AT503474A1 - Peptidbibliothek - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektorzellen- und Peptidbibliotheken umfassend eine Vielzahl von verschiedenen eukaryon-bisehen Sekretionsvektoren.

Das Gebiet des biomolekularen Screenings auf biologisch und therapeutisch relevante Verbindungen wächst rapide. Zu den relevanten Biomolekülen, auf die der Fokus solcher Screenings gelegt wird, gehören chemische Bibliotheken, Nukleinsäure-bibliotheken und Peptidbibliotheken auf der Suche nach Molekülen, die die biologische Aktivität von identifizierten Zielmolekülen hemmen oder verstärken. Unter spezieller Bezugnahme auf Peptidbibliotheken konzentrierte man sich insbesondere auf die Isolierung von Peptidhemmern von Targets und die Identifizierung von offiziellen Bindungspartnern von Targets. Über mehr als ein Jahrzehnt wird nun die Phagen-Display-Technologie angewendet, um Protein-Protein- sowie Protein-Peptid-Interaktionen zu beleuchten. Zufallspeptidbibliotheken sind nützlich, z.B. zur Vorhersage von und zum Screening auf Mimetika von Epitopsequenzen unbekannter Liganden.

Bibliotheken von Polypeptiden mit Zufallssequenzen sind wertvolle Quellen für neue Moleküle, die eine Vielfalt an potenter biologischer Wirksamkeit aufweisen. Wünschenswert sind Systeme, die ein Hoch-Durchsatz-Screening von neuen, aus einem Wirt wie Hefe sekretierten Proteinen gestatten.

Insbesondere erwiesen sich Zufallspeptidtechnologien als leistungsfähige Werkzeuge bei biologischen und medizinischen

Anwendungen mit einem möglichen Einsatz bei der Identifizierung von Affinitätsliganden, beim Medikamentendesign, bei der Ent- <

Wicklung von diagnostischen Markern und bei der Entdeckung von Impfstoffen. ' -

Traditionell werden Peptide in Phagenbibliotheken hauptsächlich als Fusionen der Phagenhüllproteine pIII und pVIII des Bakteriophagen M13 hergestellt. Diese Fusionsproteine tolerieren relativ kurze Inserts (bis zu 15 Aminosäuren). Bei Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien kam auch die Oberflächenexpression als Mittel zur Herstellung von Bibliotheken zum Einsatz. Üblicherweise eignet sich Bakterien-Display besser zur Produktion von Antikörpern und Proteinfragmenten als zur Schaffung von Zufallspeptidbibliotheken. Hefeoberflächen-Display von Peptidbibliotheken wurde ebenfalls als alternativer Weg zur Generierung von Säugerproteinen vorgeschlagen. Manche in E. coli

NACHGEREICHT • · • · · · · « • · · · ······ «·· « • · t · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · «······ · · · · · - 2 - exprimierten eukaryontischen Proteine sind unlöslich und können nicht in Phagenteilchen inkorporiert werden; stattdessen werden diese Proteine zur Verwendung bei der Erzeugung einer Bibliothek an sich mit Zelloberflächen verbindende Hefe-Adhäsionsrezeptoren fusioniert. Ähnliche Technologien zur Expression von Peptiden auf der Oberfläche von Zellen wurden mit Rhinoviren und Insektenviren entwickelt.

Die Wahl einer speziellen Plattform hängt von der Bedeutung der Bibliotheksgröße, der biosynthetischen Fähigkeit und der quantitativen Präzision für die jeweilige, ins Auge gefasste Anwendung ab.

Auf dem Gebiet sind mehrere Arten von biologischen Bibliotheken bekannt, die sowohl auf in-vitro- als auch auf in-vivo-ribosomaler Synthese basieren.

In-vitro-Transkriptions/Translationssysteme gestatten zum Beispiel die Schaffung von sehr großen Bibliotheken bis zu 1015 durch Verzicht auf einen Zelltransformationsschritt und die Steuerung von Screening-Bedingungen unabhängig von der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen.

Das in-vitro-Verfahren des Ribosomen-Displays schließt die Konservierung eines Polypeptid-Ribosom-mRNA-Dreifachkomplexes als genetische Einheit ein.

Ein anderes System, bei dem Puromycin-gekoppelte Peptid-RNA eine Rolle spielt, besteht aus e(inem kovalent gebundenen Nukleotid und Polypeptid. Kovalente RNA-Peptidkomplexe werden durch Kopplung mit Puromycin in fliner in-vitro-Transkriptions/-Translationsreaktion gebildet. *

Zur Lokalisierung der phenotypischen Wirkungen eines mutierten Enzyms wurde der in-vitrb-Transkriptions/Translations-reaktionsansatz in einer Öl-Wasser-Emulsion dispergiert, um wässerige Abteile mit Zelldimensionen zu schaffen.

In-vivo-Plattformen von Bibliothek-Displays reichen von Viruspartikeln bis zu ganzen Zellen und schließen prokaryon-tische und eukaryontische Organismen ein.

Beim Phagen-Display werden Proteine als Fusion an einem Phagenhüllprotein präsentiert und Phagenpartikel durch „Panning" gegen einen auf einen Festphasenträger gebundenen Liganden isoliert. Die Phagen pflanzen sich in E. coli fort.

Das filamentöse Phagennebenhüllprotein pIII ist das am häufigsten verwendete Display-Protein und ist in 3 bis 5 Kopien

NACHGEREICHT - 3 - pro Virion vorhanden. jWeiters wird das Hauptkapsidprotein pVIII des filamentösen Phagen für das Peptid-Display verwendet.

Weniger gebräuchliche GerüstSubstanzen für Peptid-Display sind das Nebenhüllprotein pVI und das D-Protein des Bakterio-phagen Lambda. 'Bei filamentösen Phagen werden zwei Systeme verwendet: polyvalentes Display („Ein-Gen-System") und monovalentes Display („Zwei-Gen-System"). Beim polyvalenten Display werden die für die Peptide kodierenden DNA-Fragmente in den Phagenvektor inseriert, üblicherweise zwischen einem bestimmten Hüllprotein und seinem Einzelpeptid. Beim monovalenten Display wird das Phagengenom modifiziert und der defekte Phage als „Phägemid" bezeichnet. Ein Phägemid enthält die zum Packen in Virionen erforderlichen Sequenzen, kodiert aber nicht für virale Gene.

Es wurden mehrere Fusionsproteinstrategien für die Präsentation von relativ kurzen Peptiden auf1 der Oberfläche von Gram-negativen Bakterien beschrieben. Peptide mit weniger als 60 Aminösäureresten können auf der Zelloberfläche präsentiert werden/ wenn sie in auf Oberflächen exponierten Schleifen von äußeren Membranproteinen (OMPs) aus Enterobakterien fusioniert werden.

Extrazelluläre Anhängsel wie Pili und Flagellen werden ebenfalls erfolgreich zur Präsentation von Peptiden verwendet. Das FLITRX-System, ein E.-coli-Display-Vektor, wurde auf Basis der größeren Strukturkomponenten des^E.-coli-Flagellum FliC entwickelt.

Die Konstruktion von Zufallspeptidbibliotheken wird als Fusion mit einem DNA-Bindungsprotein und als Fusion mit Ubiquitin realisiert.

Ein allgemeiner Vorteil von Eukaryonten-Systemen liegt in der Fähigkeit der Faltung von extrazellulären Säugerproteinen und -domänen mit hoher Wiedergabetreue.

Das Zwei-Hybridsystem ist ein genetisches Verfahren, das die Transkriptionsaktivität als Maß für Protein-Protein-Inter-aktionen verwendet. Es stützt sich dabei auf die modulare Beschaffenheit von vielen ortsspezifischen Transkriptionsaktivatoren, die aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer Transkriptionsaktivierungsdomäne bestehen. Die DNA-Bindungsdomäne visiert den Aktivator genau auf jene Gene an, die exprimiert

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werden, und die Aktivierungsdomäne kontaktiert andere Proteine der Transkriptionsmaschinerie zur Ermöglichung der Transkription. Im Zwei-Hybridsystem sind diese beiden Domänen des Aktivators nicht kovalent gebunden, sondern können durch die Interaktion irgendwelcher zweier Proteine zusammengebracht werden.

Das Hefe-Zwei-Hybridverfahren erlebt seit seiner Erfindung eine ständige Verfeinerung und Erweiterung, was zu Varianten wie Reverse-Zwei-Hybrid-, Drei-Hybrid- und Ein-Hybrid-Verfahren führte.

Weil das Hefe-Zwei-Hybridverfahren eine nukleare Lokalisierung und transkriptioneile Aktivierung erfordert, ist die Untersuchung von Sekretions- oder Zelloberflächenproteinen in diesem System im Allgemeinen nicht durchführbar.

Ein zytoplasmatischer Zwei-Hybrid-Assay auf der Basis von Ubiquitin wurde ebenfalls entwickelt. Wird das C-terminale Fragment von Ubiquitin an ein Reportergen fusioniert und mit dem aminoterminalen Fragment koexprimiert, dann stellen die beiden Hälften das native Ubiquitin wieder her, was zur Spaltung des Reporterproteins führt.

Einige Glykosylphosphatidylinosit-(GPI)-verankerte Proteine auf der Hefezelloberfläche wurden erfolgreich als Gerüstsubstanzen für die Präsentation von Peptiden in Hefe verwendet.

Es wurde über mehrere Hochd,urchsatz-Anwendungen bei der intrazellulären Expression von cDNA-Bibliotheken in Hefe berichtet. Beispielsweise ist instand der Technik ein duales Vektorsystem für die Expression einer humanen Fötushirn-cDNA-Bibliothek in P. pastoris und E. coli beschrieben.

Fremdproteine wurden auf def Oberfläche von Insektenzellen, in Okklusionskörpern und auf der Oberfläche von Baculovirus präsentiert. Es zeigte sich, dass Fusionsproteine mit dem baculoviralen Hüllprotein gp64, mit der pg64-Ankersequenz, sowie Fremdmembranproteine wie Influenzavirus-Hämagglutin auf die Oberfläche von infizierten Insektenzellen gerichtet sind.

Mehrere eukaryontische RNA-Viren gestatten die Insertion von kurzen Peptiden in ihre nativen Hüllproteine an bestimmten Stellen und werden für die Präsentation von Peptiden verwendet. Die Identifizierung von Hüllproteinfusionen, die nicht in die retrovirale Infektiosität eingreifen, eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung phagenähnlicher Methodiken mit dem

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Vorteil posttranslatorischer Modifikationen.

Insbesondere wird das menschliche Rhinovirus zur Schaffung von Peptid-Display-Bibliotheken verwendet.

