BR112021008083A2

BR112021008083A2 - terapia contra o câncer com célula imunológica anti-ptk7

Info

Publication number: BR112021008083A2
Application number: BR112021008083-0A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; Jason Sagert
Original assignee: Crispr Therapeutics Ag
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-08-10
Also published as: US20200140815A1; WO2020095248A1; AU2019374523A1; PH12021551047A1; CN112955472A; IL282532A; EP3877421A1; JP2022509017A; CA3118830A1; US20210290678A1; CO2021005471A2; ZA202102745B; MX2021005400A; KR20210092236A; SG11202104631SA

Abstract

TERAPIA CONTRA O CÂNCER COM CÉLULA IMUNOLÓGICA ANTI-PTK7. A presente invenção refere-se a métodos e composições (por exemplo, composições celulares) para o tratamento de câncer, tais como malignidades PTK7+.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “TERA- PIA CONTRA O CÂNCER COM CÉLULA IMUNOLÓGICA ANTI- PTK7”.

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob no U.S. 62/756.638, depositado em 7 de novembro de 2018, e do Pedido Provisório sob no U.S. 62/910.586, depositado em 4 de outubro de 2019, cujas descrições são incorporadas pelo mesmo a título de referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO ELETRONICAMENTE

[0002] A Listagem de Sequências, que faz parte da presente des- crição, é apresentada simultaneamente com o relatório descritivo como um arquivo de texto. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequências é "CT111_Seqlisting.txt", que foi criado em 7 de novem- bro de 2019 e tem 119.776 bytes. A matéria da Listagem de Sequência é incorporada no presente documento em sua totalidade a título de re- ferência.

ANTECEDENTES

[0003] A terapia com células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) usa células T geneticamente modificadas para alvejar e matar mais especificamente e eficientemente células cancerosas. Após as cé- lulas T terem sido coletadas do sangue, as células são manipuladas para incluírem CARs em sua superfície. Os CARs podem ser introduzi- dos nas células T usando tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9. Quando estas células T de CAR alogênicas são injetadas em um paci- ente, os receptores permitem que as células T matem as células cance- rosas.

SUMÁRIO

[0004] Múltiplos alvos de antígenos associados a tumores progredi- ram em testes clínicos, escolhidos predominantemente usando-se a ló- gica de que a expressão em tecidos cancerígenos deve ser seletiva em vez de tecidos normais para evitar toxicidade (Morgan, R. Blood 2013; 122 (2): 3.392 a 3.394). PTK7, entretanto, não satisfaz esses critérios devido à sua expressão excessiva evidente em tecidos normais, que inclui pulmão, músculo liso, estômago, rim e bexiga. Assim, PTK7 não foi considerado um alvo de célula T de CAR viável. Não obstante, os dados fornecidos no presente documento demonstram inesperada- mente que os animais, na realidade, toleram a terapia com células T de CAR anti-PTK7 e essas células T de CAR anti-PTK7 eliminam de forma eficaz e seletiva as células que expressam PTK7.

[0005] Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam uma célula T manipulada compreendendo um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a PTK7. Em algumas modali- dades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene in- terrompido da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC). Por exemplo, o gene TRAC pode ser interrompido por inserção do ácido nucleico que codifica um CAR. Em algumas modalidades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene interrompido de beta-2-microglobulina (β2M).

[0006] O ectodomínio do CAR, em algumas modalidades, compre- ende um anticorpo anti-PTK7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7. O scFv anti-PTK7, em algumas modalidades, compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82. Em algumas modalidades, o scFv anti-PTK7 compreende um VH que com- preende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 55, 69, 76 ou 83 e/ou um VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 56, 70, 77 ou 84. Em algumas modalidades, o scFv anti-PTK7 compreende um VH que com- preende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 e/ou SEQ ID NO: 59; e/ou o scFv anti-PTK7 compreende uma sequência de VL que compreende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e/ou SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o scFv anti-PTK7 compreende um VH que compreende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 e/ou SEQ ID NO: 87; e/ou o scFv anti-PTK7 compreende uma sequên- cia de VL que compreende sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 e/ou SEQ ID NO: 90.

[0007] O CAR, em algumas modalidades, compreende um domínio de sinalização citoplasmática CD3ζ. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimu- lador 41BB.

[0008] Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se- quência de nucleotídeos que codifica o braço de homologia esquerdo (LHA) e/ou braço de homologia direito (RHA) dentro de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91, ou a sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 92 ou 100 e/ou em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou

112. Em algumas modalidades, o gene β2M interrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer um das SEQ ID NOs: 9 a 14.

[0009] Também é fornecida no presente documento, em alguns as- pectos, uma célula T manipulada que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao an- tígeno anti-PTK7.

[0010] Também é fornecida no presente documento, em alguns as- pectos, uma população de células que compreende células T manipula- das, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao an- tígeno anti-PTK7. Em outros aspectos, é fornecida no presente docu- mento uma população de células que compreende células T manipula- das, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 e codifica o CAR de SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

[0011] É também proporcionada aqui, em alguns aspectos, uma po- pulação de células T manipuladas (por exemplo, que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR anti-PTK7), em que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população ex- pressam o CAR. Por exemplo, pelo menos 70% das células T manipu- ladas da população expressam o CAR.

[0012] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[0013] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TCR). Por exemplo, pelo menos 90% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína TCR.

[0014] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína β2M. Por exemplo, pelo menos 70% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína β2M.

[0015] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da po- pulação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 50% das células cancerosas da população. Por exemplo, as células T manipuladas da população podem induzir a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células cancerosas da população. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da po- pulação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da po- pulação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNγ. Em algumas modalidades, a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1. As células can- cerosas podem ser, por exemplo, células de sarcoma ou células de cân- cer de mama. Outras células cancerosas podem ser alvejadas. Em al- gumas modalidades, as células cancerosas podem ser células de cân- cer de mama, células de câncer de ovário, células de câncer pulmonar de células pequenas e/ou células de câncer de cólon.

[0016] Em algumas modalidades, a capacidade proliferativa das cé- lulas T manipuladas da população está dentro de 10% da capacidade proliferativa das células de controle. Em ainda outras modalidades, a população de células T, quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

[0017] Outros aspectos da presente descrição fornecem um método que compreende a administração da população de células T manipula- das como descrito no presente documento. Em algumas modalidades,

a porcentagem de peso corporal do indivíduo, após 5-10 dias de admi- nistração, está dentro de 10% do peso corporal inicial do indivíduo, em que o peso corporal inicial do indivíduo é o peso corporal do indivíduo no momento da administração. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer. O câncer pode expressar PTK7, por exemplo. Em várias moda- lidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: cân- cer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer uterino, cân- cer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leuce- mia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

[0018] Aspectos adicionais da presente descrição fornecem um mé- todo para produção de uma célula T manipulada, em que o método com- preende (a) entregar a uma célula T de uma nuclease guiada por RNA, um gRNA que alveja um gene TRAC e um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a PTK7, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC e (b) produ- ção de uma célula T manipulada. Em algumas modalidades, o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em uma modalidade relacionada, o método é fornecido em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de ho- mologia esquerdo e direito do gene TRAC.

[0019] Em algumas modalidades, o método compreende adicional- mente entregar à célula T um gRNA que alveja o gene β2M. Em algu- mas modalidades, o gRNA que alveja o gene β2M compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[0020] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyoge- nes. Em algumas modalidades, o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-PTK7, opcionalmente um fragmento variável de cadeia única anti- PTK7 (scFv).

[0021] Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: : 63, 64, 71, 78, ou 91.

[0022] Em algumas modalidades, o CAR compreende a sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um das SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73, ou 80.

[0023] Em algumas modalidades, o método para produzir é forne- cido em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas regiões deter- minantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabe- lecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL estabele- cido como SEQ ID NO: 84. Em uma modalidade, o método é fornecido em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas cadeias VH e VL que o anticorpo de referência. Em ainda outra modalidade, o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75, ou 82.

[0024] Em uma modalidade, um método para produzir supracitado é fornecido, em que o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB. Em uma modalidade relaci- onada, o CAR compreende ainda um domínio de sinalização citoplas- mática CD3ζ.

[0025] Em algumas modalidades, um método para produzir supra- citado é fornecido, em que o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91. Em ainda outras modalidades, o CAR é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79, ou 112.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura 1 mostra a expressão de PTK7 em tecidos huma- nos normais.

[0027] As Figuras 2A e 2B mostram a expressão de PTK7 em teci- dos humanos doentes e normais.

[0028] A Figura 3 mostra a prevalência de pacientes com PTK7 pela imuno-histoquímica (IHQ) em tumores sólidos.

[0029] A Figura 4 mostra a afinidade de ligação de PTK7/CTX181 Ab em linhagens celulares humanas e murinas.

[0030] As Figuras 5A e 5B mostram a expressão de PTK7 em pai- néis de tecido normal congelado (padrão FDA) de camundongo (Figura 5A) e humano (Figura 5B).

[0031] A Figura 6 mostra a expressão de PTK7 em matriz de de- senvolvimento embrionário murino congelado.

[0032] A Figura 7 inclui gráficos que mostram a edição de múltiplos genes altamente eficiente em células T de TRAC-/β2M-/ CAR+ anti-

PTK7. Os fenótipos editores conforme medido por FACS (gráfico à es- querda) e a expressão de CAR+ anti-PTK7 medida por imuno-histoquí- mica (gráfico à direita) são mostrados para quatro construtos de CAR + anti-PTK7 diferentes (PTK7-4, PTK7-7, PTK7-13 e PTK7-17).

[0033] A Figura 8 inclui um gráfico que mostra que a célula T de CAR de PTK7 com domínio coestimulador CD28 (PTK7-4) foi mais efi- caz do que a célula T de CAR de PTK7 com domínio coestimulador 4- 1BB (PTK7-4b).

[0034] As Figuras 9A a 9C incluem gráficos que mostram os efeitos de morte celular de células T de TRAC-/β2M-/ CAR+ anti-PTK7 contra linhagens celulares de sarcoma aderentes A-204 (Figura 9A) e Saos-2 (Figura 9B) e a linhagem celular de câncer de mama MCF7 (Figura 9C). Foram utilizadas razões celulares (célula T de CAR:célula cance- rosa alvo) de 2:1 e 1:1.

[0035] As Figuras 10A a 10C mostram especificidade de células T de CAR de PTK7 em células PTK7-KO Saos2 (Figura 10A) e células A498 com superexpressão de PTK7 (Figura 10B). A Figura 10C mostra a expressão de superfície de célula PTK7 nas células Saos2, células PTK7-KO Saos2, células A498 e células A498 com superexpressão de PTK7.

[0036] As Figuras 11A a 11C mostram que a potência in vitro de células T de CAR de PTK7 tendeu ao padrão de expressão em linha- gens celulares de tumor sólido: câncer de mama (Figura 11A), câncer de pâncreas (Figura 11B) e câncer pulmonar (NSCLC) (Figura 11C).

[0037] A Figura 12 inclui um gráfico que mostra a proliferação celu- lar de células de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-PTK7 após edição gênica, em comparação aos controles.

[0038] As Figuras 13A a 13B incluem gráficos que mostram a per- sistência de edição de múltiplos genes em células T. Os fenótipos edi- tores medidos por FACS permaneceu consistente desde o dia 7 (Figura

13A) até o dia 14 (Figura 13B) pós-edição. As Figuras 13C a 13D mos- tram o fenótipo editor de células T de CAR de PTK7-4 medido por FACS no Dia 7 pós-edição apresentado como gráfico FACS (Figura 13C) e gráfico (Figura 13D).

[0039] As Figuras 14A a 14F incluem gráficos que mostram que células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-PTK7 são mais eficazes na morte celular e secretam níveis mais elevados de IFNγ do que as células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-CD19 quando contatadas com células MCF7 (Fi- guras 14A a 14C) e Saos-2 (Figuras 14D a 14F).

[0040] A Figura 15 mostra que as células T de CAR anti-PTK7 fo- ram igualmente eficazes in vitro em linhagens celulares humanas e mu- rinas.

[0041] A Figura 16 inclui um gráfico que mostra que camundongos tratados com células TRAC-/β2M-/CAR+-T anti-PTK7 mostraram perda de peso corporal mínima por até 10 dias após o tratamento/injeção.

[0042] A Figura 17 mostra os níveis de expressão de superfície de célula PTK7 em linhagens celulares de câncer humano.

[0043] As Figuras 18A a 18C mostram a eficácia de células T de CAR anti-PTK7 em vários modelos de xenoenxerto in vivo.

[0044] As Figuras 19A a 19C mostram estudos in vivo de acompa- nhamento cegos para avaliar a eficácia das células T de CAR de PTK7 em tipos de câncer de ovário (Figura 19A), cólon e SCLC (Figura 19B) e de mama (Figura 19C).

[0045] A Figura 20 mostra o efeito do tratamento com células T de CAR de PTK7 sobre o peso corporal em modelo de camundongo com xenoenxerto de tumor pancreático Hs-766T.

DESCRIÇÃO DETALHADA Antígeno de Câncer PTK7

[0046] Em algumas modalidades, as células T da presente descri- ção são manipuladas com um receptor de antígeno quimérico (CAR)

projetado para alvejar PTK7. A proteína tirosina quinase 7 (PTK7), tam- bém conhecida como carcinoma quinase 4 do cólon (CCK4), é uma pro- teína tirosina quinase receptora que está envolvida na sinalização não canônica de Wnt e compreende um domínio extracelular. PTK7 carece de atividade catalítica de tirosina quinase detectável; entretanto, com- preende a atividade de transdução de sinal e presume-se que funcione na adesão celular. Pensa-se adicionalmente que o PTK7 é um marcador para a progressão tumoral no câncer, na medida em que é expresso em linhagens celulares cancerosas (por exemplo, linhagens celulares de câncer do cólon e da mama).

[0047] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente descrição são manipuladas para expressarem um CAR que compre- ende um anticorpo anti-PTK7 (por exemplo, scFv anti-PTK7). Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um scFv anti-PTK7 codifi- cado pela sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 53, 67, 74 ou

81. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um scFv anti- PTK7 codificado pela sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 113. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um scFv anti-PTK7 que compreende a sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um scFv anti-PTK7 que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 55, 69, 76 ou 83. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PTK7 é um scFv anti-PTK7 que compreende um VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 56, 70, 77 ou 84. Em algumas moda- lidades, um CAR que compreende um anticorpo anti-PTK7 é codificado pela sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72 ou 79. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticorpo anti- PTK7 é codificado por uma sequência que compreende um ácido nu- cleico que é pelo menos 90% idêntico às SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72,

79 ou 112. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticorpo anti-PTK7 é codificado pela sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 112. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticorpo anti-PTK7 compreende a sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80. Em algumas modalidades, um CAR que compreende um anticorpo anti-PTK7 compreende um anticorpo anti-PTK7 como descrito no documento US 9.359.442, US 9.102.738 ou US 9.409.995. Edição de Múltiplos Genes

[0048] As células T manipuladas da presente descrição, em algu- mas modalidades, incluem mais do que uma edição gênica, por exem- plo, em mais do que um gene. Por exemplo, uma célula T manipulada pode compreender um gene da região constante de cadeia alfa do re- ceptor de células T (TRAC) interrompido, um gene da beta-2-microglo- bulina (β2M) interrompido, um gene de morte celular programada-1 (PD- 1 ou PDCD1) interrompido, um gene CD70 interrompido ou qualquer combinação de dois ou mais dos genes interrompidos anteriores. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene β2M interrompido e um gene CD70 inter- rompido. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido, um gene β2M interrompido e um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T mani- pulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene β2Minter- rompido, um gene CD70 interrompido e um gene PD-1 interrompido.

[0049] Deve ser entendido que a interrupção gênica engloba modi- ficação gênica através da edição gênica (por exemplo, usando edição gênica CRISPR/Cas para inserir ou deletar um ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, um gene interrompido é um gene que não codifica proteína funcional. Em algumas modalidades, uma célula que compreende um gene interrompido não expressa (por exemplo, na su- perfície da célula) um nível detectável (por exemplo, por anticorpo, por exemplo, por citometria de fluxo) da proteína codificada pelo gene. Uma célula que não expressa um nível detectável da proteína pode ser refe- rida como uma célula inativada. Por exemplo, uma célula que tem uma edição no gene β2M pode ser considerada uma célula com nocaute de β2M se a proteína β2M não puder ser detectada à superfície da célula usando um anticorpo que se liga especificamente à proteína β2M.

[0050] São fornecidas no presente documento, em algumas moda- lidades, as populações de células nas quais uma determinada porcen- tagem das células foi editada (por exemplo, geneβ2M editado), resul- tando em uma determinada porcentagem de células que não expressam um determinado gene e/ou proteína. Em algumas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo ,50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 85%) das células de uma população de células editadas por genes são células com nocaute de β2M. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células (por exemplo, células T) da população não ex- pressam níveis detectáveis de proteína β2M. Em algumas modalidades, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células de uma população de células editadas por genes podem ser células com nocaute de β2M.

[0051] Métodos para usar a tecnologia de edição gênica CRISPR- Cas para criar uma deleção genômica em uma célula (por exemplo, para realizar nocaute de um gene em uma célula) são conhecidos (Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015;95;e52118). Edição do Gene TRAC

[0052] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido. Esta interrupção leva à perda de função do TCR e torna as células T manipuladas não alorreativas e ade- quadas para transplante alogênico, minimizando o risco de doença de enxerto versus hospedeiro. Em algumas modalidades, a expressão do gene TRAC endógeno é eliminada para prevenir uma resposta de en- xerto-versus-hospedeiro. Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada inserindo um receptor de antígeno quimérico (CAR) no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor viral adenoassociado (AAV) e modelo de doador). Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada por gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC. Em algumas modalidades, uma deleção genômica no gene TRAC é criada realizando-se nocaute de um receptor de antígeno quimérico (CAR) no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor AAV e um modelo de doador). Em algumas modalida- des, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada por gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC e inserção de um receptor de antígeno quimérico (CAR) no gene TRAC.

[0053] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de TRAC modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma interrupção genômica no gene TRAC estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 18 e 19). Consulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, de- positado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene TRAC localizada no cromossomo 14 (GRCh38: cromossomo 14: 22,547,506-22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734). Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC criam Indels no gene TRAC interrompendo a expressão do mRNA ou proteína.

[0054] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície do receptor de células T (TCR). Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície TCR. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% da população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de superfície TCR.

