DE102004010928A1

DE102004010928A1 - Protein zur Bindung prokaryonter DNA sowie Verfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA

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Publication number: DE102004010928A1
Application number: DE200410010928
Authority: DE
Inventors: Karl-Hermann Dr.Rer.Nat.Habil. Schmidt; Eberhard Prof. Dr. Med. Straube; Stefan Dr. med. Rußwurm; Hans-Peter Dr. Deigner; Svea Sachse
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2024-03-06
Also published as: DE102004010928B4

Abstract

Beschrieben wird ein Protein, das nicht methylierte CpG-Motive bindet, wobei es eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei die Bindungsstelle für nicht methylierte CpG-Motive erhalten ist. Des weiteren betrifft die Anmeldung ein Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonter DNA mit den Schritten a) Kontaktieren mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryonten DNA mit einem erfindungsgemäßen Protein, wodurch ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird, und b) Separation des Komplexes.

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein, das nicht methylierte Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide (CpG-Motive) einer DNA bindet, eine dafür kodierende Nukleinsäure, ein Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonter DNA bzw. zur Abreicherung dieser DNA aus physiologischen Flüssigkeiten sowie einen Kit zur Durchführung der Verfahren.
Durch Bakterien verursachte Infektionen sind eine der häufigsten Ursachen für Entzündungskrankheiten. Zur Prognose des Krankheitsverlaufes sowie insbesondere zur rechtzeitigen Auswahl geeigneter therapeutischer Maßnahmen ist der frühzeitige Nachweis der bakteriellen Erreger von entscheidender Bedeutung.

Zum Nachweis bakterieller Erreger werden auch heute noch hauptsächlich verschiedene kulturabhängige Methoden angewendet. Eine Vielzahl von Nachteilen dieser Methoden führten dazu, daß gerade in der letzten Dekade parallel zur stürmischen technologischen Entwicklung der Molekularbiologie verstärkt nach Alternativen gesucht wurde. Erste Berichte zum Einsatz kulturunabhängiger Nachweisverfahren bakterieller Erreger, welche auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion beruhen, stammen vom Anfang der 90er Jahre. So konnten beispielsweise Miller und Kollegen (Miller N J Clin Microbiol. 1994 Feb; 32(2): 393–7) zeigen, dass kulturunabhängige Verfahren den klassischen Kultivierungs- und Mikroskopietechniken beim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis überlegen sind. In letzter Zeit haben aber weitere molekularbiologische Methoden, die auf dem Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren basieren, an Bedeutung gewonnen (z.B: M. Grijalva et al. Heart 89 (2003) 263–268; Uyttendaele M et al. Lett Appl Microbiol. 2003; 37(5): 386–91; Saukkoriipi A et al. Mol Diagn. 2003 Mar; 7(1): 9–15; Tzanakaki G et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39(1): 31–6;).

Neben der hohen Spezifität solcher molekularbiologischer Methoden ist der geringe Zeitbedarf als wesentlicher Vorteil gegenüber konventionellen kulturabhängigen Methoden zu nennen. Allerdings ist die Sensitivität des Nachweises prokaryonter DNA direkt aus Körperflüssigkeiten und nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial im Vergleich zur Kultur der Mikroorganismen bislang viel zu gering. Eine für den direkten Erregernachweis aus nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial ausreichende Menge an Nukleinsäuren von Bakterien wird allenfalls im Bereich der 16S-rRNA-Analyse mittels PCR der 16S Region auf dem bakteriellen Chromosom und der anschließenden Sequenzanalyse des PCR Fragments erreicht, da sich meist mehrere Kopien für den die 16S-rRNA kodierenden Abschnitt auf dem Chromosom befinden. Der direkte spezifische Erregernachweis mittels 16S-rRNA-Analyse setzt voraus, dass sich nur eine Erreger-Spezies in der zu untersuchenden Probe befindet. Befinden sich verschiedene Erreger-Spezies in der Probe, ist ein spezifischer Nachweis über Sequenzierung der 16S-rRNA-Region nicht möglich, da die verwendeten Primer universell für die meisten Bakterien sind. Ferner müssen sich die nachzuweisenden Bakterien in der metabolischen Phase befinden und genügend 16S-rRNA exprimieren.

Davon ist insbesondere bei Patienten, die unter einer kalkulierten antibiotischen Therapie stehen, in der Regel nicht auszugehen. Darüber hinaus kommen bestimmte Pathogenitätsfaktoren von Bakterien nicht zu jeder Zeit zur Expression, obwohl die entsprechenden Gene im bakteriellen Genom vorhanden sind. Im Ergebnis werden dem klinisch tätigen Arzt falsch negative Befunde übermittelt. Dadurch kann eine gezielte antibiotische Therapie entweder gar nicht oder viel zu spät eingeleitet werden. Der Arzt ist in solchen Fällen auf sein Erfahrungswissen und auf allgemeine Richtlinien (wie z.B. der Paul-Ehrlich-Gesellschaft) angewiesen und wird daher viel zu allgemein antibiotisch behandeln. Der nicht zielgenaue Einsatz von Antibiotika birgt eine Reihe von Risiken nicht nur für den einzelnen Patienten (wie z.B. unnötige Nebenwirkungen in Form von Nierenschäden etc.), sondern auch für die gesamte Gesellschaft (z.B. die Entwicklung zusätzlicher Antibiotikaresistenzen wie MRSA (multiresistente Staphylococcus aureus, etc.). Deshalb bietet der Nachweis der klinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren und Resistenzen von Bakterien auf chromosomaler und Plasmid-Ebene, also letztendlich auf DNA-Ebene, für die Diagnose vieler Infektionserkrankungen, aber auch der Sepsis, erhebliche Vorteile. Dies gilt umso mehr, da auf dieser Ebene auch eine Unterscheidung zwischen pathogenen und kommensalen Bakterien getroffen werden kann.

Am häufigsten erfolgt der erregerspezifische Nukleinsäurenachweis durch Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT), wie beispielsweise die Vervielfältigung der prokaryonten DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. der Ligase-Kettenreaktion (LCR). Der hohen Spezifität und schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse stehen die Störanfälligkeit durch Kontaminationen oder durch stark inhibierende Faktoren in klinischen Proben gegenüber.

