JP2022550608A - プリオン病の治療のためのジンクフィンガータンパク質転写因子 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経系におけるプリオン遺伝子の発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、およびプリオン病を治療するための前記タンパク質の使用方法を提供する。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2019年10月2日に提出した米国仮出願62/909,725、および2020年5月11日に提出した米国仮出願63/023,197に基づく優先権を主張する。前記仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年10月2日に提出した米国仮出願62/909,725、および2020年5月11日に提出した米国仮出願63/023,197に基づく優先権を主張する。前記仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記のASCIIコピーは、2020年10月2日に作成され、025297_WO012_SL.txtという名称であり、サイズは197,128バイトである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記のASCIIコピーは、2020年10月2日に作成され、025297_WO012_SL.txtという名称であり、サイズは197,128バイトである。
発明の背景
プリオン病は、人間と動物の両方に影響を与える進行性の神経変性疾患の一群を意味する。これらの障害は、ニューロンの喪失と神経膠症を付随して脳を海綿状に変化させるプリオンタンパク質のミスフォールドされたアイソフォーム(PrP Scrapie;PrPSc)の蓄積を特徴とする。プリオンという用語は、タンパク質性感染性粒子の略であり、これらの病原性アイソフォームのタンパク質のみの性質を意味する。異常な形状のタンパク質(PrPSc)は、その後、豊富に発現される生理学的形態のプリオンタンパク質(細胞性PrP;PrPC)に結合し、これを疾患の原因となるアイソフォームPrPScに変換することができる。この現象は、自己テンプレート化として知られている。タンパク質配列は同一であるが、PrPScは、溶解性、構造、および安定性の点で生物物理学的にPrPCとは大幅に異なる(Riesner, Brit Med Bull. (2003) 66:21-33)。PrPScアイソフォームの増殖に続いて凝集が起こり、中枢神経系で神経細胞死を引き起こす。ヒトプリオン病は、遺伝性(症例の10~15%を占める)、孤発性または獲得性であり、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、およびクールー病が含まれうる。人間の場合、プリオン病は、脳機能を損ない、進行性の認知機能低下と異常な動きを引き起こす。プリオン病は、常に致命的であり、典型的には、発病から数か月~数年以内に死に至る。
プリオン病は、人間と動物の両方に影響を与える進行性の神経変性疾患の一群を意味する。これらの障害は、ニューロンの喪失と神経膠症を付随して脳を海綿状に変化させるプリオンタンパク質のミスフォールドされたアイソフォーム(PrP Scrapie;PrPSc)の蓄積を特徴とする。プリオンという用語は、タンパク質性感染性粒子の略であり、これらの病原性アイソフォームのタンパク質のみの性質を意味する。異常な形状のタンパク質(PrPSc)は、その後、豊富に発現される生理学的形態のプリオンタンパク質(細胞性PrP;PrPC)に結合し、これを疾患の原因となるアイソフォームPrPScに変換することができる。この現象は、自己テンプレート化として知られている。タンパク質配列は同一であるが、PrPScは、溶解性、構造、および安定性の点で生物物理学的にPrPCとは大幅に異なる(Riesner, Brit Med Bull. (2003) 66:21-33)。PrPScアイソフォームの増殖に続いて凝集が起こり、中枢神経系で神経細胞死を引き起こす。ヒトプリオン病は、遺伝性(症例の10~15%を占める)、孤発性または獲得性であり、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、およびクールー病が含まれうる。人間の場合、プリオン病は、脳機能を損ない、進行性の認知機能低下と異常な動きを引き起こす。プリオン病は、常に致命的であり、典型的には、発病から数か月~数年以内に死に至る。
PrPの正確な機能は、この分野ではまだ議論の余地があるが、多くの表現型の中において、PrPは、神経新生および神経保護、概日リズム、ミエリン維持、上皮間葉転換(EMT)、および長期増強(LTP)において役割を果たすと仮定されている。家族性の形態に加えて、プリオン病はまた、孤発性または獲得性でありうる。孤発性プリオン病の人には、この病気の家族歴やPRNP遺伝子の同定可能な変異がない。孤発性プリオン病は、PrPCがPrPScに自然に変換されるときに発生する。孤発性のプリオン病には、孤発性CJD(sCJD)、孤発性致死性不眠症(sFI)、および可変プロテアーゼ感受性プリオン症(VPSPr)が含まれる。獲得性プリオン病は、外部供給源からのPrPScへの曝露に起因する。例えば、異型CJD(vCJD)は、プリオン病の牛からのPrPScを含む牛肉製品の消費に起因する獲得性プリオン病の一種である。牛では、この形態の病気は、ウシ海綿状脳症(BSE)または「狂牛病」として知られている。獲得性ヒトプリオン病の別の例は、パプアニューギニアのサウスフォレ族で確認されたクールー病である。クールー病は、人食い葬儀の際に個人が罹患した人間の組織を食したときに伝染した。
PrP発現の低下は、概念研究の多くの遺伝学的証拠、ならびにプリオン感染マウスの生存を延長することが示されているPrPを低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のインビボ有効性によってサポートされる治療戦略である。例えば、Bueler et al., Cell (1993) 73(7):1339-47; Bueler et al., Mol Med Camb Mass. (1994) 1(1):19-30; Fischer et al., EMBO J. (1996) 15(6):1255-64; Mallucci et al., Science (2003) 302(5646):871-4; and Safar et al., J Gen Virol. (2005) 86(Pt 10):2913-23, Minikel et al., Nucleic Acids Res. (2020) 10.1093/nar/gkaa616を参照のこと。50%のPrPノックダウンを達成するASOは、マウスのプリオン病の発症を2倍以上まで遅らせることが示されているが、PrPノックダウンのレベルが高いほど、さらなる治療効果が得られうる。ASOで達成可能な範囲を超えたPrPノックダウンの分布もまた、有効性にとって重要でありうる。よって、PrP発現を標的とすることによるプリオン病の有効な治療の必要性が残っている。
本開示は、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウス)PRNP遺伝子内またはその近くの部位を標的とするジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインを提供する。本開示のZFPドメインは、哺乳動物のPRNP遺伝子をDNAレベルで特異的に阻害するために転写因子に融合されうる。これらの融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)とも呼ばれ、(i)PRNP遺伝子の標的領域に特異的に結合するZFPドメイン、および(ii)前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。これらのタンパク質は、プリオン病を治療するために用いることができる。
1の態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ZFPドメインが、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウス)プリオンタンパク質遺伝子(PRNP遺伝子)に結合する、融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、前記ZFP-TFの標的領域は、PRNP遺伝子における転写開始部位(TSS)の約1kbまたは500bp以内である。ある実施態様において、融合タンパク質は、1個またはそれ以上(例えば、2個、3個、4個、5個、または6個)のジンクフィンガーを含んでいてもよく、それは、適宜、PRNP遺伝子の発現を、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、または最小において、少なくとも約40%、75%、90%、95%、または99%まで抑制する。ジンクフィンガードメインの非限定的な例を、図4および8Aの表に示す。ある実施態様において、融合タンパク質は、図4および8Aの表に示される1つまたはそれ以上の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施態様において、融合タンパク質は、示される骨格変異を有するか、または有さずに、図4および8Aの表の一行からの認識ヘリックス配列のいくつかまたは全てを含む。特定の実施態様において、融合タンパク質は、図9Aまたは9Bの表に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、融合タンパク質の転写リプレッサードメインは、KOX1のKRABドメインアミノ酸配列を含みうる。融合タンパク質では、ZFPドメインは、ペプチドリンカーを介して転写リプレッサードメインに結合していてもよい。
