KR20230080439A - 알파-시누클레인 발현을 억제시키기 위한 신규 아연 핑거 단백질 전사 인자 - Google Patents

알파-시누클레인 발현을 억제시키기 위한 신규 아연 핑거 단백질 전사 인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경계에서 알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 아연 핑거 융합 단백질, 및 상기 단백질을 이용하여 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 알츠하이머병, 및 다른 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

알파-시누클레인 발현을 억제시키기 위한 신규 아연 핑거 단백질 전사 인자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 2일에 출원된 미국 가출원 63/087,164를 우선권 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2021년 9월 30일에 작성된 서열 목록의 전자 카피는 025297_WO035_SL.txt로 명명되고, 그 크기는 167,361 바이트이다.
파킨슨병 (PD)은 운동 결함을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애이다. PD 환자 중 대략 50%는 결국 치매에 걸린다. PD는 알츠하이머병에 이어 두 번째로 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다. 미국에는 대략 백만 명의 PD 환자가 존재하며, 매년 50,000-60,000건의 신규 사례가 있다. 산발성 형태의 PD의 전형적인 발병 연령은 60-70세이다. 일반적으로 초기 진단에서 PD 합병증으로 사망할 때까지 15-20년의 기간이 걸린다.
PD 환자는 운동완만증, 강직, 구부정한 자세, 가면 얼굴 표정, 몸통의 앞쪽으로 기울어짐, 팔 흔들기 감소, 팔꿈치, 손목, 엉덩이 및 무릎 굽힘, 자세 불안정, 안정시 사지 떨림, 및 셔플링, 짧은 보폭 보행과 같은 다양한 운동 증상을 나타낸다. 환자는 종종 후각 상실, 수면 장애, 장 운동 감소, 신경병증성 통증 및 치매를 비롯한 비운동성 증상도 보인다. 예컨대, 문헌 [Jeanjean and Aubert, Lancet (2011) 378(9805):1773-4]; [Kalia and Lang, Lancet (2015) 386(9996):896-912]을 참조한다.
PD 환자의 뇌는 흑질이라고 불리는 부위에서의 도파민 생산 (도파민성) 뉴런의 손실을 특징으로 한다. PD 환자의 뇌는 또한 뉴런 내부에 형성된 단백질 응집체 또는 클럼프인 루이소체, 및 루이소체와 유사한 단백질 응집체를 함유하는 신경돌기 (뉴런의 돌기)인 루이 신경돌기가 존재하는 것을 특징으로 한다. 루이소체는 1912년 프레데릭 루이(Friedrich Lewy)에 의해 PD 환자의 뇌에서 처음 발견되었으며, 나중에 알파-시누클레인의 응집 및 불용성 형태의 원섬유를 포함하는 것으로 밝혀졌다 ([Goedert and Spillantini, Mol Psychiatry. (1998) 3(6):462-5]; [Spillantini et al., Neurosci Lett. (1998) 251(3):205-8]; [Spillantini et al., Nature (1997) 388(6645):839-40]). 알파-시누클레인 유전자 (SNCA)의 돌연변이는 1997년 PD 가족에서 확인되었다 (예컨대, 문헌 [Polymeropoulos et al., Science (1997) 276(5321):2045-7] 참조). 추후, SNCA 유전자의 중복 및 삼중복 뿐만 아니라, 알파-시누클레인의 추가의 점 돌연변이가 유전성 또는 가족성 형태의 PD와 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 알파-시누클레인 발현 수준을 제어하는 게놈 중 일부의 변화는 비편향된 대규모 집단 연구 (게놈 전체 연관 연구, GWAS)에서 PD 위험 증가와 연관이 있는 것으로 나타났다.
알파-시누클레인은 뉴런의 시냅스전 말단에서 소포체 방출에 관여하는 막 결합 단백질이다. 이는 또한 DNA 수복에서도 중요한 역할을 할 수 있다. 성숙한 알파-시누클레인은 NAC (알츠하이머병 아밀로이드의 비-A-베타 성분) 영역으로 알려진 소수성 아미노산을 함유하는 중앙 코어 영역 (잔기 61-95)을 포함하는 작은 14 kD 단백질이다. NAC는 단백질 응집에 기여한다. 미스폴딩된 알파-시누클레인 폴리펩티드는 올리고머와 원시섬유로 응집되고, 이어서 함께 모여 루이소체에서 발견되는 크고 불용성인 응집체를 형성한다. 축적된 증거는 알파-시누클레인 미스폴딩 및 응집이 PD에서 발생하는 세포 손상에서 중요한 역할을 하고, 결국에는 흑질에서 뉴런의 사멸로 이어진다는 것을 나타낸다. 추가로, 알파-시누클레인의 더 작은 응집체는 프리온 질환에서 볼 수 있는 것과 유사하게 세포에서 세포로 이동하고 뇌 전역으로 확산되는 것으로 밝혀졌다. 알파-시누클레인 응집의 억제는 뉴런의 손상을 감소시키고, PD의 진행을 저속화시키거나, 또는 심지어는 중단시킬 수 있다.
알파-시누클레인의 수준을 감소시키기 위한 현행 접근법은 RNA 수준에서 알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO), 및 세포 밖의 알파-시누클레인의 특정 3D 형상 또는 입체구조를 표적화하는 모노클로날 항체 (mAb)의 사용을 포함한다. 그러나, 알파-시누클레인을 표적화함으로써 PD를 치료하는 임상적으로 효과적인 방법이 여전히 긴급하게 요구되고 있다.
본 개시내용은 인간 SNCA 유전자 중의 또는 그 근처의 부위를 표적화하는 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인을 제공한다. 본 개시내용의 ZFP 도메인은 전사 인자에 융합되어 DNA 수준에서 인간 SNCA 유전자의 발현을 특이적으로 억제시킬 수 있다. 이들 융합 단백질은 (i) SNCA 유전자 중의 표적 영역에 특이적으로 결합하는 ZFP 도메인 및 (ii) 유전자의 전사를 감소시키는 전사 리프레서 도메인을 함유한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 ZFP 도메인은 인간 알파-시누클레인 유전자 (SNCA 유전자) 중의 표적 영역에 결합하는 것인 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역 (즉, 표적 부위)은 SNCA 유전자 중 전사 개시 부위 (TSS, 예컨대, TSS 1, 2a, 또는 2b)의 약 1 kb 이내에 있다. 추가 실시양태에서, 표적 영역은 도 2b 및/또는 4에 제시된 바와 같이 SNCA 유전자의, TSS 2a의 상류 약 500 bp 이내에, TSS 2b의 하류 약 500 bp 이내에 및/또는 TSS 1 상류 또는 하류 약 500 bp 이내에 있다. 표적 영역의 비제한적인 예는 표 1에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의) 아연 핑거를 포함한다. 이는 바람직하게는 검출가능한 오프-타겟 결합 또는 활성 (예컨대, SNCA 유전자가 아닌 유전자에의 결합)은 전혀 없이 또는 최소로 하면서, SNCA 유전자의 발현을 적어도 약 40%, 75%, 90%, 95%, 또는 99%만큼 억제시킬 수 있다. 아연 핑거 도메인의 비제한적인 예는 표 1에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 1에 제시된 하나 이상의 인식 나선 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 융합 단백질은 표시된 백본 돌연변이(들)를 포함하거나, 또는 포함하지 않는, 표의 단일 열로부터의 일부 또는 모든 인식 나선 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 전사 리프레서 도메인은 KOX1 단백질의 KRAB 도메인으로부터의 것이다. 아연 핑거 도메인은 펩티드 링커를 통해 전사 리프레서 도메인에 연결될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 발명의 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물이며, 여기서 코딩 서열은 뇌 세포에서 구성적으로 활성이거나 또는 유도가능한 포유동물 프로모터와 같은 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결되고, 여기서 프로모터는 임의적으로 인간 시냅신 I 프로모터인 것인, 핵산 구축물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 인간 세포, 예컨대, 뇌 세포 또는 만능 줄기 세포일 수 있으며, 여기서 줄기 세포는 임의적으로 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (예컨대, 핵산 구축물 또는 재조합 바이러스, 예컨대 AAV (예컨대, AAV2, AAV6, AAV9, 또는 그의 하이브리드)의 도입을 통해) 인간 뇌 세포 내로 본 발명의 융합 단백질을 도입하여 상기 세포에서 알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는, 인간 뇌 세포에서 알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 방법을 포함한다. 뇌 세포는 뉴런, 신경교 세포, 뇌실막 세포, 또는 신경상피 세포일 수 있다. 세포는 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 다계통 위축증, 또는 다른 시누클레인병증을 앓고 있거나, 또는 그가 발병할 위험이 있는 환자의 뇌에 있을 수 있다.
본 개시내용은 또한 환자에게 본 개시내용의 융합 단백질을 코딩하는 재조합 AAV를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 시누클레인병증을 치료하는 (예컨대, 그의 진행을 저속화시키는) 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, AAV는 정맥내, 척수강내, 뇌실내, 대수조내, 선조체내, 또는 흑질내 주사, 또는 임의의 뇌 영역으로의 주사를 통해 환자에게 도입된다. 환자는 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 또는 다계통 위축증을 앓을 수 있다.
