KR102546839B1 - 키메라 항원 수용체를 이용한 t 세포 악성종양의 치료를 위한 car-t 세포의 유전자 편집 - Google Patents

키메라 항원 수용체를 이용한 t 세포 악성종양의 치료를 위한 car-t 세포의 유전자 편집 Download PDF

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매튜 쿠퍼
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워싱턴 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 T 세포 악성종양에 의해 발현된 항원을 표적으로 하는 동족살해-내성 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포의 사용을 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체를 이용한 T 세포 악성종양의 치료를 위한 CAR-T 세포의 유전자 편집
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 일련번호 62/370,485(출원일: 2016년 8월 3일), 미국 가출원 일련번호 62/482,570(출원일: 2017년 4월 6일) 및 미국 가출원 일련번호 62/505,614(출원일: 2017년 5월 12일)의 유익을 주장하고, 이들에 관한 것이며, 이들 기초 출원은 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 원용된다.
본 발명의 분야
본 출원은 일반적으로 T 세포 요법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 조작된 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)-T 세포 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 개시된 조성물 및 방법은 특히 골수 악성종양 및 림프구 악성종양의 치료에 유용하다.
서열목록에 대한 참조
서열목록의 종이 사본 및 동일 서열목록의 컴퓨터 판독 가능 형태가 이하에 첨부되며 그리고 본 명세서에 참고로 원용된다. 컴퓨터 판독 가능 형태로 기록된 정보는 37 C.F.R. 1.821(f)에 따라서 기록된 서열목록과 동일하다.
T 세포는, 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 키메라 항원 수용체 T 세포는 B 세포 악성종양에 대해서 이례적인 임상적 효능을 입증한다. 그러나, T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 세포 요법의 개발은, 부분적으로는 악성 T 세포와 효과기 T 세포 간의 표적 항원의 공유된 발현으로 인해 문제가 있는 것으로 입증되었다. CAR-T 세포 상에서의 표적 항원의 발현은 CAR-T 세포의 동족살해 및 효능의 상실을 유도할 수 있고, 그리고 임상적 유익을 저감시킬 수 있다. 따라서, 동족살해를 유도하지 않지만 T 세포 악성종양의 치료에 효율적인 CAR-T 세포가 필요하다.
일 양상에 있어서, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)를 제공하되, 여기서 CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 악성 종양 또는 암 상에서의 표면-발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 양상에서, 항원은 악성 T 세포 상에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항원은 CD7, CD5, CD2, CD30 또는 CD4일 수 있다. CAR-T 세포는 또한 자살 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, CAR-T 세포는 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(T-cell Receptor Alpha Chain: TRAC)에 대한 변형을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 악성 종양을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 복수의 키메라 항원 수용체 T(chimeric antigen receptor T: CAR-T) 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 CAR-T 세포는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하고, CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 대상체의 악성 종양 또는 암 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 양상에 있어서, 항원은 악성 T 세포 상에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항원은 CD7, CD5, CD2, CD30 또는 CD4일 수 있다. 복수의 CAR-T 세포는 또한 자살 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 복수의 CAR-T 세포는 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형을 포함할 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 예방 또는 저감하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 CAR-T 세포는 (a) 동일한 키메라 항원 수용체 및 (b) 자살 유전자 및/또는 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함하며; CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 대상체의 악성 종양 또는 암 상에서 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 양상에 있어서, 항원은 악성 T 세포 상에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항원은 CD7, CD5, CD2, CD30 또는 CD4일 수 있다. 추가의 양상에 있어서, 대상체는 동종(allogenic) CAR-T 세포 요법의 필요가 있을 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 동종 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 동종반응성(alloreactivity)을 예방 또는 저감시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 CAR-T 세포는 (a) 동일한 키메라 항원 수용체 및 (b) 자살 유전자 및/또는 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 하는 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)의 변형을 포함하고; CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 대상체의 악성 종양 또는 암 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 양상에 있어서 항원은 악성 T 세포 상에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항원은 CD7, CD5, CD2, CD30 또는 CD4일 수 있다.
본 개시내용의 추가의 양상 및 반복은 이하에 포함된다.
본 출원 파일은 컬러로 수행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 가진 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용을 지불 시 특허청에서 제공될 것이다.
도 1은 조작된 CAR-T 세포의 개략도를 예시한다.
도 2는 CD7 좌위의 유전자 편집이 야생형 (WT) T 세포와 비교해서 T 세포의 90% 미만에서 CD7 발현의 손실을 초래하는 것을 도시한다.
도 3a는 CD7 유전자 편집된 CD7 CAR-T(CD7ΔCART7) 세포가 시험관내에서 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 세포의 CD7 양성 MOLT 3 세포를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다.
도 3b는 CD7ΔCART7이 시험관내에서 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 세포의 CD7 양성 HSB-2 세포를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다.
도 4a 내지 도 4d는 CD7ΔCART7이 생체내에서 CD7 양성 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 세포를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다. 도 4a는 치료 스케줄을 예시하고, 도 4b는 대조군과 비교해서 CD7-CAR 마우스에서의 종양의 저감을 예시하고, 도 4c는 마우스로부터의 총 광자가 대조군과 비교해서 CD7 CAR 마우스에서 감소하는 것을 예시하며, 도 4d는 CD7 CAR-T 세포를 공급받은 마우스가 CD19 CAR-T 세포로 처리된 마우스보다 유의하게 더 길게 생존하는 것을 예시한다.
도 5a 내지 도 5j는 CART7 유도된 동족살해를 예시한다. 도 5a는 항-CD7-CAR 작제물 및 항-CD19-CAR 작제물의 개략도를 도시하고, 도 5b는 항-CD3/CD28 비드의 존재 하에 50 U/㎖ IL-2 및 10ng/㎖ IL15로 보충된 Xcyte 배지에서 배양된 T 세포를 예시하며, 도 5c는, CART19와 대조적으로, CART7이 동족살해를 겪어, 형질도입 후 수일 내에 강인한 확장, 즉, 증식을 입증하는데 실패한 것을 예시하고, 도 5d는 CART7 세포가 CD4 표현형으로 편중되는 것을 예시하며, 도 5e는 WT 세포에 비해서 인델(indel)을 가진 서열분석 판독치의 백분율로서 gRNA 표적화 CD7의 편집 효율을 예시하고, 도 5f는 유세포분석에 의해 유전자 편집 효율을 결정하는 실험 설계를 예시하며, 도 5g는 FlowJo V10을 이용해서 분석된 유세포분석 데이터를 예시하고, 도 5h는 CD7g4를 이용한 유전자 편집 후의 CD7+였던 세포의 백분율을 예시하며, 도 5i는 비-상동 말단 접합을 검출하기 위하여 CD7g4를 이용한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 후의 CD7 좌위의 표적화된 심층 서열분석을 예시하고, 도 5j는 CD7g4를 이용한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 후의 원발성 T 세포의 생존능을 예시한다.
도 6a 내지 도 6g는 CD7ΔCART7이 시험관내 및 생체내에서 T-ALL 세포주를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다. 도 6a는 유전자 편집된 CAR-T 생성의 개요를 예시하고, 도 6b는 ViaStainTM을 구비한 Nexcelom Cellometer를 이용해서 결정된 바와 같은 세포 계수치를 예시하며, 도 6c는 렌티-GFP로 형질도입된 WT 세포(GFP+ T 세포)가 CD7ΔCART19에 비해서 CD7ΔCART7에 의해 효율적으로 추정되었음을 예시하고, 도 6d는 CD7ΔCART7이 MOLT-4, MOLT-3 및 HSB-2 세포에서 CD7ΔCART19에 비해서 CD7+ T-ALL 세포주를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시하며, 도 6e는 CD7ΔCART7 또는 CD7ΔCART19와 함께 CCRF-CEMCBR-GFP가 주입된 NSG 마우스를 치료하는 실험 설계를 묘사하고, 도 6f는 CD7ΔCART7-처치된 마우스가 CD7ΔCART19-처치된 마우스에 비해서 유의하게 연장된 생존율을 갖는 것을 예시하며, 도 6g는 CD7ΔCART7-처치된 마우스가 BLI 영상화에 의해 CD7ΔCART19-처치된 마우스에 비해서 유의하게 저감된 종양 부담을 갖는 것을 예시한다.
도 7a 내지 도 7g는 CD7 및 TRAC가 결여된 UCART7 세포가 시험관내에서 T-ALL 세포주를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다. 도 7a는 T 세포가 항-CD3/CD28 비드의 존재(비드 대 세포 비 3:1) 하에 50 U/㎖ IL-2 및 10ng/㎖ IL15가 보충된 Xcyte 배지에서 배양된 개략도를 예시한다. 활성화 후 +2일째에, 비드를 제거하고 4x106개의 T 세포를, 론자 뉴클레오펙터(Lonza nuceleofector)4DTM, 15㎍의 spCas9 mRNA, 20㎍의 CD7gRNA 및 20㎍의 TRACgRNA를 이용해서 전기천공하였다. CD3+ CAR-T는 제조사의 지시에 따라서 밀테니이(Miltenyi) 항-CD3 마이크로비드를 사용해서 +7일째에 결실되었고, 추가로 2일 동안 배양되었으며, 도 7b 내지 도 7c는 다중(Multiplex) 유전자 편집이 FACS 및 도 7d CD7 및 도 7e TRAC 좌위의 표적화된 심층-서열분석에 의해 결정된 바와 같이 TRAC 및 CD7의 고효율 이중 결실을 초래한 것을 예시하고, 도 7f는 CD7ΔCART7 및 UCART7이 잔류 비-유전자 편집된 T 세포 및 유전자 편집된 세포 상에서의 지속적인 CD7 표면 발현 둘 다의 동족살해로 인해 강인한 확장을 나타내지만 더 적은 세포를 산출할 공산이 있음을 예시하며, 도 7g는 UCART7이 낮은 표적비 대 효과기에서도 시험관내에서 CD7+ T-ALL 세포주를 사멸시키는 효율이 CD7ΔCART7과 동등한 것을 예시한다.
도 8a 내지 도 8b는 UCART7이 시험관내에서 원발성 환자 T-ALL 블라스트(blast)를 사멸시키는 것을 예시한다. CD7+ T-ALL을 지닌 3명의 개별적인 환자로부터 획득한 원발성 블라스트는 150nM 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지화시켰다. 표지화된 세포를 FACS 분석 전 24시간 동안 3벌로 CD7ΔCART7, UCART7, 또는 그들 각각의 CD19 대조군과 1:1 비로 공동-항온처리하였다. 어큐카운트 형광 비드(Accucount florescent bead)는 실제 세포 계수치를 결정하는데 사용되었다. 데이터는 길리오스 세포측정기(Gallios cytometer)를 이용해서 수집하였다. 도 8a는 대표적인 FACS 플롯을 예시하고, 도 8b는 CD7ΔCAR7 및 UCART7이 CD7ΔCAR19 및 UCART19에 비해서 T-ALL 블라스트를 효율적으로 사멸시키는 것을 예시한다.
도 9a 내지 도 9f는 UCART7이 이종 GvHD를 유도하는 일 없이 생체내에서 원발성 환자 T-ALL 블라스트를 사멸시키는 것을 예시한다. 도 9a는 실험 설계를 예시하고, 도 9b는 종양 세포와 T 세포 둘 다를 도시하기 위하여 제공된 혈액 분석의 대표적인 유세포분석을 예시하며, 도 9c는 혈액 중 총 마우스 및 인간 CD45 세포로부터의 종양 세포의 백분율을 도시하고, 도 9d는 비장 내 총 마우스 및 인간 CD45 세포로부터의 종양 세포의 백분율을 도시하며, 도 9e는 Cooke에 따라서 등급화된 임상 GvHD 점수를 도시하고 도 9f는 WT T 세포, TRACΔT 세포, UCART7 및 UCART19의 주입 후의 마우스의 대표적인 화상을 도시한다.
본 개시내용의 맥락에서, 동족살해는 CAR-T 세포가 표적화된 CAR-T 세포와 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하는 다른 CAR-T 세포의 표적이 되고 이에 의해서 사멸될 경우 일어나는데, 그 이유는 표적화된 CAR-T 세포가 두 T 세포 상의 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식된 항원을 발현하기 때문이다. 당업계에서 공지된 이 문제를 극복하기 위하여, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하며, 여기서 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되어 있다. 본 개시내용의 CAR-T 세포는 T 세포의 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합된 항원이 결여되어 있기 때문에, T 세포는 "동족살해-내성(fratricide-resistant)"으로 지칭된다. 본 개시내용은 또한 상기 T 세포를 조작하는 방법 및 이의 용도를 포함한다.
