DE69839424T2 - Nukleinsäure bindende proteine - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-Bindeproteine. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Entwerfen eines Proteins, welches zum Binden an eine beliebige vordefinierte Nukleinsäuresequenz fähig ist.
- Protein-Nukleinsäure-Erkennung ist ein alltägliches Phänomen, welches für eine große Anzahl von biomolekularen Kontrollmechanismen wesentlich ist, welche das Funktionieren von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen regulieren. Zum Beispiel bilden Protein-DNA-Interaktionen die Basis der Genexpressionsregulation und sind daher einer der am meisten von Molekularbiologen untersuchten Gegenstände.
- Eine Fülle von biochemischen und strukturellen Information erklärt in zahlreichen Fällen die Details einer Protein-DNA-Erkennung in dem Ausmaß, in welchem allgemeine Erkennungsprinzipien zum Vorschein gekommen sind. Viele DNA-bindende Proteine enthalten unabhängig gefaltete Domänen für die DNA-Erkennung, und diese Domänen wiederum gehören zu einer großen Anzahl von strukturellen Familien, wie zum Beispiel die Leucinzipper-, die "Helix-Drehung-Helix"- und Zinkfingerfamilien.
- Trotz der großen Vielfalt von strukturellen Domänen leitet sich die Spezifität der bis heute beobachteten Interaktionen zwischen Protein und DNA am häufigsten von der Komplementarität der Oberflächen einer Protein-α-Helix und der DNA-Hauptfurche ab [Klug, (1993) Gene 135: 83–92]. In Hinblick auf die wiederauftretende physikalische Interaktion einer α-Helix und einer Hauptfurche besteht die quälende Möglichkeit, dass die Kontakte zwischen bestimmten Aminosäuren und DNA-Basen von einem einfachen Satz von Regeln beschrieben werden könnten; tatsächlich einem stereochemischen Erkennungscode, welcher eine primäre Proteinstruktur zu einer Präferenz der Bindestellen-Sequenz in Beziehung setzt.
- Es ist jedoch klar, dass kein Code gefunden wird, welcher eine DNA-Erkennung durch alle DNA-bindenden Proteine beschreiben kann. Die Strukturen von zahlreichen Komplexen zeigen signifikante Unterschiede auf die Weise, dass die Erkennungs-α-Helices von DNA-bindenden Proteinen von verschiedenen strukturellen Familien mit der DNA-Hauptfurche interagieren, was daher Ähnlichkeiten in den Erkennungsmustern ausschließt. Die Mehrzahl der bekannten DNA-bindenden Motive ist nicht besonders vielseitig, und beliebige Codes, welche auftreten könnten, würden wahrscheinlich die Bindung an sehr wenige verwandte DNA-Sequenzen beschreiben.
- Sogar innerhalb jeder Familie von DNA-bindenden Proteinen schien es überdies bisher so zu sein, dass das Entziffern eines Codes unzuverlässig sein würde. Aufgrund der Komplexität der Protein-DNA-Interaktion scheint es keine eine einfache "alphabetische" Äquivalenz zwischen den primären Strukturen von Proteinen und Nukleinsäuren zu geben, welche eine direkte Aminosäure-zu-Base-Beziehung spezifiziert.
- Die internationale Patentanmeldung
WO 96/06166 - Jedoch ist dieser Code unvollständig, wobei er keine spezifischen Instruktionen bereitstellt, welche die spezifische Nukleotidselektion verschieden von G in der 5'-Position von jedem Quadruplet erlauben. Das Verfahren basiert auf einer Randomisierung und nachfolgenden Selektion, um Nukleinsäure-Bindeproteine für andere Spezifitäten zu erzeugen. Sogar mit Hilfe von einer teilweisen Randomisierung und Selektion war jedoch weder das Verfahren, welches in
WO 96/06166 - Überdies gibt dieses Dokument an, dass Zinkfinger an ein Nukleinsäuretriplett oder mehrfaches davon binden. Wir haben jetzt bestimmt, dass Zinkfinger-Bindungsstellen durch Überlappen von 4-bp-Teilstellen bestimmt werden, und dass eine Sequenzspezifität an der Grenze zwischen Teilstellen aus einer Synergie zwischen benachbarten Fingern hervorgeht. Dies hat wichtige Folgen für den Entwurf und die Selektion von Zinkfingern mit neuen DNA-Bindungsspezifitäten.
- Suzuki und Yagi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12357–12361) offenbaren Entwurfsregeln für Zinkfingerproteine, welche ausschließlich einen Triplettentwurfscode verwenden.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung stellt einen vollständigeren Code bereit, welcher die Selektion von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz als Zielsequenz und den Entwurf eines spezifischen Nukleinsäure-Bindeproteins erlaubt, welches daran. bindet. Überdies stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, durch welches ein Zinkfingerprotein spezifisch für eine beliebige gegebene Nukleinsäuresequenz entworfen und optimiert werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb einen Erkennungscode, welcher für die Interaktionen von klassischen Zinkfingern mit Nukleinsäure aufgeklärt wurde. In diesem Fall wird ein Regelmuster bereitgestellt, welches Binden an alle Nukleinsäuresequenzen abdeckt.
- Der Code, welcher in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, berücksichtigt synergistische Interaktionen zwischen benachbarten Zinkfingern, was die Selektion von beliebigen gewünschten Bindungsstellen erlaubt.
- Gemäß einem erfindungsgemäßen ersten Aspekt stellen wir deshalb ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins bereit, welches an eine Ziel- Nukleotidsequenz bindet, wobei das Bindeprotein zwei oder mehr Zinkfinger der Cys2-His2-Klasse umfasst, wobei das Verfahren umfasst:
- (i) Auswählen eines Quadruplets innerhalb der Ziel-Nukleotidsequenz,
- (ii) Entwerfen des Bindeproteins, so dass Binden eines Zinkfingers an das Quadruplet erreicht wird, indem die Sequenz bestimmter Reste des Zinkfingers abhängig von der Nukleotidsequenz des Quadruplets wie folgt ausgewählt wird: (a) wenn Base 4 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Arg oder Lys, (b) wenn Base 4 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Glu, Asn oder Val, (c) wenn Base 4 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val oder Lys, (d) wenn Base 4 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val, Ala, Glu oder Asn, (e) wenn Base 3 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +3 in der α-Helix His, (f) wenn Base 3 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Asn, (g) wenn Base 3 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ala, Ser oder Val mit der Maßgabe, dass wenn es Ala ist, dann ist einer der Reste bei –1 oder +6 ein kleiner Rest, (h) wenn Base 3 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ser, Asp, Glu, Leu, Thr oder Val, (i) wenn Base 2 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Arg, (j) wenn Base 2 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Gln, (k) wenn Base 2 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position –1 in der α-Helix His oder Thr, (l) wenn Base 2 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Asp oder His, (m) wenn Base 1 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +2 Glu, (n) wenn Base 1 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +2 Arg oder Gln, (o) wenn Base 1 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +2 Asn, Gln, Arg, His oder Lys, (p) wenn Base 1 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +2 Ser oder, Thr,
- (iii) Synthetisieren eines Polynukleotids, welches das Bindeprotein aus (ii) kodiert,
- (iv) Inserieren der Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor,
- (v) Einführen des Expressionsvektors aus (iv) in eine Zelle, und
- (vi) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, unter welchen das kodierte Nukleinsäure-Bindeprotein exprimiert wird, wobei die Zinkfingerbindenden Motive die Struktur haben:
- Wie schon oben erwähnt, sind die Quadruplets überlappend, welche in der vorliegenden Erfindung spezifiziert sind, derartig, dass, wenn sie von 3' nach 5' auf dem -Strang der Nukleinsäure gelesen werden, Base 4 des ersten Quadruplets Base 1 des zweiten ist und so weiter. Folglich wird in der vorliegenden Anwendung auf die Basen von jedem Quadruplet durch eine Nummer von 1 bis 4 bezuggenommen, wobei 1 die 3'-Base ist und 4 die 5'-Base ist. Base 4 ist zu der 5'-Base eines klassischen Zinkfinger-Bindetripletts äquivalent.
- Alle nukleinsäurebindenden Restpositionen von Zinkfingern, auf welche hierin Bezug genommen wird, werden vom ersten Rest in der α-Helix des Fingers von +1 bis +9 nummeriert. "–1" bezieht sich auf den Rest in der Gerüststruktur, welcher direkt der α-Helix eines Cys2-His2-Zinkfingerpolypeptids vorangeht.
- Reste, auf welche hierin als "++2" bezuggenommen wird, sind Reste, welche in einem benachbarten (C-terminalen) Finger vorliegen. Sie spiegeln die synergistische Kooperation zwischen Position +2 auf Base 1 (auf dem +-Strang) und Position +6 des vorhergehenden (N-terminalen) Fingers auf Base 4 des vorhergehenden (3') Quadruplets wider, welche aufgrund der Überlappung dieselbe Base ist. Wenn es keinen C-terminalen benachbarten Finger gibt, arbeiten "++"-Interaktionen nicht.
- Cys2-His2-Zinkfingerbindeproteine, wie sie im Stand der Technik gut bekannt sind, binden an Zielnukleinsäuresequenzen über α-helikale Zinkmetallatom-koordinierte Bindemotive, welche als Zinkfinger bekannt sind. Jeder Zinkfinger in einem Zinkfinger-Nukleinsäure-Bindeprotein ist verantwortlich für die Bestimmung der Bindung an ein Nukleinsäurequadruplet in einer Nukleinsäure-Bindungssequenz. Vorzugsweise gibt es 2 oder mehr Zinkfinger in jedem Bindeprotein, zum Beispiel 2, 3, 4, 5 oder 6 Zinkfinger. Vorteilhafterweise gibt es 3 Zinkfinger in jedem Zinkfinger-Bindeprotein.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Produktion von dem, was im Wesentlichen künstliche Nukleinsäure-Bindeproteine sind. In diesen Proteinen können künstliche Aminosäureanaloga verwendet werden, um den Proteinen die gewünschten Eigenschaften zu verleihen, oder aus anderen Gründen. Daher bedeutet der Begriff "Aminosäure", insbesondere in einem Zusammenhang, worin auf eine "beliebige Aminosäure" Bezug genommen wird, eine beliebige Sorte von natürlichen oder künstlichen Aminosäuren oder Aminosäure-Analoga, welche in der Proteinkonstruktion gemäß Verfahren verwendet werden können, welche im Stand der Technik bekannt sind. Überdies kann eine beliebige spezifische Aminosäure, auf welche hierin Bezug genommen wird, durch ein funktionelles Analogon davon ersetzt werden, insbesondere ein künstliches funktionelles Analogon. Die hierin verwendete Nomenklatur umfasst deshalb spezifisch innerhalb seinen Umfangs funktionelle Analoga der definierten Aminosäuren.
- Die α-Helix eines Zinkfinger-Bindeproteins lagert sich antiparallel zum Nukleinsäurestrang, derartig, dass die primäre Nukleinsäuresequenz 3' nach 5' angeordnet ist, damit sie der N-terminalen zur C-terminalen Sequenz des Zinkfingers entspricht. Da Nukleinsäuresequenzen konventionell 5' nach 3' und Aminosäuresequenzen vom N-Terminus zum C-Terminus geschrieben werden, führt das dazu, dass, wenn eine Nukleinsäuresequenz und ein Zinkfingerprotein gemäß Konvention abgeglichen werden, die primäre Interaktion des Zinkfingers mit dem -Strang der Nukleinsäure stattfindet, da dieser Strang 3' nach 5' abgeglichen wird. Diese Konventionen werden in der hierin verwendeten Nomenklatur verwendet. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass in der Natur bestimmte Finger, wie zum Beispiel Finger 4 des Proteins GLI, an den +-Nukleinsäurestrang binden: siehe Suzuki et al. (1994) NAR 22: 3397–3405 und Pavletich und Pabo (1993) Science 261: 1701–1707. Es ist der Einschluß von derartigen Fingern in ein erfindungsgemäßes nukleinsäurebindendes Molekül vorgesehen.
- Die Erfindung stellt eine Lösung für ein Problem bereit, welches bisher im Stand der Technik ungelöst war, indem es den rationalen Entwurf von Polypeptiden ermöglicht, welche Nukleinsäurequadruplets binden, deren 5'-Rest anders als G ist. Insbesondere stellt die Erfindung zum ersten Mal eine Lösung für den Entwurf von Polypeptiden zum Binden von Quadruplets bereit, welche 5' A oder C enthalten.
- Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 erläutert Zinkfinger-DNA-Interaktionen. A: Modell von klassischen Triplettinteraktionen mit DNA-Basentripletts in Zif268; B: ähnliches Modell, welches Quadrupletinteraktionen zeigt; C: Modell für einen Bibliotheksentwurf zur Erkennungscodebestimmung. -
2 zeigt die Aminosäuresequenz von drei Fingern, welche zur Phage-Display-Selektion bei der Bestimmung von einem Erkennungscode verwendet wurden. -
3 listet die sequenzspezifischen Zinkfingerklone auf, welche durch Phagenselektionen erhalten wurden, und ihre Bindungsstellen-Signaturen. -
4 zeigt die Base/Aminosäure-Korrelation der Klone, welche mit Phagenselektionen isoliert wurden. Erkennungsmuster sind hervorgehoben. -
5 erläutert die sequenzspezifischen Interaktionen, nach welchen an Position 2 der α-Helix selektiert wurde, Binden an Position 1 des Quadruplets. -
6 erläutert den Entwurf eines Zinkfinger-Bindeproteins, welches für ein mutiertes G12V-ras-Onkogen spezifisch ist. -
7 erläutert die Bindungsspezifität des Bindeproteins für das Onkogen gegenüber der Wildtyp-ras-Sequenz: -
8 erläutert die Ergebnisse eines ELISA-Testes, welcher unter Verwendung des anti-ras-Bindeproteins mit sowohl Wildtyp-Zielnukleinsäuresequenzen als auch mutierten Zielnukleinsäuresequenzen durchgeführt wurde. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Position +6 in der α-Helix ist generell für die Interaktion mit der Base 4 eines gegebenen Quadruplets im Ziel verantwortlich. Erfindungsgemäß interagiert ein A an Base 4 mit Gln, Asn oder Val an Position +6, während ein C an Base 4 mit Ser, Thr, Val, Ala, Glu oder Asn interagiert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäure-Bindeproteinen, welche zum Binden an eine Nukleinsäure fähig sind. Während daher die Lösungen, welche durch die Erfindung bereitgestellt werden, zu einem funktionellen Nukleinsäure-Bindemolekül führen, ist es möglich, dass natürlicherweise auftretende Nukleinsäure-bindende Zinkfingermoleküle bestimmten oder allen hierin bereitgestellten Regeln nicht folgen können. Dies spielt keine Rolle, weil es das erfindungsgemäße Ziel ist, den Entwurf der nukleinsäurebindenden Moleküle auf der Nukleinsäuresequenzbasis zu ermöglichen, und nicht das Gegenteil. Deshalb stellen die Regeln in bestimmten Fällen eine Anzahl von Möglichkeiten für einen beliebigen gegebenen Rest bereit. In anderen Fällen können alternative Reste zu den gegebenen möglich sein. Die vorliegende Erfindung strebt es daher nicht an, jede Lösung für die Konstruktion eines Bindeproteins für eine gegebene Zielnukleinsäure bereitzustellen. Sie stellt jedoch das erste Mal eine vollständige Lösung bereit, welche ein funktionelles Nukleinsäure-Bindeprotein erlaubt, welches für ein beliebiges gegebenes Nukleinsäurequadruplet konstruiert werden soll.