본 개시내용은 또한 상기 방법에 사용하기 위한 융합 단백질 및 상기 방법에 사용하기 위한 의약 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명에서 자명하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태 및 측면을 나타내지만, 이는 제한이 아니라 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.
도 1은 유전자에서 18개의 염기쌍을 인식하는 조작된 6-핑거 아연 핑거 단백질-전사 인자 (ZFP-TF)에 의한 SNCA 유전자의 특이적 표적화를 도시한 것이다. ZFP-TF가 유전자에 결합하면 SNCA 전사는 감소되고, 이는 차례로 SNCA mRNA 및 알파-시누클레인 단백질 수준 감소로 이어진다. 본 도면은 예시적인 조작된 ZFP (SBS-82110)에 대한 게놈 표적 서열 (결합된 서열; 서열식별번호: 226)을 개시한다.
도 2a는 인간 SNCA 유전자의 게놈 구조를 도시한 다이어그램이다. 유전자는 7개의 엑손 (2개의 비단백질 코딩 및 5개의 단백질 코딩)을 갖고, 여기서 각 전사체는 5개의 인트론을 함유한다. TSS 1, TSS 2a 및 TSS 2b로 명명되는 3개의 전사 개시 부위 (TSS)가 존재하며, 이들은 각각 비코딩 엑손 1, 2a 및 2b로 시작하는 전사체를 생성한다. 모든 전사체에서 첫 번째 단백질 코딩 엑손은 엑손 3이다.
도 2b는 인간 SNCA 유전자의 상류 게놈 영역을 도시한 다이어그램이다. SNCA mRNA 서열은 적색 막대로 표시되어 있다. 유전자 아래 클러스터 중의 작은 삼각형 표시는 본원에서 예시된 416개의 대표적인 ZFP-TF에 의해 표적화되는 SNCA 유전자 중의 영역을 도시한 것이다. 본 도면은 또한 ZFP-TF mRNA로의 형질감염 24시간 후에 수확된 SK-N-MC 인간 신경모세포종 세포에서의 인간 SNCA mRNA 발현 감소에 대해 각 ZFP-TF가 미치는 효과를 보여준다. RT-qPCR에 의해 메신저 RNA 수준을 측정하였다. 정규화된 SNCA 발현 수준은 "SNCA mRNA" 구배 막대로 표시되어 있다. 가장 진한 색상 (적색)은 100% 감소를 나타낸다. 가장 옅은 색상 (흰색)은 0% 감소를 나타낸다. RT-qPCR 데이터를 두 하우스키핑 유전자 (ATP5B EIF4A2)의 mRNA 수준의 평균에 대해 정규화하였다. 오른쪽을 가리키는 삼각형은 ZFP-TF가 유전자의 센스 가닥에 결합한다는 것을 나타낸다. 왼쪽을 가리키는 삼각형은 ZFP-TF가 유전자의 안티센스 가닥에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 3a-3e는 본원에 기술된 바와 같은 416개의 ZFP-TF의 라이브러리로부터의 스크리닝 결과를 보여주는 그래프이다. 스크리닝을 SK-N-MC 인간 신경상피 세포주에서 수행하였다. 각 그래프에서 y축은 두 하우스키핑 유전자 (EIF4A2ATP5B)의 기하 평균에 대해 정규화된 것으로, 상이한 ZFP-TF를 코딩하는 RNA로의 형질감염 24시간 후에 평가된 알파-시누클레인 mRNA 발현이다. RNA 용량은 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다 (3, 10, 30, 100, 300 및 1,000 ng). 막대는 4회에 걸친 기술적 반복의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 그래프 아래의 숫자는 ZFP-TF의 내부 참조 번호이다.
도 4는 인간 SNCA 유전자의 상류 게놈 영역을 도시한 다이어그램이다. SNCA mRNA 서열은 적색 막대로 표시되어 있다. 유전자 아래 클러스터 중의 작은 삼각형 표시는 1, 2, 또는 3개의 포스페이트 접촉 돌연변이를 갖는 27개의 대표적인 ZFP-TF에 의해 표적화되는 SNCA 유전자 중의 영역을 도시한 것이다. 본 도면은 또한 ZFP-TF mRNA로의 형질감염 24시간 후에 수확된 SK-N-MC 인간 신경모세포종 세포에서의 인간 SNCA mRNA 발현 감소에 대해 각 ZFP-TF가 미치는 효과를 보여준다. RT-qPCR에 의해 메신저 RNA 수준을 측정하였다. 정규화된 SNCA 발현 수준은 "SNCA mRNA" 구배 막대로 표시되어 있다. 가장 진한 색상 (적색)은 100% 감소를 나타낸다. 가장 옅은 색상 (흰색)은 0% 감소를 나타낸다. RT-qPCR 데이터를 두 하우스키핑 유전자 (ATP5B EIF4A2)의 mRNA 수준의 평균에 대해 정규화하였다. 오른쪽을 가리키는 삼각형은 ZFP-TF가 유전자의 센스 가닥에 결합한다는 것을 나타낸다. 왼쪽을 가리키는 삼각형은 ZFP-TF가 유전자의 안티센스 가닥에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 5는 1, 2, 또는 3개의 포스페이트 접촉 돌연변이를 갖는 27개의 대표적인 ZFP-TF의 라이브러리로부터의 예시적인 스크리닝 결과를 보여주는 것이다. 스크리닝을 SK-N-MC 인간 신경상피 세포주에서 수행하였다. 각 그래프에서 y축은 두 하우스키핑 유전자 (EIF4A2ATP5B)의 기하 평균에 대해 정규화된 것으로, 상이한 ZFP-TF를 코딩하는 RNA로의 형질감염 24시간 후에 평가된 알파-시누클레인 mRNA 발현이다. RNA 용량은 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다 (3, 10, 30, 100, 300, 및 1,000 ng). 막대는 4회에 걸친 기술적 반복의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 그래프 아래의 숫자는 ZFP-TF의 내부 참조 번호이다.
도 6a6b는 40개의 알파-시누클레인 ZFP-TF가 SK-N-MC 인간 신경모세포종 세포 및 인간 iPSC 유래 뉴런에서 광범위한 알파-시누클레인 억제 활성을 나타내었다는 것을 보여주는 그래프 패널이다. 표 12에 기술된 20개의 예시적인 ZFP-TF는 패널 a에 제시되어 있다. 도 3a-3e에서 특징화되었지만, 표 12에는 기술되어 있지 않은 예시적인 ZFP-TF는 패널 b에 제시되어 있다. y축은 두 하우스키핑 유전자 (ATP5BEIF4A2)의 기하 평균에 대해 정규화된 것으로, 상이한 ZFP-TF를 코딩하는 RNA로의 SK-N-MC 세포 형질감염 24시간 후에, 또는 상이한 ZFP-TF를 코딩하는 AAV6으로의 iPSC 유래 뉴런 형질도입 28일 후에 평가된 알파-시누클레인 mRNA 발현이다. 사용된 RNA 또는 AAV6의 양은 x축에 표시되어 있으며, 여기서 RNA (3, 10, 30, 100, 300, 및 1,000 ng) 또는 AAV6 (1E3, 3E3, 1E4, 3E4, 1E5, 및 3E5) 용량은 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다. 청색 및 오렌지색 막대는 4회에 걸친 기술적 반복의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 적정 스케일의 확대 버전은 도면 하단에 제시되어 있다.
도 7a-7d는 마우스 1차 뉴런 (a 및 b) 및 인간 iPSC 유래 뉴런 (c 및 d)에서의 40개의 알파-시누클레인 ZFP-TF의 오프-타겟 활성을 도시한 볼케이노 플롯의 패널이다. 용이하게 참조할 수 있도록 인간 iPSC 유래 뉴런에서의 ZFP-TF의 억제 활성을 도시한 도 6a-6b로부터의 막대 그래프가 상응하는 ZFP-TF의 볼케이노 플롯 옆에 제시되어 있다. 볼케이노 플롯은 형질도입 7일 후 마우스 1차 뉴런 (a 및 b) 또는 형질도입 19일 후 인간 iPSC 유래 뉴런 (c 및 d)의 트랜스크립톰의 변화를 보여주는 마이크로어레이 데이터를 요약한 것이다. 노란색 원은 인간 알파-시누클레인을 나타낸다. 녹색 원 (각 볼케이노 플롯의 오른쪽)은 >2배만큼 유의하게 상향조절된 유전자를 나타낸다. 이들 유전자의 수는 녹색 텍스트로 표시되어 있다. 적색 원은 >2배만큼 유의하게 하향조절된 유전자를 나타낸다. 이들 유전자의 수는 적색 텍스트로 표시되어 있다.
