿入する。次に、組換え
カセットを条件的複製シャトルベクター(例えば、pSV1.RecA)へ移入する。組換
えカセット、RecA様タンパク質遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子を共に条件的複製シ
ャトルベクターに結合し、特定の核酸が具体的なヌクレオチド配列に組込んでい
る場合にはRecA様タンパク質遺伝子と薬剤耐性遺伝子は共に結合したままであり
、RecA様タンパク質も薬剤耐性遺伝子も組込まれた特定の核酸に結合していない
。好適実施態様においては、条件的複製シャトルベクターはTSSVであり、TSSVは
ATCC No.97968をもつpSV1.RecAである。
本発明の方法によれば、条件的複製シャトルベクターを独立起原のクローニン
グベクターを含むRecA-ホスト細胞へ形質転換する。独立起原のクローニングベ
クターは、また、抗生物質又は個々の実施態様においてはクロラムフェニコール
のような対応する毒性物質/薬剤に対してホスト細胞に耐性を与える遺伝子を含
むことができる。条件的複製シャトルベクターが複製することができる条件下で
細胞を増殖させ(例えば、条件的複製シャトルベクターが30°で複製し43°で複
製しないTSSVである場合、ホスト細胞を30°で生育する)、条件的複製シャトル
ベクターによって保有される特定の薬剤耐性遺伝子(又は第１薬剤耐性遺伝子)、
及び独立起原のクローニングベクターが保有する第２薬剤耐性遺伝子によ
り形質転換細胞が選択される。条件的複製シャトルベクターがRecA様タンパク質
遺伝子をもっているので、相同的組換えは条件的複製シャトルベクターと独立起
原のクローニングベクターと独立起原のクローニングベクター間で起こり組換え
カセットの5’か又は3’フランキング領域で配列相同性によってレプリコン複合
体を形成する。次に、細胞を第１及び第２薬剤を含む平板上で非許容条件(例え
ば、上記TSSVについては43℃)で増殖することによりレプリコン複合体か選択さ
れるので、組込まれない遊離の条件的複製シャトルベクターは消失する。これに
より、(独立起原のクローニングベクターか又はホスト染色体へレプリコン複合
体を形成する)組込み条件的複製シャトルベクターをもつホスト細胞の選択がも
たらされる。正しい独立起原のクローニングベクターのレプリコン複合体は、PC
R又は更に好ましくはサザンブロット分析により同定される。
次いで、レプリコン複合体は、第２薬剤(即ち、独立起原のクローニングベク
ターにより最初に保有された遺伝子が保護している薬剤)を含む平板上に画線さ
れ、非許容条件下で一晩増殖される。レプリコン複合体の画分は、組換えカセッ
トの5’か又は3’フランキング領域で配列相同性によって第２組換え因子(分割
と定義される)を受ける。分割された独立起原のクローニングベクターは、上記
条件的複製シャトルベクター上のRecA様タンパク質遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び
特定の核酸の結合再配列のために第１薬剤耐性遺伝子(即ち、条件的複製シャト
ルベクターが含む特定の薬剤耐性遺伝子)及びRecA様タンパク質遺伝子を自動的
に消失する。更に、切除した条件的複製シャトルベクターは、非許容条件下で複
製することができないので希釈される。
分割された独立起原のクローニングベクターは、更に、第２薬剤及び第１薬剤
に対して耐性のある遺伝子を含む細胞を逆選択する物質(例えば、テトラサイク
リン耐性を与える遺伝子はフザリン酸により逆選択される)を含む平板上でホス
ト細胞(例えば、37℃で)を増殖させることにより選択される。分割された独立起
原のクローニングベクターは、もとの独立起原のクローニングベクターか又は正
確に修飾した独立起原のクローニングベクターである。正しく分割されたBACを
同定する方法は、5〜10コロニーを選択しミニプレップDNAを調製する方法である
。次いで、正しいターゲッティング因子を検出するサザンブロットを用いて
DNAが分析される。また、所望のクローンが組換えカセットが含む特定の核酸用
の標識プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより同定される。そ
のプローブは当該技術に周知であり、核酸配列に対してハイブリダイズする標識
ヌクレオチドプローブが含まれる。また、マーカー核酸は組換えカセットに含ま
れ、構築されて独立起原のクローニングベクターに組込まれる際に特定の核酸と
共に保たれる。
マーカーは、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、及び
テトラサイクリンのような薬剤に対して上で例示したようにホスト細胞に特定の
薬剤耐性を与えるマーカータンパク質、米国特許第5,625,048号、発行日4/29/97
、及び国際出願第97/26333号、公開日7/24/97、これらの明細書の記載は本願明
細書に含まれるものとする、に記載された緑色蛍光タンパク質又は修飾した緑色
蛍光タンパク質のような細胞に特定の物理的特性を与えるタンパク質、又はルシ
フェラーゼのような酵素をコードしているマーカー遺伝子又はマーカー核酸であ
る。また、他のマーカータンパク質、例えば、β-ガラクトシダーゼである。
本発明の相同的組換え方法は、選択的であり、非特異的ヌクレオチド配列の再
配列は起こらず、1種以上の慣用の分析方法によって実質的に検出もできない。
その方法としては、予想されない欠失、又は挿入又は再配列が修飾操作中に生じ
たかを求める修飾した独立起原のクローニングベクター及び修飾されない独立起
原のクローニングベクターのパルスフィールドゲルマッピングが含まれる。具体
的な実施態様においては、同じフィルターが全独立起原のクローニングベクター
用プローブ、特定の核酸用プローブ、及び修飾されていない問題の遺伝子の領域
用プローブで別個にプローブされる。制限酵素消化から、断片が保存されている
かを意味する修飾した独立起原のクローニングベクターのフィンガープリントが
現れる。その制限酵素消化を下記に例示する。制限酵素消化は、独立起原のクロ
ーニングベクターの制限部位について選択された１種以上の追加の制限酵素で繰
り返される。
代替的方法においては、修飾した独立起原のクローニングベクター及び修飾さ
れない独立起原のクローニングベクターが独立起原のクローニングベクターに挿
入されることが予想される組換えカセットによって含まれるDNAの領域に特異的
なプローブ（例えば、プロモーター配列、特定の核酸、及びポリアデニン付加シ
グナル配列)及び修飾領域外の領域に特異的なプローブ(例えば、プロモーター領
域近傍であるが修飾領域の外)の双方で分析される。
本発明の修飾した独立起原のクローニングベクターは、ゲルろ過、例えば、無
傷の線状BAC DNAが得られるSEPHAROSE CL-4Bを充填したカラムにより精製される
。カラムは、下記の実施例に記載されるように適切なバッファーでプレ平衡化さ
れる。精製したDNAは、例えば、臭化エチジウム染色後に紫外線で直接目視され
る。SEPHAROSE CL-4Bのようなカラムは、分解したDNAを純粋な線状DNAから効率
よく分離することができる。
本発明は、また、本発明の修飾した独立起原のクローニングベクターの使用方
法を提供する。その修飾した独立起原のクローニングベクターは、トランスジェ
ニック動物をつくるために動物に挿入される核酸を含む。本発明の修飾した独立
起原のクローニングベクターは、当該技術において既知の方法、例えば、トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トラン
スダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェ
クション(リソソーム融合)、遺伝子ガンの使用、又はDNAベクター輸送体により
所望のホスト細胞へ導入される(例えば、Wuら，1992，J．Biol．Chem．267:963-
967;Wu & Wu，1988，J．Biol．Chem．263:14621-14624;Hartmutら，1990年３月1
5日出願のカナダ特許出願第2,012,311号を参照されたい)。
選択遺伝子の構成的発現は、低レベルであっても本発明によって企図される。
種々の治療的異種遺伝子、例えば、重症複合型免疫不全症(SCID)を治療するアデ
ノシンデアミナーゼ(ADA);腫瘍浸潤(TIL)T細胞の中のマーカー遺伝子又はリンホ
カイン遺伝子[Kasisら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87:473(1990);Culver