[0055] Em algumas modalidades, os gRNAs que alvejam a região genômica de TRAC criam Indels no gene TRAC que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguin- tes sequências na Tabela 1: Tabela 1. Sequência SEQ ID NO: AAGAGCAACAAATCTGACT 1 AAGAGCAACAGTGCTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 2 AAGAGCAACAGTGCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 3 AAGAGCAACAGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 4 AAGAGCAACAGTGCTGACTAAGAGCAACAAATCTGACT 5 AAGAGCAACAGTGCTGTGGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 6 AAGAGCAACAGTGCTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 7 AAGAGCAACAGTGCTGTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 8

[0056] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende uma deleção no gene TRAC em relação às células T não modifi- cadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende uma deleção de 15-30 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de bases no gene TRAC relativo às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de mais do que 30 pares de ba- ses no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algu- mas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 20 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não mo- dificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende uma deleção de SEQ ID NO: 104 (AGAGCAACAGTGCTG- TGGCC) no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma de- leção que compreende o SEQ ID NO: 104 (AGAGCAACAGTGCTG- TGGCC) no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma de- leção de SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende uma deleção compreendendo SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Edição do Gene β2M

[0057] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene β2M interrompido. β2M é um componente comum (inva- riante) dos complexos MHC I. A interrupção de sua expressão por edi- ção gênica prevenirá respostas hospedeiro versus células T alogênicas terapêuticas levando a persistência aumentada de células T alogênicas. Em algumas modalidades, a expressão do gene β2M endógeno é elimi- nada para evitar uma resposta hospedeiro-versus-enxerto.

[0058] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de β2M modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma interrupção genômica no gene β2M estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 20 e 21). Consulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, de- positado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene β2M localizada no Cromossomo 15 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710).

[0059] Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região ge- nômica de β2M criam Indels no gene β2M interrompendo a expressão do mRNA ou proteína.

[0060] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície β2M. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de prote- ína de superfície β2M. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%- 90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%- 80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%- 90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície β2M.

[0061] Em algumas modalidades, um gene β2M editado compre- ende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada das se- guintes sequências na Tabela 2. Tabela 2. Sequências SEQ ID NO: CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 9 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 10 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 11 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGATAGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 12 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 13 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 14 Edição do Gene PD-1

[0062] PD-1 é uma molécula de ponto de verificação imunológico que é suprarregulada nas células T ativadas e serve para atenuar ou parar as respostas das células T. A interrupção de PD-1 por edição gê- nica pode levar a respostas de células T terapêuticas mais persistentes e/ou potentes e/ou reduzir a supressão imunitária em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene PD-

1 endógeno é eliminada para intensificar a eficácia antitumoral das cé- lulas T de CAR da presente descrição.

[0063] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de PD-1 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma deleção genômica no gene PD- 1 estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 22 e 23). Con- sulte também Pedido Internacional sob no PCT/US2018/032334, depo- sitado em 11 de maio de 2018, incorporado no presente a título de refe- rência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene PD-1 localizada no cromossomo 2 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 2: 241,849,881-241,858,908; Ensembl: ENSG00000188389).

[0064] Em algumas modalidades, gRNAs que alvejam a região ge- nômica de PD-1 criam Indels no gene PD-1 interrompendo a expressão da proteína ou mRNA de PD-1.

[0065] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de prote- ína de superfície PD-1. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%- 90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%- 80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%- 90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Edição do Gene CD70

[0066] Agrupamento de Diferenciação 70 (CD70) é um membro da superfamília dos fatores de necrose tumoral e sua expressão é restrita a linfócitos T e B ativados e células dendríticas maduras. CD70 foi tam- bém detectado em tumores hematológicos e em carcinomas. CD70 está implicado na sobrevivência das células tumorais e células T reguladoras através da interação com seu aglutinante, CD27. A interrupção de CD70 por edição gênica aumenta a expansão celular e reduz a exaustão ce- lular. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene CD70 endógeno é eliminada para intensificar a eficácia antitumo- ral das células T de CAR da presente descrição. Em algumas modalida- des, gRNAs que alvejam a região genômica de CD70 criam Indels no, ou em torno do, gene CD70 interrompendo a expressão da proteína e/ou mRNA de CD70.

[0067] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de CD70 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como fornecido no presente documento para criar uma interrupção genômica no gene CD70 estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 24-27). Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequên- cia do gene CD70 localizada no cromossomo 19 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 19: 6,583,183-6,604,103; Ensembl: ENSG00000125726).

[0068] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD70. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T mani- puladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície CD70. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressa um nível detectável de proteína de superfície CD70. Fenótipos Celulares

[0069] Em algumas modalidades, uma ou mais edições gênicas dentro de uma população de células resulta em um fenótipo associado a mudanças na capacidade proliferativa celular, exaustão celular, viabi- lidade celular, capacidade de lise celular (por exemplo, produção e/ou liberação de citocinas aumentadas) ou qualquer sua combinação.

[0070] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem capacidade proliferativa celular pelo menos 20% maior, em relação às células T de controle. Por exemplo, as células T manipuladas podem exibir capacidade proliferativa celular pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo me- nos 90% maior, em relação às células de controle. Em algumas moda- lidades, as células T manipuladas da presente descrição exibem capa- cidade proliferativa celular 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, maior em relação às células T de controle.

[0071] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem um aumento de pelo menos 20% na viabilidade celular, em relação às células de controle. Por exemplo, as células T manipuladas da presente descrição podem exibir aumento de pelo me- nos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na viabilidade celular em relação às células de con- trole. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente descrição exibem um aumento de 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% na viabilidade celular em relação às células de controle.

[0072] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da pre- sente descrição exibem um aumento de pelo menos 20% na capacidade de lise celular (matam pelo menos 20% mais células alvo) em relação às células de controle. Por exemplo, as células T manipuladas da pre- sente descrição podem exibir um aumento de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na capacidade de lise celular, em relação às células de controle. Em algu- mas modalidades, as células T manipuladas da presente descrição exi- bem um aumento de 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%- 60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%- 60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%- 60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%- 60% na capacidade de lise celular, em relação às células de controle. Por exemplo, o nível de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) secretadas pelas células T manipuladas pode pelo menos 2 vezes (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes) maior do que o nível de citocinas secretadas pelas células T de controle.

[0073] As células T de controle, em algumas modalidades, são cé- lulas T manipuladas (por exemplo, células T com edição gênica). Em algumas modalidades, as células T de controle são células T manipula- das que compreendem um gene TRAC interrompido, um ácido nucleico que codifica um CAR (por exemplo, um CAR anti-PTK7) inserido no gene TRAC e/ou um gene β2M interrompido. Em algumas modalidades, as células T de controle são células T não editadas. Métodos de Edição Gênica

[0074] A edição gênica (que inclui edição genômica) é um tipo de manipulação genética na qual nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s) é/são inserido(s), deletado(s) e/ou substituído(s) em uma sequência de DNA, como no genoma de uma célula alvejada. A edição gênica alvejada per- mite a inserção, exclusão e/ou substituição em sítios pré-selecionados no genoma de uma célula-alvo (por exemplo, em um gene alvejado ou sequência de DNA alvejada). Quando uma sequência de um gene en- dógeno for editada, por exemplo por deleção, inserção ou substituição de nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s), o gene endógeno que compre- ende a sequência afetada pode ser inativado ou silenciado devido à al- teração de sequência. Portanto, a edição alvejada pode ser usada para interromper a expressão do gene endógeno. “Integração alvejada” se refere a um processo envolvendo inserção de uma ou mais sequências exógenas, com ou sem deleção de uma sequência endógena no local de inserção. A integração alvejada pode resultar da edição gênica alve- jada quando um modelo doador contendo uma sequência exógena está presente.

[0075] A edição alvejada pode ser alcançada através de uma abor- dagem independente de nucleases ou através de uma abordagem de- pendente de nucleases. Na abordagem de edição alvejada indepen- dente de nucleases, a recombinação homóloga é guiada por sequências homólogas flanqueando um polinucleotídeo exógeno a ser introduzido em uma sequência endógena através da maquinaria enzimática da cé- lula hospedeira. O polinucleotídeo exógeno pode introduzir deleções, inserções ou substituição de nucleotídeos na sequência endógena.

[0076] Alternativamente, a abordagem dependente de nucleases pode alcançar edição alvejada com frequência mais elevada através da introdução específica de quebras de filamento duplo (DSBs) por nuclea- ses de corte raro específicas (por exemplo, endonucleases). Essa edi- ção alvejada dependente de nucleases utiliza também mecanismos de reparo do DNA, por exemplo, junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que ocorre em resposta a DSBs. O reparo do DNA por NHEJ leva frequentemente a inserções ou deleções (indels) aleatórias de um pequeno número de nucleotídeos endógenos. Em contraste com o re- paro mediada por NHEJ, o reparo pode também ocorrer por um reparo dirigido por homologia (HDR). Quando um modelo doador contendo ma- terial genético exógeno flanqueado por um par de braços de homologia está presente, o material genético exógeno pode ser introduzido no ge- noma por HDR, o que resulta em integração alvejada do material gené- tico exógeno.

[0077] Endonucleases disponíveis capazes de introduzir DSBs es- pecíficas e alvejadas incluem, mas não limitadas a, nucleases de dedos de zinco (ZFN), nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (TALEN) e nuclease CRISPR-Cas9 guiada por RNA (CRISPR/Cas9; Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Intercaladas Associa- das 9). Adicionalmente, o sistema DICE (troca de cassete de integrase dupla) utilizando integrases phiC31 e Bxb1 pode ser também usado para integração alvejada.

[0078] As ZFNs são nucleases alvejadas que compreende uma nu- clease fundida a um domínio de ligação de DNA de dedos de zinco (ZFBD), que é um domínio de polipeptídeo que se liga ao DNA de uma maneira específica da sequência através de um ou mais dedos de zinco. Um dedo de zinco é um domínio de cerca de 30 aminoácidos dentro do domínio de ligação dos dedos de zinco cuja estrutura é estabilizada atra- vés da coordenação de um íon de zinco. Exemplos de dedos de zinco incluem, mas não limitados a, dedos de zinco C2H2, dedos de zinco

C3H e dedos de zinco C4. Um domínio de dedo de zinco desenhado é um domínio não ocorrendo na natureza cujo desenho/composição re- sulta principalmente de critérios racionais, por exemplo, aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processa- mento de informação em uma base de dados armazenando informação de desenhos de ZFP existentes e dados de ligação. Consulte, por exem- plo, Patente sob nos U.S. 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; consulte também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. Um domínio de dedo de zinco selecionado é um domí- nio não encontrado na natureza cuja produção resulta principalmente de um processo empírico como exibição em fagos, armadilha de intera- ção ou seleção de híbridos. Os ZFNs são descritos em maior detalhe na Pat. sob nº U.S. 7.888.121 e Pat. sob nº U.S. 7.972.854. O exemplo mais conhecido de um ZFN é uma fusão da nuclease FokI com um do- mínio de ligação ao DNA de dedos de zinco.

[0079] Uma TALEN é uma nuclease alvejada que compreende uma nuclease fundida a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL. Um “domínio de ligação ao DNA efetor tipo ativador de transcrição“, “domí- nio de ligação ao DNA efetor de TAL“ ou “domínio de ligação ao DNA TALE“ é um domínio de polipeptídeo de proteínas efetoras de TAL que é responsável pela ligação da proteína efetora de TAL ao DNA. As pro- teínas efetoras TAL são secretadas por patógenos de plantas do gênero Xanthomonas durante a infeção. Estas proteínas entram no núcleo da célula vegetal, se ligam a sequências de DNA específicas do efetor atra- vés de seu domínio de ligação ao DNA e ativam a transcrição gênica em estas sequências através de seus domínios de transativação. A es- pecificidade do domínio de ligação ao DNA efetor de TAL depende de um número variável efetor de repetições imperfeitas de 34 aminoácidos, que compreendem polimorfismos em posições repetidas selecionadas chamadas dirresíduos variáveis de repetição (RVD). As TALENs são descritas em maior detalhe no Pedido de Patente dos EUA No. 2011/0145940. O exemplo mais reconhecido de uma TALEN na técnica é um polipeptídeo de fusão da nuclease FokI a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL.

[0080] Exemplos adicionais de nucleases alvejadas adequadas para uso como fornecido no presente documento incluem, mas não es- tão limitados a, Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 e Wβ/SPBc/TP901-1, quer sejam usadas individualmente ou em combinação.

[0081] Outros exemplos não limitantes de nucleases alvejadas in- cluem nucleases de ocorrência natural e recombinantes, por exemplo, CRISPR/Cas9, endonucleases de restrição, endonucleases de migra- ção de meganucleases e similares. Edição Gênica CRISPR-Cas9

[0082] O sistema CRISPR-Cas9 é um mecanismo de defesa ocor- rendo naturalmente em procariotas que foi reaproveitado como uma pla- taforma de direcionamento de DNA guiado por RNA usada para edição gênica. Se baseia na DNA nuclease Cas9 e dois RNAs não codificantes - crisprRNA (crRNA) e RNA transativador (tracrRNA) - para alvejar a clivagem do DNA.

[0083] O crRNA conduz o reconhecimento de sequência e a espe- cificidade do complexo CRISPR-Cas9 através do emparelhamento de bases de Watson-Crick tipicamente com uma sequência de 20 nucleo- tídeos (nt) no DNA alvo. Alterar a sequência de 5’ 20nt no crRNA permite direcionar o complexo CRISPR-Cas9 para loci específicos. O complexo CRISPR-Cas9 se liga somente a sequências de DNA que contêm uma sequência correspondente aos primeiros 20 nt do crRNA, RNA guia único (sgRNA), se a sequência alvo for seguida por um motivo de DNA curto específico (com a sequência NGG) referido como um motivo adja- cente protoespaçador (PAM).

[0084] TracrRNA hibridiza com a extremidade 3’ de crRNA para for- mar uma estrutura duplex de RNA que é ligada pela endonuclease Cas9 para formar o complexo CRISPR-Cas9 cataliticamente ativo, que pode então clivar o DNA alvo.

[0085] Uma vez que o complexo CRISPR-Cas9 está ligado ao DNA em um sítio alvo, dois domínios de nuclease independentes dentro da enzima Cas9 clivam cada um dos filamentos de DNA a montante do local de PAM, deixando uma quebra de filamento duplo (DSB) em que ambos os filamentos do DNA terminam em um par de bases (uma ex- tremidade cega).

[0086] Após ligação do complexo CRISPR-Cas9 ao DNA em um sí- tio alvo específico e formação da DSB sítio-específica, a próxima etapa crítica é reparo da DSB. As células usam duas vias principais de reparo de DNA para reparar o DSB: união de extremidade não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido por homologia (HDR).

[0087] NHEJ é um mecanismo de reparo robusto que parece alta- mente ativo na maioria dos tipos de células, que inclui células que não se dividem. NHEJ é propensa a erros e pode frequentemente resultar na remoção ou adição de entre uma e várias centenas de nucleotídeos no local da DSB, embora tais modificações tenham tipicamente < 20 nt. As inserções e deleções (indels) resultantes podem interromper as re- giões codificantes ou não codificantes dos genes. Alternativamente, HDR usa um longo trecho de DNA doador homólogo, proporcionado en- dógena ou exogenamente, para reparar a DSB com elevada fidelidade. HDR é ativo apenas na divisão das células e ocorre em uma frequência relativamente baixa na maioria dos tipos de células. Em muitas modali- dades da presente descrição, NHEJ é utilizada como o operante do re- paro.

[0088] Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR) é de Streptococcus pyogenes, embora outros ho- mólogos Cas9 possam ser usados. Deve ser entendido que Cas9 de tipo selvagem pode ser usada ou versões modificadas de Cas9 podem ser usadas (por exemplo, versões evoluídas de Cas9 ou ortólogos ou variantes de Cas9), como fornecido no presente documento. Em algu- mas modalidades, Cas9 pode ser substituída por outra endonuclease guiada por RNA, como Cpf1 (de um sistema CRISPR/Cas de classe II). RNAs Guia

[0089] A presente descrição proporciona um ácido nucleico que al- veja o genoma que pode direcionar as atividades de um polipeptídeo associado (por exemplo, um polipeptídeo sítio-dirigido) para uma se- quência alvo específica dentro de um ácido nucleico alvo. O ácido nu- cleico que alveja o genoma pode ser um RNA. Um RNA que alveja o genoma é referido como um “RNA guia” ou “gRNA” no presente docu- mento. Um RNA guia compreende pelo menos uma sequência espaça- dora que hibrida com uma sequência de ácido nucleico alvo de interesse e uma sequência repetida de CRISPR. Nos sistemas do Tipo II, o gRNA compreende também um segundo RNA chamado a sequência de tracrRNA. No RNA guia de Tipo II (gRNA), a sequência repetida de CRISPR e a sequência de tracrRNA hibridam entre si para formar um dúplex. No RNA guia de Tipo V (gRNA), o crRNA forma um dúplex. Em ambos os sistemas, o dúplex se liga a um polipeptídeo sítio-dirigido, tal que o RNA guia e o polipeptídeo sítio-dirigido formem um complexo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o genoma fornece a especificidade do alvo para o complexo em virtude de sua associação ao polipeptídeo sítio-dirigido. O ácido nucleico que alveja o genoma di- reciona assim a atividade do polipeptídeo sítio-dirigido.

[0090] Como é entendido pelo perito na técnica, cada RNA guia é desenhado para incluir uma sequência espaçadora complementar à sua sequência alvo genômica. Consulte Jinek et al., Science, 337, 816 a 821

(2012) e Deltcheva et al., Nature, 471, 602 a 607 (2011).

[0091] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o ge- noma é um RNA guia de molécula dupla. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que alveja o genoma é um RNA guia de molécula única.

[0092] Um RNA guia de molécula dupla compreende dois filamen- tos de RNA. O primeiro filamento compreende, na direção 5’ para 3´, uma sequência de extensão espaçadora opcional, uma sequência es- paçadora e uma sequência repetida de CRISPR mínima. O segundo filamento compreende uma sequência de tracrRNA mínima (comple- mentar à sequência repetida de CRISPR mínima), uma sequência de tracrRNA 3’ e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional.

[0093] Um RNA guia de molécula única (sgRNA) em um sistema de Tipo II compreende, na direção 5’ para 3', uma sequência de extensão espaçadora opcional, uma sequência espaçadora, uma sequência re- petida de CRISPR mínima, um ligante guia de molécula única, uma se- quência de tracrRNA mínima, uma sequência de tracrRNA 3’ e uma se- quência de extensão de tracrRNA opcional. A extensão de tracrRNA op- cional pode compreender elementos que contribuem funcionalidade adi- cional (por exemplo, estabilidade) ao RNA guia. O ligante guia de molé- cula única liga a repetição de CRISPR mínima e a sequência de tracrRNA mínima para formar uma estrutura em grampo. A extensão de tracrRNA opcional compreende um ou mais grampos.