- Wie schon oben erwähnt, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins bereit, welches an eine Ziel-Nukleotidsequenz bindet, wobei das Bindeprotein zwei oder mehr Zinkfinger der Cys2-His2-Klasse umfasst, wobei das Verfahren umfasst:
- (i) Auswählen eines Quadruplets innerhalb der Ziel-Nukleotidsequenz,
- (ii) Entwerfen des Bindeproteins, so dass Binden eines Zinkfingers an das Quadruplet erreicht wird, indem die Sequenz bestimmter Reste des Zinkfingers abhängig von der Nukleotidsequenz des Quadruplets wie folgt ausgewählt wird: (a) wenn Base 4 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Arg oder Lys, (b) wenn Base 4 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Glu, Asn oder Val, (c) wenn Base 4 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val oder Lys, (d) wenn Base 4 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val, Ala, Glu oder Asn, (e) wenn Base 3 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +3 in der α-Helix His, (f) wenn Base 3 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Asn, (g) wenn Base 3 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ala, Ser oder Val mit der Maßgabe, dass wenn es Ala ist, dann ist einer der Reste bei –1 oder +6 ein kleiner Rest, (h) wenn Base 3 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ser, Asp, Glu, Leu, Thr oder Val, (i) wenn Base 2 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Arg, (j) wenn Base 2 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Gln, (k) wenn Base 2 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position –1 in der α-Helix His oder Thr, (l) wenn Base 2 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Asp oder His, (m) wenn Base 1 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +2 Glu, (n) wenn Base 1 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +2 Arg oder Gln, (o) wenn Base 1 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +2 Asn, Gln, Arg, His oder Lys, (p) wenn Base 1 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +2 Ser oder Thr,
- (iii) Synthetisieren eines Polynukleotids, welches das Bindeprotein aus (ii) kodiert,
- (iv) Inserieren der Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor,
- (v) Einführen des Expressionsvektors aus (iv) in eine Zelle, und
- (vi) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, unter welchen das kodierte Nukleinsäure-Bindeprotein exprimiert wird, wobei die Zinkfingerbindenden Motive die Struktur haben:
- Das Vorangehende stellt einen Satz von Regeln dar, welche den Entwurf eines Zinkfinger-Bindeproteins erlauben, welches für eine beliebige gegebene Nukleinsäuresequenz spezifisch ist. Ein neuer Befund, welcher sich darauf bezieht, ist, dass Position +2 in der Helix für die Bestimmung der Bindung an Base 1 des Quadruplets verantwortlich ist. Indem es dies macht, kooperiert es synergistisch mit Position +6, welche Bindung an Base 4 im Quadruplet bestimmt, wobei die Basen 1 und 4 in benachbarten Quadruplets überlappen.
- Obwohl die Bindung von Zinkfinger-Polypeptiden an überlappende Quadrupletsequenzen berücksichtigt wird, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Bindung von Polypeptiden, welche entworfen werden sollen, an Zielsequenzen, welche kein Mehrfachens von überlappenden Quadruplets sind. Zum Beispiel kann ein Zinkfinger-Polypeptid zum Binden an eine palindromische Zielsequenz entworfen werden. Derartige Sequenzen werden allgemein zum Beispiel als Zielsequenzen eines Restriktionsenzyms gefunden.
- Vorzugsweise wird ein Zinkfinger, welcher an weniger als drei Nukleotide bindet, durch Spezifizieren von Aminosäuren im Zinkfinger geschaffen, wobei die Aminosäuren unfähig sind, eine H-Bindung mit der Nukleinsäure in der relevanten Position zu unterstützen.
- Vorteilhafterweise wird dies durch Substituieren von Gly an Position –1 erzielt (zum Eliminieren eines Kontaktes mit Base 2) und/oder Ala an Positionen +3 und/oder +6 (zum Eliminieren eines Kontaktes an der dritten bzw. vierten Base).
- Vorzugsweise sollte der Kontakt mit der endgültigen (3'-)Base in der Zielsequenz wenn notwendig durch Substituieren eines Restes an der relevanten Position verstärkt werden, welche einen direkten Kontakt mit dem Phosphatgerüst der Nukleinsäure bilden kann.
- Ein Zinkfinger-bindendes Motiv ist eine Struktur, welche den Fachleuten gut bekannt ist und zum Beispiel definiert ist in Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609–1614, Berg (1988) PNAS (USA) 85: 99–102, Lee et al. (1989) Science 245: 635–637, siehe Internationale Patentanmeldungen
WO 96/06166 WO 96/32475 - Wie hierin verwendet bezieht sich "Nukleinsäure" sowohl auf RNA und DNA, welche aus natürlichen Nukleinsäure-Basen oder synthetische Basen oder Mischungen davon konstruiert wurde. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Bindeproteine jedoch DNA-Bindeproteine.
-
- In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt können Zinkfinger-Nukleinsäurebindende Motive als Motive mit der folgenden primären Struktur dargestellt werden: wobei X (einschließend Xa, Xb und Xc) eine beliebige Aminosäure ist. X2-4 und X2-3 beziehen sich auf die Anwesenheit von 2 oder 4 beziehungsweise 2 oder 3 Aminosäuren. Die Cys- und His-Reste, welche zusammen das Zinkmetallatom koordinieren, sind in fettem Text markiert und sind normalerweise invariant, wie auch der Leu-Rest an Position +4 in der α-Helix.
- Modifikationen dieser Repräsentation können auftreten oder durch Insertion, Mutation oder Deletion von Aminosäuren bewirkt werden, ohne dass notwendigerweise die Zinkfingerfunktion verschwindet. Zum Beispiel ist es bekannt, dass der zweite His-Rest durch Cys ersetzt werden kann (Krizek et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 4518–4523), und dass Leu bei +4 in einigen Fällen durch Arg ersetzt werden kann. Der Phe-Rest vor X kann durch einen beliebigen Aromaten außer Trp ersetzt werden. Überdies haben Experimente gezeigt, dass Abweichungen von den bevorzugten Struktur- und Restzuweisungen für den Zinkfinger toleriert werden und sogar beim Binden an bestimmte Nukleinsäuresequenzen nützlich sein können. Sogar wenn man dies berücksichtigt, ändert sich die allgemeine Struktur, welche eine α-Helix koordiniert durch ein Zinkatom involviert, welches vier Cys- oder His-Reste kontaktiert, jedoch nicht. Wie hierin verwendet, werden die Strukturen (A) und (B) oben als eine beispielhafte Struktur betrachtet, welche alle Zinkfingerstrukturen des Cys2-His2-Typs darstellt.
- Vorzugsweise ist Xa F/Y-X oder P-F/Y-X. In diesem Zusammenhang ist X eine beliebige Aminosäure. Vorzugsweise ist X in diesem Zusammenhang E, K, T oder S. Weniger bevorzugt, aber ebenso vorgesehen sind Q, V, A und P. Die verbleibenden Aminosäuren bleiben möglich.
- Vorzugsweise besteht X2-4 aus zwei Aminosäuren anstatt aus vier. Die erste dieser Aminosäuren kann eine beliebige Aminosäure sein, aber S, E, K, T, P und R werden bevorzugt. Vorteilhafterweise ist sie P oder R. Die zweite dieser Aminosäuren ist vorzugsweise E, obwohl beliebige Aminosäuren verwendet werden können. Vorzugsweise wird X2-4 ausgewählt aus beliebigen von: Ser-X, Glu-X, Lys-X, Thr-X, Pro-X und Arg-X.
- Vorzugsweise ist Xb T oder I.
- Vorzugsweise ist Xc S oder T.
- Vorzugsweise ist X2-3 G-K-A, G-K-C, G-K-S oder G-K-G. Jedoch sind Abweichungen von den bevorzugten Resten möglich, zum Beispiel in Form von M-R-N oder M-R.
- Vorzugsweise ist X2-3 Gly-Lys-Ala, Gly-Lys-Cys, Gly-Lys-Ser, Gly-Lys-Gly, Met-Arg-Asn oder Met-Arg.
- Vorzugsweise ist der Linker T-G-E-K oder T-G-E-K-P.
- Wie oben dargestellt, treten die. hauptsächlichen Bindungsinteraktionen mit Aminosäuren –1, +2, +3 und +6 auf. Die Aminosäuren +4 und +7 sind in hohem Maße invariant. Die verbleibenden Aminosäuren können im Wesentlichen beliebige Aminosäuren sein. Vorzugsweise wird Position +9 durch Arg oder Lys besetzt. Vorteilhafterweise sind Positionen +1, +5 und +8 nicht hydrophobe Aminosäuren, d. h. nicht Phe, Trp oder Tyr.
- Indem das obige zusammengeführt wird, ermöglicht die Erfindung daher in einem am stärksten bevorzugten Aspekt die Definition von jedem Rest in einem Zinkfinger-Nukleinsäure-bindenden Motiv, welches spezifisch an ein gegebenes Nukleinsäurequadruplet bindet.
- Der Code, welcher durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, ist nicht vollkommen fest; bestimmte Wahlen werden ermöglicht. Zum Beispiel können die Positionen +1, +5 und +8 eine beliebige Aminosäure-Zuweisung haben, während andere Positionen bestimmte Optionen haben können: zum Beispiel ermöglichen die vorliegenden Regeln, dass zum Binden an einen zentralen T-Rest eine beliebige aus Ala, Ser oder Val bei +3 verwendet werden kann. Im weitesten Sinn stellt deshalb die vorliegende Erfindung eine sehr große Anzahl von Proteinen bereit, welche zum Binden an jedes definierte Zielnukleinsäurequadruplet fähig sind.
- Vorzugsweise kann jedoch die Anzahl von Möglichkeiten signifikant reduziert werden. Zum Beispiel können die unkritischen Reste +1, +5 und +8 durch die Reste Lys, Thr bzw. Gln als eine Voreinstellungsoption besetzt werden. Im Falle der anderen Wahlen kann zum Beispiel die zuerst gegebene Option als Voreinstellung verwendet werden. Daher ermöglicht der erfindungsgemäße Code den Entwurf eines einzelnen definierten Polypeptids (ein "Voreinstellungs"-Polypeptid), welches an sein Zielquadruplet bindet.
- In einem erfindungsgemäßen weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins der Cys2-His2-Zinkfingerklasse bereitgestellt, welches zum Binden an eine Ziel-Nukleinsäuresequenz fähig ist, umfassend die Schritte von:
- (a) Auswählen einer Modell-Zinkfingerdomäne aus der Gruppe bestehend aus natürlicherweise auftretenden Zinkfingern und Konsensus-Zinkfingern, und
- (b) Mutieren eine oder mehrere der Positionen –1, +2, +3 oder +6 des Fingers gemäß den oben dargestellten Regeln.
- Im Allgemeinen können natürlicherweise auftretende Zinkfinger aus denjenigen Fingern ausgewählt werden, für welche die Nukleinsäure-Bindungsspezifität bekannt ist. Zum Beispiel können dies die Finger sein, für welche eine Kristallstruktur bestimmt wurde: nämlich Zif 268 (Elrod-Erickson et al. (1996) Structure 4: 1171–1180), GLI (Pavletich und Pabo (1993) Science 261: 1701–1707), Tramtrack (Fairall et al. (1993) Nature 366: 483–487) und YY1 (Houbaviy et al. (1996) PNAS (USA) 93: 13577–13582).
- Vorzugsweise ist der Modell-Zinkfinger ein natürlich auftretender Zinkfinger, dessen Struktur aus einem Finger eines Proteins ausgewählt wird, welches aus der Gruppe bestehend aus Zif 268, GLI, Tramtrack und YY1 ausgewählt wird.
- Der natürlicherweise auftretende Zinkfinger 2 in Zif 268 ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt, von welchem ein Zinkfinger konstruiert werden soll, und wird bevorzugt.
- Konsensus-Zinkfingerstrukturen können durch Vergleichen der Sequenzen von bekannten Zinkfingern hergestellt werden, ungeachtet, ob ihre Bindedomäne bekannt ist. Vorzugsweise wird die Konsensusstruktur aus der Gruppe ausgewählt, welche aus der Konsensusstruktur PYKCPECGKSFSQKSDLVKHQRTHTG und der Konsensusstruktur PYKCSECGKAFSQKSNLTRHQRIHTGEKP besteht.
- Die Konsensussequenzen werden vom Konsensus abgeleitet, welcher von Krizek et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 4518–4523 und von Jacobs (1993) Doktorarbeit, Universität Cambridge, UK, bereitgestellt wurde. In beiden Fällen können die Linkersequenzen, welche oben zum Verbinden von zwei Zinkfingermotiven beschrieben sind, nämlich TGEK oder TGEKP, an den Enden des Konsensus' gebildet werden. Wenn notwendig, kann daher ein P entfernt werden, oder im Falle des Konsensus', welcher mit TG endet, kann EK (P) hinzugefügt werden.
- In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das Bindeprotein zwei oder mehr Zinkfinger-bindende Motive, welche N-terminal nach C-terminal angeordnet sind.