ら，同書88:3155(1991)];血友病を治療するVIII因子及びIX因子のような凝固因
子の遺伝子[Dwarkiら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:1023-1027(1995);Thom
pson,Thromb．and Haemostatis，66:119-122(1991)]のようなこれらに限定され
ない遺伝子;及び他の周知の種々の治療的遺伝子、例えば、β-グロビン、ジスト
ロフィン、インスリン、エリスロポエチン、成長ホルモン、
グルコセレブロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-アンチトリプシン、フェニ
ルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オルニチントランス
カルボアミラーゼ、アポリポプロテイン等のようなこれらに限定されない遺伝子
が本発明の独立起原のクローニングベクターへ挿入される。一般的には、Anders
onらの米国特許第5,399,346号を参照されたい。
具体的な方法は、修飾した独立起原のクローニングベクターを受精動物接合体
に前核注入する工程を含む。その方法を下記に例示し、修飾した独立起原のクロ
ーニングベクターは直線化したBACであり、動物接合体はマウス接合体である。2
plの0.6μg/mlのBAC DNAを注入した。
修飾した独立起原のクローニングベクターの両端の存在についてIOBCVの無傷
核酸挿入断片がゲノムに組込まれたかを求めるためにトランスジェニック動物が
分析される。核酸挿入断片の両端がベクター配列を含むので、ベクター配列に特
異的なPCRプライマーが作成され、トランスジェニックDNAを増幅するために用い
られる。次いで、増幅産物が増幅領域内の第３標識オリゴヌクレオチドプローブ
でプローブされる。
形成されるトランスジェニック動物は、適切に交配した後に生殖系列伝達を生
じる(実施例ではB6/CBAマウスを用いた)。トランスジェニック動物と野生型動物
の比はメンデル遺伝に従うにちがいない。
トランスジェニック動物へ挿人した問題の特定の核酸及び/又は遺伝子の発現
は、挿入断片の種類に左右される当該技術において周知の種々の方法によって求
められる。例えば、酵素について活性が適切に分析され、β-ガラクトシダーゼ
の場合には、全載染色が行なわれ、対応するmRNAを検出するために原位置ハイブ
リダイゼーションが用いられ、対応するタンパク質の発現を同定するために特異
抗体が用いられる。好適実施態様においては、発現は細胞中でのみ明らかであり
、問題の内在遺伝子が発現している。実施例においては、問題の遺伝子はマウス
亜鉛フィンガーRU49であり、その中に挿入された特定の核酸はlacZマーカー遺伝
子であり、生後６日のトランスジェニックマウスの全小脳内でのlacZマーカー遺
伝子の発現の分析は対応する内在RU49発現パターンに極めて似ていた。
本発明は、また、脊椎動物において高い遺伝子ターゲッティング率を得るため
の標的BBPAC修飾の使用を提供する。BBPACは遺伝子ターゲッティング構築物を含
む核酸挿入断片を含む。環状BBPACが用いられ、好ましくは直線化核酸挿入断片
も用いられる。いずれの場合にも、BBPAC又は直線化核酸挿入断片は本明細書に
記載されるようにゲルろ過で精製される。
本発明の態様においては、遺伝子ターゲッティングは、100kbより大きいBBPAC
遺伝子ターゲッティング構築物を用いてES細胞中で行なわれる。一般的な意味で
は、BBPAC遺伝子ターゲッティング構築物は従来の正の選択遺伝子ターゲッティ
ング構築物と似ている(図7)。2つの相同領域、長いアーム(＞80kb)と短いアーム
(10〜20kb)を含み、neoカセット(pgk-neo-ポリA)がBBPACの中央へ導入される。
この構築物をつくるために２つの標的BBPAC修飾を用いる。第１修飾は、neo遺伝
子を導入してBBPACにおいて問題の遺伝子を破壊するものである。第２修飾は、
短いアーム(10〜20kb)をつくるものである。第２修飾の理由は、ES細胞クローン
をスクリーニングする点で標的対立遺伝子と野生型対立遺伝子間の多型性を検出
するために短いアームに隣接する内在プローブ(KOプローブ)の使用を可能にする
ためである(図7;上記Gene Targeting，a practical approach)。
哺乳動物のBBPAC遺伝子ターゲッティング方法の好ましい形としては、負の選
択が含まれる。ヘルペスチミジンキナーゼカセット又はジフテリアトキシン遺伝
子カセットの使用のような従来の負の選択カセットは、トランスフェクトした哺
乳動物細胞にエピソームDNAとして長時間存在する傾向があるのでBBPAC構築物と
必ずしも作用しない[Bakerら，NAR 25:1950-1956]。一例として、EGFP1カセット
は負のスクリーニングカセットとして用いられる。この場合、短いアームをつく
る修飾の第２工程においては、CMVプロモーター誘導緑色蛍光タンパク質(EGFP-1
)及びポリAシグナルが導入される。他の負の選択カセットと異なり、GFPは細胞
に対して毒性でなく、蛍光マーカータンパク質として役立つ。遺伝子ターゲッテ
ィングが起こる場合、EGFP-1カセットは消失し、細胞はUV光下で緑色蛍光を呈す
る。一方、BBPACが非相同的に組込んでいる場合、EGFP-1カセットも組込んでい
るので細胞はUV下で緑色蛍光を呈する。最終的なサザンブロット分析については
、UV光下で緑色蛍光を呈しないneo耐性細胞系のみを選択する。
BBPACターゲッティング構築物により標的ES細胞をつくる方法は、次の工程
を除いて実質的には従来のプロトコール(上記Gene Targeting，A Practical App
roach)と同じである。まず、直線化無傷BBPAC核酸挿入断片(例として)を本明細
書に記載されるゲルろ過手順を用いて精製する。次に、直線化無傷BBPAC核酸挿
入断片によるES細胞のトランスフェクションを、例えば、担体としてプソラレン
不活性化アデノウイルスを用いてBaker[NAR，25:1950-1956(1997)]に記載されて
いるように行う。
本方法は、線状BBPAC DNAによる哺乳動物細胞におけるトランスフェクション
効率を従来のDNA構築物のトランスフェクション効率と同様であることを可能に
する。一方、BBPACターゲッティング構築物は、従来のターゲッティング構築物
より10〜100倍のターゲッティング頻度を潜在的に与えることができ、よって、
標的クローンを得るために単離及びスクリーニングするのに必要とするのはわず
か数ダースのコロニーであるのでマウスES細胞において遺伝子ターゲッティング
を行うことは容易かつ安価である。
本発明は、更に、BBPACターゲッティング構築物、又は好ましくはトランスジ
ェニックノックアウト動物(TKO)をつくるターゲッティング構築物を含む直線化
無傷BBPAC核酸挿入断片の注入により脊椎動物受精接合体において遺伝子ターゲ
ッティングを行う方法を提供する。大きなターゲッティング構築物(＞100kb)は
非常に高いターゲッティング率(上記の数理的モデリングにより予想される)を与
えることができ、遺伝子ターゲッティングは修飾したBBPACターゲッティング構
築物の前核注入により脊椎動物受精接合体で直接行なわれる。TKO方法は以前にB
rinsterら[PNAS，86:7087-91(1989)]によって小さなDNA構築物(2.6〜8.9kb)で試
みられたが、研究者らは相対的に低いターゲッティング率(0.2％)を得たに過ぎ
なかった。本発明のBBPAC(＞100kb)における大きな相同DNAは、ターゲッティン
グ率を2〜10％の好ましい範囲まで高める。
その実施態様においては、遺伝子ターゲッティング構築物の設計は、neo遺伝
子の代わりにIRES-GFPカセット又はIRES-lacZカセットが問題の遺伝子のエキソ
ンに融合して遺伝子を破壊する以外はES細胞ターゲッティング構築物に似ている
(図7)。上記のように、BBPAC修飾の２つの逐次工程は遺伝子ターゲッティング構
築物を含むBBPACをつくる工程に関係する。
修飾したBBPAC TKO構築物をミリグラム量で調製し、上記のように直線化する
。次いで、直線化DNAを標準プロトコール、例えば、前核注入により受精接合体
へ導入する(上記Hoganら，(1986))。次いで、トランスジェニック動物を標準サ
ザンブロットで同定する。遺伝子ターゲッティング因子は、更に、トランスジェ