別の態様において、本開示は、本発明の融合タンパク質のコーディング配列を含む核酸構築物であって、前記コーディング配列が、転写調節エレメント、例えば、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーター(例えば、ヒトシナプシンIプロモーター)などに作動可能に連結されている、核酸構築物を提供する。本開示はまた、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、ヒト細胞、および/または脳細胞もしくは多能性幹細胞であって、前記幹細胞は、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞(iPSC)であってもよい。本開示はまた、核酸構築物を含む組換えウイルス(適宜、血清型6または9の組換えアデノ随伴ウイルス(AAV))を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、哺乳動物の脳細胞におけるプリオンタンパク質(PrP)の発現を阻害するための方法であって、本発明の融合タンパク質を、適宜、(例えば、組換えウイルスを介して)本明細書に記載される核酸構築物の導入により前記細胞に導入し、それにより前記細胞におけるPrPの発現を阻害することを含む、方法を提供する。哺乳動物の脳細胞は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスの細胞であってもよく、および/またはニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞であってもよい。ある実施態様において、細胞は、プリオン病に罹患しているか、または発症するリスクのある患者の脳内にあり、前記プリオン病は、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、孤発性CJD、異型CJD、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、孤発性致死性不眠症(sFI)、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症(VPSPr)である。
本開示はまた、患者における神経変性疾患を治療するための方法であって、本発明の融合タンパク質をコードする組換えAAVを前記患者に投与することを含む、方法を提供する。神経変性疾患は、プリオン病であってもよく、前記プリオン病は、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病、例えば、CJD、孤発性CJD、異型CJD、GSS、FFI、sFI、クールー病、またはVPSPrなどである。ある実施態様において、前記疾患は、タウオパシー、例えば、アルツハイマー病(AD)、進行性核上性麻痺(PSP)、前頭側頭型認知症(FTD)、または大脳皮質基底核変性症(CBD)、または慢性外傷性脳症(CTE)などでありうる。他の実施態様において、前記疾患は、シヌクレイン病、例えば、パーキンソン病(PD)、多系統萎縮症(MSA)、またはレビー小体型認知症(DLB)などでありうる。
ある実施態様において、本融合タンパク質をコードするAAVは、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、または視床内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して患者に導入される。
本開示は、本明細書に記載の方法で使用するための本発明の融合タンパク質、核酸構築物、および組換えウイルス、ならびに本明細書に記載の方法において薬剤を製造するための融合タンパク質、核酸構築物、組換えウイルスの使用を提供する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、限定ではなく、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本開示は、哺乳動物PRNP遺伝子内またはその近くの部位(すなわち、配列)を標的とするZFPドメインを提供する。本明細書に記載のZFPドメインは、別の機能的分子またはドメインに結合されるか、または融合されていてもよい。本開示のZFPドメインは、哺乳動物PRNP遺伝子のRNAへの転写を抑制するための転写因子に融合されていてもよい。前記融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)と呼ばれる。これらのZFP-TFは、PRNP遺伝子内またはその近くの標的領域(すなわち、標的部位)に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。前記ZFP-TFを患者の脳に導入することによってニューロンのPrPレベルを下げると、PrPScの形成および拡散を抑制し(例えば、減少させ、または停止させ)、それによりプリオン病を治療する(例えば、症状を緩和し、症状の発症または悪化を予防し、および生存率を増加する)ことが期待される。
本開示は、哺乳動物PRNP遺伝子内またはその近くの部位(すなわち、配列)を標的とするZFPドメインを提供する。本明細書に記載のZFPドメインは、別の機能的分子またはドメインに結合されるか、または融合されていてもよい。本開示のZFPドメインは、哺乳動物PRNP遺伝子のRNAへの転写を抑制するための転写因子に融合されていてもよい。前記融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)と呼ばれる。これらのZFP-TFは、PRNP遺伝子内またはその近くの標的領域(すなわち、標的部位)に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。前記ZFP-TFを患者の脳に導入することによってニューロンのPrPレベルを下げると、PrPScの形成および拡散を抑制し(例えば、減少させ、または停止させ)、それによりプリオン病を治療する(例えば、症状を緩和し、症状の発症または悪化を予防し、および生存率を増加する)ことが期待される。
PRNP阻害に対する我々のZFP-TF方法には、現在他が試験しているアプローチと比較していくつかの利点がある。ZFP-TFは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)について報告されているよりも高いレベルのPrP抑制を達成することができる。さらに、ZFP-TFは、(ZFP-TF発現構築物、例えば、組換えウイルス(例えば、組換えAAVなど)を患者に導入することによって)一度だけ投与する必要がありうるが、ASOは、反復投与を要する。さらに、ZFP-TF方法は、各細胞のゲノムにおけるPRNP遺伝子の2個の対立遺伝子を関与させるだけで済む。対照的に、ASOは各細胞のPRNPmRNAの多数のコピーに関与する必要がある。さらに、組換えウイルス、例えば、組換えAAVなどを用いると、ZFP-TFを目的の脳領域に送達することができる。
プリオン病治療への我々のアプローチは、安全であることが期待される。約18,000人に1人の割合のヒトが、機能喪失型PRNP変異についてヘテロ接合であると推定されるが、これらの個体には認識できる有害な影響はない。
I.ZFPドメインの標的
本発明の融合タンパク質のZFPドメインは、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウス)PRNP遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。ZFP-TFのDNA結合ZFPドメインは、前記融合タンパク質をPRNP遺伝子の標的領域に指示し、前記融合タンパク質の転写リプレッサードメインを標的領域に提示する。次に、前記リプレッサードメインは、RNAポリメラーゼによるPRNP遺伝子の転写を抑制する。前記標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするPRNP遺伝子においていずれかの適切な部位でありうる。一例として、前記標的領域は、PRNP転写開始部位(TSS)、またはPRNP転写調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、RNAポリメラーゼ休止部位など)を含むか、これらに隣接する。例えば、前記標的領域は、TSSの上流および/または下流約500~1,000bpにありうる。
くる
本発明の融合タンパク質のZFPドメインは、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウス)PRNP遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。ZFP-TFのDNA結合ZFPドメインは、前記融合タンパク質をPRNP遺伝子の標的領域に指示し、前記融合タンパク質の転写リプレッサードメインを標的領域に提示する。次に、前記リプレッサードメインは、RNAポリメラーゼによるPRNP遺伝子の転写を抑制する。前記標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするPRNP遺伝子においていずれかの適切な部位でありうる。一例として、前記標的領域は、PRNP転写開始部位(TSS)、またはPRNP転写調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、RNAポリメラーゼ休止部位など)を含むか、これらに隣接する。例えば、前記標的領域は、TSSの上流および/または下流約500~1,000bpにありうる。
くる
ある実施態様において、ゲノム標的領域は、少なくとも8bpの長さである。例えば、前記標的領域は、8bp~40bpの長さ、例えば、12、15、18、21、24、27、30、33、または36bpの長さでありうる。前記標的配列は、遺伝子のセンス鎖上または遺伝子のアンチセンス鎖上にあってもよい。標的の正確性を確保し、ZFP-TFによるオフターゲット結合または活性を減少するために、選択されるPRNP標的領域の配列は、好ましくは、他の遺伝子の配列に対して75%未満の相同性(例えば、70%未満、65%未満、60%未満、または50%未満)を有する。特定の実施態様において、本発明のZFP-TFの標的領域は、15~18bpの長さであり、TSSの約500~1,000bp内に存在する。マウスPRNP遺伝子の標的領域の例を図1および図4に示す。ヒトPRNP遺伝子の標的領域の例を図8Aに示す。
ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、またはほとんどなく、図4および図8Aの表の一行に示される標的部位(すなわち、結合配列)に結合する。
標的部分をさらに評価するための他の基準には、このような部分または関連する部分に結合するZFPの過去の利用可能性、特定の標的部分に結合する新しいZFPの設計の容易性、およびオフターゲット結合評価が含まれる。