본 발명의 각종 양상은 이하의 부문들에서 더욱 상세히 기재된다.
I. CAR-T 세포
본 개시내용의 일 양상은 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 포함하되, 여기서 T 세포는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 즉, 동족살해-내성 CAR-T 세포이다.
CAR-T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 그리고 당업계에서 일반적으로 사용되는 어구 "키메라 항원 수용체(CAR)"는, 세포외 도메인에 항원의 결합 시 특화된 기능을 수행하도록 세포에 지시하는 세포내 도메인에 결합된 항원-특이적 세포외 도메인을 갖는 재조합 융합 단백질을 지칭한다. 용어 "인공 T-세포 수용체", "키메라 T-세포 수용체" 및 "키메라 면역수용체"는 각각 본 명세서에서 용어 "키메라 항원 수용체"와 호환 가능하게 사용될 수 있다. 키메라 항원 수용체는, MHC-독립적 항원에 결합하고 그리고 그들의 세포내 도메인을 통해서 활성화 신호를 변환하는 그들의 능력에 의해 다른 항원 결합제와는 구별된다. CAR의 세포외 및 세포내 부분은 이하에 더욱 상세히 논의된다.
키메라 항원 수용체의 항원-특이적 세포외 도메인은 항원, 전형적으로 악성 종양의 표면-발현된 항원을 인식하고 특이적으로 결합한다. 항원-특이적 세포외 도메인은, 예를 들어, 0.1pM 내지 약 10μM, 바람직하게는 약 0.1pM 내지 약 1μM, 더 바람직하게는 약 0.1pM 내지 약 100nM의 친화도 상수 또는 상호작용 친화도(KD)로 항원에 결합할 경우 항원에 특이적으로 결합한다. 상호작용 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 개시내용의 CAR에서 사용하기에 적합한 항원-특이적 세포외 도메인은 임의의 항원-결합 폴리펩타이드일 수 있고, 매우 다양한 것들이 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 경우에, 항원-결합 도메인은 단쇄 Fv(scFv)이다. 기타 항체 기반 인식 도메인(cAb VHH(낙타과 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화된 버전, IgNAR VH(상어 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화된 버전, sdAb VH(단일 도메인 항체 가변 도메인) 및 "낙타화된" 항체 가변 도메인이 사용하기에 적합하다. 몇몇 경우에, T-세포 수용체(TCR) 기반 인식 도메인, 예컨대, 단쇄 TCR(scTv, V.알파.V.베타르 함유하는 단쇄 2-도메인 TCR)이 또한 사용하기에 적합하다.
적합한 항원은 T 세포-특이적 항원 및/또는 T 세포에 특이적이지 않은 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, CAR-T 세포의 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합된 항원, 및 CAR-T 세포가 결여된 항원은 악성 T 세포 상에 발현된 항원, 더 바람직하게는 비-악성 T 세포와 비교해서 악성 T 세포 상에 과발현된 항원이다. "악성 T 세포"는 T-세포 악성 종양으로부터 유래된 T 세포이다. 용어 "T-세포 악성 종양"은 T-세포 전구체, 성숙 T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 유래된 악성종양의 광범위한 고도로 이질적인 그룹화를 지칭한다. T-세포 악성종양의 비제한적인 예는 T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종(T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma: T-ALL), T-세포 대형 과립 림프구(large granular lymphocyte: LGL) 백혈병, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1-양성(human T-cell leukemia virus type 1-positive: HTLV-1+) 성인 T-세포 백혈병/림프종(adult T-cell leukemia/lymphoma: ATL), T-세포 전림프구 백혈병(T-cell prolymphocytic leukemia: T-PLL), 및 각종 말초 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma: PTCL)(혈관면역모세포성 T-세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma: AITL), ALK-양성 역형성 대세포 림프종, 및 ALK-음성 역형성 대세포 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아님)을 포함한다. 예를 들어, 비제한적인 예로서, CD7, CD5, CD2, CD30 및 CD4가 악성 T 세포 상에서 발현된 적합한 항원일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD5에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD2에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD30에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD4에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인을 포함한다.
위에서 기재된 바와 같이, 일 실시형태에 있어서, 항원은 CD7이다. CD7은 T-세포 표면막-연관 당단백질이다. CD7은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 및 비-호지킨 T 세포 림프종(non-Hodgkin's T cell lymphoma: NHL)을 포함하는 T 세포 악성종양에서 과발현될 수 있다. 본 개시내용의 CAR-T 세포는 CD7을 과발현하는 악성 T-세포를 표적화하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 키메라 항원 수용체는 또한 항원-특이적 세포외 도메인에 항원 결합 시 T 세포에 세포내 신호를 제공하는 세포내 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 키메라 수용체가 발현되는 T 세포의 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포분해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 미경험, 기억 또는 기억-유형 T 세포의 효과기 기능은 또한 항원-의존적 풀링을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 도메인"은 세포외 도메인에 항원의 결합 시 효과기 기능 신호를 변환하고 특화된 기능을 수행하도록 T 세포에 지시하는 CAR의 부분을 지칭한다. 적합한 세포내 도메인의 비제한적인 예는 T-세포 수용체의 제타 사슬 또는 이의 상동체 중 임의의 것(예컨대, 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB 1 사슬, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합, 예컨대, CD3.제타. 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, 및 이들의 조합뿐만 아니라 기타 유사한 분자 및 단편을 포함한다. 활성화 단백질의 계열의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분, 예컨대, Fc.감마.RIII 및 Fc.엡실론.RI 등이 사용될 수 있다. 통상 전체 세포내 도메인이 사용될 것이지만, 많은 경우에, 전체 세포내 폴리펩타이드를 사용할 필요는 없을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된(즉, 절단된) 부분이 용도를 발견할 수 있는 정도까지, 이러한 절단된 부분은 효과기 기능신호를 여전히 변환시키는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 도메인은 효과기 기능 신호를 변환시키기에 충분한 세포내 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
전형적으로, 항원-특이적 세포외 도메인은 막관통 도메인에 의해 키메라 항원 수용체의 세포내 도메인에 연결된다. 막관통 도메인은 세포막을 횡단하고, CAR을 T 세포 표면에 고정시키고, 세포외 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 접속시키며, 따라서, T 세포 표면 상에 CAR의 발현에 영향을 미친다. 키메라 항원 수용체는 또한 하나 이상의 공자극 도메인 및/또는 하나 이상의 스페이서를 더 포함할 수 있다. 공자극 도메인은 생체내에서 사이토카인 생산, 증식, 세포독성 및/또는 지속성을 증대시키는 공자극 단백질의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된다. 스페이서는 (i) 항원-특이적 세포외 도메인을 막관통 도메인에, (ii) 막관통 도메인을 공자극 도메인에, (iii) 공자극 도메인을 세포내 도메인에, 그리고/또는 (iv) 막관통 도메인을 세포내 도메인에 접속시킨다. 예를 들어, 항원-특이적 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 도메인의 혼입은 항원-결합 도메인의 유연성에 영항을 미칠 수 있고, 이에 따라서 CAR 기능에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 막관통 도메인, 공자극 도메인 및 스페이서는 당업계에 공지되어 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 CAR-T 세포는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 따라서 동족살해-내성이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, T 세포의 항원은 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 항원에 특이적으로 결합하지 않도록 변형된다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체에 의해 인식된 항원의 에피토프는 하나 이상의 아미노산 변화(예컨대, 치환 또는 결실)에 의해 변형될 수 있거나, 또는 에피토프는 항원으로부터 결실될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 항원의 발현은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감된다. 단백질의 발현을 감소시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 변형시키거나 대체시키는 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에 있어서, T 세포는 항원이 예컨대 항원을 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해 발현되지 않도록 변형된다. 상기 실시형태의 각각에 있어서, CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 하나 또는 바람직하게는 모든 항원에서 결여될 수 있다. 항원에서 결여되도록 T 세포를 유전자 변형시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적인 예는 위에서 제공되어 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, CRISPR/cas9 유전자 편집이, 예를 들어, 실시예 4 내지 8에 대한 방법에 기재된 바와 같이, 항원에서 결여되도록 T 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 CAR-T 세포는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 신호전달이 더욱 결핍될 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 CAR-T 세포에서 내인성 TCR 신호전달을 감소 또는 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CAR-T 세포에서 내인성 TCR 신호전달을 감소 또는 제거하는 것은 동종 T 세포가 CAR-T 세포를 생산하는데 사용될 경우 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease: GvHD)을 예방 또는 저감시킬 수 있다. 내인성 TCR 신호전달을 감소 또는 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, TCR 수용체의 일부분(예컨대, TCR 수용체 알파 사슬(TRAC) 등)을 변형시키는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. TRAC 변형은 TCR 매개 신호전달을 차단할 수 있다. 따라서, TRAC 변형은 생명을 위협하는 GvHD를 유도하는 일 없이 CAR-T 세포의 공급원으로서 동종 T 세포의 안전한 사용을 허용할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본 개시내용에 의해 포괄된 CAR-T 세포는 하나 이상의 자살 유전자를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "자살 유전자"는, 활성화된 경우, CAR-T 세포의 사멸을 초래하는, 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 CAR-T 세포에 도입된 핵산 서열을 지칭한다. 자살 유전자는 요구되는 경우 생체내에서 CAR-T 세포의 유효한 추적 및 제거를 용이하게 할 수 있다. 자살 유전자를 활성화시킴으로써 용이하게 된 사멸은 당업계에 공지된 방법에 의해 일어날 수 있다. 당업계에 공지된 적합한 자살 유전자 요법 시스템은, 각종 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-tk)/간시클로비어(ganciclovir)(GCV) 자살 유전자 요법 시스템 또는 유도성 카스파제 9 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 실시형태에 있어서, 자살 유전자는 CD34/티미딘 키나제 키메라 자살 유전자이다.
예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 CD7에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하며, 여기서 T 세포는 CD7이 결여되어 있다(예컨대, CD7ΔCART7 세포). 비제한적인 예에서, CD7의 결여는, (a) 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 CD7에 특이적으로 결합하지 않도록 T 세포에 의해 발현된 CD7의 변형, (b) 항원의 발현이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감되도록 하는 T 세포의 변형, 또는 (c) CD7이 (예컨대, CD7을 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해) 발현되지 않도록 하는 T 세포의 변형으로부터 기인되었다. 추가의 실시형태에 있어서, T 세포는, 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함한다. 비제한적인 예에서, CD7ΔCART7 세포에서 발현된 자살 유전자는 인간 CD34 cDNA의 세포외 및 막관통 도메인에 대해서 프레임내 융합된 변형된 인간-단순포진 바이러스-1-티미딘 키나제(TK) 유전자를 암호화하며, 차단된 TCR에서 초래되는 변형은 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형이다.
또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 CD5에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하되, 여기서 T 세포는 CD5가 결여되어 있다(예컨대, CD5ΔCART5 세포). 비제한적인 예에서, CD5의 결여는 (a) 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 CD5에 특이적으로 결합하지 않도록 T 세포에 의해 발현된 CD5의 변형, (b) 항원의 발현이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감되도록 하는 T 세포의 변형, 또는 (c) CD5가 (예컨대, CD5를 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해) 발현되지 않도록 하는 T 세포의 변형으로부터 기인되었다. 추가의 실시형태에 있어서, T 세포는, 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함한다. 비제한적인 예에서, CD5ΔCART5 세포에서 발현된 자살 유전자는 인간 CD34 cDNA의 세포외 및 막관통 도메인에 대해서 프레임내 융합된 변형된 인간-단순포진 바이러스-1-티미딘 키나제(TK) 유전자를 암호화하며, 차단된 TCR에서 초래되는 변형은 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형이다.
또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 CD2에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하되, 여기서 T 세포는 CD2가 결여되어 있다(예컨대, CD2ΔCART2 세포). 비제한적인 예에서, CD2의 결여는 (a) 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 CD2에 특이적으로 결합하지 않도록 T 세포에 의해 발현된 CD2의 변형, (b) 항원의 발현이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감되도록 하는 T 세포의 변형, 또는 (c) CD2가 (예컨대, CD2를 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해) 발현되지 않도록 하는 T 세포의 변형으로부터 기인되었다. 추가의 실시형태에 있어서, T 세포는, 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함한다. 비제한적인 예에서, CD2ΔCART2 세포에서 발현된 자살 유전자는 인간 CD34 cDNA의 세포외 및 막관통 도메인에 대해서 프레임내 융합된 변형된 인간-단순포진 바이러스-1-티미딘 키나제(TK) 유전자를 암호화하며, 차단된 TCR에서 초래되는 변형은 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형이다).