Bei einem herkömmlichen PCR-Nachweisverfahren muß für eine erfolgreiche Detektion von Erregern im Blut mindestens 1 Target-DNA des Erregers in 10 μl Blut vorhanden sein. Das entspricht ca. 100 Targets in 1 ml Blut bzw. 1000 Targets in 10 ml Blut.

Anders verhält es sich mit der Blutkultur zum Nachweis von Erregern einer Infektion. Hier liegt die untere Nachweisgrenze bei etwa 3–5 Bakterien pro 10 ml.

Diese Nachweisgrenze wird derzeit mit PCR-Verfahren noch nicht erreicht, auch nicht mit solchen die ihre Zielsequenz im Bereich der 16S-rRNA Region auf dem Chromosom haben. Obwohl mehrere die 16S-rRNA kodierende Regionen auf dem bakteriellen Chromosom lokalisiert sind, meist 3 bis 6, bleibt die Voraussetzung, daß sich mindestens ein Molekül der Template-DNA im PCR-Reaktionsgemisch befindet. Eine verbesserte diagnostische Sicherheit ist von PCR-Verfahren zu erwarten, deren spezifische Zielsequenzen für speziesspezifische Proteine kodieren, entweder im Chromosom oder auf Plasmiden der Mikroorganismen. Auch hier trifft das Obengesagte zur Nachweisgrenze zu. Gerade unter dem Einfluß einer laufenden Antibiotikatherapie kann das Wachstum der Erreger stark verlangsamt oder eingeschränkt sein, auch wenn das eingesetzte Antibiotikum letztlich nicht wirksam ist. Diese Situation ist gerade bei solchen Patienten häufig anzutreffen, die bereits unter Antibiotikatherapie stehen und bei denen aus diesem Grund keine krankheitsverursachenden Bakterien aus den Blutkulturen oder anderen Proben (wie z.B. Trachealabstrichen, bronchoalveolären Lavagen (BAL) etc.) angezüchtet werden können.

Wegen unzureichender Sensitivität hat der erregerspezifische Nukleinsäurennachweis ohne Amplifikationsschritt durch direkten Nachweis der prokaryonten DNA (Sondentechnik, FISH-Technik) nur bei ausreichend hoher Keimzahl im Untersuchungsmaterial diagnostische Bedeutung.

Die wesentliche Problematik des Nachweises prokaryonter DNA zur Identifikation bakterieller Erreger in Körperflüssigkeiten bestehen neben PCR-hemmenden Bestandteilen im Untersuchungsmaterial vor allem im Überschuß von eukaryonter gegenüber prokaryonter DNA. Hierbei sind insbesondere kompetitive Prozesse bei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an prokaryonter DNA als hinderlich für einen qualitativen und quantitativen Erregernachweis anzusehen.

Die üblichen Methoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeit an, so daß das Verhältnis Wirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1:10^–6 und 1:10^–8 betragen kann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweises mikrobieller DNA in Körperflüssigkeiten gut nachzuvollziehen.

Es wäre also wünschenswert, die prokaryonte DNA von eukaryonter DNA trennen und insbesondere gegenüber letzterer auch anreichern zu können.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die die Trennung und/oder Anreicherung prokaryonter DNA aus Untersuchungsproben mit hohem Anteil eukaryonter DNA, insbesondere von Patienten mit Infektionen, ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird dies durch ein Protein erreicht, das nicht methylierte CpG-Motive bindet, wobei es eine 25%ige bis 35%ige, insbesondere etwa 27,6%ige, Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist, wobei die Bindungsstelle für nicht methylierte CpG-Motive im erfindungsgemäßen Protein enthalten ist, und es gegenüber dem Wildtyp-Protein verkürzt ist, vorzugsweise bis maximal zur Länge der Bindungsstelle für nicht methylierte CpG-Motive. Dies bedeutet, daß es nur maximal soweit verkürzt ist, daß die Bindungsstelle für nicht methyliert CpG-Motive erhalten bleibt.

Als Wildtyp-CGPB-Protein (oder CPGbP656) wird im folgenden das humane CGPB-Protein (vgl. Voo et al., Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20(6): 2108–21.) bezeichnet. Das erfindungsgemäße Protein wird im folgenden als CPGbP181 bezeichnet. Das in EP 02020904 beschriebene Protein, das eine verkürzte Variante des Wildtyp-CGPB-Proteins ist und als Grundlage für das erfindungsgemäße Protein diente, wird im folgenden mit CPGbP241 bezeichnet.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, wobei

1 die Aminosäuresequenz von CPGbP181 (fett dargestellt) verglichen mit dem Wildtyp-CGPB-Protein (CPGbP656) und dem CPGbP241 (kursiv dargestellt) zeigt;

2 die DNA-Sequenz und Übersetzung in die Aminosäuresequenz des kompletten CPG-bindenden Proteins CPGbP656 zeigt, wobei die verkürzten CPG-bindenden Peptide CPGbP241 (fett) und CPGbP181 (kursiv) dargestellt sind;

3 eine PCR von Streptokokken-DNA in Humanblut darstellt;

4 eine nested PCR mit den PCR-Produkten aus dem Primär-PCR-Ansatz von 3 als Template zeigt;

5 ein Gelretardierungsexperiment darstellt;

6 ein weiteres Gelretardierungsexperiment wiedergibt;

7 die Elution von Kalbsthymus-DNA und pUC18emm an rCpG-181-Sepharose zeigt, und

8 die Darstellung der Bestimmung der eluierten DNA in den Fraktionen durch Messung der Extinktion bei 254 nm in Abhängigkeit des NaCl-Gradienten ist.

Das Wildtyp-CGPB-Protein CPGbP656 bindet nicht methylierte CpG-Motive prokaryonter DNA, wobei ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird. Dieser kann z.B. auf einem Träger gebunden sein oder werden, wodurch eine Trennung und/oder Anreicherung der DNA erfolgen kann. Die vorliegende Erfindung basiert nun auf der überraschenden Erkenntnis, das ein im Vergleich zum Wildtyp-CGPB-Protein (CPGbP656 mit 656 Aminosäuren) erfindungsgemäßes Protein, insbesondere CPGbP181 mit 181 Aminosäuren, das eine 27,6%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist, eine verbesserte Bindungseigenschaft gegenüber nicht methylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA als das Wildtyp-CGPB-Protein und Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie besitzt.