II.ZFPドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」は、亜鉛によって安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質を意味する。ZFPは、配列特異的な方法でDNAに結合する。ZFPの各DNA結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、典型的に、7つのアミノ酸残基で構成され、DNA結合の特異性を決定するDNA結合「認識ヘリックス」を含有する。ZFPドメインは、少なくとも1つのフィンガーを有し、各フィンガーは、2~4塩基対のDNA、典型的には、3または4塩基対のDNAに結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、約30個のアミノ酸およびキレート亜鉛で構成される。操作されたZFPは、天然に存在するZFPと比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、以下に限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット(またはクアドラプレット)ヌクレオチド配列および各ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つまたはそれ以上のアミノ酸配列に関連するものである。例えば、米国特許第5,789,538号;第5,925,523号;第6,007,988号;第6,013,453号;第6,140,081号;第6,200,759号;第6,453,242号;第6,534,261号;第6,979,539号;および第8,586,526号;および国際特許公開WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60970;WO01/88197;WO02/016536;WO02/099084;およびWO03/016496に詳細に記載されるZFP設計方法を参照のこと。本明細書に記載されるZFPドメインは、別の分子、例えば、タンパク質に結合され、または融合されていてもよい。このようなZFP融合物は、遺伝子活性化(例えば、活性化ドメイン)、遺伝子抑制(例えば、抑制ドメイン)、リガンド結合(例えば、リガンド結合ドメイン)、ハイスループットスクリーニング(例えば、リガンド結合ドメイン)、超変異の局所化(例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン)、クロマチン修飾(例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン)、組換え(例えば、リコンビナーゼドメイン)、標的化されたインテグレーション(例えば、インテグラーゼドメイン)、DNA修飾(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン)、塩基エディッション(例、塩基エディタードメイン)、またはターゲットDNA切断(例えば、ヌクレアーゼドメイン)を可能にするドメインを含んでいてもよい。操作されたZFPドメインの例を図4および8Aの表に示す。
「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」は、亜鉛によって安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質を意味する。ZFPは、配列特異的な方法でDNAに結合する。ZFPの各DNA結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、典型的に、7つのアミノ酸残基で構成され、DNA結合の特異性を決定するDNA結合「認識ヘリックス」を含有する。ZFPドメインは、少なくとも1つのフィンガーを有し、各フィンガーは、2~4塩基対のDNA、典型的には、3または4塩基対のDNAに結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、約30個のアミノ酸およびキレート亜鉛で構成される。操作されたZFPは、天然に存在するZFPと比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、以下に限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット(またはクアドラプレット)ヌクレオチド配列および各ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つまたはそれ以上のアミノ酸配列に関連するものである。例えば、米国特許第5,789,538号;第5,925,523号;第6,007,988号;第6,013,453号;第6,140,081号;第6,200,759号;第6,453,242号;第6,534,261号;第6,979,539号;および第8,586,526号;および国際特許公開WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60970;WO01/88197;WO02/016536;WO02/099084;およびWO03/016496に詳細に記載されるZFP設計方法を参照のこと。本明細書に記載されるZFPドメインは、別の分子、例えば、タンパク質に結合され、または融合されていてもよい。このようなZFP融合物は、遺伝子活性化(例えば、活性化ドメイン)、遺伝子抑制(例えば、抑制ドメイン)、リガンド結合(例えば、リガンド結合ドメイン)、ハイスループットスクリーニング(例えば、リガンド結合ドメイン)、超変異の局所化(例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン)、クロマチン修飾(例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン)、組換え(例えば、リコンビナーゼドメイン)、標的化されたインテグレーション(例えば、インテグラーゼドメイン)、DNA修飾(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン)、塩基エディッション(例、塩基エディタードメイン)、またはターゲットDNA切断(例えば、ヌクレアーゼドメイン)を可能にするドメインを含んでいてもよい。操作されたZFPドメインの例を図4および8Aの表に示す。
本発明の操作されたZFP融合タンパク質のZFPドメインは、少なくとも1個(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、またはそれ以上)のジンクフィンガーを含んでいてもよい。1個のフィンガーを有するZFPドメインは、典型的に、3個または4個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。2個のフィンガーを有するZFPドメインは、典型的に、6個または8個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。3個のフィンガーを有するZFPドメインは、典型的に、9個または12個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。4個のフィンガーを有するZFPドメインは、典型的に、12~15個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。5個のフィンガーを有するZFPドメインは、典型的に、15~18個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。6個のフィンガーを有するZFPドメインは、18~21個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。
ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、図4および8Aの表に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、図4および8Aの表に示されるように、F1、F2、F3、F4、F5、またはF6の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、図4および8Aの表の一行に示される2つの隣接するDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、図4および8Aの表の一行に示されるF1-F2、F2-F3、F3-F4、F4-F5、またはF5-F6の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、図4および8Aの表の一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたZFPは、図4および8Aの表の一行に示されるF1、F2、F3、F4、F5、およびF6(例えば、F1~F6)の配列を含みうる。
ZFPドメインの標的特異性は、例えば、米国特許第2018/0087072号に記載されるZFP骨格配列に対する変異によって改善されうる。前記変異には、DNA骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるがヌクレオチド標的特異性には関連しないZFP骨格の残基に対してなされた変異が含まれる(例えば、Miller et al., Nat Biotechnil.(2019)37(8):945-52を参照のこと)。ある実施態様において、これらの変異には、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。ある実施態様において、これらの変異には、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。さらなる実施態様において、変異は、DNA結合ヘリックスに対して位置(-5)、(-9)および/または(-14)で行われる。ある実施態様において、ジンクフィンガーは、位置(-5)、(-9)および/または(-14)において1つまたはそれ以上の変異を含んでいてもよい。さらなる実施態様において、マルチフィンガーZFPドメインにおける1つまたはそれ以上のジンクフィンガーは、位置(-5)、(-9)および/または(-14)における変異を含みうる。ある実施態様において、位置(-5)、(-9)および/または(-14)におけるアミノ酸(例えば、アルギニン(R)またはリジン(K))は、アラニン(A)、ロイシン(L)、セリン(S)、アスパラギン酸(N)、グルタミン酸(E)、チロシン(Y)、および/またはグルタミン(Q)において変異を有する。1個、2個、または3個の骨格変異を有する操作されたZFPの例を図4、8A、9Aおよび9Bの表に示す。図4および8A中の記号「^」は、示される認識ヘリックスの1番目のアミノ酸の4位上流のアルギニン(R)残基がグルタミン(Q)に変化されていることを示し、図9Aおよび9Bの表中に太字で示される。各認識ヘリックス配列では、7個のDNA結合アミノ酸の位置に-1、+1、+2、+3、+4、+5、および+6の番号が付けられている。よって、RからQへの置換の位置は(-5)として番号付けされる。
ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、図4および8Aの表に示されるように、DNA結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。ある実施態様において、本発明の操作されたZFPは、図4および8Aの表の一行に示されるように、DNA結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたZFPは、図9Aおよび9Bの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたZFPは、翻訳後修飾後に配列が現れるので、図9Aおよび9Bの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。例えば、翻訳後修飾は、図9Aおよび9Bの表の一行に示されるように、配列から開始因子メチオニン残基を除去していてもよい。