또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 CD30에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하되, 여기서 T 세포는 CD30이 결여되어 있다(예컨대, CD30ΔCART30 세포). 비제한적인 예에서, CD30의 결여는 (a) 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 CD30에 특이적으로 결합하지 않도록 T 세포에 의해 발현된 CD30의 변형, (b) 항원의 발현이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감되도록 하는 T 세포의 변형, 또는 (c) CD30이 (예컨대, CD30을 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해) 발현되지 않도록 하는 T 세포의 변형으로부터 기인되었다. 추가의 실시형태에 있어서, T 세포는, 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함한다. 비제한적인 예에서, CD30ΔCART30 세포에서 발현된 자살 유전자는 인간 CD34 cDNA의 세포외 및 막관통 도메인에 대해서 프레임내 융합된 변형된 인간-단순포진 바이러스-1-티미딘 키나제(TK) 유전자를 암호화하며, 차단된 TCR에서 초래되는 변형은 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형이다.
또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 CD4에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포를 제공하되, 여기서 T 세포는 CD4가 결여되어 있다(예컨대, CD4ΔCART4 세포). 비제한적인 예에서, CD4의 결여는 (a) 키메라 항원 수용체가 더 이상 변형된 CD4에 특이적으로 결합하지 않도록 T 세포에 의해 발현된 CD4의 변형, (b) 항원의 발현이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 T 세포에서 저감되도록 하는 T 세포의 변형, 또는 (c) CD4가 (예컨대, CD4를 암호화하는 유전자의 결실 또는 파괴에 의해) 발현되지 않도록 하는 T 세포의 변형으로부터 기인되었다. 추가의 실시형태에 있어서, T 세포는, 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함한다. 비제한적인 예에서, CD4ΔCART4 세포에서 발현된 자살 유전자는 인간 CD34 cDNA의 세포외 및 막관통 도메인에 대해서 프레임내 융합된 변형된 인간-단순포진 바이러스-1-티미딘 키나제(TK) 유전자를 암호화하며, 차단된 TCR에서 초래되는 변형은 내인성 T-세포 수용체 알파 사슬(TRAC)에 대한 변형이다.
T 세포에서의 CAR 설계, 전달 및 발현 방법, 그리고 임상-등급 CAR-T 세포 집단의 제조는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lee et al., Clin . Cancer Res., 2012, 18(10): 2780-90](전문이 참고로 본 명세서에 원용됨) 참조. 예를 들어, 조작된 CAR은 레트로바이러스를 이용해서 T 세포에 도입될 수 있고, 이것은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 표적 세포 게놈 내로 효율적으로 그리고 안정적으로 통합시킨다. 바이러스 벡터 생산을 위한 예시적인 방법은 실시예 4 내지 8에 대한 방법에서 기재된다. 당업계에 공지된 기타 방법은, 렌티바이러스 형질도입, 전이인자-기반 시스템, 직접 RNA 형질주입, 및 CRISPR/Cas 시스템(예컨대, 적합한 Cas 단백질, 예컨대, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Casl Od, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(또는 CasA), Cse2(또는 CasB), Cse3(또는 CasE), Cse4(또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 및 Cu1966 등을 사용하는 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
CAR-T 세포는, 대상체로부터 수집된 T 세포를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 T 세포의 임의의 적합한 공급원으로부터 생성될 수 있다. 대상체는 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 T 세포 악성 종양을 가진 환자, 또는 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 T 세포 악성 종양을 가진 대상체와 동일한 종의 대상체일 수 있다. 수집된 T 세포는 CAR-T 세포를 생성시키기 위하여 CAR로 형질도입되기 전에 당업계에 통상적으로 공지된 방법을 이용해서 생체밖에서 확장될 수 있다.
CAR-T 세포의 생성을 위하여 자가유래 T 세포의 사용은, 가능하다면, 단일 시도를 제공할 수 있다. CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체는, 악성종양의 치료를 받고 있을 수 있으며, 이 치료는 숙주의 T 세포의 개수 및 기능에 영향을 미칠 수 있고, 이에 따라서 CAR-T 세포로 효율적으로 조작될 수 있는 T 세포의 개수를 저감시킬 수 있다. 또한 T-세포 혈액학적 악성종양 및 정상 T 효과기는 동일 표면 항원의 다수를 공발현시켜 유전자 편집 및 렌티바이러스 형질도입을 위하여 악성 T 세포로부터 멀리 정상 T 효과기를 정화시키는 것을 어렵게 할 수 있다. 또한, 정제 과정이 절대적이지 않을 경우, 악성 T 세포 내에 CD7과 같은 표적 항원을 결실시킬 위험이 있을 것이고 그 결과 동족살해 CAR-T 세포에 대해서 잠재적으로 내성이 있는 오염된 T 세포 암의 집단을 생성시킬 수 있다. 따라서 악성 T 세포에 의한 정상 효과기 T 세포의 오염 위험을 피하기 위하여, T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 세포를 생성시키는 환자-유래 T 세포의 사용은 바람직하지 않을 수 있다.
이러한 오염 위험을 극복하기 위하여, T 세포 악성종양이 없는 다른 대상체(공여체 대상체)로부터의 T 세포가 동종 요법을 위한 CAR-T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 동종 요법을 위한 T 세포는 단일 대상체 또는 다수의 대상체로부터 수집될 수 있다. 혈액 세포를 수집하고 T 세포를 단리 및 농축시키고, 이들을 생체밖에서 확장시키는 방법은 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있다.
예시적인 실시형태에 있어서, CD7 특이적 CAR T-세포를 위한 CAR은 CD28 및 4-1BB 내부 신호전달 도메인을 가진 제3 세대 CAR 골격에 상업적으로 합성된 항-CD7 단쇄 가변 단편(scFv)을 클로닝시킴으로써 생성될 수 있다. 세포외 hCD34 도메인은 바이러스 형질도입 후의 CAR의 검출 및 항-hCD34 자성 비드를 사용한 정제를 둘 다 가능하게 하기 위하여 P2A 펩타이드 이후에 첨가될 수 있다. CD7에 특이적인 CAR을 생성하는 예시적인 방법은 실시예 4 내지 8에 대한 방법에서 기재되어 다. 유사한 방법은 다른 악성 T 세포 항원에 특이적인 CAR을 제조하기 위하여 후속될 수 있다.
추가의 양상에 있어서, CAR-T 세포 대조군이 작성될 수 있다. 대조군 CAR-T 세포는 악성 T-세포 상에 발현되지 않는 항원에 결합하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. CAR-T 세포 대조군이 결합하는 항원 대조군은 CD19일 수 있다. CD19는 T 세포 상이 아니라 B 세포 상에 발현된 항원이므로, CD19에 결합하도록 적합화된 세포외 도메인을 가진 CAR-T 세포는 T 세포에 결합하지 않을 것이다. 이들 CAR-T 세포는 CART19 세포라 불릴 수 있고, CART7 세포의 결합 효율 및 비-특이적 결합을 분석하기 위하여 대조군으로부터 사용될 수 있다.
II. CAR-T 세포를 사용하는 방법
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 악성 T 세포를 사멸시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 키메라 항원 수용체(CAR-T 세포)를 포함하는 유효량의 T 세포와 악성 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, CAR-T 세포는 키메라 항원 수용체가 특이적으로 결합하는 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 악성 세포 상에서 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 실시형태에 있어서, 악성 세포는 악성 T 세포이다. 추가의 실시형태에 있어서, 항원은 CD4, CD5, CD7, CD30, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 CAR-T 세포는 부문 I에서 상세히 기재되어 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, CAR-T 세포는 CD7ΔCART7 세포, CD5ΔCART5 세포, CD30ΔCART30 세포, CD4ΔCART4 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
악성 세포를 유효량의 CAR-T 세포와 접촉시키는 것은, 일반적으로 CAR-T 세포와 악성 세포를, CAR-T 세포의 키메라 항원 수용체가 악성 세포의 표면 상에서 그의 동족 항원을 결합시킬 수 있기에 충분한 시간 기간 동안 혼합하는 것을 포함한다. 이것은 시험관내 또는 생체밖에서 일어날 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은, 측정 가능한 효과, 예컨대, 항원-의존적 세포 증식, 사이토카인 분비, 세포독성 사멸 등을 초래하는 양을 의미한다. 유효량은, 당업계에 공지된 그리고/또는 실시예에서 더욱 상세히 기재된 방법을 이용해서 결정될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 T 세포 악성 종양을 가진 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, T 세포 악성 종양은 혈액학적 악성 종양이다. 몇몇 실시형태에 있어서, T 세포 악성 종양은 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 (T-ALL) 또는 T 세포 비호지킨 림프종(T-NHL)이다. 상기 방법은 치료적 유효량의 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 CAR-T 세포는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하고, CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식된 항원이 결여되며, 키메라 항원 수용체는 악성 T 세포 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 실시형태에 있어서, 항원은 CD4, CD5, CD7, CD30, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적합한 대상체는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다. 적합한 CAR-T 세포는 부문 I에서 상세히 기재되어 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, CAR-T 세포는 CD7ΔCART7 세포, CD5ΔCART5 세포, CD30ΔCART30 세포, CD4ΔCART4 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이 방법은 동종 CAR-T 세포 요법 또는 자가유래 CAR-T 세포 요법을 포함할 수 있지만, 동종 CAR-T 세포 요법이 부문 I에 논의된 이유로 바람직할 수도 있다. CAR-T 세포 요법은 면역요법, 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 요법에 의해 수반될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 비-T 세포 골수 또는 림프구 악성 종양을 지닌 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 CAR-T 세포는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하고, CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식된 항원에서 결여되며, 키메라 항원 수용체는 비-T 세포 골수 또는 림프구 악성 종양 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 적합한 대상체는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다. 적합한 CAR-T 세포는 부문 I에서 상세히 기재되어 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, CAR-T 세포는 CD7ΔCART7 세포이다. 상기 방법은 동종 CAR-T 세포 요법 또는 자가유래 CAR-T 세포 요법을 포함할 수 있지만, 동종 CAR-T 세포 요법이 부문 I에 논의된 이유로 바람직할 수도 있다. CAR-T 세포 요법은 면역요법, 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 요법에 의해 수반될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 예방 또는 저감시키기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체는 T-세포 악성 종양, 비-T 세포 골수 악성 종양, 또는 림프구 악성 종양을 가진 대상체이다. 상기 방법은 치료적 유효량의 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 CAR-T 세포는 (a) 동일한 키메라 항원 수용체 및 (b) 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함하고; CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식된 항원이 결여되며, 키메라 항원 수용체는 악성 종양 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 실시형태에 있어서, 악성 세포는 악성 T 세포이다. 추가의 실시형태에 있어서, 항원은 CD4, CD5, CD7, CD30, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 대상체는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다. 상기 방법은 동종 CAR-T 세포 요법 또는 자가유래 CAR-T 세포 요법을 포함할 수 있지만, 동종 CAR-T 세포 요법이 부문 I에 논의된 이유로 바람직할 수도 있다. CAR-T 세포 요법은 면역요법, 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 요법에 의해 수반될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 동종 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체에서 동종반응성을 예방 또는 저감시키기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 동종 CAR-T 세포 요법을 필요로 하는 대상체는 T-세포 악성 종양, 비-T 세포 골수 악성 종양, 또는 림프구 악성 종양을 갖니 대상체이다. 상기 방법은 치료적 유효량의 복수의 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 각각의 CAR-T 세포는 (a) 동일한 키메라 항원 수용체 및 (b) 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함하고; CAR-T 세포에는 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식된 항원이 결여되고, 키메라 항원 수용체는 악성 종양 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 각종 실시형태에 있어서, 악성 세포는 악성 T 세포이다. 추가의 실시형태에 있어서, 항원은 CD4, CD5, CD7, CD30, 또는 이들의 임의의 조합이다. 적합한 대상체는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다. CAR-T 세포 요법은 면역요법, 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 기타 요법에 의해 수반될 수 있다.
상기 양상들의 각종 실시형태에 있어서, 복수의 CAR-T 세포는 복수의 CD7ΔCART7 세포, 복수의 CD5ΔCART5 세포, 복수의 CD30ΔCART30 세포, 복수의 CD4ΔCART4 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, CAR-T 세포는 자살 유전자 및/또는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 하는 변형을 포함할 수 있다.