Prokaryonte DNA unterscheidet sich von eukaryonter DNA beispielsweise durch das Vorkommen nicht methylierter CpG-Motive (Deutsches Ärzteblatt, Jg. 98/15: A981-A985 (2001)). Die Erfindung basiert auf der Kenntnis, daß sich eukaryonte DNA und prokaryonte DNA durch ihren Anteil an CpG-Motiven unterscheiden. In der prokaryonten DNA befinden sich CpG-Motive in einem 20-fachen Überschuß im Vergleich zu eukaryonter DNA, die solche Motive nur übergangsweise enthält, z.B. in Krebszellen oder Promotorregionen ((Deutsches Ärzteblatt, Jg. 98/15: A981-A985 (2001)). In prokaryonter DNA sind diese Motive nicht methyliert, wohingegen sie in eukaryonter DNA zum größten Teil methyliert sind, was die Unterschiedlichkeit nochmals erhöht. Nicht methylierte CpG-Motive sind nicht methylierte Deoxycytidylat-Deoxyguanylat-Dinucleotide innerhalb des prokaryonten Genoms oder innerhalb von Fragmenten desselben.

Des weiteren basiert die Erfindung auf der Kenntnis, daß das erfindungsgemäße Protein spezifisch an nicht methylierte CpG-Motive bindet. Diese spezifische Bindungseigenschaft des erfindungsgemäßen Proteins wird genutzt, um prokaryonte DNA zu binden und dadurch nachfolgend aus einer Probe z.B. mit überwiegendem Anteil eukaryonter DNA anzureichern, zu trennen und zu isolieren.

Der Begriff „Homologie" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet den Grad der Übereinstimmung von zwei Protein-Sequenzen. Dabei bedeutet x%ige Homologie, daß x von 100 Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Der Ausdruck „verkürzt" wie er zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Proteins verwendet wird, bedeutet, daß die Länge der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins (CPGbP181) kürzer als die Länge der Aminosäuresequenz des Wildtyp-CGPB-Proteins (CPGbP656) ist. Die Verkürzung erfolgt am N-terminalen und am C-terminalen Ende der Wildtyp-Proteinsequenz (1). Die größte Verkürzung stellt dabei die DNA-Bindestelle des Proteins dar. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Protein gegenüber dem Wildtyp-Protein auf maximal die DNA-Bindungsstelle verkürzt ist.

Das erfindungsgemäße Protein kann vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 19959 Dalton (nativ) bzw. 21444 Dalton (im Plasmid pQE60) aufweisen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Proteins etwa 10,09 (natives Protein) bzw. 10,15 (im Plasmid pQE60). Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Protein besitzt die in SEQ ID No. 2 bzw. 1 dargestellte Aminosäuresequenz. Dieses hat besonders gute Bindungseigenschaften gegenüber nicht methylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA.

Das in EP 02020904 beschriebene Protein (CPGbP241), das eine verkürzte Variante des Wildtyp-CGPB-Proteins (CPGbP656) ist und als Grundlage für das erfindungsgemäße Protein (CPGbP181) diente, hat eine Länge von 241 Aminosäuren, ein Molekulargewicht von etwa 33650 Dalton (nativ) bzw. 28138 Dalton (im Plasmid pQE60) und einen isoelektrischen Punkt von 9,89 (nativ) bzw. 9,88 (im Plasmid pQE60). Die cDNA- und Aminosäuresequenz ist in 1 und 2 gezeigt.

Das Wildtyp-CGBP-Protein hat eine Länge von 656 Aminosäuren, 135 positiv und 94 negativ geladene Reste, ein Molekulargewicht von etwa 75684 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von 8,15. Die cDNA- und Aminosäuresequenz ist in 1 gezeigt.

Der Sequenzvergleich des erfindungsgemäßen Proteins (CPGbP181) gemäß SEQ ID No. 2 mit dem in EP 02020904 beschriebenen Protein (CPGbP241) ist in 1 und 2 dargestellt.

Das erfindungsgemäße Protein wird bevorzugt durch Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenz in ein Plasmid und Expression in Escherichia coli hergestellt. Ein das erfindungsgemäße Protein exprimierender E.coli-Stamm wurde am 16. Februar 2004 unter der Nr. DSM 16229 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt. Alternativ können andere, dem Fachmann vertraute Verfahren zur Herstellung angewendet werden. Die Nutzung des Plasmids pQE9 stellt dabei eine beispielhafte Möglichkeit dar, aber jedes andere geeignete Plasmid ist als Vektor einsetzbar. Die Expression in E. coli stellt ebenfalls nur ein Beispiel dar. Eine Expression in anderen prokaryonten System als auch in einem eukaryonten System als auch die chemische oder enzymatische Synthese oder die Aufreinigung aus einer genetisch veränderter Tabakpflanze sind weitere mögliche Ausführungsformen der Proteingewinnung. Das Protein kann sowohl im Labormaßstab (z.B. im Erlenmeyerkolben) als auch im industriellen Maßstab (z.B. Fermenter) hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Protein kann z.B. mittels Bindung von an den Anfang oder das Ende des Proteins eingebrachten Histidin-Reste (His-tag) an eine geeignete nickelhaltige Matrix gereinigt werden, eine Methode, die dem Fachmann bekannt ist.

Weitere Möglichkeiten der Reinigung können jegliche Art von Fusionsproteinen sein, die eine Aufreinigung über geeignete Matrices (Säulen, Gele, Beads etc.) erlauben. Andere Formen von tag's können Fusionspeptide/-proteine, z.B. Streptavidin-tag, Myc-tag und andere sein.

Eine bevorzugte Form des erfindungsgemäßen Proteins ist die native Form, aber auch eine denaturierte Form ist zur Bindung nicht methylierter CpG-Motive geeignet. Unter „denaturierten Formen" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden andere Sekundärstrukturen als die in der Natur vorkommenden verstanden.

Die native oder auch denaturierte Form des erfindungsgemäßen Proteins stellt eine beispielhafte Ausführungsform dar. Die Erfindung schließt die in vitro-Synthese sowie alle weiteren chemischen oder enzymatischen Modifikation des Proteins ein, wie z.B. Einbau von Disulfidbrücken, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustausche sowie Fusion mit Proteinen oder anderen Molekülen ein. Solche Modifikationen können z.B. durch Rekombination und/oder Expression und/oder chemische und/oder enzymatische Modifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzielt werden.