- Weiterhin wird bevorzugt, dass dem N-terminalen Zinkfinger ein Leaderpeptid mit der Sequenz Met-Ala-Glu-Glu-Lys-Pro vorangeht.
- Wenn die Nukleinsäurespezifität des ausgewählten Modellfingers bekannt ist, kann die Mutation des Fingers zum Modifizieren seiner Spezifität zum Binden an die Zielnukleinsäure auf Reste gerichtet werden, von welchen bekannt ist, dass sie eine Bindung an Basen betreffen, an welchen sich die natürlichen und gewünschten Ziele unterscheiden. Anderenfalls sollte sich die Mutation der Modellfinger auf die Reste –1, +2, +3 und +6 wie durch die vorangehenden Regeln ermöglicht konzentrieren.
- Um ein Bindeprotein mit verbesserter Bindung herzustellen, können überdies die Regeln, welche durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, durch physikalisches oder virtuelles Modellieren der Proteins/Nukleinsäure-Schnittstelle supplementiert werden, um die Restselektion zu unterstützen.
- Erfindungsgemäß konstruierte Zinkfinger-bindende Motive können in Nukleinsäure-Bindeproteinen mit einer Vielzahl von Zinkfingern kombiniert werden. Vorzugsweise haben die Proteine wenigstens zwei Zinkfinger. In der Natur haben Zinkfinger-Bindeproteinen allgemein wenigstens drei Zinkfinger, obwohl Proteine mit zwei Zinkfingern wie zum Beispiel Tramtrack bekannt sind. Die Anwesenheit von wenigstens drei Zinkfingern wird bevorzugt. Bindeproteine können durch Verbinden der benötigten Finger von Ende zu Ende, N-Terminus nach C-Terminus konstruiert werden. Vorzugsweise wird dies bewirkt durch Verbinden der relevanten Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen, welche die Zinkfinger kodieren, um eine zusammengesetzte kodierende Sequenz herzustellen, welche das vollständige Bindeprotein kodiert. Die Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins wie oben definiert bereit, wobei das Nukleinsäure-Bindeprotein durch rekombinante DNA-Technologie konstruiert wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- (a) Herstellen einer Nukleinsäure kodierend eine Sequenz kodierend zwei oder mehr Zinkfinger-bindende Motive wie oben definiert, welche N-terminal nach C-terminal angeordnet sind,
- (b) Inserieren der Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, und
- (c) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle, um das Nukleinsäure-Bindeprotein zu erhalten.
- Ein "Leader" peptid kann zum N-terminalen Finger hinzugefügt werden. Vorzugsweise ist das Leaderpeptid MAEEKP.
- Die Nukleinsäure, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, kann für weitere Manipulation in Vektoren eingeschlossen werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich Vektor (oder Plasmid) auf diskrete Elemente, welche zum Einführen einer heterologen Nukleinsäure in Zellen entweder für eine Expression oder Replikation davon verwendet werden. Auswahl und Verwendung von derartigen Vehikeln liegt innerhalb des Könnens des Fachmanns. Viele Vektoren sind verfügbar, und die Auswahl von einem geeignetem Vektor hängt von der beabsichtigten Verwendung des Vektors ab, d. h. ob er zur DNA-Amplifizierung oder für eine Nukleinsäureexpression verwendet werden soll, der Größe der DNA, welche in den Vektor inseriert werden soll, und der Wirtszelle, welche mit dem Vektor transformiert werden soll. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, welche von ihrer Funktion (DNA-Amplifizierung oder DNA-Expression) und der Wirtszelle abhängig sind, für welche er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten schließen generell ein oder mehrere des Folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor, eine Transkriptionsterminationssequenz und eine Signalsequenz.
- Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten generell eine Nukleinsäuresequenz, welche dem Vektor ermöglichen, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Typischerweise ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz derartig, dass sie es ermöglicht, den Vektor unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und schließt Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen ein. Derartige Sequenzen sind für eine Anzahl von Bakterien, Hefe und Viren gut bekannt. Der Replikationsursprung vom pBR322-Plasmid ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (z. B. SV 40, Polyom, Adenovirus) sind für Klonierungsvektoren in Säugerzellen geeignet. Generell wird die Replikationsursprungskomponente nicht für Säugetier-Expressionsvektoren gebraucht, wenn diese nicht in Säugerzellen verwendet werden, welche für einen hohen Grad an DNA-Replikation kompetent sind, wie zum Beispiel COS-Zellen.
- Die meisten Expressionsvektoren sind Shuttlevektoren d. h. sie sind fähig zur Replikation in wenigstens einer Organismenklasse, können aber in eine andere Organismenklasse zur Expression transfiziert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor in E. coli kloniert, und dann wird derselbe Vektor in Hefe oder Säugerzellen transfiziert, auch wenn er nicht unabhängig vom Wirtszellchromosom replizieren kann. DNA kann ebenso durch Insertion ins Wirtsgenom repliziert werden. Jedoch ist die Gewinnung von genomischer DNA, welche das Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, komplexer als die von einem exogen replizierten Vektor, weil ein Restriktionsenzymverdau zum Ausschneiden der Nukleinsäure-Bindeprotein-DNA benötigt wird. DNA kann durch PCR amplifiziert werden und direkt in die Wirtszellen ohne jede Replikationskomponente transfiziert werden.
- Vorteilhafterweise kann ein Expressions- und Klonierungsvektor ebenso ein Selektionsgen enthalten, worauf als selektierbarer Marker bezuggenommen wird. Dieses Gen kodiert ein Protein, welches für das Überleben oder Wachstum von transformierten Wirtszellen, welche in einem selektiven Kulturmedium wachsen gelassen werden, notwendig ist. Wirtszellen, welche nicht mit dem Vektor transformiert sind, welcher das Selektionsgen enthält, werden nicht im Kulturmedium überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, welche einen Widerstand gegenüber Antibiotika und anderen Toxinen bilden, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, auxotrophe Mängel komplementieren oder kritische Nährstoffe bereitstellen, welche in komplexen Medien nicht verfügbar sind.
- Als ein selektiver Genmarker, welcher für Hefe geeignet ist, kann ein beliebiges Markergen verwendet werden, welches die Selektion für Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Hefemarker sind zum Beispiel diejenigen, welche Widerstand gegenüber den Antibiotika G418, Hygromycin oder Bleomycin bilden oder eine Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante ermöglichen, zum Beispiel das URA3-, LEU2-, LYS2-, TRP1- oder HIS3-Gen.
- Da die Vektorreplikation praktischerweise in E. coli durchgeführt wird, werden ein genetischer E.-coli-Marker und ein E.-coli-Replikationsursprung vorteilhafterweise eingeschlossen. Diese können von E.-coli-Plasmiden erhalten werden, wie zum Beispiel pBR322, dem Bluescript( c )-Vektor oder einem pUC-Plasmid, z. B. pUC18 oder pUC19, welche beide einen E.-coli-Repiikationsursprung und einen genetischen E.-coli-Marker enthalten, welcher Widerstand gegenüber Antibiotika bildet, wie zum Beispiel Ampicillin.
- Geeignete selektierbare Marker für Sängerzellen sind diejenigen, welche die Identifizierung einer Zelle ermöglichen, welche zur Aufnahme einer Nukleinsäure eines Nukleinsäure-Bindeproteins kompetent ist, wie zum Beispiel Dihydrofolat-Reduktase (DHFR, Methotrexatwiderstand), Thymidinkinase oder Gene, welche Widerstand gegenüber G418 oder Hygromycin bilden. Die Säugerzellen- Transformanten werden unter Selektionsdruck gebracht, welcher nur diejenigen Transformanten an ein alleiniges Überleben adaptiert, welche den Marker aufgenommen haben und exprimieren. Im Falle eines DHFR- oder Glutaminsynthasemarkers (GS-Markers) kann ein Selektionsdruck durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen erzeugt werden, unter welchen der Druck progressiv erhöht wird, was zu einer Amplifizierung (an seiner chromosomalen Integrationsstelle) von sowohl des Selektionsgens als auch der verbundenen DNA, welche das Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, führt. Amplifizierung ist das Verfahren, durch welches Gene bei einem größeren Bedarf für die Produktion eines Proteins, welches für das Wachstum kritisch ist, zusammen mit nahe assoziierten Genen, welche ein gewünschtes Protein kodieren können, in einem Tandem innerhalb der Chromosomen von rekombinanten Zellen wiederholt werden. Erhöhte Mengen von gewünschtem Protein werden normalerweise mit einer derartig amplifizierten DNA synthetisiert.
- Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen Promotor, welcher durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operativ mit einer Nukleinsäure verbunden ist, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert. Ein derartiger Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Die Promotoren werden mit DNA, welche das Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, durch Entfernen des Promotors von der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau und durch Inserieren der isolierten Promotorsequenz in den Vektor operativ verbunden. Sowohl die native Promotorsequenz eines Nukleinsäure-Bindeproteins als auch viele heterologe Promotoren können zur direkten Amplifizierung und/oder zur Expression einer DNA, welche ein Nukleinsäurebindeprotein kodiert, verwendet werden.
- Promotoren, welche zur. Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, schließen zum Beispiel die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme, alkalische Phosphatase, das Tryptophan-Promotorsystem (Trp-Promotorsystem) und Hybridpromotoren wie zum Beispiel den tac-Promotor ein. Ihre Nukleotidsequenzen wurden publiziert, was es dem Fachmann ermöglicht, sie operativ an DNA zu ligieren, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, wobei Linker oder Adapter verwendet werden, um die benötigten Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten ebenso generell eine Shine-Dalgarno-Sequenz operativ verbunden mit der DNA, welche das Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert.
- Bevorzugte Expressionsvektoren sind bakterielle Expressionsvektoren, welche einen Promotor eines Bakteriophagen wie zum Beispiel Phagex oder T7 umfassen, welcher in den Bakterien funktionieren kann. In einem der am weitesten verbreitet verwendeten Expressionssysteme kann die Nukleinsäure, welche das Fusionsprotein kodiert, vom Vektor durch T7-RNA-Polymerase transkribiert werden (Studier et al., Methods in Enzymol. 185: 60–89, 1990). Im E.-coli-BL21-(DE3)-Wirtsstamm, welcher in Verbindung mit pET-Vektoren verwendet wird, wird die T7-RNA-Polymerase vom λ-lysogenen DE3 im Wirtsbakterium hergestellt, und seine Expression ist unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren lac-UV5-Promotors. Dieses System wurde erfolgreich für die Überproduktion von vielen Proteinen verwendet. Alternativ kann das Polymerasegen auf einem Lambda-Phagen durch Infektion mit einem int-Phagen wie zum Beispiel dem CE6-Phagen eingeführt werden, welcher kommerziell verfügbar ist (Novagen, Madison, USA). Andere Vektoren schließen Vektoren ein, welche den Lambda-PL-Promotor wie zum Beispiel PLEX (Invitrogen, NL) enthalten, Vektoren, welche die trc-Promotoren wie zum Beispiel pTrcHisXpressTm (Invitrogen) oder pTrc99 (Pharmacia Biotech, SE) enthalten, oder Vektoren, welche den tac-Promotor wie zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Biotech) oder PMAL (New England Biolabs, MA, USA) enthalten.
- Überdies schließt das erfindungsgemäße Nukleinsäure-Bindeprotein-Gen vorzugsweise eine Sekretionssequenz ein, um eine Sekretion des Polypeptids von bakteriellen Wirten zu erleichtern, derartig, dass es als ein lösliches natives Peptid hergestellt wird anstatt in einem Inklusionskörper. Das Peptid kann ggf. aus dem bakteriellen periplasmatischen Raum oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
- Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefewirten können reguliert werden oder sind konstitutiv und werden vorzugsweise von einem hoch exprimierten Hefegen abgeleitet, insbesondere einem Saccharomyces-cerevisiae-Gen. Daher kann der Promotor des TRP1-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, des Säurephosphatasegens (PH05-Gens), ein Promotor eines Gens, welches ein Pheromon für den a- oder α-Faktor zur Hefepaarung kodiert, oder ein Promotor, welcher von einem Gen abgeleitet wird, welches ein glykolytisches Enzym kodiert wie zum Beispiel der Promotor der Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(GAP), 3-Phosphoglyceratkinase-(PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glukose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- oder Glukokinasegene oder ein Promotor vom TATA-Bindeproteingen (TBP-Gen) verwendet werden. Außerdem ist es möglich, Hybridpromotoren zu verwenden, welche stromaufwärtige Aktivierungssequenzen (upstream activation sequences UAS) von einem Hefegen und stromabwärtige Promotorelemente umfassen, welche eine funktionelle TATA-Box von einem anderen Hefegen einschließen, zum Beispiel einen Hybridpromotor, welcher ein oder mehrere UAS des Hefe-PH05-Gens und stromabwärtige Promotorelemente einschließt einschließend eine funktionelle TATA-Box des Hefe-GAP-Gens (PH05-GAP-Hybridpromotor). Ein geeigneter konstitutiver PHO5-Promotor ist z. B. ein gekürzter Säurephosphatase-PH05-Promotor ohne die stromaufwärtigen regulatorischen Elemente (UAS) wie zum Beispiel das PH05-Promotorelement (–173-Promotorelement), welches bei Nukleotid –173 beginnt und bei Nukleotid –9 des PH05-Gens endet.
- Eine Transkription eines Nukleinsäure-Bindeprotein-Gens von Vektoren in Säugetier-Wirten kann durch Promotoren kontrolliert werden, welche von den Virengenomen abgeleitet werden, wie zum Beispiel Polyomvirus, Adenovirus, Geflügelpockenvirus, Rinder-Papillomvirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus (CMV), von einem Retrovirus und Affen-Virus 40 (SV40), von heterologen Säugetier-Promotoren wie zum Beispiel dem Aktin-Promotor oder einem sehr starken Promotor, z. B. einem ribosomalen Proteinpromotor und vom Promotor, welcher normalerweise mit einer Nukleinsäure-Bindeproteinsequenz assoziiert ist, unter der Voraussetzung, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
- Eine Transkription einer DNA, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Inserieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind relativ unabhängig von der Orientierung und der Position. Viele Enhancersequenzen sind von Säugetiergenen bekannt (z. B. Elastase und Globin). Jedoch wird typischerweise ein Enhancer von einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwendet. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270) und den Enhancer des frühen CMV-Promotors ein. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur Nukleinsäure-Bindeprotein-DNA gespleißt werden, ist aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
- Vorteilhafterweise kann ein eukaryotischer Expressionsvektor, welcher ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, eine Locus-Kontrollregion (locus control region LCR) umfassen. LCRs sind fähig, eine Transgenexpression zu steuern, welche von einer Stelle mit hohem Integrationsniveau unabhängig ist, wobei das Transgen in das Wirtszellchromatin integriert ist, was insbesondere von Wichtigkeit ist, wenn das Nukleinsäure-Bindeprotein-Gen im Zusammenhang einer dauerhaft transfizierten eukaryotischen Zelllinie exprimiert werden soll, in welcher eine chromosomale Integration des Vektors stattgefunden hat, oder in transgenen Tieren.