Bei der zunehmenden Anzahl von Möglichkeiten, die für Polypeptidbibliotheken und -Screening zur Verfügung stehen, ist es wichtig, die Kriterien zur Auswahl einer entsprechenden Technologie für eine gegebene Anwendung in Betracht zu ziehen (siehe nachstehende Tabelle 1). Zu den Auswahlkriterien für eine optimale Strategie gehören: verfügbare Größe der Bibliothek, Peptidgröße, biosynthetische Fähigkeiten des Systems und quantitative Unterscheidung von falschen Screening-Positiven.

Tabelle 1: Vergleich von verschiedenen biologischen Peptid-Display- Sy Sternen

Eigenschaft Ribosomen -Display Phagen-Display Bakterien- Display Hefe- Display Display auf Basis von Säuger zellen Theoretisches oberes Limit der Bibliotheks große 1015 <1011 i, o \—1 CO o i—1 108 Wirtsex pressions systeme In vitro Prokaryont fi* Prokaryont Hefe zelle Säuger zelle Linker Nicht kovalent oder kovalent Virus- kapsid Zelle Zelle Zelle Insert- größenbe- schränkung + + Faltungs maschinerie — Nicht nativ Nicht nativ Nativ Nativ Posttransla torische Modifika tionen -/+ +

Im Fall von Phagen-Display-Bibliotheken ist Biopanning das

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Verfahren der Wahl. Das Zielmolekül wird an eine KunststoffOberfläche gebunden und aspezifische Stellen werden blockiert. Die Display-Bibliothek wird dann mit dem Target inkubiert und die gebundenen Klone werden eluiert, amplifiziert und für weitere Selektionsrunden verwendet. Zielmoleküle können auf Immuno-röhrchen, Mikroplattenvertiefungen oder Kügelchen immobilisiert werden.

Die Isolierung von spezifischen Peptid-synthetisierenden Klonen in auf Zelloberflächen präsentierten Display-Systemen kann durch Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) erreicht werden. Dabei werden Zellen mit fluoreszenzmarkierten Zielmolekülen inkubiert, und es können jene abgetrennt werden, die in der Lage sind, das Target zü binden. Zellsortierung kann die positiven Klone stark anreichern und zwischen Klonen unterschiedlicher Affinität und Spezifität unterscheiden. Weiters ermöglicht sie ein Screening mit dem Zielmolekül in Lösung. Somit ist keine Elution erforderlich, wodurch die Isolierung von unspezifisch an den festen Träger bindenden Klonen und auch das Elutionsproblem von sehr fest bindenden Klonen vermieden werden. Diese Zellen können auch mittels Magnetteilchentechnologie angereichert werden.

Der Nachweis von Proteinen, die löslich in Zellen exprimiert werden, erfordert üblicherweise einen Lyseschritt für den Zugriff auf intrazelluläre Produkte. Dabei werden Einzelkolonien auf Membrane transferiert, lysiert und mit dem Zielmolekül inkubiert. Der Nachweis eines gefundenen Liganden erfolgt üblicherweise mit einem markierten zweiten Liganden. t

Ein anderer Ansatz zur Erzeugung von Peptidbibliotheken wurde in der WO 00/20574 beschrieben. Diese PCT-Anmeldung bezieht sich auf die Verwendung von Gerüstproteinen (z.B. grün fluoreszierendes Protein) in Fusionskonstrukten mit zufälligen und definierten Peptiden und Peptidbibliotheken, um die Zellexpressionsniveaus zu erhöhen, den Zellkatabolismus zu senken, die Konformationsstabilität in Bezug auf lineare Peptide zu erhöhen und die Konzentrationen in stabilem Zustand der Zufallspeptide und Mitglieder von Zufallspeptidbibliotheken, die in Zellen zum Zweck des Nachweises der Anwesenheit der Peptide und des Screenens von Zufallspeptidbibliotheken exprimiert werden, zu steigern.

Im Stand der Technik mangelt es jedoch an leistungsfähigen

NACHGEREICHT ♦ · ♦ · · · • »•t ♦ · ♦ · · · • »•t

«····♦· · ««9 · - 7 -und zuverlässigen Expressionssystemen in Eukaryonten, insbesondere in Hefe, welche die Expression und extrazelluläre zur Verfügungstellung einer Peptidbibliothek ermöglichen. Bei vielen Anwendungen wäre ein solches extrazelluläres Eukar-yonten-bibliothekssystem von Vorteil gegenüber bestehenden Systemen, die entweder die Lyse von Zellen oder die Ablösung der Mitglieder der Peptidbibliothek von der extrazellulären Oberfläche eines Wirtsorganismus (oder Wirtsvirus) verlangen.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Herstellung von verbesserten eukaryontischen Peptidbibliotheken zur Verfügung zu stellen, die für Screening-Zwecke verwendet werden können.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Vektorbibliothek umfassend eine Vielzahl von verschiedenen eukaryontischen Sekretionsvektoren, worin jeder Vektor unter der Steuerung von transkriptorischen und translatorischen Steuersequenzen ein Gen umfasst, das für ein extrazelluläres lösliches Fusionspolypeptid kodiert und eine Kodiersequenz für ein an variable Kodiersequenzen für ein Peptid gekoppeltes Gerüstpolypeptid 'aufweist, wobei die Vektoren eine Kodiersequenz für ein Sekretionssignalpeptid umfassen, welches an das für das Fusionspolypeptid kodierende Gen gekoppelt ist.

Bei herkömmlichen Verfahren (Bakterien-Display, Phagen-Display, Hefe-Display, Säugerzel^len-Display) wird das Peptid auf einer Oberfläche präsentiert. Somit können Reaktionspartner sterisch behindert werden, und e$ kann eine andere Wechselwirkung in dem auf der Oberfläche präsentierten System als in r freier Lösung stattfinden. Der Überstand des vorliegenden Sekretionssystems kann direkt füf Screening-Zwecke verwendet werden. Das Kombinationspeptid kann direkt einem in-vitro-Assay unterzogen werden. Herkömmliches Biopanning lässt keine Anwendung eines invasiven Assays zu; eines Assays, bei dem das Biomolekül (Phage, Zelle, etc.) zerstört wird, wie bei Massenspektrometrie, Elektrophorese oder immunologischen Assays unter Anwendung von denaturierenden Bedingungen.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „extrazelluläres lösliches Fusionspolypeptid" auf Fusionspolypeptide, die nicht an die Zellwand oder Zellmembran eines Wirts binden, in dem diese Polypeptide exprimiert und sekretiert werden. Wenn also das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid exprimiert und

NACHGEREICHT sekretiert wird, bleibt es daher nicht mit der Zellwand und/oder Zellmembran der Wirtszelle assoziiert, sondern diffundiert z.B. in die Kulturbrühe oder in den Überstand der Zellkultur und kann daher als „freies" Polypeptid betrachtet werden.

Der Ausdruck „gekoppelt an" in Bezug auf Kodiersequenzen (d.h. Nukleinsäuren), die für ein Polypeptid oder Peptid kodieren, bedeutet, dass die Kodiersequenzen kovalent im System gebunden sind, gegebenenfalls gekoppelt mit einer entsprechenden Linkersequenz. „Eukaryontische Sekretionsvektoren" gemäß der vorliegenden Erfindung sind in eukaryontischen Wirten zu verwendende Vektoren umfassend Signalsequenzen, die die Sekretion eines Polypeptids in ein Kulturmedium gestatten, wodurch das sekretierte Polypeptid nicht an der Zellwand oder Zellmembran des eukaryontischen Wirts gebunden bleibt. Die erfindungsgemäßen eukaryontischen Sekretionsvektoren können auch Shuttlevektoren sein, was bedeutet, dass sich solche Vektoren, z.B. Plasmide, in einem Organismus fortpflanzen können und die Expression in einem anderen Organismus stattfindet (z.B. Fortpflanzung in einem prokaryontischen Organismus wie Escherichia coli und Expression in Hefe).

Die Bereitstellung einer sekretorischen Signalsequenz gestattet die Sekretion des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptid aus der Wirtszelle in den Überstand des Kulturmediums. In der Folge wird die Isolierung dieses Polypeptids erleichtert, weil keine Lyse der Wirtszelle und ke^ne Abtrennung des Polypeptids von der Oberfläche der Zellen erforderlich sind.

Das an das Gerüstprotein zu fusionierende Peptid kann vorzugsweise maximal 100 Aminosäurefeste, bevorzugter maximal 80 Aminosäurereste, noch bevorzugter maximal 60 Aminosäurereste, am meisten bevorzugt maximal 40 Aminosäurereste, insbesondere maximal 20 Aminosäurereste, umfassen.

Ein „Vektor" ist ein Replikon wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an den ein anderes DNA-Segment angelagert werden kann, um die Replikation des angelagerten Segments herbeizuführen. Ein „Replikon" ist irgendein genetisches Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert; d.h. zu einer Replikation unter seiner eigenen Steuerung fähig ist.

Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotor-

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Sequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription und Translation des insertierten DNA-Fragments erleichtern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise eine Replikationstartstelle, Promotor(en), Terminator(en) sowie spezifische Gene, die eine phenotypische Selektion in transformierten Zellen ermöglichen können. Die transformierten Wirte können gemäß auf dem Gebiet bekannten Mitteln fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erzielen.

Eine DNA-"Kodiersequenz", wie hierin verwendet, ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Steuerung entsprechender Regulationssequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Kodiersequenz sind durch ein Startkodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstoppkodon am 3' -(Carboxyl)-Terminus festgelegt. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz befinden sich üblicherweise 3' zur Kodiersequenz. „Transkriptorische und translatorische Steuersequenzen" sind DNA-Regulationssequenzen wie Promotoren, Enhancer, Polyadeny-lierungssignale, Terminatoren und dgl., die die Expression einer Kodiersequenz in einer Wirtszelle ermöglichen. Eine Kodiersequenz steht „unter der Steuerung" von transkriptorischen und translatorischen Steuersequenzen* in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Kodiersequenz in mRNA transkribiert, die dann trans-RNA-gespleißt und in das Protein translatiert wird, für das die Kodiersequenz kodiert. f

Eine „Signalsequenz" ist auch mit der Kodiersequenz enthalten. Diese Sequenz kodiert ’für ein Signalpeptid, vorzugsweise N-terminal zum Polypeptid, welches mit der Wirtszelle kommuniziert und das Polypeptid aus der Zelle sekretiert. Signalsequenzen, die geeigneterweise erfindungsgemäß verwendet werden, können mit einer Vielfalt von für Eukaryonten nativen Proteinen assoziiert gefunden werden. Eine „sekretorische Signalsequenz" gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher eine DNA-Sequenz, die für ein Peptid kodiert, welches als Bestandteil eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen Sekretionspfad einer Zelle dirigiert, in der es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird üblicherweise gespalten, damit das Sekretionspeptid beim Durchtritt durch den Sekretionspfad

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• * - 10 entfernt wird.