CAR-T 세포는 정맥내 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. CAR-T 세포는 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. CAR-T 세포는 정맥내 투여에 적합한 약제학적 조성물로 주사될 수 있다 적합한 IV 투여를 위한 적합한 약제학적 조성물은 당업계에 공지되어 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 성분은 주사된 CAR-T 세포의 생존능 및/또는 활성을 지속시키는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, CAR-T 세포 조성물은 CAR-T 세포를 지속시키기 위하여 IL-2를 포함할 수 있다.
CAR-T 세포는 유효 용량으로 투여될 수 있다. 유효 용량은 1회 또는 다회 용량일 수 있고, 목적하는 치료 효과를 내기에 충분하다. CAR-T 세포의 전형적인 용량은 약 1x 105 내지 5 x 107개 세포/Kg(요법을 공급받고 있는 대상체의 체중)의 범위일 수 있다. 유효 용량은 악성 종양의 병기, 대상체의 건강, 및 악성 종양의 유형에 기초하여 계산될 수 있다. 다회 용량이 투여되는 상황에서, 그 용량 및 용량 간 간격은 요법에 대한 대상체의 반응에 기초하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "유효 용량" 또는 "치료적 유효량"은, 치료적 또는 예방적 유익을 제공하는 양을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "치료 효과"는, 악성 세포의 수의 감소, 기대수명의 증가, 또는 악성 병태와 연관된 각종 생리학적 증상의 개선 등에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
실시예
이하의 실시예들이 본 개시내용의 각종 실시형태를 입증하기 위하여 포함된다. 후술하는 실시예에 개시된 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자라면, 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나는 일 없이 개시된 구체적인 실시형태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
실시예에 대한 도입부
T 세포 악성종양은 현재 효과적이거나 표적화된 요법이 없는 소아 및 성인 둘 다에서 높은 재발률 및 사망률을 갖는 엄청나게 충격적인 혈액암의 부류를 대표한다. 집중적인 다제 화학요법 섭생에도 불구하고, T 세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)을 가진 성인의 50% 및 소아의 75% 미만이 5년 넘게 생존한다. 초기 요법 후 재발한 자들에 대해서, 구제(salvage) 화학요법 섭생은 사례의 20 내지 40%에서 관해를 유도한다. 관련된 위험 및 독성을 가진 동종 줄기세포 이식은 오로지 치유적 요법이다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포는 유망한 암 면역요법이다. 이러한 표적화된 요법은 B 세포 백혈병 및 림프종을 가진 환자에서 관해 및 심지어 장기 재발 없는 생존을 유도하기 위한 커다란 잠재성을 제시하였다. 따라서, T 세포 악성종양에 대한 표적화된 요법은 상당히 충족되지 않은 의료적 필요를 나타낸다. 그러나, 몇 가지 문제는 T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 세포의 임상적 개발을 제한하였다. 첫 번째로, T 효과기 세포와 T 세포 악성종양 간의 표적 항원의 공유된 발현은 CAR-T 세포의 동족살해, 또는 자체-사멸을 초래한다. 두 번째로, 악성 세포에 의한 오염 없이 적절한 수의 자가유래 T 세포의 수확은 기껏해야 기술적 도전이고 엄청나게 비용이 드는 것이다. 세 번째로, 동종 공여체로부터의 유전자 변형된 CAR-T 세포의 사용은 면역-손상된 HLA-정합 또는 부정합 수용체에게 주입될 경우 생명을 위협하는 이식편-대-숙주 질환(GvHD)을 초래할 수 있다.
많은 T 세포 악성종양은 CD7을 과발현시켜, T 세포 암의 면역요법에 대한 매력적인 표적을 제공한다. 그러나, CAR-T를 조작하는데 사용되던 것들을 비롯하여 정상 T 세포도 CD7을 과발현시킨다(>86%). 따라서, CD7-표적화된 CAR-T 세포는 T 세포 동족살해를 유도하여, 치료적 잠재성을 제한한다. CRISPR/Cas9를 이용해서 CD7 및 T 세포 수용체 알파 사슬(TRAC)의 결실과 함께 CD7 표적화 CAR을 이용하여 이들 동일한 T 세포의 형질도입은 유의한 효과기 T 세포 동족살해 없이 악성 T 세포의 효율적인 표적화 및 사멸을 초래할 것이라는 가설이 세워졌다. TRAC 결실은 TCR 매개 신호전달을 차단하여, 생명을 위협하는 GvHD를 유도시키는 일 없이 그리고 CART7 요법에 대해 내성이 있는 CD7-결실된 악성 세포에 의한 오염의 위험 없이 CAR-T의 공급원으로서 동종 T 세포의 안전한 사용을 허용한다. 고효율 CRISPR/Cas9 유전자-편집을 이용해서, CD7 및 TRAC-결실된 CAR-T 표적화 CD7(UCART7)이 생성되었다. 이들 UCART7 세포는 이종 GvHD를 초래하는 일 없이 인간 T-ALL 세포주 및 환자-유래 원발성 T-ALL을 시험관내 및 생체내에서 효율적으로 사멸시킨다. 따라서, 처음으로, CAR-T 요법을 이용해서 T 세포 악성종양을 효율적으로 치료하기 위한 "기성품"(off-the-shelf) 전략에 대한 전임상 데이터가 제시된다.
실시예 1: CAR-T 세포의 유전자 편집
T-세포는 항원 인식 모이어티 및 T-세포 활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 유전자일 수 있다. CAR-T 세포는 B 세포 악성종양에 대한 이례적인 임상 효능을 입증한다. 그러나, T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 요법의 개발은, 부분적으로는 T 세포 악성종양과 효과기 T 세포 간에 공유된 표적 항원의 발현으로 인해 문제가 있는 것으로 입증되었다. CAR-T 세포 상에서의 표적 항원의 발현은 CAR-T의 동족살해 및 효능의 손실을 유도할 수 있고, 그리고 또한 임상적 유익을 저감시킬 수 있다. CAR-T의 유전자 편집을 통해서, CAR-T (및 T 세포 악성종양) 상에서 통상 발현되는 T 세포-특이적 표적 항원의 효율적인 결실이 유전자 편집된 CAR-T 세포를 사용한 종양 표적의 효율적인 사멸 및 상당한 "동족살해" 없는 CAR-T의 효율적인 확장을 초래할 수 있음이 입증되었다. CD7을 결실시키기 위하여 편집된 유전자를 갖는 T세포에서 CD7-CAR을 과발현하고 이중대립으로 결핍된 CD7을 갖는 T 세포 산물의 개발(도 1)이 기재된다. 이 접근법은 각종 T 세포 암 상에서 그리고 정상의 T 세포 상에서 발현된 CD5, CD4 및 CD2와 같은 다른 T 세포 항원을 포함하도록 확장될 수 있다. 또한, CAR을 발현하는 렌티바이러스 및 레트로바이러스 작제물에서의 자살 유전자의 혼입은 삽입성 돌연변이유발 및 백혈병유발 둘 다뿐만 아니라 장기 T 세포 및 NK 세포 혈구감소증도 방어하는데 사용될 것이다.
실시예 2: CD7 발현의 손실을 초래한 CD7 좌위의 유전자 편집
부착 분자 CD7은 T-ALL(T 급성 림프모구성 백혈병; 98%) 및 다른 T 세포 악성종양 상에서 고도로 발현되고 T 세포 암의 면역요법에 대한 매력적인 표적인 것을 입증한다. 그러나, CD7은 활성화된 T 세포 상에 고도로 발현된다(>86%). CRISPR/Cas9는 CAR-T 세포 상에서 CD7 발현을 결실시키는데 사용되었다. hCD7을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)는 워싱턴 대학 게놈 조작 코어에 의해 활성에 대해서 설계되고 검증되었다. 최대 활성을 갖는 gRNA는, gRNA 안정성을 증가시키기 위하여 변형된 염기(2'Ome 및 포스포로티에이트)를 편입하여 상업적으로 합성되었다. CD7 CAR을 생성시키기 위하여, 항-CD7 단쇄 가변 단편(scFv)이 상업적 유전자 합성을 이용해서 작성되었고, CD28 및 4-1BB 내부 신호전달 도메인을 갖는 제3세대 CAR(펜실베니아대학의 C. June박사에 의해 제공됨)의 골격에 클로닝되었다. 이 작제물은 바이러스 형질도입 후 CAR의 결실을 가능하게 하기 위하여 P2A 펩타이드를 통해서 인간 CD34(또는 CD34-TK75 키메라 자살 유전자; Eissenberg et al Molecular Therapy, 2015)의 세포질 절단 돌연변이체를 발현시키도록 변형되었다. 인간 원발성 T 세포는 CD7 gRNA(20㎍) 및 Cas9 mRNA(15㎍)와 함께 비드 제거 및 전기천공 전에 48시간 동안 항-CD3/CD28 비드를 이용해서 활성화되었다. 이어서, T 세포는 24시간 동안 유지되었다. 3일째에, T 세포에 CD7-CAR, CD7-CAR-P2A-CD34, CD7-CAR-P2A-CD34-TK75, 또는 대조 CD19-CAR 중 하나를 암호화하는 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 더욱 6일 동안 확장시켰다. 형질도입 효율 및 CD7 제거는 유세포분석에 의해 확인되었다. CD7 좌위의 유전자 편집은 대조 T 세포에 비해서 T 세포의 90% 초과에서 CD7 발현의 손실을 초래하였다(도 2).
실시예 3: CD7 CAR-T 세포는 CD7 양성 T-ALL 세포를 시험관내에서 효율적으로 사멸시킨다
CD7+ T-ALL 세포주를 시험관내에서 표적화하기 위하여 유전자 편집된(CD7 결실된) CD7 CAR-T 세포의 능력이 시험되었다. CD19 CAR-T 세포와 대조적으로, CD7 CAR-T 세포는 4시간 크롬 방출 검정에 의해 결정된 바와 같이 CD7+ 세포주 MOLT-3 및 HSB-2를 효율적으로 사멸시켰다(도 3). T-ALL을 생체내에서 근절시키는 CD7 결실된 CD7 CAR-T의 능력이 시험되었다. NSG 마우스는 CBR(click beetle red) 루시페라제를 발현하도록 변형된 5x105 MOLT-3 T-ALL 세포의 주입 전에 준-치명적으로 조사하였다(200cGy). CAR-T의 단일 용량(3x106)은 3일째에 i.v. 주사하였다. CD7 CAR-T 세포를 공급받은 마우스는 생물발광 영상화에 의해 평가된 바와 같이 CD19 CAR-T 세포를 공급받은 마우스에 비해서 유의하게 저감된 종양 부담을 지녔다. 또한, CD7 CAR-T 세포를 공급받은 마우스는 CD19 CAR-T 세포로 처리된 마우스보다 유의하게 더 길게 생존하였다(p=0.0018, 도 4). 이들 데이터는 T-ALL을 표적화하는 유망한 요법으로서 게놈 편집과 조합하여 T 세포 입양 요법을 뒷받침한다.
실시예 4 내지 8에 대한 방법
CAR 설계
CD7-CAR은 항-CD7 단쇄 가변 단편(scFv)의 상업적 유전자 합성을 사용해서 생성되었고 CD28 및 4-1BB 내부 신호전달 도메인을 가진 제3 세대 CAR의 골격에 클로닝되었다. Ef1α pELNS 렌티바이러스 플라스미드는 Carl June 박사(펜실베이나 대학)로부터의 일종의 선물이었다. 작제물은 바이러스 형질도입 후 CAR의 검출 및, 필요 시, 항-hCD34 자성 비드를 사용한 CAR-T의 정제를 둘 다 가능하게 하기 위하여 P2A 펩타이드를 통해서 hCD34의 세포외 도메인을 발현하도록 변형되었다. CART19는 비-표적화 대조군으로서 사용되었다.
바이러스 벡터 생산
레티바이러스를 생산하기 위하여, 렌티-X 293T 세포주(Takara Bio, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)에 CAR 렌티바이러스 벡터 및 패키징 플라스미드인 pMD.Lg/pRRE, pMD.G, pRSV.Rev 1,2를 제조사의 지시에 따라서 CalPhos의 포유류 형질주입 키트(Takara)를 사용해서 형질주입시켰다. 바이러스를 형질주입 후 36시간에 수확하고, 여과시켜 세포 찌꺼기를 제거하고, 25 000 rpm, 4℃에서 90분 동안 초원심분리(Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman Coulter, 인디아나주의 인다아나폴리스 소재)에 의해 농축시켰다. 바이러스를 인산염완충식염수 중에 재현탁시키고, 액체 질소로 동결시키고, 단일 사용 분취액으로 -80℃에서 보관하였다.