도 8a8b는 암컷 PAC 시누클레인 마우스의 상이한 뇌 영역에서의 (a) ZFP-TF 및 알파-시누클레인 mRNA 발현 수준 또는 (b) 신경교 섬유성 산성 단백질 (GFAP), 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 및 NeuN의 mRNA 발현 수준을 보여주는 그래프 패널이다 (Kuo et al., Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50). 선조체 중의 두 부위에 지시된 시험 물품을 코딩하는 AAV9 또는 비히클을 동물에 양측으로 투여하였다. 모든 유전자 발현 데이터는 3개의 하우스키핑 유전자 (ATP5B, EIF4A2, 및 GAPDH)의 기하 평균에 대해 정규화된 것이다. y축은 지시된 유전자의 mRNA 발현 수준이고, x축은 뇌 영역이다. 적색 사각형은 ZFP-TF 82195를 투여받은 n = 3마리 동물에 대한 평균 발현 데이터를 나타낸 것이고, 녹색 삼각형은 ZFP-TF 82264를 투여받은 n = 3마리 동물에 대한 평균 발현 데이터를 나타낸 것이다. 패널 a에서, 알파-시누클레인 mRNA 발현은 비히클로 처리된 동물 3마리의 평균에 대해 정규화된 것이고, ZFP-TF 발현은 투입 RNA ng당 카피로서 로그 스케일로 제공된 것이다. 패널 b에서, 모든 발현 데이터는 비히클로 처리된 동물 3마리의 평균에 대해 정규화된 것이다. 통계 분석은 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어서, 던넷(Dunnett) 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, ***, p < 0.001, ***, p < 0.0001.
본 개시내용은 인간 SNCA 유전자 중의 또는 그 근처의 부위 (즉, 서열)를 표적화하는 ZFP 도메인을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 ZFP 도메인은 또 다른 기능성 분자 또는 도메인에 부착되거나, 또는 융합될 수 있다. 본 개시내용의 ZFP 도메인은 인간 SNCA 유전자의 RNA로의 전사를 억제시키기 위해 전사 인자에 융합될 수 있다. 융합 단백질은 아연 핑거 단백질 전사 인자 (ZFP-TF)로 명명된다. 이들 ZFP-TF는 SNCA 유전자 중의 또는 그 근처의 표적 영역에 특이적으로 결합하는 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 유전자의 전사를 감소시키는 전사 리프레서 도메인을 포함한다. ZFP-TF를 환자의 뇌 내로 도입하여 뉴런에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 것이, 알파-시누클레인이 올리고머 (더 작은 가용성 응집체) 또는 원섬유 (더 큰 불용성 응집체) 형태로 어셈블리되는 것을 억제시킬 것으로 (예컨대, 감소 또는 정지시킬 것으로) 예상된다. 알파-시누클레인 응집 감소와 함께, 뇌 세포는 그의 세포 품질 관리 기구를 사용하여 미스폴딩된 및 독성 형태의 알파-시누클레인을 적시에 제거할 수 있는 능력을 갖게 될 것이다. 그 결과, 알파-시누클레인의 응집 및 세포-대-세포 전파가 감소 또는 방지될 것이다.
알파-시누클레인 억제에 대한 본 발명자들의 ZFP-TF 접근법은 다른 이들에 의해 시험되고 있는 현행 접근법에 비해 여러 장점이 있다. ZFP-TF는 (환자에게 ZFP-TF 발현 구축물을 도입함으로써) 단 한 번만 투여되어야 할 필요가 있을 수 있지만, ASO는 반복 투약되어야 한다. 추가로, ZFP-TF 접근법은 각 세포의 게놈에서 SNCA 유전자의 두 대립유전자를 결속시키기만 하면 된다. 대조적으로, ASO는 각 세포에서 다수의 SNCA mRNA 카피를 결속시켜야 한다.
본 발명자들의 ZFP-TF 접근법은 항체가 알파-시누클레인 형상 또는 입체형태의 서브세트에만 결합할 수 있기 때문에 항체 접근법보다 유리하다. 이는 강건한 치료 효과에 충분하지 않을 수 있다. 대조적으로, ZFP-TF는 DNA 수준에서 알파-시누클레인 발현을 억제시키고, 모든 형태의 알파-시누클레인의 수준을 저하시킨다. 따라서, ZFP-TF는 항체와 달리, 독성 종의 형태에 효능작용을 나타낸다. 추가로, 항체는 세포 상의 또는 세포 외부의 알파-시누클레인에 크게 작용하는 것으로 생각되는 반면, ZFP-TF는 세포 내부의 알파-시누클레인을 직접적으로 감소시키고 간접적으로 세포외 알파-시누클레인 수준을 저하시킬 수 있다. 따라서, 알파-시누클레인은 대체로 세포내 단백질이기 때문에, ZFP-TF 접근법이 더 효과적일 것으로 예상된다. 추가로, 항체는 반복 투여가 필요한 반면, ZFP-TF는 그의 발현 구축물의 단 한 번의 전달만이 요구된다.
I. ZFP 도메인의 표적
본 발명의 융합 단백질의 ZFP 도메인은 인간 SNCA 유전자 중의 또는 그 근처의 표적 영역에 특이적으로 결합한다. 도 1은 ZFP 도메인의 표적 SNCA 유전자 서열에의 결합을 도시한 것이다. 도면의 ZFP 도메인은 6개의 아연 핑거를 갖지만; 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이, 더 적거나, 더 많은 아연 핑거를 갖는 ZFP 도메인 또한 사용될 수 있다.
인간 SNCA 유전자는 약 117 kb에 걸쳐 있으며, chr4:89,724,099-89,838,315(GRCh38/hg38)로 매핑되었다. 그의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호GenBank accession number) NC_000004 버전 000004.12로 이용가능하다. 유전자는 7개의 엑손 (2개의 비단백질 코딩 및 5개의 단백질 코딩)을 갖고, 여기서 각 전사체는 5개의 인트론을 갖는다 (도 2a). 유전자에 대해 3개의 전사 개시 부위 (TSS)가 존재하며: 하나는 엑손 1의 시작부에 있고, 2개는 엑손 2에 있고, 그 결과로 엑손 2a 및 2b가 발현된다. 첫 번째 단백질 코딩 엑손은 엑손 3이다. 문헌 [Touchman et al., Genome Res. (2001) 11:78-86] 또한 참조한다. 인간 알파-시누클레인의 이소형 1 (전장)은 하기에 제시되어 있다:
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (서열식별번호 1; P37840-1).
이소형 2-4는 아미노산 잔기 103-130이 결실되어 있다는 점에서 이소형 1과 상이하다. 이소형 2-5는 아미노산 잔기 41-54가 결실되어 있다는 점에서 이소형 1과 상이하다. 알파-시누클레인의 유전자 분석은 유전자 카피 증폭 (예컨대, 문헌 [Brueggemann et al., Neurology (2008) 71:1294]; [Troiano et al., Neurology (2008) 71:1295]; [Uchiyama et al., Neurology (2008) 71:1289-90] 참조), 및 시누클레인병증, 예컨대 PD 및 루이소체 치매에 대한 잠재적 원인으로서의 특정 점 돌연변이를 지적하였다. 예를 들어, 하기 알파-시누클레인 점 돌연변이가 일부 PD 환자에서 확인되었다: A30P (Kruger et al., Nature Genet. (1998) 18:106-8); E46K (Zarranz et al., Ann Neurol. (2004) 55:164-73; Choi et al., FEBS Lett. (2004) 576:363-8); H50Q (Khalaf et al., J Biol Chem. (2014) 289:21856-76); G51D (Lesage et al., Ann Neurol. (2013) 73:459-71); 및 A53T (Polymeropoulos et al., Science (1997) 276:2045-7).
ZFP-TF의 DNA 결합 ZFP 도메인은 융합 단백질을 SNCA 유전자의 표적 영역으로 유도하고, 융합 단백질의 전사 리프레서 도메인을 표적 영역으로 가져온다. 이어서, 리프레서 도메인은 RNA 폴리머라제에 의해 SNCA 유전자의 전사를 억제시킨다. ZFP-TF에 대한 표적 영역은 유전자 발현의 억제를 허용하는 SNCA 유전자 중의 또는 그 근처의 임의의 적합한 부위일 수 있다. 예로서, 표적 영역은 SNCA TSS 또는 SNCA 전사 조절 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서, RNA 폴리머라제 정지 부위 등) (그의 하류 또는 상류)를 포함하거나, 또는 그에 인접해 있다.
상기 기술된 바와 같이, 인간 SNCA 유전자는 3개의 전사 개시 부위 (TSS)를 갖는다. 이는 5'에서 3'으로 TSS 1, TSS 2a, 및 TSS 2b이며, 엑손 1 (TSS 1), 엑손 2a, 및 엑손 2b (TSS 2a 및 2b)의 5' 말단에 위치한다 (도 2b). 3개의 TSS에서의 전사는 길이가 다른 RNA 이소형으로 이어진다. 그러나, 알파-시누클레인의 번역은 엑손 3에서 시작되기 때문에, 상이한 TSS로부터 생산된 RNA는 동일한 단백질을 형성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF의 게놈 표적 영역은 TSS 1 (예컨대, 염기쌍 529-1529) 또는 TSSs 2a 및 2b (예컨대, 염기쌍 1613-2949)에 걸쳐 있거나 그 부근에 있다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 TSS 1의 상류 또는 하류 약 500 bp 이내에, 및/또는 TSS 2a의 상류 또는 하류 약 500 bp 이내에, 및/또는 TSS 2b의 상류 또는 하류 약 500 bp 이내에 있다.