ニック動物のDNAを適切な酵素、例えば、酵素Xで消化することにより同定され(
図7)、フランキングKOプローブでプローブされる(図7)。ターゲッティング因子
を含むマウスは、更に、適切なサイズのバンドをもつ。その遺伝子ターゲッティ
ング因子は、構築物が内在プロモーターをトラップするように設計されるので、
標的内在遺伝子の発現パターンのGFP又はlacZマーカー遺伝子の発現により確認
される。
TKO法は、脊椎動物遺伝学の分野において事態の重要な波及がある。ゼブラフ
ィッシュ、ラット及び他の哺乳動物のようなES細胞をもたない多くの生物におい
て遺伝子ターゲッティングを可能にする。これは、ヒト疾患の良好な動物モデル
(例えば、ラット及びサル)をつくること、又は臓器移植(例えば、ブタ又はヒヒ)
又は商業的理由(例えば、脂肪のほとんどない豚肉又は牛肉)に適した遺伝的標的
動物をつくることを援助する。本方法は、また、マウスにおける遺伝子ターゲッ
ティングにさえ更に利点がある。例えば、トランスジェニック動物はめったにキ
メラではないので、本方法は自動的に生殖系列伝達を得る。また、得られる129
株以外の株の標的マウスを可能にし、高価で時間を要する異系交配プロトコール
を回避する。
本発明の他の態様においては、BBPACターゲッティング構築物を用いた体細胞
における遺伝子ターゲッティングを行う方法が提供される。体細胞における遺伝
子ターゲッティングは相同性の長さに左右されるので、大きなDNAターゲッティ
ング構築物を用いると体細胞におけるターゲッティング率が向上する。この場合
の実験設計は、上記ES細胞と同様である。体細胞遺伝子ターゲッティングは、遺
伝子治療、例えば、造血系の遺伝病における機能遺伝子の標的挿入に有効である
。その方法は、実験のための標的細胞系をつくるのにも有効である。
RecA様タンパク質をコードしている条件的複製シャトルベクターは、本発明に
より提供される。RecA様タンパク質は、誘導プロモーターか又は構成的プロ
モーターによって制御される。条件的複製シャトルベクターは、好ましくは温度
感受性シャトルベクター(TSSV)である。その実施態様においては、TSSVはテトラ
サイクリン耐性を与える遺伝子とrecAであるRecA様タンパク質の双方を含む。好
適実施態様においては、TSSVはATCC No.97968をもつpSV1.RecAである。
本発明の方法によって修飾された問題の遺伝子を含む独立起原のクローニング
ベクターは、本発明に含まれる。更に詳しくは、その独立起原のクローニングベ
クターは、RecA-ホスト細胞において、RecA様タンパク質をコードしている条件
的複製シャトルベクターによる相同的組換えを受ける。好適実施態様においては
、独立起原のクローニングベクターは、RecA様タンパク質をコードしている温度
感受性シャトルベクターによりRecA-ホスト細胞において相同的組換えを受ける
。好適実施態様において、修飾した独立起原のクローニングベクターは、ATCC N
o.97968をもつ温度感受性シャトルベクターpSV1.RecAによる相同的組換えを受け
たBACである。
本発明は、本発明の具体例として示される下記の限定しない実施例によって更
によく理解される。下記の実施例は、本発明の好適実施態様を具体的に説明する
ために示される。しかしながら、本発明の範囲を制限するものとして解釈される
べきではない。
実施例 E ．coliにおける相同的組換えに基づく修飾及び131キロベースの細菌人工染色体 のトランスジェニックマウスにおける生殖系列伝達 はじめに
細菌の人工染色体、例えば、細菌人工染色体(BAC)やP-1由来人工染色体(PAC)
は、300kb程度の外来ゲノムDNAを増殖する環状細菌プラスミドである(Shizuyaら
，PNAS，89，8794-97，1992;Ioannouら，Nature Genet.，6，84-90，1994)。大
部分のBAC及びPACについては、問題の平均サイズは130〜150kbである。ゲノム機
能研究に細菌の人工染色体を用いることは酵母の系(即ち、YAC)と比べていくつ
かの利点がある。第１に、BAC及びPACライブラリーはクローニング効率が高いた
めに構築が非常に容易である。第２に、BAC及びPACを組換え不能E．coliホスト
細胞中で増殖するので、安定性が高く、キメリズムが最少である。
100世代の増殖後のBAC又はPACに再配列が認められなかった。第３に、BAC及びPA
C DNAがせん断に対して耐性がある超らせん環状プラスミドとして存在するので
非常に容易である。従来の細菌プラスミドDNA単離法は、ミリグラムの無傷BAC又
はPAC DNAを得るために用いられる。更に、直接DNAシークエンシングはBAC又はP
AC DNAに用いられ、YAC DNAには可能ではない。これらの利点は、BACやPACを多
くの種におけるゲノム研究の重要な手段にした。
BBPACはゲノム研究の物理的地図作成に有効であるが、YACに有効である簡便な
方法はBBPACを修飾するのに有効ではない。簡便な相同的組換えのBBPAC修飾法が
開示され、標的BBPAC修飾と呼ばれる(その方法の概略図については図７参照)。
本方法は、あるBBPACの範囲内の選択部位にマーカー挿入、欠失、点突然変異の
ような正確な修飾を可能にする。本方法は、いくつかの工程:cDNA又はゲノムDNA
プローブを用いたBBPACの単離、BBPACの簡便なマッピングと部分的シークエンシ
ング、シャトルベクターのクローニング、標的修飾、修飾したBBPACのパルスフ
ィールドゲル分析、及び最後に機能研究用直線化BBPAC DNAの調製、例えば、BBP
ACトランスジェニックマウスをつくる前核注入を必要とする。本方法は簡便かつ
信頼性があるので、cDNA又はゲノムDNAによるBBPACのスクリーニング工程からす
ぐに機能研究ができる修飾したBBPACの工程までの全断片操作が6〜8週内で終え
られることを予定することは合理的なことである。
本方法を用いて、IRES-LacZマーカー遺伝子をマウス亜鉛フィンガー遺伝子、R
U49を含む131kbの細菌人工染色体(BAC)へ導入した。修飾したBACに再配列又は欠
失は検出されない。更に、修飾したBACの前核注入によりトランスジェニックマ
ウスがつくられ、無傷BACの生殖系列伝達が得られた。従来のトランスジェニッ
ク構築物で得られなかった小脳にlacZ導入遺伝子の適切な発現が認められた。概
要としては、遺伝子発現及び遺伝子機能の生体内研究のためにBAC、PAC及びP1を
修飾する新規で効率のよい方法が開発された。
材料及び方法
1．BAC の単離及び最初のマッピング
(I) BAC単離(3〜4日間)
BACクローンをユニークなcDNAか又はゲノムDNAプローブで単離する。各種
のBACライブラリー(高密度BACコロニーDNA膜として)はリサーチジェネティクス
社及びゲノムリサーチ社から入手できる。リサーチジェネティクス製のマウス12
9ゲノムBACライブラリーは、ゲノムDNAの良好な供給源であることがわかった。
膜への損傷を避けるために、プローブをまずマウスゲノムサザンブロットで試験
してプローブが反復要素を含まないことを確かめる。ライブラリーを製造業者の
指示書に従ってスクリーニングする。正のクローンは、数日で会社から入手され
る。
(II) アルカリ性溶解法によるミディプレップBACDNAの調製(１日):
試薬:1．溶液I:50mMグルコース、25mMトリスHCl(pH8.0);10mM EDTA(pH8.0)
2．溶液II:0.2N NaOH、1％SDS(0.4g NaOH、45ml ddH20、5ml 10％SDS)
3．溶液IIi:5M KOAc(60ml)、氷酢酸(11.5ml)、H2O(28.5ml)
プロトコール:
1)．各BAC含有細菌を12.5μg/mlのクロラムフェニコールを含む50mlのLBに接種
する。37℃で一晩増殖させる。
2)．ファルコン管中の一夜培養物を3500RPM、4℃で20分間回転させる。上清を流
し出す。
3)．沈降物を1mlの冷溶液Ｉに懸濁させる。細胞混合物を15mlのポリブレン遠心
管へ移し、氷上に５分間置く。
4)．次に、2mlの新しい(調製後＜2週間)溶液IIを加える。数回激しく反転するこ
とにより十分に混合する。
5)．1mlの冷溶液IIIを直ちに加え、数回穏やかに反転することにより混合し、10
分間氷上に置く(この溶液を一晩放置する)。
6)．10,000rpm、4℃で12分間回転させる。上清を新しいポリブレン管に移す。
7)．4mlのフェノール(pH6.0)/クロロホルム(1:1)を加え、管を数回反転させるこ
とにより十分に混合する。10,000rpm、4℃で12分間回転させる。
