DE3931841A1 - Dopamin-d2-rezeptor - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Dopamin-D2-Rezeptor, DNAs, die diesen Rezeptor kodieren, sowie die Verwendung dieses Rezeptors bzw. der DNAs zum Screenen von Substanzen auf deren Fähigkeit, den Dopamin-D2-Rezeptor zu beeinflussen.

Dopamin-D2-Rezeptoren spielen bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen - wie Parkinson-Syndroma und Schizophrenie - eine bedeutende Rolle, da sie den Zielort für Wirkstoffe gegen diese Krankheiten darstellen. Es war bislang nicht möglich, gezielt Wirkstoffe gegen diese Erkrankungen zu suchen, weil die Dopamin-D2-Rezeptoren bislang nicht in auch nur annähernd reiner Form vorlagen und daher auch ihre Struktur nicht bekannt war. Es war daher keine gezielte Suche nach Wirkstoffen gegen diese Krankheiten möglich.

Es wurde nun ein Polypeptid gefunden und in reiner Form erhalten, welches einen Dopamin-D2-Rezeptor darstellt.

Gegenstand der Erfindung sind ein gegebenenfalls glykosyliertes Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion, Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhältliche Polypeptide mit Dopamin-D2-Rezeptor-Aktivität.

Gegenstand der Erfindung sind weiter DNAs, die für die oben genannten Polypeptide kodieren, Wirtsorganismen, die diese DNAs enthalten, sowie die Verwendung dieser Polypeptide und DNAs zum Auffinden von Substanzen, die den Dopamin-D2-Rezeptor beeinflussen.

Die neuen Polypeptide und DNAs lassen sich gentechnisch nach bekannten Methoden herstellen. So kann man aus menschlicher Hypophyse mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Nach Einsetzen dieser cDNA in einen kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor z.B. gt 10 wird eine cDNA-Bibliothek angelegt. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in Maniatis et al., "Molecular Cloning", CSH Press, (1982), nachzulesen. Auch das Screening solcher Genbanken mit radioaktiv markierten DNA-Sonden ist inzwischen eine vielfach verwendete und beschriebene Methode. Nach diesem Verfahren kann ein cDNA-Klon, der Homo­ logie zur DNA-Sonde besitzt, isoliert und charakterisiert werden. Dieses Verfahren ist in "DNA cloning" Vol. I, IRL Press, 1985, beschrieben.

Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktionsenzymen leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adaptoren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein kodierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Genfragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvektoren, z. B. die handelsüblichen Plasmide M13mp18 oder Bluescript, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfragmente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontrollregionen versehen werden, die die Expression der Proteine ermöglichen.

Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorganismen mit den so erhaltenen Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend beschrieben (M. Wigler et al., Cell 16 (1979), 777 bis 785; F. L. Graham and A. J. van der Eb, Virology 52 (1973), 456 bis 467). Auch können die Hybridplasmide mit entsprechenden Signalsequenzen versehen werden, die die Sekretion der Polypeptide ins Medium erlauben.

Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die Dopamin-D2-Rezeptor-cDNA unter die Kontrolle des Maus-Metallothionein- oder des viralen SV40-Promotors oder unter die Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139 bis 144). Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons und der Leader-/Prosequenz des Gens für den Dopamin-D2-Rezeptor. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vorteilhaft sind Integration und Expression des Fremdgens in einen Vektor, der den Promotor des Cytomegalievirus enthält.

Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor derart transfizieren, daß die transiente Expression der so eingebrachten DNA für eine pharmakologische Charakterisierung der exprimierten heterologen Polypeptide ausreicht.

In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Replikation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz kodieren, ist der Aufbau von "shuttle"-Vektoren möglich. Konstruktionen und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bakterienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryontenzellen, z. B. in die menschliche Nieren-Zellinie 293.

Auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe und andere Pilze, Insektenzellen sowie tierische und humane Zellen wie z. B. CHO-, COS und L-Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Expressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwendet werden.