CRISPR / cas9 유전자 편집
가이드 RNA를 Washington University Genome Engineering & iPSC(서열번호 7 내지 16)에 의해 설계하고 활성에 대해 검증하였다. gRNA(400ng, Addgene 43860) 및 spCas9(500ng, Addgene 43945)를 암호화하는 플라스미드를 20㎕ 용액 P3(프로그램 FF-120) 중에서 뉴클레오펙터(nucleofector) 4D(Lonza, 뉴욕주 소재)를 사용해서 백혈병 세포주인 K562에 전기천공하였다.
RNA 가이드는 상업적으로 합성되어(Trilink Biotechnologies, 캘리포니아주의 샌디에이고 소재), 뉴클레아제 활성으로부터 보호하기 위하여 gRNA의 5' 및 3' 말단의 3개의 말단 염기에서 2'-O-메틸 및 3' 포스포로티오에이트 염기를 혼입시켰다. 서열번호 17 내지 19는 완전 가이드 서열이다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(spCas9) mRNA(5meC, Ψ)는 Trilink Biotechnologies로부터 구입하였다.
유전자 편집된 CAR-T
T 세포를 항-CD3/CD28 비드의 존재(비드 대 세포비 3:1) 하에 50 U/㎖ IL-2 및 10ng/㎖ IL-15가 보충된 Xcyte 배지에서 배양하였다. 활성화 후 +2일째에, 비드를 제거하고, 4x106개의 T 세포를 뉴클레오펙터 4D, 프로그램 EO-115를 사용해서 15㎍ spCas9(Trilink, 캘리포니아주 소재) 및 20㎍의 각각의 gRNA(Trilink)와 함께 100㎕ 완충액 P3에 전기천공하였다. 세포에 +3일째에 폴리브렌(polybrene)(Sigma Aldrich. 미주리주의 세인트루이스에 소재)(최종 농도 6㎍/㎖)의 존재 하에 CAR7 또는 CAR19(대조군) 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. 세포를 하류 실험에서 사용하기 전에 추가로 6일 동안 확장시켰다.
표적화된 심층 서열분석
CD7 좌위를 프라이머인 순방향 프라이머 GCCTGCGTGGGATCTACCTGAGGCA[서열번호 1] 및 역방향 프라이머 AGCTATCTAGGAGGCTGCTGGGGGC[서열번호 2]로 증폭시켰다. TRAC 좌위를 순방향 프라이머 TGGGGCAAAGAGGGAAATGA[서열번호 3] 및 역방향 프라이머 R_GTCAGATTTGTTGCTCCAGGC[서열번호 4]로 증폭시켰다. PCR 산물은 Illumia MiSeq 플랫폼(캘리포니아주의 샌디에이고 소재)을 사용해서 서열분석되었다. 편집 효율은 WT 세포로부터 얻어진 판독치와 정렬된 인델을 가진 서열결정 판독치의 백분율로서 결정하였다.
세포주
CD7 양성 T-ALL 세포주인, MOLT-3(ACC 84), MOLT-4(ACC 362), HSB-2(ACC 435) 및 CCRF-CEM(ACC 240)은 독일생물자원센터(DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell cultures)(독일 라이프니츠 소재)로부터 직접 얻었다. 이들 세포주를 마이코플라즈마 시험하고 DSMZ에 의해 특성규명하였다. CCRF-CEM 세포에 EF1αCBR-GFP 렌티바이러스를 형질도입하였다. GFP 양성 세포를, CCRF-CEMCBR-GFP 세포주를 확립시키기 위하여 선별하고 클로닝하였다.
크롬 방출 검정
CAR-T를 5% 소태아 혈청이 보충된 RPMI에서 25:1 내지 0.25:1의 범위의 효과기:표적[E:T]비에서 MOLT-3, MOLT4, HSB2 또는 CCRF 세포주(4 x 104개의 총 세포/웰)와 함께 항온처리하였다. 크롬-51 방출 검정은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다.
시험관내 원발성 T-ALL 사멸 검정.
동의한 환자로부터의 원발성 T-ALL은 Siteman Cancer Center(IRB #201108251)로부터 획득되었다. 사전 동의는 모든 대상체로부터 얻었다. 원발성 세포는, T-ALL 블라스트와 CAR-T 간의 구별화를 가능하게 하기 위하여 150nM 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터(CFSE)(Sigma Aldrich, 미주리주 소재)로 표지화시켰다. 표지화된 세포를 FACS 분석 전 24시간 동안 CD7ΔCART7, UCART7, 또는 그들 각각의 CD19 대조군과 1:1 비로 공동-항온처리하였다. 살아 있는 표적 세포의 절대 세포 계수치는 7-아미노악티노마이신 D 및 SPHERO 어큐카운트 플루오로스피어(AccuCount fluorosphere)(Spherotech Inc., 미국 일리노이주 레이크포레스트 소재)를 사용해서 유세포분석에 의해 정량화되었다. 데이터는 FlowJo V10을 사용해서 분석되었다.
동족살해 검정
WT T 세포는 항-CD3/CD28 비드의 존재(비드 대 세포비 3:1) 하에 50 U/㎖ IL-2 및 10ng/㎖ IL15가 보충된 Xcyte 배지에서 배양하였다. 비드를 48시간 후에 제거하고 T 세포에 GFP를 발현시키는 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. 형질도입 후 72시간에, T 세포를, 유세포분석을 사용해서 GFP에 대해서 선별하고, 50 U/㎖ IL-2 및 10ng/㎖ IL-15, 50 ng/㎖ SCF, 10 ng/㎖ IL-7, 및 20 ng/㎖ FL3TL이 보충된 Xcyte 배지에서 24시간 동안 1:1의 비에서 CD7ΔCART7 또는 CD7ΔCART19와 공동-항온처리하였다. 퍼센트 GFP+ 세포는 7-아미노악티노마이신 D를 사용한 유세포분석에 의해 정량화된, 총 생존 세포의 백분율로서 계산되었다.
T 세포 표현형 분석
배양된 T 세포를 PBS/0.1% BSA에서 세척하고, 4C에서 15분 동안 4% 래트 혈청이 보충된 50uL 브릴리언트 완충액(Brilliant Buffer(BD Biosciences)에서 1x106개 세포로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 이하의 항체 형광단 접합체(달리 언급되지 않는 한 모두 BD Biosciences로부터 입수): CD7 BV421, CD4 BV510, CCR4 BV605 (BioLegend), CD8 BV650, CD196 BV786(BioLegend), CD3 AF488, CD45RA PerCPCy5.5, CD183 PE, CD197 PE-CF594, CD185 PE-Cy7(BioLegend), 및 CCR10 APC(R&D Systems)를 사용해서 100㎕의 브릴리언트 완충액 중에서 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 형광단 접합된 항체의 전체 상세는 표 1에 나열되어 있다. 이어서, 세포를 PBS/0.1% BSA에서 2회 세척하고, 데이터는 ZE5(Yeti) 세포측정기(BioRad/Propel Labs) 상에서 획득하였다. 보상 및 분석은 형광 마이너스 원(fluorescence minus one: FMO) 대조군을 사용해서 FlowJo V10 (TreeStar) 상에서 수행하였다. 통계학적 분석은 본페로니 사후 상관(Bonferroni post-hoc correction)과 함께 2원분산분석(2-way ANOVA)을 사용해서 GraphPad Prism 7 상에서 수행하였다.
유세포분석에 사용된 접합된 항체의 상세.
항원 클론 형광색소 제조사 카탈로그 번호
hCD7 MT701 BV421 BD Biosciences 562635
hCD4 SK3 BV510 BD Biosciences 562970
hCD194/CCR4 L291H4 BV605 BioLegend 359418
hCD8 RPA-T8 BV650 BD Biosciences 563821
hCD196/CCR6 G034 BV785 BioLegend 353422
hCD3 UCHT1 AF488 BD Biosciences 557694
hCD45RA HI100 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 563429
hCD183/CXCR3 1C6 PE BD Biosciences 557185
hCD197/CCR7 150503 PE-CF594 BD Biosciences 562381
hCD185/CXCR5 RF8B2 PE-Cy7 BioLegend 356924
hCCR10 314305 APC R&D FAB3478a100
hCD34 QBEnd10 PE Beckman Coulter IM1250U
hCD4 RPA-T4(RUO) APC BD Biosciences 555349
hCD8-PECy7 HIT8a (RUO) PeCy7 BD Biosciences 555635
mCD45-BV510 30-F11 BV510 BD Biosciences 563891
hCD45 2D1 APC-H7 BD Biosciences 560274
hCD3 SK7 APC eBioScience 47-0036-42
동물 모델
동물 프로토콜은 의약 동물연구 위원회의 워싱턴 대학(Washington University School of Medicine Animal Studies Committee)의 규제를 준수하였다. 6 내지 10주령의 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)가 모든 마우스 실험에서 사용되었다. 수컷 마우스와 암컷 마우스 둘 다가 모두 실험에서 사용되었고 치료군으로 랜덤하게 할당되었다.
CCRF-CEM 이종이식 모델
CD7ΔCAR7의 항-백혈병 효과는 GFP 및 클릭-비틀 레드 루시페라제(CBR)를 과발현하도록 변형된 T-ALL 세포주인, CCRF-CEM을 사용해서 생체내에서 시험되었다. NSG 마우스에게는 0일째에 1 x 105 CCRF-CEMCBR-GFP를 꼬리정맥에 주사하였다. 수컷 마우스 및 암컷 마우스 둘 다 사용하였다. CAR-T(2 x 106)를 1일째에 CCRF-CEMCBR-GFP 세포를 공급받은 마우스에 주사하였다. 생체내에서 CCRF-CEMCBR-GFP 종양 성장을 추적하기 위하여, 마우스에게 50㎍/g D-루시페린(Biosynth, 미국 일리노이즈주의 이타스카에 소재)을 복강내에 주사하고 영상화하였다. 통계학적 고려사항: 로그-랭크(Mantel-Cox) 시험이 생존의 유의차를 결정하기 위하여 사용되었다. BLI 영상화에 의해 규정된 바와 같이 종양 부담의 통계학적 분석은, 반복된 측정 데이터에 대한 2원분산분석을 사용해서 결정하였고, 이어서 다중 비교를 위하여 스텝-다운 본페로니 조정을 사용하였다.
환자 유래 이종이식 모델
T-ALL PDX DFCI12는 Public Repository of Xenografts(PRoXe)로부터 얻었다. www.PRoXe.org. NSG는 0일째에 1x106개의 PDX DFCI12 세포를 접종하고 나서 +1일째에 2x106개의 UCART7, UCART19, TRACΔ 또는 WT T의 주입을 행하였다. 말초혈액 및 비장은 1주 후에 유세포분석에 의해 분석하였다. 적혈구는 적혈구 용해 완충액(Red Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma-Aldrich)을 사용해서 용해시키고 빙랭 PBS로 세척하였다. 샘플은 염색용 완충액(0.5% 소혈청 알부민 및 2mM EDTA가 보충된 PBS) 중에 세포를 재현탁시키고 이하의 형광색소-표지된 단클론성 항체; CD34-PE, CD7-BV421, CD4-APC, CD8-PECy7, mCD45-BV510 및 hCD45-APC-H7의 사전-적정된 포화 희석액으로 4℃에서 30분 동안 항온처리함으로써 유세포분석을 위하여 준비하였다. 항체의 완전한 상세는 표 1에서 찾을 수 있다. 항체는 달리 기술되지 않는 한 BD biosciences로부터 구입하였다. 데이터는 FlowJo V10을 사용해서 분석하였다.
비표적 (Off target) 분석
dsODN의 게놈 삽입
무딘 이중-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드(dsODN)는 2개의 변형된 올리고뉴클레오타이드(Integrated DNA technologies, 아이오와주 소재)를 어닐링시킴으로써 준비하였다.