Eine Bibliothek, insbesondere eine biologische (Peptid-) Bibliothek, umfasst im Allgemeinen einen Pool von Mikroorganismen, die verschiedene Polypeptide exprimieren. Jeder Mikroorganismus trägt nur eine kodierende DNA-Sequenz für ein bestimmtes Peptid und repräsentiert einen Klon. Jeder Klon der Bibliothek kann vermehrt werden und exprimiert dann dasselbe Peptid.

Die Konstruktion einer Polypeptidbibliothek beginnt mit dem Design der kodierenden DNA-Sequenz. Die Quelle für dieses Insert kann ein Pool von chemisch synthetisierten degenerierten Oligo-nukleotiden, cDNA, genomischen DNA-Fragmenten oder mutageni-sierten spezifischen Genfragmenten sein. Diese Bibliothek wird dann durch Viruspartikel oder Zellen gebildet.

Der nächste Schritt besteht im Screenen der Bibliothek auf Zielmoleküle. Dann werden als Binder an die Zielsubstanz identifizierte Klone sequenziert und ihre Kodierregionen in die jeweiligen Peptidsequenzen translatiert.

Die Einführung von DNA-Fragmenten in einen geeigneten Vektor und die Transformation in Mikroorganismen erfordern optimierte Protokolle zur Maximierung der Klonierungseffizienz, insbesondere für die Konstruktion von großen Bibliotheken. Eine Zelle ist mit exogener oder heterologer DNA, insbesondere mit Mitgliedern der erfindungsgemäßen Vektorbibliothek „trans- Ϋ formiert" worden, wenn eine solche DNA in das Innere der Zelle eingeführt worden ist. Die transformierende DNA kann gegebenenfalls in das Genom der Zelle integriert (kovalent gekoppelt) t werden. In Prokaryonten, Hefen und Säugerzellen kann die transformierende DNA beispielsweise auf einem episomalen Element wie einem Vektor oder Plasmid belassen werden. In Bezug auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, bei der die transformierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so dass es durch Chromosomenreplikation von Tochterzellen übernommen wird. Diese Stabilität zeigt sich in der Fähigkeit der eukaryontischen Zellen, Zelllinien oder Klone zu bilden, die aus einer Population von die transformierende DNA enthaltenden Tochterzellen bestehen.

Weil das Klonieren eines DNA-Fragments mit dem Vektor kompatible Enden erfordert, müssen die beiden DNAs mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten werden. Die Vektor-DNA muss

NACHGEREICHT • ···· « *·· f - 11 - linearisiert und gereinigt werden. Eine Ligationsreaktion wird dort aufgebaut, wo degenerierte DNÄ-Fragmente in molarem Überschuss mit dem Vektor vermischt und zusammen mit dem Enzym T4-DNA-Ligase ligiert werden.

Die Menge an benötigten Doppelstrang-DNA-Fragmenten hängt von der Anzahl der randomisierten Nukleotide und von der Erwartung ab, wie oft eine einzelne Sequenz in der Bibliothek vertreten sein soll (Bibliothekskomplexität). Der andere wichtige Parameter ist die Transformationseffizienz (Anzahl von Transformanten, die aus 1 pg Vektor-DNA erhalten werden) des verwendeten Systems. Eine hohe Transformationseffizienz in E. coli wird üblicherweise mittels Elektroporation erzielt und beträgt etwa 109 Transformanten pro pg supercoiled Vektor-DNA, während die Effizienz eines geschnittenen und religierten Vektors etwa 10 bis 100 Mal geringer ist. Der Ligationsmix wird zur Transformation kompetenter E.-coli-Zellen in mehreren getrennten Transformationen verwendet. Ein Aliquot der transformierten Zellen wird auf festem Medium gezüchtet und für die Berechnung der Bibliothekskomplexität gezählt. Die Bibliothek kann in flüssigem Milieu gezüchtet werden. Die Plasmide können geerntet und gereinigt werden, um den endgültigen Wirtsorganismus der Bibliothek zu transformieren.

Alternativen zur Insertion von doppelsträngigen Oligo-nukleotiden in den Vektor sind Verfahren auf Basis von Gap Repair (DeMarini, D.J., et al., Biotechniques, 2001; 30:520-3) oder einer Ligation des einzelst^ängigen Oligonukleotids an ein Ende des Vektors unter Durchführung der zweiten Strangsynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase und einer zweiten Ligation an das andere Ende des Vektors.

Zur Verbesserung der Affinität von bereits isolierten Peptidliganden kann eine zweite Bibliothek durch Einführen von entweder Ziel- oder Zufallsmutationen konstruiert werden. Bei der Kassetten-Mutagenese werden die Target-Regionen durch ein synthetisches DNA-Duplex mit den gewünschten Mutationen substituiert. Bei der regionalen Mutagenese werden Mutationen durch chemische oder enzymatische Behandlung mit einer gesteuerten Änderungsquote pro Nukleotid eingeführt, und dann wird die DNA kloniert. Bei der kombinatorischen Mutagenese wird eine bestimmte Menge von Aminosäuren pro Peptid unter Verwendung des Kassettenverfahrens (Merino, E., et al., Biotechniques, 1992;

NACHGEREICHT * · • · ···· · Φ··« *····· · ·· · • · · · « φ · • ♦ · · ♦ # φ • · · · · · · ·· ··· ···· · ·«· « - 12 -12:508-10) ersetzt. Gespikte Oligonukleotide werden durch Zugabe einer bestimmten Menge einer Mischung von verschiedenen Basen an vorherbestimmten Stellen zum Spiken der Wildtyp-Base synthetisiert.

Das Gerüstpolypeptid ist vorzugsweise ein Polypeptid, das sich leicht in den Überstand oder in die extrazelluläre Matrix sekretieren lässt, somit weist dieses Polypeptid vorzugsweise keine Transmembran- oder Zellwand/Membran-Bindungsdomänen auf.

Die Sekretionsfähigkeit von Polypeptiden und Proteinen hängt in erster Linie von den physikochemischen Eigenschaften der Moleküle ab und kann nicht aufgrund einer primären Proteinsequenz vorhergesagt werden, außer wenn transmembrane Domänen vorhanden sind. Proteine mit transmembranen Domänen werden im Allgemeinen nicht sekretiert. Die Sekretion kann mittels herkömmlicher Untersuchungen wie ELISA, Westernblot, enzymatischer Tests etc. bestimmt werden. Eine den Erfordernissen des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechende Sekretionsrate findet sich, mit HSA und eIF5a als Beispielen, z.B. in Schuster M. et al. (J. Biotechn. 84 (2000) 237-248).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der eukaryontische Sekretionsvektor ein Hefe-, Säuger-, Insekten- oder Pflanzenvektor.

Es ist besonders bevorzugt, dass sich der Sekretionsvektor für die Proteinexpression in Hefe eignet.

Die Sekretionssignalsequenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem alpJia-Faktor-Sekretionssignal, . . .

Erfindungsgemäß können alle auf dem Gebiet bekannten t

Sekretionssignalsequenzen zweckmäßig in der Vektorbibliothek verwendet werden, mit der Maßgabe,\ dass sie vom eukaryontischen Wirt erkannt werden und die Sekretion des daran fusionierten Polypeptids induzieren.

Tabelle 2: Übersicht über Sekretionssignalsequenzen

Signalsequenz_ Hefe-Mating-Faktor ot_ Hefe-Invertase-suc2-Leader_ Hefe-saure-Phosphatase-phol-Leader Hefe-saure-Phosphatase-pho5-Leader Hefeinulinase-inulp-Leader_

NACHGEREICHT 13 - • · «♦··

Hefe-g-Galaktosldase Leader Hefe-Killertoxin-Leader K28-Killervirus-pptox-Leader Pflanzen-Chitinase Leader Synthetische Prepro-Leader Native Prepro-Proteinsequenz

Zur Sekretion bestimmte Proteine besitzen vorzugsweise ein Signalpeptid am N-Terminus.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Hefevektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus YEpFLAG-1, pYES, pYC, p427-TEF, p417CYC, pTEF-MF, pGAL-MF, pESC-HIS, pESC-LEÜ, pESC-TRP, pESC-URA.

Der YEpFLAG-l-Vektor (Sigma, MO) ist ein 7205-bp Hefeexpressionsvektor zur Klonierung und extrazellulären Expression von Proteinen als N-terminales FLAG-Fusionsprotein im Wirtsstamm S. cerevisiae BJ3505. Die Transkription wird vom Hefe-Alkohol-Dehydrogenasepromotor (ADH2) durch Glukose-Repression reguliert. Der Promotor wird stark reprimiert, wenn der Hefewirt, transformiert mit einem YEpFLAG-l-Vektorkonstrukt, in Anwesenheit von Glukose gezüchtet wird. Wenn die Glukose im Medium aufgrund des Hefestoffwechsels abgereichert ist, wird der Promotor zu einem hohen Grad dereprimiert. Die alpha-Faktor-Leaderseguenz kodiert für ein Peptid mit 83 Aminosäuren, das für die extrazelluläre Sekretion des Hefe-alpha-Faktor-Mating-Pheromons verantwortlich ist. Die Entfernung der Leaders^uenz findet während der extrazellulären Sekretion aus dem Wirt BJ3505 durch t proteolytische Spaltung statt. Dadurch wird ein FLAG-Fusions-protein mit einem freien N-Termihus generiert. Das FLAG-Epitop (DYKDDDDK), ein saures und stark hydrophiles Oktapeptid mit hoher Oberflächenwahrscheinlichkeit, gestattet die immunologische Detektion und Affinitätsreinigung des Fusionsproteins. Der Protease-defiziente Hefestamm BJ3505 (pep4::HIS3 prb-delta 1.6R HIS3 lys2-208 trpl-delta 101 ura3-52 gal2 canl) wird für die extrazelluläre Expression von Proteinen verwendet und gestattet eine Wachstumsselektion auf Tryptophan-Mangelmedium.

Bevorzugte Vektoren zur erfindungsgemäßen Verwendung sind YEp-Vektoren. Die episomalen Hefeplasmidvektoren YEp replizieren autonom aufgrund der Anwesenheit eines Segments des 2-pm-Plasmids von Hefe, das als Replikationsstartpunkt dient (2 pm

NACHGEREICHT

• ·· ···♦ · ·«#« ·· · · · «« · • % · · · • · · · · • · · · · ·*· ···· · ··· · - 14 - ; ori). Der 2-pm-ori ist verantwortlich für die hohe Kopienzahl und die hohe Transformationsfrequenz von YEp-Vektoren. YEp-Vektoren enthalten entweder eine vollständige Kopie des 2-μιτι-Plasmids oder, wie bei den meisten dieser Art von Vektoren, eine Region, die den ori und das REP3-Gen umfasst. Das REP3-Gen ist in cis zum ori zur Vermittlung der Wirkung der trans-agierenden REP1- und REP2-Gene erforderlich, welche für Produkte kodieren, die die Partition des Plasmids zwischen Zellen bei einer Teilung fördern. Daher müssen die YEp-Plasmide, die die nur ori und REP3 umfassende Region enthalten, in cir+-Wirten vermehrt werden, die das native 2-pm-Plasmid enthalten.