Diese eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Produkte posttrans­ lational zu modifizieren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können durch geeignete Detergenzien solubilisiert werden und durch geeignete Affinitätschromatographie nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen-Strukturanalyse oder anderen geeigneten physikalischen Verfahren, dazu benutzt werden, die räumliche Struktur der Liganden-Bindungsstelle aufzuklären.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es aber auch möglich, andere DNA-Sequenzen, z. B. chemisch synthetisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expression des humanen Dopamin-D2-Rezeptors zu benutzen.

Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu identifizieren und zu charakterisieren, die an den humanen Dopamin-D2-Rezeptor binden und dort agonistisch oder antagonistisch wirken. Eine Möglichkeit, diese Wirkung zu untersuchen und zu quantifizieren, besteht in der Bestimmung des cAMP-Spiegels vor und nach Liganden-Bindungen. Eine andere Möglichkeit stellt die Messung des Stromflusses durch die Zellmembran dar.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen näher beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Maniatis et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, oder "DNA cloning", Vol T bis TTT, TRT Press 1985 bis 1987, Herausgeber D.M. Glover, hingewiesen.

Beispiel 1 Isolierung eines cDNA Klones für den humanen Dopamin-D2-Rezeptor

0,5 g menschliche Hypophyse (Autopsiematerial) wurden in 6 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5% Sarcosyl im ULTRA-TURRAX ® aufgeschlossen. Grobe Zelltrümmer wurden bei 3000 rpm abzentrifugiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation durch ein 5,7-M-CsCl-Kissen über Nacht bei 45 000 rpm abgetrennt. Anschließend wurde die PolyA⁺-enthaltende RNA-Fraktion durch Affinitätschromatographie an oligo (dT)-Cellulose abgetrennt.

Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (AMV) und oligo (dT)12-18 als Starter wurde die polyA⁺-RNA in einzelsträngige cDNA umgeschrieben. Die Synthese des zweiten Stranges erfolgte mit E.coli DNA-Polymerase. An die doppelsträngige cDNA wurde mit Hilfe des Enzyms T4 DNA-Ligase ein EcoRI-Adaptor mit folgender Sequenz angesetzt: 5′AATTCCATGG ATGCATGC 3′. Der kommerziell erhältliche Phagenvektor gt 10 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Beide DNAs wurden miteinander ligiert und mit kommerziell erhältlichem Verpackungsextrakt zu infektiösen Phagen verpackt. Die rekombinanten Phagen wurden mit E.coli C 600 Hfl auf NZYDT-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die so erhaltene cDNA-Bibliothek enthielt 2×10⁶ unabhängige Klone. Nach Amplifikation der cDNA-Bibliothek entsprechend herkömmlicher Methoden wurden ca. 10⁶ Phagen mit C 600 Hfl Zellen ausplattiert. Die Phagen wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, mit 0,5 N NaOH/1,5 M NaCl lysiert und die denaturierte DNA durch 2-stündiges Backen bei 80°C fest an das Filter gebunden. Die Filter wurden in 6×SET-Puffer (1×SET=0,15 M NaCl, 15 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA), 0,1% SDS und 5×Denhardt's Lösung (100×Denhardt = 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA pro 50 ml) für 4 h, bei 68°C vorhybridisiert. Mit Hilfe eines DNA-Synthesizers wurde eine Oligonukleotid-Sonde, die 45 Basen umfaßt, hergestellt. Sie besteht aus folgender Sequenz:
5′ ATGGATCCAC TGAACCTGTC CTGGTACGAT CTGGAGAGGC AGACC 3′.