8)．上層を新しい管に移し、それに8mlの100％エタノールを加える。管を数回激
しく反転させて十分に混合する。10,000rpm、4℃で30分間回転させる。-20℃で
一晩置いた後に遠心分離する。
9)．沈降物を70％エタノールで洗浄する。減圧下で乾燥し、DNAを200μl TEに懸
濁させる。BACミディプレップDNAは4℃で数ヵ月貯蔵される(反復凍結解凍は分解
を生じるので、BAC DNAを凍結させてはならない)。
(III) BACマキシプレップDNAの調製:
２つの方法を用いて多量の無RNA BACマキシプレップDNAを調製した。第１の方
法は、標準塩化セシウムバンド法である(上記Maniatis参照)。第２の方法は、市
販のカラム、ヌクレオボンドAX-500(The Nest Group製、マサチューセッツ州サ
ウスバラ)を用いる。マキシプレップDNAは4℃で長期貯蔵される。
(IV) パルスゲル電気泳動及びサザンブロットによるBACのマッピング(3〜5日間)
:
各BACのサイズを求めるためとBACが問題の遺伝子を含むことを確認するために
、BACの簡便なマッピングを行う。次の酵素:Not I(BAC挿入断片を遊離させる)、
Mlu I、NotI/Mlu I(二重消化)、PmeI、PmeI/NotI及びXhoIを用いて各BACをマッ
ピングする。消化を40μl全容量で行い、次の成分:5μlミニプレップDNA、4μl
消化緩衝液、4μl 10×BSA(必要な場合)、1μl 100mMスペルミジン(最終濃度2.5
mM)、2μl酵素(10〜40単位)、及びddH20を含む。37℃で＞5時間消化する。
消化したBACをパルスフィールドゲル(Bio-Rad CHEF-DRII)で分割する。ゲルは
0.5×TBE中1％アガロースである。ゲルを0.5×TBE中で行う。分離条件は、次の
条件:6v/cm、5〜15直線勾配、15℃で15〜18時間である。高分子量マーカーとし
てバイオラブのPFGEマーカー及び低分子量マーカーとして1kb DNAラダーを用い
る。
次に、ゲルを臭化エチジウム(10mg/ml原液の1〜5000、又は1〜10,000希釈液)
で30分間染色した後に写真をとった。次に、ゲルをニトロセルロース膜にブロッ
トし、cDNAとゲノムDNAプローブに対して標準プロトコール(上記Maniatis)に従
ってハイブリダイズする。全cDNAがBACに含まれることを確かめるために、遺伝
子の5’端と3’端双方からのプローブ又はオリゴヌクレオチドを用いてブロット
を別個にプローブする。通常は全遺伝子を含む大きなBACについてBAC修飾を選択
する。
2．組換えカセットによるシャトルベクターの構築
標的BAC修飾は相同的組換えに基づく方法であるので、BAC由来の相同配列が得
られなければならない。各々約500bpの２つの相同配列(即ち、A及びB、図7)は、
BAC修飾用シャトルベクターを構築するために必要とされるものの全てである。
相同配列は、ある修飾(即ち、挿入、欠失及び点突然変異)がBACのAとB間に導入
されるように選ばれる。AとBは、BACの直接シークエンシングにより得られる。
シークエンシングオリゴヌクレオチドは、cDNA配列に基づいて設計される。
(I) BACの直接シークエンシング(2〜3日間)
1）マキシプレップDNAを用いる場合には直接工程２へ進む。ミディプレップDNA
を用いる場合には、まず、100μlのddH20及び10μlの10mg/mlのRNAse Aを100μl
のミディプレップBAC DNAに加え、37℃で＞1時間インキュベートする。(本工程
は重要であり、不完全なRNAse処理により沈降及びシークエンシングが不十分に
なる)。
2）処理したDNAに132μlのPEG混合物(2.5M NaCl及び20％PEG 8000)を加える。氷
上に５分間置く。
3）4℃で15分間回転させる。上清を捨てる。2分間回転させる。PEG混合物を含む
残りの上清を完全に除去する。
4）沈降物を70％エタノールで洗浄する。スピードバク中で乾燥し、20μlのddH2
0に懸濁させる。
5）2μlをアガロースゲルにより行い最終濃度を定量する。通常は自動シークエ
ンシングに6〜8μl(500〜1000ng)を用い、150ngシークエンシングオリゴヌクレ
オチドを用いる。
各シークエンシング反応により、500bpまでの配列が得られる。配列を比較す
るためにあるプライマーについて１以上のBACをシークエンシングする。シーク
エンシングの主な目的は、シークエンシングオリゴ(通常は他のPCRプライマーで
ある)から約500bp離れている20bp PCRプライマーを設計することであり、このゲ
ノム断片のPCR増幅を可能にし、ビルディングベクターの中へクローン化する。
従って、適切な位置にありいくつかの独立したシークエンシング反応が同じ
である20bp配列が同定される限り、目標は達成される。間にあるDNA配列の性質
はあまり重要ではない。
(II) 標的BAC修飾に用いられるベクター:
BAC修飾用シャトルベクターを構築するために２ベクター系が設計される(図1)
。第１ベクターは、pBS.KSのビルディングベクターであり、相同配列Aと相同配
列Bを含む組換えカセット及びその間に導入される修飾を構築するために用いら
れる。組換えカセットは、次の理由のためにpSV1.RecAシャトルベクターに構築
されなかった。第１に、低コピープラスミドであるので、高品質DNAを得ること
が難しい;第２に、大きなプラスミド(11kb)であるので、相対的にクローン化が
難しい。ビルディングベクターは、BACに導入されるマーカー遺伝子を含み、そ
れに隣接している部位をクローン化する(通常は相同Aをクローン化するEcoRI及
び相同BのXbaI、及び修飾BACをマッピングするMluI、PmeI及びPacIのような稀有
制限部位)。2つのSal I部位(又は１つはSal I、１つはXhoI)は多重クローニング
部位を隣接している。組換えカセットを遊離し、pSV1.RecAベクターのSal I部位
へサブクローン化してシャトルベクターの構築を完成するために用いられる。ビ
ルディングベクターを設計することについてのことは、生物実験(例えば、前核
注入)用の修飾した線状BACを遊離するためにNotI部位が末端に用いられるので、
組換えカセット内にNot I部位があってはならいことである。種々のビルディン
グベクターとシャトルベクターの地図と用途を次に記載する。
(A) ビルディングベクター(pBV)全てpBS.KS(Stratagene)に基づく
pBV.IRES.LacZ.PA(図9)このベクターは、lacZマーカー遺伝子をある遺伝子の
コーティングエキソン又は3’UTRへ導入して遺伝子発現及び生体内遺伝子調節を
研究するために設計される。IRESは、内在翻訳開始コドンに依存しないマーカー
遺伝子の翻訳を可能にする。
pBV.EGFP1(図10)このベクターは、緑色蛍光タンパク質の明るい方をある遺伝
子のエキソンへ導入した後に内在ATGと内在遺伝子とをフレーム内で融合させる
ために設計される。緑色蛍光タンパク質は、生細胞及び生物中での遺伝子発現を
標識する。マーカー遺伝子はポリA付加配列を含まないので、内在ポリA配列
が用いられる。
pBV.IRES.EGFP1(図11)このベクターは、EGFP1遺伝子をある遺伝子のコーティ
ング領域又は3’UTRへ導入するために用いられ、その翻訳は内在翻訳フレームに
無関係である。
pBV.pGK.Neo.PA(図12)このベクターは、neo発現カセットをpgkプロモーター及
びポリA付加シグナルを有するneo遺伝子を含むBACへ導入するために設計される
。修飾BACは、ネオマイシン耐性を選択することにより安定なトランスフェクト
した細胞を得るために組織細胞の細胞系(即ち、ES細胞)へ導入される。このベク
ターは、修飾BACによる遺伝子ターゲッティングに特に有効である。neo遺伝子の
3’端に２つの同じpgkpA配列があるが、neo遺伝子の適切な発現を妨害しないこ
とに留意されたい。唯一の結果は、BAC修飾中にpgkPAの一方が相同的組換えのた
めに欠失されるということである。
(B) 温度感受性組換え誘導シャトルベクター(pSV1.RecA)(図8)
このプラスミドベクターをO'Connorら(Science，1989，Vol 244，pp.1307-131
2)によって最初に構築されたpMBO96ベクターから改良した。pMBO96ベクターは、
Dr．Michael O'Connorから寄贈されたものである。もとのベクターは、テトラサ
イクリン耐性をもち、pSC101温度感受性複製起点を含み、プラスミドを30℃で複