Das erfindungsgemäße Protein weist eine Vielzahl von Vorteilen auf. Es kann, besser als das Wildtyp-CGPB-Protein oder Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie, prokaryonte DNA über nicht methylierte CpG-Motive binden. Dadurch wird es möglich, aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA die prokaryonte DNA spezifisch abzutrennen und/oder anzureichern. Dies ermöglicht letztendlich einen schnellen und einfachen Erregernachweis sowie eine frühzeitige Diagnose von Infektionen, die durch bakterielle Erreger verursacht sein können. Vice versa kann die Erfindung auch zur Abreicherung mikrobieller DNA im Sinne einer Reinigung bei klinischen Zuständen angewandt werden, die mit einem unphysiologischen Vorkommen von Bakterien oder deren Spaltprodukten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, von Patienten einhergehen. Dies gilt umso mehr, da gut belegt ist, daß Bakterien aber auch deren Spaltprodukte, wie beispielsweise bakterielle DNA, für eine Vielzahl den Patienten schädigenden biologischen Effekte verantwortlich sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine gerichtet sind. Dabei kann es sich um mono- oder polyklonale Antikörper handeln. Sie können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wozu der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt.

Die Antikörper können zur Isolierung und Quantifizierung der erfindungsgemäßen Proteine verwendet werden. Auch hierbei handelt es sich um an sich bekannte Einsatzmöglichkeiten, für die der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner Nukleinsäure, insbesondere DNA, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert. Eine solche DNA ist die in SEQ ID No. 1 (oder 2) dargestellte.

Aufgrund der guten Bindungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Proteins an nicht methylierte CpG-Motive prokaryonter DNA ist weiterhin Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonter DNA mit den Schritten

a) Kontaktieren mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryonten DNA mit dem erfindungsgemäßen Protein, wodurch ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird, und
b) Separation des Komplexes.

Diese kann aufgereinigt und wieder in Lösung gebracht sein oder direkt in der Ursprungsquelle (z. B. Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Trachealaspirat, Urin, bronchalveoläre Lavage, Nasenabstrich, Hautabstrich, Punktionsflüssigkeit) vorliegen.

Die Separation kann mittels verschiedener Verfahren zur Trennung, Isolierung oder Anreicherung von DNA-Protein-Komplexen oder DNA-Polypeptid-Komplexe erfolgen, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Dabei werden bevorzugt Methoden angewendet, bei denen das DNA-bindende Protein an einen Träger immobilisiert ist oder wird, um die DNA aus der Probelösung zu trennen und/oder anzureichern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform schließt sich an die Separation ein Schritt zur Abtrennung der DNA vom erfindungsgemäßen Protein aus dem Komplex an. Dies kann beispielsweise durch herkömmliche Verfahren zur DNA-Aufreinigung erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Im einfachsten Falle beruht die Abtrennung auf der Änderung des pH-Wertes oder der Salzkonzentration (z. B. auf 1 M NaCl) des Mediums/Puffers oder der Zufügung chaotroper Reagenzien, etc; also geeignete Parameter, die zur Auflösung des Protein-DNA-Komplexes führen. Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Protein an einen Träger gebunden. Diese Ausführungsform stellt eine besonders einfache Möglichkeit der Anreicherung prokaryonter DNA dar, da die Separation aus der Lösung besonders einfach, beispielsweise durch physikalischer Entfernung (z.B. Abzentrifugation) des oder der beladenen Träger aus der Lösung, erfolgen kann.

Für die Lösung für die prokaryonte DNA kommt grundsätzlich jedes geeignete Lösungsmittel in Frage. Besonders zweckmäßig ist das Verfahren jedoch zur Anreicherung prokaryonter DNA aus Lösungen, die verschiedene biomolekulare Spezies, insbesondere verschieden Arten von DNA, enthalten. Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter oder viraler DNA aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA. Dabei wird beispielsweise die in Körperflüssigkeiten befindliche prokaryonte DNA durch spezifische Bindung an das erfindungsgemäße Protein von der eukaryonten DNA getrennt und angereichert. Die so angereicherte prokaryonte DNA erleichtert den Nachweis prokaryonter Erreger mit Hilfe molekularbiologischer Methoden und kann zur Diagnose von Krankheiten, die durch pathogene Erreger verursacht werden, beitragen.

Insbesondere die Ausführungsform, bei der das erfindungsgemäße DNA-bindende Protein an die Oberfläche eines Trägers immobilisiert ist, eignet sich für eine Adsorption prokaryonter DNA aus Körperflüssigkeiten, vorzugsweise aus dem Blut. Dieser Ansatz bietet überdies die Möglichkeit, mikrobielle DNA, die im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vorliegt, aus diesen zu entfernen. Die so von der mikrobiellen DNA, die auch allein in der Lage ist, schwere Entzündungsreaktionen bei Patienten auszulösen, gereinigte Körperflüssigkeit (z. B. Vollblut, Serum oder Liquor), kann dann in den Körper zurückgeführt werden. Dieses Prinzip kann also zur Abreichung prokaryonter DNA aus physiologischen Flüssigkeiten im Sinne der Reinigung eingesetzt werden, wobei die speziellen Bindungseigenschaften des erfindungsgemäßen Proteins genutzt werden.

Als Körperflüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle vom Körper eines Säugers, einschließlich Mensch, stammenden Flüssigkeiten verstanden, insbesondere solche in denen Krankheitserreger vorkommen können, wie z. B. Blut, Urin, Liquor, Pleural-, Perikardial-, Peritoneal- sowie Synovialflüssigkeit. Die auf humanes Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Unter bakteriellen Erregern werden vorzugsweise Erreger einer Sepsis, aber auch alle anderen bakteriellen Erreger von Infektionen verstanden. Sie können sich dabei von kommensalen Erregern unterscheiden, die zur normalen Besiedlung des Organismus gerechnet werden und gelegentlich auch in Untersuchungsproben von Patienten gefunden werden, aber keine klinische Bedeutung haben.

Bei der Isolierung der Gesamt-DNA aus infizierten Körperflüssigkeiten kann das Verhältnis Wirts-DNA zur Erreger-DNA oft nur 1:10 bis 1:10^–8 oder sogar noch weniger betragen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch die spezifische Bindung prokaryonter DNA an das erfindungsgemäße Protein eine Anreicherung um 1 Potenzeinheit und mehr.