Diese Sonde wurde am 5′-Ende mit 32p-ATP markiert. Sie wurde dann mit den vorhybridisierten Filtern in einer Lösung, die 6×SET, 0,1% SDS, 30% Formamid, 5×Denhardt′s und 10% Dextransulfat enthielt, über Nacht bei 42°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Filter wurden danach mehrfach in 6×SET/0,1% SDS bei 42°C gewaschen, angetrocknet und einem Röntgen­ film expondiert. Klone, die beim Screening eine radioaktive Antwort gaben, wurden isoliert und weitergezüchtet. Ein Klon, im folgenden hD₂R genannt, enthielt ein etwa 2,2 kb großes Insert, das die kodierende Region sowie 5′- und 3′-nicht-kodierende Bereiche enthält. Phagen-DNA von hD₂R wurde durch Inkubation der gereinigten Phagen mit Proteinase K (ad 60 µg/ml) bei 55°C für 1 h und anschließender Phenol/Chloroformextraktion präpariert. Nach Zugabe von 3 Volumen Ethanol (-20°C) fiel die Phagen-DNA aus und wurde mit einer sterilen Injektionsnadel in 70%iges Ethanol überführt, gewaschen und kurz sedimentiert. Nach kurzem Trocknen des Pellets an der Luft wurde es in TE-Puffer suspendiert.

Beispiel 2 Herstellung von einzelsträngiger DNA, die für den humanen Dopamin-D2-Rezeptor kodiert

Ausgangspunkt war der in Beispiel 1 beschriebene Phagenklon hD₂R. Er wurde präparativ mit dem Restriktionsenzym Eco RI geschnitten. Das Eco- RI-Fragment, das die den D2-Rezeptor kodierende DNA-Sequenz enthielt, wurde elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. 30 ng dieses Fragments wurden bei 4°C 12 h mit 100 ng des mit Eco RI geschnittenen, kommerziell erhältlichen Klonierungsvektors M13mp18 oder M13mp19 ligiert. Das Volumen des Ligationsansatzes betrug 10 µl. Die Ligation wurde durch 5 min Erhitzen auf 80°C beendet. 1/10 Volumen dieses Ligationsansatzes wurde zur Transformation von 100 µl kompetenten SR 101 Zellen eingesetzt. Nach Beendigung der Transformation wurden dem Transformationsansatz 60 µl 0,2 M IPTG-Lösung und 120 µl XGal (20 mg/ml) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde in NZYDT-Topagar auf NZYDT-Agarplatten mit 200 µl SR 101 Zellen (OD₆₀₀= 1) ausplattiert. Das Medium NZYDT ist kommerziell erhältlich (GTBCO-BRL). Klone, die die D2-Rezeptor-cDNA enthielten, konnten aufgrund fehlender Blaufärbung der Plaques identifiziert werden. Sie wurden als mp hD₂R bezeichnet. Mittels DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463) wurde die DNA-Sequenz der den D2-Rezeptor kodierenden cDNA aufgeklärt.

Beispiel 3 Transiente Expression des klonierten Rezeptorgens in 293 Zellen

Wenn nicht besonders beschrieben sind die Methoden zur Zellkultur in "Zell- und Gewebekultur" von Lindl und Bauer (Gustav Fischer Verlag) nachzulesen.

293 Zellen wurden unter Standard-Bedingungen in einer 10-cm-Zellkultur­ schale bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8×10⁶ Zellen kultiviert. Nach Trypsinierung wurden die Zellen 1 : 3 in MEM Medium (Gibco 041 bis 1090 M), das 2,2 g/l NaHCO₃ enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausgesät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kultiviert.

Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 µg der DNA-Lösung (1 mg/ml), gereinigt über CsCl-Grandient, wurden mit 437 µl H₂O versetzt, danach wurden 62,5 µl 2 M CaCl₂ zugesetzt und schließlich 500 µl BBS. Diese Reihenfolge ist streng zu beachten. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipitate.

Die Lösung wurde auf eine 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vorsichtiger Durch­ mischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in einem 3% CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfernung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml serumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollmedium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5% CO₂-Inkubator konnten die Zellen für pharmakologische und elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.

Beispiel 4 Rezeptor-Bindungstest

Den nach Beispiel 4 transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale heruntergewaschen. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1200 g 10 min lang zentri­ fugiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurden die Zellen zur Membranpräparation verwendet.