Die meisten YEp-Plasmide sind relativ instabil und gehen in etwa 10-2 oder mehr Zellen nach jeder Generation verloren. Auch unter selektiven Wachstumsbedingungen behalten nur 60 bis 95 % der Zellen das YEp-Plasmid.

Die Kopienzahl der meisten YEp-Plasmide reicht von 10 bis 40 pro Zelle bei cir+-Wirten. Die Plasmide teilen sich jedoch nicht gleichmäßig unter den Zellen auf, und es besteht eine starke Streuung in der Kopienzahl pro Zelle bei den Populationen.

Es wurden mehrere Systeme zur Erzeugung sehr hoher Kopienzahlen von YEp-Plasmiden pro Zelle entwickelt, einschließlich der Verwendung der teilweise defekten Mutation leu2-d, deren Expression mehrere Größenordnungen kleiner als das Wildtyp-LEC72+-Allel ist. Die Kopienzahl von solchen YEp-leu2-d-Vektoren pro Zelle reicht von 200 bis 300, und diese hohe Kopienzahl bleibt über viele Generationen nach dei^tAufzucht in leucinhaltigen Medien ohne selektiven Druck bestehen. Die YEp-_Zeu2-d-Vektoren i sind nützlich in groß angelegten Kulturen mit kompletten Medien, wo eine Plasmidselektion nicht möglich ist. Die häufigste Verwendung für YEp-Plasmidvektoren besteht in der Überproduktion von Genprodukten in Hefe.

Andere bevorzugte Vektoren, die erfindungsgemäß zum Einsatz gelangen, sind Ylp-Vektoren. Die Ypl-integrativen Vektoren replizieren nicht autonom, sondern integrieren sich in das Genom mit niedriger Frequenz durch homologe Rekombination. Die Integration von ringförmiger Plasmid-DNA durch homologe Rekombination führt zu einer Kopie der Vektorsequenz, flankiert von zwei direkten Kopien der Hefesequenz. Die Integrationsstelle kann durch Schneiden des Hefesegments im Ylp-Plasmid mit einer Restriktionsendonuklease und Transformieren des Hefestamms mit

NACHGEREICHT ·· • ·· ···· 9 ···· ·»«······· • · · · · · · • · · « · · · • · · · · « · ·· ··· ···♦ · «t· · - 15 - dem linearisierten Plasmid anvisiert werden. Die linearen Enden sind rekombinogen und lenken die Integration zu der Stelle im Genom, die zu diesen Enden homolog ist. Darüber hinaus erhöht die Linearisierung die Effizienz der integrativen Transformation vom 10-fachen auf das 50-fache.

Andere Vektoren, die vorzugsweise erfindungsgemäß zum Einsatz gelangen, sind YCp-Vektoren. Die YCp-Vektoren des Zentromerplasmids von Hefe sind autonom replizierende Vektoren, die Zentromersequenzen, CEN, und autonom replizierende Sequenzen, ARS, enthalten. Die YCp-Vektoren sind typischerweise in sehr geringen Kopienzahlen vorhanden, nämlich 1 bis 3 pro Zelle, gegebenenfalls auch mehr, und gehen ohne selektiven Druck in etwa IO-2 Zellen pro Generation verloren. In vielen Fällen verteilen sich die YCp-Vektoren auf zwei der vier Ascosporen eines Ascus, was darauf hinweist, dass sie das Verhalten von Chromosomen während der Meiose sowie während der Mitose imitieren. Es wird angenommen, dass die ARS-Sequenzen den natürlichen Replikationsstartpunkten von Hefechromosomen entsprechen und alle eine spezifische Konsensussequenz enthalten. Die CEN-Funktion hängt von drei konservierten Domänen mit der Bezeichnung I, II und III ab; alle diese drei Elemente sind für die mitotische Stabilisierung von YCp-Vektoren notwendig. YRp-Vektoren, die zwar ARS, aber keine funktionellen CEN-Elemente enthalten, transformieren Hefe rr\it hoher Frequenz, gehen aber bei zu hoher Frequenz, nämlich 10 % pro Generation, verloren, weshalb sie für allgemeine Vektoren unerwünscht sind.

Bevorzugt verwendete replikative Hefeplasmide sind YRp-Vektoren, die sich als unabhängige Plasmide vervielfachen können, weil sie eine chromosomale DNA-Sequenz tragen, die einen Replikationsstartpunkt enthält.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Kodiersequenz für das Peptid an das 3'-Ende des Gerüstpolypeptids gekoppelt. Das Sekretionssignal kann am N-Terminus des Proteins platziert sein.

Durch das Koppeln der Kodiersequenz des Peptids an das 3'-Ende der Kodierregion für das Gerüstpolypeptid entsteht eine Nukleinsäure, die für ein bevorzugtes Fusionspolypeptid kodiert, das an seinen C-Terminus ein Peptid fusioniert hat. Es ist natürlich auch möglich, die Kodiersequenz des Peptids an das 5'-Ende des Gerüstpolypeptids zu koppeln. In einem solchen Fall

NACHGEREICHT

muss das Peptid am 3'-Ende der Sekretionssignalsequenz positioniert sein. Weiters kann es vorzugsweise auch möglich sein, die Kodierregion des Peptids an das 3'- sowie das 5'-Ende der Kodiersequenz des Gerüstpolypeptids zu koppeln. Selbstverständlich können die an das 3' und 5'-Ende gekoppelten Peptide verschieden oder gleich sein. Das resultierende Fusionspolypeptid umfasst in der Folge das Peptid am N- und/oder C-Terminus des Gerüstpolypeptids.

Die Kodiersequenz für das Peptid kodiert vorzugsweise für eine Zufalls- oder Halbzufallspeptidsequenz oder ist ein Fragment eines genomischen, Gen-, EST- oder mRNA-Nukleinsäure-moleküls.

Erfindungsgemäß können alle Arten von Peptiden mit dem Gerüstpolypeptid fusioniert sein. Diese Peptide können mittels genomischen, Gen- EST- oder mRNA-Nukleinsäuremoleküle oder Fragmenten derselben kodiert werden oder randomisierte bzw. semirandomisierte Peptidsequenzen sein. Eine Vektorbibliothek, die diese Nukleinsäuremoleküle umfasst, kann z.B. zur Expression einer Peptidbibliothek verwendet werden, die zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt wird.

Bezüglich der Zufallspeptidsequenz sei bemerkt, dass zum Beispiel in chemischen Bibliotheken die Diversität mit 20n angegeben wird (20 ist die Anzahl der verschiedenen Aminosäuren, n ist die Anzahl der randomisierten Positionen). Beispielsweise hat eine komplette, aus fünf Aminosäuren bestehende Bibliothek 3,2 x 106 verschiedene Moleküle. ^Je länger die Peptidsequenzen sind, desto fehleranfälliger ist die Synthese. In chemischen i

Bibliotheken besteht keine Tendenz zu bestimmten Aminosäuren, wohingegen in biologischen Bibliotheken manche Aminosäuren aufgrund der Kodon-Degeneration stärker repräsentiert sind als andere.

In einer vollständig degenerierten Oligonukleotidbibliothek ist die Diversität durch (4 x 4 x 4)n gegeben, wobei 4 die Anzahl der verschiedenen Nukleotide und n die Anzahl der randomisierten Kodons ist. Die Größe von biologischen Bibliotheken ist in erster Linie durch die Transformationseffizienz bei Mikroorganismen und die Menge von handhabbaren Zellen beschränkt. Die obere Grenze der Transformationseffizienz in E. coli ist als 109 Transformanten pro 1 pg Vektor-DNA beschrieben. Biologische Bibliotheken können aus langen Zufallspolypeptiden hergestellt

NACHGEREICHT werden. Wenn die randomisierten Aminosäurepositionen mehr als sieben ausmachen, ist die Bibliothek unvollständig (z.B. sieben randomisierten Aminosäuren resultieren in 1,3 x 109 Peptiden). Manche Aminosäuren sind nicht gleichmäßig verteilt, weil manche Aminosäuren durch mehr als ein Triplett kodiert werden. Andere Peptide können für die Zelle toxisch sein oder weniger effizient exprimiert werden. Der Vorteil von in unvollständigen Bibliotheken exprimierten langen Zufallssequenzen liegt darin, dass die Bindungsregion in den meisten Fällen auf einige wenige Aminosäurereste beschränkt ist. Da ein langes variables Peptid innerhalb seiner Sequenz mehrere kurze Peptidabschnitte enthält, ist die Gesamtzahl an verschiedenen kurzen Peptiden höher als die Anzahl der verschiedenen Klone, die die Bibliothek repräsentieren. Weiters erlauben lange Zufallssequenzen eine Affinitätsselektion oder Peptidliganden, die die Interaktion weniger beabstandeter Reste oder kleiner Strukturelemente erfordern.

In einem vollständig degenerierten Oligonukleotid kodiert jedes Triplett für eines der 64 möglichen Kodons. Bei jeder Kopplungsreaktion wird eine identische Mischung aller vier Nukleotide (N) für alle drei Positionen im Triplett verwendet.

So enthält das Oligonukleotid alle 64 möglichen Kodons, und es sind alle 20 Aminosäuren und drei Stoppkodons vertreten.

Um bestimmte Stoppkodons oder Aminosäuren zu vermeiden, können manche Positionen des Oligonukleotids nicht zur Gänze randomisiert werden. Für eine Position des Tripletts wird eine Mischung von nur zwei Nukleotiden^anstelle einer Mischung aller vier verwendet (siehe nachstehende Tabelle 3).

Tabelle 3: Oligonukleotid-Design

NACHGEREICHT

Triplett Funktion Referenz NNK alle 20 Aminosäuren möglich nur 1 Stoppkodon möglich [1, 2] NNS alle 20 Aminosäuren möglich nur 1 Stoppkodon möglich [1, 2] 18 18 NNY + RNN kein Stoppkodon [3] möglich, aber Cys und Gin fehlen RNN + NNG + NHY Cys fehlt [4] N = A, C, G, T; K = G, T; S = G, C; Y = C, T; R = A, G, H = A, C, T; [1] Scott, J.K. und G.P. Smith, Science, 1990. 249(4967):386-90; [2] Smith, G.P. und J.K. Scott, Methods

Enzymol, 1993. 217:228-57; [3] Mandecki, W., Protein Eng, 1990. 3:221-6; [4] Scalley-Kim, M., Protein Sei, 2003. 12:197-206.