[0094] Um RNA guia de molécula única (referido como um “sgRNA” ou “gRNA”) em um sistema de Tipo V compreende, na direção 5´ para 3´, uma sequência repetida de CRISPR mínima e uma sequência espa- çadora.

[0095] O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora com menos do que 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de mais de 20 nucleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreen- der uma sequência espaçadora de comprimento variável com 17-30 nu- cleotídeos na extremidade 5’ da sequência de sgRNA (ver Tabela 3).

[0096] O sgRNA pode compreender nenhuma uracila na extremi- dade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender uma ou mais uracilas na extremidade 3´ da sequência de sgRNA. Por exemplo, o sgRNA pode compreender 1 uracila (U) na extremidade 3´ da sequên- cia de sgRNA. O sgRNA pode compreender 2 uracilas (UU) na extremi- dade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 3 uraci- las (UUU) na extremidade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 4 uracilas (UUUU) na extremidade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 5 uracilas (UUUUU) na extremi- dade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 6 uraci- las (UUUUUU) na extremidade 3´ da sequência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 7 uracilas (UUUUUUU) na extremidade 3´ da se- quência de sgRNA. O sgRNA pode compreender 8 uracilas (UUUUUUUU) na extremidade 3´ da sequência de sgRNA.

[0097] O sgRNA pode ser não modificado ou modificado. Por exem- plo, os sgRNAs modificados podem compreender um ou mais nucleotí- deos de fosforotioato de 2´-O-metila. Tabela 3. SEQ ID NO. Sequência de sgRNA 15 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 16 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 17 n(17-30)guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuug aaaaaguggcaccgagucggugcu(1-8)

[0098] A título de ilustração, os RNAs guia usados no sistema CRISPR/Cas/Cpf1 ou outros RNAs menores podem ser prontamente sintetizados por meios químicos, como ilustrado em baixo e descrito na técnica. Embora os procedimentos químicos sintéticos estejam continu- amente em expansão, a purificação de tais RNAs por procedimentos tais como cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC, que evita o uso de géis tais como PAGE) tende a se tornar mais desafiante à medida que os comprimentos dos polinucleotídeos aumentam signifi- cativamente para além de uma centena ou assim de nucleotídeos. Uma abordagem usada para gerar RNAs de maior comprimento é produzir duas ou mais moléculas que são ligadas entre si. RNAs muito mais lon- gos, tais como aqueles que codificam uma endonuclease Cas9 ou Cpf1, são mais prontamente gerados enzimaticamente. Vários tipos de modi- ficações de RNA podem ser introduzidos durante a ou após síntese quí- mica e/ou geração enzimática de RNAs, por exemplo, modificações que intensificam a estabilidade, reduzem a probabilidade ou o grau de res- posta imunológica inata e/ou intensificam outros atributos, como des- crito na técnica. Sequência Espaçadora

[0099] Um gRNA compreende uma sequência espaçadora. Uma sequência espaçadora é uma sequência (por exemplo, uma sequência de 20 nucleotídeos) que define a sequência alvo (por exemplo, uma se- quência alvo de DNA, como uma sequência alvo genômica) de um ácido nucleico alvo de interesse. Em algumas modalidades, a sequência es- paçadora tem 15 a 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a se- quência espaçadora tem 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sequên- cia espaçadora tem 20 nucleotídeos.

[00100] A “sequência alvo” é adjacente a uma sequência PAM e é a sequência modificada por uma nuclease guiada por RNA (por exem- plo, Cas9). O “ácido nucleico alvo” é uma molécula de filamento duplo: um filamento compreende a sequência alvo e é referida como o “fila- mento de PAM”, e o outro filamento complementar é referido como o “filamento diferente de PAM”. Um perito na técnica reconhece que a se- quência espaçadora de gRNA hibrida com o complemento reverso da sequência alvo, que está localizado no filamento diferente de PAM do ácido nucleico alvo de interesse. Assim, a sequência espaçadora de gRNA é o equivalente de RNA da sequência alvo. Por exemplo, se a sequência alvo é 5-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3 (SEQ ID NO: 104), então a sequência espaçadora de gRNA é 5-AGAGCAACAGUG- CUGUGGCC-3 (SEQ ID NO: 105). O espaçador de um gRNA interage com um ácido nucleico alvo de interesse de uma maneira específica da sequência através de hibridação (isto é, emparelhamento de bases). A sequência de nucleotídeos do espaçador varia assim dependendo da sequência alvo do ácido nucleico alvo de interesse.

[00101] Em um sistema CRISPR/Cas aqui, a sequência espaça- dora é desenhada para hibridar com uma região do ácido nucleico alvo que está localizada 5’ de um PAM da enzima Cas9 usada no sistema. O espaçador pode corresponder perfeitamente à sequência alvo ou pode ter incompatibilidades. Cada enzima Cas9 tem uma sequência PAM específica que reconhece em um DNA alvo. Por exemplo, S. pyo- genes reconhece em um ácido nucleico alvo um PAM que compreende a sequência 5´-NRG-3´, em que R compreende A ou G, em que N é qualquer nucleotídeo e N é imediatamente 3´ da sequência de ácidos nucleicos alvo alvejada pela sequência espaçadora.

[00102] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos alvo compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende menos do que 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende mais do que 20 nucle- otídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende pelo menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compre- ende no máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos alvo compreende 20 bases imediatamente 5’ do primeiro nu- cleotídeo de PAM. Por exemplo, em uma sequência que compreende

5´-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3´, o ácido nucleico alvo com- preende a sequência que corresponde aos Ns, em que N é qualquer nucleotídeo, e a sequência NRG sublinhada é o PAM de S. pyogenes.

[00103] Exemplos não limitantes de gRNAs que podem ser usados como fornecido no presente documento são proporcionados na Tabela 4 e PCT/US2018/032334, depositada em 11 de maio de 2018. Tabela 4. Sequências de gRNA/Sequências Alvo Sequências de gRNA Nome Sequência Não modificada Sequência Modificada sgRNA de TRAC AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauag- A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagag- caaguuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* (SEQ ID NO: 18) U*U (SEQ ID NO: 28) Espaçador de sgRNA de TRAC AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 19) A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 29) sgRNA de β2M GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauag- G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagag- caaguuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* (SEQ ID NO: 20) U*U (SEQ ID NO: 30) Espaçador de sgRNA de β2M GCUACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 21) G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 31) sgRNA de PD-1 CUGCAGCUUCUCCAACACAUguuuuagagcuagaaauag- C*U*G*CAGCUUCUCCAACACAUguuuuagag- caaguuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* ID NO: 22) U*U (SEQ ID NO: 32) Espaçador de sgRNA de PD-1 CUGCAGCUUCUCCAACACAU (SEQ ID NO: 23) C*U*G*CAGCUUCUCCAACACAU (SEQ ID NO: 33) sgRNA de CD70 (E1_T7) GCUUUGGUCCCAUUGGUCGCguuuuagagcuagaaauag- G*C*U*UUGGUCCCAUUGGUCGCguuuuagag- caaguuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* (SEQ ID NO: 24) U*U (SEQ ID NO: 34), T7 Espaçador CD70 sgRNA (E1_T7) GCUUUGGUCCCAUUGGUCGC (SEQ ID NO: 25) G*C*U*UUGGUCCCAUUGGUCGC (SEQ ID NO: 35) sgRNA de CD70 (E1_T8) GCCCGCAGGACGCACCCAUAguuuuagagcuagaaauag- G*C*C*CGCAGGACGCACCCAUAguuuuagag- caaguuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* (SEQ ID NO: 26) U*U (SEQ ID NO: 36), T8 Espaçador CD70 sgRNA (E1_T8) GCCCGCAGGACGCACCCAUA (SEQ ID NO: 27) G*C*C*CGCAGGACGCACCCAUA (SEQ ID NO: 37) Sequências Alvo Nome do Guia Sequência Alvo (PAM) sgRNA de CD70 (E1_T7) GCTTTGGTCCCATTGGTCGC (GGG) (SEQ ID NO: 38) sgRNA de CD70 (E1_T8) GCCCGCAGGACGCACCCATA (GGG) (SEQ ID NO: 39) sgRNA de TRAC AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 40) sgRNA de ββ2M GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 41) sgRNA de PD-1 CTGCAGCTTCTCCAACACAT (CGG) (SEQ ID NO: 42) *: Resíduo de fosforotioato de 2´-O-metila Células T de receptor de antígeno quimérico (CAR)

[00104] Um receptor de antígeno quimérico se refere a um receptor de célula imunitária artificial que é manipulado para reconhecer e se li- gar a um antígeno expresso por células tumorais. Geralmente, um CAR é projetado para uma célula T e é uma quimera de um domínio de sina- lização do complexo de receptor de células T (TCR) e um domínio de reconhecimento de antígeno (por exemplo, um fragmento de cadeia simples (scFv) de um anticorpo ou outro fragmento de anticorpo) (En- blad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26 (8): 498 a 505). Uma célula T que expressa um CAR é referida como uma célula T de CAR. Os CARs têm a capacidade para redirecionar a especificidade e a reativi- dade das células T na direção de um alvo selecionado de uma maneira não restrita ao MHC. O reconhecimento do antígeno não restrito a MHC dá às células T que expressam CARs a capacidade para reconhecerem um antígeno independentemente do processamento do antígeno, igno- rando assim um mecanismo principal do escape tumoral. Além disso, quando expressos em células T, os CARs não se dimerizam vantajosa- mente com as cadeias alfa e beta do receptor de células T (TCR) endó- geno.

[00105] Existem quatro gerações de CARs, cada uma das quais contém componentes diferentes. Os CARs de primeira geração unem um scFv derivado de anticorpo ao domínio de sinalização intracelular CD3ζeta (ζ ou z) do receptor de células T através de domínios de char- neira e transmembranar. Os CARs de segunda geração incorporam um domínio adicional, por exemplo, CD28, 4-1BB (41BB) ou ICOS, para for- necer um sinal coestimulador. Os CARs de terceira geração contêm dois domínios coestimuladores fundidos com a cadeia CD3ζ de TCR. Os do- mínios coestimuladores de terceira geração podem incluir, por exemplo, uma combinação de CD3ζ, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS ou OX40. Os CARs, em algumas modalidades, contêm um ectodomínio (por exem- plo, CD3ζ), comummente derivado de um fragmento variável de cadeia única (scFv), uma charneira, um domínio transmembranar e um endodo- mínio com um (primeira geração), dois (segunda geração) ou três domí- nios de sinalização (terceira geração) derivados de CD3Ζ e/ou molécu- las coestimuladoras (Maude et al., Blood. 2015; 125 (26): 4.017 a 4.023; Kakarla e Gottschalk, Cancer J. 2014; 20 (2): 151 a 155).

[00106] Os CARs diferem tipicamente em suas propriedades funci- onais. O domínio de sinalização CD3ζ do receptor de células T, quando envolvido, ativará e induzirá a proliferação de células T mas pode levar à anergia (uma ausência de reação pelos mecanismos de defesa do corpo, resultando em indução direta da tolerância de linfócitos periféri- cos). Os linfócitos são considerados anérgicos quando falham em res- ponder a um antígeno específico. A adição de um domínio coestimula- dor nos CARs de segunda geração melhorou a capacidade replicativa e a persistência de células T manipuladas. Efeitos antitumorais similares são observados in vitro com CARs CD28 ou 4-1BB, mas estudos pré- clínicos in vivo sugerem que os CARs 4-1BB podem produzir prolifera- ção e/ou persistência superiores. Os testes clínicos sugerem que ambos estes CARs de segunda geração têm capacidade para induzir prolifera- ção substancial de células T in vivo, mas os CARs que contêm o domí- nio coestimulador 4-1BB parecem persistir mais tempo. Os CARs de terceira geração combinam múltiplos domínios de sinalização (coesti- muladores) para aumentar a potência.

[00107] Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimé- rico é um CAR de primeira geração. Em outras modalidades, um recep- tor de antígeno quimérico é um CAR de segunda geração. Em ainda outras modalidades, um receptor de antígeno quimérico é um CAR de terceira geração.

[00108] Um CAR, em algumas modalidades, compreende um do- mínio extracelular (ecto) que compreende um domínio de ligação ao an-

tígeno (por exemplo, um anticorpo, como um scFv), um domínio trans- membranar e um domínio citoplasmático (endo). Ectodomínio

[00109] O ectodomínio é a região do CAR que é exposta ao fluido extracelular e, em algumas modalidades, inclui um domínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um peptídeo de sinal, um domínio espa- çador e/ou um domínio de charneira. Em algumas modalidades, o do- mínio de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que inclui VL e VH de imunoglobulinas conectadas a um peptídeo ligante curto. O ligante, em algumas modalidades, inclui resíduos hidro- fílicos com trechos de glicina e serina para flexibilidade bem como tre- chos de glutamato e lisina para solubilidade adicionada. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) não é realmente um fragmento de um anticorpo, mas ao invés é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e cadeia leve (VL) de imunoglobulinas, conec- tadas a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o terminal N da VH ao terminal C da VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Exemplos não limitantes de sequências de pro- teína de VH e VL que podem ser usadas para criar um scFv anti-PTK7 podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 55, 69, 76 ou 83 (VH) e SEQ ID NOs: 56, 70, 77 ou 83 (VL). Em algumas modali- dades, o scFv da presente descrição é humanizado. Em outras modali- dades, o scFv é totalmente humano. Em ainda outras modalidades, o scFv é uma quimera (por exemplo, de sequência de camundongo e hu- mana). Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-PTK7 (se liga especificamente a PTK7). Exemplos não limitantes de proteínas scFv anti-PTK7 que podem ser usadas como fornecido no presente docu- mento podem incluir a sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75, 82. Podem ser usadas outras proteínas scFv.

[00110] O peptídeo de sinal pode intensificar a especificidade do antígeno da ligação ao CAR. Os peptídeos de sinal podem ser derivados de anticorpos, tais como, mas não se limitando a, CD8, bem como mar- cadores de epítopos tais como, mas não se limitando a, GST ou FLAG. Exemplos de peptídeos de sinal incluem MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 106) e MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 93). Podem ser usados outros peptídeos de sinal.

[00111] Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou do- mínio de charneira está localizado entre um domínio extracelular (que compreende o domínio de ligação ao antígeno) e um domínio trans- membranar de um CAR ou entre um domínio citoplasmático e um domí- nio transmembranar do CAR. Um domínio espaçador é qualquer oli- gopeptídeo ou polipeptídeo que funciona para ligar o domínio trans- membranar ao domínio extracelular e/ou ao domínio citoplasmático na cadeia de polipeptídeos. Um domínio de charneira é qualquer oligopep- tídeo ou polipeptídeo que funciona para proporcionar flexibilidade ao CAR, ou seus domínios, ou para prevenir o impedimento estérico do CAR ou seus domínios. Em algumas modalidades, um domínio espaça- dor ou um domínio de charneira pode compreender até 300 aminoáci- dos (por exemplo, 10 a 100 aminoácidos ou 5 a 20 aminoácidos). Em algumas modalidades, um ou mais domínio(s) espaçador(es) pode(m) ser incluído(s) em outras regiões de um CAR. Em algumas modalida- des, o domínio de charneira é um domínio de charneira CD8. Podem ser usados outros domínios de charneira. Domínio Transmembranar

[00112] O domínio transmembranar é uma hélice alfa hidrofóbica que abrange a membrana. O domínio transmembranar proporciona es- tabilidade do CAR. Em algumas modalidades, o domínio transmembra- nar de um CAR como fornecido no presente documento é um domínio transmembranar CD8. Em outras modalidades, o domínio transmem- branar é um domínio transmembranar CD28. Ainda em outras modali- dades, o domínio transmembranar é uma quimera de um domínio trans- membranar CD8 e CD28. Outros domínios transmembranares podem ser utilizados como aqui fornecido. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8a:

FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR (SEQ ID NO: 107). Podem ser usados outros domínios transmembranares. Endodomínio

[00113] O endodomínio é a extremidade funcional do receptor. Após reconhecimento do antígeno, os receptores se agrupam e um sinal é transmitido para a célula. O componente de endodomínio mais co- mummente usado é CD3-zeta, que contém três (3) motivos de ativação à base de imunorreceptor de tirosina (ITAM). Isto transmite um sinal de ativação para a célula T após o antígeno estar ligado. Em muitos casos, CD3-zeta pode não proporcionar um sinal de ativação totalmente com- petente e, assim, é usada uma sinalização coestimuladora. Por exem- plo, CD28 e/ou 4-1BB podem ser usados com CD3-zeta (CD3ζ) para transmitir um sinal proliferativo/de sobrevivência. Portanto, em algumas modalidades, a molécula coestimuladora de um CAR como fornecido no presente documento é uma molécula coestimuladora CD28. Em outras modalidades, a molécula coestimuladora é uma molécula coestimula- dora 4-1BB. Em algumas modalidades, um CAR inclui CD3ζ e CD28. Em outras modalidades, um CAR inclui CD3-zeta e 4-1BB. Ainda em outras modalidades, um CAR inclui CD3ζ, CD28 e 4-1BB. A Tabela 5 fornece exemplos de moléculas de sinalização que podem ser usadas como fornecido no presente documento. Tabela 5 Nome Sequência SEQ ID NO: 43 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAAC-

TACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG 4-1BB 44

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 45 TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGG-

CCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCC CD28 46

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 47 CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTA-

TAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGG GTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGA-

TGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGG CD3-zeta TTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA 48 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN-

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Anticorpos

[00114] Um anticorpo (indistintamente usado na forma plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., atra- vés de pelo menos um local de reconhecimento do antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo “anticorpo” engloba não só anticorpos monoclonais intactos (isto é, de comprimento total), mas também fragmentos de ligação ao antí- geno (tais como Fab, Fab´, F(ab´)2, Fv), fragmento variável de cadeia única (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão que compreende uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos VHH de camelo ou lhama), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento do antígeno da especifi-

cidade requerida, que inclui variantes de glicosilação de anticorpos, va- riantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos cova- lentemente modificados.

[00115] Uma molécula de anticorpo típica compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que estão usualmente envolvidas na ligação ao antígeno. Estas regiões/resíduos que são responsáveis pela ligação ao antígeno podem ser identificadas a partir de sequências de aminoácidos das sequências de VH/VL de um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo anti-PTK7 como descrito no presente documento) por métodos conhe- cidos na técnica. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdi- vididas em regiões de hipervariabilidade, também conhecidas como “re- giões determinantes da complementaridade” (“CDR”), intercaladas com regiões que são mais conservadas, que são conhecidas como “regiões estruturais” (“FR”). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A extensão da re- gião estrutural e CDRs pode ser precisamente identificada usando me- todologia conhecida na técnica, por exemplo, pela definição de Kabat, pela definição de Chothia, pela definição de AbM e/ou pela definição de contato, todas as quais são bem conhecidas na técnica. Como usado aqui, uma CDR pode se referir à CDR definida por qualquer método co- nhecido na técnica. Dois anticorpos que têm a mesma CDR significa que os dois anticorpos têm a mesma sequência de aminoácidos dessa CDR como determinado pelo mesmo método. Consulte, por exemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91 a 3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901 a 917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927 a 948; and Almagro, J. Mol. Recognit. 17:

132 a 143 (2004). Ver também hgmp.mrc.ac.uk e bioinf.org.uk/abs.