일부 실시양태에서, 게놈 표적 영역의 길이는 적어도 8 bp 길이이다. 예를 들어, 표적 영역은 8 bp 내지 40 bp 길이, 예컨대 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36 bp 길이일 수 있다. 표적화된 서열은 유전자의 센스 가닥 또는 유전자의 안티센스 가닥에 있을 수 있다. 표적화 정확성을 보장하고, ZFP-TF에 의한 오프-타겟 결합 또는 활성을 감소시키기 위해, 선택된 SNCA 표적 영역의 서열은 바람직하게는 다른 유전자 중의 서열과 75% 미만의 상동성 (예컨대, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 또는 50% 미만)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF의 표적 영역은 15-18 bp 길이이고, TSS 1, 2a, 또는 2b의 500 bp 이내에 위치한다. 표적 영역의 예는 도 2b표 1에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 바람직하게는 검출가능한 오프-타겟 결합 또는 활성은 전혀 없거나, 또는 거의 없이, 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 표적 부위 (즉, 결합 서열)에 결합한다.
표적 세그먼트를 추가로 평가하기 위한 다른 기준은 상기 세그먼트 또는 관련 세그먼트에 대한 ZFP 결합의 사전 이용가능성, 주어진 표적 세그먼트에 결합하는 새로운 ZFP 디자인의 용이성, 및 오프-타겟 결합 위험을 포함한다.
II. ZFP 도메인
"아연 핑거 단백질" 또는 "ZFP"는 아연에 의해 안정화된 DNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 지칭한다. ZFP는 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합한다. ZFP의 개별 DNA 결합 단위는 아연 "핑거"로 지칭된다. 각 핑거는 전형적으로 7개의 아미노산 잔기로 구성되고, DNA 결합 특이성을 결정하는 DNA 결합 "인식 나선"을 함유한다. ZFP 도메인은 적어도 하나의 핑거를 가지며, 각 핑거는 2 내지 4개의 DNA 염기쌍, 전형적으로, 3 또는 4개의 DNA 염기쌍에 결합한다. 각 아연 핑거는 전형적으로 대략 30개의 아미노산을 포함하고, 아연을 킬레이팅한다. 조작된 ZFP는 자연적으로 발생된 ZFP와 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 디자인 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 디자인은 예를 들어, 트리플렛 (또는 쿼드루플렛) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 트리플렛 또는 쿼드루플렛 뉴클레오티드 서열은 특정한 트리플렛 또는 쿼드루플렛 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예컨대, 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539; 및 8,586,526; 및 International Patent Publications WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; 및 WO 03/016496에 상세히 기술된 ZFP 디자인 방법을 참조한다. 본원에 기술된 ZFP 도메인은 또 다른 분자, 예를 들어, 단백질에 부착되거나, 또는 융합될 수 있다. 상기 ZFP-융합은 유전자 활성화 (예컨대, 활성화 도메인), 유전자 억제 (예컨대, 억제 도메인), 리간드 결합 (예컨대, 리간드-결합 도메인), 고처리량 스크리닝 (예컨대, 리간드-결합 도메인), 국재화된 과돌연변이 (예컨대, 활성화-유도 시티딘 데아미나제 도메인), 염색질 변형 (예컨대, 히스톤 데아세틸라제 도메인), 재조합 (예컨대, 레콤비나제 도메인), 표적화된 통합 (예컨대, 인테그라제 도메인), DNA 변형 (예컨대, DNA 메틸-트랜스퍼라제 도메인), 염기 편집 (예컨대, 염기 편집기 도메인), 또는 표적화된 DNA 절단 (예컨대, 뉴클레아제 도메인)을 가능하게 하는 도메인을 포함할 수 있다. 조작된 ZFP 도메인의 예는 표 1에 제시되어 있다.
본 발명의 조작된 ZFP 융합 단백질의 ZFP 도메인은 적어도 하나의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13개 또는 그 초과의) 아연 핑거(들)를 포함할 수 있다. 1개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 3 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 2개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 6 또는 8개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 3개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 9 또는 12개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 4개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 12 내지 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 5개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 15 내지 18개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 6개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 18 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 표 1에 제시된 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 예를 들어, 조작된 ZFP는 표 1에 제시된 바와 같은 F1, F2, F3, F4, F5, 또는 F6의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 표 1의 단일 열에 제시된 2개의 인접한 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 예를 들어, 조작된 ZFP는 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 F1-F2, F2-F3, F3-F4, F4-F5, 또는 F5-F6의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 표 1의 단일 열에 제시된 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 예를 들어, 조작된 ZFP는 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 F1, F2, F3, F4, F5, 및 F6 (예컨대, F1-F6)의 서열을 포함할 수 있다.
ZFP 도메인의 표적 특이성은, 예컨대, 미국 특허 공개 2018/0087072에 기술된 바와 같이 ZFP 백본 서열에 대한 돌연변이에 의해 개선될 수 있다. 돌연변이는 DNA 백본 상의 포스페이트와 비특이적으로 상호작용할 수 있지만, 뉴클레오티드 표적 특이성에 관여하지 않는 ZFP 백본 내의 잔기로 이루어진 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 돌연변이는 양이온성 아미노산 잔기를 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 돌연변이화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 돌연변이는 극성 아미노산 잔기를 중성 또는 비극성 아미노산 잔기로 돌연변이화하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 돌연변이는 DNA 결합 나선에 대해 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거는 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 다중-핑거 ZFP 도메인 중의 하나 이상의 아연 핑거는 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)의 아미노산 (예컨대, 아르기닌 (R) 또는 리신 (K))은 알라닌 (A), 류신 (L), 세린 (S), 아스파르테이트 (N), 글루타메이트 (E), 티로신 (Y), 및/또는 글루타민 (Q)으로 돌연변이화된다. 1, 2, 또는 3개의 백본 돌연변이를 포함하는 조작된 ZFP의 예는 도 45, 및 표 1 2에 제시되어 있다. 표 1에서의 기호 "∧"는 표시된 인식 나선에서 제1 아미노산의 상류로 4번째 위치에 있는 아르기닌 (R) 잔기가 글루타민 (Q)으로 변이된 것을 나타낸다. 각각의 인식 나선 서열에서, 7개의 DNA 결합 아미노산의 위치는 -1, +1, +2, +3, +4, +5, 및 +6으로 넘버링된다. 따라서, R에서 Q로의 치환을 위한 위치는 (-5)로 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 표 1에 제시된 바와 같은 DNA 결합 인식 나선 서열 및 연관된 백본 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 ZFP는 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 DNA 결합 인식 나선 서열 및 연관된 백본 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP는 표 2의 단일 열에 제시된 서열의 인식 나선 및 백본 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP는 표 2의 단일 열에 제시된 서열의 인식 나선 및 백본 부분을 포함하며 서열은 번역 후 변형 이후에 나타날 것이다. 예를 들어, 번역 후 변형은 표 2에 제시된 바와 같은 서열로부터 개시인자 메티오닌 잔기를 제거할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF는 하나 이상의 아연 핑거 도메인을 포함한다. 도메인은 예를 들어, 하나의 도메인이 하나 이상의 (예컨대, 4, 5, 또는 6개의) 아연 핑거를 포함하고, 또 다른 도메인은 추가의 하나 이상의 (예컨대, 4, 5 또는 6개의) 아연 핑거를 포함하도록 연장가능한 가요성 링커를 통해 함께 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 핑거 어레이가 8, 9, 10, 11 또는 12개 또는 그 초과의 핑거를 포함하는 1개의 DNA 결합 도메인을 포함하도록 하는 표준 핑거간 링커이다. 다른 실시양태에서, 링커는 비정형 링커, 예컨대, 가요성 링커이다. 예를 들어, 2개의 ZFP 도메인은 전사 리프레서 TF에 (N 말단에서 C 말단으로) ZFP-ZFP-TF, TF-ZFP-ZFP, ZFP-TF-ZFP, 또는 ZFP-TF-ZFP-TF (2개의 ZFP-TF 융합 단백질은 링커를 통해 함께 융합됨) 입체형태로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, ZFP-TF는 "2 핸드"이며, 즉, 이는 2개의 ZFP 도메인이 2개의 불연속 표적 부위에 결합하도록 개재 아미노산에 의해 분리된 2개의 아연 핑거 클러스터 (2개의 ZFP 도메인)를 함유한다. 2 핸드 유형의 아연 핑거 결합 단백질의 예로는 4개의 아연 핑거의 클러스터가 단백질의 아미노 말단에 위치하고, 3개의 핑거의 클러스터는 카르복실 말단에 위치하는 것인 SIP1이 있다 (문헌 [Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073-84] 참조). 이들 단백질 내의 아연 핑거의 각각의 클러스터는 고유 표적 서열에 결합할 수 있고, 2개의 표적 서열 사이의 간격은 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
III. 아연 핑거 단백질 전사 인자
본원에 기술된 ZFP 도메인은 전사 인자에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 DNA 결합 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 인자 도메인 (즉, ZFP-TF)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 전사 리프레서 도메인일 수 있고, 여기서 ZFP 및 리프레서 도메인은 직접 펩티딜 연결 또는 펩티드 링커에 의해, 또는 이량체화에 의해 (예컨대, 류신 지퍼, STAT 단백질 N 말단 도메인, 또는 FK506 결합 단백질을 통해) 서로 회합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "융합 단백질"은 공유 연결된 도메인을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 비공유 결합을 통해 서로 회합된 폴리펩티드의 복합체를 지칭한다. 전사 리프레서 도메인은 ZFP 도메인의 C- 또는 N-말단을 포함한 임의의 적합한 위치에서 ZFP 도메인과 회합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF는 약 25 nM 미만의 KD로 그의 표적에 결합하고, 인간 SNCA 유전자의 전사를 20% 이상만큼 (예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 그 초과만큼) 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF 중 2개 이상의 것이 환자에서 동시에 사용되며, 여기서 ZFP-TF는 SNCA 유전자 중의 상이한 표적 영역에 결합하여 SNCA 발현의 최적 억제를 달성한다.