- Eukaryotische Vektoren können ebenso Sequenzen enthalten, welche für die Transkriptionstermination und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind allgemein in den 5' und 3'-nichttranslatierten Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, welche wie polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Anteil der mRNA transkribiert werden, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert.
- Ein Expressionsvektor schließt einen beliebigen Vektor ein, welcher fähig ist, Nukleinsäuren eines Nukleinsäure-Bindeproteins zu exprimieren, welche operativ mit regulatorischen Sequenzen verbunden sind, wie zum Beispiel Promotorregionen, welche zur Expression von derartigen DNAs fähig sind. Daher bezieht ein Expressionsvektor sich auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie zum Beispiel ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderer Vektor, welcher/welches nach Einführung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind den Fachleuten gut bekannt und schließen diejenigen ein, welche in eukaryotischen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, welche episomal bleiben, oder diejenigen, welche ins Wirtszellgenom integrieren. Zum Beispiel können DNAs, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodieren, in einen Vektor inseriert werden, welcher für eine cDNA-Expression in Säugerzellen geeignet ist, z. B. ein CMV-Enhancer-basierter Vektor wie zum Beispiel pEVRF (Matthias et al. (1989) NAR 17, 6418).
- Besonders geeignet zum Ausführen der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, welche die transiente Expression von DNA, welche ein Nukleinsäure-Bindeprotein kodiert, in Säugerzellen ermöglichen. Eine transiente Expression involviert normalerweise die Verwendung von einem Expressionsvektor, welcher fähig ist, wirksam in einer Wirtszelle zu replizieren, derartig, dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Nukleinsäure-Bindeproteingehalte synthetisiert. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind transiente Expressionssysteme geeignet z. B. zum Identifizieren von Mutanten eines Nukleinsäure-Bindeproteins, zum Identifizieren möglicher Phosphorylierungsstellen oder zum Charakterisieren funktioneller Domänen des Proteins.
- Eine erfindungsgemäße Vektorkonstruktion verwendet konventionelle Ligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form wieder ligiert, um die benötigten Plasmide zu erzeugen. Wenn gewünscht, wird eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden auf bekannte Weise durchgeführt. Geeignete Verfahren zum Konstruieren von Expressionsvektoren, zur Herstellung von in-vitro-Transkripten, zum Einführen von DNA in Wirtszellen und zur Durchführung von Analysen zum Beurteilen einer Nukleinsäure-Bindeprotein-Expression und -funktion sind den Fachleuten bekannt. Die Anwesenheit eines Gens, die Amplifizierung und/oder Expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, zum Beispiel durch konventionelles Southernblotten, Northernblotten, um die mRNA-Transkription zu quantifizieren, Dot-Blotten (DNA- oder RNA-Analyse) oder in-situ-Hybridisierung, welche eine geeignete markierte Sonde verwendet, welche auf einer hierin bereitgestellten Sequenz basieren kann. Die Fachleute werden leicht erkennen, wie diese Verfahren wenn gewünscht modifiziert werden können.
- In Übereinstimmung mit einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Zellen bereitgestellt, welche die oben beschriebenen Nukleinsäuren enthalten. Derartige Wirtszellen wie zum Beispiel Prokaryoten, Hefe und höhere Eukaryotenzellen können zum Replizieren von DNA und Herstellen des Nukleinsäure-Bindeproteins verwendet werden. Geeignete Prokaryoten schließen Eubakterien ein, wie zum Beispiel gramnegative oder grampositive Organismen, wie zum Beispiel E. coli, z. B. die E.-coli-K12-Stämme DH5a und HB101, oder Bazillen. Weitere Wirte, welche für die Nukleinsäure-Bindeprotein-kodierenden Vektoren geeignet sind, schließen eukaryotische Mikroben wie zum Beispiel filamentöse Pilze oder Hefe ein, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Höhere eukaryotische Zellen schließen Insekten- und Vertebratenzellen ein, insbesondere Säugerzellen, welche menschliche Zellen einschließen, oder kernhaltige Zellen von anderen multizellulären Organismen. In den letzten Jahren wurde die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ein Routineverfahren. Beispiele von geeigneten Säugetier-Wirtszelllinien sind epitheliale oder fibroblastische Zelltlinien wie zum Beispiel Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), NIH-3T3-Zellen, HeLa-Zellen oder 293T-Zellen. Die Wirtszellen, auf welche sich diese Offenbarung bezieht, umfassen Zellen in in-vitro-Kultur, als auch Zellen, welche sich innerhalb eines Wirtstieres befinden.
- DNA kann stabil in Zellen eingeschlossen werden oder kann transient exprimiert werden, wobei Verfahren verwendet werden, welche im Stand der Technik bekannt sind. Stabil transfizierte Säugerzellen können durch Transfizieren von Zellen mit einem Expressionsvektor mit einem selektierbaren Markergen und Wachsenlassen der transfizierten Zellen unter Bedingungen hergestellt werden, welche für Zellen selektiv sind, welche das Markergen exprimieren. Zum Herstellen transienter Transfektanten werden Sängerzellen mit einem Reportergen zum Überwachen der Transfektioneffizienz transfiziert.
- Zum Herstellen derartig stabil oder transient transfizierter Zellen sollten die Zellen mit einer hinreichenden Menge von der Nukleinsäure-Bindeprotein-kodierenden Nukleinsäure transfiziert werden, um das Nukleinsäure-Bindeprotein zu bilden. Die präzisen DNA-Mengen, welche das Nukleinsäure-Bindeprotein kodieren, können empirisch bestimmt und für eine bestimmte Zelle und einen bestimmten Test optimiert werden.
- Wirtszellen werden mit den oben dargestellten Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transfiziert oder vorzugsweise transformiert und in konventionellen Nährstoffmedien kultiviert, welche so modifiziert sind, damit sie zum Induzieren von Promotoren, zum Selektieren von Transformanten oder zum Amplifizieren von Genen geeignet sind, welche die gewünschten Sequenzen kodieren. Heterologe DNA kann in Wirtszellen durch ein beliebiges Verfahren eingeführt werden, welches im Stand der Technik bekannt ist, wie zum Beispiel durch Transfektion mit einem Vektor, welcher eine heterologe DNA kodiert, durch die Calciumphosphat-Kopräzipitationstechnik, oder durch Elektroporation. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Eine erfolgreiche Transfektion wird generell anerkannt, wenn irgendein Hinweis auf die Wirkung von diesem Vektor in der Wirtszelle auftritt. Eine Transformation wird erzielt, indem Standardtechniken verwendet werden, welche für die bestimmten verwendeten Wirtszellen geeignet sind.
- Eine Aufnahme von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, Transfektion von eukaryotischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder eine Kombination von Plasmidvektoren jeweils kodierend ein oder mehrere unterschiedene Gene, oder mit linearer DNA und eine Selektion von transfizierten Zellen ist im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch], Zweite Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press).
- Transfizierte oder transformierte Zellen werden kultiviert, indem Medien und Kulturverfahren verwendet werden, welche im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise unter Bedingungen, unter welchen das Nukleinsäure-Bindeprotein, welches durch die DNA kodiert wird, exprimiert wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Medien ist den Fachleuten bekannt, so dass sie leicht hergestellt werden können. Geeignete Kulturmedien sind ebenso kommerziell verfügbar.
- In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ebenso Mittel bereit, durch welche das Binden des Proteins, welches gemäß den Regeln entworfen wird, durch Randomisieren der Proteine und Selektieren auf verbesserte Bindung verbessert werden kann. In diesem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung des Verfahrens dar, welches in
WO 96/06166 - Vorzugsweise umfasst deshalb das erfindungsgemäße Verfahren die weiteren Schritte des Randomisierens der Sequenz der Zinkfinger-bindenden Motive an ausgewählten Stellen, des Screenens der erhaltenen randomisierten Moleküle und des Selektierens der Moleküle mit den vorteilhaftesten Eigenschaften. Generell werden diejenigen Moleküle, welche eine höhere Affinität und/oder Spezifität der Ziel-Nukleinsäuresequenz zeigen, ausgewählt.
- Mutagenese und Screenen von Zielnukleinsäuremolekülen kann durch ein beliebiges geeignetes Mittel erzielt werden. Vorzugsweise wird die Mutagenese auf der Ebene der Nukleinsäure durchgeführt, zum Beispiel durch Synthetisieren neuer Gene, welche mutierte Proteine kodieren, und deren Exprimieren, um eine Anzahl von verschiedenen Proteinen zu erhalten. Alternativ können selbst existierende Gene derartig durch ortsgerichtete Mutagenese oder Zufallsmutagenese mutiert werden, um die gewünschten mutierten Gene zu erhalten.
- Mutationen können durch ein beliebiges Verfahren erzeugt werden, welches den Fachleuten bekannt ist. Bevorzugt ist eine Mutagenese einer Nukleinsäuresequenz, welche das interessierende Protein kodiert, jedoch ortsgerichtet. Eine Anzahl von Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese ist im Stand der Technik bekannt, von Verfahren, welche einen einzelsträngigen Phagen wie zum Beispiel M13 verwenden, bis zu PCR-basierten Techniken (siehe "PCR Protocols: A guide to methods and applications [PCR-Protokolle: Ein Leitfaden zu Verfahren und Anwendungen]", MA. Innis, D. H. Geifand, J. J. Sninsky, T. J. White (Hrsg.). Academic Press, New York, 1990). Vorzugsweise kann das kommerziell verfügbare Veränderte-Stelle-II-Mutagenesesystem (Promega) gemäß den Anweisungen verwendet werden, die der Hersteller gegeben hat.
- Screenen der Proteine, welche durch mutierte Gene hergestellt werden, wird vorzugsweise durch Exprimieren der Gene und Testen der Bindefähigkeit des Proteinprodukts durchgeführt. Ein einfaches und vorteilhafterweise schnelles Verfahren, durch welches dies ausgeführt werden kann, ist Phage-Display, in welchem die mutierten Polypeptide als Fusionsproteine mit den Hüllenproteinen von filamentösen Bakteriophagen exprimiert werden, wie zum Beispiel das kleine Hüllenprotein pII des m13-Bakteriophagen oder Gen III des Fd-Bakteriophagen, und Präsentieren auf dem Kapsid des Bakteriophagen, welcher mit den mutierten Genen transformiert ist. Die Ziel-Nukleinsäuresequenz wird als eine Sonde zum direkten Binden des Proteins auf der Phagenoberfläche und Auswählen des Phagen, welcher vorteilhafte Mutanten besitzt, durch Affinitätsreinigung verwendet. Der Phage wird dann durch Passage durch einen bakteriellen Wirt amplifiziert und weiteren Runden von Selektion und Amplifizierung unterzogen, um den Mutantenpool für den gewünschten Phagen anzureichern und gegebenenfalls den bevorzugten Klon (die bevorzugten Klone) zu isolieren. Eine detaillierte Methodologie für Phage-Display ist im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel in
US-Patent 5,223,409 ; Choo und Klug (1995) Current Opinions in Biotechnology 6: 431–436; Smith (1985) Science 228: 1315–1317; und McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552–554 dargestellt. - Vektorsysteme und Kits für Phage-Display sind kommerziell verfügbar, zum Beispiel von Pharmacia.
- Wie schon oben beschrieben, umfassen die oben beschriebenen Verfahren daher vorzugsweise die zusätzlichen Schritte von einer oder mehreren Runden der Randomisierung und Selektion des Nukleinsäure-Bindeproteins, um dessen Merkmale zu verbessern. Vorzugsweise wird die Randomisierung und Selektion durch Phage-Display-Technologie durchgeführt. In diesem Zusammenhang wird bevorzugt, dass das Verfahren die Schritte umfasst:
- (a) Herstellen eines Nukleinsäurekonstrukts, welches ein Fusionsprotein umfassend das Nukleinsäure-Bindeprotein und ein kleines Hüllprotein eines filamentösen Bakteriophagen exprimiert,
- (b) Herstellen weiterer Nukleinsäurekonstrukte, welche ein Fusionsprotein umfassend ein selektiv mutiertes Nukleinsäure-Bindeprotein und ein kleines Hüllprotein eines filamentösen Bakteriophagen exprimieren,
- (c) Bewirken der Expression der in den Schritten (a) und (b) definierten Fusionsproteine auf der Oberfläche eines mit den Nukleinsäurekonstrukten transformierten Bakteriophagen, und
- (d) Testen der Fähigkeit des Bakteriophagen, die Ziel-Nukleinsäuresequenz zu binden, und Selektieren desjenigen Bakteriophagen, welcher überlegene Bindungsmerkmale zeigt.
- Randomisierung der erfindungsgemäß hergestellten Zinkfinger-bindenden Motive wird vorzugsweise auf diejenigen Reste gerichtet, für welche der hierin bereitgestellte Code eine Wahl von Resten ergibt. Deshalb werden zum Beispiel die Positionen +1, +5 und +8 vorteilhafterweise randomisiert, während vorzugsweise hydrophobe Aminosäuren vermieden werden; Positionen, welche in das Binden an die Nukleinsäure involviert sind, insbesondere –1, +2, +3 und +6, können ebenso randomisiert werden, vorzugsweise innerhalb der Wahlen, welche durch die erfindungsgemäßen Regeln bereitgestellt werden.
- Vorzugsweise kann deshalb das "Voreinstellungs"-Protein, welches gemäß den Regeln hergestellt wird, welche durch die Erfindung bereitgestellt werden, verbessert werden, indem das Proteins einer oder mehreren Runden von Randomisierung und Selektion innerhalb der spezifizierten Parameter unterzogen wird.
- Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Zinkfingerproteine derartig randomisiert werden, dass 2 oder mehr Reste zusammen randomisiert werden. Zum Beispiel wird es bevorzugt, dass Reste –1 und +6 von benachbarten Zinkfingern in einem Zinkfingerprotein zusammen randomisiert werden. Vorzugsweise wird Position +6 eines Zinkfingers und Positionen –1, +1, +2 und +3 eines benachbarten Zinkfingers zusammen randomisiert. Dies spiegelt eine Kooperativität zwischen benachbarten Zinkfingern wider, was sich im Binden von Positionen +2 und +6 von benachbarten Zinkfingern an dieselbe Position auf gegenüberliegenden Strängen der DNA-Doppelhelix widerspiegelt und es ermöglicht, dass jede mögliche Tripelverbindungsbasensequenz spezifiziert wird. Weiterhin wird es bevorzugt, dass das Nukleinsäure-Bindeprotein an einer beliebigen der Positionen –1, +5, +8, –1, +2, +3 oder +6 selektiv randomisiert wird. Stärker bevorzugt wird im Nukleinsäure-Bindeprotein Position +6 eines Zinkfingers und Positionen –1, +1, +2 und +3 eines benachbarten Zinkfingers randomisiert.
- Erfindungsgemäße Nukleinsäure-Bindeproteine können in einer großen Vielfalt von Anwendungen, welche Diagnostika einschließen, und als Forschungswerkzeuge verwendet werden. Vorteilhafterweise können sie als diagnostische Werkzeuge zum Identifizieren der Anwesenheit von Nukleinsäuremolekülen in einer komplexen Mischung verwendet werden. Erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Moleküle können ein einzelnes verändertes Basenpaar in Zielnukleinsäuremolekülen unterscheiden.
- Folglich stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls bereit, umfassend die Schritte:
- (a) Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins, welches spezifisch für das Ziel-Nukleinsäuremolekül ist, durch das Verfahren wie oben beschrieben,
- (b) Aussetzen eines Testsystems umfassend das Ziel-Nukleinsäuremolekül gegenüber dem Nukleinsäure-Bindeprotein unter Bedingungen, welche ein Binden unterstützen, und Entfernen aller Nukleinsäure-Bindeproteine, welche ungebunden bleiben, und
- (c) Detektieren der Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins in dem Testsystem.
- Erfindungsgemäß wird die Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins im Testsystem mittels eines Antikörpers detektiert. Weiterhin wird bevorzugt, dass das Nukleinsäure-Bindeprotein bei der Verwendung auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen präsentiert wird und die Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins durch Detektieren des Bakteriophagen oder eines Bestandteils davon detektiert wird.
- In einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Moleküle in einen ELISA-Test eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann Phage-Display der erfindungsgemäßen Moleküle zum Detektieren der Anwesenheit der Zielnukleinsäure verwendet werden und unter Verwenden von einem enzymgebundenen Anti-Phagen-Antikörper visualisiert werden.
- Weitere Verbesserungen zur Verwendung von Zinkfinger-Phagen zur Diagnose können zum Beispiel durch Koexprimieren eines Markerproteins fusioniert mit dem kleinen Hüllenprotein (gVIII) von Bakteriophagen gemacht werden. Da eine Detektion mit einem Anti-Phagen-Antikörper dann überflüssig sein würde, würden Zeit und Kosten von allen Diagnosen weiter reduziert. Abhängig von den Erfordernissen könnten geeignete Marker zum Präsentieren fluoreszierende Proteine (A. B. Cubitt et al. (1995) Trends Biochem Sci. 20, 448–455; T. T. Yang et al. (1996) Gene 173, 19–23) oder ein Enzym wie zum Beispiel alkalische Phosphatase, welche früher auf gIII präsentiert wurde (J. McCafferty, R. H. Jackson, D. J. Chiswell, (1991) Protein Engineering 4, 955–961) einschließen. Markieren verschiedener Typen von diagnostischem Phagen mit unterschiedenen Markern würde multiplexes Screenen einer einzelnen Nukleinsäureprobe erlauben. Dennoch ist die grundlegende ELISA-Technik sogar in Abwesenheit von derartigen Verbesserungen zuverlässig, schnell, einfach und besonders billig. Überdies benötigt sie keine spezialisierte Vorrichtung, noch verwendet sie gefährliche Reagenzien wie zum Beispiel radioaktive Isotope, weshalb sie zur Routineverwendung in der Klinik geeignet ist. Der hauptsächliche Vorteil des Protokolls ist, dass es eine Gelelektrophorese überflüssig macht und so den Weg zu einer automatisierten Nukleinsäurediagnose öffnet.
- Die Erfindung stellt Nukleinsäure-Bindeproteine bereit, welche mit einer ausgezeichneten Spezifität konstruiert werden können. Die Erfindung eignet sich deshalb zum Entwurf von jedem Molekül, dessen spezifische Nukleinsäurebindung benötigt wird. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Proteine bei der Herstellung von chimären Restriktionsenzymen verwendet werden, in welchen eine Nukleinsäure-Spaltungsdomäne mit einer Nukleinsäure-Bindedomäne fusioniert ist, welche einen Zinkfinger wie hierin beschrieben umfasst.
- Ebenso sind therapeutische Mittel und Verfahren offenbart, welche eine Verwendung von Nukleinsäure-Bindeproteinen involvieren, wie sie hierin beschrieben sind. Offenbart ist die Verwendung von Polypeptidfusionen, welche eine Integrase umfassen, wie zum Beispiel eine virale Integrase, und ein Nukleinsäure-Bindeprotein, wie es hierin beschrieben ist, für Zielnukleinsäuresequenzen in vivo (Bushman (1994) PNAS (USA) 91: 9233–9237). In Gentherapie-Anwendungen kann das Verfahren zum Einbringen von funktionellen Genen in fehlerhafte Gene angewendet werden, oder zum Einbringen von anti-Sense-Nukleinsäure, um eine unerwünschte Nukleinsäure zu zerstören. Alternativ können Gene in bekannte repetitive Nukleinsäurefolgen, wie zum Beispiel Zentromere, zusammen mit einer aktivierenden Sequenz wie zum Beispiel einem LCR eingebracht werden. Dies würde einen Weg zur sicheren und vorhersagbaren Nukleinsäureaufnahme ins Genom darstellen.
- In konventionellen therapeutischen Anwendungen können Nukleinsäure-Bindeproteine, wie sie hierin beschrieben sind, zum spezifischen Knock-out einer Zelle mit mutierten vitalen Proteinen verwendet werden. Wenn zum Beispiel auf Zellen mit mutiertem ras gezielt wird, werden sie zerstört, weil ras für das zelluläre Überleben essentiell ist. Alternativ kann die Wirkung von Transkriptionsfaktoren moduliert werden, vorzugsweise reduziert, indem der Zelle Mittel verabreicht werden, welche an die Bindungsstelle binden, welche für den Transkriptionsfaktor spezifisch ist. Zum Beispiel kann die Aktivität von HIV-tat durch Bindeproteine reduziert werden, welche für HIV-TAR spezifisch sind.
- Überdies können Bindeproteine, wie sie hierin beschrieben sind, mit toxischen Molekülen gekoppelt werden, wie zum Beispiel Nukleasen, welche irreversible Nukleinsäureschaden und Zelltod verursachen können. Derartige Mittel sind fähig, Zellen, welche eine Mutation in ihren endogenen Nukleinsäuren umfassen, selektiv zu zerstören.
- Nukleinsäure-Bindeproteine und Derivate davon wie oben angegeben können ebenso zur Infektionsbehandlung und Entsprechendem in Form von organismusspezifischen antibiotischen oder antiviralen Wirkstoffen angewendet werden. In derartigen Anwendungen können die Bindeproteine mit einer Nuklease oder einem anderen Kern-Toxin gekoppelt werden und spezifisch auf die Nukleinsäuren von Mikroorganismen gezielt werden.
- Ebenso offenbart sind pharmazeutische Präparate, welche als aktive Bestandteile die Verbindungen, wie sie hierin beschrieben sind, oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon enthalten, und Verfahren zu ihrer Herstellung.
- Die pharmazeutischen Präparate, wie sie hierin beschrieben sind, welche die Verbindungen, wie sie hierin beschrieben sind, oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon enthalten, sind zur enteralen, wie zum Beispiel oralen, außerdem zur rektalen und parenteralen Verabreichung an ein warmblütiges Tier/warmblütige Tiere, wobei der pharmakologische aktive Bestandteil allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vorliegt. Die tägliche Dosis des aktiven Bestandteils hängt vom Alter und dem individuellen Zustand und ebenso von der Verabreichungsweise ab.
- Die neuen pharmazeutischen Präparate enthalten zum Beispiel von etwa 10% bis etwa 80%, vorzugsweise von etwa 20% bis etwa 60%, des aktiven Bestandteils. Pharmazeutische Präparate, wie sie hierin beschrieben sind, zur enteralen oder parenteralen Verabreichung liegen zum Beispiel in Einheitsdosierung vor, wie zum Beispiel zuckerbeschichteten Tabletten, Tabletten, Kapseln oder Suppositorien und außerdem Ampullen. Diese werden in einer Weise hergestellt, welche per se bekannt ist, zum Beispiel durch konventionelles Mischen, Granulieren, Zuckerbeschichtung, Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Daher können pharmazeutische Präparate zur oralen Verwendung erhalten werden durch Verbinden des aktiven Bestandteils mit festen Trägern, wenn gewünscht Granulieren der erhaltenen Mischung und Verarbeiten der Mischung oder Granula, wenn gewünscht oder notwendig nach Hinzugeben von geeigneten Hilfsstoffen, um Tabletten oder zuckerbeschichtete Tablettenkerne zu ergeben.
- Geeignete Träger sind insbesondere Füllstoffe, wie zum Beispiel Zucker, zum Beispiel Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosepräparationen und/oder Calciumphosphate, zum Beispiel Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, außerdem Binder, wie zum Beispiel Stärkepaste, wobei zum Beispiel Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Gelatine, Tragacanth, Methylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon verwendet werden, wenn gewünscht Sprengmittel, wie zum Beispiel die oben erwähnten Stärken, außerdem Carboxymethylstärke, kreuzverbundenes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat; Hilfsstoffe sind in erster Linie Gleitmittel, Flussregulatoren und Schmiermittel, zum Beispiel Kieselsäure, Talk, Stearinsäure oder Salze davon, wie zum Beispiel Magnesium- oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglykol. Zuckerbeschichtete Tablettenkerne werden mit geeigneten Überzügen bereitgestellt, welche wenn gewünscht gegenüber Magensaft resistent sind, wobei unter anderem konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, welche wenn gewünscht Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid enthalten, Beschichtungslösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelmischungen oder Lösungen von geeigneten Cellulosepräparationen für die Herstellung von Magensaftresistenten Überzügen, wie zum Beispiel Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat. Farbstoffe oder Pigmente, zum Beispiel zum Identifizieren oder zum Bezeichnen verschiedener Dosierungen des aktiven Bestandteils, können zu den Tabletten oder zuckerbeschichtete Tablettenüberzügen hinzugegeben werden.
- Andere oral verwendbare pharmazeutische Präparate sind Hartgelatinekapseln und ebenso weiche geschlossene Kapseln, welche aus Gelatine und einem Plastifizierer gemacht werden, wie zum Beispiel Glycerin oder Sorbitol. Die Hartgelatinekapseln können den aktiven Bestandteil in Form von Granula enthalten, zum Beispiel in einer Mischung mit Füllstoffen wie zum Beispiel Lactose, Bindern wie zum Beispiel Stärken, und/oder Schmiermitteln wie zum Beispiel Talk oder Magnesiumstearat und, wenn gewünscht, Stabilisierern. In weichen Kapseln wird der aktive Bestandteil vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert, wie zum Beispiel Fettölen, Paraffinöl oder flüssigen Polyethylenglykolen, wobei es ebenso möglich ist, Stabilisierer hinzuzugeben.
- Geeignete rektal verwendbare pharmazeutische Präparate sind zum Beispiel Suppositorien, welche aus einer Kombination des aktiven Bestandteils mit einer Suppositorienbasis bestehen. Geeignete Suppositorienbasen sind zum Beispiel natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffin-Kohlenwasserstoffe, Polyethylenglykole oder höhere Alkanole. Außerdem können rektale Gelatinekapseln, welche eine Kombination des aktiven Bestandteils mit einer Basissubstanz enthalten, ebenso verwendet werden. Geeignete Basissubstanzen sind zum Beispiel flüssige Triglyceride, Polyethylenglykole oder Paraffin-Kohlenwasserstoffe.
- Geeignete Präparate für eine parenterale Verabreichung sind in erster Linie wässrige Lösungen eines aktiven Bestandteils in wasserlöslicher Form, zum Beispiel ein wasserlösliches Salz, und außerdem Suspensionen des aktiven Bestandteils, wie zum Beispiel geeignete ölige Injektionssuspensionen, wobei geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel verwenden werden, wie zum Beispiel Fettöle, zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride, oder wässrige Injektionssuspensionen, welche viskositätserhöhende Substanzen enthalten, zum Beispiel Natrium-Carboxymethylcellulose, Sorbitol und/oder Dextran und, wenn notwendig, ebenso Stabilisierer.
- Die Dosis des aktiven Bestandteils hängt von der warmblütigen Tierspezies, dem Alter und dem individuellen Zustand und der Verabreichungsweise ab. Im Normalfall wird eine ungefähre tägliche Dosis von etwa 10 mg bis etwa 250 mg für eine orale Verabreichung an einen Patienten mit einem Gewicht von annähernd 75 kg geschätzt.
- Die Erfindung wird unten nur für den Zweck der Erläuterung in den folgenden Beispielen beschrieben.