Rev_5Phos/A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C(서열번호 5), 및 For_/5Phos/G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T*(서열번호 6)는 포스포로티오이에이트 연결을 나타내고 5phos는 5' 포스포릴화를 나타낸다. 원발성 T 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였지만, 100 p㏖ dsODN의 첨가를 행하였다. 세포는 수확 및 DNA 추출(DNAeasy Qiagen GmbH, 독일 소재) 전에 추가로 7일 동안 배양하였다.
dsODN 캡처
소형의 적당한 게놈 좌위의 하이브리드 캡처는 소정의 바이트 설계 및 프로토콜 변형 없이 어려운 것으로 입증될 수 있다. 삽입된 dsODN 서열에 상보적인 변형된 xGEN 록다운 프로브(Lockdown probe)를 사용하여 34 bp DNA dsODN을 함유하는 단편이 농축되었다. xGen 록다운 프로브는 하이브리드 풀 다운 효과를 최대화하기 위하여 경쟁적 혼성화 방법으로 관여하도록 설계되었다. 이 신규한 설계는 2 염기 오프셋 설계를 갖는 태그 영역을 인터로게이팅(interrogating)하는 다중 프로브로 구성된다. 부가적으로, 변형된 xGen 록다운 프로브는 표준 120 nt DNA xGen 록다운 프로브의 대략적인 융점 온도로 표적 서열 결합을 증대시키도록 설계되었다. 스트렙타비딘/바이오틴-매개 풀 다운 기전은 34bp 태그를 함유하는 gDNA의 농축된 서브세트의 결과를 증강시키도록 변형되었다.
자동화된 이중 인덱스화된 라이브러리는, 250bp 삽입물을 표적화하는 Sci클론 NGS 기기(Perkin Elmer) 상에서 KAPA HTP 라이브러리 키트(KAPA Biosystems)를 이용해서 250ng의 게놈 DNA로 작제되었다. 이중 인덱스된 KAPA 라이브러리프라이머 서열은 서열번호 20 내지 서열번호 54이다. 라이브러리는 8 PCR 사이클 동안 농축되었다. 16개의 라이브러리가 5㎍ 라이브러리 풀을 생성하는 풀링된 사전 캡처였다. 라이브러리 풀은 34bp ODN 서열을 표적화하는 주문제작 세트의 xGen 록다운 프로브(IDT)와 혼성화되었다. 캡처된 라이브러리 풀의 농도는 Illumina HiSeq4000 플랫폼에 적합한 클러스트 계수치를 생성하도록 qPCR(KAPA Biosystems)을 통해서 정확하게 결정되었다. 2x150 서열 데이터는 샘플당 평균 3.5Gb의 데이터를 생성하였다.
GUIDE-seq
표적화된 캡처 실험을 위하여 작제된 16개의 기존의 이중 인덱스화된 KAPA가 Guide-Seq 증폭을 위하여 사용되었다. PCR 반응은 샘플당 20ng의 기존의 라이브러리, KAPA HiFi Hotstart Readymix(KAPA Biosystems), 및 10μM 프라이머로 셋업되었다. PCR 조건은 다음과 같았다:
라이브러리 생성을 위한 PCR 사이클링 파라미터
50㎕ 반응을 위한 칵테일
25㎕　　　 KAPA HiFi Master Mix
1.0㎕　　 10μM P5
1.5㎕　　 10μM GSiP
x㎕　　　 20ng의 기존의 이중 인덱스된 라이브러리
y㎕　　　 뉴클레아제-무함유수
사이클 조건
5분 동안 95℃
[30초 동안 95℃, 2분 도안 70℃(-1℃/사이클), 30초 동안 72℃]의 15회 사이클
[30초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 30초 동안 72℃]의 10회 사이클
5분 동안 72℃
4℃ 유지
GUIDE-seq 인덱스화된 프라이머(GSiP)는, P7 접종 서열 및 8bp 샘플 인덱스를 혼입시키면서 센스 및 안티센스 Guide-seq ODN 서열을 표적화하기 위하여 설계되었다.
32개의 앰플리콘 라이브러리(16개 센스 및 16개 안티-센스)가 Illumina HiSeq4000 플랫폼을 위하여 적절한 클러스터 계수치를 생성하도록 qPCR(KAPA Biosystems)을 통해서 정확하게 정량화되었다. 앰플리콘 라이브러리를 정규화시키고 함께 풀링시켰다. 앰플리콘 라이브러리 풀(pool)과 표적화된 캡처 풀을 1레인의 HiSeq4000 2x150 서열 데이터(Illumina)를 생성하기 전에 등몰 농도로 조합하였다.
데이터 분석
서열은 BWA MEM v0.7.10을 사용해서 참조 게놈(build GRCh37-lite)과 정렬시켰다. guide-seq 패키지의 변형된 버전은 표적 서열이 적어도 10개 판독치의 지지체로 존재하는 10-bp 슬라이딩 창을 확인하는데 사용되었다. 비표적 정렬을 특성규명하기 위하여, 중단점의 양 측면에 측접하는 35bp의 참조 서열을 검색하여 관찰된 서열과 정렬시켰다. 부위는 유지될 순방향 및 역방향 둘 다에서 적어도 하나의 지지 판독치를 갖도록 요구되었다. 대조 샘플 중 하나에서 확인된 임의의 부위가 또한 제거되었다. 코드 이용 가능성: 변형된 guide-seq 코드는 github.com/chrisamiller/guideseq에서 입수 가능하다.
실시예 4: CD7-CAR-T 세포는 실질적인 동족살해를 유도한다.
CD7-CAR-T(CART7)를 생성하기 위하여, 항-CD7 단쇄 가변 단편(scFv)은 상업적으로 합성되었고, CD28 및 4-1BB 내부 신호전달 도메인을 가진 제3 세대 CAR 골격에 클로닝되었다. hCD34의 세포외 도메인은 바이러스 형질도입 후의 CAR의 검출과 항-hCD34 자성 비드를 사용한 정제 둘 다를 가능하게 하기 위하여 P2A 펩타이드 이후에 첨가되었다(도 5a). CAR-T 표적화 CD19(CART19)는 무관한 CAR-T 대조군으로서 사용되었다. T 세포의 형질도입 후에, CART19보다 유의하게 더 적은 CART7이 있었다(도 5c). 또한, CART7은 CART19와 비교할 때 CD4 표현형을 향하여 편향되었다(도 5d).
실시예 5: CRISPR/Cas9에 의한 CD7의 결실
동족살해를 예방하기 위하여, CD7은 CRISPR/Cas9 유전자-편집을 사용해서 CAR-T가 결여되어 있었다. CD7을 표적화하는 10개의 가이드 RNA(gRNA)가 설계되었고, 활성이 검증되었다(서열번호 7 내지 16). gRNA 및 Cas9를 암호화하는 플라스미드가 K562 백혈병 세포주에 전기천공되었다. CD7g4 및 CD7g10은 CD7 좌위를 가로지르는 표적화된 심층-서열분석에 의해 결정된 바와 같이 최고의 유전자-편집 효율을 지녔고(도 5e) 추가의 연구를 위하여 선택되었다. CD7g4 및 CD7g10 가이드는 상업적으로 합성되어 뉴클레아제 활성 15로부터 보호하기 위하여 gRNA의 5' 및 3'의 3개의 말단 염기에서 2'-O-메틸 및 3' 포스포로티오에이트 염기를 혼입시켰다. 인간 원발성 T 세포에서 CD7g4 및 CD7g10 둘 다에 의한 유전자-편집의 효능이 시험되었다. 활성화된 T 세포는 gRNA 및 Cas9 mRNA로 전기천공되었고(도 5f), 이어서 +7일째에 유세포분석에 의해 분석되었다. CD7g4는 CD7 발현을 결실시키고, CD7+ T 세포의 백분율을 98.8%±0.17로부터 9.1%±1.74까지 저감시킴에 있어서 가장 효과적이었다(도 5g 내지 도 5h). CD7 좌위의 효율적인 파괴는 CD7 서열 판독치의 89.14%에서 관찰된 인델을 가진 표적화된 심층-서열분석에 의해 확인되었다(도 5i). 생존능의 유일한 최소 손실은 24시간 후의 전기천공에서 관찰되었다(도 5j). CD7g4가 세포에서 CD7의 발현의 결실에서 가장 효과적이었으므로, 모든 향후의 실험은 CD7g4를 이용해서 수행되었다.
실시예 6: CD7ΔCART7은 동족살해를 예방하고 T-ALL를 시험관내 및 생체내에서 효율적으로 사멸시킨다.
CD7의 CRISPR/Cas9 유전자-편집에 이은 CART7 작제물을 이용한 CD7 편집된 T 세포(CD7Δ)의 형질도입은 도 5a에 도시된 바와 같이 수행하여 CD7ΔCART7을 생성하였다. 활성화된 T 세포는 3일째에 CAR7 또는 CAR19 대조군 중 하나로 바이러스 형질도입하기 전에 1일째에 spCas9 mRNA(15㎍) 및 CD7g4(20㎍)로 전기천공하였다. 세포를 추가로 6일 동안 배양하였다(도 6a). 유전자-편집 후 잔류 CD7 표면 발현에 기인하는 낮은 수준의 동족살해가 예상되었고, 이것은 CD7ΔCART19에 대한 CD7ΔCART7 수율의 보통의 저감으로 확인되었다(6일에 걸친 7.5-접힘 대 12.6-접힘 확장 도 6b). GFP로 형질도입된 자가유래 T 세포는 CD7ΔCART19에 의해서가 아니라 CD7ΔCART7에 의해 효율적으로 사멸되었고, 이것은 CAR-T가 CD7을 표적화할 경우 CD7 결실에 대한 요건을 확인해주었다(도 6c). 최종적으로, CD7ΔCART19와 대조적으로, CD7ΔCART7은 4시간 Cr 방출 검정에 의해 결정된 바와 같이 CD7+ T-ALL 세포주인 MOLT-4(70% CD7+), MOLT-3(96% CD7+) 및 HSB-2(99% CD7+)를 효율적으로 사멸시켰다(도 6d). T-ALL의 이종이식 모델에서 CD7ΔCART7의 활성을 평가하기 위하여, 1x105 클릭 비틀 레드 루시페라제(CBR) 표지된 CCRF-CEM T-ALL(FACS에 의해 99% CD7+) 세포가 +1일째에 2x10x6 CD7ΔCART7 또는 비표적화 CD7ΔCART19 대조 세포의 주입 전에 NSG 수용체에 I.V. 주사되었다(도 6e). CD7ΔCART19를 공급받은 마우스, 또는 종양만이 주사된 마우스와 대조적으로, CD7ΔCART7을 공급받은 마우스는 유의하게 연장된 생존율을 지녔고(도 6f) 생물발광 영상화(BLI)에 의해 결정된 바와 같이 저감된 종양 부담을 지녔다(도 6g). 환자 원발성 T-ALL 세포에 대한 CD7ΔCART7의 효능을 평가하기 위하여, CAR-T는 환자 유래 이종이식편에 대해서 시험되었다. 그러나, T-ALL 블라스트는 종양만을 공급받은 마우스에서 단지 검출 가능하였고, CD7ΔCART7 또는 CD7ΔCART19 중 하나 또는 조작되지 않은 T 세포를 공급받은 마우스에서 제거되었으며, 이것은 CD7ΔCART7이 비-형질도입된 인간 T 세포 및 CD7ΔCART19 둘 다와 유사한 수준의 동종반응성을 NSG 마우스에서 생체내에서 유지한 것을 시사한다.
실시예 7: CART7 내 TRAC 및 CD7의 이중 결실은 동족살해, GvHD를 예방하고 강인한 CD7 지향된 T-ALL 사멸을 유지한다.
치명적인 GvHD의 위험으로 인해, 비-자체 T 세포의 사용을 제한하는 동종반응성 장벽을 극복하기 위하여, CD7과 T 세포 수용체 알파 사슬(TRAC) 둘 다가 유전적으로 결실된 CAR-T를 생성하였다. TRAC를 표적으로 하는 gRNA 서열은 Osborn 등으로부터 얻었다. T 세포는 20㎍의 CD7g4, 20㎍의 TRACg 및 15㎍의 Cas9 mRNA로 비드 제거 및 전기천공하기 전 2일 동안 항-CD3/CD28 비드를 이용해서 활성화시켰다(도 7a). 다중 CRISPR/cas9 유전자-편집은, FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이 72.8%±1.92의 세포 중에 CD7 및 TRAC의 동시 결실을 초래하였다(도 7b 내지 도 7e).