A. 전사 리프레서 도메인
본 발명의 ZFP-TF는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 ZFP 도메인 및 SNCA 유전자의 전사 활성을 약화시키는 하나 이상의 전사 리프레서 도메인을 포함한다. 하나 이상의 조작된 ZFP 도메인 및 하나 이상의 전사 리프레서 도메인은 가요성 링커에 의해 연결될 수 있다. 전사 리프레서 도메인의 비제한적인 예로는 KOX1, KAP-1, MAD, FKHR, EGR-1, ERD, SID, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-ERB-A, MBD2, MBD3, TRa, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 핵 호르몬 수용체 (예컨대, 에스트로겐 수용체 또는 갑상선 호르몬 수용체), DNMT 패밀리의 구성원 (예컨대, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, 및 MeCP2의 KRAB 도메인이 있다. 예컨대, 문헌 [Bird et al. (1999) Cell 99:451-454]; [Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446]; [Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450]; 및 [Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342]을 참조한다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321]; 및 [Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 전사 리프레서 도메인은 인간 아연 핑거 단백질 10/KOX1 (ZNF10/KOX1)의 크루펠-연관 박스 (KRAB) 도메인으로부터의 서열을 포함한다 (예컨대, 진뱅크 번호 NM_015394.4). 예시적인 KRAB 도메인 서열은 하기와 같다:
DAKSLTAWSR TLVTFKDVFV DFTREEWKLL DTAQQIVYRN VMLENYKNLV
SLGYQLTKPD VILRLEKGEE PWLVEREIHQ ETHPDSETAF EIKSSV
(서열식별번호 12).
이러한 KRAB 서열의 변이체는 또한 이들이 동일하거나 유사한 전사 리프레서 기능을 갖는 한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 바람직하게는 검출가능한 오프-타겟 결합 또는 활성은 전혀 없거나, 또는 거의 없이, 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 표적 부위에 결합한다. 오프-타겟 결합은 예를 들어, 오프-타겟 유전자에서 ZFP-TF의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 1에 제시된 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 1의 단일 열에 제시된 2개의 인접한 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 1의 단일 열에 제시된 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 2의 단일 열에 제시된 서열의 인식 나선 및 백본 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 2의 단일 열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 2의 단일 열에 제시된 서열의 인식 나선 및 백본 부분 서열을 포함하며 서열은 번역 후 변형 이후에 나타날 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조작된 ZFP-TF는 표 2의 단일 열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며 서열은 번역 후 변형 이후에 나타날 것이다. 예를 들어, 번역 후 변형은 표 2에 제시된 바와 같은 서열로부터 개시인자 메티오닌 잔기를 제거할 수 있다.
B. 펩티드 링커
본 발명의 ZFP-TF의 ZFP 도메인 및 전사 리프레서 도메인 및/또는 ZFP 도메인 내의 아연 핑거는 펩티드 링커, 예컨대, 약 5 내지 200개의 아미노산 (예컨대, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산)의 비절단가능한 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 바람직한 링커는 전형적으로 재조합 융합 단백질로서 합성되는 가요성 아미노산 서브서열이다. 예컨대, 상기 설명; 및 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; 및 9,163,245; 및 WO 2011/139349를 참조한다. 본원에 기술된 단백질은 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 링커의 비제한적인 예로는 DGGGS (서열식별번호 2), TGEKP (서열식별번호 3), LRQKDGERP (서열식별번호 4), GGRR (서열식별번호 5), GGRRGGGS (서열식별번호 6), LRQRDGERP (서열식별번호 7), LRQKDGGGSERP (서열식별번호 8), LRQKD(G3S)2 ERP (서열식별번호 9), 및 TGSQKP (서열식별번호 10)가 있다.
일부 실시양태에서, TGEKPFA (서열식별번호 15) 및/또는 TGSQKPFQ (서열식별번호 16)는 ZFP 도메인 내의 아연 핑거를 연결하고/거나, LRQKDAARGSGG (서열식별번호 17) 또는 LRGSGG (서열식별번호 18)를 ZFP 도메인을 전사 리프레서 도메인에 연결한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 3 내지 20개의 아미노산 잔기 길이이고, G 및/또는 S가 풍부하다. 상기 링커의 비제한적 예로는 G4S-유형 링커 (서열식별번호 11), 즉, 하나 이상 (예컨대, 2, 3, 또는 4개)의 GGGGS (서열식별번호 11) 모티프 또는 모티프의 변이 (예컨대, 모티프에 1, 2, 또는 3개의 아미노산 삽입, 결실, 및 치환을 갖는 것)를 함유하는 링커이다.
IV. ZFP-TF의 발현
본 개시내용의 ZFP-TF는 이를 코딩하는 핵산 분자를 통해 환자에게 도입될 수 있다. 핵산 분자는 RNA 또는 cDNA 분자일 수 있다. 핵산 분자는 지질:핵산 복합체 (예컨대, 리포솜)를 포함하는 조성물의 주사를 통해 환자의 뇌 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, ZFP-TF는 ZFP-TF를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 발현 벡터를 통해 환자에게 도입될 수 있다. 발현 벡터는 신경계의 세포에서 ZFP-TF에 대한 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 전사 신호 서열, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 안정한 에피솜으로서 세포 내에 여전히 존재한다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 뇌에서 ZFP-TF 발현을 지시하기 위한 벡터 상의 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 적합한 프로모터는 제한 없이, 레트로바이러스 RSV LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서 포함), CMV 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서 포함), CMV 극초기 프로모터, SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, EFlα 프로모터, MoMLV LTR 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터 (TTR), TK 프로모터, 테트라시클린 반응성 프로모터 (TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터 (LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제 (hTERT) 프로모터, CMV 인핸서/닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터 (CAG 프로모터; 문헌 [Niwa et al., Gene (1991) 108(2):193-9]), 및 RU-486-반응성 프로모터를 포함한다. 뉴런 및/또는 신경교 세포에의 발현을 제한하는 뇌 세포-특이적 프로모터, 예컨대, 시냅신 I 프로모터, MeCP2 프로모터, CAMKII 프로모터, PrP 프로모터, GFAP 프로모터, 또는 조작된 또는 천연 프로모터 또한 사용될 수 있다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 핵 국재화 신호와 조합된 리포솜, 자연적으로 발생된 리포솜 (예컨대, 엑소솜), 또는 바이러스 형질도입을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
발현 벡터의 생체내 전달을 위해, 바이러스 형질도입이 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어, 백시니아 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭시바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 하이브리드 바이러스 벡터는 본 개시내용에서 사용하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적합화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. AAV 벡터는 CNS 유전자 전달에 특히 적합한데, 그 이유는 AAV 벡터가 분열 및 비분열 세포, 둘 모두를 감염시키고, 장기간 발현을 위한 안정한 에피솜 구조로서 존재하고, 매우 낮은 면역원성을 갖기 때문이다 ([Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18:1458-61]; [Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15:808-16]). 임의의 적합한 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9, 또는 AAVrh10, 또는 유사형의 것, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, 또는 AAV2/9, 또는 본원에 열거된 AAV 혈청형 중 하나의 변이체 또는 유도체인 혈청형 (즉, 다중 혈청형으로부터 유래된 AAV; 예를 들어, rAAV는 그의 게놈에 AAV2 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 AAV8, 5, 6 또는 9 캡시드를 포함한다)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 AAV 바이러스 벡터이고, 이는 생산 시스템, 예컨대, 곤충 세포/바큘로바이러스 생산 시스템 또는 포유동물 세포 생산 시스템에서의 AAV 비리온의 생산을 가능하게 하기 위해 그의 게놈이 양쪽 말단에 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 갖는 것을 비롯한 구축물을 포함하는 재조합 AAV 비리온에 의해 표적 인간 세포에 도입된다. AAV는 그의 캡시드 단백질이 인간 또는 비인간 영장류에서 감소된 면역원성 또는 증진된 형질도입 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV9가 사용된다. 본원에 기술된 바이러스 벡터는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 임의의 적합한 허용 또는 패키징 세포는 바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포가 패키징 세포주로서 사용될 수 있다.