- Beispiel 1
- Bestimmung von Bindungsstellenpräferenzen in Zinkfingern
- Entwerfen von Phage-Dispay-Bibliotheken für Zinkfinger
- Es wird die Zinkfinger-DNA-Erkennung an der Schnittstelle zwischen benachbarten DNA-Teilstellen studiert, wobei eine Phage-Display-Bibliothek für Zinkfinger verwendet wird. Diese Bibliothek basiert auf der dreifingerigen DNA-bindenden Domäne von Zif268, enthält aber Aminosäurerandomisierungen von Finger 2 (F2) und Finger 3 (F3) an Restpositionen, welche ein Netzwerk von Kontakten über die Schnittstelle ihrer DNA-Teilstellen bilden könnten. Der detaillierte Entwurf der Bibliothek wird in
1c zusammen mit den generischen DNA-Bindungsstellen gezeigt, welche in Selektionen verwendet werden. Kurz gesagt enthält die Bibliothek Randomisierungen bei F2-Restposition 6 (danach bezeichnet F2 [+6]) und F3-Restpositionen –1, +1, +2 und +3 (danach bezeichnet F3 [–1], F3 [+2] etc.). - Es werden Bibliotheksselektionen ausgeführt, wobei DNA-Bindungsstellen verwendet werden, welche dem Zif268-Operator ähneln, welche aber systematische Basenkombinationen im DNA-Dublett enthalten, welches den Basenschritt zwischen den DNA-Teilstellen von F2 und F3 bildet. DNA-Bindungsstellen liegen in der generischen Form 5'-GNX-XCG-GCG-3' vor, wobei X-X eine gegebene Kombination der Basen an der Schnittstelle zwischen den DNA-Teilstellen bezeichnet und N bezeichnet, dass die vier Basen an DNA-Position 3 gleichermaßen repräsentiert sind. Daher wird den Interaktion zwischen F3 [+3] und Nukleotidposition 3N in diesem Experiment vollständige Freiheit ermöglicht. Dieses Merkmal der Bibliothek ermöglicht eine Selektion einer großen Familie (oder Datenbank) von verwandten Zinkfingern, welche eine gegebene Basenkombination an den Nukleotidpositionen 4X und 5X binden, welche aber infolge verschiedener Interaktionen mit der mittleren Base in der nominalen Triplett-Teilstelle von F3 nicht identisch sind.
- Die erste Bibliothek LIB-A, welche konstruiert werden soll, enthält Randomisierungen an F2-Restposition 6 und F3-Restpositionen –1, 1, 2 und 3 (siehe
2 ) und wird sortiert, wobei die DNA-Sequenz 5'GNX-XCG-GCG-3' verwendet wird, wobei X-X eine bekannte Kombination der zwei Basen an DNA-Positionen 4X und 5X bezeichnet und N eine gleiche Wahrscheinlichkeit von einer beliebigen der vier Basen an DNA-Position 3 bezeichnet. Die zweite Bibliothek LIB-B enthält Randomisierungen an F2-Restposition 6 und F3-Restpositionen –1 und 2 und wird sortiert, wobei die DNA-Sequenz 5'-GCX-XCG-GCG3' verwendet wird, wobei X-X eine bekannte Kombination der zwei Basen an DNA-Positionen 4X und 5X bezeichnet. - Die Gene für die zwei verschiedenen Phage-Display-Bibliotheken für Zinkfinger werden von vier synthetischen DNA-Oligonukleotiden durch eine direktionale Ende-zu-Ende-Ligation assembliert, wobei drei kurze komplementäre DNA-Linker verwendet werden. Die Oligonukleotide enthalten selektiv randomisierte Codons (der Sequenz NNS; N = A/C/GR, S = G/C) an den geeigneten Aminosäurepositionen der Finger 2 und 3. Die Konstrukte werden durch PCR amplifiziert, welche Primer verwendet, welche Not-I- und Sfi-I-Restriktionsstellen enthalten, mit den obigen Endonukleasen verdaut, um Klonierungsüberhänge herzustellen, und in den Phagenvektor Fd-Tet-SN ligiert. Elektrokompetente E.-coli-TG-1-Zellen werden mit dem rekombinanten Vektor transformiert und auf TYE-Medium (1,5% Agar, 1% Bacto-Trypton, 0,5% Bakto-Hefeextrakt, 0,8% NaCl) platiert, welches 15 μg/ml Tetracyclin enthält.
- Diese Freiheit zu einigen Protein-DNA-Interaktionen, welche nicht untersucht sind, ist eine geeignete Strategie, welche auf eine Erhöhung der Klondiversität gerichtet ist, welche mit einem beliebigen Selektionsexperiment erhalten werden kann. Jedoch ist es gleichzeitig wichtig, die Anzahl von Kontakten zu begrenzen, welche eine beliebige kontextmäßige Freiheit ermöglichen, anderenfalls besteht die Gefahr, dass ein Teilsatz von besonders starken intermolekularen Interaktionen die Selektionen beherrschen wird. Um diese Möglichkeit zu antizipieren, wird ebenso eine kleinere Unterbibliothek geschaffen, welche randomisierte Reste nur an Positionen F2 [+6] und F3 [–1 und +2] enthält und deshalb keine kontextmäßige Selektionsfreiheit erlaubt. Klone, welche aus dieser Bibliothek ausgewählt werden, werden mit einem Asterisken markiert, wenn sie hierin diskutiert werden.
- Experimentelle Strategie
- Phagenselektionen von den zwei Zinkfingerbibliotheken werden getrennt durchgeführt, um die Diversität der DNA-Sequenzen zu bestimmen, welche spezifisch durch Mitglieder von jeder Bibliothek gebunden werden können. Sechzehn Selektionen werden mit jeder Bibliothek durchgeführt, wobei die verschiedenen DNA-Bindungsstellen verwenden werden, welche allen 16 möglichen Basenkombinationen an den Nukleotidpositionen 4X und 5X entsprechen. Die DNA-Bindungsstelle, welche zum Auswählen spezifisch bindender Phagen verwendet wird, ist auf einer festen Oberfläche immobilisiert, während ein 10facher Überschuss von jeder der anderen 15 DNA-Stellen in Lösung als ein spezifischer Kompetitor vorliegt.
- Phagenselektionen
- Tetracyclin-resistente Kolonien werden von Platten in 2 × TY-Medium (16 g/Liter Bacto-Trypton, 10 g/Liter Bakto-Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl), welches 50 μM ZnCl2 und 15 μg/ml Tetracyclin enthält, übertragen und über Nacht bei 30°C in einem Schüttelinkubator kultiviert. Der geklärte Kulturüberstand, welcher Phagenpartikel enthält, wird durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 300 g erhalten.
- Biotinylierte DNA-Zielstellen (1 pmol) werden an Streptavidin-beschichtete Röhrchen (Boehringer Mannheim) gebunden. Phagenüberstandslösungen werden 1:10 in PBS-Selektionspuffer verdünnt (PBS, welche 50 μM ZnCl2, 2% Marvel, 1% Tween, 20 μg/ml beschallte Lachssamen-DNA, 10 pmol/ml jedes der anderen 15 möglichen unbiotinylierten DNA-Stellen enthält), und 1 ml wird in jedes Röhrchen bei 20°C für 1 Stunde gebracht. Nach dieser Zeit werden die Röhrchen geleert und 20-mal mit PBS enthaltend 50 μM ZnCl2, 2% Marvel und 1% Tween gewaschen. Die zurückgehaltenen Phagen werden in 0,1 ml 0,1 M Triethylamin eluiert und mit einem gleichen Volumen 1 M Tris (pH 7,4) neutralisiert. E. coli TG-1 in der logarithmischen Phase (0,5 ml) werden mit eluierten Phagen infiziert (50 μl) und zur Herstellung von Phagenüberständen für nachfolgende Selektionsrunden verwendet. Nach 3 Selektionsrunden werden E. coli platiert, welche mit selektierten Phagen infiziert sind. Einzelne Kolonien werden gepickt und verwendet, um Phagen für Bindungsstellen-Signaturtests und DNA-Sequenzierung wachsen zu lassen.
- Nach drei Runden von Phagenselektion gegen eine bestimmte DNA-Bindungsstelle werden einzelne Zinkfingerklone gewonnen, und die DNA-Bindungsspezifität von jedem Klon wird durch das Bindungsstellen-Signaturverfahren bestimmt. Dies involviert Screenen jedes Zinkfinger-Phagen nach Binden an acht verschiedene Bibliotheken der DNA-Bindungsstelle, welche derartig entworfen sind, dass jede Bibliothek eine fixierte Base und eine randomisierte Base an jeder der Positionen 4X und 5X enthält (d. h. Bibliotheken GN, AN, TN, CN und NG, NA, NT, NC). Daher ist jede der 16 DNA-Bindungsstellen, welche in Selektionsexperimenten verwendet werden, durch eine einzigartige Kombination von zwei Bibliotheken spezifiziert – zum Beispiel liegt die DNA-Bindungsstelle, welche 4G5G enthält, in nur zwei der acht Bibliotheken vor, in welchen im relevanten Dublett ein Nukleotid randomisiert ist und das andere Nukleotid als Guanin fixiert ist, d. h. in den Bibliotheken 4G5N und 4N5G. Die acht DNA-Bibliotheken, welche in Bindungsstellen-Signaturen verwendet werden, werden auf einer Mikrotiterplatte angeordnet, und Zinkfinger-Phagenbindung wird durch Phagen-ELISA detektiert. Die Bindungsmuster an die acht DNA-Bibliotheken zeigen die DNA-Sequenzspezifität (oder -präferenz) von jedem Phagenklon, und nur diejenigen Klone, für welche gefunden wird, dass sie relativ spezifisch sind, werden danach sequenziert, um die Identität der Aminosäuren zu zeigen, welche in den randomisierten Zinkfingerrest-Positionen vorhanden sind.
- Das Verfahren ist wie früher beschrieben (Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11163–11167; Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11168–11172). Kurz gesagt werden 5'-biotinylierte positionell randomisierte Oligonukleotidbibliotheken, welche Zif268-Operatorvarianten enthalten, durch Primerverlängerung wie beschrieben synthetisiert. DNA-Bibliotheken (0,4 pmol/Loch für LIB-A und 1,2 pmol/Loch für LIB-B) werden zu Streptavidin-beschichteten ELISA-Löchern (Boehringer-Mannheim) in PBS hinzugegeben, welche 50 μM ZnCl2 (PBS/Zn) enthalten. Eine Phagenlösung (Überstand einer über-Nacht-Bakterienkulter verdünnt 1:10 in PBS/Zn, welche 2% Marvel, 1% Tween und 20 μg/ml beschallte Lachssamen-DNA enthält) wird in jedes Loch eingebracht (50 μl/Loch). Man lässt für eine Stunde bei 20°C binden. Ungebundener Phage wird durch sechsmaliges Waschen mit PBS/Zn entfernt, welches 1% Tween enthält, dann durch dreimaliges Waschen mit PBS/Zn. Gebundene Phagen werden durch ELISA mit Meerretiichperoxidase-konjugiertem anti-M13-IgG (Pharmacia Biotech) detektiert und quantifiziert, wobei SOFFMAX 2.32 (Molecular Devices) verwendet wird.
- Die kodierende Sequenz von einzelnen Zinkfingerklonen wird durch PCR amplifiziert, welche externe Primer verwendet, welche komplementär zur Phagensequenz sind. Diese PCR-Produkte werden manuell sequenziert, wobei eine Sequenzierung durch Thermo-Sequenase-Zyklus (Amersham Life Science) verwendet wird.
- Analyse von Zinkfingern, welche durch Phagen selektiert wurden
-
3 zeigt die Bindungsstellen-Signaturen von relativ sequenzspezifischen Zinkfinger-Phagen, welche aus beiden Bibliotheken ausgewählt werden, wobei die 16 verschiedenen DNA-Dubletts verwendet werden, welche den Basenschritt zwischen den DNA-Teilstellen von Fingern 2 und 3 bilden. Die Ergebnisse zeigen, dass Zinkfingerklone ausgewählt werden, welche spezifisch an fast alle Teilstellen binden, wobei diejenigen Tripletts eingeschlossen sind, in welchen die 5' Position (Nukleotid 5X im Modellsystem) als eine Base fixiert wird, welche von Guanin verschieden ist. Insgesamt zeigen die Selektionen, dass eine beliebige der vier Basen sowohl an die 5'- als auch an die 3' Positionen einer nominalen Triplett-Teilstelle spezifisch gebunden werden kann. Die Ergebnisse werden in4 zusammengefasst. - Selektionen von der kleineren Teilbibliothek ergeben Finger, welche spezifisch an nur 8 der 16 Dubletts binden können, während Mitglieder der größeren Bibliothek Finger ergeben, welche 15 der 16 Dubletts erkennen. Es ist nicht bekannt, ob dieser Effizienzunterschied daraus entsteht, dass mehr randomisierte Positionen in der größeren Bibliothek eingeschlossen sind, oder durch die Konformationsflexibilität, welche durch die kontextmäßige Freiheit hervorgebracht wurde, welche in die größere Bibliothek hineinkonstruiert wurde, oder beidem. Der einzige Basenschritt, welcher keine spezifischen Zinkfinger ergibt, ist 4G5A. Dieses Dinukleotid kann eine unvorteilhafte DNA-Deformation im Zusammenhang der DNA-Bindungsstellen induzieren, welche zur Selektion verwendet werden.
- Beispiel 2
- Bestimmung der +2-Spezifität für Position 1
- Die Aminosäure, welche in der α-helikalen Position 2 eines Zinkfingers vorliegt, kann helfen, die Spezifität für das Basenpaar an der Schnittstelle von zwei überlappenden DNA-Quadruplet-Teilstellen zu bestimmen (siehe
1B ; Position 5/5' korrespondierend zu Position 1 oder 4 des Quadruplets wie oben diskutiert). Es wurde gezeigt, dass ein Asp-Rest, welcher in F3 [+2] von Wildtyp-Zif268 vorliegt, eine Rolle in der DNA-Erkennung spielt, und weitere Beispiele werden durch die aktuellen Phage-Display-Experimente generiert (siehe Beispiel 1 für Details und5A ). - Es wird dem experimentellen Protokoll von Beispiel 1 gefolgt.
5A zeigt ein Beispiel von verwandten Zinkfingerklonen, welches die Wirkung von der α-helikalen Position 2 auf die DNA-Bindespezifität zeigt. In diesem Fall ist Position 6 von Finger 2 invariant (Asn), und die Veränderung im Falle der Spezifität des Zinkfingers, um einen Kontakt zu dieser Base auszuwählen, wird durch Position +2 im Finger +3 diktiert. - Diese Zinkfingerfamilie wird von Selektionen abgeleitet, welche DNA-Bindungsstellen verwenden, welche 4T5A- oder 4T5C-Teilstellenschnittstellen enthalten. Die Basenpräferenz für das 5X-5'X-Basenpaar wird durch die Aminosäure bestimmt, welche an F3 [+2] vorliegt, wahrscheinlich durch die Bildung von Kreuzstrangkontakten.