Nach Resuspendierung des Zellpellets in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 wurden die Zellen mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX ® homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 50 000 g in einem Sorvall SS 34 Rotor bei 4°C 20 min zentrifugiert. Das Membranpellet wurde in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,2 aufgenommen und erneut mit Hilfe eines ULTRA-TURRAX ® homogenisiert. Nach Zentrifugation wie oben wurde das Pellet in 3,5 ml BB (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl) aufgenommen. Nach kurzer Homogenisierung mit einem Gewebe-Homogenisator konnten die Membranen in dem eigentlichen Bindungstest eingesetzt werden.

800 µl dieser so hergestellten Membranen wurden bei 4°C mit [³H] Spiperon (Endkonzentration 2 nM) und verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanz für 2 h inkubiert. Danach wurden die Membranen über Glasfaser­ filter (Schleicher + Schuell No. 34) filtriert, um das nicht-gebundene radioaktive markierte Spiperon abzutrennen. Die Menge an gebundenen Spiperon wurde im Flüssigkeits-Szintillationszähler bestimmt.

Beispiel 5 Bestimmung des cAMP-Spiegels

Ca. 5×10⁵ nach Beispiel 3 transfizierten 293 Zellen wurden unmittelbar nach der Transfektion 48 h in 1 ml serumfreiem Medium, welches 25 mM HEPES pH 7,2 enthielt, vorinkubiert. 10 min vor der Stimulation der exprimierten Rezeptoren mit Dopamin wurden 50 µl IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin, Sigma) zugesetzt. Die Endkonzentration von IBMX betrug 100 µM. IBMX inhibiert die cAMP-abhängige Phosphodiesterase. Unmittelbar vor der Stimulation der cAMP Synthese mit Forskolin wurde den Zellen Dopamin (Endkonzentration 10 µM) zugesetzt.

Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 200 µM eiskalter 3,9 M Perchlorsäure gestoppt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand mit 0,2 M Na-Acetat pH 6,0 äquilibriert. An eine Acetylierung mit Triethylamin und Acetanhydrid schloß sich eine 12 h Inkubation bei 4°C in Anwesenheit von 5000 cpm (125) -Succinyl-cAMP-Tyrosin-Methylester, anti-cAMP Antikörper in 0,1 M Na-Acetat pH 6,0 und 0,08% g-Globulin an. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Antikörper mit 16% PEG gefällt und die präzipitierte Radioaktivität im Gamma-Counter bestimmt.

Formelübersicht

Formel I

Claims (9)

1. Ein gegebenenfalls glykosyliertes Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Aminosäuresequenz sowie dessen durch Deletion, Substitution, Insertion, Inversion, Addition oder Austausch von Aminosäuren erhältliche Polypeptide mit Dopamin-D2-Rezeptor Aktivität.

2. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 kodieren.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält, welche funktionell mit einer Expressions-Kontroll­ sequenz verbunden ist, die die Expression in geeigneten Wirtssystemen ermöglicht.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressions-Kontrollsequenz ein in E.coli wirksames Promoter­ system, ein Promotersystem eines E.coli Bakteriophagen, eine Hefe Expressions-Kontrollsequenz oder eine andere eukaryontische Expressions-Kontrollsequenz ist.

6. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 enthält.

7. Wirtsorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bakterium, ein Pilz, eine tierische oder eine menschliche Zelle ist.

8. Gentechnisches Verfahren zur Herstellung des Polypeptides gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem geeigneten Wirtsorganismus DNA-Sequenzen zur Expression bringt, die für die Peptidsequenz nach Anspruch 1 kodiert.

9. Verwendung des nach Beispiel 8 hergestellten Polypeptids oder eines Wirtsorganismus nach Anspruch 7 zum Screening von Substanzen auf deren Fähigkeit, sich an den Dopamin-D2-Rezeptor zu binden.