V. 제약 용도
본 발명의 ZFP-TF는 알파-시누클레인 발현의 하향조절을 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 환자는 신경퇴행성, 질환, 예컨대 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 다계통 위축증, 및 임의의 다른 시누클레인병증을 앓고 있거나, 또는 그의 발병 위험이 있는 환자이다. 위험이 있는 환자는 유전적으로 소인이 있는 환자, 예컨대, 뇌진탕과 같은 반복된 뇌 손상을 겪은 환자, 및 환경적 신경독소에 노출된 환자를 포함한다. 본 개시내용은 신경계 질환 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 인간 환자에서 신경계 질환 (예컨대, 신경퇴행성 질환)을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 대상체의 신경계에 치료 유효량 (예컨대, SNCA 발현을 충분히 억제시킬 수 있는 양)의 ZFP-TF (예컨대, 이를 발현하는 rAAV 벡터)를 도입하는 단계를 포함한다. "치료하는"이라는 용어는 증상의 완화, 증상의 발병의 예방, 질환 진행의 저속화, 삶의 질의 개선, 및 생존 증가를 포괄한다.
본 개시내용은 재조합 게놈이 ZFP-TF에 대한 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대, 재조합 AAV (rAAV)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 예컨대, 물, 염수 (예컨대, 포스페이트-완충처리된 염수), 덱스트로스, 글리세롤, 수크로스, 락토스, 젤라틴, 덱스트란, 알부민, 또는 펙틴을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 조성물은 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, pH-완충제, 안정화제, 또는 제약 조성물의 유효성을 증진시키는 다른 시약을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 전달 비히클, 예컨대, 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 및 소포체를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 치료제에 의해 표적화되는 세포는 제한 없이, 뉴런 세포 (예컨대, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 도파민성 뉴런, 콜린성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, GABA성 뉴런, 또는 세로토닌성 뉴런); 신경교 세포 (예컨대, 핍지교세포, 성상세포, 혈관주위세포, 슈반 세포, 또는 소교 세포); 뇌실막 세포; 또는 신경상피 세포를 비롯한, 뇌 내의 세포이다. 치료제에 의해 표적화되는 뇌 영역은 시누클레인병증으로 가장 크게 영향을 받는 영역, 예컨대, 선조체, 미상, 피각, 흑질, 중뇌, 후각 망울, 소뇌, 청반, 뇌교, 수질, 뇌간, 담창구, 해마, 및 대뇌 피질, 또는 다른 뇌 영역일 수 있다. 선조체내 주사, 흑질내 주사, 뇌내 주사, 대수조내 (ICM) 주사를 통해, 또는 더욱 일반적으로 실질내 주사, 뇌실내 (ICV) 주사, 척수강내 주사, 또는 정맥내 주사를 통해 이들 영역에 직접 도달될 수 있다. 다른 투여 경로로는 제한 없이, 뇌실내, 비내, 또는 안내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 예컨대, 척수강내 및/또는 뇌실내 주사, 또는 대수조내 주사를 통해 뇌척수액 (CSF)으로의 직접 투여 후 CNS 조직 전역으로 확산된다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 정맥내 투여 후에 혈뇌 장벽을 가로질러 대상체의 CNS 조직 전역에 걸쳐 광범위한 분포를 달성한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 실질내 주사를 통해 표적 영역으로 직접 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 실질내 전달 후에 다른 뇌 영역으로 역행 또는 전향 수송을 거칠 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 벡터는 높은 효율로 안정하고, 비독성인 유전자 전달을 달성하는 별개의 CNS 조직 표적화 능력 (예컨대, CNS 조직 친화성)을 갖는다.
예로서, 제약 조성물은 뇌실내 투여를 통해, 예컨대, 환자의 전뇌의 뇌실 영역, 예컨대, 우측 뇌실, 좌측 뇌실, 제3 뇌실, 또는 제4 뇌실 내로 환자에게 제공될 수 있다. 제약 조성물은 뇌내 투여, 예컨대, 뇌의 선조체, 미상, 피각, 흑질, 중뇌, 후각 망울, 대뇌, 소뇌, 청반, 뇌교, 수질, 뇌간, 담창구, 해마, 대뇌 피질, 두개강내, 수막, 경막, 거미막, 또는 연막 내로의 또는 그 근처로의 조성물의 주사를 통해 환자에게 제공될 수 있다. 뇌내 투여는, 일부 경우에, 뇌 주위의 지주막하 공간의 뇌척수액 (CSF) 내로의 작용제의 투여를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 뇌내 투여는 정위 절차를 사용하는 주사를 수반한다. 정위 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전형적으로 특정한 뇌내 영역, 예컨대, 뇌실 영역으로의 주사를 가이드하기 위해 함께 사용되는 컴퓨터 및 3차원 스캐닝 장치의 사용을 수반한다. 미세-주사 펌프 (예컨대, 월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments)로부터의 것) 또한 사용될 수 있다. 일부 경우에, 미세주사 펌프는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 전달하는 데 사용된다. 일부 경우에, 조성물의 주입 속도는 0.1 ㎕/분 내지 100 ㎕/분 범위이다. 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 주입 속도는, 예를 들어, 대상체 종, 대상체의 연령, 대상체의 체중/크기, AAV의 혈청형, 요구되는 투여량, 및 표적화된 뇌내 영역을 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 따라서, 다른 주입 속도가 특정 상황에서 통상의 기술자에 의해 적절한 것으로 간주될 수 있다.
대상체에게 rAAV를 전달하는 것은, 예를 들어, 정맥내 투여에 의해 달성될 수 있다. 특정 경우에, rAAV를 뇌 조직, 척수, 뇌척수액 (CSF), 뉴런 세포, 신경교 세포, 수막, 성상세포, 핍지교세포, 미세아교세포, 간질 공간 등에 국소적으로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 AAV는 뇌실 영역 내로 뿐만 아니라, 선조체, 미상, 피각, 흑질, 중뇌, 후각 망울, 소뇌, 청반, 뇌교, 수질, 뇌간, 담창구, 해마, 대뇌 피질, 또는 다른 뇌 영역으로의 주사에 의해 CNS로 직접 전달될 수 있다. AAV는 관련 기술분야에 공지된 신경외과 기술을 사용하여, 예컨대 정위 주사에 의해 니들, 카테터 또는 관련 장치를 이용하여 전달될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9]; [Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32]; [Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223]; 및 [Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29] 참조).
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기술되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나, 등가인 방법 및 물질 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 신경학, 의약, 의약 및 제약 화학, 및 세포 생물학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함하여야 한다. 본 명세서 및 실시양태 전역에 걸쳐, "갖는다(have)" 및 "포함한다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대 "갖다(has)," "갖는(having)," "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"이라는 파생어는 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것은 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 다수의 문헌이 본원에서 인용되지만, 이러한 인용은 이들 문헌 중 임의의 것이 관련 기술분야의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우에 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 달리 언급되거나, 또는 문맥으로부터 달리 명백해지지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어느 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: ZFP-TF의 스크리닝
알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 ZFP-TF를 확인하기 위해, 본 발명자들은 TSS 1의 상류 500 bp부터 TSS 1의 하류 500 bp, 또는 TSS 2a의 상류 500 bp부터 TSS 2b의 하류 500 bp에 걸쳐있는 인간 SNCA 유전자의 영역 중 15 또는 18 bp 서열에 결합하는 것으로 예측되는 416개의 ZFP-TF의 라이브러리를 디자인하고, 스크리닝하였다 (도 2b). ZFP-TF의 표적 영역은 도 2b에서 화살촉으로 표시되어 있고, 여기서 화살촉 방향은 ZFP-TF가 결합하는 DNA 가닥을 나타낸다 (5'에서 3' 방향). 도 4SNCA 유전자의 TSS 2a 및 2b를 표적화하는 1, 2, 또는 3 포스페이트 접촉 변이를 갖는 ZFP-TF에 대해 도 2b에 제시된 것과 유사한 데이터를 보여주는 것이다. 본 연구에서, KRAB 도메인 서열 (서열식별번호 12)을 전사 리프레서로서 사용하고, ZFP 도메인의 C-말단에 융합시켰다. 47개의 대표적인 ZFP-TF의 서열이 하기 표 2에 제시되어 있다. PCR (정방향 프라이머 GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG (서열식별번호 13); 역방향 프라이머 T(180)CTGGCAACTAGAAGGCACAG (서열식별번호 14))을 사용하여 pVAX-ZFP 또는 pVAX-GFP 플라스미드로부터 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하였다. 제조업체의 설명서에 따라 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 전사 키트(mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Transcription Kit) (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 메신저 RNA를 합성하고, RN이지96(RNeasy96) 칼럼 (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 정제하였다. 이어서, 각 ZFP-TF를 코딩하는 RNA를 6-용량 희석액으로 96 웰 플레이트에 분취하였다.