製するが43℃では複製を停止し消失する。E．coli RecA遺伝子をPCRで増幅し、B
amHI部位へサブクローン化してpSV1.RecAベクターを作成する。Sal I部位を用い
てビルディングベクターからの組換えカセットをサブクローン化する。
(III) ２つのPCR増幅BAC断片をビルディングベクターの中へクローン化する(6〜
8日間)
標的BAC修飾の第１工程は、従来のサブクローニングの２工程を含む、２つの
小ゲノム断片(A及びB)を適切なビルディングベクターの中へサブクローン化する
工程を必要とする。A及びB断片を設計する場合に下記の点に注意を払わなければ
ならない。
１．各断片は、＞500bpでなければならない(試みた最短は450bpであった)。PC
Rプライマーの端に適切な制限部位が設計されたPCR増幅断片は選択方法であ
る。しばしば、追加の制限部位が２つのPCRプライマーの一方に設計されてクロ
ーン化PCR断片の向きを決定する点で支持する。PCR増幅の相対的不正確さは、BA
C修飾効率に影響しないと思われる。
2．前述のように、A断片もB断片も内部XbaI、EcoRI及びSal I部位を含んではな
らない。これらの部位はサブクローニングに用いるからである。NotIを用いてBA
Cを直線化するのでNotI部位も含んではならない。
3．アームの向きは内在遺伝子座のように保存されなければならない。
(IV) ビルディングベクターからの組換えカセットをpSV1.RecAシャトルベクター
の中へサブクローン化する（4日間）
1．組換えカセットをシャトルベクターの中へクローン化する前に、通常は次の
平板:テトラサイクリン(10μg/ml)LB寒天平板及びテトラサイクリン(10μg/ml)
＋クロラムフェニコール(12.5μg/ml)LB寒天平板を調製する。標準プロトコール
[上記Sambrookら(1989)]に従って平板を調製する。
2．アルカリ性溶解法によりpSV1.RecA及びビルディングベクターミディプレップ
DNAを調製する(上記参照)。pSV1.RecAベクターについては、高純度DNAを得るた
めにキアジェンカラムを用いるが収率は通常は低い。これは、pSV1プラスミドの
コピー数が低いためである。pSV1.RecA DNAの調製については、培養物はLB＋テ
トラサイクリン(10μg/ml)中30℃で増殖しなければならない。最終ミディプレッ
プDNAを通常は200μlのTE又はddH2Oに溶解する。
3．2〜5μgのpSV1.RecA及びpBVをSal Iで消化する。pSV1.RecAについては、反応
を200μl容量で行う。
100μlのミディプレップDNA(2〜5μg)又は
20μlのキアジェンミディプレップのpSV1.RecA
20μlのH緩衝液(Boehringer Mannheim)
8μlのRnase(10mg/ml)(アルカリ性溶解プレップの場合)
10μlのSal I(20単位、Boehringer Mannheim)
62μlのddH2O
反応を37℃で＞6時間(通常は一晩)行ってから30単位以上のSal Iを加え、更に
1〜2時間消化を続ける。(場合によっては)少量の試料の消化(5μl)がゲル
上で行なわれて完全に達成したことを確認する。
4．(場合によっては)消化の終わりに、65℃で15分間加熱することによりSal Iを
不活性化する。
5．次に、20μlの10×脱リン酸緩衝液、4μl(1単位/μl)の仔ウシ腸アルカリホ
スファターゼ(Boehringer Mannheim)を加えることによりベクターを37℃で30分
間アルカリホスファターゼで処理する。次に、20μlの50mM EDTA(最終濃度5mMま
で)を加え、75℃で15分間加熱することにより酵素を不活性化する。
6．消化したpSV1ベクターとpBVを組換えカセットと1％低融点シープラークGTGア
ガロースにより75Vで8〜10時間行う。櫛状の歯をいくつか一緒にテープで巻いて
つくった大きなウェルでDNAを実験しなければならない。
7．11kbの直線化プラスミドバンドがpSV1.RecAのゲルに見えなければならない。
このバンドとゲルからの組換えカセット挿入断片を切断する。これらのDNA断片
をジーンクリーンスピンカラム(Bio 101，Inc.)を用いて製造業者の指示書に従
って精製する。精製したDNAの少量をゲル上で行ってDNA濃度を定量する。
8．連結反応:各連結反応を＞50ng pSV1.ベクター、100〜200ng挿入断片、2μl10
×連結緩衝液(Boehringer-Mannheim)、２μl 10mMATP、１μlリガーゼ(Boehring
er-Mannheim)及びddH20を含む20μlの全容量で行う。連結反応を16℃で一晩行う
。
9．DH5a成分をpSV1ベクターで形質転換する。連結反応の半量(10μl)を100μlの
冷化学誘導DH5aコンピテント細胞に加えることにより形質転換に用いる。氷上で
15分間インキュベートしてから37℃で２分間熱ショック処理し、管に1mlLBを加
え、30℃で30分間振盪する。次に、細胞を6000×gで４分間遠心分離し、沈降物
を100μl LBに再懸濁し、Tet(10μg/ml)LB寒天平板に塗沫する。平板を30℃で＞
15時間インキュベートする。
11．コロニーを選び、標準プロトコールに従ってコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行い[上記Sambrookら(1989)]、相同アーム(A又はB)又はマーカー遺伝子のよ
うなpBV1由来の断片でプローブする。更に、正のクローンを制限消化、必要な場
合にはサザンブロットにより分析する。
3．細菌における標的BAC相同的組換え
(I) 装置
細菌インキュベーター:30℃か又は43℃に設定。
シェーカー:30℃か又は43℃に設定。
(II) 試薬及び平板
標的修飾実験の前に下記の試薬と平板を調製しなければならない。平板は全て
１ヵ月までの間4℃に貯蔵される。種々の抗生物質耐性平板の詳細な調製方法はM
aniatisに見られる。
1．テトラサイクリン貯蔵液(1000×):50％エタノール中10mg/ml、アルミニウム
ホイルでラップし、-20℃に１ヵ月までの間貯蔵される。
2．クロラムフェニコール貯蔵液(1000×):12.5mg/ml、エタノールに溶解(＞50％
)、-20℃に貯蔵される。
3．テトラサイクリン平板(tet平板):10μg/mlテトラサイクリンを含むLB寒天平
板。4℃に貯蔵しアルミニウムホイルでラップして遮光する。
4．クロラムフェニコール平板(Chl平板):LB平板は12.5μg/mlクロラムフェニコ
ールを含む。
5．テトラサイクリン＋クロラムフェニコール平板:LB平板は10μg/mlのテトラサ
イクリン及び12.5μg/mlのクロラムフェニコールを含む。
6．フザリン酸＋クロラムフェニコールTB平板(FA＋Chl平板):次のように調製す
る。
まず、トリプトンブイヨン寒天、又はTB寒天をつくる。
上記TBをオートクレーブにかける。また、500mlの1M NaH2PO4・H2Oをオートク
レーブにかける。オートクレーブにかけた後、TB寒天が約60℃に下がるまで待っ
てから下記の成分を加える。
平板に注ぎ、平板を外で一晩放置してから4℃で貯蔵する。遮光は必要ない。
(III) コンピテントなBAC含有細菌をつくる(1日):
化学的方法を用いてBAC含有細菌ホストからコンピテント細胞を調製する(Inou
eら，Gene 96,p23-28,1990)。
(1) 培養液及び平板:
LB＋アンピシリン(50μg/ml)寒天平板;
TB培養液(10mM Pipes、55mM MnCl2、15mM CaCl2及び250mM KCl)、MnCl2を除く全
ての成分を混合し、pHをKOHで6.7に調整する。次に、MnCl2を溶解し、その溶液
を0.45uフィルターユニットでろ過することにより滅菌し、4℃で貯蔵した。塩を
全て固形分として加えた。
(2) BAC含有DH10Bの凍結貯蔵液を金属ループで取り、3mlのLB＋クロラムフェニ
コール(12.5μg/ml)へ接種した。培養物を激しく振盪しながら37℃で一晩増殖し
た。
(3) 0.5mlの一夜培養物を取り、50mlのLB＋クロラムフェニコール(12.5μg/ml)
に加え、600nmの光学濃度が約0.6に達するまで激しく振盪しながら37℃で増殖す
る。
(4) フラスコを氷上で10分置く。次に、50mlのファルコン管に移し、3000rpm、4
℃で10分間遠心分離する。
(5) 上消を流す。沈降物を16mlの氷冷TBに再懸濁する。氷上で10分間インキュベ
ートしてから上記のように回転させる。
(6) 細胞沈降物を7％DMSOで補足した4mlのTBに穏やかに再懸濁した。氷上で10分