ある実施態様において、本発明のZFP-TFは、1個またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む。前記ドメインは、例えば、1つのドメインが、1個またはそれ以上(例えば、4個、5個、または6個)のジンクフィンガーを含み、別のドメインが、さらに1個またはそれ以上(例えば、4個、5個、または6個)のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な可撓性リンカーを介して一緒に連結されていてもよい。ある実施態様において、前記リンカーは、フィンガーアレイが、8個、9個、10個、11個または12個またはそれ以上のフィンガーを含む1個のDNA結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施態様において、前記リンカーは、可撓性リンカーなどの非定型リンカーである。例えば、2つのZFPドメインは、構造(N末端からC末端まで)ZFP-ZFP-TF、TF-ZFP-ZFP、ZFP-TF-ZFP、またはZFP-TF-ZFP-TFにおける転写リプレッサーTFに連結されていてもよい(2つのZFP-TF融合タンパク質はリンカーを介して融合される)。
ある実施態様において、ZFP-TFは、「ツーハンド(two-handed)」、すなわち、それらは、介在するアミノ酸によって分離された2つのジンクフィンガークラスター(2つのZFPドメイン)を含み、前記2つのZFPドメインが2つの不連続な標的部位に結合している。ツーハンドタイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例は、SIP1であり、4個のジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、3個のフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置している(Remacleetal., EMBO J.(1999)18(18):5073-84)。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、2個の標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。
あるいは、DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来していてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ、例えば、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII、およびI-TevIIIなどの認識配列が知られている。米国特許第5,420,032号および第6,833,252号;Belfort et al., NucleicAcidsRes.(1997)25:3379-88; Dujon et al., Gene(1989)82:115-8; Perler et al., NucleicAcidsRes.(1994)22:1125-7; Jasin, Trends Genet(1996)12:224-8; Gimble et al., JMolBiol.(1996)263:163-80; Argast et al., JMolBiol.(1998)280:345-53;ならびにニューイングランドバイオラボのカタログなども参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al., Mol Cell(2002)10:895-905; Epinat et al., NucleicAcidsRes.(2003)31:2952-62; Ashworth et al., Nature(2006)441:656-59; Paques et al., Current Gene Therapy(2007)7:49-66;および米国特許公報第2007/0117128号を参照のこと。
III.ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載のZFPドメインは、転写因子に融合されていてもよい。ある実施態様において、前記転写因子は、転写リプレッサードメインであって、前記ZFPおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーによって、または二量体化によって(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質を介して)相互に結合していてもよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して相互に結合されたポリペプチドの複合体を意味する。転写リプレッサードメインは、ZFPドメインのC末端またはN末端を含むいずれかの適切な位置でZFPドメインと結合することができる。
本明細書に記載のZFPドメインは、転写因子に融合されていてもよい。ある実施態様において、前記転写因子は、転写リプレッサードメインであって、前記ZFPおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーによって、または二量体化によって(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質を介して)相互に結合していてもよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して相互に結合されたポリペプチドの複合体を意味する。転写リプレッサードメインは、ZFPドメインのC末端またはN末端を含むいずれかの適切な位置でZFPドメインと結合することができる。
ある実施態様において、本発明のZFP-TFの2つまたはそれ以上が患者において同時に使用され、前記ZFP-TFは、PRNP発現の最適な抑制を達成するために、PRNP遺伝子の異なる標的領域に結合する。
A.転写リプレッサードメイン
本発明のZFP-TFは、本明細書に記載される操作されたZFPドメインおよびPRNP遺伝子の転写活性を弱める1つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインを含む。1つまたはそれ以上の操作されたZFPドメインおよび1つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインは、可撓性リンカーによって結合されていてもよい。転写リプレッサードメインの非限定的な例は、KOX1のKRABドメイン、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-ベータ誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、核ホルモン受容体(例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体)、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、およびMeCP2である。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらに例示的な抑制ドメインには、以下に限定されないが、ROM2およびAtHD2Aが含まれる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照すること。
本発明のZFP-TFは、本明細書に記載される操作されたZFPドメインおよびPRNP遺伝子の転写活性を弱める1つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインを含む。1つまたはそれ以上の操作されたZFPドメインおよび1つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインは、可撓性リンカーによって結合されていてもよい。転写リプレッサードメインの非限定的な例は、KOX1のKRABドメイン、KAP-1、MAD、FKHR、EGR-1、ERD、SID、TGF-ベータ誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-ERB-A、MBD2、MBD3、TRa、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、核ホルモン受容体(例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体)、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、およびMeCP2である。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらに例示的な抑制ドメインには、以下に限定されないが、ROM2およびAtHD2Aが含まれる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照すること。
ある実施態様において、転写リプレッサードメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質10/KOX1(ZNF10/KOX1)のクルッペル関連ボックス(KRAB)ドメインからの配列(例えば、GenBank番号NM_015394.4)を含む。例示的なKRABドメイン配列は:
DAKSLTAWSR TLVTFKDVFV DFTREEWKLL DTAQQIVYRN VMLENYKNLV SLGYQLTKPD VILRLEKGEE PWLVEREIHQ ETHPDSETAF EIKSSV
(配列番号261)
である。
このKRAB配列の変異体はもまた、同一または類似の転写抑制機能を有する限り用いられてもよい。
DAKSLTAWSR TLVTFKDVFV DFTREEWKLL DTAQQIVYRN VMLENYKNLV SLGYQLTKPD VILRLEKGEE PWLVEREIHQ ETHPDSETAF EIKSSV
(配列番号261)
である。
