TW202039829A - 改善之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於基於PD-1表現預先選擇TIL之方法以及用於擴增該等經預先選擇之PD-1陽性TIL以產生具有增強腫瘤特異性殺滅能力（例如增強的細胞毒性）之治療性TIL族群之方法。
Description
本發明關於改善之腫瘤反應性T細胞的選擇。
相關申請案的交互參照
此申請案主張美國臨時專利申請案62/756,006(2018年11月5日提出)、美國臨時專利申請案62/826,831(2019年3月29日提出)、美國臨時專利申請案62/903,629(2019年9月20日提出)及美國臨時專利申請案62/924,602(2019年10月22日提出)之優先權，彼等全文以引用方式併入本文中。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療大型(bulky)、難治性癌症對於預後不良病患代表一種強大的治療方案。Gattinoni,et al.
,Nat. Rev. Immunol. 2006, 6,
383-393。成功免疫療法需要大量的TIL，而商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增的技術、後勤及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2的TIL擴增及隨後的「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al.
,Science 2002, 298,
850-54；Dudley,et al.
,J. Clin. Oncol. 2005, 23,
2346-57；Dudley,et al.
,J. Clin. Oncol. 2008
,26,
5233-39；Riddell,et al.
,Science 1992, 257,
238-41；Dudley,et al.
,J. Immunother. 2003
,26,
332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如，200倍)的經照射的通常來自多個供體之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量的IL-2。Dudley,et al., J. Immunother. 2003, 26,
332-42。經歷REP程序的TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤病患中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受性參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的TIL製程受限於長度、成本、無菌性考量及本文所述之其他因子，使得該等過程之商業化潛力受到嚴重限制。雖然已有TIL之鑑定，例如，已顯示TIL表現各種受體，包括抑制性受體程序性細胞死亡1(PD-1；亦稱為CD279)(見Gros, A., et al., Clin Invest. 124(5):2246-2259 (2014))，但此資訊於發展治療性TIL族群的有用性尚未完全實現。有提供適用於商業規模製造且經法規核准用於多個臨床中心的人病患之TIL製程及基於該過程之療法的迫切需求。本發明藉由提供基於PD-1表現預先選擇TIL之方法來符合此需求，以獲得具有增強的腫瘤特異性殺滅能力(例如，增強的細胞毒性)之TIL。
本發明提供用於擴增TIL及產生治療性TIL族群之方法，該方法包括PD-1狀態預先選擇步驟。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；
(b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群；
(c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群；及
(f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；
b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群；
c) 藉由在包含IL-2、OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
d) 藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群。
在一些實施例中，「獲得(obtaining)」表示在方法及/或過程中所採用之TIL可直接衍生自樣本(包括來自手術切除、細針活體組織切片、粗針活體組織切片、小活體組織切片或其他樣本)作為方法及/或過程步驟的一部分。在一些實施例中，「接受(receiving)」表示在方法及/或過程中所採用之TIL可間接衍生自樣本(包括來自手術切除、細針活體組織切片、粗針活體組織切片、小活體組織切片或其他樣本)且接著在方法及/或過程中採用(例如，當步驟(a)以已經藉由不包括在部分(a)之分開過程自樣本衍生之TIL開始時，該TIL可被稱為「接受(received)」)。
在一些實施例中，在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係大於步驟(b)之培養基中APC數量。
在一些實施例中，在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係等於步驟(b)之培養基中APC數量。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養經選擇呈PD-1陽性之第一TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，該第一TIL族群可藉由腫瘤碎解以處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1陽性TIL而獲得，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(b) 藉由使該第二TIL族群與含有額外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL族群之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中之APC數量係步驟(a)中之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增；及
(c) 收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由在包含IL-2、OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群以實施經選擇呈PD-1陽性之TIL的初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(b) 藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
c) 收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。
在一些實施例中，在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係大於步驟(b)之培養基中APC數量。
在一些實施例中，在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係等於步驟(b)之培養基中APC數量。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，步驟(b)之該選擇包含下列步驟：(i)使該第一TIL族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，(ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，及(iii)實施基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，該單株抗PD-1 IgG4抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)或其變體、片段或接合物。在一些實施例中，該抗IgG4抗體係抗人IgG4選殖株HP6023選殖株。
在一些實施例中，該快速第二擴增中APC數量對該初始第一擴增中APC數量之比例係選自約1.5:1至約20:1的範圍。
在一些實施例中，該比例係選自約1.5:1至約10:1的範圍。
在一些實施例中，該比例係選自約2:1至約5:1的範圍。
在一些實施例中，該比例係選自約2:1至約3:1的範圍。
在一些實施例中，該比例係約2:1。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約1x108
個APC至約3.5x108
個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約3.5x108
個APC至約1x109
個APC的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約1.5x108
個APC至約3x108
個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約4x108
個APC至約7.5x108
個APC的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約2x108
個APC至約2.5x108
個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約4.5x108
個APC至約5.5x108
個APC的範圍。
在一些實施例中，將約2.5x108
個APC添加至該初始第一擴增且將5x108
個APC添加至該快速第二擴增。
在一些實施例中，該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約1.5:1至約100:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約50:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約25:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約20:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約10:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群至少50倍。
在一些實施例中，該方法包含在收集該治療性TIL族群之步驟之後實施下列額外步驟：將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋。