[00116] Em algumas modalidades, o anticorpo é um scFv, como um scFv anti-PTK7. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgD, IgE, IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não necessita de ser de qualquer classe particular. Dependendo da sequên- cia de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclas- ses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tri- dimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhe- cidas.

[00117] Os anticorpos a serem usados como fornecido no presente documento podem ser murinos, de rato, humanos ou qualquer outra ori- gem (que inclui anticorpos quiméricos ou humanizados). Em alguns exemplos, o anticorpo compreende uma região constante modificada, como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exem- plo, não desencadeia a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[00118] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente des- crição é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados se re- ferem a formas não humanas (por exemplo, murinas) que são imuno- globulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que contêm sequência mínima deri- vada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos hu- manizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) nos quais os resíduos de uma região determinante da complementaridade

(CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) de Fv da imu- noglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos corres- pondentes. Ademais, o anticorpo humanizado pode compreender resí- duos que não são encontrados nem no anticorpo destinatário nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglo- bulina humana. Um anticorpo humanizado compreenderá também oti- mamente pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina hu- mana. Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original. Os anticorpos humanizados podem também envolver maturação de afi- nidade.

[00119] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente des- crição é um anticorpo quimérico, que pode incluir uma região constante pesada e uma região constante leve de um anticorpo humano. Os anti- corpos quiméricos se referem a anticorpos que tem uma região variável ou parte da região variável de uma primeira espécie e uma região cons- tante de uma segunda espécie. Tipicamente, em estes anticorpos qui- méricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada mimetiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamí- fero (por exemplo, um mamífero não humano como camundongo, coe- lho e rato), enquanto as porções constantes são homólogas às sequên- cias em anticorpos derivados de outro mamífero como humano. Em al- gumas modalidades, modificações de aminoácidos podem ser feitas na região variável e/ou na região constante.

[00120] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente des- crição se liga especificamente a um antígeno alvo, como PTK7 humano. Um anticorpo que “se liga especificamente” (usado indistintamente aqui) a um alvo ou epítopo é um termo bem entendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica são também bem conhecidos na técnica. Se diz que uma molécula exibe “ligação específica” se reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior dura- ção e/ou com maior afinidade com um antígeno alvo particular do que com alvos alternativos. Um anticorpo “se liga especificamente“ a um an- tígeno alvo se se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exem- plo, um anticorpo que se liga especificamente (ou preferencialmente) a um epítopo de PTK7 é um anticorpo que se liga a este epítopo de PTK7 com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos de PTK7 ou epítopos diferentes de PTK7. É também entendido pela leitura desta definição que, por exem- plo, um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno alvo pode ou não pode se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo antígeno alvo. Como tal, “ligação específica” ou “ligação preferencial” não requer necessariamente (embora possa incluir) liga- ção exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação preferencial.

[00121] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (KD) entre o anticorpo e PTK7 é 100 pM a 1 µM. Em algumas modalidades, o KD entre o anticorpo e PTK7 é 1 nM a 100 nM.

[00122] Também dentro do escopo da presente descrição estão as variantes funcionais de qualquer um dos anticorpos exemplificativos, conforme descrito no presente documento. Uma variante funcional pode conter uma ou mais variações de resíduo de aminoácido em VH e/ou VL, ou em uma ou mais das CDRs de VH e/ou uma ou mais das CDRs de VL em relação a um anticorpo de referência, embora retendo subs- tancialmente semelhante ligação e atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação, especificidade de ligação, atividade inibidora, ati- vidade antitumoral substancialmente semelhantes ou uma combinação das mesmas) como o anticorpo de referência.

[00123] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui descrito compre- ende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação à CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo de referência, como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56). “Coletivamente” significa que o número total de variações de aminoácidos em todas as três CDRs de VH está dentro da gama definida. Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode com- preender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) em comparação à CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL do anticorpo de referência.

[00124] Em alguns exemplos, um anticorpo aqui descrito pode com- preender uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de ami- noácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de ami-

noácidos) como a contraparte CDR de VH de um anticorpo de referên- cia, como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56). Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VH, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VH de um anticorpo de referência, como o Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56). Adicional ou alternativamente, um anticorpo pode compreender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VL do anticorpo de referên- cia. Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VL, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VL do anticorpo de referência.

[00125] Em alguns casos, as variações de resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservativas de resíduos de aminoácidos. Como usado aqui, uma “substituição conservativa de aminoácidos” se refere a uma substituição de aminoácidos que não altera a carga relativa ou as características de tamanho da proteína na qual a substituição de aminoácidos é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência polipeptídica conhecida por um perito na técnica, tais como são encontradas em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. As substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre os aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) A  G, S; (b) R  K, H; (c) N  Q, H; (d) D  E, N; (e) C  S, A;

(f) Q  N; (g) E  D, Q; (h) G  A; (i) H  N, Q; (j) I  L, V; (k) L  I, V; (l) K  R, H; (m) M L, I, Y; (n) F  Y, M, L; (o) P  A; (p) S  T; (q) T S; (r) W  Y, F; (s) Y  W, F; e (t) V I, L.

[00126] Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no pre- sente documento pode compreender CDRs de VH que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VH de um anticorpo de referência como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56). Adicional ou alternativamente, o anticorpo pode compreender CDRs de VL que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VL do anticorpo de referência. Em algumas modalidades, um anti- corpo pode compreender um VH que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntico ao VH de um anticorpo de referência como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 55; VL: SEQ ID NO: 56) e/ou um VL que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idên- tico ao VL do anticorpo de referência. Modelo Doador

[00127] O ácido nucleico que codifica um CAR pode ser entregue a uma célula T que compreende o que é referido no presente documento como um modelo doador (também referido como um polinucleotídeo do- ador). Um modelo doador pode conter uma sequência não homóloga, como o ácido nucleico que codifica um CAR, flanqueada por duas regi- ões de homologia para permitir HDR eficiente em uma localização ge- nômica de interesse. Em algumas modalidades, a região de homologia pode compreender uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 92 ou 100. Em algumas modalidades, a sequência não homóloga é flan- queada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 92 e uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 100. Alternativamente, um modelo doador pode não ter regiões de homologia com a localização alvejada no DNA e pode ser integrado por união de extremidade depen- dente de NHEJ após clivagem no sítio alvo.

[00128] Um modelo doador pode ser DNA ou RNA, de filamento único e/ou filamento duplo, e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Se introduzido na forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da degrada- ção exonucleolítica) por métodos conhecidos por aqueles indivíduos versados na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinu- cleotídeo são adicionados ao terminal 3’ de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma das ou am- bas as extremidades. Consulte, por exemplo, Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84: 4.959 a 4.963; Nehls et al., (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicionais para proteção de polinucleotídeos exóge- nos da degradação incluem, mas não estão limitados a, adição de grupo(s) amino terminal(ais) e o uso de ligações internucleotídeos mo- dificadas tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e resí- duos de ribose de O-metila ou desoxirribose.

[00129] Um modelo doador pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor que tem sequências adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que codifica resistência a antibióticos. Além disso, um modelo doador pode ser introduzido como ácido nucleico nu, como ácido nucleico comple- xado com um agente como um lipossomo ou poloxâmero, ou pode ser entregue por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesvírus, retroví- rus, lentivírus e lentivírus defeituoso em integrase (IDLV)).

[00130] Um modelo doador, em algumas modalidades, é inserido tal que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no local de integração, nomeadamente o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o doador é inserido. No entanto, em algumas modalidades, o modelo doador compreende um promotor e/ou intensifi- cador exógenos, por exemplo um promotor constitutivo, um promotor indutível ou promotor específico de tecido. Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor de EF1α que compreende uma se- quência de SEQ ID NO: 101. Podem ser usados outros promotores.

[00131] Ademais, as sequências exógenas podem também incluir sequências reguladoras transcricionais ou translacionais, por exemplo, promotores, intensificadores, isoladores, locais internos de entrada de ribossomos, sequências que codifica peptídeos 2A e/ou sinais de polia- denilação.

[00132] Em algumas modalidades, o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91. Métodos e Construtos de Entrega

[00133] Nucleases e/ou modelos doadores podem ser entregues usando um sistema de vetor, que inclui, mas não se limitando a, vetores de plasmídeo, minicírculos de DNA, vetores retrovirais, vetores lentivi- rais, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus; vetores de herpesvírus e vetores de vírus adenoassociados e suas combinações.

[00134] Métodos convencionais de transferência de genes basea- dos em vírus e não virais podem ser usados para introduzir ácidos nu- cleicos que codifica nucleases e modelos doadores em células (por exemplo, células T). Os sistemas de entrega de vetor não viral incluem plasmídeos de DNA, minicírculos de DNA, ácido nucleico nu e ácido nucleico complexado com um veículo de entrega, como um lipossomo ou poloxâmero. Os sistemas de entrega de vetor viral incluem vírus de DNA e RNA, que possuem genomas epissomais ou integrados após a entrega à célula.

[00135] Os métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos in-

cluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, li- possomas, imunolipossomas, policação ou conjugados lipídeo:ácido nu- cleico, DNA nu, RNA nu, RNA coberto, vírions artificiais e absorção in- tensificada por agente do DNA. Sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) pode ser também usada para entrega de ácidos nucleicos. Entrega Viral Adenoassociada

[00136] O ácido nucleico doador que codifica um construto de CAR pode ser entregue a uma célula usando um vírus adenoassociado (AAV). Os AAVs são pequenos vírus que se integram especificamente por sítio no genoma do hospedeiro e podem, portanto, entregar um transgene, como CAR. Repetições terminais invertidas (ITRs) estão pre- sentes flanqueando o genoma de AAV e/ou o transgene de interesse e servem como origens de replicação. Estão também presentes no ge- noma de AAV proteínas rep e cap que, quando transcritas, formam cap- sídeos que encapsulam o genoma de AAV para entrega em células alvo. Receptores de superfície em estes capsídeos que conferem o serotipo de AAV, que determina a que órgãos alvo os capsídeos se ligarão prin- cipalmente e assim que células o AAV infetará mais eficientemente. Existem doze serotipos de AAV humanos correntemente conhecidos. Em algumas modalidades, o AAV é serotipo 6 de AAV (AAV6).

[00137] Os vírus adenoassociados estão entre os vírus o mais fre- quentemente usados para terapia gênica por várias razões. Em primeiro lugar, os AAVs não provocam uma resposta imunológica após adminis- tração a mamíferos, que inclui humanos. Em segundo lugar, os AAVs são efetivamente entregues às células alvo, particularmente quando é dada consideração à seleção do serotipo de AAV apropriado. Final- mente, os AAVs têm a capacidade de infetar células tanto em divisão como não em divisão porque o genoma pode persistir na célula hospe-

deira sem integração. Este traço os torna um candidato ideal para tera- pia gênica. Reparação Dirigida por Homologia (HDR)

[00138] O ácido nucleico doador que codifica um CAR é inserido por reparo dirigido por homologia (HDR) no lócus do gene alvo. Ambas as cadeias do DNA no lócus alvo são cortadas por uma enzima CRISPR Cas9. HDR ocorre então para reparar a quebra de filamento duplo (DSB) e inserir o DNA doador. Para que isto ocorra corretamente, a se- quência doadora é desenhada com resíduos de flanqueamento que são complementares à sequência rodeando o local de DSB no gene alvo (doravante “braços de homologia”). Estes braços de homologia servem como o modelo paro reparo de DSB e permitem que HDR seja um me- canismo essencialmente isento de erros. A taxa de reparo dirigido por homologia (HDR) é uma função da distância entre a mutação e o local de corte, logo é importante escolher locais alvo sobrepostos ou próxi- mos. Os modelos podem incluir sequências extras flanqueadas pelas regiões homólogas ou podem conter uma sequência que difere da se- quência genômica, permitindo assim a edição da sequência.

[00139] O gene alvo pode ser associado a uma resposta imunoló- gica em um indivíduo, em que a deleção permanente de pelo menos uma porção do gene alvo modulará a resposta imunológica. Por exem- plo, para gerar uma célula T de CAR, o gene alvo pode ser a região constante de TCRα (TRAC). A interrupção de TRAC leva à perda da função do TCR endógeno.

[00140] Em algumas modalidades, o gene alvo está em um lócus de porto seguro. Células T manipuladas

[00141] As células T de CAR manipuladas (com edição gênica) da presente descrição podem ser autólogas (“próprias”) ou não autólogas (“não próprias”, por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas).

“Autólogo“ se refere a células do mesmo indivíduo. “Alogênico“ se refere a células da mesma espécie que um indivíduo, mas que diferem gene- ticamente das células do indivíduo. Em algumas modalidades, as célu- las T são obtidas de um indivíduo mamífero. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um indivíduo humano.

[00142] As células T podem ser obtidas de um número de fontes que inclui, mas não se limitando a, células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodos, sangue do cordão umbi- lical, tecido do timo, tecido de um local de infeção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em determinadas modalidades, as células T podem ser obtidas de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas do perito, como sedimentação, por exemplo, separação com FICOLL™.

[00143] Em algumas modalidades é usada uma população isolada de células T. Em algumas modalidades, após isolamento das células mononucleares do sangue periférico (PBMC), os linfócitos T tanto cito- tóxicos como auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T virgem, de memória e efetoras antes da ou após ativação, ex- pansão e/ou modificação genética.

[00144] Uma subpopulação específica de células T, que expressam um ou mais dos seguintes marcadores de superfície celular: TCRab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, proteínas MCH-I e/ou proteínas MCH-II, pode ser adicionalmente isolada por técnicas de se- leção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, uma subpopula- ção específica de células T, que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo consistindo em TCRab, CD4 e/ou CD8, é adici- onalmente isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em al- gumas modalidades, as populações de células T manipuladas não ex-

pressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos seguin- tes marcadores: CD70, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, HΜ3 e LAG3. Em algumas modalidades, as subpopulações de células T podem ser isoladas por seleção positiva ou negativa antes da manipulação ge- nética e/ou pós-manipulação genética.

[00145] Em algumas modalidades, uma população isolada de célu- las T expressa um ou mais dos marcadores que inclui, mas não se limi- tando a, um CD3+, CD4+, CD8+ ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, as células T são isoladas de um indivíduo e primeiramente ativadas e estimuladas para proliferarem in vitro antes de serem subme- tidas a edição gênica.

[00146] Para alcançar doses terapêuticas suficientes de composi- ções de células T, as células T são frequentemente sujeitas a uma ou mais rondas de estimulação, ativação e/ou expansão. As células T po- dem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos conforme descrito, por exemplo, nas Patentes sob no U.S.6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; e 6,867,041. Em algumas modalidades, as células T são ati- vadas e expandidas por cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, cerca de 1 dia a cerca de 3 dias, cerca de 1 dia a cerca de 2 dias, cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, cerca de 2 dias a cerca de 4 dias , cerca de 3 dias a cerca de 4 dias, ou cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias ou cerca de 4 dias antes da introdução das composições de edição de ge- noma nas células T.

[00147] Em algumas modalidades, as células T são ativadas e ex- pandidas durante cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas antes da introdução das composições de edição gênica nas células T.

[00148] Em algumas modalidades, as células T são ativadas ao mesmo tempo que as composições de edição do genoma são introdu- zidas nas células T.

[00149] Também são fornecidas populações de células T manipu- ladas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, pelo menos 25% a 100% das células T manipuladas da população expres- sam o CAR. Em algumas modalidades, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR. Em algumas modalidades, pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressam o CAR. Em algumas modalidades, pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro. Métodos de Tratamento e Composições

[00150] São fornecidos no presente documento, em algumas mo- dalidades, métodos para o tratamento de câncer (por exemplo: tumores sólidos). Exemplos não limitativos de tumores sólidos que podem ser tratados conforme fornecido no presente documento incluem: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer uterino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, cân- cer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles e/ou melanoma. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, cân- cer uterino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, cân- cer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos mo- les, leucemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangio- carcinoma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de cé- lula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado,

adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar in- tra-hepático. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a entrega de células T de CAR (por exemplo, células T de CAR anti-Ptk7) da presente descrição a um indivíduo com câncer (por exemplo, tumo- res sólidos), que inclui câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer cervical , câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer de nasofaringe, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), glioblastoma e/ou melanoma. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a entrega de células T de CAR (por exemplo, células T de CAR anti-PTK7) da presente des- crição a um indivíduo com leucemia ou linfoma, por exemplo, leucemia ou linfomas de células T, células B, células NK, células dendríticas. Exemplos não limitativos de leucemias incluem leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crô- nica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

[00151] A etapa de administrar pode incluir a colocação (por exem- plo, transplante) de células, por exemplo, células T manipuladas, em um indivíduo, por um método ou rota que resulta na localização pelo menos parcial das células introduzidas em um local desejado, como tumor, de modo que o efeito (ou efeitos) desejado seja produzido. As células T manipuladas podem ser administradas por qualquer via apropriada que resulte na entrega em uma localização desejada no indivíduo onde pelo menos uma porção das células implantadas ou componentes das célu- las permanece viáveis. O período de viabilidade das células após admi- nistração a um indivíduo pode ser tão curto quanto algumas horas, por exemplo, vinte e quatro horas, a alguns dias, até tão longo quanto vários anos, ou mesmo o tempo de vida do indivíduo, isto é, enxerto de longo prazo. Por exemplo, em alguns aspectos descritos no presente docu- mento, uma quantidade eficaz de células T manipuladas é administrada através uma via de administração sistémica, como uma via intraperito- neal ou intravenosa.

[00152] Um indivíduo pode ser qualquer indivíduo para o qual diag- nóstico, tratamento ou terapia é desejado. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.

[00153] Um doador é um indivíduo que não é o indivíduo a ser tra- tado. Um doador é um indivíduo que não é o paciente. Em algumas mo- dalidades, um doador é um indivíduo que não tem ou não é suspeito de ter o câncer a ser tratado. Em algumas modalidades são usados múlti- plos doadores, por exemplo, dois ou mais doadores.