間インキュベートしてから0.5mlのアリコートに分配し、液体窒素に浸す
ことにより直ちに凍結する。用時使用のために管を-80℃に貯蔵する。
(IV) レプリコン複合体の形成及びサザンブロット分析による同定(4日間):
1．10μlのミディプレップDNA及び200μlのBAC含有コンピテント細胞を用いてコ
ンピテントBAC細胞をTsシャトルベクターで形質転換する。パートIIの(IV)のよ
うに形質転換を行う。1/10の形質転換細胞をTet＋Chl平板上に播種し、30℃で一
晩増殖させる。
2．レプリコン複合体をつくるために、単コロニー(合計で６まで)を滅菌金属ル
ープで取り、各々を1mlのLBに希釈する。回転させて細菌をLBに分散する。
100μl LB＋細菌を２つのTet＋Chl平板上に播種する。一方を43℃のインキュベ
ーターでインキュベートし、もう一方を30℃で一晩インキュベートする。
3．厚い菌叢の細菌を30℃にインキユベートした平板上で増殖する。43℃にイン
キュベートした平板については、わずかに数十個の個別のコロニーが非常に小さ
いサテライトコロニーのぼんやりしたバックグラウンドの上に増殖する。20のお
おきなコロニーを取り、各コロニーをtet(10μg/ml)とクロラムフェニコール(12
.5μg/ml)で補足した2mlのLBへ接種し、同じコロニーをtet＋Chl平板に画線する
。ミニ培養物を43℃で激しく撹拌しながら一晩増殖させる。マスタープレートを
43℃のインキュベーターで一晩インキュベートし、用時使用のために4℃に貯蔵
する。
4．標準アルカリ性溶解法を用いて1.5mlのミニ培養液からミニプレップDNAをつ
くる。DNAを30μlのTEに溶解し、制限酵素分析に5〜10μlのDNAを用いる。
5．適切な酵素で制限消化し、レプリコン複合体をサザンブロットにより分析す
る。500bp相同性(＞10％)でさえレプリコン複合体形成の効率が高いために、通
常は一方の相同部位(Aか又はB)上のレプリコン複合体形成のみ分析する。例えば
、A側のレプリコン複合体形成を分析するために、プローブとして断片Aを用い、
A側でのレプリコン形成を検出する酵素(例えば、EcoRI)でBAC DNAを消化させる
。標準サザンブロットを行いレプリコン複合体が現れる。対照として、もとのBA
C及びシャトルベクターがこの分析に含まれなければならない。サザンブロット
プローブとして相同アームを用いる理由は、レプリコン複合体BACの適切なサイ
ズの２つのバンドに対してハイブリダイズするということである。対照と
して、もとのBACとシャトルベクターがこの分析に含まれなければならない。
(V) 分割及び正しい分割BACのサザンブロット分析(6日間):
1．レプリコン複合体が同定されると、43℃で増殖したTet＋Chl平板からのレプ
リコン複合体の精製した単コロニーを取り、クロラムフェニコール平板(12.5μg
/ml)に画線して単コロニーを増殖させる。
2．Chl平板を43℃で一晩インキュベートし、細菌を分割し、温度感受性pSV1プラ
スミドを消失するので、tet耐性遺伝子を消失する。
3．分割BACのtet感受性を選択するために、Chl平板からの8〜16の単コロニーを
取り、フザリン酸＋クロラムフェニコール平板に画線する(各平板上に2〜8の別
個のコロニーが画線される)。FA＋Chl平板の抗生物質の有効性を試験するために
２つの対照か行なわれる。1つはTet耐性コロニー(Tet＋Chl平板からの)を画線す
るものであり、２つ目はtet感受性コロニー(もとのBACを生育している平板から
の)である。行なわれる他の対照はChl平板だけ(フザリン酸を含まない)のレプリ
コン複合体コロニーを画線するものである。
4．FA＋Chl平板を37℃で2〜3日間インキュベートする。フザリン酸が存在するた
めに分割したコロニーの増殖が非常にゆっくりであるので長時間のインキュベー
ションが必要である。Tet含有コロニーは48時間でさえ増殖するはずがない。従
って、Chl平板よりChl＋フザリン酸平板上の方がコロニーが少ないはずである。
これらのコロニーは分割したコロニーである。
5．A）正しいBACを同定するために２つの代替的方法か用いられる。AとB双方の
相同がほぼ同じ長さである場合には、10〜20コロニーだけ取り、アルカリ性溶解
でミニプレップDNAを調製し、サザンブロットを行いターゲッティング因子を分
析する。約半量の分割BACが正しい標的マーカー遺伝子を含まなければならない
。B）2つの相同アームが同じ長さでない(差が＞500bp)場合には、正しい分割BAC
を選択するためにコロニーハイブリダイゼーションを用いなければならない。FA
＋Chl平板から50〜100の個別コロニーを取り、Chl平板とTet＋Chl平板上にフザ
リン酸選択の対照として画線する。各平板は50の試験コロニーとChl平板からの
レプリコン複合体である２つの正の対照コロニーを収容することができる。Chl
平板上では量の多いコロニーが増殖するはずであり、Tet＋Chlでは正
のレプリコン複合体対照以外は全く増殖しない。工程４のtet感受性の選択は非
常に緊縮性であり実質的にバックグラウンドがない。従って、FA＋Chl平板上で
増殖するコロニーは全て分割コロニーを含むことがわかった。コロニーハイブリ
ダイゼーションを標準プロトコール[上記Sambrookら，（1989)]に従って行い分
割されかつ標的修飾が生じたコロニーを選択する。コロニーハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、lacZ、Neo、GFP又はポリA配列のようなアームのない組換えカ
セットの一部でなければならない。
6．ミディプレップDNAは、上記のようにアルカリ性溶解法により正のクローンに
調製される。両側の相同(A及びB)についてターゲッティング因子を確認するため
に制限消化及びサザンブロットが行なわれる。
7．パルスフィールド分析は、修飾因子を確認するために及び修飾BACに再配列が
あるかを求めるために行なわれなければならない。BAC挿入断片(Research Genet
ics)に隣接する２つのNot I部位があるので、Not Iによる消化は修飾BACのサイ
ズを表さなければならない。一般的にはMluI、Pad及びPmeI部位が組換えカセッ
トに含まれる。これらの酵素による消化は、ターゲッティング因子を確認する。
これらの酵素とNot Iによる二重消化は、BACの組換えカセットの組込み部位を求
めるために援助する。断片サイズの分布が広いので、XhoIは通常は修飾BACをフ
ィンガープリントするために用いられる。もとのBACと修飾BACのXho消化パター
ンを比較すると修飾BACの全体の再配列がわかる。BamHIやAvrIIのような他の酵
素もこのために用いられる。標的BAC修飾は、望まない再配列をBACへ導入しない
ことがわかった。PFGEブロットに対してハイブリダイズするために用いられたプ
ローブとしては、挿入断片の特定のプローブ(s.a．lacZ、ポリA、GFP及びNeo)及
び全BACプローブ(BACからの消化したバンド全てを示す)が含まれる。修飾BACが
特定の標的修飾因子をもち再配列がないことが確認されると、これらのBACは生
物実験、例えば、トランスジェニックマウスをつくること又は細胞をトランスフ
ェクトすることにすぐに用いることができる。
4．前核注入用の多量、高品質直線化BAC DNAの調製
(I) マキシプレップBAC DNAの調製(1日):
上記BACの項の単離及び最初のマッピングを参照されたい。
(II) 前核注入用の無傷直線化BAC DNAを調整する(1日):
1．下記の成分を含む全容量500μlの50μgセシウムバンドのBACマキシプレップD
NAを消化する。
50μg DNA
50μl 10X NotI緩衝液又は緩衝液3(NEB)
50μl 10XBSA
12.5μl 100mMスペルミジン(最終濃度2.5mM)
25μl(250単位)NotI(NEB)
ddH20全量500μlに
37℃で＞10時間、消化を行う。
2．CL4bカラムの調製(室温で行なわれる):
5mlのブラスチックピペットを用い、吹いて先端に綿を入れ、ピペットをスタ
ンドにクランプする。CL4bセファロース(Pharmacia)を十分に振盪し、そのセフ
ァロースをプラスチックピペットに徐々に加える。充填したセファロースがほと
んど上になるまで加える(予備の約1mlの余地がある)。カラムを決して乾かさな
い。
3．カラムの準備ができると、10mlの注射器を用いてカラムの上部にレザバーを
設置する(緩衝液をこのレサバーに加える)。カラムを30mlの注入緩衝液(10mMト