このKRAB配列の変異体はもまた、同一または類似の転写抑制機能を有する限り用いられてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がなく、またはほとんど伴わず、図4および8Aの表の一行に示される標的部位に結合する。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるZFP-TFの活性を測定することによって決定されてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、図4および8Aの表に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、図4および8Aの表の一行に示される2つの隣接するDNA結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、図4および8Aの表の一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、図9Aおよび9Bの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、図9Aおよび9Bの表の一行に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたZFP-TFは、翻訳後修飾後に配列が現れるため、図9Aおよび9Bの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたZFP-TFは、配列が翻訳後修飾の後に現れるため、図9Aおよび9Bの表の一行に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、翻訳後修飾は、図9Aおよび9Bの表に示される配列からの開始因子メチオニン残基を除去してもよい。
B.ペプチドリンカー
本発明のZFP-TFのZFPドメインおよび転写リプレッサードメイン、ならびに/あるいは前記ZFPドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約5~200個のアミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸)の切断不可能なペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。例えば、上記ならびに米国特許第6,479,626号;第6,903,185号;第7,153,949号;第8,772,453号;および第9,163,245号;およびWO2011/139349を参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。リンカーの非限定的な例は、DGGGS(配列番号252)、TGEKP(配列番号253)、LRQKDGERP(配列番号254)、GGRR(配列番号255)、GGRRGGGS(配列番号256)、LRQRDGERP(配列番号257)、LRQKDGGGSERP(配列番号258)、LRQKD(G3S)2ERP(配列番号259)、およびTGSQKP(配列番号260)である。ある実施態様において、TGEKPFA(配列番号348)および/またはTGSQKPFQ(配列番号349)は、ZFPドメイン内のジンクフィンガーを、ならびに/あるいはLRQKDAARGSGG(配列番号350)またはLRGSGG(配列番号351)は、ZFPドメインを、転写リプレッサードメインに結合する。
本発明のZFP-TFのZFPドメインおよび転写リプレッサードメイン、ならびに/あるいは前記ZFPドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約5~200個のアミノ酸(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸)の切断不可能なペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。例えば、上記ならびに米国特許第6,479,626号;第6,903,185号;第7,153,949号;第8,772,453号;および第9,163,245号;およびWO2011/139349を参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。リンカーの非限定的な例は、DGGGS(配列番号252)、TGEKP(配列番号253)、LRQKDGERP(配列番号254)、GGRR(配列番号255)、GGRRGGGS(配列番号256)、LRQRDGERP(配列番号257)、LRQKDGGGSERP(配列番号258)、LRQKD(G3S)2ERP(配列番号259)、およびTGSQKP(配列番号260)である。ある実施態様において、TGEKPFA(配列番号348)および/またはTGSQKPFQ(配列番号349)は、ZFPドメイン内のジンクフィンガーを、ならびに/あるいはLRQKDAARGSGG(配列番号350)またはLRGSGG(配列番号351)は、ZFPドメインを、転写リプレッサードメインに結合する。
ある実施態様において、ペプチドリンカーは、3~20個のアミノ酸残基の長さであり、Gおよび/またはSが多い。このようなリンカーの非限定的な例は、G4S型リンカー(配列番号347)、すなわち、1個またはそれ以上(例えば、2個、3個、または4個)のGGGGS(配列番号251)モチーフ、または前記モチーフの変形(前記モチーフから1個、2個、または3個のアミノ酸の挿入、欠失、および置換を有するものなど)を含むリンカーである。
IV.ZFP-TFの発現
本開示のZFP-TFは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。前記核酸分子は、RNAまたはcDNA分子でありうる。核酸分子は、脂質:核酸複合体(例えば、リポソーム)を含む組成物の注射を介して患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ZFP-TFは、ZFP-TFをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されうる。前記発現ベクターは、神経系の細胞におけるZFP-TFのコーディング配列の発現を可能にする発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などを含みうる。ある実施態様において、前記発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在したままである。他の実施態様において、前記発現ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
本開示のZFP-TFは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。前記核酸分子は、RNAまたはcDNA分子でありうる。核酸分子は、脂質:核酸複合体(例えば、リポソーム)を含む組成物の注射を介して患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ZFP-TFは、ZFP-TFをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されうる。前記発現ベクターは、神経系の細胞におけるZFP-TFのコーディング配列の発現を可能にする発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などを含みうる。ある実施態様において、前記発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在したままである。他の実施態様において、前記発現ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
ある実施態様において、脳におけるZFP-TF発現を指示するためのベクター上のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターには、以下に限定されないが、レトロウイルスRSV LTRプロモーター(適宜、RSVエンハンサーを有する)、CMVプロモーター(適宜、CMVエンハンサーを有する)、CMV前初期プロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、EF1αプロモーター、MoMLV LTR、CK6プロモーター、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン/ウサギβ-グロビンプロモーター(CAGプロモーター;Niwa et al., Gene(1991)108 (2):193-9)、およびRU-486応答性プロモーターが含まれる。ニューロン特異的プロモーター、例えば、シナプシンIプロモーター、MeCP2プロモーター、CAMKIIプロモーター、PrPプロモーター、GFAPプロモーター、またはニューロンとグリア細胞への発現を制限する操作されたか、または天然のプロモーターなどもまた用いられうる。
エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム(例えば、エキソソーム)、またはウイルス形質導入を含むが、これらに限定されない、細胞にヌクレオチド配列を導入するためのいずれかの方法が用いられてもよい。
発現ベクターのインビボ送達のために、ウイルス形質導入が用いられてもよい。当該技術分野で公知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクチンベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクターが、本開示における使用のために当業者によって用いられうる。ある実施態様において、本明細書で用いられるウイルスベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである。AAVベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のための安定したエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、CNS遺伝子送達に特に適する(Hadaczek et al., MolTher.(2010)18:1458-61; Zaiss, et al., GeneTher.(2008)15:808-16)。いずれかの適切なAAV血清型が用いられてもよい。例えば、前記AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9、またはAAVrh10、あるいはAAV2/8、AAV2/5、AAV2/6、またはAAV2/9などのシュードタイプのもの(すなわち、複数の血清型に由来するAAV;例えば、rAAVが、そのゲノムおよびAAV8、5、6、または9キャプシドにAAV2逆方向末端反復(ITR)を含む)であってもよい。ある実施態様において、前記発現ベクターは、AAVウイルスベクターであり、昆虫細胞/バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系などの産生系においてAAVビリオンの生成を可能にするために、そのゲノムが、両端にAAV逆末端反復(ITR)配列を有することを含む構築物を含む組換えAAVビリオンによって標的ヒト細胞に導入される。前記AAVは、そのキャプシドタンパク質が、ヒトまたは非ヒト霊長類において免疫原性を低下させるか、または形質導入能を高めるように操作されていてもよい。ある実施態様において、AAV9が用いられる。本明細書に記載のウイルスベクターは、当該技術分野で公知の方法を用いて生成されうる。いずれかの適切な許容細胞またはパッケージング細胞がウイルス粒子を生成するために用いられてもよい。例えば、哺乳動物または昆虫細胞がパッケージング細胞株として用いられうる。