당해 분야에서의 최근의 명명법으로 유지함에 있어서, CD7ΔTRACΔCART7은 범용 CART7 또는 UCART717로 지칭된다. UCART7은 T-ALL 세포주의 시험관내 사멸에서의 CD7ΔCART7과 같이 유효하였다. UCART7은 CD7ΔCART7과 비교해서 증식 결함을 지니지 않았지만, CD7ΔCART7에서 관찰되는 바와 같이, UCART7은 CD19 대조 CART와 비교해서 적당히 저감된 CAR-T 증식 및 수율을 초래하였다(도 7f). TRAC의 불완전한 유전자-편집이 잔류하는 잠재적 동종반응성 CD3+ CAR-T를 남기므로, 이들은 +8일째에 항-CD3 자성 비드를 사용하여 음성 선택에 의해서 결실되었다. UCART7과 CD7ΔCART7은 둘 다 CD7+ T-ALL 세포주인 MOLT3, CCRF-CEM 및 HSB-2를 시험관내에서 동등하게 높은 효율로 사멸시켰으며, 이는 CD7 및 TRAC의 이중 결실 시 효능의 손실이 없는 것을 입증한다(도 7g). 흥미롭게도, UCART19에 의한 비-특이적 사멸이 CD7ΔCART19와 비교할 때 높은 효과기 대 표적(E:T)비에서 감쇠되었는데, 이는 TRAC 결실 후의 동종반응성의 손실을 시사한다.
원발성 T-ALL 블라스트를 시험관내에서 사멸시키는 UCART7의 능력이 다음에 시험되었다. 원발성 T-ALL과 CAR-T 간의 항원 발현의 유사성으로 인해, 원발성 T-ALL 세포는 T-ALL을 CAR-T로부터 명확하게 구별하기 위하여 CFSE로 표지화시켰다. T-ALL 세포는 24시간 동안 1:1의 비에서 CAR-T로 항온처리되었다. CD7ΔCART7과 UCART7은 둘 다 각각의 CD19 대조 CAR-T에 비해서 모두 3가지 원발성 샘플을 가로질러 평균 95%의 T-ALL 블라스크를 사멸시켰으며(도 8a), 따라서, 시험관내에서 인간 원발성 T-ALL에 대해서 예외적인 효능을 입증한다.
WT T 세포, CD7ΔCART 및 CD7ΔCART19 중 어느 하나가 원발성 T-ALL PDX 보유 NSG 마우스에 주입될 경우의 항-종양 활성을 감안해서, 동종반응성 이식편-대-백혈병 효과(GvL) 또는 이종 GvHD 없이 생체내에서 원발성 T-ALL을 사멸시키는 UCART7의 능력이 시험되었다(도 9a). TRAC를 결실시키도록 편집된 T 세포의 수용체(TRACΔ)는 WT T 세포의 수용체와 비교할 때 혈액(도 9b 내지 도 9c) 및 비장(도 9d) 둘 다에서 높은 종양 부담을 나타내었다(+48일째 비장 p <0.0001, 혈액 p = 0.0001). 또한, 동종반응성 T 세포(도 9b) 및 심한 GvHD(평균 임상 GvHD 점수 = 5.66, p<0.0001 도 9e)의 상당한 확장이 WT T 세포의 수용체에서 관찰되었다. 이와 대조적으로, GvHD는 완전히 존재하지 않았고, T 세포는 TRACΔT 세포를 공급받은 마우스에서 검출 불가능하였다(p<0.0001, 도 9e, 도 9f). T-ALL 블라스트는, 이들 마우스에서의 총 CD45+ 세포의 56% 초과를 포함하는 T-ALL과 함께 UCART19를 공급받은 마우스에 비해서 UCART7을 공급받은 마우스의 말초 혈액에서 존재하지 않았으며(p<0.0001), PDX 단독 대조군에서 관찰된 높은 종양 부담과 동등하였다(도 9c). 일치하는 결과가 비장에서 관찰되었고(도 9d, UCART7 <3% T-ALL 대 UCART19 = 85.87% T-ALL; p<0.0001), TRACΔT 세포, UCAR19 및 PDX 단독 수용체 마우스가 비장비대증을 나타내었다. 이와는 아주 대조적으로, UCART7 수용체는 정상 크기의 비장을 가졌다. 또한, UCART19와 달리, UCART7은 hCD34 에피토프에 의해 검출되는 바와 같은 주사 후 6주에 검출 가능하였는데(도 9b), 이는 생체내에서 UCART7의 지속성을 입증한다.
실시예 8: 비표적 뉴클레아제 활성
CRISPR/Cas9를 이용한 고효율 유전자-편집은, 이들 T 세포의 생물학에 대해서, 이어서 UCART7 주입을 받은 수용체에 대해서 잠재적으로 결정적인 효과를 가질 수도 있었던 바람직하지 않은 비표적 유전자 변화를 유도할 수 있다. 인간 원발성 T 세포에서의 비표적 유전자 변화를 평가하는 2가지 상이한 기술이 사용되었는데, 이들은 둘 다 DNA 이중 가닥 파괴 시 소형의 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(dsODN)의 삽입에 의존한다. 제1 프로토콜은, PCR을 사용하는 삽입된 dsODN을 둘러싸는 표적 부위를 특이적으로 증폭시키기 위하여, 바코드부착된 인덱스의 내포 없이도, GUIDE-seq의 변형된 버전을 사용하였고; 제2 기술은 표적 dsODN 서열을 함유하는 좌위를 농축시키기 위하여 IDT(Integrated DNA Technologies) 캡처 프로브를 사용하였다. 두 기술은 삽입된 dsODN의 좌위를 식별하기 위하여 차세대 서열분석을 사용한다. 비표적 뉴클레아제 활성의 보나 파이드 부위(bona fide site)의 식별을 확실하게 하기 위하여, 각 조건(CD7g4, TRACg 및 조합된 CD7g+TRACg)이 세벌로 수행되어, 복제물당 평균 1.26x106(평균) 서열분석 판독치를 생성하였다. 10x 커버리지 초과의 양방향성 서열분석 판독치를 가진 좌위가 분석에 포함되었다. 먼저, 표적 부위를 식별하는 각 기술의 능력이 평가되었다. 두 GUIDE-seq 및 dsODN 캡처는 표적 활성의 식별된 부위를 강인하게 식별하였으며, 각각의 표적 부위는 각 조건에서 모두 3가지 복제물에 걸쳐서 300X 내지 22,000 X 커버리지를 생성하였다(표 2 및 표 3). 다음에, 동일한 엄격성(stringency)을 이용하는 비표적 뉴클레아제 활성이 평가되었다. GUIDE-seq는 다중 편집된 T 세포(CD7g4+TRACg)의 단일 비표적 부위를 드러냈었으며, RBM33 내 인트론 삽입은 모두 3개의 복제물에 존재한다. 표적 활성의 높은 커버리지에도 불구하고 dsODN 캡처에 의해 평가될 경우 비표적 부위는 관찰되지 않았다(표 2). 2개 이상의 복제물에 존재하는 잠재적인 비표적 부위를 포함하도록 GUIDE-seq 분석의 엄격성의 완화 시, 본 발명자들은 CD7에 대해서 추가로 4개의 잠재적인 비표적 부위, TRAC에 대해서 4개의 부위, 그리고 다중화된 CD7 및 TRAC 유전자-편집에 대한 잠재적인 비표적 활성의 하나의 추가의 부위를 식별하였다(표 2). GUIDE-seq에 의해 식별된 좌위는 dsODN 캡처를 이용해서 얻어진 데이터에 존재하지 않았고, 저감된 엄격성을 가진 이들 데이터의 분석 후에 확인된 비표적 뉴클레아제 활성의 추가의 부위도 아니었다. 이들 결과는 CD7g4 및 TRAC gRNA를 가진 원발성 T 세포의 고효율 CRISPR/Cas9 유전자-편집이 개별적으로 또는 조합하여 이들 플랫폼을 이용해서 유의한 비표적 활성과 연관되지 않는 것을 시사한다.
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실시예 4 내지 8에 대한 논의
이 보고에서는, CD7 및 TRAC 둘 다가 결여된 CRISPR/cas9 유전자 편집된 인간 T 세포의 생성이 입증되었다. CD7-CAR을 가진 이들 유전자 편집된 T 세포(UCART7)의 렌티바이러스 형질도입은 결과에 따른 동족살해 또는 T 세포 매개 이종 GvHD 없이 시험관내 및 생체내에서 CD7+ 원발성 인간 T-ALL 및 T-ALL 세포주의 효율적인 사멸을 허용한다. 이 작업은 부분적인 동족살해를 유도하는 이전의 CAR-T 표적화 T 세포 악성종양을 개선한다. Pinz 등은 CD4+의 유지된 CD8+ CAR-T-매개 세포독성이 완전한 CD4+ T 세포 손실을 초래하는 CD4-표적화된 CAR-T의 전임상 개발을 기술하였다. 마찬가지로, Mamonkin 등은 단지 과도적인 동족살해를 유도하여, 활성화된 WT T 세포 상에서 CD5의 거의 보편적인 발현에도 불구하고 충분한 CD5 CAR-T 확장을 허용하는 CD5-표적화된 CAR-T를 기술하였다.
CD7은 대부분의 NHL 및 T-ALL에서 높은 발현으로 인해 표적으로서 선택되었다. T 세포 악성종양에 부가해서, CD7은 대략 24%의 AML에서 발현되고, 백혈병 줄기세포의 마커인 것으로 여겨지며, 따라서 CART7은 림프구 악성종양뿐만 아니라 골수를 치료하는데 사용될 수 있었다. 게다가, 면역 기능에 손상을 주는 일 없이 T 세포에서 결실될 수 있었던 항원이 표적화될 필요가 있었다. CD7의 유전자 결실을 가진 마우스는 정상 림프구 집단을 이용해서 표현형적으로 정상이며(정상 수명을 지님), 동종 자극 및 유사분열촉진 자극에 반응하여 T 세포 활성을 유지한다. 따라서, CD7은 AML 및 T 세포 악성종양 둘 다를 표적으로 하는 CAR-T의 유전자-편집을 위한 이상적인 후보이다.
CART7이 CART7, 우세하게는 CD4+ 및 CD7-24를 생존시키면서 CD7 결실 없이 사용될 경우 광범위한 동족살해가 있었다. 이들 데이터는 그 자체로 CD7이 없는 CART7을 사용하는 중요성을 강조한다. 이러한 세포는 CD4 세포의 균형잡힌 확장을 가진 CD8 T 세포독성의 확장을 허용하면서 동족살해에 대한 최적의 내성을 제공한다. 실제로, 고효율 CRISPR/cas9-매개 CD7 유전자 결실은 CAR7 동족살해를 완화시켰고, CD7 단백질 손실(유전자 결실을 침체시킬 수 있음) 시, 세포는 완전한 동족살해 내성을 입증하였다.
CART7의 생성을 위하여 자가유래 T 세포의 사용은 단일 시도를 제공한다. 첫 번째로, 재발된 T-ALL 및 T-NHL을 지닌 환자는 흔히 퓨린 뉴클레오사이드 유사체(플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 넬라라빈(nelarabine)) 및 T 세포 세포독성 단클론성 항체(Campath)와 같은 T 세포 독으로 고도로 사전 처치된다. 따라서, T 세포의 수 및 기능은 현저하게 저감될 수 있고, 이에 따라서 치료적 유익을 위한 효율적인 생성, 충분한 수 및 CART7의 기능을 제한할 수 있다. 두 번째로, 대부분의 T-세포 혈액학적 악성종양 및 정상 T 효과기는 다수의 동일 표면 항원을 공발현시켜 유전자 편집 및 렌티바이러스 형질도입을 위하여 악성 T 세포로부터 떨어져서 정상 T 효과기를 정제시키는 것을 매우 어렵게 만든다. 정제 과정이 절대적이지 않을 경우, 악성 T 세포 내에 CD7을 결실시킬 위험이 있을 것이고 따라서 UCART7에 대해서 잠재적으로 내성이 있는 오염된 T 세포 암의 집단을 생성시킬 것이다. 그러므로, 악성 T 세포에 의한 정상 효과기 T 세포의 잠재적 오염 위험은 T 세포 악성종양에 대한 CAR-T 세포를 생성시키는 환자-유래 T 세포의 사용을 불가능하게 한다. 결과적으로, CD7ΔCART7은 TRAC를 편집해내어 GVHD를 유도할 위험 없이 동종 공여체 T 세포의 사용을 허용함으로써 더욱 변형되었다. UCART19의 인간 시도에서, 동종 공여체 T 세포로부터 생성된 CD19에 대한 TRAC 편집된 비-동종반응성 CAR-T의 최초의 성공에 이어서, 본 발명자들은, 고효율로 그리고 최소의 비표적 효과로, 다중 CRISPR/Cas9 유전자-편집에 의해 CD7 및 TRAC 둘 다를 성공적으로 결실시킨 UCART7을 개발하였다. UCART7은 CD7ΔCART7과 같이 효율적으로 T-ALL 세포주 및 원발성 환자 T-ALL을 시험관내에서 사멸시켰다. T-ALL PDX에 대해서 생체내에서 동종반응성 항-백혈병 활성을 입증했던 CD7ΔCART7과 달리, UCART7은 GvHD를 유도하는 일 없이 동종반응성과는 독립적으로 강인한 CAR7-매개 사멸을 입증하였다. 이것은 TRAC 결실이 CAR-매개 세포독성을 변경하지 않지만 GvHD를 완전히 예방하는 것을 시사한다.