Eine andere Möglichkeit, randomisierte Oligonukleotide zu konstruieren, wurde von LaBean et al. vorgestellt (Protein Sei, 1993. 2:1249-54). Dieses Verfahren minimiert Stoppkodons und passt für in 207 natürlichen Proteinen beobachtete Aminosäurefrequenzen. Bei Verwendung eines Suchalgorithmus mit Verfeinerungsgitter werden die Terminationskodons minimiert und die Aminosäurezusammensetzungen der Peptide ausbalanciert. Es werden drei Mischungen von Nukleotiden konstruiert, die jeweils einer der drei Positionen im Kodon entsprechen.

Ein unterschiedlicher Ansatz zur Synthese von randomisierter DNA wurde von Neuner et al. (Nucleic Acids Res., 1998. 26:1223-7) beschrieben. Die Strategie basiert auf dem Einsatz von Dinukleotidphosphoramit-Baublöcken im Rahmen eines Harzspaltverfahrens. Sieben Dinukleotid-Baublöcke sind erforderlich, um für alle 20 natürlich Aminosäuren zu kodieren. Ϋ

Es besteht auch die Möglichkeit, Peptide durch Einführen von zwei Kodons für Cystein in beiden Seiten der Zufallsregion unter Zwangsbedingungen zu setzen. Das Screenen von Pools dieser t zyklischen Bibliotheken (CX5C, CX6C, CX7C) führte zur Isolierung von Liganden zu mehreren Integrinen (Koivunen, E., et al. Biotechnology (N Y), 1995. 13:265-70). Zyklische und lineare Peptidbibliotheken wurden auch zum Screenen auf Streptavidin-binder verwendet. Eine Analyse der Bindungspeptide zeigte, dass die entsprechend unter Zwangsbedingungen gesetzten zyklischen Peptide Streptavidin um drei Größenordnungen besser banden als lineare Peptide (Giebel, L.B., et al., Biochemistry, 1995. 34:15430-5). Die Verwendung von gespaltenen Inteinen (Scott, C.P., et al., Chem Biol, 2001. 8:801-15) gestattet ebenfalls die Herstellung von zyklischen Peptiden.

Verfahren zur Herstellung von zufällig gescherter genomischer DNA und/oder cDNA und zur Handhabung solcher DNAs

NACHGEREICHT sind auch auf dem Gebiet bekannt. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Ä Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999); die durch Bezugnahme hierein inkorporiert sind). Details zur Bibliothekskonstruktion, -manipulation und -Wartung sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt. (Siehe z.B. Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra).

Unter „randomisiert" wird hierin verstanden, dass jede Nukleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen aus Zufallsnukleotiden bzw. -aminosäuren besteht. Wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben, werden die zu den Peptiden führenden Nukleinsäuren chemisch synthetisiert und können somit irgendein Nukleotid an irgendeiner Position enthalten. So kann, wenn die Nukleinsäuren zur Bildung von Peptiden exprimiert werden, irgendein Aminosäurerest an irgendeiner Position enthalten sein. Der synthetische Prozess kann so konzipiert sein, dass randomisierte Nukleinsäuren erzeugt werden, die die Bildung von allen oder den meisten möglichen Kombinationen über die Länge der Nukleinsäure zulassen, wodurch eine Bibliothek von rando-misierten Nukleinsäuren gebildet wird. „Semirandomisiert" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Peptidsequenz, die von einer eigenen Sequenz stammt uncj bei der einzelne Aminosäure- f reste durch Zufallssequenzen ausgetauscht werden (z.B. werden 10 %, 30 % oder 60 % der gesamten ^pinosäurereste ausgetauscht).

Die erfindungsgemäße Bibliothek umfasst vorzugsweise eine *

Vielzahl von verschiedenen eukaryontischen Sekretionsvektoren, nämlich mindestens 2, vorzugsweise mindestens 10, bevorzugter mindestens 100, am meisten bevorzugt mindestens 1000, insbesondere mindestens 10.000.

Gemäß einer bevorzugten Äusführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Gerüstpolypeptid ein eukaryontischer Initiationsfaktor, vorzugsweise der eukaryontische Initiationsfaktor 5a (eIF5a), insbesondere der humane eukaryontische Initiationsfaktor 5a (eIF5a).

Das Gerüstpolypeptid, das in der Vektor/Peptid-Bibliothek einsetzbar ist, kann verschiedene Merkmale aufweisen, so auch die Fähigkeit, aus einem Wirt effizient sekretiert und korrekt gefaltet zu werden, um die Zugänglichkeit des erfindungsgemäßen

NACHGEREICHT 20 20

Peptids für Bindungspartner, die das Peptid binden sollen, zu gewährleisten.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung des eukaryontischen Initiationsfaktors, vorzugsweise des eukaryontischen Initiationsfaktors 5a (eIF5a), insbesondere des humanen eukaryontische Initiationsfaktors 5a (eIF5a), als Gerüstpolypeptid. Der eukaryontische Initiationsfaktor 5a (eIF5a) ist ein Protein, welches für das Überleben der eukaryontischen Zelle wesentlich ist. eIF5a ist ein kleines (17 kDa) Protein, das im ersten Schritt der Bildung der Peptidbindung an der Translation beteiligt ist und auch an der Regulierung des Zellzyklus teilnimmt. Es ist das einzige bekannte Zellprotein, das die posttranslatorisch abgeleitete Aminosäure Hyposin [Νε-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysine] enthält. eIF5a wird vorzugsweise als Gerüstpolypeptid verwendet, weil es in Säugern, insbesondere im Menschen, ubiquitär exprimiert wird und daher keine Immunantwort zeigt, wenn es an Säuger verabreicht wird. Weiters konnten Schuster et al. (Schuster M. et al., J Biotechnol, 2000. 84:237-48) die Expression von eIF5a als FLAG-Fusionsprodukt mit hoher Ausbeute und Reinheit mit Hilfe des YepFLAG-l-Vektorsystems zeigen.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Zellbibliothek umfassend Wirtszellen enthaltend die erfindungsgemäße Vektorbibliothfk.

Die erfindungsgemäße Vektorbibliothek kann in Wirtszellen eingeführt (z.B. transformiert) ^werden, wodurch es zur Bildung einer Zellbibliothek kommt. Diese Zellbibliothek kann jene Polypeptide exprimieren, für die die Vektorbibliothek kodiert.

Ein noch anderer Aspekt der' vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Wirtszelle umfassend einen Vektor der erfindungsgemäßen Vektorbibliothek.

Die Wirtszellen, die auch Teil einer Zellbibliothek sein können, sind vorzugsweise Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise Zellen von Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Saccharomyces cerevisiae, Säuger-Wirtszellen oder Pflanzen-Wirtszellen.

Insbesondere eignen sich diese Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Peptidbibliothek, umfassend die folgenden Schritte:

NACHGEREICHT

* 4 - 21 - Vorsehen von Vektoren einer erfindungsgemäßen Vektorbibliothek, - Transferieren dieser Vektoren in Wirtszellen, - Isolieren von einen Einzelvektor enthaltenden Wirtszellen, - Kultivieren dieser Wirtszellen in einem Kulturmedium unter für die Expression der Fusionspolypeptide zweckmäßigen Bedingungen und gegebenenfalls - Isolieren der exprimierten Fusionspolypeptide aus dem Überstand des Kulturmediums.

Die erfindungsgemäßen Vektoren, insbesondere die erfindungsgemäße Vektorbibliothek, können in Wirtszellen transferiert (z.B. transformiert) werden, die zur Expression der erfindungsgemäßen Fusionspolypeptide verwendet werden können. Nach Transferieren der Vektoren in die Wirtszellen werden Zellen, die einen Einzelvektor der Bibliothek enthalten, isoliert (d.h. individualisiert, vereinzelt). Jede isolierte Wirtszelle wird für die Expression und Sekretion der Fusionspolypeptide kultiviert, was in einer Peptidbibliothek resultiert. Gegebenenfalls kann das exprimierte Fusionspolypeptid aus dem Überstand des Kulturmediums isoliert werden. Die Isolierung dieses Polypeptids kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren (z.B. Chromatographie) bewerkstelligt werden.

Die erfindungsgemäße Peptidbibliothek kann in einer pharmazeutischen Präparation oder als8Vakzine verwendet werden. ö

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Wirtszellen ijafe-Wirtszellen, vorzugsweise Zellen von Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Saccharomyces cerevisiae, Säuger-Wirtszellen oder Pflanzen-Wirtszellen. '

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren eine Peptids mit gezielter biologischer Wirksamkeit oder mit Bindungskapazität an einen Bindungspartner, umfassend die folgenden Schritte: - Vorsehen eines durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlichen Polypeptids, - Kontaktieren des Polypeptids mit einer Zielzelle oder einem Zielmolekül und - Bewerten der Fähigkeit des sekretierten Polypeptids, einen biologischen Prozess in einer Zielzelle zu regulieren oder an ein Zielmolekül zu binden.

NACHGEREICHT - 22 - 22

Die erfindungsgemäße Peptidbibliothek kann zur Identifizierung von Peptiden verwendet werden, die eine biologische Aktivität oder Bindungskapazität an einen Bindungspartner (z.B. Antikörper) aufweisen. Diese Aktivität bzw. Kapazität kann durch Kontaktieren mindestens eines Mitglieds der Peptidbibliothek (Einzelmitglieder oder Pools von Einzelmitgliedern) mit einer Zielzelle oder einem Zielmolekül ausgewertet werden. Dabei wird der Einfluss des Polypeptids, insbesondere des mit einem Gerüstpolypeptid fusionierten Peptids, auf die Zielzelle bzw. das Zielmolekül bestimmt.

Das Zielmolekül ist vorzugsweise ein Protein, insbesondere ein Enzym, ein Rezeptor, ein Matrixprotein, ein Zellskelett-protein, ein Eisentransportprotein, ein Peptidhormon, ein Glukosetransporter, ein antigenbindendes Protein, ein Immunoglobulin, ein Peptidhemmer, ein Sauerstofftransportprotein, ein Signaltransduktionsprotein, ein Transkriptionsfaktor oder ein Hitzeschockprotein.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Fusionspolypeptid enthaltend einen eukaryontischen Initiationsfaktor, vorzugsweise den eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), insbesondere den humanen eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), fusioniert an ein pharmazeutisch aktives Peptid.