V.医薬用途
本発明のZFP-TFは、PrP発現の下方調節を必要とする患者を治療するために用いることができる。前記患者はプリオン病に罹患しているか、または発症するリスクがある。治療されるプリオン病は、家族性、孤発性、または獲得性のプリオン病であってもよく、CJD、sCJD、vCJD、GSS、FFI、sFI、クールー病、VPSPrでありうる。リスクのある患者には、遺伝的素因のある患者、ならびに狂牛病に罹っている牛の肉またはその他の環境に起因するプリオンにさらされた患者が含まれる。本開示は、治療を必要とするヒト患者などの対象における神経変性疾患を治療するための方法であって、ZFP-TF(例えば、それを発現するrAAVベクター)の治療上有効量(例えば、PRNP発現の十分な抑制を可能にする量)を、前記対象の神経系にを導入することを含む方法を提供する。ある実施態様において、神経変性疾患は、プリオン病である。用語「治療する」は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の増加を包含する。脳脊髄液または血漿中のプリオンまたはニューロフィラメント軽鎖(NfL)レベルを含むがこれらに限定されないバイオマーカーもまた、治療の進行をモニターするために測定されうる。
本発明のZFP-TFは、PrP発現の下方調節を必要とする患者を治療するために用いることができる。前記患者はプリオン病に罹患しているか、または発症するリスクがある。治療されるプリオン病は、家族性、孤発性、または獲得性のプリオン病であってもよく、CJD、sCJD、vCJD、GSS、FFI、sFI、クールー病、VPSPrでありうる。リスクのある患者には、遺伝的素因のある患者、ならびに狂牛病に罹っている牛の肉またはその他の環境に起因するプリオンにさらされた患者が含まれる。本開示は、治療を必要とするヒト患者などの対象における神経変性疾患を治療するための方法であって、ZFP-TF(例えば、それを発現するrAAVベクター)の治療上有効量(例えば、PRNP発現の十分な抑制を可能にする量)を、前記対象の神経系にを導入することを含む方法を提供する。ある実施態様において、神経変性疾患は、プリオン病である。用語「治療する」は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の増加を包含する。脳脊髄液または血漿中のプリオンまたはニューロフィラメント軽鎖(NfL)レベルを含むがこれらに限定されないバイオマーカーもまた、治療の進行をモニターするために測定されうる。
本開示は、ウイルスベクター、例えば、組換えゲノムがZFP-TFのための発現カセットを含む組換えrAAVなどを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体、例えば、水、生理食塩水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)、デキストロース、グリセロール、ショ糖、乳糖、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどをさらに含んでいてもよい。さらに、前記組成物は、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などを含みうる。前記医薬組成物は、送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞などを含んでいてもよい。
本開示の治療法の標的となる細胞は、以下に限定されないが、神経細胞(例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン);グリア細胞(例えば、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞);上衣細胞;または神経上皮細胞を含む。治療法の標的となる脳領域は、例えば、例えば、大脳皮質(古典型CJD)、視床(FFI)、脳幹(スクレイピー、BSE、および慢性消耗病)、および小脳(クールー病)であってもよい。前記標的となる領域は、線条体内注射、視床内注射、脳内注射、大槽内(ICM)注射、より一般的には、実質内注射、脳室内(ICV)注射、髄腔内注射、または静脈内注射によって直接到達されうる。他の投与経路には、以下に限定されないが、脳内、心室内、鼻腔内、または眼内投与が含まれる。ある実施態様において、ウイルスベクターは、例えば、髄腔内および/または脳内注射、または大槽内注射を介して脳脊髄液(CSF)に直接投与された後、CNS組織全体に広がる。他の実施態様において、ウイルスベクターは、血液脳関門を通過し、静脈内投与後に対象のCNS組織全体に広範囲に分布することを達成する。他の実施態様において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。ある場合において、ウイルスベクターは、実質内送達後に、他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受けうる。ある態様において、ウイルスベクターは、高い効率にて安定で無毒な遺伝子導入を達成する、異なるCNS組織標的化能力(例えば、CNS組織向性)を有する。
一例として、医薬組成物は、脳室内投与により、患者の前脳の脳室領域、例えば、右側脳室、左側脳室、第三脳室、または第四脳室などに提供されうる。医薬組成物は、脳内投与、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、大脳、髄質、橋、小脳、青斑核橋、髄質、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、大脳、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳軟膜へまたはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されうる。脳内投与には、ある場合において、脳周辺のくも膜下腔の脳脊髄液(CSF)への薬剤の投与が含まれうる。
ある場合において、脳内投与は、定位固定法を用いた注射に関する。定位固定法は、当該技術分野で周知であり、典型的に、特定の脳内領域、例えば、心室領域に対して注射を誘導するために一緒に用いられるコンピュータおよび3次元走査装置の使用を伴う。マイクロインジェクションポンプ(例えば、World Precision Instruments製)もまた用いられてもよい。ある場合において、マイクロインジェクションポンプは、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために用いられる。ある場合において、組成物の注入速度は、0.1μl/分~100μl/分の範囲である。当業者に理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重/サイズ、AAVの血清型、必要とされる投薬量、および対象とする脳内領域を含む様々な因子に依存する。よって、他の注入速度は、当業者が特定の状況において適切であると見なされるものであってもよい。
rAAVの対象への送達は、例えば、静脈内投与によって行われてもよい。ある例において、rAAVを、脳組織、脊髄、脳脊髄液(CSF)、神経細胞、グリア細胞、髄膜、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、間質腔などに局所的に送達することが望まれうる。ある場合において、組換えAAVは脳室領域に注入することによりCNSに、ならびに実質、皮質、小脳葉、視床、海馬、または他の脳領域、あるいは脳領域の組み合わせに直接送達されてもよい。AAVは、当該技術分野で公知の神経外科技術を用いて、例えば、定位固定注射などによってニードル、カテーテル、または関連するデバイスで送達されうる(例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29を参照のこと)。
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または同等のものもまた、本開示の実施または試験で用いることができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載の神経学、医学、医薬品化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に行われているか、または本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施される。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。本明細書および実施態様を通して、単語「有する(have)」および「含む(comprise)」、あるいはこれらの変形「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(comprises)」、または「含む(comprising)」などは、記載される整数または整数群を含むが、他の整数または整数群を除くことではないことを意味するものと理解される。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。多くの文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれもが当該技術分野の一般的な技術常識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で用いられるように、1つまたはそれ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記載される参照値に類似する値を意味する。特定の実施態様において、前記用語は、特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、記載され参照値の(より大きいか、または小さいかの)いずれかの方向において10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を意味する。