ZFP-TF 코딩 서열을 보유하는 재조합 rAAV 벡터를 널리 공지된 방법에 따라 HEK293 세포에서 생성하였다. 세포를 AAV 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨 지 3일 후에, 세포를 수확하였다. 이어서, 세포를 3 라운드에 걸쳐 동결/해동하여 용해시키고, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 rAAV 비리온을 침전시켰다. 재현탁 후, 염화세슘 구배에서 밤새도록 초원심분리하여 비리온을 정제하였다. 비리온을 투석하여 제제화한 후, 여과 멸균하였다. AAV를 분취하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. AAV는 해동 후 다시 동결시키지 않았다.
SK-N-MC 인간 신경상피 세포주에서 스크리닝을 수행하였다. SK-N-MC 세포는 인간 알파-시누클레인을 높은 수준으로 발현하는 바, 따라서, 알파-시누클레인 발현을 감소시키는 ZFP-TF 시험에 적절하다. SK-N-MC 세포를 전면생장 때까지 조직 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포를 웰당 150,000개 세포로 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 아막사(Amaxa)® SF 용액에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 ZFP-TF RNA (6개 용량: 3, 10, 30, 100, 300 및 1000 ng)와 혼합하고, 아막사® 셔틀 플레이트 웰로 옮겼다. 아막사® 뉴클레오펙터(Nucleofector)® 장치 (론자(Lonza); 프로그램 CM-137)를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 이글즈 MEM 세포 배지를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트로 옮기고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
ZFP-TF를 또한 인간 iPSC 유래 GABA성 뉴런 (셀룰러 다이나믹스 인터내셔널(Cellular Dynamics International))에서도 시험하였다. 세포를 웰당 40,000개 세포의 밀도로 폴리-L-오르니틴 및 라미닌으로 코팅된 96 웰 플레이트에 플레이팅한 후, 이어서, 제조업체의 설명서에 따라 유지시켰다. 세포를 플레이팅 48시간 후에 6개의 상이한 MOI (1E3, 3E3, 1E4, 3E4, 1E5 및 3E5)로 원하는 ZFP-TF를 발현하는 AAV6으로 형질감염시켰다. 형질도입된 세포를 최대 32일 동안 유지시켰다 (50-75% 배지 교체는 매 3-5일마다 수행). AAV 형질감염 28-30일 후에 세포를 수확하였다.
수확된 세포를 용해시키고, 제조업체의 설명서에 따라 C2CT 키트를 사용하여 역전사를 수행하였다. 택맨(TaqMan) 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)을 사용하여 SNCA의 발현 수준을 측정하였다. SNCA 발현 수준을 하우스키핑 유전자 EIF4A2, ATP5BGAPDH의 발현 수준의 기하 평균에 대해 정규화하였다. 모의 형질감염 및 SNCA를 표적화하지 않는 것으로 공지된 ZFP-TF를 사용한 형질감염을 음성 대조군으로 사용하였다.
다수의 시험된 ZFP-TF를 이용하여 알파-시누클레인의 용량 의존적 억제를 입증하였다. 달성된 최대 억제는 99% 초과였지만, 본 발명자들은 알파-시누클레인을 더 낮은 정도로 억제시킨 ZFP-TF 또한 확인하였다 (예컨대, 최고 용량에서 약 90%, 약 75% 또는 약 40%). 도 3a-e 5는 스크리닝 데이터를 보여주는 것이다.
실시예 2: 알파-시누클레인 ZFP-TF의 오프-타겟 활성
알파-시누클레인 ZFP-TF가 전체 유전자 발현에 미치는 오프-타겟 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 대표적인 알파-시누클레인 ZFP-TF를 코딩하는 AAV로 처리된 인간 iPSC 유래 뉴런 및 1차 마우스 피질 뉴런으로부터 단리된 총 RNA에 대한 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
인간 iPSC 유래 뉴런을 실시예 1에 기술된 바와 같이 처리하였다. 마이크로어레이 분석을 위해, 세포를 웰당 260,000개 세포의 밀도로 폴리-L-오르니틴- 및 라미닌으로 코팅된 24 웰 플레이트 상에 플레이팅한 후, 플레이팅 48시간 후에 1E5 VG/세포로 형질감염시키고, 바이러스 형질감염 19일 후에 수확하였다. 수확된 세포로부터 단리된 RNA를 마이크로어레이 분석을 위해 사용하였다.
1차 마우스 피질 뉴런을 기브코(Gibco)로부터 구입하였다. 세포를 200,000개의 세포/웰로 폴리-D-리신으로 코팅된 24 웰 플레이트에 플레이팅하고, 제조업체의 설명서에 따라 글루타맥스(GlutaMAX)™ I 보충제, B27 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 기브코 뉴로베이설 배지(Gibco Neurobasal Medium)를 사용하여 유지시켰다. (DIV2에서) 플레이팅 48시간 후, 세포를 3E3 VG/세포의 MOI로 AAV6으로 감염시키고, 7일 후에 수확하였다 (DIV9에서; 50% 배지 교체는 매 3-4일마다 수행). 이어서, RNA 단리 및 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
제조업체의 설명서에 따라 진티탄(GeneTitan)™ 플랫폼 (클라리옴 S(Clariom S) 키트)을 사용하여 오프-타겟 분석을 수행하였다. 검정 결과는 TAC 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. > 2배로 조절된 FDR 보정 p 값 ≤0.05를 갖는 차별적으로 조절된 유전자를 분석에서 호출하였다. 최소의 오프-타겟 및 모의 형질감염을 갖는 것으로 알려진 ZFP-TF를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 7a-d는 인간 iPSC 유래 뉴런 및 1차 마우스 피질 뉴런에서 40개의 대표적인 알파-시누클레인 ZFP-TF의 마이크로어레이 결과를 보여주는 것이다. 광범위한 오프-타겟 활성을 보였고, 여기서 일부 ZFP-TF는 매우 낮은 정도에서 전혀 검출가능하지 않은 오프-타겟 활성을 보였다.
실시예 3: 알파-시누클레인 mRNA 발현의 생체내 억제
인간 및 마우스 뉴런 둘 모두에서 최소의 내지 전혀 검출가능하지 않은 오프-타겟 활성을 갖고, 인간 iPSC 유래 뉴런에서 상이한 최대 억제 활성 (82195, ~95%; 82264, ~80%)을 갖는 대표적인 두 ZFP-TF (82195 및 82264)를 발현하는 AAV9 구축물을 사용하여 PAC 시누클레인 마우스 모델에서 인간 SNCA의 생체내 억제를 입증하였다 (Kuo et al., Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50). 상기 마우스 모델은 마우스 알파-시누클레인-널 배경에서 그의 상류 조절 서열과 함께 전체 인간 SNCA 서열을 발현한다. 각 ZFP-TF 및 비히클을 발현하는 AAV9 벡터를 8주령된 암컷 PAC 시누클레인 마우스 (군당 n = 3)의 2개 부위의 선조체에 양측으로 0.5 ㎕/분 속도로 투여하였다 (반구당 2개 부위: 전방 선조체에 5 ㎕ 및 후방 선조체에 4 ㎕, 총 9 ㎕/반구 및 18 ㎕/동물). 주입 후, 시험 물품이 확산되도록 니들을 5분 동안 제자리에 그대로 두었다. 이어서, 니들을 1-2분에 걸쳐 천천히 리트랙션시켰다. 주사에 대한 정위 좌표는 하기와 같았다 (문측 선조체 - AP: + 1.4 mm, ML: +/-1.7 mm, DV: -3.0 mm; 미측 선조체: AP: +0.2 mm, ML: +/-2.3 mm, DV: -2.7mm). 3주 후에 마우스를 안락사시키고, 분자 분석을 위해 그의 뇌를 수집하였다. 안락사시, 동물을 0.9% 염수로 경심관류하고, 뇌를 꺼내고, 반으로 절단하였다. 좌측 반구는 12개의 다른 영역 (후각 망울; 문측, 내측, 및 미측 피질; 문측, 내측, 및 미측 선조체; 해마; 시상; 복측 중뇌; 수질; 및 소뇌)으로 추가 해부하였다. 해부된 조직을 RNA 무결성을 보존하기 위해 RNA레이터(RNALater)에 넣었다. 24시간 후, RNA레이터를 제거하고, 조직을 액체 질소에서 급냉시키고, -80℃에서 보관할 때까지 드라이아이스에서 유지시켰다.
뇌 조직을 얼음 상에서 0.6 mL TRI 시약 (써모 피셔(Thermo Fisher)) 및 2개의 3.2 mm 강철 비드 (바이오스펙 프로덕츠(BioSpec Products))를 함유하는 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옮겼다. 하기 파라미터를 사용하여 4℃에서 퀴아젠 티슈라이저(TissueLyser)를 사용하여 샘플을 용해시켰다: 5 사이클, 90s 지속 시간 및 25.1 프리퀀시. 짧은 회전 후, 실온에서 70 ㎕의 1-브로모-3-클로로프로판을 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 10 s 동안 와동시키고, 4℃에서 10 min 동안 12,000 x g로 원심분리하고, 각 샘플로부터의 수성 상 120 ㎕를 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다.