Human-eIF5a ist ein Molekül,, das im Menschen ubiquitär exprimiert und in der Folge vom Immunsystem nicht als Fremdpolypeptid erkannt wird. Daher i$t elF, insbesonder eIF5a, ein geeignetes Gerüstpolypeptid zur Einführung von pharmazeutisch * aktiven Peptiden. eIF5a ist weiters von Vorteil, weil sich eIF5a enthaltende Fusionspolypeptide ίή Wirtszellen wie Hefe leicht als Sekretionspolypeptide hersteilen lassen.

Wie hierin verwendet, kann „pharmazeutisch aktive Peptide" sämtliche Peptide umfassen, die auf dem Gebiet bekannt sind und von denen man weiß, dass sie bei Verabreichung an einen menschlichen oder tierischen Körper eine biologische Aktivität aufweisen. Zu den Peptiden gehören auch antimikrobielle Peptide wie antimykotische Peptide oder antibakterielle Peptide und Peptide wie Insulin/Proinsulin/Preproinsulin oder Varianten davon, Peptidhormone wie das Wachstumshormon, Prolaktin, FSH oder Varianten davon, oder die Blutgerinnungsfaktoren VII oder VIII oder Varianten davon. Der Ausdruck „pharmazeutisch aktives

NACHGEREICHT

Peptid" gilt auch für Peptide, die, wenn erfindungsgemäß an elF, insbesondere eIF5a, konjugiert, als eIF5a-Peptid-Konjugat eine pharmazeutische Wirkung zeigen, nicht unbedingt aber als Peptid ohne Konjugation an eIF5a.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein C-terminal verlängertes elF, insbesondere eIF5a, umfassend eine C-terminale Verlängerung der natürlich vorkommenden elF-Sequenz.

Die Zusammensetzung umfasst weiters vorzugsweise mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten oder Träger.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiters pharmazeutisch akzeptable Exzipienten und/oder Träger umfassen. Geeignete Exzipienten und Träger sind auf dem Gebiet gut bekannt (siehe z.B. „Handbook of Pharmaceutical Excipients", 5th Edition by Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Siän C. Owen (2005), APhA Publications).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Peptid an den C-Terminus des eukaryontischen Initiationsfaktors, vorzugsweise eukaryontischen Initiationsfaktors 5a (eIF5a), fusioniert.

Aufgrund der dreidimensionalen Struktur von eIF5a wird bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Peptide an den C-Terminus von eIF5a fusioniert werden, weil die Zugänglichkeit des Peptids an dieser Stelle garantiert werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, das Peptid an cjen C-Terminus eines (N- oder C-terminal) trunkierten eIF5a zu fusionieren.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Vakzineformulierung umfassend ein Fusionspolypeptid enthaltend einen eukaryontischen Initiationsfaktor, vorzugsweise den eukaryontischen Initiationsfäktor 5a (eIF5a), insbesondere den humanen eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), fusioniert an ein antigenes Peptid.

Ein „antigenes Peptid" wie hierin verwendet umfasst mindestens sechs Aminosäurereste der Aminosäuresequenz eines Proteins voller Länge und ein Epitop davon, so dass ein gegen das Peptid gerichteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit dem Protein voller Länge oder mit irgendeinem das Epitop enthaltenden Fragment bildet. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid mindestens 8 Aminosäurereste, z.B. ein Peptid mit einer Länge von 9 bis 11 Aminosäuren, oder mindestens 15 Aminosäurereste oder mindestens 20 Aminosäurereste oder

NACHGEREICHT

mindestens 30 Aminosäurereste. Vom antigenen Peptid enthaltene bevorzugte Epitope sind Bereiche des Proteins, die auf der Oberfläche desselben angeordnet sind.

Das antigene Peptid ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Erregerantigen, tumorassoziierten Antigen, Enzym, Substrat, Selbstantigen, organischen Molekül oder Allergen. Mehr bevorzugte Antigene sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus viralen Antigenen, bakteriellen Antigenen oder Antigenen aus Erregern von Eukaryonten oder Phagen. Zu den bevorzugten viralen Antigenen gehören HAV-, HBV-, HCV-, HIV-I-, HIV-II-Antigene, Parvovirus-, Influenza-, HSV-, Hepatitisvirus-, Flavivirus-, West-Nil-Virus-, Ebolavirus-, Poxvirus-, Pockenvirus-, Masernvirus-, Herpesvirus-, Adenovirus-, Papillomavirus-, Polyomavirus-, Parvovirus-, Rhinovirus-, Coxsackievirus-, Poliovirus-, Echovirus-, Japanisches Encephalitisvirus-, Dengue-virus-, Frühsommer-Meningo-Enzephalitis-Virus-, Gelbfiebevirus-, Coronavirus-, Respiratory-Syncytial-Virus-, Parainfluenzavirus-, La-Crosse-Virus-, Lassavirus-, Rabiesvirus-, Rotavirus-Antigene; zu den bevorzugten bakteriellen Antigenen gehören Pseudomonas-, Mycobacterium-, Staphylococcus-, Salmonella-, Meningococcal-, Borellia-, Listeria-, Neisseria-, Clostridium-, Escherichia-, Legionella-, Bacillus-, Lactobacillus-, Streptococcus-, Entero-coccus-, Corynebacterium-, Nocardia-, Rhodococcus-, Moraxella-, Brucella, Campylobacter-, Cardipbacterium-, Franciselia-, Helicobacter-, Haemophilus-, Klebsiella-, Shigella-, Yersinia-, Vibrio-, Chlamydia-, Leptospira-^f Rickettsia-, Mycobacterium-, Treponema-, Bartonella-Antigene. Bevorzugte eukaryontische Antigene von pathogenen Eukaryonten schließen Giardia-, Toxoplasma-, Cyclospora-, Cryptosporidium-, Trichinella-, Hefe-, Candida-, Aspergillus-, Cryptococcus-, Blastomyces-, Histo-plasma-, Coccidioides-Antigene ein.

Die Formulierung umfasst vorzugsweise weiters einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten oder Träger oder Hilfsstoff.

Exzipienten, Träger und Hilfsstoffe zur Verwendung in Vakzinen sind dem Fachmann bekannt. Siehe beispielsweise „Vaccine Design: Subunit & Adjuvant Approach" von Jessica R. Burdman, Michael F. Powell (Editor), Mark J. Newman (Editor), 1995 (Springer/Kluwer).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid oder eine Peptidbibliothek wie durch

NACHGEREICHT - 25 • · · 9 • · · * - 25 • · · 9 • · · *

die vorliegende Erfindung definiert an den C-Terminus des eukaryontischen Initiationsfaktors 5a (eIF5a) fusioniert. Es ist natürlich auch möglich, die Kodiersequenz des Peptids an das 5'-Ende des Gerüstpolypeptids zu koppeln. In einem solchen Fall ist das Peptid am 3'-Ende der Sekretionssignalsequenz anzuordnen. Darüber hinaus besteht vorzugsweise auch die Möglichkeit, die Kodierregion des Peptids sowohl an das 3'- als auch an das 5'-Ende der Kodiersequenz des Gerüstpolypeptids zu koppeln. Selbstverständlich können die an das 3'- und 5'-Ende gekoppelten Peptide verschieden oder gleich sein. Das resultierende Fusionspolypeptid umfasst daher das Peptid am N- und/oder C-Terminus des Gerüstpolypeptids.

Das an eIF5a zu fusionierende Peptid kann antigene Eigenschaften aufweisen und in der Folge für eine Aktivimpfung von Tieren und Menschen verwendet werden. Das antigene Peptid kann ein bekanntes Antigen sein oder durch ein erfindungsgemäßes Verfahren unter Verwendung einer Zellbibliothek wie hierein beschrieben identifiziert werden.

Kloniert als carboxyterminale Elongationen von eIF5a wurden die Fusionsprodukte in hohen Konzentrationen auf Mikroplattenebene hergestellt. Als Screening-Anwendung ist ein Modellansatz beschrieben, bei dem nach Peptiden gesucht wird, die die Bindung von Autoantikörpern an den Blutgerinnungsfaktor VIII hemmen. Der gut charakterisierte monoklonal^ Mäuse-Antikörper ESH8 wurde als gegen FVIII gerichteter Modell-Antikörper verwendet.

Die vorliegende Erfindung i^st weiters durch die folgenden

Figuren und Beispiele veranschaulicht, ohne dass sie dabei auf * diese eingeschränkt ist.

Fig. 1 zeigt den Ablaufplan'des Screenens auf Binder aus der sekretierten Bibliothek.

Fig. 2 zeigt die Klonierungsstelle zur Konstruktion der Bibliothek.

Fig. 3 zeigt das Screenen auf Binder an ESH8. Dotblots der Überstände entwickelt mit verschiedenen Antikörpern: (A) ESH8; (B) ESH8 in Anwesenheit von FVIII; (C) anti-FLAG Ml; (D): sekundärer anti-IgG-HRP-Antikörper allein. In Position A12: FVIII; in den Positionen F12, G12, H12: eIF5a ohne C-terminaler Bibliothek.

Fig. 4 zeigt die Ausrichtung der Zufallspeptide mit der Aminosäuresequenz von Human-FVIII. Sequenzhomologien sind fett

NACHGEREICHT 26 gedruckt.

Fig. 5 zeigt SDS-PAGE und Westernblots der sekretierten Fusionsproteine. (A) SDS-Gel, (B) Westernblot entwickelt mit anti-FLAG Ml, (C) Westernblot entwickelt mit ESH8.

Fig. 6 zeigt die teilweise Neutralisierung der Hemmwirkung von ESH8 nach Zugabe von Kulturüberständen von den sekretierten Fusionsproteinen. Durch Zugabe von ESH8 verringerte sich die FVIII-Aktivität von normalem Plasma auf 23,51 % der ursprünglichen Aktivität. (A) Kulturüberstände ohne Verdünnung, (B) Überstand verdünnt 1:10, (C) Überstand verdünnt 1:100.

Fig. 7 zeigt die teilweise Neutralisierung der Hemmwirkung von ESH8 nach Zugabe von Kulturüberständen von den Fusionsproteinen. Durch Zugabe von ESH8 verringerte sich die FVIII-Aktivität von normalem Plasma auf 32,6 % der ursprünglichen Aktivität.

BEISPIELE

Beispiel 1:

Das Ziel des vorliegenden Beispiels ist die Implementierung eines Systems einer in Hefe generierten, sekretierten Zufallspeptidbibliothek, die ein Hoch-Durchsatz-Screening auf Mikroplattenebene gestattet.