-
5B zeigt Beispiele von Korrelationen zwischen bestimmten Aminosäuren, welche bei F3 [+2] ausgewählt werden, und der Identität der Base, welche an Position 5'X vorliegt. Selektionen zeigen die Möglichkeit von DNA-Kontakten von fünf Aminosäuren (Asn, Gin, Arg, Lys und His), welche alle eine H-Bindung zum exozyklischen Sauerstoffatom von entweder Guanin (O6) oder Thymin (O4) an Nukleotidposition 5'X geben können. Die Klone, welche mit diesen Aminosäuren an F3 [+2] isoliert werden, werden in diesem Diagramm zusammen mit der Bindungsstellen-Signatur gelistet, welche die Basenpräferenz an Position 5'X zeigt. Insgesamt beherrscht Ser die Selektionen mit einer Häufigkeit von 38% in Übereinstimmung mit dessen Anwesenheit an Position 2 in über der Hälfte aller bekannten Zinkfinger. Threonin, Ala und Gly traten häufig in den Selektionen auf (15%, 15% bzw. 9%), aber zeigten überhaupt keine erkennbaren Unterscheidungsmuster. Bestimmte Aminosäuren (Cys, Asp, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Val und Trp) werden niemals an Position 2 ausgewählt. Ihre Bindefähigkeit in bestimmten Situationen soll jedoch nicht ausgeschlossen werden. - Ein kleiner Aminosäure-Teilsatz, welcher in F3 [+2] ausgewählt wird, zeigt signifikante Korrelationen zur Identität des Basenpaars an Position 5'X (
5B ), was nahelegt, dass Kreuzstranginteraktionen zwischen diesen ein allgemeiner DNA-Erkennungsmechanismus sein können. Die meisten dieser Korrelationen können als Paarungen zwischen Wasserstoffbindungsdonoren in F3 [+2] und Guanin oder Thymin an DNA-Position 5'X in Übereinstimmung mit dem Gerüst des Zif268-Modells gedeutet werden. Im Gegensatz zu Aminosäuren, welche niemals an Position 2 ausgewählt werden, oder Aminosäuren, welche ausgewählt werden, aber welche keine signifikanten Korrelationen zeigen, haben die Aminosäuren, welche konsistent eine Rolle in der DNA-Erkennung von dieser Position zu spielen scheinen, Seitenketten mit mehrfachen Wasserstoff-Bindegruppen. Es ist möglich, dass diese Reste eine Rolle in der Basenerkennung spielen können, weil sie eine größere Spezifität durch Teilnahme in stützenden Netzwerken erzielen. - Beispiel 3
- Konstruktion eines Zinkfingerproteins
- Das Ziel, welches für das Zinkfinger-Nukleinsäure-Bindeprotein ausgewählt wird, ist die aktivierende Punktmutation des menschlichen EJ-Blasenkarzinom-ras-Onkogens, welches die erste DNA-Läsion war, über welche berichtet wurde, dass sie Transformationseigenschaften auf ein zelluläres Protoonkogen vermittelt. Seit der ursprünglichen Entdeckung wurde gefunden, dass ras-Genmutationen mit großen Häufigkeiten in einer Anzahl von menschlichem Krebsen auftreten und etablierte Ziele für die Onkogenese-Diagnose in frühen Stadien des Tumorwachstums sind.
- Die EJ-Blasenkarzinom-Mutation ist ein einzelnes Nukleotid, welches in Codon 12 von H-ras verändert ist, was zu einer Mutation von GGC zu GTC an dieser Position führt. Ein Zinkfinger-Peptid wird so entworfen, dass es eine 10-bp-DNA-Stelle bindet, welche dem nichtkodierenden Strang des mutierten ras-Gens zugeordnet ist, derartig, dass drei Finger die 'Anticodons' 10, 11 und 12 hintereinander kontaktieren, wie in
6 gezeigt, plus dem vorangehenden 5'-G (auf dem +-Strang der DNA). Der Grund von diese Zuweisung berücksichtigt die Tatsache, dass Zinkfinger die meisten Kontakte zu einem DNA-Strang bilden, und der mutierte nichtkodierende Strang ein Adenin trägt, welches in hohem Maße vom Cytosin, welches im Wildtypras vorhanden ist, durch einen bidentaten Kontakt von einem Asparaginrest unterschieden werden kann. - Der erste Finger des Leitpeptids zum Entwurf wird gemäß den hierin dargestellten Regeln entworfen, wobei von einem Zif268-Finger-2-Modell zum Binden des Quadruplets 5'-GCCG-3' ausgegangen wird, welches 'Anticodon' 10 der bezeichneten Bindungsstelle plus einer 3'-Base entspricht. Der Finger hat die folgende Sequenz:
- Eine DNA-kodierende Sequenz, welche dieses Polypeptid kodiert, wird aus synthetisierten Oligonukleotiden konstruiert.
- Ausgehend von der Ähnlichkeit der DNA-Teilstellen sind die zweiten und dritten Finger der DNA-bindenden Domäne direkte Wiederholungen von diesem ersten Finger, worin aber der dritte α-helikale Rest, welcher Base 3 eines Quadruplets +3 kontaktiert, gemäß den Erkennungsregeln zu Histidin in Finger 2 und Asparagin in Finger 3 mutiert wird, derartig, dass die Spezifität von diesen Fingern als 5'-GGCG-3' (schließt 'Anticodon' 11 ein) bzw. 5'-GACG-3' (schließt 'Anticodon' 12 ein) vorhergesagt wird. Daher haben die zweiten und dritten Fingerpolypeptide die Sequenzen
- Ein Konstrukt, welches aus DNA-Sequenzen besteht, welche die drei miteinander verbundenen Finger kodieren, welchem ein Leader MAEEKP am N-Terminus vorangeht, wird als eine Fusion an das kleine Hüllenprotein (Gen III) vom Fd-Bakteriophagen im Phagenvektor Fd-Tet-SN (Y. Choo, A. Klug, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11163–11167) kloniert. In Phage-Display-Screening ist die DNA-bindende Domäne zum Binden der mutierten ras-Sequenz mit einem scheinbaren Kd von 17 nM und zum Diskriminieren der Wildtyp-Sequenz in hohem Maße fähig.
- Beispiel 4
- Verbesserung der Bindungsleistung durch selektive Randomisierung
- Während ein Kd von 17 nM für die meisten praktischen Anwendungen von DNA-bindenden Proteinen hinreichend ist, unterschreitet die scheinbare Affinität des entworfenen Proteins etwa 5-fach die Kd im nanomolaren Bereich, welche für die Reaktion von Wildtyp-Zinkfingerproteinen mit ihren natürlichen Bindungsstellen gefunden werden (Y. Choo. A. Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11168–11172).
- Gemäß den Erkennungsregeln könnte der erste Finger der Leitpeptids Cytosin kontaktieren, wobei das Leitpeptid eines aus Ser, Asp, Glu, Leu, Thr oder Val in der dritten α-Helixposition verwendet. Zum Bestimmen des optimalen Kontakts wird das Codon für die helikale Position 3 von Finger 1 durch Kassettenmutagenese so konstruiert, dass Position 1 = A/G, Position 2 = A/C/G und Position 3 = C/G ist. Deshalb spezifiziert die Randomisierung neben Asp, Glu, Ser und Thr ebenso Ala, Arg, Asn, Gly und Lys. Selektionen dieser Minibibliothek finden über eine Phagenbindungsrunde an 5 nM mutiertes DNA-Oligo in 100 μl PBS statt, welche 50 μM ZnCl2, 2% (Gewicht/Volumen) fettfreie Trockenmilch (Marvel) und 1% (Volumen/Volumen) Tween-20 mit 1 μg Poly-dIdC als Kompetitor enthält, gefolgt von sechs Waschungen mit PBS, welche 50 μM ZnCl2 und 1% (Volumen/Volumen) Tween-20 enthält. Gebundene Phagen werden mit 0,1 M Triethylamin für 3 min eluiert und direkt in ein gleiches Volumen von 1 M Tris-Cl pH 7,4 übertragen.
- Es wird gefunden, dass eine einzelne Runde von Randomisierung und Selektion hinreichend ist, die Affinität des Leit-Zinkfinger-Peptids gegenüber diesem Standard zu verbessern. Eine kleine Mutantenbibliothek wird mit beschränkten Variationen konstruiert, welche in der dritten α-helikalen Position (+3) von Finger 1 des entworfenen Peptids spezifisch sind. Eine Selektion von dieser Bibliothek führt zu einer optimierten DNA-bindenden Domäne mit Asparagin an der variablen Position, wobei die Domäne fähig ist, die mutierte ras-Sequenz mit einem scheinbaren Kd von 3 nM zu binden, d. h. gleich zu demjenigen der Wildtyp-Zif268-DNA-bindenden Domäne (
7 ). Die Asparagin-Selektion an dieser Position zum Binden eines Cytosins gegenüber ist eine unerwartete Abweichung von den Erkennungsregeln, welche normalerweise Asparagin mit Adenin paaren. - Die Asparagin-Selektion ist jedoch mit physikalischen Betrachtungen der Protein-DNA-Schnittstelle konsistent. Neben der klassischen bidentaten Interaktion von Asparagin und Adenin, welche in Zinkfinger-DNA-Komplexen beobachtet wird, wurde beobachtet, dass Asparagin einen Basenpaar-Schritt in der DNA-Hauptfurche überbrückt, zum Beispiel in den Ko-Kristallstrukturen der GCN4-DNA-bindenden Domäne. Eine Anzahl von verschiedenen Basenpaar-Schritten ermöglicht die korrekten stereochemischen Paarungen von Wasserstoffbindungsdonoren und -akzeptoren, welche Asparagin erfüllen könnte, was den unterstrichenen Schritt GCC von ras-'Anticodon' 10 einschließt. Obwohl Asparagin an Position 3 der Zinkfingerhelix normalerweise nicht so angeordnet sein würde, dass es einen Basenpaar-Schritt gemäß dem Zif268-Modell überbrückt, ist es bekannt, dass eine Biegung der DNA nichtkanonische Zinkfinger-DNA-Interaktionen ermöglichen kann (L. Fairall, J. W. R. Schwabe, L. Chapman. J. T. Finch, D. Rhodes (1993) Nature 366, 483–487). Die Sequenz GGC (Codon 10) wird häufig auf der Außenseite einer Biegung im Nukleosomenkern gefunden, und es wurde beobachtet, dass sie eine intrinsische Biegung in der Kristallstruktur eines dekameren DNA-Oligonukleotids bildet. Im letzteren Fall entsteht die Biegung aus der bevorzugten Stapelung der Purine: dies ist mit einer großen Propellerdrehung assoziiert und engt die Hauptfurche ein, was beides ein Überbrücken des Basenpaar-Schritts durch Asparagin begünstigen würde (T. E. Ellenberger, C. J. Brandt, K. Struhl, S. C. Harrison (1992) Cell 71, 1223–1237). Neben der Erklärung der Selektion der nichtkanonischen Kontakte in dem optimierten Komplex könnte deshalb die sequenzabhängige Deformation von ras-DNA für unsere Beobachtung verantwortlich sein, dass Wildtyp- und EJ-ras-Genfragmente eine verschiedene elektrophoretische Beweglichkeit in Polyacrylamidgelen haben, da das Wildtyp-ras-Gen zwei GGC-Sequenzen 5 bp getrennt voneinander hat, welche daher außerhalb der helikalen Phase liegen (was zu keiner Nettobiegung führt), während die EJ-Mutation eine von diesen GGC-Sequenzen betrifft.
- Während es daher möglich ist, eine adäquate DNA-bindende Domäne durch rationalen Entwurf zu konstruieren, welcher auf Erkennungsregeln basiert, wird die Bindungsaffinität von diesem Leitpeptid verbessert, wobei Phage-Display verwendet wird, welches zur Selektion eines nichtkanonischen DNA-Kontakts führt.
- Beispiel 5
- Diagnose einer ras-Mutation, welche das Zinkfinger-Nukleinsäure-Bindeprotein verwendet
- Die optimierte DNA-bindende Domäne, welche auf Phagen präsentiert wird, wird in der Diagnose der aktivierenden Punktmutation des EJ-ras-Onkogens angewendet. Ein bakterieller Kulturüberstand, welcher den diagnostischen Phagen enthält, wird 1:1 mit PBS enthaltend 50 μM ZnCl2, 4% (Gewicht/Volumen) fettfreie Trockenmilch (Marvel) und 2% (Gewicht/Gewicht) Tween-20 verdünnt. Biotinylierte Oligonukleotide (7,5 pmol) enthaltend doppelsträngige DNA, welche Codons 8–16 vom Wildtyp oder des punktmutierten ras-Gens umfassen, werden zu 50 μl verdünnten Phagen hinzugegeben und für 1 h bei 20°C inkubiert. Im Experiment, welches in
8 gezeigt wird, werden gebundene Phagen mit 0,5 mg Streptavidinbeschichteten paramagnetischen Beads (Dynal) gefangen – es können jedoch Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten (Boehringer Mannheim) ebenso ohne Veränderung des Protokolls verwendet werden. Ungebundener Phage wird durch sechsmaliges Waschen der Beads mit PBS enthaltend 50 μM ZnCl2 und 1% (Gewicht/Gewicht) Tween-20 entfernt. Die Beads werden danach für 1 h bei RT mit anti-M13-IgG, welcher mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist (Pharmacia Biotech), in PBS 1:5000 verdünnt inkubiert, welche 50 μM ZnCl2 und 2% (Gewicht/Volumen) fettfreie Trockenmilch (Marvel) enthält. Der Antikörperüberschuss wird durch sechsmaliges Waschen mit PBS enthaltend 50 μM ZnCl2 und 0,05% (Gewicht/Gewicht) Tween-20 und dreimaliges Waschen mit PBS enthaltend 50 μM ZnCl2 entfernt. Der ELISA wird mit 0,1 mg/ml Tetramethylbenzidin (Sigma) in 0,1 M Natriumacetat pH 5,4, welches 2 μl frisches 30%iges Wasserstoffperoxid pro 10 ml Puffer enthält, entwickelt und nach annähernd 1 min mit einem gleichen Volumen 2 M H2SO4 gestoppt. Die Reaktion bewirkt eine gelbe Farbe, welche durch Subtrahieren der Absorption bei 650 nm von der Absorption bei 450 nm quantifiziert wird. Es sollte angemerkt werden, dass in diesem Protokoll der ELISA nicht kompetitiv ist, jedoch könnte eine lösliche (nicht-biotinylierte) Wildtyp-ras-DNA in den Bindereaktionen eingeschlossen werden, was möglicherweise zu einer besseren Unterscheidung zwischen Wildtyp und mutiertem ras führt. - Die Phagen werden spezifisch durch DNA zurückgehalten, welche die Mutante, aber nicht die Wildtyp-ras-Sequenz enthält, was die Detektion der Punktmutation durch ELISA (
8 ) erlaubt. - Beispiel 6
- Konstruktion eines anti-HIV-Zinkfingers
- Die Sequenz des HIV-TARs, derjenigen Region des LTRs, welche für eine Tat-Transaktivierung verantwortlich ist, ist bekannt (Jones und Peterlin (1994) Ann. Rev. Biochem. 63: 717–743). Eine Sequenz mit der TAT-Region wird identifiziert, und ein Zinkfinger-Polypeptid, welches entworfen ist, um daran zu binden.