Das erfindungsgemäße Protein kann direkt oder indirekt an den Träger gekoppelt sein. Die Art der Kopplung hängt von dem Träger und dem Trägermaterial ab. Als Träger kommen dabei insbesondere Membranen, Mikropartikel und Harze oder ähnliche Materialien für Affinitätsmatrices in Frage. Geeignete Materialien zur Anbindung des erfindungsgemäßen Proteins, sowie – abhängig von der Art des Materials – die Durchführung der Anbindung, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Für die indirekte Kopplung eignen sich beispielsweise spezifische Antikörper gegen das erfindungsgemäße Protein oder das Polypeptid, die ihrerseits durch bekannte Verfahren an den Träger gebunden sind.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Anreicherung prokaryonter DNA. Eine weitere Anwendung besteht in der Trennung von prokaryonter DNA aus einem Gemisch eukaryonter und prokaryonter DNA durch die Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein, welches z.B. an eine Matrix immobilisiert wurde. Das Gemisch aus körpereigner und prokaryonter DNA wird mittels geeigneter Verfahren mit der Affinitätsmatrix in Verbindung gebracht, und dabei wird die prokaryonte DNA an das immobilisierte erfindungsgemäße Protein gebunden; die eukaryonte DNA durchläuft zum Beispiel eine Trennsäule und kann separat gesammelt werden. Affinitätsmatrices können beispielsweise polymere Polysaccharide, wie Agarosen, andere Biopolymere, synthetische Polymere, oder Träger mit Silikat-Grundgerüst, wie poröse Gläser oder sonstige feste oder flexible Träger, sein, an welchen das erfindungsgemäße DNA-bindende Protein immobilisiert wird. Nach erfolgter Trennung prokaryonter von eukaryonter DNA wird die Affinitätsmatrix mit einem geeigneten Reagenz gespült, so daß entweder das Bindungsprotein mit der gekoppelten prokaryonten DNA von der Matrix und/oder die prokaryonte DNA von dem Bindungsprotein getrennt wird und für weitere Arbeitsschritte in ausreichender Menge zur Verfügung steht.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein welches an Mikropartikeln immobilisiert wurde. Hierbei kommen alle Mikropartikel in Frage, die eine Immobilisierung des DNA-bindenden erfindungsgemäßen Proteins ermöglichen. Solche Mikropartikel können aus Latex, Kunststoff (z. B. Styropor, Polymer), Metall oder ferromagnetischen Stoffen bestehen. Weiterhin können auch fluoreszierende Mikropartikel, wie sie beispielsweise von der Firma Luminex angeboten werden, verwendet werden. Nachdem die prokaryonte DNA an die an Mikropartikel immobilisierten erfindungsgemäßen Proteine gebunden wurde, werden die Mikropartikel mit geeigneten Methoden, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Fällung, Sortierung über Messung der Fluoreszensintensität oder magnetische Verfahren, von dem Stoffgemisch getrennt. Die prokaryonte DNA steht nach Trennung von den Mikropartikeln zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung.

Eine andere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein, welches anschließend durch Elektrophorese von übrigen Bestandteilen des Gemisches getrennt wird.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Trennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein, wobei das erfindungsgemäße Protein anschließend an entsprechende Antikörper gebunden wird. Die Antikörper können an feste oder flexible Substrate, z. B. Glas, Kunststoffe, Silizium, Mikropartikel, Membranen gebunden sein, oder sich in Lösung befinden. Nach Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein und dessen Bindung an den spezifischen Antikörper erfolgt die Trennung aus dem Stoffgemisch mit dem Fachmann bekannten Methoden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Reinigung von Körperflüssigkeiten von prokaryonter DNA eingesetzt werden. Hierbei ist es zweckmäßig, daß die Separation extrakorporal unter sterilen Bedingungen erfolgt, damit die Körperflüssigkeiten wieder in den Körper zurückgeführt werden können, so daß das körpereigene Immunsystem bei der Beseitigung von Infektionen unterstützt wird, indem die sich in den Körperflüssigkeiten befindende prokaryonte DNA entfernt wird.

Bei der extrakorporalen Entfernung der prokaryonten DNA aus Körperflüssigkeiten kommen alle geeigneten chemischen, mechanischen oder elektrochemischen Verfahren in Betracht. Weiterhin stellt auch die Kombination mit anderen extrakorporalen Verfahren, wie Hämoperfusion, Herz-Lungen-Maschine oder Endotoxin-Adsorber, eine weitere zweckmäßige Anwendung dar.

Das erfindungsgemäße Protein kann auch zur Detektion prokaryonter DNA eingesetzt werden. Hierbei schließt sich nach der Anreicherung der prokaryonten DNA ein Schritt zur Amplifikation der prokaryonten DNA an, wozu sich alle gängigen Amplifikationsmethoden eignen (PCR, LCR, LM-PCR etc.).

Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Kit zur Anreicherung prokaryonter DNA mittels eines der vorstehend beschriebenen Verfahren, in dem zumindest das erfindungsgemäße Protein gegebenenfalls zusammen mit weiteren geeigneten Reagenzien zur Verfahrensdurchführung enthalten sind.

Der Kit kann neben dem erfindungsgemäßen Protein mindestens ein Set von Primern, welche zur Amplifikation genomischer DNA bestimmter Prokaryonten unter Standardbedingungen geeignet sind, enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen hat den Vorteil, daß durch spezifische Bindung nicht-methylierter CpG-motiv-reicher prokaryonter DNA an Proteine mit spezifischer Affinität für solche Strukturen eine Konzentrierung prokaryonter DNA aus der Gesamt-DNA eines infizierten Wirts gelingt und damit die Nachweisempfindlichkeit für Verfahren zum Nachweis von Erreger-DNA in Körperflüssigkeiten stark erhöht wird.

Die Abtrennungsmöglichkeiten prokaryonter DNA von eukaryonter DNA mit einem spezifisch bindenden Protein sind nicht zeitaufwendiger als bekannte Methoden zur Isolierung von Gesamt-DNA. Der nachfolgende DNA-Nachweis kann über eine PCR-Reaktion erfolgen. Eine nested PCR wird in den meisten Fällen nicht notwendig sein, so daß eine beträchtliche Zeitersparnis in der Diagnostik möglich wird.