本発明がより理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであって、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1:ZFP-TFのスクリーニング
マウスPRNP遺伝子の発現を抑制するZFP-TFを同定するために、転写開始部位(TSS)の上流約500bpからTSSの下流約500bpまでに及ぶマウスPRNP遺伝子の領域において15から22bpまでの配列に結合すると予測される384個のZFP-TFのライブラリーを設計し、スクリーニングした(図1および2)。ZFP-TFの標的領域は、前記2つの図中に矢印で示され、矢印の方向は、ZFP-TFが結合するDNA鎖(5’から3’)を示す。前記ZFP-TFのうちの192個は、親タンパク質であり、残りの半分は、3つのRからQへの変異を含む親タンパク質の変異体であった(Miller et al., NatBiotechnol.(2019)37(8):945-52)。この研究では、KRABドメイン配列(配列番号262)を転写リプレッサーとして使用し、ZFPドメインのC末端に融合させた。
マウスPRNP遺伝子の発現を抑制するZFP-TFを同定するために、転写開始部位(TSS)の上流約500bpからTSSの下流約500bpまでに及ぶマウスPRNP遺伝子の領域において15から22bpまでの配列に結合すると予測される384個のZFP-TFのライブラリーを設計し、スクリーニングした(図1および2)。ZFP-TFの標的領域は、前記2つの図中に矢印で示され、矢印の方向は、ZFP-TFが結合するDNA鎖(5’から3’)を示す。前記ZFP-TFのうちの192個は、親タンパク質であり、残りの半分は、3つのRからQへの変異を含む親タンパク質の変異体であった(Miller et al., NatBiotechnol.(2019)37(8):945-52)。この研究では、KRABドメイン配列(配列番号262)を転写リプレッサーとして使用し、ZFPドメインのC末端に融合させた。
各ZFP-TFをコードするメッセンジャーRNAを調製し、6回希釈で96ウェルプレートに分注した。マウスNeuro2a細胞を、Amaxa(登録商標)Nucleofector(登録商標)機器(Lonza,Switzherland)を用いてmRNAでトランスフェクトした。24時間後、トータルRNAを前記細胞から抽出し、PRNPおよび2つの参照遺伝子(ATP5b、EIF4A2)の発現をリアルタイムRT-qPCRを用いてモニターした。このために、前記細胞を溶解し、逆転写を、C2CTキットを製造業者の説明書に従って用いて行った。TaqMan定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いてPRNPの発現レベルを測定した。PRNP発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子EIF4A2およびATP5Bの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬トランスフェクションおよびPRNPを標的としないことが公知のZFP-TFによるトランスフェクションを、ネガティブコントロールとして使用した。
図3A~Dは、mRNA形態のZFP-TFの示された量の投与24時間後の正規化したPRNP発現を示す(左から右に、3ng、10ng、30ng、100、ng、300ngまたは1000ngの示されたZFP-TF mRNA用量)。PRNP発現を抑制するZFP-TFの能力もまた、図2の色勾配によって示す(ZFP-TFが強力であるほどその色は濃くなる)。
384個のZFP-TFのうち、36個をさらなる研究のために選択した。これらの36個のZFP-TFによって標的とされるマウスPRNPゲノム配列、ならびにZFP-TFにおける6個のジンクフィンガーのDNA結合アミノ酸配列を図4に示す。対応するZFPの全アミノ酸配列を図9Aに示す。Neuro2a細胞におけるこれらの36個のZFP-TFの各々の活性を図5に示す。図5のデータは、ZFP-TF##81185、81187、81189、81193、81199、81201、81208、81210、81228、81230、81234、81240、81244、81278、81282、81295、81303、81309、および81312が特に強力であることを示し、マウスPRNP遺伝子の発現に対する用量依存的な抑制効果が示される。
実施例2:一次ニューロンにおける選択したZFP-TFのPRNP抑制活性
次に、マウスの一次皮質ニューロンにおいて選択した36個のZFP-TFの活性を試験した。一次マウス皮質ニューロン(MCN;Gibco)は、製造業者のプロトコルに従って培養した。ZFP-TFのコーディング配列を、発現を促進するためのヒトSYN1プロモーターを用いて組換えAAV2/6ベクターにクローン化した。ウイルスをHEK293T細胞で生成し、CsCl密度勾配を用いて精製し、当該技術分野で公知の方法に従ってリアルタイムqPCRによって用量設定した。精製したウイルスを用いて、DIV2上の培養初代MCNを、1x102vg/細胞、3x102vg/細胞、1x103vg/細胞、3x103vg/細胞、1x104vg/細胞、または3x104vg/細胞で感染させた。7日後、トータルRNAをニューロンから抽出し、PRNP mRNAおよび3つの参照遺伝子(ATP5b、EIF4A2、GAPDH)の発現をリアルタイムRT-qPCRを使用してモニターした。
次に、マウスの一次皮質ニューロンにおいて選択した36個のZFP-TFの活性を試験した。一次マウス皮質ニューロン(MCN;Gibco)は、製造業者のプロトコルに従って培養した。ZFP-TFのコーディング配列を、発現を促進するためのヒトSYN1プロモーターを用いて組換えAAV2/6ベクターにクローン化した。ウイルスをHEK293T細胞で生成し、CsCl密度勾配を用いて精製し、当該技術分野で公知の方法に従ってリアルタイムqPCRによって用量設定した。精製したウイルスを用いて、DIV2上の培養初代MCNを、1x102vg/細胞、3x102vg/細胞、1x103vg/細胞、3x103vg/細胞、1x104vg/細胞、または3x104vg/細胞で感染させた。7日後、トータルRNAをニューロンから抽出し、PRNP mRNAおよび3つの参照遺伝子(ATP5b、EIF4A2、GAPDH)の発現をリアルタイムRT-qPCRを使用してモニターした。
該データは、36個の選択した全てのZFP-TFが、マウスニューロンにおけるPRNP発現に対して強力な用量依存的抑制活性を示したことを示す(図6Aおよび6B)。
実施例3:マウスPRNPのZFP-TFのオフターゲット活性
広範囲の遺伝子発現に対するマウスPrnpZFP-TFのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なプリオンZFP-TFをコードするAAV6で処理した一次マウス皮質ニューロンから分離したトータルRNAを用いてマイクロアレイ実験を行った。
広範囲の遺伝子発現に対するマウスPrnpZFP-TFのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なプリオンZFP-TFをコードするAAV6で処理した一次マウス皮質ニューロンから分離したトータルRNAを用いてマイクロアレイ実験を行った。
一次マウス皮質ニューロンは、Gibcoから購入した。細胞をポリ-D-リジンでコーティングした24ウェルプレートに200,000細胞/ウェルでプレーティングし、Gibco Neurobasal Medium(GlutaMAX(登録商標)Iサプリメント、B27サプリメント、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含む)を使用して製造業者の説明書に従って維持した。(DIV2で)プレーティング48時間後、該細胞を3E3 VG/細胞の感染多重度(MOI)でAAV6に感染させ、7日後に回収した(DIV9;3~4日ごとに50%の培地交換を行った)。その後、RNA分離およびマイクロアレイ分析を行った。
オフターゲット分析は、GeneTitan(登録商標)プラットフォーム(Clariom Sキット)を用いて製造業者の説明書に従って行った。該アッセイ結果を、TACソフトウェアを用いて分析した。遺伝子は、FDR補正したp値が0.05以下の場合に差次的に調節されるものとした。最小のオフターゲットを有することが公知のZFP-TFと模擬トランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図7Aは、一次マウス皮質ニューロンにおいて試験した36個の代表的なマウスPRNP ZFP-TFのマイクロアレイ結果を示す。広範囲のオフターゲット特異性が観察され、一部のZFP-TFは、オフターゲット活性が非常に低いか、全く示さなかった。図7Bは、各ZFP-TFについて調節不全の数を示す。
実施例4:ヒトiPSC由来ニューロンにおけるヒトPRNP ZFP-TFの活性
ヒトPRNPを標的とするように設計された12個のZFP-TFを、ヒトiPSC由来のGABA作動性ニューロン(Cellular Dynamics International)で試験した。これら12個のZFP-TFによって標的とされるヒトPRNPゲノム配列、ならびにZFP-TFにおけるジンクフィンガーのDNA結合アミノ酸配列を図8Aに示す。対応するZFPの全アミノ酸配列を図9Bに示す。前記細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングした96ウェルプレートに1ウェルあたり40,000細胞の密度でプレーティングし、製造業者の説明書に従って維持した。前記細胞を、プレーティング48時間後に6個の異なるMOI(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5、および3E5)で目的のZFP-TFを発現するAAV6にてトランスフェクトした。形質導入された細胞を最大33日間維持した(3~5日ごとに50~75%の培地交換を行った)。AAV感染31日後に細胞を回収した。
ヒトPRNPを標的とするように設計された12個のZFP-TFを、ヒトiPSC由来のGABA作動性ニューロン(Cellular Dynamics International)で試験した。これら12個のZFP-TFによって標的とされるヒトPRNPゲノム配列、ならびにZFP-TFにおけるジンクフィンガーのDNA結合アミノ酸配列を図8Aに示す。対応するZFPの全アミノ酸配列を図9Bに示す。前記細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングした96ウェルプレートに1ウェルあたり40,000細胞の密度でプレーティングし、製造業者の説明書に従って維持した。前記細胞を、プレーティング48時間後に6個の異なるMOI(1E3、3E3、1E4、3E4、1E5、および3E5)で目的のZFP-TFを発現するAAV6にてトランスフェクトした。形質導入された細胞を最大33日間維持した(3~5日ごとに50~75%の培地交換を行った)。AAV感染31日後に細胞を回収した。