T 세포에 부가해서, NK 세포는 또한 CD7을 발현한다. UCART7-매개 T 세포 및 NK 세포 사멸은 동종 UCART7 거부를 잠재적으로 예방 또는 제한할 수 있고 UCART7 지속성을 증가시킬 수 있다. 본 발명자들의 면역-결핍 PDX T 모델에서 UCART7 지속성의 관찰에도 불구하고, 임상 연구는 T 세포 신생물에 대해서 치료된 인간에서 UCART7 지속성을 완전히 특성규명하도록 요구될 것이다.
강인한 비표적 뉴클레아제 활성이 CD7, TRAC, 또는 다중 유전자-편집 후에 관찰되지 않았지만, 고충실도 Cas9(SpCAS9-HF1)의 최근의 개발은 바람직하지 않은 유전자 사건의 위험을 더욱 저감시킬 수 있다. 게다가, 최근에 보고된 바와 같이 TRAC 좌위 또는 잠재적으로 CD7 좌위 내에 직접 CAR의 삽입은, 바람직하지 않은 좌위 내로의 랜덤한 바이러스 백터 통합으로부터의 발암성 변형의 위험을 더욱 경감시킬 것이다. 나아가, 상기 벡터는 [18F] FHBG PET-CT 영상화를 사용한 유전자 변형된 T 세포의 효율적인 추적 및 T 세포의 생체내 제거 둘 다를 가능하게 하기 위하여 최초 인간 연구에서 이미 제시된 CD34-TK와 같은 자살 유전자의 혼입을 허용한다. 이 전략은 CRISPR/Cas9 유전자-편집 및 바이러스 통합으로부터 기인되는 잠재적인 독성 또는 발암성 변형에 대해서 보호할 것이다.
이 연구는 T 세포 악성종양에 대한 최초의 임상적으로 실행 가능한 입양 T 세포 유전자 요법을 제시한다. 구체적으로, 인간 T 세포의 CD7xTRAC 다중 유전자-편집에 이어서 제3 세대 CD7-CAR을 이용한 렌티바이러스 형질도입은 동족살해에 대해서 완전히 내성이 있고 생체내 동종반응성 또는 GvHD 잠재성을 나타내지 않는 UCART7을 초래하는 것을 나타낸다. 이것은 CAR-T의 공급원으로서 "기성품" 종양-무함유 동종 T 세포의 사용을 허용할 것이다. 인간 T-ALL 세포주 또는 원발성 인간 T-ALL PDX 종양을 보유하는 NSG 마우스에서의 이들 유전자 변형된 T 세포의 사용은 이종 GvHD의 증상이 없이 이들 종양의 생체내에서의 신속하고도 효율적인 제거를 초래한다. 이들 지견은 재발성 및 난치성 T 세포 혈액학적 악성종양을 가진 소아 및 성인의 치료를 위하여 특이적으로 이들 관찰을 병원으로 옮기는 추가의 노력을 보장한다.
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SEQUENCE LISTING <110> DIPERSIO, John F. COOPER, Matthew <120> GENE EDITING OF CAR-T CELLS FOR THE TREATMENT OF T CELL MALIGNANCIES WITH CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 047563-576545 <150> 62/370,485 <151> 2016-08-03 <150> 62/482,570 <151> 2017-04-06 <150> 62/505,614 <151> 2017-05-12 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 gcctgcgtgg gatctacctg aggca 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 agctatctag gaggctgctg ggggc 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 tggggcaaag agggaaatga 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 gtcagatttg ttgctccagg c 21 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; 5' PHOSPHORYLATION; AND PHOSPHOROTHIOATE AT POSITIONS 1, 2, 32 AND 33 <400> 5 ataccgttat taacatatga caactcaatt aaac 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; 5' PHOSPHORYLATION; AND PHOSPHOROTHIOATE AT POSITIONS 1, 2, 32 AND 33 <400> 6 gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 gatgctcgga cgccccacca ngg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 atgctcggac gccccaccaa ngg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 aggctgtctg cgggtcaggg ngg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 atcacggagg tcaatgtcta ngg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 tcagggaggg cggagcctgt ngg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 gacctccgtg atggcctggc ngg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 cgtgatggcc tggcaggtgt ngg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 gaggtcaatg tctacggctc ngg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 tgtctacggc tccggcaccc ngg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 gtagacattg acctccgtga ngg 23 <210> 17 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; GM AT POSITION 1; UM AT POSITION 97; AND PHOSPHOROTHIOATE AT POSITIONS 1, 2, 3, 97, 98 AND 99 <400> 17 guagacauug accuccguga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 18 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; 2'-O-METHYADENSOSINE AT POSITION 1; UM AT POSITION 97; AND PHOSPHOROTHIOATE AT POSITIONS 1, 2, 3, 97, 98 AND 99 <400> 18 aucacggagg ucaaugucua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 19 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 19 gagaaucaaa aucggugaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 20 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 20 caagcagaag acggcatacg agatcgcgat tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 21 caagcagaag acggcatacg agatgtgctg tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 22 caagcagaag acggcatacg agatatgaat gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 23 caagcagaag acggcatacg agatacggta gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 24 caagcagaag acggcatacg agattgcatt cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 25 caagcagaag acggcatacg agatgttttg ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 26 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 26 caagcagaag acggcatacg agataagggg ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 27 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 27 caagcagaag acggcatacg agatatcaag ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 28 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 28 caagcagaag acggcatacg agattaagtc ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 29 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 29 caagcagaag acggcatacg agatactcgc ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 30 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 30 caagcagaag acggcatacg agattggtcc ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 31 caagcagaag acggcatacg agattcccta ttgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 32 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 32 caagcagaag acggcatacg agattatgtt gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 33 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 33 caagcagaag acggcatacg agatacgcgt gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 34 caagcagaag acggcatacg agatgtggtt tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 35 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 35 caagcagaag acggcatacg agattatgcc gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctatac cgttattaac atatgacaac tcaattaaac 100 <210> 36 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 36 caagcagaag acggcatacg agattcagag ccgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 37 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 37 caagcagaag acggcatacg agattgaagc tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 38 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 38 caagcagaag acggcatacg agatcgtata tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 39 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 39 caagcagaag acggcatacg agatgtagca tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 40 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 40 caagcagaag acggcatacg agataactct acgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 41 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 41 caagcagaag acggcatacg agatgtgcgg acgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 42 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 42 caagcagaag acggcatacg agattcggag aagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 43 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 43 caagcagaag acggcatacg agatcgatgg cagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 44 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 44 caagcagaag acggcatacg agatcggttt gtgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 45 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 45 caagcagaag acggcatacg agatcgccgt atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 46 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 46 caagcagaag acggcatacg agatgttagg atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 47 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 47 caagcagaag acggcatacg agataaagga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 48 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 48 caagcagaag acggcatacg agataagcca tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 49 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 49 caagcagaag acggcatacg agatataaaa tggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 50 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 50 caagcagaag acggcatacg agattgcatg gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 51 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 99 <400> 51 caagcagaag acggcatacg agattacgta cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgttt aattgagttg tcatatgtta ataacggtat 100 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 19 <400> 52 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED; and phosphorothioate at position 69 <400> 53 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tgagctcaca ctctttccct acacgacgct 60 cttccgatct 70 <210> 54 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 54 gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cactatagcc tatctcgtat gccgtcttct 60 gcttg 65

Claims (33)

  1. 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)로서,
    CAR-T 세포는 CD7이 결여되고,
    키메라 항원 수용체는 CD7에 특이적으로 결합하며,
    CAR-T 세포는, 내인성 T 세포 수용체 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 내인성 T 세포 수용체 알파 사슬(TRAC)의 변형을 더 포함하는 것인, CAR-T 세포.
  2. 삭제
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  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 제1항의 CAR-T 세포를 포함하는, T 세포 악성 종양 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 T 세포 악성 종양은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia: T-ALL)인 것인, 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 T 세포 악성 종양은 비-호지킨 림프종인 것인, 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 CAR-T 세포는 골수 악성종양 및 림프구 악성종양을 치료하는데 사용되는 것인, 약학 조성물.
  12. 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포를 포함하는 T 세포 악성 종양 치료용으로 사용하기 위한 약학 조성물로서,
    각각의 CAR-T 세포는 동일한 키메라 항원 수용체를 포함하고,
    CAR-T 세포는 CD7이 결핍되고,
    키메라 항원 수용체는 CD7에 특이적으로 결합하며,
    내인성 T 세포 수용체 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 상기 CAR-T 세포는 내인성 T 세포 수용체 알파 사슬(TRAC)의 변형을 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 내인성 T 세포 수용체 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되며, 상기 CAR-T 세포는 동종반응성 또는 이식편대숙주병을 유도하지 않으며, 상기 CAR-T 세포는 동족 살해를 유도하지 않는 것인, 약학 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제12항에 있어서, 상기 T 세포 악성 종양은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (T-ALL) 또는 비-호지킨 림프종인, 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 청구항 제1항에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포를 제조하는 방법으로서, CRISPR/Cas9 를 사용하는 유전자 편집과 SEQ ID NO: 7에 의해 암호화된 서열을 포함하는 CD7 가이드 RNA에 의하여 CD7을 삭제하는 것을 포함하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 CD7 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 18을 포함하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  23. 청구항 제1항에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포를 제조하는 방법으로서,
    CRISPR/Cas9 유전자 편집 및 CD7 가이드 RNA를 사용하여 CD7을 삭제하는 단계; 및
    CRISPR/Cas9 유전자 편집 및 TRAC 가이드 RNA를 사용하여 TRAC를 삭제하는 단계를 포함하며,
    상기 CD7 및 TRAC의 편집은 단일 단계(즉, 다중 편집임)로 수행되는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CD7 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 7을 포함하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CD7 가이드 RNA가 SEQ ID NO: 18을 포함하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  26. 제23항 내지 제25중 어느 한 항에 있어서, TRAC gRNA가 SEQ ID NO: 19를 포함하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, CD7 및 TRAC의 이중 결실은 악성 T-세포 사멸에서 CAR-T 세포의 효능 손실을 야기하지 않으며, 상기 CAR-T 세포는 악성 T-세포 사멸에서 효능을 유지하는 것인, CAR-T 세포의 제조방법.
  28. 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)로서,
    CAR-T 세포는 CD7이 결핍되도록 유전적으로 변형되었으며,
    키메라 항원 수용체는 CD7에 특이적으로 결합하며,
    CAR은 4-1BB 공자극 도메인을 포함하며,
    CAR-T 세포는, 내인성 T 세포 수용체 매개 신호전달이 CAR-T 세포에서 차단되도록 유전적으로 변형된 내인성 T 세포 수용체 알파 사슬(TRAC)을 포함하는 것인, CAR-T 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 CAR은 CD7에 결합하는 scFv를 포함하는 것인, CAR-T 세포.
  30. 제28항에 있어서, 상기 CAR은 CD28 공자극 도메인을 더 포함하는 것인, CAR-T세포.
  31. 제28항에 있어서, 상기 CAR은 CD3ζ 효과기 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 것인, CAR-T 세포.
  32. 제28항에 있어서, T 세포가 T 세포 악성종양을 갖지 않는 공여자로부터 얻은 원발성 T 세포인 것인, CAR-T 세포.
  33. T-세포 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 청구항 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포를 포함하는 것인, 약학 조성물.
KR1020197006314A 2016-08-03 2017-08-03 키메라 항원 수용체를 이용한 t 세포 악성종양의 치료를 위한 car-t 세포의 유전자 편집 KR102546839B1 (ko)

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