リスHCl、pH7.5、0.1mM EDTA及び100mM No.Cl)で平衡化する。これは約2〜3時間
かかる。
4．ここで5μlの10×DNA色素を0.5mlの消化BACDNAに加える。リザバーを取出し
、DNA(＋色素)をカラムの上部にパスツールピペットで穏やかに加える。DNA＋色
素がカラムの中へ行くまで待ち、カラムの上部に0.5mlの注入緩衝液を穏やかに
加える。
5．注入緩衝液がほとんど入ると、その中の10mlの注入緩衝液をレザバーに戻す
。ここで0.5mlの画分を24ウェルプレートに集め始める。一般的には約12画分を
集める(又は青色色素がほとんどカラムの底部になるまで)。
6．50μlの各画分をパルスフィールドゲルで実験して適切な画分を同定する。臭
化エチジウム染色後にバンドが見えなければならない。サザンブロットを行っ
て収量が最高で分解が最低の画分を選択する。
7．精製したDNAを4℃で貯蔵する。数週間安定である(例えば、3週間後に分解が
検出されなかった)。
結果
BACは、生体内遺伝子発現の調節を研究する手段として有効である。具体的な
例においては、BACはマウス脳特異的亜鉛フィンガー遺伝子、RU49が含まれる[Ya
ngら，Development 122:555(1996)]。RU49は、原位置ハイブリダイゼーションに
よりマウス小脳、歯状回及び脳の嗅球の顆粒細胞集団で発現されることがわかっ
た。しかしながら、lacZマーカー遺伝子の適切な発現は、トランスジェニックマ
ウスにおける10kb RU49プロモーター-lacZ構築物を含む小脳では得られなかった
。例えば、10株の中から１株だけが小脳で部分的発現を示した。この問題を克服
するために、IRES-lacZマーカー遺伝子をRU49を含むBACへ挿入する相同的組換え
の方法が開発された。無傷修飾BACのトランスジェニックマウス及び小脳内でのl
acZ導入遺伝子の適切な発現の生殖系列伝達を証明する。
E．coli中でBACを修飾するために、相同的組換えに温度感受性シャトルベクタ
ーが用いられた[O'Connorら，Science 244:1307-1312(1989);Hamiltonら，J．Ba
cteriol．171:4617(1989)]。この温度感受性プラスミドは、許容温度(30℃)で増
殖する細胞中で複製するが、複製起点が制限温度で機能することができないこと
から制限温度(42〜44℃)で増殖する細胞中で消失する[Hashimoto-Gotohら，J．B
acteriol．131:405-412(1977)]。組換え不能のBACホスト、即ち、RecA-ホスト細
胞を克服するために、recA遺伝子が温度感受性シャトルベクターへ導入された。
温度感受性シャトルベクター(recA遺伝子を含む組換えカセットを有する)で形質
転換した場合、ホスト株は相同的組換えを行う条件的コンピテントになり、常在
BACの生体内修飾を可能にする。
標的BAC修飾の一般戦略を図１に示し、マーカー遺伝子、例えば、IRES-lacZ-p
GKポリA(ILPA)をBACへ挿入することに関係する工程を示す。まず、2つの小ゲノ
ム断片、例えば、各々が500塩基対より大きい問題の遺伝子を含むA及びBを、ビ
ルディングベクター(pBV1)の中へ適切な順序と向きでクローン化して組換えカッ
セットを作成する。次に、組換えカセットを温度感受性シャトルベクター
(例えば、pSV1.RecA)へ移入する。組換えカセットがシャトルベクター内に直接
組込まれない理由は、低コピー数[Bochnerら，J．Bacteriol．143:926(1980);Ma
loyら，Bacteriol．145:1110(1981)]及びベクターサイズが大きいためにDNAを操
作する点で相対的に難しいことによる。
次いで、本シャトルベクターは、BACを含むE．coliへ形質転換される。形質転
換細胞は、テトラサイクリン耐性(pSV1.RecAがもつ)及びクロラムフェニコール(
BACがもつ)によって30℃で選択される。シャトルベクターはrecA遺伝子を有する
ので、相同的組換えはA又はBのいずれかの相同によってシャトルベクターとBAC
間で生じレプリコン複合体を形成する。レプリコン複合体は、テトラサイクリン
とクロラムフェニコール平板上43℃で増殖することにより選択される。この温度
は、シャトルベクター複製に対して非許容的であるので、組込まれない遊離シャ
トルベクターを消失し、組込まれたシャトルベクター(BACか又は細菌染色体へ)
を有する細菌を選択することになる。正しいBACレプリコン複合体がサザンブロ
ット分析により同定される。
次いで、レプリコン複合体をクロラムフェニコール平板上に再画線し、43℃で
一晩増殖させる。レプリコン複合体の画分は、A又はBのいずれかの相同によって
第２組換え因子(分割)を受ける。切除したシャトルベクタープラスミドは非許容
温度で複製することができないので、分割したBACはtet及びrecA遺伝子を自動的
に消失する。フザリン酸平板上で増殖するとテトラサイクリン耐性の消失が選択
されるので、即ち、テトラサイクリンに耐性のあるBACを逆選択するので、分割
したBACはクロラムフェニコール及びフザリン酸平板上37℃で増殖することによ
り選択される。図１に示されるように、対の相同断片が第２組換え因子を受ける
ことに依存して、分割したBACはもとのBACか又は正確に修飾したBACである。所
望のクローンは、挿入したマーカーの標識プローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーションにより同定される。本方法の重要な態様は、recA遺伝子が細菌ホス
トへ一時的にのみ導人されることである。修飾が終了すると、細菌はrecA遺伝子
を自動的に消失し、修飾したBACを安定に維持するのに適した組換え不能状態に
戻る。
BACの標的修飾と呼ばれるこの戦略は、IRES-lacZ-ポリA(ILPA)マーカーを
RU49遺伝子座を含む131kbマウスBAC169へ導入することにより試験した(図2A)。
この場合、RU49の第１コーティングエキソンに対するマーカー遺伝子が標的であ
り、相同断片は各々1kbと1.6kbである(図2B)。IRES配列をlacZ遺伝子の前に置く
とlacZ遺伝子が翻訳開始部位後に置かれる場合でさえマーカー遺伝子の翻訳を行
わせる[Pelletierら，Nature 334:320(1988)]。組換えカセットを含むpSV1.RecA
温度感受性シャトルベクターをBAC169を含むDH10E．coli株へ形質転換し、クロ
ラムフェニコールとテトラサイクリンを含む平板上30℃か又は43℃で増殖するこ
とにより選択した。厚い菌叢の形質転換細胞を生じる30℃での増殖と対照的に、
43℃での増殖により個々のコロニーの増殖が得られた。これらを20取り、シャト
ルプラスミドのBAC169へのレプリコン複合体形成をサザンブロットにより試験し
た。図3Bに示されるように、RU49相同カセットのB1断片を用いた20コロニーの分
析により、約4〜8kbEcoRIバンド(10％)を含む２つのクローンの同定が得られ、
これらのクローンがこの相同領域によって生じたレプリコン複合体をもつことが
示された。
次いで、細胞をまずクロラムフェニコール平板上43℃で、次にクロラムフェニ
コール及びフザリン酸平板上37℃で増殖することによりレプリコン複合体を上記
のように分割する。フザリン酸は、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む細菌に対
して強力な逆選択を与える。実際に、これらの平板から取った200コロニーは全
てtet感受性であり、選択の緊縮性を示す。クロラムフェニコール平板上で増殖
する重複コロニーをpgkポリAプローブとのコロニーハイブリダイゼーションに用
いた。200コロニーの中の８コロニーが＋であった(4％)。プローブとしてA1か又
はB1を用いたサザンブロット分析からこれらのクローンが全て正しい分割BACを
含むことがわかった(図3C及び図3D)。3種のBAC(レーン4、5及び8)は野生型バン
ドを含み、他のクローンからの混入か又は２種類の異なる相同領域によって分割
した２コピーのレプリコン複合体を含むBACを表すものである。
我々の分析の次の工程は、予想されない欠失又は挿入が修飾操作中に生じるか
を求める修飾BACの徹底的なマッピングであった。図４は、修飾BAC L1及びL2及
びもとのBAC169のパルスフィールドゲルマッピングを示す写真である。同じフィ
ルターを、挿入マーカー遺伝子(pgkポリA)からのプローブとRU49(A2)の5’