Das „YEpFLAG-1 Expression System for Yeast" (Sigma) ermöglicht eine Hoch-Durchsatz-Produktion und -Reinigung von

Proteinen unter physiologischen ^Bedingungen. Die Genexpression wird durch den Alkohol-Dehydrogenase-Promotor autoinduziert. Die „Yeast-Mating-Pheromon-alpha-Lea^iersequenz" stromaufwärts der

Genfusionsstelle erleichtert die Sekretion des rekombinanten *

Proteins in den Kulturüberstand. Das N-terminale Oktapeptid FLAG-Tag DYKDDDDK ermöglicht einen raschen Nachweis des rekombinanten Proteins mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (Prickett, K.S., et al. Biotechniques, 1989. 7:580-9). Die Verwendung des YEpFLAG-l-Vektorsystems zur Erzeugung des eukaryontischen Initiationsfaktors 5a (eIF5a; GenBank Zugangsnummer M23419) lieferte das rekombinante Protein in hoher Ausbeute und Reinheit (Schuster, M., et al., J Biotechnol, 2000. 84:237-48; Schuster, M., et al., J Biomol Screen, 2000. 5:89-97). Aufgrund dieser Vorteile wurde das Protein eIF5a als Gerüst für die Expression einer C-terminalen Zufallspeptidbibliothek ausgewählt. Zur Veranschaulichung des Funktionierens dieser Strategie wurden auf einen monoklonalen Antikörper gegen FVIII

NACHGEREICHT - *27 gerichtete Peptide entwickelt.

Etwa 30 % von an schwerer Hämophilie A leidenden Patienten entwickeln Antikörper gegen FVIII, welche die Wirkung der koagulationsfördernden Aktivität von intravenös injiziertem FVIII neutralisieren, wodurch die Wirkung einer Ersatztherapie zunichte gemacht wird. Es werden zwar verschiedene Epitope auf dem FVIII-Molekül an diese Antikörper gebunden, doch dominieren Inhibitoren, die an die C2-Domäne oder an die A2-Domäne von FVIII binden. Zur Identifizierung von FVIII-Mimotypen werden Phagen-Display-Bibliotheken verwendet (Villard, S., et al.,

Blood, 2003. 102:949-52; Villard, S., et al., J Biol Chem, 2002. 277:27232-9; Muhle, C., et al., Thromb Haemost, 2004. 91:619-25) .

Zur Bewertung der Wirksamkeit einer Unterbrechung der Interaktion zwischen dem FVIII-Molekül und seinen Inhibitoren durch Peptide, die aus einer in Hefe sekretierten erfindungsgemäßen Zufallsbibliothek stammen - zur Wiedererlangung der koagulationsfördernden Aktivität von FVIII - wurde ein Modellsystem untersucht. Der monoklonale Maus-Antikörper ESH8, ein gut charakterisierter Inhibitor, der an die C2-Domäne von FVIII bindet, wurde zum Screenen auf potentielle Bindungspeptide und zur Charakterisierung ihres Potentials bei der Unterbrechnung der Wechselwirkungen des Inhibitors mit FVIII verwendet.

In diesem Beispiel sind Design, Konstruktion, Expression und Screening einer Bibliothek von Zufallspolypeptiden beschrieben, die in den Kulturüberstand als F^isionsprodukte mit eIF5a sekretiert wurden. Weiters wurde die Leistungsfähigkeit dieser abgeleiteten Peptide bei der Wiederherstellung der koagulationsfördernden Aktivität von mit FVIII-Antikörpern inkubierten Plasmapräparationen untersucht.

Material und Verfahren

Konstruktion der Bibliothek

Es wurden allgemeine Verfahren zur DNA-Manipulation in vitro gemäß Sambrook et al. angewendet (Sambrook, J., et al.,

Molecular Cloning: A Labratory Manual. 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Labratory Press).

Randomisierte Peptide wurden unter Verwendung eines erstellten Leserahmens und dreier Nukleotidmischungen entsprechend den drei Kodonpositionen designt. Für die erste und die zweite Position jedes Tripletts wurden identische Mischungen aller vier

NACHGEREICHT

Nukleotide (,,N") verwendet. Die dritte Position hatte eine Mischung von dC und dG („S"). Auf diese Weise würde die Mischung nur 32 Tripletts anstelle von 64 enthalten, aber es wären alle 20 Aminosäuren vertreten und nur ein Terminationskodon (Amber) möglich. Die Oligonukleotid-Inserts wurden mittels PCR ampli-fiziert und unter Verwendung eines „MinElute PCR Purification Set" (Qiagen) gereinigt. Die gereinigten Zufallssequenzen wurden mit den Restriktionsenzymen Ncol und Cfr42l (beide von MBI Fermentas) verdaut.

Das Plasmid YEpFLAG-1 (Sigma) wurde als Klonier- und auch als Expressionsvektor verwendet. Im ersten Schritt wurde das Gen von eIF5a zwischen der EcoRI- und der Cfr42l-Stelle in YEpFLAG-1 insertiert. Im zweiten Schritt wurde die Zufallsbibliothek zwischen der Ncol-Stelle von eIF5a und der Cfr42l-Stelle des Plasmids insertiert.

Die resultierenden Konstrukte wurden durch Elektroporation zu kompetenten GeneHogs-E.-coli-Zellen (Invitrogen) transformiert. Die Plasmide wurden mittels eines „Plasmid Preparation Kit" (Maxi Kit, Qiagen) gewonnen und mit Hilfe eines Lithiumacetat-Verfahrens zum Hefe-Stamm BJ3505 (Sigma) transformiert und auf Platten enthaltend selektives „Synthetic Complete Medium" ohne Tryptophan (Sigma) gezüchtet.

Gen-Expression, Screening und Proteincharakterisierunq

Einzelklone wurden auf Mik^oplatten mit 96 Vertiefungen transferiert, die 200 μΐ flüssiges Medium, nämlich „Yeast Peptone High Stability Expressic^n Medium (YPHSM)", enthielten. Das Wachstum und die Induktion der Hefezellen erfolgte während 4 Tagen bei 28°C.

Die Kulturüberstände wurde Unter Verwendung eines Dotblot-Geräts (Bio-Rad) auf Protran-Nitrozellulosemembrane (Schleicher & Schuell) gespottet. Die Membrane wurden entweder mit murinem anti-FVIII-Antikörper ESH8 (American Diagnostica) oder mit dem anti-FLAG-Antikörper Ml (Sigma) inkubiert. Die Entwicklung der Blots erfolgte mit Hilfe eines anti-Maus-IgG-HRP-Konjugats (A-8429, Sigma) und von Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrat" (Pierce). Die Chemilumineszenzsignale wurden unter Verwendung eines Lumineszenz-Imagers (Boehringer Mannheim) detektiert.

Klone, die ein positives Signal abgaben, wurden für einen zweiten Screening-Schritt kultiviert. Die Membrane wurden noch-

NACHGEREICHT mals mit ESH8 und Ml inkubiert, wie bei der ersten Screening-Runde beschrieben; darüber hinaus wurde eine Membran mehr mit ESH8 in Anwesenheit von 10 IE/ml FVIII (Octapharma) inkubiert. Positive Klone wurden anhand der Stärke ihrer Chemilumineszenz-signale ausgewertet. Die Plasmide von den positiven Klonen wurden unter Verwendung eines „Yeast Plasmid Isolation Kit” (RPM) gewonnen und in E. coli amplifiziert. Nach der Plasmidreinigung erfolgte die Sequenzierung. Für die Kultivierung in größerem Maßstab wurden Übernacht-Kulturen der positiven Hefeklone zur Inokulation von YPHSM in Schüttelflaschen verwendet und 3 Tag lang bei 28°C gezüchtet.

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 10.000 x g 5 min lang entfernt. Die Überstände wurden sofort gefroren und bei -20°C aufbewahrt. Für die SDS-Elektrophorese und den Westernblot wurden die Kulturüberstände mit 4X „NuPage LDS Sample Buffer” (Invitrogen) und 0,2 M DTT vor dem Einfrieren gemischt.

Die SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 4-12 % „NuPage Novex Bis-Tris”-Gradientengelen (Invitrogen) in einem „Xcell Mini-Cell”-System (Novex) durchgeführt. Die Gele wurden mit „GelCode Blue Stain Reagent” (Pierce) gefärbt. Für den Westernblot wurden die Proteine mit Hilfe des „Xcell Mini-Cell”-Systems auf Protran-Nitrozellulosemembrane übertragen. Die Entwicklung der Blots erfolgte wie bei der Entwicklung der Dotblots beschrieben.

Die Konzentrationen der Fusionsproteine wurden mit Hilfe eines SPR-Verfahrens bestimmt. 6er monoklonale Antikörper M2 wurde mittels EDC/NHS-Chemie au^r-einem CM-5-Chip (BIACORE) immobilisiert. Die Bindung von FLAG-Fusionsproteinen generiert eine Antwort, die proportional zur gebundenen Masse ist. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von bakterieller Alkaliphosphatase (Sigma) als Referenz zur Berechnung der Proteinkonzentrationen herangezogen. Fähigkeit von Peptiden zur Neutralisierung eines gegen FVIII gerichteten Antikörpers

Der Antikörper ESH8 wurde in feststehender Konzentration zu „Normal Reference Plasma" (American Diagnostica) gegeben, was zu eine Reduktion der Wirksamkeit um 70 % führte. Nach der Zugabe von Kulturüberständen in Serienverdünnungen wurden die Mischungen 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Mit Hilfe eines „Coamatic FVIII Activity Kit” (Chromogenix) wurde die verbleibende FVIII-Aktivität bestimmt.

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Ergebnisse und Diskussion

Fig. 1 ist eine Darstellung des Workflow des Bibliothek-Designs, der Bibliothekskultivierung, des Screenings und der Charakterisierung von aus der Bibliothek stammenden Peptiden.

Synthetische Oligonukleotide, die zur Konstruktion der Bibliothek verwendet wurden, enthielten lange variable Abschnitte von 30 Zufallskodons, flankiert von konstanten Sequenzen an beiden Enden (Fig. 2). Jedes randomisierte Kodon („NNS") kodierte für alle 20 Aminosäuren, 30 Kodons wurden in einer Reihe angeordnet. Dadurch wurde eine Zufallsbibliothek für Peptide mit einer Länge von 30 Aminosäuren geschaffen. Am 3'-Terminus der Zufallssequenz wurde ein Stoppkodon (Ocker) platziert.

Zur Identifizierung von Peptiden, die an ESH8 binden, wurden die Kulturüberstände von 3.080 in Mikroplatten kultivierten

Einzelklonen gescreent. Für die zweite Screening-Runde wurden 88 Klone aus der ersten Screening-Runde gewählt. Ihre Überstände wurden auf Nitrozellulosemembrane gespottet und mit ESH8, ESH8 und FVIII sowie dem anti-FLAG-Antikörper Ml inkubiert (Fig. 3). Die Entwicklung erfolgte mit einem anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat. Die Fig. 3A und 3B zeigen, welche sekretierten Proteine an ESH8 und an ESH8 in Anwesenheit von FVIII banden. Unter konkurrierenden Bedingungen wurden weniger positive Dots erhalten. Die Inkubation mit dem anti-FLAG-An£ikörper Ml (Fig. 3C) ermöglichte die Schätzung der Menge von sekr^tiertem rekombinantem Protein. Als negative Kontrolle wurde eine Membran mit dem anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat allein inkubiert (Fig. 3D). Überstände von Klonen, die an ESH8 in Anwesenheit von FVIII und nicht an den zweiten Antikörper allein banden, wurden weiter charakterisiert.