Bereits vorstehend wurde angesprochen, das erfindungsgemäße Protein zur Abreicherung prokaryontischer DNA in physiologischen Körperflüssigkeiten einzusetzen. Abreicherung im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet dabei, daß die Menge der prokaryontischen DNA verringert wird. Diese Möglichkeit zur Verringerung der prokaryontischen DNA ermöglicht es auch, die erfindungsgemäßen Proteine in der Umwelttechnik, der Abwasserwirtschaft und der Klimatechnik einzusetzen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele erläutert, ohne sie aber darauf einzuschränken.

Beispiel 1: Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins
Aus der DNA Sequenz für das komplette CPGbP Protein wurden die Primer 1 (GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG-fw, SEQ ID Nr. 3) und 2 (AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT-CTGAG-rv, SEQ ID Nr. 4) konstruiert, die ein verkürztes DNA-Fragment amplifizieren, das für ein verkürztes CPG-bindendes Protein, CPGbP181, kodiert. Das DNA-Fragment wurde nach Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hind III in den Vektor pQE9 (Qiagen) ligiert. In pQE9 entsteht ein offener Leserahmen, in dem an das 5' Ende ein für 6 × His-Tag kodierendes DNA Fragment fusioniert wird (pQE9[6HisCPGbP181]).
Das Plasmid pQE9[6HisCPGbP181] wurde in den E. coli Expressionsstamm M15[pREP4] (Qiagen) transformiert. Der Klon wird im weiteren M15[pCPGbP181] bezeichnet und das exprimierte Protein rCPGbP181. Die Expression des Proteins rCPGbP181 erfolgte nach folgendem Protokoll: Eine Kolonie des Expressionsstammes M15[pCPGbP181J wird in 2 ml Luria Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin bei 37°C unter Schütteln über Nacht angezüchtet. Anschließend wird die Vorkultur in 200 ml vorgewärmtes Nährmedium, das die gleichen Antibiotikakonzentrationen enthält, überführt. Nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C unter Schütteln wird IPTG zur Induktion der Expression zugegeben und weitere 5 Stunden inkubiert. Danach werden die Bakterien abzentrifugiert und das Sediment in 5 ml 0.2 M Trispuffer, pH 7.5 resuspendiert. Die Bakterien werden im Eisbad 5 × 1 min mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation wird das Sediment in 10 ml 0.2 M Tris, 2M Harnstoff, pH7.5 resuspendiert und 15 min geschüttelt. Nach erfolgter Zentrifugation wird das verbliebene Sediment in 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol aufgenommen und suspendiert. Die Inclusionbodies werden unter Agitation für 1 Stunde bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zentrifugation befindet sich das Rohprotein im Überstand und kann direkt auf eine 3 ml Ni-Agarosesäule aufgetragen werden. Die nächsten Schritte sollten im Kühlraum bei +4 bis +6°C erfolgen. Zunächst wird die Säule mit 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol Puffer, pH7.5 gewaschen bis die Extinktion die Nulllinie erreicht hat. Von hier aus kann rCPGbP181 auf verschiedenen Wegen gewonnen werden: 1. Als denaturiertes Protein gelöst in 6M Guanidinhydrochlorid oder 6 M Harnstoff und 2. als natives Protein löslich in Puffern physiologischer Konzentration. Im 2. Fall ist die Ausbeute aber geringer.
Reinigung nach Methode 1 (denaturiert):
Das Protein rCPGbP181 wird von der Ni-NTA Agarose mit einem Imidazolgradienten von 0–0.5 M eluiert M in dem Puffer 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH7.5 als Grundlage. Dabei wird rCPGbP181 bei 0.2–0.3 M Imidazol von der Säule abgelöst. Das so gewonnene Protein wird gegen 0.2 M Tris, 6M Harnstoff, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH7.5 dialysiert und eingefroren. Bei Dialyse gegen physiologische Puffer fällt so gereinigtes rCPGbP181 aus.
Reinigung nach Methode 2 (nativ):
Nach dieser Methode wird die Guanidinhydrochlorid Konzentration von 6 molar auf der Ni-NTA Agarose mit dem gebundenem rCPGbP181 über einen Gradienten auf 0 molar Guanidinhydrochlorid gebracht. Grundlage ist der Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH7.5. Die Flussgeschwindigkeit betrug 0.5 ml/min. Danach wurde zur Elution ein Imidazolgradient von 0 bis 0.5 molar angelegt in Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH7.5 als Grundlage. Auch hier wurde ein wesentlicher Anteil des gebundenen Proteins (20%) bei 0.2 bis 0.3 molar Imidazol eluiert. Dieses native rCPGbP181-Eluat blieb in diesem Puffer gelöst, auch nach Dialyse in PBS. Von Nachteil ist aber, dass ca. 80% des an Ni-NTA Agarose gebundenen rCPGbP181 unter diesen Bedingungen auf der Säule verblieben und nachträglich nur unter den denaturierenden Bedingungen von Methode 1 noch gewonnen werden konnten. Das heißt, die Ausbeute der verwendeten Methode 2 ergab nur 20% natives, in physiologischen Puffern lösliches rCPGbP181.
Beispiel 2: Erregernachweis mittels nested PCR:
Frisches, heparinisiertes Humanblut, das Streptococcus pyogenes mit 10³/ml koloniebildende Einheiten als Erreger enthält, wird für den Erregernachweis verwendet. Die DNA wird mittels Absorption an DNA bindende Matrix mit kommerziellen Kits zur Isolierung von Gesamt-DNA aus Körperflüssigkeiten nach abgewandelter Vorschrift der Hersteller isoliert. Dazu werden 100 μl infiziertes Blut in Eppendorf Tubes mit 200 μl des Totallysispuffers versetzt, der Proteinase K und SDS enthält. Das Gemisch wird 30 min bei 37°C inkubiert, und danach 20 min auf 95°C erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 20 μg Mutanolysin zugegeben und weitere 60 min bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugation wird das Gemisch auf die Zentrifugationssäulchen mit DNA- bindender Matrix aufgetragen und die DNA nach Vorschrift des Herstellers gereinigt. Die gereinigte DNA wird in einem Endvolumen von 100 μl 0.01 molar Trispuffer, pH 7.5 oder in gleicher Menge Elutionpuffer des Herstellers aufgenommen. Für den Erregernachweis wurden Primer zur Identifizierung des Streptolysin O Gens (slo) konstruiert.
1. PCR. Amplification eines 465 by Fragmentes

Forward-Primer 1: 5'-AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG (SEQ ID Nr. 5)
Reverse-Primer 2: 5'-GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT (SEQ ID Nr. 6)
Primer Konzentration 1 mg/ml