[00154] Em algumas modalidades, a população de células T mani- puladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos no presente documento compreende células T alogênicas obtidas de um ou mais doadores. "Alogênico" se refere a uma célula, população celular ou amostras biológicas que compreende células, obtidas de um ou mais doadores diferentes da mesma espécie, onde os genes em um ou mais loci não são idênticos ao receptor. Por exemplo, uma população de cé- lulas T manipuladas, sendo administrada a um indivíduo, pode ser deri- vada de um ou mais doadores não relacionados ou de um ou mais ir- mãos não idênticos. Em algumas modalidades podem ser usadas po- pulações de células singênicas, tais como aquelas obtidas de doadores geneticamente idênticos (por exemplo, gêmeos idênticos). Em algumas modalidades, as células são células autólogas; isto é, as células T ma- nipuladas são obtidas ou isoladas a partir de um indivíduo e administra- das ao mesmo indivíduo, isto é, o doador e o destinatário são os mes- mos.

[00155] Em algumas modalidades, uma população de células T ma- nipuladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos no presente documento não induz toxicidade no indivíduo, por exemplo, as células T manipuladas não induzem toxicidade em células não cancero- sas. Em algumas modalidades, uma população de células T manipula- das sendo administrada não desencadeia a lise mediada por comple- mento ou não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[00156] Uma quantidade eficaz se refere à quantidade de uma po- pulação de células T manipuladas necessária para prevenir ou aliviar pelo menos um ou mais sinais ou sintomas de uma condição médica (por exemplo, câncer) e se relaciona com uma quantidade suficiente de uma composição para proporcionar o desejado efeito, por exemplo, para tratar um indivíduo que tem uma condição médica. Uma quantidade efi- caz inclui também uma quantidade suficiente para prevenir ou retardar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o decurso de um sintoma da doença (por exemplo, mas não se limitando a, desacelerar a progressão de um sintoma da doença) ou reverter um sintoma da do- ença. É entendido que, para qualquer dado caso, uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada por um perito na técnica usando ex- perimentação de rotina.

[00157] Para uso nos vários aspectos descritos no presente docu- mento, uma quantidade eficaz de células (por exemplo, células T mani- puladas) compreende pelo menos 102 células, pelo menos 5 X 102 cé- lulas, pelo menos 103 células, pelo menos 5 X 103 células, pelo menos 104 células, pelo menos 5 X 104 células, pelo menos 105 células, pelo menos 2 X 105 células, pelo menos 3 X 105 células, pelo menos 4 X 105 células, pelo menos 5 X 105 células, pelo menos 6 X 105 células, pelo menos 7 X 105 células, pelo menos 8 X 105 células, pelo menos 9 X 105 células, pelo menos 1 X 106 células, pelo menos 2 X 106 células, pelo menos 3 X 106 células, pelo menos 4 X 106 células, pelo menos 5 X 106 células, pelo menos 6 X 106 células, pelo menos 7 X 106 células, pelo menos 8 X 106 células, pelo menos 9 X 106 células ou seus múltiplos.

As células são derivadas de um ou mais doadores ou são obtidas de uma fonte autóloga. Em alguns exemplos descritos no presente docu- mento, as células são expandidas em cultura antes da administração a um indivíduo com sua necessidade.

[00158] Os modos de administração incluem injeção, infusão, insti- lação ou ingestão. Injeção inclui, sem limitação, injeção e infusão intra- venosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intraventriculares, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intraperito- neais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, intracerebroespinhais e intraesternais. Em algumas modalidades, a via é intravenosa.

[00159] Em algumas modalidades, as células T manipuladas são administradas sistemicamente, o que se refere à administração de uma população de células sem ser diretamente em um local, tecido ou órgão alvo, tal que entrem, ao invés, no sistema circulatório do indivíduo e, assim, sejam sujeitas ao metabolismo e outros processos similares.

[00160] A eficácia de um tratamento que compreende uma compo- sição para o tratamento de uma condição médica pode ser determinada pelo médico perito. Um tratamento é considerado “tratamento eficaz“ se qualquer um dos ou todos os sinais ou sintomas de, como um exemplo, níveis de alvo funcional forem alterados de uma maneira benéfica (por exemplo, aumentado em pelo menos 10%) ou outros sintomas clinica- mente aceitos ou marcadores da doença (por exemplo, câncer) forem melhorados ou aliviados. A eficácia pode ser também medida pela falha de um indivíduo em piorar como avaliado por hospitalização ou neces- sidade de intervenções médicas (por exemplo, a progressão da doença é interrompida ou pelo menos desacelerada). Os métodos de medição destes indicadores são conhecidos por aqueles indivíduos versados na técnica e/ou descritos no presente documento. O tratamento inclui qual- quer tratamento de uma doença no indivíduo e inclui: (1) inibir a doença,

por exemplo, parar, ou desacelerar a progressão dos sintomas; ou (2) atenuar a doença, por exemplo, causar a regressão dos sintomas; e (3) prevenir ou reduzir a probabilidade do desenvolvimento de sintomas.

[00161] A presente descrição é exemplificada pelas seguintes mo- dalidades:

[00162] Modalidade 1. Uma célula T manipulada que compre- ende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especi- ficamente a PTK7.

[00163] Modalidade 2. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 1, que compreende adicionalmente um gene da região constante alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

[00164] Modalidade 3. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 2, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC.

[00165] Modalidade 4. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, que compreende adicionalmente um gene da beta-2-microglobulina (β2M) interrompido.

[00166] Modalidade 5. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo anti-PTK7.

[00167] Modalidade 6. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 5, em que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7.

[00168] Modalidade 7. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 6, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas regi- ões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de ca- deia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 84.

[00169] Modalidade 8. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 7, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas ca- deias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00170] Modalidade 9. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 7, em que o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

[00171] Modalidade 10. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o CAR compreende adi- cionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimu- lador 41BB.

[00172] Modalidade 11. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade 10, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3ζ.

[00173] Modalidade 12. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 11, em que o gene TRAC interrom- pido compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o LHA e/ou RHA dentro de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91, ou a sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 92 ou 100 e/ou em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

[00174] Modalidade 13. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 4 a 12, em que o gene β2M interrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer um das SEQ ID NOs: 9 a 14.

[00175] Modalidade 14. Uma população da célula T manipulada,

conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da po- pulação expressam o CAR.

[00176] Modalidade 15. A população, de acordo com a modali- dade 14, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da popu- lação expressam o CAR.

[00177] Modalidade 16. A população, de acordo com a modali- dade 14 ou 15, em que pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[00178] Modalidade 17. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 16, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TCR).

[00179] Modalidade 18. A população, de acordo com a modali- dade 17, em que pelo menos 90% das células T manipuladas da popu- lação não expressam um nível detectável de proteína de TCR.

[00180] Modalidade 19. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 18, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína β2M.

[00181] Modalidade 20. A população, de acordo com a modali- dade 19, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da popu- lação não expressam um nível detectável de proteína β2M.

[00182] Modalidade 21. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 20, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população.

[00183] Modalidade 22. A população, de acordo com a modali- dade 21, em que as células T manipuladas da população, quando co- cultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que ex- pressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

[00184] Modalidade 23. A população, de acordo com a modali- dade 21 ou 22, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secre- tam IFNγ.

[00185] Modalidade 24. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 21 a 23, em que a razão entre células T manipu- ladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

[00186] Modalidade 25. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 21 a 24, em de que as células cancerosas com- preendem células de sarcoma.

[00187] Modalidade 26. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 21 a 24, em que as células cancerosas compre- endem células de câncer de mama, células de câncer de ovário, células de câncer pulmonar de células pequenas e/ou células de câncer de có- lon.

[00188] Modalidade 28. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 27, em que quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

[00189] Modalidade 29. Um método que compreende a adminis- tração da população de células T manipuladas de qualquer uma das modalidades 14 a 28 a um indivíduo.

[00190] Modalidade 30. O método, de acordo com a modalidade 29, em que o indivíduo é um indivíduo humano.

[00191] Modalidade 31. O método, de acordo com a modalidade 30, em que o indivíduo tem um câncer.

[00192] Modalidade 32. O método, de acordo com a reivindica- ção 31, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leu- cemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

[00193] Modalidade 33. O método, de acordo a modalidade 31 ou 32, em que o câncer compreende células cancerosas que expressam PTK7.

[00194] Modalidade 34. Um método para produzir uma célula T manipulada, em que o método compreende (a) entregar a uma célula T uma nuclease guiada por RNA, um gRNA que alveja um gene TRAC e um vetor que compreende um modelo de doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a PTK7; e (b) produzir uma célula T modifi- cada com um gene TRAC interrompido e que expressam o CAR.

[00195] Modalidade 35. O método, de acordo com a modalidade 34, em que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 40.

[00196] Modalidade 36. O método, de acordo com a modalidade 34 ou 35 em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito para o gene TRAC.

[00197] Modalidade 37. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 34 a 36, que compreende adicionalmente entregar à célula T de um gRNA que alveja o gene β2M.

[00198] Modalidade 38. O método, de acordo com a modalidade 37, em que o gRNA que alveja o gene β2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nucle- otídeos de SEQ ID NO: 41.

[00199] Modalidade 39. O método de qualquer uma das modali- dades 34-38, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

[00200] Modalidade 40. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 34 a 39, em que o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-PTK7.

[00201] Modalidade 41. O método, de acordo com a modalidade 40, em que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7.

[00202] Modalidade 42. O método, de acordo com a modalidade 41, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas regiões determi- nantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabe- lecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL estabele- cido como SEQ ID NO: 84.

[00203] Modalidade 43. O método, de acordo com a modalidade 42, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00204] Modalidade 44. O método, de acordo com a modalidade 42, em que o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

[00205] Modalidade 45. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 34 a 44, em que o CAR compreende um domínio co- estimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00206] Modalidade 46. O método, de acordo com a modalidade 45, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinaliza- ção citoplasmática CD3ζ.

[00207] Modalidade 47. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 34 a 46, em que o modelo doador compreende a se- quência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91.

[00208] Modalidade 48. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 34 a 47, em que o CAR é codificado por uma sequên- cia de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

[00209] A presente descrição é exemplificada adicionalmente pelas seguintes modalidades:

[00210] Modalidade A1. Uma célula T manipulada que compre- ende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especi- ficamente a PTK7.

[00211] Modalidade A2. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A1, que compreende adicionalmente um gene da região constante alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

[00212] Modalidade A3. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A1 ou A2, que compreende adicionalmente um gene beta- 2-microglobulina (β2M) interrompido.

[00213] Modalidade A4. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A3, em que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo anti-PTK7.

[00214] Modalidade A5. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A4, em que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7.

[00215] Modalidade A6. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A5, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas re- giões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de ca- deia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 84.

[00216] Modalidade A7. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A6, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas ca- deias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00217] Modalidade A8. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A6, em que o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

[00218] Modalidade A9. A célula T manipulada de qualquer uma das modalidades A1 a A8, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00219] Modalidade A10. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A9, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3ζ.

[00220] Modalidade A11. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidade A1 a A10, em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 ou uma sequência de nucleotídeos que compre- ende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idên- tica às SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

[00221] Modalidade A12. A célula T modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A11, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC interrompido.

[00222] Modalidade A13. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações A2 a A12, em que o gene TRAC inter- rompido compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o LHA e/ou RHA dentro de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91, a sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 92 ou 100 e/ou a se- quência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91.

[00223] Modalidade A14. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A13, em que o gene β2M interrom- pido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir de qualquer um das SEQ ID NOs: 9 a 14.

[00224] Modalidade A15. Uma célula T manipulada que compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido;(ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um frag- mento de ligação ao antígeno anti-PTK7.

[00225] Modalidade A16. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A15, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização citoplas- mático CD3ζ.

[00226] Modalidade A17. A célula T manipulada, de acordo com a modalidade A15 ou A16, em que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

[00227] Modalidade A18. Uma célula T manipulada que compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compre- ende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um en- dodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um do- mínio de sinalização citoplasmática CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrom- pido.

[00228] Modalidade A19. Uma célula T manipulada que compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compre- ende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00229] Modalidade A20. Uma célula T manipulada que compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 e codifica um CAR que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00230] Modalidade A21. A célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades A1 a A20, em que a célula T é uma célula T humana.

[00231] Modalidade A22. Uma população de células que as com- preendem células T manipuladas, de qualquer uma das modalidades A1 a A21, em que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T ma- nipuladas da população expressam o CAR.

[00232] Modalidade A23. A população, de acordo com a modali- dade A22, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da po- pulação expressam o CAR.

[00233] Modalidade A24. A população, de acordo com a modali- dade A22, em que pelo menos 25% das células T manipuladas da po- pulação expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[00234] Modalidade A25. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A24, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TCR).

[00235] Modalidade A26. A população, de acordo com a modali- dade A25, em que pelo menos 90% das células T manipuladas da po- pulação não expressam um nível detectável de proteína TCR.

[00236] Modalidade A27. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A26, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína β2M.

[00237] Modalidade A28. A população, de acordo com a modali- dade A27, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da po- pulação não expressam um nível detectável de proteína β2M.

[00238] Modalidade A29. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A28, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população.

[00239] Modalidade A30. A população, de acordo com a modali- dade A29, em que as células T manipuladas da população, quando co-

cultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que ex- pressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

[00240] Modalidade A31. A população, de acordo com a modali- dade A29 ou A30, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNγ.

[00241] Modalidade A32. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A29 a A31, em que a razão entre células T mani- puladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

[00242] Modalidade A33. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A29 a A32, em de que as células cancerosas compreendem células de sarcoma.

[00243] Modalidade A34. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A29 a A32, em que as células cancerosas com- preendem células de câncer de mama, células de câncer de ovário, cé- lulas de câncer pulmonar de células pequenas e/ou células de câncer de cólon.

[00244] Modalidade A35. A população, de acordo com qualquer uma das modalidades A22 a A34, em que quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

[00245] Modalidade A36. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas compre- endem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrom- pido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7.

[00246] Modalidade A37. A população de células, de acordo com a modalidade A36, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um domínio coestimulador CD3ζ.

[00247] Modalidade A38. A população de células, de acordo com a modalidade A36 ou A37, em que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

[00248] Modalidade A39. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas compre- endem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que com- preende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização citoplasmática CD3ζ; e (ii) um gene β2M inter- rompido.

[00249] Modalidade A40. Uma população de células que compre- ende células T manipuladas, em que as células T manipuladas compre- endem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 e codifica o CAR de SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

[00250] Modalidade A41. Um método que compreende a adminis- tração da população de células T manipuladas de qualquer uma das modalidades A22 a A40 a um indivíduo.

[00251] Modalidade A42. O método, de acordo com a modalidade A41, em que o indivíduo é um indivíduo humano.

[00252] Modalidade A43. O método, de acordo com a modalidade A42, em que o indivíduo tem um câncer.

[00253] Modalidade A44. O método, de acordo com a reivindica- ção A43, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leu- cemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

[00254] Modalidade A45. O método, de acordo com a modalidade A43 ou A44, em que o câncer compreende células cancerosas que ex- pressam PTK7.

[00255] Modalidade A46. Um método para produzir uma célula T manipulada, em que o método compreende (a) entregar a uma célula T (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA que alveja um gene TRAC e (iii) um vetor que compreende um modelo de doador que com- preende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a PTK7; e (b) produzir uma célula T modificada com um gene TRAC interrompido e que expressam o CAR.

[00256] Modalidade A47. O método, de acordo com a modalidade A46, em que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 40.

[00257] Modalidade A48. O método, de acordo com a modalidade A46 ou A47, que compreende adicionalmente a entrega à célula T de um gRNA que alveja o gene β2M.

[00258] Modalidade A49. O método, de acordo com a modalidade

A48, em que o gRNA que alveja o gene β2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[00259] Modalidade A50. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A49, em que o ectodomínio do CAR compre- ende um anticorpo anti-PTK7.

[00260] Modalidade A51. O método, de acordo com a modalidade A50, em que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7.

[00261] Modalidade A52. O método, de acordo com a modalidade A51, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas regiões deter- minantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabe- lecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL estabele- cido como SEQ ID NO: 84.

[00262] Modalidade A53. O método, de acordo com a modalidade A52, em que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

[00263] Modalidade A54. O método, de acordo com a modalidade A52, em que o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de aminoáci- dos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

[00264] Modalidade A55. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A54, em que o CAR compreende adicional- mente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

[00265] Modalidade A56. O método, de acordo com a modalidade A55, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinali- zação citoplasmática CD3ζ.

[00266] Modalidade A57. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A56, em que o CAR é codificado por uma se- quência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 ou uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

[00267] Modalidade A58. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A57, em que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito do gene TRAC.

[00268] Modalidade A59. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A58, em que o modelo doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91.

[00269] Modalidade A60. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades A46 a A59, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

[00270] Modalidade A61. Uma célula T manipulada produzida pelo método de qualquer uma das modalidades A46 a A60.

[00271] Modalidade A62. Uma população de células que compre- ende a célula T manipulada da modalidade A61.

[00272] Modalidade A63. Um método para tratar o câncer em um indivíduo, em que compreende a administração ao indivíduo da popula- ção de células de qualquer uma das modalidades A22 a A40 ou A62.

[00273] Modalidade A64. O método, de acordo com a reivindica- ção A63, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leu- cemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

[00274] Modalidade A65. O método, de acordo com as modalida- des A63 ou A64, em que o câncer compreende células cancerosas que expressam PTK7.

EXEMPLOS Exemplo 1. Expressão de PTK7 em Tecidos Humanos Normais

[00275] A expressão de PTK7 foi avaliada em um painel de tecido humano normal congelado (Padrão de FDA, Biochain) usando um anti- corpo monoclonal biotinilado recombinante personalizado (mAb CTX181, Creative Biolabs, 1 mg/ml, SEQ ID NO: 108, e SEQ ID NO: 109) específico para o construto de CAR de PTK7 ou um controle de isotipo de camundongo biotinilado (Novus, NBP2-21948). As lâminas foram fixadas com acetona -20 °C por 10 min à temperatura ambiente seguido por uma coloração imuno-histoquímica manual à temperatura ambiente. O bloqueio para minimizar a coloração não específica foi re- alizado com Peroxidased 1, Avidina e Biotina e Background Sniper (Bi- oCare Medical, PX968M, AB972L, BS966M) em etapas sequenciais. As lâminas foram coloridas com o anticorpo monoclonal primário CTX181 biotinilado (1: 600) por 30 min, seguido de incubação com o reagente 4plus Estreptavidina-HRP Label (BioCare Medical) por 15 min cada. A visualização do antígeno alvo foi visualizada com cromógeno substrato DAB (cor marrom) (Dako, K3468). A hematoxilina de Mayer (Dako, S3309) foi usada para contrastar os núcleos das células. A Figura 1 mostra que a expressão de PTK7 não foi disseminada em tecidos hu- manos normais. Sequências para mAb CTX181: >181_HC (SEQ ID NO: 108)

[00276] QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG- MHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYV-

DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSF NSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG- CLVKDYFPEPVTVSWNS- GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHE- DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI- AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK >181_LC (SEQ ID NO: 109)

[00277] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQK- PGQAPRLLIYDASNRATGIPAR-

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Exemplo 2. Expressão de PTK7 em Tecidos Humanos Doentes

[00278] A expressão de PTK7 foi avaliada em microarranjos de tu- mor de pacientes normais e doentes fixados em formalina, embebidos em parafina (FFPE) usando um anticorpo monoclonal de camundongo anti-PTK7 humano, clone 4F9 (EMD Millipore, MABN721) (Figuras 2A e 2B). A Tabela 6 lista os microarranjos de tecido FFPE (TMA) usados na US Biomax, Inc.