Die Plasmide von zehn positiven Klonen wurden gewonnen und sequenziert. Die Peptidsequenzen und die Parameter der resultierenden Fusionsproteine sind in Tabelle 3 angeführt. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen, dass·die Leserahmen der Zufallssequenzen bei manchen Klonen beschädigt waren. Das könnte während der Oligonukleotidsynthese oder während der PCR des Oligonukleotids passiert sein. Diese Klone synthetisierten längere Peptide als beabsichtigt. Die Sequenzen der Zufallspeptide wurden mit der FVIII-Sequenz verglichen (Fig. 4). Für

NACHGEREICHT •· ·#·· ···· •· ·#·· ····

♦ · -*5ι die Peptide 033A8 und 033A9 konnten keine Sequenzhomologien gefunden werden. Die anderen Peptide zeigten kurze Konsensussequenzen mit den Al-, A2-, A3-, CI- oder C2-Domänen von FVIII.

Tabelle 4: I Sequenzen der Zufallspeptide und Konzentration, nachgewiesen in den Kulturüberständen ID Peptidsequenz cprot [pg/ml] 011F3 RHWTALGPAPTHTCADLNYPLLS 29 013H4 STKTLGRPLHGPAGPVEGGALAGVAEDADLVTAVSGR 36 015A2 YHCKREDLTDRDATCALRQPPQAVRGLGPRVTAVSGR 34 023D3 RRAEITHPGMMLASG 29 030C8 HNPFAIHRWECCTPALRALVGPDVQQLPVLTAVSGR 8 031D1 VVHLLALPALLAREVGPPQLGSLDPLPQRVTAVSGR 4 032H4 TALQVAAALDVGPLQGRQVQLGERLLPAREVTAVSCGRSS 20 033A8 NVGTCTSSPARCGWPRRRTSCAALAGLLV 48 033A9 KADILPEMNSMRADRM 40 034F10 WERGRRVGAQVRHARHLVARVLDGAGHQARLTAVNGP 9

In Fig. 5 sind die SDS-PAGE und Westernblots der Kultivierung der Klone in größerem Maßstab gezeigt.

Die verschiedenen Kulturüberstände wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Interaktion des monoklonalen Antikörpers ESH8 mit FVIII in einem FVIII-Aktivitätsässay zu hemmen. Untersucht wurden die Veränderungen der FVI^I-Aktivität bei konstanter ESH8-Konzentration in Anwesenheit abnehmender Mengen der Fusionsproteine (siehe Fig. 6) . Alle spezifischen Proteine senkten die Hemmwirkung von ESH8^ was zu höheren FVIII-Aktivitäten führte, wohingegen die Zugabe des Gerüstproteins eIF5a allein keine Wirkung auf die Aktivität zeigte.

Die neutralisierenden Eigenschaften der Proteine 013H4, 015A2, 023D3 und 031D1 wurden in einem anderen FVIII-Aktivitäts-test bestätigt, wo der Mengenbereich an zugegebenem Protein erweitert wurde (Fig. 7). Das Zufallspeptid von Klon 031D1 - das eine starke ESH8-Inhibition auch bei geringen Konzentrationen zeigte - zeigt drei Sequenzhomologien mit der C2-Domäne von FVIII (siehe Fig. 4E) . Die Motive SLDP, P-LL-R, VH—AL des Zufallspeptids ist in der FVIII-Sequenz von 2315Ser - 2338Leu zu finden. Das Motiv des Peptids 013H4 ST-TL ist in FVIII bei

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2138Ser - 2142Leu zu finden, das Motiv von 014A2 LR--PQ bei 2325Leu - 2330Gln. Das Peptid 023D3 zeigt keine Homologien mit der C2-Domäne.

Dieses System bietet ein rasches und einfaches Verfahren, mit dem lange Zufallsproteine exprimiert und anschließend auf ihre Interaktionen mit Zielproteinen gescreent werden können. Es wurde ein System zur Konstruktion verschiedener Bibliotheken von Zufallssequenzpeptiden als sekretierte Fusionsprodukte mit eIF5a designt und implementiert. Die durch den Alkohol-Dehydrogenase-Promotor regulierte Überexpression von neuen Genen gestattete die Herstellung von Fusionsproteinen in Konzentrationen von bis zu 80 % Gesamtprotein im Überstand. Die die Bibliothek tragenden Hefen wurden genauso leicht auf Mikroplattenebene wie in Schüttelflaschen kultiviert. Das Screenen dieser Bibliothek auf Bindungspartner konnte auf Nitrozellulosemembranen leicht durchgeführt werden. *

NACHGEREICHT

Claims (21)

1. • · • ·· #··♦ • ···· • · ·· · « · ·· 9 • · • · · • 9 • « • · · • 9 • · • · · • 9 999 ···« · 9 Patentansprüche: 1. .Vektorbibliothek umfassend eine Vielzahl von verschiedenen eukäryontischen Sekretionsvektoren, worin jeder Vektor unter der Steuerung von transkriptorischen und translatorischen Steuer-seqüenzen ein Gen umfasst, das für ein extrazelluläres lösliches Fusionspolypeptid kodiert und eine Kodiersequenz für ein an variable Kodiersequenzen für ein Peptid gekoppeltes Gerüst-polyjpeptid aufweist, wobei die Vektoren eine Kodiersequenz für ein Sekretionssignalpeptid umfassen, welches an das für das Fusionspolypeptid kodierende Gen gekoppelt ist.
2. 2. Bibliothek nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der eukaryontische Sekretionsvektor ein Hefe-, Säuger-, Insektenoder .Pflanzenvektor ist.
3. 3. Bibliothek nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sekretionssignalsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hefe-Mating-Faktor a, Hefe-Invertase-suc2-Leader, Hefe-saure-Phosphatase-phol-Leader, Hefe-saure-Phosphatase-pho5-Leader, Hefe-Inulinase-inulp-Leader, Hef e- a-Galaktosidase-Leader, Hefe-Killertoxin-Leadern, K28-Killervirus-pptox-Leader, Pflanzen-Chitinase-Leader, synthetischen Prepro-Leadern, nativer Prepro-Proteinsequenz.
4. 4. Bibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefevektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus YEpFLAG-1, pYES, pYC, p427-TEF, p417CYC, pTEF-MF, pGAL-MF, pESC-HIS, pESOLEU, pESC-TRP, pESC-URA.
5. 5. Bibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodiersequenz für das Peptid an das 3'-Ende des Gerüstpolypeptids gekoppelt ist.
6. 6. Bibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodiersequenz für eine Zufalls- oder Semizufallspeptidsequenz kodiert oder ein Fragment eines genomischen, Gen-, EST- oder mRNA-Nukleinsäuremoleküls ist.
7. 7. Bibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- NACHGEREICHT - 34 - 34 »··· ·· · · ·

   ·· ···· ♦ · · zeichnet, dass die Bibliothek eine Vielzahl von verschiedenen eukaryontischen Sekretionsvektoren, nämlich mindestens 2, vorzugsweise mindestens 10, bevorzugter mindestens 100, am meisten bevorzugt mindestens 1000, insbesondere mindestens 10.000, umfasst.
8. 8. Bibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstpolypeptid ein eukaryontischer Initiationsfaktor (elF) , vorzugsweise der eukaryontische Initiationsfaktor 5a (eIF5a) , insbesondere der humane eukaryontische Initiationsfaktor 5a (eIF5a), ist.
9. 9. Zellbibliothek umfassend Wirtszellen enthaltend die Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. 10. Wirtszelle umfassend einen Vektor der Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
11. 11. Zellbibliothek und Wirtszelle nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszellen Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise Zellen von Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Saccharomyces cerevisiae, Säuger-Wirtszellen oder Pflanzen-Wirtszellen sind.
12. 12. Verfahren zur Herstellung einer Peptidbibliothek, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen von Vektoren einer Vektorbibliothek nach einem der Ansprüche 1 bis 8, - Transferieren dieser Vektoren in Wirtszellen, - Isolieren von einen Einzelvektor enthaltenden Wirtszellen, - Kultivieren dieser Wirtszellen in einem Kulturmedium unter für die Expression der Fusionspolypeptide zweckmäßigen Bedingungen und gegebenenfalls - Isolieren der exprimierten Fusionspolypeptide aus dem Überstand des Kulturmediums.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszellen Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise Zellen von Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Saccharomyces cerevisiae, Säuger-Wirtszellen oder Pflanzen-Wirtszellen sind. ···· · ···♦ • · *!?5 *-* • ·· · • · · • · · • · · • «·· ·
14. 14. Verfahren zum Identifizieren eine Peptids mit gezielter biologischer Wirksamkeit oder mit Bindungskapazität an einen Bindungspartner, umfassend die folgenden Schritte: - Vorsehen eines durch ein Verfahren nach Anspruch 12 oder 13 erhältlichen Polypeptids, - Kontaktieren des Polypeptids mit einer Zielzelle oder einem Zielmolekül und - Bewerten der Fähigkeit des sekretierten Polypeptids, einen biologischen Prozess in einer Zielzelle zu regulieren oder an ein Zielmolekül zu binden.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ein Protein, insbesondere ein Enzym, ein Rezeptor ist.
16. 16. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Fusionspolypeptid enthaltend einen eukaryontischen Initiationsfaktor, vorzugsweise den eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), insbesondere den humanen eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), fusioniert an ein pharmazeutisch aktives Peptid.
17. 17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten oder Träger umfasst. 3? t'
18. 18. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an den C-Terminus des eukaryontischen Initiationsfaktors fusioniert ist.
19. 19. Vakzineformulierung umfassend ein Fusionspolypeptid enthaltend einen eukaryontischen Initiationsfaktor, vorzugsweise den eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), insbesondere den humanen eukaryontischen Initiationsfaktor 5a (eIF5a), fusioniert an ein antigenes Peptid.
20. 20. Formulierung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung weiters mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten oder Träger oder Hilfsstoff umfasst. NACHGEREICHT

    • ·· ···· · ···· ·· · · · «· · • * · · · • ψ · · · • · · · · ··· ···· · ··· ·
21. 21. Formulierung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an den C-Terminus des eukaryontischen Initiationsfaktors fusioniert ist. NACHGEREICHT