非修飾領域からのプローブ(A2)と共に全BAC169プローブで別々にプローブした。
BAC169プローブ(左パネル)は、各BACの制限断片全てとハイブリダイズする。従
って、XhoI消化により修飾BACのフィンガープリントが示され、実質的に断片全
てが保存されることがわかった。7kb RU49断片を4kbマーカー遺伝子(図2B)で置
換するためにILPA挿入断片を含む断片が対応する野生型断片よりわずかに小さい
という差だけである。BAC全挿入断片を遊離するNotIによる消化は、同じ理由で
修飾BACではわずかに小さいDNA挿入断片を示す。マーカー遺伝子が更にPmeI部位
(図2)をもつように操作されたので、BAC L1とL2 DNAをこの酵素で消化するとも
とのBAC169に見られる単一断片と対照的に２断片が生じることになる。断片のサ
イズにより、これらのBACが約75kb 5'→PmeI部位、及び53kb3'→PmeI部位を含む
ことが求められる。修飾操作中に明らかな再配列は生じなかった。
この結論を確認するために、修飾BAC及びBAC169を、マーカー特異的プローブ(
pgkポリA)及びプロモーター領域近傍プローブと修飾領域の外のプローブ(A2)の
双方でプローブした。一貫して、両修飾BACはBAC169に存在しないマーカー遺伝
子プローブと相同である単一バンドを含んでいた。A2プローブを用いた場合、予
想されたサイズの単一バンドが３種類の全てに見られた。更に、8種の修飾BAC全
部をHindIII、EcoRI及びAvrII消化物でフィンガープリントするとBAC内に検出で
きる再配列又は欠失が存在しないことがわかった。従って、recA遺伝子をBACホ
スト株へ一時的に導入すると再配列又は欠失が導入されない。
標的BAC修飾の再現性及び信頼性を試験するために、IRES-lacZ配列をpgk-neo
配列で置き換えることによりBAC L1を修飾した。この場合には、各々約500bpの
相同断片を用いた。修飾BACが効率よく得られ、再配列又は欠失をもたないこと
がわかった。従って、標的BAC修飾は、BACに望まない変化を導入せずにBACを正
確に修飾する簡便な方法である。
遺伝子発現及び遺伝子機能の生体内研究のために修飾BACを用いるという可能
性を証明するために、IRES-LacZ挿入により修飾したBAC169を有するトランスジ
ェニックマウスがつくられた。前核注入用128kb BAC挿入断片を精製するため
に、大きなYAC DNAを精製するいくつかの確立した方法が試みられ、相当量のDNA
断片化が得られた。対照的に、SEPHAROSE CL-4Bを充填した簡便なゲルろ過カラ
ムが試みられた場合、無傷線状BAC DNA挿入断片の非常に純粋な画分が適切な注
入緩衝液、例えば、100mM NaCl、10mMトリスHCl、pH7.5及び0.1mM EDTA中で得ら
れた(図5A)。典型的には低DNA収量を生じるYAC DNA精製と異なり、SEPHAROSE CL
-4Bカラムを用いた精製画分は多量の高濃度線状DNA(例えば、0.5mlの3μg/mlDNA
以上)を含有した。精製DNAは、臭化エチジウム染色後に紫外線により直接目視さ
れた。SEPHAROSE CL-4Bカラムは、分解したDNA(この場合には画分3〜6)を純粋な
線状DNA(画分7〜9)から効率よく分離することができた(図5A)。画分８は3μg/ml
DNAを含有し、直接前核注入に用いた。
受精C57BL/6マウス接合体への前核注入を、標準プロトコールに従って行なう[
Hoganら,Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s，ニューヨーク，1986)]。2種類の異なる濃度の画分８BAC DNA(上記のように得
られた):3μg/ml及び0.6μg/mlを用いた。高濃度DNAで新生仔は得られず、高濃
度が接合体に毒性であることが示された。しかしながら、低濃度の純粋な線状DN
Aにより、15匹の新生マウスが得られ、そのうちの２匹(１３％)、Y7及びY9がサ
ザンブロットにより示されるlacZマーカー遺伝子を含有した(図5B)。バンドの強
さは、Y7の2〜3のトランスジェニックコピー及びY９の１コピーの定量を可能に
する。
無傷BACがゲノムに組込まれたかを求めるために、BACの両端の存在についてト
ランスジェニックマウスを分析した。BAC両端がベクター配列を含むので、べク
ター配列に特異的なPCRプライマーを作成し、トランスジェニックDNAを増幅する
ために用いた。次に、増幅した産物を増幅した領域内の第３標識オリゴヌクレオ
チドプローブでプローブした。図5C及び図5Dに示されたように、Y3、Y7及びY9は
両端が存在するが、負の対照は存在しない。Y7及びY9はlacZ遺伝子ももっている
ので、無傷BAC導入遺伝子を含むと思われる。Y3については、両端をもつがlacZ
遺伝子を含まない。これは、組込む前の注入中の再配列か又は断片化によるもの
である。
Y7トランスジェニックマウスは、B6/CBAマウスと交配した後に生殖系列伝達
を生じた。合計８匹の子である２匹の同腹仔においては、３匹がlacZ導入遺伝子
を有した(図5E)。分析から更に導入遺伝子が50を超えるY7の子孫にメンデル分配
で伝達されることが示された。
次に、Y7トランスジェニックマウスの小脳でのlacZ遺伝子の発現を全組織標本
lacZ染色により求めた。RU49は通常は小脳の顆粒細胞、歯状回及び嗅球(脳室下
帯、吻側遊走流、及び固有の嗅球を含む)で発現する[Yangら，Development，122
:555-566(1996)]。以前の研究では、10kbプロモーターを含むRU49プロモーターl
acZトランスジェニックマウスが作成された。しかしながら、トランスジェニッ
ク系の全てが強力な位置効果を示した。脳では全く発現せず、皮質では異所的に
発現したが小脳では発現しなかった。具体的な10kb-lacZトランスジェニック系
は、小脳で制限された発現を示したが、発現は小脳の尾側半分に制限された。生
後６日のY7系におけるlacZ遺伝子を取囲んでいる128kbのRU49内在配列において
は、トランスジェニックマウスは内在発現パターンに極めて似ているlacZ発現パ
ターンを示した(図6)。小脳においては、マーカー遺伝子は小脳全体で発現し(図
6A)、5匹の対照同腹仔には発現が見られない(図6B)。分析から更に導入遺伝子が
EGL中高レベルで及びIGL中低レベルで発現する。lacZマーカー遺伝子は歯状回及
び吻側遊走流及び嗅球でも発現する(図6C及び6D)。BAC導入遺伝子のパターンは
、脳内での内在RU49発現パターンに極めて似ている。BAC導入遺伝子の大きなゲ
ノムDNAが位置効果を克服し、従来のトランスジェニック構築物を用いた我々の
結果と対照的に生体内RU49の適切な発現を与えることは明らかである。
本明細書に教示されたように、細菌の人工染色体(BACやPAC)は、遺伝子ターゲ
ッティング用の大きなDNAを構築するのに理想的である。標的BAC修飾法について
本明細書に示されたように、BACやPACは選択遺伝子、マーカー遺伝子、及び欠失
を導入するために容易に修飾される。BBPAC遺伝子ターゲッティング構築物をつ
くるには従来のターゲッティング構築物をつくるのとほぼ同じ時間がかかる(1〜
3ヵ月)。更に、BBPACターゲッティング構築物DNAは、ミリグラム量かつ高品質で
容易に単離される。これは、多量の高品質YAC DNAを精製することが困難である
のでYAC系より有利である。
本発明は、本明細書に記載される個々の実施態様によって範囲が制限されない
。実際に、本明細書に記載されたもののほかに本発明の種々の変更が上記説明及
び添付の図面から当業者に明らかである。そのような変更は、後記請求の範囲の
範囲内に包含されるものである。
核酸又はポリペプチドに示された全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び
全ての分子量又は分子質量値はおよそであり、説明のために示されることは理解
されるべきである。
種々の文献が本明細書に引用され、それらの記載は本願明細書に含まれるもの
とする。
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フロントページの続き
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(72)発明者 ヤン シアンドン ダブリュー
アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021
ニューヨーク ヨーク アベニュー
1230 ボックス 339