As seções FFPE foram cozidas por 30 min a 60 °C, desparafinizadas e reidratadas.

A recuperação do antígeno foi realizada por 40 min a 95 ° C em solução 1X Reveal Decloaker usando uma câ- mara Decloaker (BioCare Medical). As demais etapas foram realizadas à temperatura ambiente.

O bloqueio para minimizar a coloração não es- pecífica foi realizado com Peroxidased 1 (BioCare Medical, PX968M) e Background Sniper (BioCare Medical, BS966M). As lâminas foram co- loridas por 60 min com o anticorpo monoclonal primário anti-PTK7 ou controle de isotipo IgG de camundongo (Novus Biologicals, LLC), lava- das e então coloridas por 30 min, com o anticorpo secundário de pero- xidase de rábano anticamundongo de cabra EnVision (Dako, K400111- 2). A visualização do antígeno alvo foi visualizada com cromógeno subs- trato DAB (cor marrom) (Dako, K3468). A hematoxilina de Mayer (Dako, S3309) foi usada para contrastar os núcleos das células.

As lâminas foram digitalizadas com o scanner Pannoramic MIDI II (3DHistech, Ther- moFisher Scientific) e pontuadas usando um sistema de pontuação se- miquantitativo avaliando tanto a intensidade da coloração (1 + -3 +, onde 1+ representa baixa expressão do antígeno), bem como a porcentagem de a seção manchada (1-100%). Os resultados foram tabulados para estabelecer os dados resumidos da prevalência do paciente (Figura 3). PTK7 foi mostrado como expresso em uma ampla faixa de cânceres de tumor sólido.

Tabela 6. TMAs de FFPE Tecido TMA de FFPE (US Biomax, Inc.

Nome/Número) Glioblastoma cerebral GL806f Carcinoma hepatocelular LV631 Hepatocolangiocarcinoma hepático LV642 Osteossarcoma OS804c Câncer Gástrico ST483e Cancro do ovário OVC962 Carcinoma de células escamosas esofágico HEso-Squ127Lym-01 Câncer de pâncreas em estágio avançado PA1921a

Adenocarcinoma pulmonar BCS04017b Carcinoma de células escamosas pulmonar HLug-Squ090Lym-01 Câncer pulmonar de pequenas células BS04116 Câncer biliar intra-hepático HIBD-Ade100PG-01 Exemplo 3. Transreatividade de humano/camundongo de CTX181 anti-PTK7

[00279] Para avaliar a transreatividade de espécies do anticorpo CTX181 personalizado, sua afinidade de ligação foi avaliada em fi- broblastos 3T3L1 murinos e linhagens celulares de câncer de mama M158 murinas e comparada com sua afinidade de ligação em Saos2 humano (osteossarcoma), A498 (carcinoma renal) e HCC70 (mama câncer) linhagens celulares. Para cada linhagem celular, um ensaio de ligação de titulação de dose (200 nM - 0,0032 nM de anticorpo CTX181 final) foi executado em 2x10 6 células em cada concentração. As células foram coloridas por 30 min em gelo com anticorpo CTX181, seguido por lavagem e 15 min coloridas à TA com anticorpo IgG-Fc humano conju- gado com fluoróforo APC secundário. As células foram avaliadas quanto à coloração em um citômetro de fluxo Novocyte (Acea Biosciences). Fi- gura 4 mostra afinidade de ligação equivalente para o anticorpo CTX181 em linhagens celulares murinas e humanas. Exemplo 4. Expressão de PTK7 em Tecidos Normais Humanos e de Camundongo

[00280] A expressão de PTK7 foi avaliada em um painel de tecido normal de camundongo congelado (FDA Standard, Biochain; Figuras 5A e 5B), bem como uma matriz de desenvolvimento embrionário murino congelado (Zyagen; Figura 6) usando CTX181, específico para o cons- truto CAR de PTK7, ou um controle de isotipo de camundongo biotini- lado (Novus, NBP2-21948). As lâminas foram fixadas com acetona -20 °C por 10 min à temperatura ambiente seguido por uma coloração imuno-histoquímica manual à temperatura ambiente. O bloqueio para minimizar a coloração não específica foi realizado com Peroxidased 1, Avidina e Biotina e Background Sniper (BioCare Medical, PX968M,

AB972L, BS966M) em etapas sequenciais. As lâminas foram coloridas com o anticorpo monoclonal primário CTX181 biotinilado (1: 300 para humanos; 1: 600 para murinos) por 30 min, seguido de incubação com reagente 4plus Estreptavidina-HRP Label (BioCare Medical) por 15 min cada. A visualização do antígeno alvo foi visualizada com cromógeno substrato DAB (cor marrom) (Dako, K3468). A hematoxilina de Mayer (Dako, S3309) foi usada para contrastar os núcleos das células. Exemplo 5. Geração de células T de TRAC-/β 2M-/CAR+anti-PTK7

[00281] Este exemplo descreve a produção de células T humanas alogênicas que carecem de expressão do gene do receptor de células T (TCR) (gene editado na região Constante Alfa de TCR (TRAC)), o gene β2-microglobulina (β2M) e que expressam um receptor de antí- geno quimérico (CAR) que alveja PTK7 e cânceres PTK7+. Quatro CARs anti-PTK7 exclusivos (PTK7-4, PTK7-7, PTK7-13 e PTK7-17) que compreendem domínios coestimuladores CD28 foram separadamente expressos em células T de TRAC-/β2M- para experimentação e avalia- ção. O PTK7-4 também foi gerado com um domínio coestimulador 41BB no lugar de CD28 (PTK7-4b). A Tabela 7 lista as estruturas de CAR de PTK7. A Tabela 11 lista as sequências de componentes de CAR de PTK7. A Tabela 12 lista os componentes doadores. Tabela 7. CAR Estrutura de CAR SEQ ID NO: PTK7-4 CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL-CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]-CD3ζ 50 PTK7-4b CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL-CD8[tm]-41BB[domínio coestimulador]-CD3ζ 52 PTK7-7 CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH-CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]-CD3ζ 66 PTK7-13 CD8 [peptídeo de sinal]-VL-ligante-VH-CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]-CD3ζ 73 PTK7-17 CD8 [peptídeo de sinal]-VH-ligante-VL-CD8[tm]-CD28[domínio coestimulador]-CD3ζ 80

[00282] Células T humanas primárias ativadas foram eletroporadas com Cas9: complexos de gRNA RNP e vetores adenovirais adenoasso- ciados (AAVs) para gerar células T de TRAC-/β2M-/ CAR+ anti-PTK7. Sorotipo 6 de AAV recombinante (AAV6) que compreende uma das se- quências de nucleotídeos que codificam um CAR anti-PTK7 (SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112) foram entregues com Cas9: sgRNA

RNPs (1 µM de Cas9, 5 µM de gRNA) para células T humanas alogêni- cas ativadas. Os seguintes sgRNAs foram usados: TRAC (SEQ ID NO: 28) e β2M (SEQ ID NO: 30). As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs também podem ser usadas (por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20). Consulte também a Ta- bela 4.

[00283] Cerca de uma (1) semana após a eletroporação, as células foram processadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de ex- pressão de TRAC, β 2M e CAR anti-PTK7 na superfície celular da po- pulação de células editada (Figura 7). A Tabela 8 lista os anticorpos que foram usados. Para todas as células T de CAR anti-PTK7 e células de controle de TRAC-/β2M-, >90% das células viáveis careciam de expres- são de TCR e >60% careciam de expressão de β 2M. As células trata- das com o construto que codifica o CAR de PTK7-4 tiveram a maior + porcentagem de células viáveis que expressam um CAR anti-PTK7 (>70%). A orientação das sequências de VH e VL no scFV parece afetar a expressão do CAR. O CAR de PTK7-4 difere do CAR de PTK7-7 na orientação da sequência VH e VL, entretanto, PTK7-7 expressa apenas em <50% da população de células viáveis. A célula T de CAR de PTK7 com o domínio coestimulador CD28 (PTK7-4) foi mais eficaz do que o domínio coestimulador 4-1BB (PTK7-4b) (Figura 8). Tabela 8. Anticorpo Clone Flúor nº do Catálogo Diluição TCRαβ BW242/412 PE 130-099-661 (Miltenyi) 1:100 β2M 2M2 FITC 316304 (Biolegend) 1:100 IgG, F(ab')₂ fragmento espe- policlonal Biotinilada; Detectada com 109-006-097 (Jackson Immuno-re- 1:20 cífico SA-APC search) Estreptavidina-APC (SA- N/A APC 17-4317-82 (eBioscience através de 1:100 APC) ThermoFisher)

[00284] Ensaio de Morte Celular. Um ensaio de morte celular (ci- totoxicidade) foi então usado para avaliar a capacidade das células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-PTK7 para causar lise celular em linhagens ce- lulares de sarcoma aderentes que expressam PTK7 (A-204 e Saos-2) e uma linhagem celular de câncer de mama que expressa PTK7 (MCF7).

As células aderentes foram semeadas em placas de 96 poços a 50.000 células por poço e deixadas durante a noite a 37 oC. Durante o dia se- guinte, as células T foram adicionadas aos poços que contêm células alvo em razões de 2:1 ou 1:1 célula T: célula alvo. Células T de TRAC - /β2M- foram utilizadas como controle negativo. Após aproximadamente 20 horas, as células T foram removidas da cultura por aspiração e 100 µl de Celltiter-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço da placa para avaliar o número de células viáveis restantes. A quantidade de luz emitida por cada poço foi então quantificada usando um leitor de placas. As células T de CAR anti-PKT7, particularmente aquelas que expres- sam os construtos de PTK7-4, PTK7-7 e PTK7-13, exibiram potente ci- totoxicidade para as linhagens celulares A-204 (Figura 9A) e Saos (Fi- gura 9B). Além disso, as células T de CAR anti-PKT7 que expressam o CAR de PTK7-4 mostraram a maior atividade citotóxica em relação à linhagem celular de MCF7 (Figura 9C), que é conhecida por ter menor expressão de mRNA de PTK7 do que as linhagens celulares de sar- coma testadas.

[00285] A especificidade celular das células T de CAR de PTK7-4 foi exemplificada usando células PTK7 knock-out (KO) Saos2 (Figura 10A) e células A498 com superexpressão de PTK7 (Figura 10B). As cé- lulas PTK7 KO Saos-2 foram geradas por meio de eletroporação de complexos de partículas de ribonucleoproteína (RNP) (1 µM de Cas9 e 5 µM de gRNA de PTK7 (SEQ ID NO: 111; consulte a Tabela 9)) de acordo com os métodos estabelecidos. As células foram analisadas quanto à perda de expressão de superfície de célula PTK7 por citome- tria de fluxo usando o mAb CTX181 (Figura 10C) e subsequentemente expandidas. A análise de citometria de fluxo mostrou que a expressão da proteína foi reduzida em 88,6%, indicando edição gênica altamente eficiente. A eficácia in vitro de células PTK7 KO Saos-2 foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade celular em comparação a células Saos-2

WT. A Figura 10A mostra uma diminuição na eficácia de células PTK7 KO Saos2 a serem lisadas por células T de CAR de PTK7, indicando que as células T de CAR eram específicas para células alvo que expres- sam PTK7. Tabela 9. Sequência de gRNA de PTK7 Nome Sequência não modificada (sequência espaçadora de gRNA sub- Sequência modificada (SEQ ID NO: 111) linhada) (SEQ ID NO: 110) PTK7 _T11 CCGCCGCGAUGGGAGCUGCGguuuuagagcuagaaauagcaa- C*C*G*CCGCGAUGGGAGCUGCGguuuuagag- guuaaaauaaggcuaguc- cuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc- cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U* U*U *: Resíduo de fosforotioato de 2´-O-metila

[00286] As células A498 com superexpressão de PTK7 foram gera- das da seguinte forma: Células de carcinoma de células renais A498 foram semeadas em 60-70% de confluência em meio MEM1α + FBS a 10% suplementado com 10 µg/ml de polibreno. Com base na multiplici- dade de infecção desejada (MOI), as células A498 foram transduzidas no dia seguinte com um lentivírus que expressa cDNA de humPTK7 (LPP-A6381-Lv225-200, GeneCopoeia, Rockville, MD, EUA). Após 24- 48 horas de infecção por lentivírus, meio fresco foi substituído contendo 4 µg/ml de seleção de puromicina. O tratamento com puromicina foi con- tinuado por 5-7 dias após a transdução até que todas as células não transduzidas fossem eliminadas da cultura. A expressão da construção lentiviral humPTK7cDNA foi avaliada por citometria de fluxo (Figura 10C) usando o mAb CTX181. A eficácia in vitro de cDNA humPTK7 que expressa células A498 foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade ce- lular em comparação com células A498 WT. A Figura 10B mostra um aumento na eficácia das células T de CAR de PTK7 para lisar células A498 que expressam cDNA humPTK7 em comparação com células A498 WT, indicando que as células T de CAR PTK7 eram específicas para células alvo que expressam o antígeno PTK7. Exemplo 6. Potência in vitro de células T de CAR de PTK7 em linha- gens celulares de tumor sólido

[00287] Ensaio de Morte Celular.

Para examinar a eficácia em li- nhagens celulares tumorais adicionais, linhagens celulares que expres- sam PTK7 alta, média e baixa para câncer de mama, pancreático e NSCL foram selecionadas do banco de dados Broad Cancer Cell Line.

Um ensaio de morte celular (citotoxicidade) foi usado para avaliar a ca- pacidade das células T de TRAC-/β2M-/CAR+ anti-PTK7 para causar lise celular em uma linhagem celular de sarcoma aderente que expressa PTK7 (Saos-2), linhagens celulares de câncer de mama que expressam PTK7 em vários graus (HCC1395, MCF7, HCC1419), linhagens celula- res pancreáticas que expressam PTK7 em vários graus (Panc-1, Hs766T, Aspc1) e linhagens celulares de câncer pulmonar de células não pequenas que expressam PTK7 em vários graus (NCI-H1975, NCI- H520, NCI-H460). As células aderentes foram semeadas em placas de 96 poços a 50.000 células por poço e deixadas durante a noite a 37 ° C.

Durante o dia seguinte, as células T foram adicionadas aos poços con- tendo células alvo em proporções de 0,125: 1, 0,25: 1, 1: 1 ou 4: 1 célula T efetora: célula alvo.

Células T de TRAC-/β2M- foram utilizadas como controle negativo.

Após aproximadamente 24 horas, as células T foram removidas da cultura por aspiração e 100 µl de Celltiter-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço da placa para avaliar o número de célu- las viáveis restantes.

A quantidade de luz emitida por cada poço foi en- tão quantificada usando um leitor de placas.

A expressão da proteína PTK7 foi avaliada pela coloração de células alvo por 30 min em gelo com o anticorpo CTX181, seguido por lavagem e uma coloração de 15 min à TA com anticorpo IgG-Fc humano conjugado com fluoróforo APC secundário.

As células alvo foram avaliadas quanto à coloração em um citômetro de fluxo Novocyte (Acea Biosciences). As Figuras 11A-11C mostram que as células T de CAR anti-PKT7 exibiram citotoxicidade em relação a todas as linhagens celulares testadas e sua potência in vitro tendeu com o nível de expressão de PTK7 nessas linhagens celulares tumorais.

[00288] A atividade funcional das células T de CAR de PTK7 foi ainda avaliada usando ensaios de liberação de citocinas para Interferon gama (IFNg) e Interleucina-2 (IL2). As células T de todos os genótipos testados foram incubadas com células alvo durante 24 horas nas pro- porções celulares indicadas acima. Após 24 horas, o meio sobrenadante em torno de uma amostra celular foi coletado e os níveis de IFNg e IL2 foram medidos usando um ELISA (RD Systems) seguindo as instruções do fabricante. As células T de CAR de PTK7 secretaram IFNg e IL2 na presença de linhagens celulares cancerosas que expressam PTK7 (Saos2, HCC1395, MCF7, Panc1, Hs766T, NCI-H520 e NCI-H1975) quando usadas em uma razão de células T:células alvo de 4:1 ou 1:1. As células de controle (TCR-/β2M- (Sem AAV) e não editadas (sem RNP)) não apresentaram resposta secretora específica de IFNg ou IL2 na presença de qualquer uma das linhagens celulares cancerígenas lis- tadas. Coletivamente, esses ensaios funcionais demonstraram que as células T de CAR anti-PTK7 eram citotóxicas e secretavam IFNg e IL2 na presença de células que expressavam PTK7. Exemplo 7. Capacidades funcionais de células T de CAR+ anti- PTK7.

[00289] As células T de TRAC-/β 2M -/CAR+ anti-PTK7-4 (também referidas como células T de CAR de PTK7-4) foram geradas conforme descrito no Exemplo 5. As populações de células T de TRAC-/β 2M - /CAR + anti-CD19 e células T de TRAC -/β2M- foram geradas de forma semelhante para uso como controles. Após a preparo das células T edi- tadas por transfecção, foi testada a capacidade de todos os tipos de células editadas e células T não editadas para proliferar ao longo de 7 6 dias. 5x10 células foram semeadas para cada genótipo de células T. Notavelmente, como mostrado na Figura 12, as células T de TRAC-/β

2M -/CAR +anti-PTK7-4 tiveram capacidade para proliferar a taxas e ní- veis comparáveis a todos os experimentos de controle. Após 7 dias de proliferação celular, uma amostra de cada genótipo a ser injetada em modelos de camundongo foi congelada em cyrostor10 e armazenada em nitrogênio líquido. As células restantes de cada genótipo continua- ram a proliferar até o dia 14 pós-edição. Notavelmente, como mostrado nas Figuras 13A-13B, a porcentagem de células viáveis com edição ge- nética de TCR, β 2M e CAR permaneceu consistente do dia 7 ao dia 14 pós-edição. As Figuras 13C-13D mostram que em experiências subse- quentes, 70,9% das células expressaram o construto de CAR de PTK7- 4, enquanto 98% das células tinham o TRAC KO e 97% das células tinham o β2M KO. A expressão de CAR anti-CD19 foi detectada usando um FAB anticamundongo policlonal biotinilado primário seguido por um conjugado de estreptavidina-APC; a expressão de CAR anti-PTK7 foi detectada usando um conjugado de anticorpo anti-PTK7-PE (Miltenyi no de catálogo: 130-091-364) (Figuras 14A e 14D).