回収した細胞を溶解し、逆転写を、C2CTキットを使用して製造業者の説明書に従って行った。TaqMan定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いてPRNPの発現レベルを測定した。PRNP発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子EIF4A2、ATP5B、およびGAPDHの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬感染をネガティブコントロールとして使用した。
用量依存的な抑制は、ヒトPRNPを標的とするZFP-TFを用いて示した。達成された最大の抑制は99%以上であった一方で、プリオンの抑制の程度が低いZFP-TFも同定された(例えば、最高用量で約90%、約75%、または約80%)。
ヒトPRNPを標的とする12個の例示的なZFP-TFの用量依存的な活性を図8Bおよび8Cに示す。これらのデータは、前記ZFP-TFが広範囲のプリオン抑制活性プロファイルを示し、試験した最高用量におけるプリオンmRNA抑制が約75%~99%以上の範囲であることを示している。
実施例5:ヒトPRNPZFP-TFのオフターゲット活性
広範囲の遺伝子発現に対するヒトPRNPZFP-TFのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なヒトPRNPZFP-TFをコードするAAVで処理したヒトiPSC由来ニューロンから単離したトータルRNAを用いてマイクロアレイ実験を行った。
広範囲の遺伝子発現に対するヒトPRNPZFP-TFのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なヒトPRNPZFP-TFをコードするAAVで処理したヒトiPSC由来ニューロンから単離したトータルRNAを用いてマイクロアレイ実験を行った。
ヒトiPSC由来ニューロンを、実施例4に記載されているように処理した。マイクロアレイ分析のために、前記細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングした24ウェルプレートに1ウェルあたり260,000細胞の密度でプレーティングし、プレーティング48時間後に1E5 VG/細胞で目的のZFP-TFを発現するAAV6にてトランスフェクトし、ウイルストランスフェクション19日後に回収した。トータルRNAを回収した細胞から単離し、マイクロアレイ解析のために使用した。
オフターゲット分析は、GeneTitan(登録商標)プラットフォーム(Clariom Sキット)を使用して製造業者の説明書に従って行った。アッセイ結果を、TACソフトウェアを用いて分析した。遺伝子は、FDR補正したp値が0.05以下の場合に差次的に調節されるものとした。最小のオフターゲットを有することが公知のZFP-TFと模擬トランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図8Dは、ヒトiPSC由来ニューロンで試験した12個のヒトPRNPのZFP-TFのマイクロアレイ結果を示す。広範囲のオフターゲット特異性が観察され、一部のZFP-TFは、オフターゲット活性が非常に低いか、全く示さなかった。図8Eは、各ZFP-TFについて調節不全の数を示す。広範囲のさまざまなオフターゲット特異性が観察され、一部のZFP-TFは非常に低いオフターゲット活性を示した。
Claims (28)
- ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ZFPドメインが、哺乳類のプリオンタンパク質遺伝子(PRNP遺伝子)における標的領域に結合する、融合タンパク質。
- 前記標的領域が、前記PRNP遺伝子における転写開始部位(TSS)の約1kbまたは500bp以内である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記PRNP遺伝子が、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスのPRNP遺伝子である、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、6個のジンクフィンガーを含み、適宜、前記PRNP遺伝子の発現を、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、最小において、少なくとも約40%、75%、90%、95%、または99%まで抑制する、請求項1~3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記転写リプレッサードメインが、KOX1のKRABドメインアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、ペプチドリンカーを介して前記転写リプレッサードメインに結合している、請求項1~5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、図4および8Aの表に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記ZFPドメインが、図4および8Aの表における一行に示されるDNA結合認識ヘリックス配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記コーディング配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項1~8のいずれか1項に記載の融合タンパク質のコーディング配列を含む、核酸構築物。
- 前記転写調節エレメントが、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーターであり、前記プロモーターが、適宜、ヒトシナプシンIプロモーターである、請求項9に記載の核酸構築物。
- 請求項9または10に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、脳細胞または多能性幹細胞であって、前記幹細胞が、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 請求項9または10に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
- 前記組換えウイルスが、適宜、血清型6または9の組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項14に記載の組換えウイルス。
- 請求項9または10に記載の核酸構築物、あるいは請求項14または15に記載の組換えウイルス、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物の脳細胞におけるプリオンタンパク質(PrP)の発現を阻害するための方法であって、適宜、請求項7または8に記載の核酸構築物あるいは請求項14または15に記載の組換えウイルスを導入することにより、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入し、それにより前記細胞におけるPrPの発現を阻害することを含む、方法。
- 前記哺乳動物の脳細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスの細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物の脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記細胞が、プリオン病に罹患しているか、または発症するリスクのある患者の脳内にあり、前記プリオン病が、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病である、請求項17~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、孤発性CJD、変異型CJD、ゲルストマン・ストロスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、孤発性致死性不眠症(sFI)、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症(VPSPr)である、請求項20に記載の方法。
- 請求項14または15に記載の組換えウイルスを前記細胞に導入することを含む、請求項17~21のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項15に記載の組換えAAVを前記患者に投与することを含む、患者の神経変性疾患を治療し、または予防するための方法。
- 前記神経変性疾患が、プリオン病であって、適宜、前記プリオン病が、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病である、請求項23に記載の方法。
- 前記AAVが、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、または視床内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して患者に導入される、請求項23または24に記載の方法。
- 前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、孤発性CJD、変異型CJD、ゲルストマン・ストロスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、孤発性致死性不眠症(sFI)、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症(VPSPr)である、請求項24または25に記載の方法。
- 請求項17~26のいずれか1項に記載の方法で使用するための、請求項1~8のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項9または10に記載の核酸構築物、あるいは請求項14または15に記載の組換えウイルス。
- 請求項18~25のいずれか1項に記載の方法における患者を治療するための薬剤の製造のための、請求項1~8のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項9または10に記載の核酸構築物、あるいは請求項14または15に記載の組換えウイルスの使用。
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