Ansatz:

5 μl DNA-Isolat
0.5 μl Primer fw 1
0.5 μl Primer rv 2
14 μl Aqua dest
total 25 μl in Ready to go Kit (Amersham-Pharmacia)

Reaktion:

5 min 95°C
Zyklen 40 (30 sec. 95°C, 30 sec 51°C, 3 min 72°C, 1 × 7 min 72°C)

In 3 ist die 1. PCR von Streptokokken-DNA in Hummanblut dargestellt (je 10 μl des 25 μl Ansatzes aufgetrennt: 1) PCR Ansatz mit 5 μl Template DNA; 2) Ansatz mit 5 μl Template, 1 : 10 verdünnt. 3) Positivkontrolle: 0.2 μl Streptokokken-DNA als Template ohne Anwesenheit eukaryotischer DNA aus Blut. ST) Molekulargewichtsstandard)
Ergebnis: Die 1. Primär-PCR ergibt keine positive Reaktion. Deshalb wurde nachfolgend eine 2. PCR (nested PCR) durchgeführt.
2: PCR, nested PCR. Amplifikation eines 348 by Fragmentes innerhalb des obigen slo-Fragments

Forward Primer 3: 5'-CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT (SEQ ID Nr. 7)
Reverse Primer 4: 5'-CTGAAGGTAGCATTAG TCTTTGATAACG (SEQ ID Nr. 8)
Primer-Konzentration: 1 mg/ml

Ansatz:

5 μl aus PCR1, Probe 1, 3
0.5 μl Primer fw 1
0.5 μl Primer rv 2
14 μl Aqua dest
total 25 μl in Ready to go Kit (Amersham-Pharmacia)

Reaktion:

5 min 95°C
Zyklen 40 (30 sec. 95°C, 30 sec 54°C, 3 min 72°C, 1 × 7 min 72°C)