- Die ausgewählte Sequenz ist 5'-AGA GAG CTC-3', welche das Komplement der Nukleotide +34 bis +42 von HIV ist. Die korrespondierenden Aminosäuren, welche in den Fingern 1, 2 und 3 eines Zinkfinger-Bindeproteins benötigt werden, werden gemäß den Regeln, welche oben angegeben sind, wie folgt bestimmt:
Finger 3: Ziel 5'-GAGA-3' Position –1 Gln Position +2 Gly Position +3 His Position +6 Val Finger 2: Ziel 5'-CGAG-3' Position –1 Arg Position +2 Ser Position +3 Asn Position +6 Arg Finger 1: Ziel 5'-CTC-3' Position –1 Asp Position +3 Ser Position +6 Glu - Das Gerüst des Polypeptids wird vom mittleren Zif-268-Finger genommen. Die Sequenz des vollständigen Polypeptids wird in SEQ. ID. Nr. 2 gezeigt.
- Die Reste +2 und +6 von Finger 3 werden teilweise durch Randomisierung und Phage-Display-Selektion ausgewählt. An Position 2 werden zwei Tripletts GAT und GGT verwendet, welche Asp oder Gly kodieren. Position +6 wurde randomisiert. An diesen Positionen werden die Reste Gly und Val ausgewählt. Die verwendete Methodologie ist wie folgt: Kolonie-PCR wird mit einem Primer durchgeführt, welcher eine einzelne Fehlpaarung enthält, um die benötigten Randomisierungen in Finger 3 zu bilden. Klonieren von einem PCR-Produkt in einen Phagenvektor ist wie früher beschrieben (Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11163–11167; Choo, Y. & Klug, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11168–11172).
- Kurz gesagt enthielten vorwärts- und rückwärts-PCR-Primer alleinige Restriktionsstellen für Not I bzw. Sfi I und amplifizierten eine Region mit etwa 300 Basenpaaren umfassend drei Zinkfinger. Die PCR-Produkte werden mit Sfi I und Not I verdaut, um kohäsive Enden zu bilden, und werden mit 100 ng von auf ähnliche Weise verdautem fd-Tet-SN-Vektor ligiert. Elektrokompetente TG1-Zellen werden mit dem rekombinanten Vektor transformiert. Einzelne Transformantenkolonien werden über Nacht in 2 × TY enthaltend 50 μM ZnCl2 15 μg/ml Tetracyclin wachsen gelassen. Eine einzelsträngige DNA wird aus Phagen im Kulturüberstand hergestellt und mit Sequenase 2.0 (United States Biochemical) sequenziert.
- Das erfindungsgemäß konstruierte Polypeptid wird dann auf Binden an HIV-DNA getestet, und man erhält positive Ergebnisse.
- Beispiel 6
- Entwerfen eines Zinkfingers, welcher für ein 8bp-Palindrom spezifisch ist
- Zinkfingerarrays binden an asymmetrische DNA-Sequenzen, aber es ist nicht bekannt, dass sie Palindrome binden. Um zu bestimmen, ob ein Zinkfingerarray an ein Palindrom binden kann, wird eine Dreifingerdomäne zum Erkennen der palindromischen 8-bp-Sequenz GCGGCCGC konstruiert, welche durch die Restriktion Endonuklease NotI gebunden und gespalten wird.
- Eine Zinkfingerdomäne wird aus der Zif268-Bibliothek für mittlere Finger (siehe
WO 96/06166 - Um die Spezifität des Zinkfingers zur NotI-Erkennungssequenz GCG-GCC-GC zu verändern, wird der N-Terminus der α-Helix von Finger 1 (F1) von Position –2 bis +2 mutiert. Position –2 in WT-Zif268 ist Ser und könnte eine wasservermittelte H-Bindung zu einem DNA-Phosphat bilden: dies wird zu Arg mutiert, um einen direkten Phosphatkontakt zu bilden. Die Positionen –1, 1 und 2 werden zu Gly oder Ala mutiert (Gly für –1, welche gerade außerhalb der Helix ist, und Ala für die anderen Positionen auf der Helix), um H-bindende Gruppen zu eliminieren, welche in der DNA-Erkennung wirken könnten. Das Protein kann eine beliebige Base (N) in der Sequenz GCG-GCC-GCN mit einem kleinen Vorzug für A über G/T/C akzeptieren. Die Bindungsstärke ist nicht betroffen, obwohl sogar der Arg→G-Kontakt von WT-Zif268 infolge der Kompensation vom konstruierten Phosphatkontakt deletiert wird. Daher wird ein Protein, welches die palindromische 8-bp-Erkennungsstelle von NotI bindet, aus einer Dreifingerdomäne konstruiert, welche auf Zif268 basiert.
- Die Zinkfingerdomäne, welche aus der Bibliothek ausgewählt wurde, hatte ursprünglich Ser an Position +3 von F2 und erkennt die Sequenz GCGGYC-GCG, wobei Y C oder T ist. Da die Erkennung der NotI-Stelle ein C benötigt, welches an dieser DNA-Position spezifiziert ist, wird die Mutation Ser→Asp an Position +3 von F2 gemacht, um die DNA-Bindungsspezifität von Y zu C zu verschmälern. Diese Mutation entspricht den oben angegebenen Regeln. Das endgültige Konstrukt bindet die Sequenz GCG-GCC-GC spezifisch. SEQUENZLISTE
Claims (24)
- Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins, welches an eine Ziel-Nukleotidsequenz bindet, wobei das Bindeprotein zwei oder mehr Zinkfinger der Cys2-His2-Klasse umfasst, wobei das Verfahren umfasst: (i) Auswählen eines Quadruplets innerhalb der Ziel-Nukleotidsequenz, (ii) Entwerfen des Bindeproteins, so dass Binden eines Zinkfingers an das Quadruplet erreicht wird, indem die Sequenz bestimmter Reste des Zinkfingers abhängig von der Nukleotidsequenz des Quadruplets wie folgt ausgewählt wird: (a) wenn Base 4 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Arg oder Lys, (b) wenn Base 4 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Glu, Asn oder Val, (c) wenn Base 4 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val oder Lys, (d) wenn Base 4 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +6 in der α-Helix Ser, Thr, Val, Ala, Glu oder Asn, (e) wenn Base 3 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +3 in der α-Helix His, (f) wenn Base 3 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Asn, (g) wenn Base 3 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ala, Ser oder Val mit der Maßgabe, dass wenn es Ala ist, dann ist einer der Reste bei –1 oder +6 ein kleiner Rest, (h) wenn Base 3 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +3 in der α-Helix Ser, Asp, Glu, Leu, Thr oder Val, (i) wenn Base 2 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Arg, (j) wenn Base 2 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Gln, (k) wenn Base 2 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position –1 in der α-Helix His oder Thr, (l) wenn Base 2 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position –1 in der α-Helix Asp oder His, (m) wenn Base 1 in dem Quadruplet G ist, dann ist Position +2 Glu, (n) wenn Base 1 in dem Quadruplet A ist, dann ist Position +2 Arg oder Gin, (o) wenn Base 1 in dem Quadruplet C ist, dann ist Position +2 Asn, Gin, Arg, His oder Lys, (p) wenn Base 1 in dem Quadruplet T ist, dann ist Position +2 Ser oder Thr, (iii) Synthetisieren eines Polynukleotids, welches das Bindeprotein aus (ii) kodiert, (iv) Inserieren der Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor, (v) Einführen des Expressionsvektors aus (iv) in eine Zelle, und (vi) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, unter welchen das kodierte Nukleinsäure-Bindeprotein exprimiert wird, wobei die Zinkfingerbindenden Motive die Struktur haben: wobei X einschließend Xa, Xb und X eine beliebige Aminosäure ist und wobei X2-4 und X2-3 sich auf die Anwesenheit von 2 oder 4 beziehungsweise 2 oder 3 Aminosäuren beziehen und wobei die zwei oder mehr Zinkfinger für die Bestimmung der Bindung an ein Nukleinsäurequadruplet verantwortlich sind und wobei die Quadruplets derartig überlappend sind, dass Base 4 eines ersten Quadruplets Base 1 eines zweiten Quadruplets ist, wenn von 3' nach 5' auf dem -Strang der Nukleinsäure gelesen wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Xa Phe/Tyr-X oder Pro-Phe/Tyr-X ist.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei X2-4 ausgewählt wird aus: Ser-X, Glu-X, Lys-X, Thr-X, Pro-X und Arg-X.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Xb Thr oder Ile ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X2-3 Gly-Lys-Ala, Gly-Lys-Cys, Gly-Lys-Ser, Gly-Lys-Gly, Met-Arg-Asn oder Met-Arg ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Linker Thr-Gly-Glu-Lys oder Thr-Gly-Glu-Lys-Pro ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Position +9 Arg oder Lys ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Positionen +1, +5 und +8 nicht durch eine hydrophobe Aminosäure, Phe, Trp oder Tyr besetzt sind.
- Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Positionen +1, +5 und +8 durch die Reste Lys, Thr beziehungsweise Gin besetzt sind.
- Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins der Cys2-His2-Zinkfingerklasse, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz bindet, umfassend die Schritte: (a) Auswählen einer Modell-Zinkfingerdomäne aus der Gruppe bestehend aus natürlicherweise auftretenden Zinkfingern und Konsensus-Zinkfingern, und (b) Mutieren des Fingers gemäß den Regeln des Anspruchs 1.
- Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Modell-Zinkfinger ein Konsensus-Zinkfinger ist, dessen Struktur ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Konsensusstruktur Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Val-Lys-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly und der Konsensusstruktur Pro-Tyr-Lys-Cys-Ser-Glu-Cys-Gly-Lys-Ala-Phe-Ser-Gln-Lys-Ser-Asn-Leu-Thr-Arg-His-Gln-Arg-Ile-His-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro.
- Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Modell-Zinkfinger ein natürlich auftretender Zinkfinger ist, dessen Struktur ausgewählt wird aus einem Finger eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zif 268, GLI, Tramtrack und YY1.
- Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Modell-Zinkfinger Finger 2 aus Zif 268 ist.
- Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bindeprotein zwei oder mehr Zinkfinger-bindende Motive umfasst, welche N-terminal nach C-terminal angeordnet sind.
- Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dem N-terminalen Zinkfinger ein Leaderpeptid mit der Sequenz Met-Ala-Glu-Glu-Lys-Pro vorangeht.
- Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins wie in den Ansprüchen 11 oder 12 beansprucht, wobei das Nukleinsäure-Bindeprotein durch rekombinante Nukleinsäuretechnologie konstruiert wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Herstellen einer Nukleinsäure kodierend eine Sequenz kodierend zwei oder mehr Zinkfinger-bindende Motive wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, welche N-terminal nach C-terminal angeordnet sind, (b) Inserieren der Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, und (c) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle, um das Nukleinsäure-Bindeprotein zu erhalten.
- Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die zusätzlichen Schritte von einer oder mehreren Runden der Randomisierung und Selektion des Nukleinsäure-Bindeproteins, um dessen Merkmale zu verbessern.
- Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Randomisierung und Selektion durch Phage-Display-Technologie durchgeführt wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 18, umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines Nukleinsäurekonstrukts, welches ein Fusionsprotein umfassend das Nukleinsäure-Bindeprotein und ein kleines Hüllprotein eines filamentösen Bakteriophagen exprimiert, (b) Herstellen weiterer Nukleinsäurekonstrukte, welche ein Fusionsprotein umfassend ein selektiv mutiertes Nukleinsäure-Bindeprotein und ein kleines Hüllprotein eines filamentösen Bakteriophagen exprimieren, (c) Bewirken der Expression der in den Schritten (a) und (b) definierten Fusionsproteine auf der Oberfläche eines mit den Nukleinsäurekonstrukten transformierten Bakteriophagen, und (d) Testen der Fähigkeit des Bakteriophagen, die Ziel-Nukleinsäuresequenz zu binden, und Selektieren desjenigen Bakteriophagen, welcher überlegene Bindungsmerkmale zeigt.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Nukleinsäure-Bindeprotein an einer der Positionen +1, +5, +8, –1, +2, +3 oder +6 selektiv randomisiert ist.
- Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei in dem Nukleinsäure-Bindeprotein Position +6 eines Zinkfingers und die Positionen –1, +1, +2 und +3 eines benachbarten Zinkfingers randomisiert werden.
- Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Ziel-Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines Nukleinsäure-Bindeproteins, welches spezifisch für das Ziel-Nukleinsäuremolekül ist, durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, (b) Aussetzen eines Testsystems umfassend das Ziel-Nukleinsäuremolekül gegenüber dem Nukleinsäure-Bindeprotein unter Bedingungen, welche ein Binden unterstützen, und Entfernen aller Nukleinsäure-Bindeproteine, welche ungebunden bleiben, und (c) Detektieren der Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins in dem Testsystem.
- Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins in dem Testsystem durch einen Antikörper detektiert wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 22 oder Anspruch 23, wobei das Nukleinsäure-Bindeprotein bei der Verwendung auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen präsentiert wird und die Anwesenheit des Nukleinsäure-Bindeproteins durch Detektieren des Bakteriophagen oder eines Bestandteils davon detektiert wird.
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