[00290] A atividade funcional das células T de CAR de PTK7-4 foi verificada usando um ensaio de citotoxicidade aderente, conforme des- crito no Exemplo 5. As células T de CAR de PTK7-4 (CAR de PTK7) foram capazes de causar citotoxicidade de células Saos-2 e MCF7 que expressam PTK7 quando usadas em uma razão célula T:célula alvo de 1:1 ou 2:1. As células de controle (TCR-/β2M- (Sem AAV); TCR-/β 2M- /CAR anti-CD19 (CAR de CD19); e não editadas (sem RNP)) não mos- traram citotoxicidade específica contra células Saos-2 ou MCF7 (Figu- ras 14B e 14E).

[00291] A atividade funcional das células T de CAR de PTK7-4 foi avaliada adicionalmente usando um ensaio de liberação de citocina (In- terferon gama/IFNγ). As células T de todos os genótipos testados foram incubadas com células alvo (células Saos-2 e MCF7) por 24 horas em razões celulares de 1: 1 e 2: 1. Após 24 horas, o meio sobrenadante em torno de uma amostra celular foi coletado e os níveis de IFNɣ foram medidos usando um ELISA (RD Systems) seguindo as instruções do fabricante. As células T de CAR de PTK7-4 (CAR de PTK7) secretaram IFNɣ na presença de PTK7 que expressa células Saos-2 e MCF7 quando usadas em uma razão de célula T:célula alvo de 1:1 ou 2:1. As células de controle (TCR -/β 2M - (Sem AAV); TCR -/β 2M -/anti-CD19 CAR + (CD19 CAR); e não editadas (sem RNP)) não apresentaram res- posta secretora específica de IFN na presença de células Saos-2 ou MCF7 (Figuras 14C e 14F).

[00292] Coletivamente, esses ensaios funcionais demonstraram que as células T de CAR anti-PTK7 eram citotóxicas e secretavam IFNɣ na presença de células que expressam PTK7. Exemplo 8. Ensaio de Citotoxicidade in vitro

[00293] Para avaliar a eficácia in vitro de células T de CAR anti- PTK7 contra células murinas, fibroblastos 3T3L1 e células de câncer de mama M158, foi realizado um ensaio de citotoxicidade de 24 horas. Os resultados foram comparados com a eficácia de células T de CAR anti- PTK7 para lisar linhagens celulares de osteossarcoma Saos2 humano e carcinoma de células renais A498 humano. As células aderentes fo- ram semeadas em placas de 96 poços a 50.000 células por poço e dei- xadas durante a noite a 37 °C. Durante o dia seguinte, as células T fo- ram adicionadas aos poços contendo células alvo em proporções de 0,125: 1, 0,25: 1, 1: 1 ou 4: 1 célula T efetora: célula alvo. Células T de TRAC-/β2M- foram utilizadas como controle negativo. Após aproximada- mente 24 horas, as células T foram removidas da cultura por aspiração e 100 µl de Celltiter-Glo (Promega) foram adicionados a cada poço da placa para avaliar o número de células viáveis restantes. A quantidade de luz emitida por cada poço foi então quantificada usando um leitor de placas. As células T de CAR anti-PKT7 exibiram citotoxicidade igual- mente bem em relação às linhagens celulares Saos2 humanas e 3T3L1 murinas (Figura 15). Por outro lado, as células humanas A498 e murinas M158 não lisaram na presença de células T de CAR anti-PTK7, visto que os níveis de expressão de PTK7 são baixos nessas 2 linhagens celulares. Exemplo 9. Tolerabilidade de células T de CAR anti-PTK7 em mo- delos de camundongos

[00294] A capacidade dos camundongos NOG de tolerar o trata- mento via injeção com células T de TRAC-/β2M-//CAR+anti-PTK7-4 foi testada. Dois camundongos NOG foram doseados com 10 milhões de células T de TRAC-/β2M-//CAR anti-PTK7-4 (geradas como descrito an- teriormente); dois camundongos adicionais foram dosados com 10 mi- lhões de células T de CAR anti-CD19. Todas as células T de CAR foram administradas por meio de injeção na veia da cauda.

[00295] Os camundongos foram pesados diariamente e monitora- dos quanto a desconforto ou morbidade. Os camundongos tratados com células T de CAR anti-PTK7 mostraram perda de peso mínima seme- lhante aos camundongos tratados com células T de CAR anti-CD19 (Fi- gura 16). Após um período de dez dias após a injeção, os animais foram sacrificados e os baços e amostras de sangue foram analisados quanto à presença de células T humanas (células CD45 + humanas). Tanto no baço quanto no sangue, os camundongos tratados com anti-CAR de PTK7 T apresentaram níveis mais elevados de células T de CAR edita- das (células huCD45 +) do que em camundongos tratados com células T de CAR anti-CD19 (Tabela 10), sugerindo que o CAR anti-PTK7 As células T se expandem na presença do antígeno de camundongo. Tabela 10. Porcentagem de células CD45 + humanas ((huCD45 +/muCD45 +) * 100) em camundongos tratados com células T de CAR de PTK7 e CD19 PTK7 CD19 Camundongo 1 Camundongo 2 Camundongo 1 Camundongo 2 Baço 8,56 10,01 0,58 0,82 Sangue 18,47 15,13 0,42 0,93

[00296] Coletivamente, a perda transitória de peso corporal e os ní- veis mais elevados de células T de CAR nos camundongos tratados com CAR anti-PTK7 sugeriram que o CAR anti-PTK7 reconheceu um antígeno no camundongo, o que resultou na proliferação de células T de CAR. Uma falta geral de toxicidades significativas foi surpreendente e indica que as toxicidades no alvo/fora do tecido conhecidas associa- das ao direcionamento de PTK7 são toleráveis em camundongos e po- dem ainda ser toleráveis em humanos. Exemplo 10. Eficácia in vivo de células T de CAR anti-PTK7 em modelos de camundongo de xenoenxerto

[00297] A eficácia de células T de CAR anti-PTK7-T foi testada in vivo em modelos de camundongo de xenoenxerto de tumor de tumor Hs766T humano SKOV-3, câncer pulmonar de células não pequenas humano NCI-H1975 e humano pancreático Hs766T. Figura 17 mostra os níveis de expressão de superfície de célula PTK7 em linhagens ce- lulares de câncer humano usando o Ab CTX181. Para cada modelo de xenoenxerto, 5 camundongos fêmeas (5-8 semanas) NOG receberam dose única de ponto de tempo IV, dose única (5x10 7 células/ml) células TRAC -/β2M -/anti-CAR de PTK7 (geradas conforme descrito anterior- mente) . O peso corporal (2x semanalmente) e o volume do tumor foram os pontos finais medidos ao longo do estudo. Os camundongos foram doseados com células T de CAR anti-PTK7 quando os tumores (linha- gens celulares injetadas subcutâneas no flanco direito) atingiram 50 mm. Os estudos foram encerrados quando os tumores atingiram o ta- manho do ponto final (1.000 mm para SKOV3 (ovário), 2.000 mm para NCI-H1975 (NSCLC) e Hs766T (pancreático)) ou 90 dias, o que ocorrer primeiro. Os camundongos foram alojados e monitorados em condições livres de patógenos e padrões IACUC. As células T de CAR anti-PTK7 foram eficazes em todos os três modelos de xenoenxerto (modelo de xenoenxerto de câncer pulmonar de células não pequenas NCI-H1975

(Figura 18A), modelo de xenoenxerto de câncer de ovário SKOV3 (Fi- gura 18B) e modelo de xenoenxerto de câncer pancreático Hs766T (Fi- gura 18C)). Exemplo 11. Eficácia in vivo de células T de CAR anti-PTK7 em modelos de camundongo de xenoenxerto

[00298] A eficácia das células T de CAR anti-PTK7 foi testada in vivo em modelos OV90, OVCAR3, A2780 ovariano humano, MCF7, HCC70 mama humana, cólon humano HCT116 e modelos de xenoen- xerto de tumor pulmonar de células pequenas humanas H209. Para cada modelo de xenoenxerto, 5 camundongos fêmeas (5 a 8 semanas) NOG receberam dose única de ponto de tempo IV, dose única (5x10 7 células/ml) células TRAC -/β2M -/anti-CAR de PTK7 (geradas conforme descrito anteriormente) . O peso corporal (2x semanalmente) e o volume do tumor foram os pontos finais medidos ao longo do estudo. Os ca- mundongos foram doseados com células T de CAR anti-PTK7 quando os tumores (linhagens celulares injetadas subcutâneas no flanco direito) atingiram 50 mm. Os estudos foram encerrados quando os tumores atin- giram o tamanho do ponto final (2.000 mm) ou 90 dias, o que ocorrer primeiro. Os camundongos foram alojados e monitorados em condições livres de patógenos e padrões IACUC. A Figura 19A mostra a eficácia de células T de CAR anti-PTK7 em relação ao modelo de xenoenxerto de tumor de ovário OV90. A Figura 19B mostra a eficácia de células T de CAR anti-PTK7 em relação ao modelo de xenoenxerto de tumor de cólon HCT116. A Figura 19C mostra que as células T de CAR anti-PTK7 foram particularmente eficazes em modelos de xenoenxerto de tumor MCF7. A Figura 20 mostra a variação percentual do peso corporal do modelo de xenoenxerto de tumor pancreático Hs-766T tratado com cé- lulas T de CAR de PTK7. Mudanças na porcentagem de peso corporal equivalente foram observadas em todos os estudos de xenoenxertos medidos. A toxicidade latente mostrou variabilidade nos modelos de xe- noenxerto. Tabela 11. Componentes de CAR Estrutura de CAR:

[00299] CD8[peptídeo de sinal]-anti-Pkt7[scFV]-CD8[tm]-CD28[do- mínio coestimulador]-CD3ζ; ou

[00300] CD8[peptídeo de sinal]-anti-Pkt7[scFV]-CD8]-CD8[tm]- 41BB[domínio coestimulador]-CD3ζ Nome Sequência SEQ ID NO: PTK7-4 CAR de PKT7-4 ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCG- 49 CD28 coestim CCCGCAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCT GCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGG-

CAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGGTGATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCGTGAAA GGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAG- CCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAAC AGCTATTATGGCACCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGG- CGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACC CTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAG- CATTTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAAC CGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAC- CATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTTT ACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATATTAAAAGCGCGGCGGCGTTTGTGCCGGTGTTT- CTGCCGGCGAAACCGACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCA GCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCG- CGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTG AGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAACCATCGCAACCGCAGCAAACGCAGCCGCCTGCTGCA- TAGCGATTATATGAACATGACCCCGCGCCGCCCGGGCCCGACCCGCAAACATTATCAGCCGTATGCGCCG CCGCGCGATTTTGCGGCGTATCGCAGCCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGG- CGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCT GGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAG- GAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCG AACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGA-

TACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC CAR de PKT7-4 ATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGG- 112 CD28 coestim CCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGAGTGGTGCAACCCGGAAGGTCCCTGAGGCTCTCCTG TGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGTATGCACTGGGTGAGACAAGCCCCCGGA-

AAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGGATGATGGCTCCAACAAGTACTACGTGGACAGCGTCAAG GGCAGATTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAAC- TCCCTGAGAGCCGAAGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGGGACGACTACTATGGCTCCGGCTCCTTCA ATAGCTACTATGGCACCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGAGCAGCGGCGGA- GGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGAGATCGTGCTGACACAGTCCCCCGCTAC CCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGAGCTACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCG- TCTCCATCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACGACGCCAG CAACAGGGCCACCGGCATTCCTGCCAGATTCAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGATTTCACAC- TGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGAGGAGCAACTGGCCCCC CTTTACCTTCGGCCCCGGCACCAAGGTCGACATCAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTA- TTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTC AACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATA- CGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTT GTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTG- TTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGC CCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACG- CTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGA

Nome Sequência SEQ ID NO: CGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAA-

TCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGA AGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAAC-

CAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA CAR de PKT7-4 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR- 50 CD28 coestim QAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSY YGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS-

QSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFG PGTKVDIKSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA- VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRD FAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN-

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CAR de PKT7-4b ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCG- 51 41BB coestim CCCGCAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCT GCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGG-

CAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGGTGATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCGTGAAA GGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAG- CCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAAC AGCTATTATGGCACCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGG- CGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACC CTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAG- CATTTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAAC CGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAC- CATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTTT ACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATATTAAAAGCGCGGCGGCGTTTGTGCCGGTGTTT- CTGCCGGCGAAACCGACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCA GCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCG- CGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTG AGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAACCATCGCAACCGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTG- CTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCC GCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGA- TGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATA TGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCG- CAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATT GGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCAC-

CGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC CAR de PKT7-4b MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR- 52 41BB coestim QAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSY YGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS-

QSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFG PGTKVDIKSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA- VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEE EEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN-

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR scFv de PTK7-4 CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAG- 53

CTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGG CCTGGAATGGGTGGCGGTGATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCG- TGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGC GCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAA- CAGCTATTATGGCACCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCA GCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAC- CCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCATTTATCT GGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAAC- CGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGC AGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTT-

TACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATATTAAA CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAG- 113 scFv de PTK7-4 CTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGG

Nome Sequência SEQ ID NO: CCTGGAATGGGTGGCGGTGATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCG-

TGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGC GCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAA- CAGCTATTATGGCACCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCA GCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAC- CCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCATTTATCT GGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAAC- CGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGC AGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTT-

TACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATATTAAA scFv de PTK7-4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYV- 54 (ligante sublinhado) DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN-

RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK VH de scFv de PTK7-4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYV- 55 CDRs- em negrito DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSS VL de scFv de PTK7-4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR- 56 CDRs- em negrito FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK PTK7-4 SYGMH 57 CDR1 de VH PTK7-4 VIWDDGSNKYYVDSVKG 58 CDR2 de VH PTK7-4 DDYYGSGSFNSYYGTDV 59 CDR3 de VH PTK7-4 RASQSVSIYLA 60 CDR1 de VL PTK7-4 DASNRAT 61 CDR2 de VL PTK7-4 QQRSNWPPFT 62 CDR3 de VL PTK7-4 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- 63 Dador CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA LHA para RHA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG-

CCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTG CCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAA- TAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGT TCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAG- TCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCC ACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGG- GAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTAC CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCT- CAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAG- TCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACT GGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATA- TAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGT GTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTT- CCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCT TGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG- CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATT TTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGA- TCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATG

Nome Sequência SEQ ID NO: TTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG-

CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG- CTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCAC- CTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTT TCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT- CTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTT TTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTG- CTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGA GTGGTGCAACCCGGAAGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAG- CTACGGTATGCACTGGGTGAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGGATGA TGGCTCCAACAAGTACTACGTGGACAGCGTCAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACAACA- GCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAG GGACGACTACTATGGCTCCGGCTCCTTCAATAGCTACTATGGCACCGACGTGTGGGGCCA- GGGCACCACAGTGACAGTGAGCAGCGGCGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGA AGCGAGATCGTGCTGACACAGTCCCCCGCTACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGAGCTAC- CCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTCTCCATCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGC CCCTAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGGGCCACCGGCATTCCTGCCAGATTCAG- CGGCTCCGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTAT TACTGCCAGCAGAGGAGCAACTGGCCCCCCTTTACCTTCGGCCCCGGCACCAAGGTCGACAT- CAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCT CCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGAC- CCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTT GGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGA- ATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGAC AAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGAG- TGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAAT TTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAA- TGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGC GGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGG- CCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCC AGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAG- CAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAG CCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGG- TTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCA CCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACA- CGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTG AGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATT- CTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAG TCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCAC- CAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGG GGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACT- CAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAA

GATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG PTK7-4b GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- 64 Dador CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA LHA para RHA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG-

CCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTG CCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAA- TAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGT TCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAG- TCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCC ACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGG- GAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTAC CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCT- CAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAG- TCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACT GGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATA- TAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGT GTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTT- CCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCT

Nome Sequência SEQ ID NO: TGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG-

CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATT TTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGA- TCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATG TTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG- CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG- CTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCAC- CTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTT TCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT- CTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTT TTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTG- CTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGA GTGGTGCAACCCGGAAGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAG- CTACGGTATGCACTGGGTGAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGGATGA TGGCTCCAACAAGTACTACGTGGACAGCGTCAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACAACA- GCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAAGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAG GGACGACTACTATGGCTCCGGCTCCTTCAATAGCTACTATGGCACCGACGTGTGGGGCCA- GGGCACCACAGTGACAGTGAGCAGCGGCGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGA AGCGAGATCGTGCTGACACAGTCCCCCGCTACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGAGCTAC- CCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTCTCCATCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGC CCCTAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGGGCCACCGGCATTCCTGCCAGATTCAG- CGGCTCCGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTAT TACTGCCAGCAGAGGAGCAACTGGCCCCCCTTTACCTTCGGCCCCGGCACCAAGGTCGACAT- CAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCT CCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGAC- CCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTT GGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGA- ATCGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTC AAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG- CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAAC TGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAA- ATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGG CGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGG- CCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCC AGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAG- CAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAG CCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGG- TTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCA CCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACA- CGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTG AGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATT- CTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAG TCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCAC- CAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGG GGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACT- CAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAA

GATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG PTK7-7 CAR de PKT7-7 ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCG- 65

CCCGGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGA GCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCATTTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCA- GGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAG CGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTG- TATTATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTTTACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATATTAAAG GCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGA- AAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCT TTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGG- CGGTGATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGC GATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGG- TGTATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAACAGCTATTATGGCACCGATGTGTGG

Nome Sequência SEQ ID NO: GGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGTTTGTGCCGGTGTTTCTGCCGG-

CGAAACCGACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTG AGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGA- TTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTG ATTACCCTGTATTGCAACCATCGCAACCGCAGCAAACGCAGCCGCCTGCTGCATAGCGATTA- TATGAACATGACCCCGCGCCGCCCGGGCCCGACCCGCAAACATTATCAGCCGTATGCGCCGCCGCGCGA TTTTGCGGCGTATCGCAGCCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAG- CAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAAC GCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTG- TATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCC GCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTA-

TGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC CAR de PKT7-7 MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQK- 66

PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGGGS GGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVI- WDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVT VSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA- VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRD FAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN-

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR scFv de PTK7-7 GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC- 67

CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCATTTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGC GCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAG- CGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTAT TATTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCGCCGTTTACCTTTGGCCCGGGCACCAAAGTGGATAT- TAAAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAA AGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTT- TACCTTTAGCAGCTATGGCATGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGGT GATTTGGGATGATGGCAGCAACAAATATTATGTGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCAT- TAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTG TATTATTGCGCGCGCGATGATTATTATGGCAGCGGCAGCTTTAACAGCTATTATGGCAC-

CGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC scFv de PTK7-7 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR- 68 (ligante sublinhado) FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGG GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTIS-

RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSS VH de scFv de PTK7-7 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYV- 69

DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSS VL de scFv de PTK7-7 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR- 70

FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK PTK7-7 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- 71 Dador CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA LHA para RHA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG-

CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATT TTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGA- TCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATG TTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG- CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG- CTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCAC- CTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTT TCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT- CTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTT TTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTG- CTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACA CTGAGCCTGAGCCCCGGAGAGAGGGCTACCCTGAGCTGCAGGGCCTCCCAGTCCGTGAG- CATCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAAT AGGGCCACCGGAATCCCTGCCAGGTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGAC- CATCTCCTCCCTGGAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGGTCCAACTGGCCTCCCTTT ACCTTCGGCCCCGGCACCAAGGTGGATATTAAGGGCGGCGGCGGATCCGGAGGAGGAGGCAG- CGGAGGAGGAGGAAGCCAGGTGCAACTGGTGGAGTCCGGCGGAGGCGTGGTGCAACCTGGCAGAAGCC TGAGGCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGTATGCACTGGGTGAGG- CAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCGTGATCTGGGACGACGGCTCCAACAAGTACTACGTG GACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACTCCAAGAACACACTGTACCTGCA- GATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGGACGATTACTACGGCAGCGG CAGCTTCAATTCCTACTACGGAACCGACGTCTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGAGCA- GCAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCC GACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCG- CCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGC GGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAA- TCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACA AGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGAG- TGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAAT TTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAA- TGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGC GGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGG- CCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCC AGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAG- CAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAG CCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGG- TTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCA CCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACA- CGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTG AGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATT- CTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAG TCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCAC- CAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGG GGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACT- CAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAA

GATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG PTK7-13 CAR de PKT7-13 ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCG- 72

CCCGGAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGA GCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGG- CCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGG CAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGG- TGTATTATTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGATGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAA GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGCAGCTGGTGCA- GAGCGGCGGCGGCCTGGTGCATCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGGCAGCGGCTTTACCT TTAGCACCTATCTGATGTATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAACCCTGGAATGGGTGAG- CGCGATTGGCAGCGGCGGCGATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGAT AACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATATGGCGGTGTA- TTATTGCGCGCGCGGCCTGGGCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGT

Nome Sequência SEQ ID NO: TTGTGCCGGTGTTTCTGCCGGCGAAACCGACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGAC-

CCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGC GGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGG- CGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAACCATCGCAACCGCAGCAA ACGCAGCCGCCTGCTGCATAGCGATTATATGAACATGACCCCGCGCCGCCCGGGCCCGAC- CCGCAAACATTATCAGCCGTATGCGCCGCCGCGCGATTTTGCGGCGTATCGCAGCCGCGTGAAATTTAGC CGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAAC- CTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAA CCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGA- AGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGG

CCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC CAR de PKT7-13 MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQK- 73

PGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIKGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVR- QAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTV SSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA- VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRD FAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN-

PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR scFv de PTK7-13 GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC- 74

CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCA GGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTT- TAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTG TATTATTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGATGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGA- AATTAAAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGCAGCTGGTG CAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCATCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGGCAGCGG- CTTTACCTTTAGCACCTATCTGATGTATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAACCCTGGAATGGGTGAGC GCGATTGGCAGCGGCGGCGATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAG- CCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATATGGCGGTGTAT

TATTGCGCGCGCGGCCTGGGCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC scFv de PTK7-13 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP- 75 (ligante sublinhado) DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSG GGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVRQAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTIS-

RDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTVSS VH de scFv de PTK7-13 EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVR- 76

QAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTV

SS VL de scFv de PTK7-13 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP- 77

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIK PTK7-13 GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- 78 Dador CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA LHA para RHA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG-

CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATT TTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGA- TCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATG TTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG- CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG- CTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCAC- CTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTT TCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT- CTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTT TTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTG- CTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGAACA CTGAGCCTGTCCCCCGGAGAAAGAGCCACACTGTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCAG- CTCCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCCAGGCTGCTGATTTACGGCGCCAGCAG CAGGGCCACCGGCATCCCCGACAGATTCAGCGGATCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGA- CCATCAGCAGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCTGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCATGTA CACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGCGGA- AGCGGAGGAGGAGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCATCCCGGAGGATC CCTGAGACTGAGCTGTGCCGGCAGCGGATTCACATTCTCCACCTACCTGATGTACTGGG- TGAGGCAGGCCCCTGGCAAGACCCTGGAGTGGGTGTCCGCCATTGGCTCCGGCGGAGACACCTATTATG CCGACTCCGTCAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTG- CAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATATGGCTGTGTACTATTGCGCTAGGGGCCTGGGATACTGGGGC CAGGGAACCCTGGTGACCGTGAGCTCCAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAG- CCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAG TCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGAC- TTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATT ACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACA- TGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTT CGCTGCGTACAGGTCCCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG- GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCG GGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACA- ATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGG GAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATG- CACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGG TTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCAT- TATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTG CTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAAC- TCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTT GTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGA- GAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTG CCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTT- CTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAAT CACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGA- TGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAA TAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGA- CAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAG

GACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG PTK7-17 CAR de PKT7-17 ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCG- 79

CCCGGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCATCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCT GCGCGGGCAGCGGCTTTACCTTTAGCACCTATCTGATGTATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGG- CAAAACCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTGGCAGCGGCGGCGATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGG CCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTG- CGCGCGGAAGATATGGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCCTGGGCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTG ACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAA- TTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGC GCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCG- CCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGC AGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTA- TTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGATGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGCGCG

Nome Sequência SEQ ID NO: GCGGCGTTTGTGCCGGTGTTTCTGCCGGCGAAACCGACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCG-

CCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGC GGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCG- CTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAACCATCGCAACCGCA GCAAACGCAGCCGCCTGCTGCATAGCGATTATATGAACATGACCCCGCGCCGCCCGGG- CCCGACCCGCAAACATTATCAGCCGTATGCGCCGCCGCGCGATTTTGCGGCGTATCGCAGCCGCGTGAAA TTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAAC- TGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCG GCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAA- TGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGT

ATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC CAR de PKT7-17 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVR- 80

QAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA- PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIKSAAAFVPVFL PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAG- TCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG-

MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR scFv de PTK7-17 GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCATCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAG- 81

CTGCGCGGGCAGCGGCTTTACCTTTAGCACCTATCTGATGTATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAACC CTGGAATGGGTGAGCGCGATTGGCAGCGGCGGCGATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGG- CCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAA GATATGGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCCTGGGCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC- CGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAATTGTGCTG ACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCG- CGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTG CTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAG- CGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGT

ATGGCAGCAGCCCGATGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAA scFv de PTK7-17 EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVR- 82 (ligante sublinhado) QAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQA-

PRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIK VH de scFv de PTK7-17 EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSTYLMYWVR- 83

QAPGKTLEWVSAIGSGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGLGYWGQGTLVTV

SS VL de scFv de PTK7-17 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP- 84

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPMYTFGQGTKLEIK PTK7-17 TYLMY 85 CDR1 de VH PTK7-17 AIGSGGDTYYADSVKG 86 CDR2 de VH PTK7-17 GLGY 87 CDR3 de VH PTK7-17 RASQSVSSSYLA 88 CDR1 de VL PTK7-17 GASSRAT 89 CDR2 de VL PTK7-17 QQYGSSPMYT 90 CDR3 de VL PTK-17 91

Nome Sequência SEQ ID NO: Dador GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- LHA para RHA CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG-

CCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTG CCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAA- TAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGT TCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAG- TCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCC ACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGG- GAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTAC CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCT- CAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT ATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAG- TCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACT GGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATA- TAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGT GTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTT- CCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCT TGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG- CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATT TTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGA- TCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATG TTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAG- CTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG- CTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCAC- CTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTT TCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT- CTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTT TTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTG- CTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGGAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGGCGGA CTGGTGCATCCTGGAGGCTCCCTGAGACTGTCCTGTGCCGGCAGCGGCTTCACCTTCAGCAC- CTACCTGATGTACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAAACCCTGGAGTGGGTGAGCGCTATCGGCAGCGG CGGAGACACATACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACG- CCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCTGAGGACATGGCCGTGTACTACTGCGCTAG AGGCCTGGGCTACTGGGGACAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCAGCGGAGGCGGCGGCAGCG- GAGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGAGGCAGCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACCCTGTCCCTG TCCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGAGCAGCAGCTA- TCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGGCCCCTAGACTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCCAGAGC CACCGGAATCCCCGATAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGACCATCA- GCAGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCTATGTACACATT CGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAG- CCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAG TCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGAC- TTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATT ACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACA- TGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTT CGCTGCGTACAGGTCCCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAG- GACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCG GGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACA- ATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGG GAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATG- CACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGG TTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCAT- TATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTG CTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAAC- TCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTT GTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGA- GAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTG CCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTT- CTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAAT CACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGA- TGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAA

Nome Sequência SEQ ID NO: TAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGA-

CAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAG

GACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG peptídeo de sinal CD8 MALPVTALLLPLALLLHAARP 93 CD8a transmembranar + GCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCG- 94 ligante de 5’ (sublinhado) CCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCC GCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGG-

CTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATC

GC CD8a transmembranar + ligante de 5’ (sublinhado) SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI- 95

WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR CD8a transmembranar TTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACAC- 96 (sem ligante) CCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTG CTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGG-

TACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGC CD8a transmembranar FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI- 97 (sem ligante) WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR CD28 coestimulador TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGG- 45

CCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCC CD28 coestimulador SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 46 41BB coestimulador AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAAC- 43

TACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG 41BB coestimulador KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 44 CD3ζ CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTA- 98

TAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGA AATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAG- GATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGAT GGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGG-

CCCTGCCTCCCAGA CD3ζ RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL- 99

QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Tabela 12. Componentes Doadores Estrutura doadora: TRAC[LHA]-EF1a[promotor]-CAR-poliA– TRAC[RHA] Nome Sequência SEQ ID NO: TRAC-LHA GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTG- 100

CTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAA TGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAG- CCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTG CCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAA- TAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGT TCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAG- TCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCC ACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGG- GAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTAC

Nome Sequência SEQ ID NO: CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCT-

CAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCT

ATGGACTTCA Promotor EF1α GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGG- 101

GAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGT ACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCG- TGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCC TGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACG- TGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCC TTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGG- TGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCG ACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTT- CGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGC CTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGG- TGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTT GCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACG- CGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTC GCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAG- CTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGG GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTG- CCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCA

GGTGTCGTGA Sinal poli(A) sintético AATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG 102 TRAC–RHA TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGA- 92

CACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGG CCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGG- CCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATG ACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAG- TCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCA TTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTT- CCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAA TGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAG- CACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTT AACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAA- ATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTC AATGAGAAAGG

[00301] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes des- critos no presente documento são incorporados a título de referência no que diz respeito à matéria para a qual cada um é citado, o que em alguns casos pode englobar a totalidade do documento.

[00302] Os artigos indefinidos “um” e “uma”, como usados aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, a não ser que claramente indi- cado em contrário, devem ser entendidos como significando “pelo me- nos um(a)”.

[00303] Deve ser também entendido que, a não ser que claramente indicado em contrário, em quaisquer métodos reivindicados no presente documento que incluam mais do que uma etapa ou ação, a ordem dos passos ou atos do método não está necessariamente limitada à ordem na qual os passos ou atos do método são recitados.

[00304] Nas reivindicações, bem como no relatório descritivo acima, todas as frases de transição tais como “que compreende”, “que inclui”, “que porta”, “que tem”, “que contém”, “que envolve”, “que man- tém”, “composto por” e similares são para serem entendidas como sendo abertas, isto é, como significando que inclui mas não se limitando a. Somente as frases transicionais "que consiste em" e "que consiste essencialmente em" deverão ser frases transicionais fechadas ou semi- fechadas, respectivamente, como apresentado no Manual do Escritório de Patentes de Procedimentos de Examinação de Patente dos EUA, Seção 2111.03.

[00305] Os termos “cerca de” e “substancialmente” precedendo um valor numérico significam ±10% do valor numérico recitado.

[00306] Onde uma faixa de valores é fornecida, cada valor entre as extremidades superior e inferior da faixa é especificamente contem- plado e descrito no presente documento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T manipulada que compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um ectodomínio que se liga espe- cificamente a PTK7.

2. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) inter- rompido.

3. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene beta-2- microglobulina (β2M) interrompido.

4. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo anti-PTK7.

5. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-PTK7.

6. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende as mes- mas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iv) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 84.

7. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 6,

caracterizada pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende as mes- mas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

8. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende a sequên- cia de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

9. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende adicionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coesti- mulador 41BB.

10. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3ζ.

11. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 ou uma sequência de nucleotídeos que compre- ende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idên- tica às SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

12. Célula T modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o CAR é inserido no gene TRAC interrompido.

13. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC in- terrompido compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o LHA e/ou RHA dentro de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91, a sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 92 ou 100 e/ou a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91.

14. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o gene β2M inter- rompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos sele- cionada a partir de qualquer um das SEQ ID NOs: 9 a 14.

15. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7.

16. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compre- ende um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização ci- toplasmático CD3ζ.

17. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido com- preende o ácido nucleico que codifica o CAR.

18. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que com- preende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrompido.

19. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que com- preende uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrrompido.8

20. Célula T manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 e codifica um CAR que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

21. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato que a célula T é uma cé- lula T humana.

22. População de células que as compreendem células T manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

23. População, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zada pelo fato de que pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

24. População, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zada pelo fato de que pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

25. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 22 a 24, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das célu- las T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína do receptor de células T (TCR).

26. População, de acordo com a reivindicação 25, caracteri- zada pelo fato de que pelo menos 90% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína TCR.

27. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 22 a 26, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das célu- las T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína β2M.

28. População, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zada pelo fato de que pelo menos 70% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína β2M.

29. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 22 a 28, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de cé- lulas cancerosas que expressam PTK7, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancero- sas da população.

30. População, de acordo com a reivindicação 29, caracteri- zada pelo fato de que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que ex- pressam PTK7, induzirem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

31. População, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, ca- racterizada pelo fato de que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNγ.

32. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 31, caracterizada pelo fato de que a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1.

33. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 32, caracterizada pelo fato de que as células cancerosas com- preendem células de sarcoma.

34. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 32, caracterizada pelo fato de que as células cancerosas com- preendem células de câncer de mama, células de câncer de ovário, cé- lulas de câncer pulmonar de células pequenas e/ou células de câncer de cólon.

35. População, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 22 a 34, caracterizada pelo fato de que, quando administrada in vivo a um indivíduo, não induz toxicidade no indivíduo.

36. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene β2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7.

37. População de células, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compre- ende um domínio coestimulador CD28 e um domínio citoplasmático CD3ζ.

38. População de células, de acordo a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que o gene TRAC interrompido compre- ende o ácido nucleico que codifica o CAR.

39. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem:

(i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que com- preende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-PTK7, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ; e (ii) um gene β2M interrompido.

40. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas com- preendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC inter- rompido compreende um ácido nucleico que codifica um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 e codifica o CAR de SEQ ID NOs: 50, 52, 66, 73 ou 80; e (ii) um gene β2M interrompido.

41. Método, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da população de células T manipuladas, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 40, a um indivíduo.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um câncer.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leu- cemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon,

glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, carac- terizado pelo fato de que o câncer compreende células cancerosas que expressam PTK7.

46. Método para produzir uma célula T manipulada, caracte- rizado pelo fato de que compreende: (a) entregar a uma célula T (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA que alveja um gene TRAC e (iii) um vetor que compreende um modelo doador que compreende um ácido nucleico que codifica um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a PTK7; e (b) produzir uma célula T manipulada que tem um gene TRAC interrompido e que expressa o CAR.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o gRNA que alveja o gene TRAC compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, carac- terizado pelo fato de que compreende adicionalmente entregar à célula T um gRNA que alveja o gene β2M.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o gRNA que alveja o gene β2M compreende a sequên- cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou alveja a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de que o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-PTK7.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PTK7 é um fragmento variável de ca- deia única (scFv) anti-PTK7.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas regiões de- terminantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de ca- deia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de refe- rência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 55 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 56, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 69 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 70, (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 76 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 77, ou (iv) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 83 e um VL es- tabelecido como SEQ ID NO: 84.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o scFv anti-PTK7 compreende a sequência de amino- ácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 54, 68, 75 ou 82.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 54, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende adicional- mente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende adicionalmente um domínio de si- nalização citoplasmática CD3ζ.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 56, caracterizado pelo fato de que o CAR é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112 ou uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 90% idêntica às SEQ ID NOs: 49, 51, 65, 72, 79 ou 112.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 57, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o CAR é flanqueado pelos braços de homologia esquerdo e direito do gene TRAC.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 58, caracterizado pelo fato de que o modelo de doador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um das SEQ ID NOs: 63, 64, 71, 78 ou 91.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 59, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyoge- nes.

61. Célula T modificada manipulada, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 60.

62. População de células, caracterizada pelo fato de que compreende a célula T manipulada, como definida na reivindicação 61.

63. Método para tratar o câncer em um indivíduo, caracteri- zado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo da po- pulação de células, como definida em em qualquer uma das reivindica- ções 22 a 40 ou 62.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer ute- rino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer nasofaríngeo, câncer pulmonar de células não peque- nas (NSCLC), glioblastoma, neuronal, sarcomas de tecidos moles, leu- cemia, linfoma, melanoma, câncer de cólon, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma cerebral, carcinoma hepatocelular, hepatocolangiocarci- noma hepático, osteossarcoma, câncer gástrico, carcinoma de célula escamosa esofágico, câncer de pâncreas em estágio avançado, adeno- carcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa pulmonar, câncer de célula pequena pulmonar, carcinoma renal e câncer biliar intra-hepá- tico.

65. Método, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, carac- terizado pelo fato de que o câncer compreende células cancerosas que expressam PTK7.