60 ㎕의 이소프로필 알콜 및 12 ㎕의 매그맥스(MagMax) 자기 비드 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 조직 용해물의 수성 상을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 킹피셔 96(Kingfisher 96) 로봇 (써모 사이언티픽) 및 매그맥스 키트 (써모 피셔)를 사용하여 조직 용해물로부터 리보핵산 (RNA)을 단리시켰다. 용출된 RNA 100 ㎕를 자기 스탠드를 사용하여 자기 비드로부터 분리시켰다. RNA 수율 및 품질은 나노드롭 8000(Nanodrop 8000) 기기 (써모 사이언티픽)를 사용하여 평가하였다.
디폴트에 의해 10 ㎕의 RNA 및 10 ㎕의 RT 마스터 믹스(RT Master Mix) (10x RT 완충제, 10x 랜덤 프라이머, 25x dNTP 믹스, 멀티스크라이브(Multiscribe) 효소 및 RNAse 무함유 물)와 함께 고용량 cDNA 역전사 키트(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA)을 제조하였다. 필요한 경우, 투입량이 100 내지 1,000 ng 범위에 확실히 있도록 RNA 및 RT 마스터 믹스 부피를 조정하였다. 역전사는 하기 프로그램을 사용하여 C1000 터치 바이오래드(C1000 Touch Biorad) 열 순환기에서 수행하였다: 25℃에서 10 min, 37℃에서 120 min, 85℃에서 5 min, 및 4℃에서 유지.
바이오래드 CFX384 열 순환기를 사용하여 cDNA에 대해 RT-qPCR을 수행하였다. 뉴클레아제 무함유 물에 cDNA를 10배 희석하고, 4 ㎕의 희석된 cDNA를 각 10 ㎕ PCR 반응물에 첨가하였다. 각 샘플을 기술적 사중으로 검정하였다. 삼중 검정을 위해 2x 패스트 멀티플렉스 PCR(2x Fast Multiplex PCR) (퀴아젠) 마스터 믹스를 사용하였고, 다른 검정을 위해서는 쏘어드밴스드 유니버설 프로브즈 슈퍼믹스(SsoAdvanced Universal Probes Supermix) (바이오래드)를 사용하였다.
하기 사이클링 조건을 사용하였다: 퀴아젠 패스트 멀티플렉스 마스터 믹스 → 95℃에서 5 min, 95℃에서 45 s, 60℃에서 45 s, 플레이트 판독, 40 사이클; 바이오래드 쏘어드밴스드 마스터 믹스 → 95℃에서 90 s, 95℃에서 12 s, 60℃에서 40 s, 플레이트 판독, 42 사이클.
RNA 단리 단계 이전 대 이후의 GFP RNA 스파이킹을 사용하여 RNA 회수율(%)을 평가하였다. 연구에서 동물로부터의 풀링된 RNA의 4-샘플 5배 희석 시리즈를 표준 곡선으로 사용하였다. 샘플 데이터를 3개의 하우스키핑 유전자 ATP5B, EIF4A2, 및 GAPDH의 기하 평균에 대해 정규화하였다.
본 실험으로부터의 알파-시누클레인, ZFP-TF, GFAP, IBA1, 및 NeuN mRNA 발현 데이터는 도 8a8b에 제시되어 있다. 데이터는 유의한 ZFP-TF 발현으로 뇌 영역에서 알파-시누클레인이 억제되었다는 것을 보여준다. 추가로, GFAP, IBA1, 및 NeuN 발현 데이터는 ZFP-TF의 투여가 신경염증 마커의 발현 증가 또는 뉴런 마커 NeuN의 발현 감소로 이어지지 않았기 때문에, ZFP-TF의 내약성이 우수하였다는 것을 나타낸다.
서열 목록
하기 표 1에는 본 개시내용의 예시적인 조작된 ZFP 47개가 열거되어 있다. 각 ZFP에 대해, ZFP 도메인 내 각 아연 핑거의 게놈 표적 서열 (결합 서열) 및 DNA 결합 인식 나선 서열 (즉, F1-F6)이 단일 열에 제시되어 있다. 하기 표에서 "∧"는 지시된 나선에서 제1 아미노산의 상류로 4번째 위치에 있는 아르기닌 (R) 잔기가 글루타민 (Q)으로 변이된 것을 나타낸다. 각각의 서열에 대한 서열식별번호는 서열 밑에 괄호 안에 제시되어 있다. 칼럼 2의 뉴클레오티드 서열에서, ZFP에 의해 접촉된 뉴클레오티드는 대문자로 제시되어 있다.
표 1 예시적인 ZFP
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
하기 표 2에는 본 개시내용의 예시적인 ZFP-TF 47개의 전장의 아미노산 서열이 열거되어 있으며, 여기서 DNA 결합 인식 나선 서열은 굵은체로 표시되어 있고, 모듈내 및 모듈간 링커는 밑줄체로 표시되어 있다. R(-5)Q 백본 돌연변이는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다. ZFP 및 KRAB 도메인 사이의 링커는 이중-밑줄표시되어 있다.
표 2 예시적인 ZFP-TF 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. <120> NOVEL ZINC FINGER PROTEIN TRANSCRIPTION FACTORS FOR REPRESSING ALPHA-SYNUCLEIN EXPRESSION <130> 025297.WO035 <140> <141> <150> 63/087,164 <151> 2020-10-02 <160> 226 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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Claims (27)

  1. 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 ZFP 도메인은 인간 알파-시누클레인 유전자 (SNCA 유전자)의 표적 영역에 결합하는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 표적 영역이 SNCA 유전자 중 전사 개시 부위 (TSS)의 1 kb 이내에 있는 것인 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, TSS가 TSS1, 2a, 또는 2b인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 표적 영역이 SNCA 유전자의 TSS 1의 상류 500 bp 이내에, TSS 1의 하류 500 bp 이내에, TSS 2a의 상류 500 bp 이내에, 및/또는 TSS 2b의 하류 500 bp 이내에 있는 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이 6개의 아연 핑거를 포함하고, 융합 단백질이 임의적으로 검출가능한 오프-타겟 결합 또는 활성은 전혀 없이 또는 최소로 하면서, SNCA 유전자의 발현을 적어도 약 40%, 75%, 90%, 95%, 또는 99%만큼 억제시키는 것인 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 리프레서 도메인이 인간 KOX1로부터의 KRAB 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이 펩티드 링커를 통해 전사 리프레서에 연결된 것인 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이 표 1에 제시된 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이 표 1의 단일 열에 제시된 바와 같은 DNA 결합 인식 나선 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물이며, 여기서 코딩 서열은 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 구축물.
  11. 제10항에 있어서, 전사 조절 요소가 뇌 세포에서 구성적으로 활성이거나 또는 유도가능한 포유동물 프로모터이고, 여기서 프로모터가 임의적으로 인간 시냅신 I 프로모터인 핵산 구축물.
  12. 제10항 또는 제11항의 핵산 구축물을 포함하는 재조합 바이러스.
  13. 제12항에 있어서, 재조합 바이러스가 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인 재조합 바이러스.
  14. 제10항 또는 제11항의 핵산 구축물, 또는 제12항 또는 제13항의 재조합 바이러스, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제10항 또는 제11항의 핵산 구축물, 또는 제12항 또는 제13항의 재조합 바이러스를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 숙주 세포가 인간 세포인 숙주 세포.
  17. 제15항에 있어서, 숙주 세포가 뇌 세포 또는 만능 줄기 세포이고, 여기서 줄기 세포가 임의적으로 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)인 숙주 세포.
  18. 인간 뇌 세포 내로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을, 임의적으로 제10항 또는 제11항의 핵산 구축물 또는 제12항 또는 제13항의 재조합 바이러스의 도입을 통해 도입하여 세포에서 알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는, 인간 뇌 세포에서 알파-시누클레인의 발현을 억제시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 인간 뇌 세포가 뉴런, 신경교 세포, 뇌실막 세포, 또는 신경상피 세포인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 세포가 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 다계통 위축증, 또는 또 다른 시누클레인병증을 앓고 있거나, 또는 그가 발병할 위험이 있는 환자의 뇌에 있는 것인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 바이러스가 아데노-연관 바이러스 (AAV), 임의적으로 혈청형 9의 것인 방법.
  23. 환자에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 재조합 AAV를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 시누클레인병증을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, AAV를 정맥내, 척수강내, 뇌실내, 대수조내, 선조체내, 또는 흑질내 주사, 또는 임의의 뇌 영역으로의 주사를 통해 환자에게 도입하는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 시누클레인병증이 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 또는 다계통 위축증인 방법.
  26. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질, 핵산 구축물, 재조합 바이러스, 제약 조성물.
  27. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에서의 의약 제조를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제10항 또는 제11항의 핵산 구축물, 제12항 또는 제13항의 재조합 바이러스의 용도.
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