In 4 ist die nested PCR mit den PCR-Produkten aus dem Primär-PCR-Ansatz in 3 als Template gezeigt. Die Proben entsprechen denen aus 3.
Ergebnis: In der nested PCR wird das gewünschte slo-DNA Fragment amplifiziert bei einer Konzentration von 100 Streptokokkenzellen pro 100 μl Blut (Probe 1). Das entspricht bei 5 μl Einsatz in der 1. PCR (3) ca 5 bis 10 Templates. Bei einer 1:10 Verdünnung (Probe 2) ist die Empfindlichkeit erschöpft (0,5 bis 1 Template).
Aus diesen Versuchen ist ersichtlich, dass für einen erfolgreichen PCR-Nachweis von Erregern im Blut die Gesamt-DNA aus mindestens 1 bis 5 ml Blut isoliert werden muss. Die Gesamt-DNA-Konzentration ist dann aber zu groß, um direkt in einer PCR eingesetzt zu werden.
Andere erregerspezifische Nukleinsäurenachweise ohne Amplifikationsschritt durch direkte Detektion der bakteriellen DNA, z.B. mittels DNA-Hybridisierung, sind ebenfalls zu unempfindlich, was vor allem am hohen Überschuss von humaner DNA gegenüber bakterieller DNA liegt. Hierbei sind zudem kompetitive Prozesse bei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an bakterieller DNA als hinderlich für eine qualitative und quantitative Analyse anzusehen. Die üblichen Methoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeit an, sodass das Verhältnis Wirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1 : 10^–6 und 1 : 10^–8 betragen kann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweises mikrobieller DNA in Körperflüssigkeiten gut nachzuvollziehen.
Beispiel 3: Ermittlung der Bindungseigenschaften von rCPGbP181:
In Gelretardierungsexperimenten wurde sowohl die Bindung des denaturierten als auch die des nativen Proteins rCpGbP181 an methylierte und nicht-methylierte DNA-Moleküle mit CpG-Motiven untersucht. Als Test-DNA wurde das E. coli Plasmid pUC18 verwendet mit einem inserierten M-Proteingensegment von Streptococcus dysgalactiae supsp. equisimilis (Geyer et. al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 11-24, 1999). Die Plasmidpräparation wurde geteilt und die eine Hälfte mit dem CpG-Methylase-Kit von New England Biolabs methyliert. Beide Präparationen wurden mit rCPGbP181 (nativ oder denaturiert) gemischt und im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in den 5 und 6 einzusehen. Sowohl rCPGbP181 in nativer als auch in denaturierter Form zeigte höhere Affinität zur nichtmethylierten Plasmid-DNA, was die selektive Bindungseigenschaft für nichtmethylierte CpG-reiche DNA bestätigt.
Beschreibung des Gelretardierungsexperiment gemäß 5: Je 5 μl (72 ng) methylierte und 1 μl (142 ng) nicht methylierte pUC18emm DNA wurden mit 5 μl (0.5 μg) nativem rCPGbP181 gemischt und auf ein Volumen von 35 μl mit dem Puffer: 0.01 M Tris, 0.08M NaCl, 0.001 M EDTA, 0.005M DTE, 5% Glycerin, pH7.8 aufgefüllt. Nach 30 min Inkubation bei 20°C wurden die Gemische elektrophoretisch in 1.5%iger Agarose aufgetrennt. In Lanes 1 und 3 wurde methylierte DNA und in Lanes 2 und 4 nichtmethylierte DNA aufgetragen. In Lanes 1 und 2 wurde die DNA mit nativem rCPGbP181 gemischt. Lane 2 zeigt, dass nichtmethyliertes pUC18emm mit rCPGbp181 interagiert, keine Wechselwirkung zeigte dagegen rCPGbP181 mit methyliertem pUC18emm (Lane 1). Lanes 4 und 5 sind die Plasmide ohne Zusatz von rCPGbP181 als Kontrollen.
Beschreibung des Gelretardierungsexperiment aus 6 von nicht methyliertem und methyliertem pUCl8emm nach Inkubation mit denaturiertem rCPGbP181. Die Konzentrationen entsprechen denen von 5. In Lanes 1 und 3 wurde methylierte DNA und in Lanes 2 und 4 nichtmethylierte DNA aufgetragen. In Lanes 1 bis 4 wurde die DNA mit zwei verschiedenen Chargen von denaturiertem rCPGbP181 gemischt. Lanes 2 und 4 zeigen, dass nichtmethyliertes pUC18emm auch mit denaturiertem rCPGbP181 interagiert, keine Wechselwirkung zeigte dagegen rCPGbP181 mit methyliertem pUC18emm (Lanes 1 und 3). Lane 5 pUC18emm ohne rCPGbP181 als Kontrolle.
Beispiel 4: Bindung und Trennung eines Gemisches von Kalbsthymus-DNA und bakterieller DNA an immobilisiertes CPGbP181.
Gereinigtes CPGbp181 wurde mittels Glutaraldehyd an Aminohexyl-Sepharose (Amersham-Biosciences) nach der Vorschrift von Cambiasso et al. (Cambiasso, C. et al., Immunochemistry 12: 273–278, 1975) gekoppelt. Die immobilisierte Proteinkonzentration betrug 0.3 mg pro Milliliter Sepharose. 300 μl Sepharose wurden in ein Spin-Filter Röhrchen mit innertem Frittenmaterial gegeben, das weder DNA noch Protein absorbiert, jedoch die Sepharose zurückhält.
200 ng Kalbsthymus-DNA (eukaryontische DNA) und 25 ng pUC18emm (prokaryontische DNA) wurden in 100 μl 20 mM Tris-HCL Puffer, pH 7.5 gelöst und auf das so präparierte Säulchen gegeben. Nach jedem Schritt wurde die Flüssigkeit 0,5 min bei 14 000 Umdrehungen pro Minute in einer Eppendorfzentrifuge in je ein frischen Eppendorfröhrchen zentrifugiert. So wurde die NaCl-Konzentration in Stufen von 50 mM von 0 auf 1000 mM erhöht. In jedem Röhrchen wurde eine DNA-Fällung durchgeführt indem 10 μl 4 M Acetat, pH4,5 und 250 μl abs. Ethanol zugegeben wurden, anschließend gemischt wurden und dann 15 min bei 14 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurden. Danach wurde der Überstand abgegossen und das Präzipitat wurde mit 300 μl 70%igem Ethanol gewaschen: Nach Abgießen wurde der Rückstand 5 min in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in 15 μl dest. Wasser (PCR-tauglich) aufgenommen. Zum einen wurde die Extinktion bei 254 nm von je 10 μl der Proben gemessen (7). Zum anderen wurde mit je 3 μl jeder Probe eine PCR mit Sequenzprimern für PUC18 durchgeführt (8).
Das Ergebnis (7, 8) zeigt, daß die eukaryontische Kalbsthymus-DNA am Anfang zwischen 0 bis 0,1 M NaCl von der Säule gewaschen wird, während die prokaryontische DNA (pUC18emm) in der Fraktion bei 0.35 M NaCl eluiert wurde. Das zeigt, dass eukaryontische DNA eine niedrigere Affinität zu CPGbP181 aufweist und somit eine eindeutige Trennung beider DNA-Fraktionen erreicht wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein, das nicht methylierte CpG-Motive bindet, wobei es eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei die Bindungsstelle für nicht methylierte CpG-Motive erhalten ist.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID No. 2 aufweist.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es durch Modifikation hergestellt ist.
Protein nach Anspruch 3, wobei die Modifikation durch Rekombination und/oder Expression und/oder chemische und/oder enzymatische Modifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzielt wird.
Protein nach Anspruch 4, wobei die Modifikation durch den Einbau von Disulfidbrücken, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustausche sowie Fusion mit weiteren Proteinen oder anderen Molekülen erreicht wird.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es bis maximal auf die Länge der Bindungsstelle verkürzt ist.
Antikörper gegen die gemäß den vorhergehenden Ansprüchen definierten Proteine, wobei die Antikörper monoklonale oder polyklonale Antikörper sind.
Verwendung der Antikörper nach Anspruch 7 zur Isolierung und Quantifizierung des Proteins, wie es gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 definiert ist.
Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonter DNA mit den Schritten: a) Kontaktieren mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryonten DNA mit dem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wodurch ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird, und b) Separation des Komplexes.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei sich an die Separation ein Schritt zur Abtrennung der DNA vom Protein aus dem Komplex anschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Protein an einen Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Protein direkt an den Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Protein über einen dagegen gerichteten Antikörper an den Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Träger als Matrix, Mikropartikel oder Membran ausgebildet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Separation mittels eines gegen das Protein gerichteten Antikörper oder Antiserum erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Separation mittels Elektrophorese erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Protein ein gegen nichtmethylierte CpG-Motive gerichteter Antikörper oder ein entsprechendes Antiserum ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Lösung ein Gemisch aus eukaryonter und prokaryonter DNA enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Lösung eine Körperflüssigkeit oder davon abgeleitet ist, insbesondere Vollblut, Serum, Plasma, Zellpräparationen aus Vollblut, Urin, Liquor, Pleural-, Perikardial-, Peritoneal-, Synovialflüssigkeit und bronchoalveoläre Lavage.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Separation mittels eines Filters erzielt wird, welcher entsprechende DNA-Protein-Komplexe herausfiltert.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Protein auf einer Filtermatrix immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21 zur Anwendung in der Umwelttechnik, der Wasser- und Abwasserwirtschaft sowie der Klimatechnik.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21, wobei weiterhin nach Schritt b) als Schritt c) die prokaryonte DNA amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, mit den Schritten: a) Isolierung der prokaryonten DNA aus dem Protein DNA-Komplex, b) Denaturierung der doppelsträngige DNA, c) Hybridisierung der Einzelstränge der DNA mit komplementären Primern, d) Generierung von Doppelstrangfragmenten über Reaktion mit Polymerasen und e) Wiederholung dieser Schritte zum gewünschten Amplifikationsgrad.
Verfahren nach Anspruch 24, mit den Schritten: a) Klonierung der isolierten prokaryonten DNA-Sequenzen in Vektoren, b) Transformation geeigneter Wirtszellen mit diesen Vektoren, c) Kultivieren dieser transformierten Zellen, d) Isolation der Vektoren aus diesen Zellen und e) Isolierung der DNA.
Kit zur Anreicherung prokaryonter DNA mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 25.
Test-Kit zur Detektion prokaryonter DNA mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 25 mit einem oder mehreren Sets spezifischer Primer.
Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis 6 für das Screening von Substanzbibliotheken bezüglich ihrer Bindeeigenschaften an proteingebundene DNA-Sequenzen.
Nukleinsäure, kodierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6.