在一些實施例中，該多個腫瘤片段係分布於複數個分開的容器中，在該分開的容器之各者中，該第二TIL族群係獲自該初始第一擴增步驟之該第一TIL族群，且該第三TIL族群係獲自該快速第二擴增步驟之該第二TIL族群，且其中獲自該第三TIL族群之該治療性TIL族群係自該複數個容器之各者收集且合併以產生該經收集之TIL族群。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
在一些實施例中，該分開的容器之各者包含第一氣體可通透性表面區域。
在一些實施例中，該多個腫瘤片段係分布於單一容器中。
在一些實施例中，該單一容器包含第一氣體可通透性表面區域。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該初始第一擴增係於包含第一氣體可通透性表面區域的第一容器中實施，且在該快速第二擴增步驟中，該快速第二擴增係於包含第二氣體可通透性表面區域的第二容器中實施。
在一些實施例中，該第二容器係大於該第一容器。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，該初始第一擴增係針對各容器中的第一TIL族群實施，該快速第二擴增係於相同容器中針對自該第一TIL族群產生的該第二TIL族群實施。
在一些實施例中，各容器包含第一氣體可通透性表面區域。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
在一些實施例中，該初始第一擴增係在該初始第一擴增步驟中於各容器中針對第一TIL族群實施，該第一容器包含第一表面區域，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係層疊在該第一氣體可通透性表面區域上，且其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.1至約1:10的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.2至約1:8的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.3至約1:7的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.4至約1:6的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.5至約1:5的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.6至約1:4的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.7至約1:3.5的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.8至約1:3的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.9至約1:2.5的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係約1:2。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中於2至3天後，對該細胞培養基補充額外的IL-2。
在一些實施例中，該方法在收集該治療性TIL族群之步驟中進一步包含使用冷凍保存過程以冷凍保存該經收集之TIL族群。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍保存該輸注袋之步驟。
在一些實施例中，使用呈1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基以實施該冷凍保存過程。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
在一些實施例中，在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該初始第一擴增步驟中該細胞培養基中PBMC總數係2.5 × 108
個。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，在該細胞培養基中該抗原呈現細胞(APC)係周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該快速第二擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係5 × 108
個。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，在收集該治療性TIL族群之步驟中，該收集係使用基於膜之細胞處理系統實施。
在一些實施例中，步驟(d)之收集係使用LOVO細胞處理系統實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟之該多個片段包含每容器約60個片段，其中各片段具有約27 mm3
之體積。
在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施例中，在步驟(d)中於2至3天後，對該細胞培養基補充額外的IL-2。
在一些實施例中，IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，在將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋之步驟中，該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟之該第一期間係在一段5天、6天或7天的期間內實施。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟之該第二期間係在一段7天、8天或9天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約14天至約16天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約15天至約16天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約14天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約15天的期間內實施。
在一些實施例中，該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約16天的期間內實施。
在一些實施例中，該方法進一步包含使用冷凍保存過程以冷凍保存該經收集之治療性TIL族群之步驟，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群及冷凍保存之步驟係於16天或少於16天內實施。
在一些實施例中，收集該治療性TIL族群之步驟所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自該快速第二擴增步驟之該第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該初始第一擴增步驟之該第二TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，來自該收集該治療性TIL族群之步驟之該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施例中，方法進一步包含使用冷凍保存過程將包含步驟(f)之經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施例中，使用呈1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基以實施該冷凍保存過程。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，步驟(e)之收集係使用基於膜之細胞處理系統實施。
在一些實施例中，步驟(e)之收集係使用LOVO細胞處理系統實施。
在一些實施例中，步驟(c)之該多個片段包含每第一氣體可通透性表面區域約60個片段，其中各片段具有約27 mm3
的體積。
在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施例中，IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，步驟(d)之輸注袋係含HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在一些實施例中，步驟(c)之第一期間及步驟(c)之第二期間各自個別地在一段5天、6天或7天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(c)之該第一期間在一段5天、6天或7天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(d)之該第二期間在一段7天、8天或9天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(c)之該第一期間及步驟(c)之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約14天至約16天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約15天至約16天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約14天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約15天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)在一段約16天的期間內實施。
在一些實施例中，步驟(a)至(f)及冷凍保存在16天或少於16天內實施。
在一些實施例中，步驟(f)所收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施例中，其中步驟(c)之容器係大於步驟(b)之容器。
在一些實施例中，步驟(d)中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，步驟(d)中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自步驟(d)之該第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(c)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，來自步驟(f)之TIL係輸注至病患。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含：
(a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；
(b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群；
(c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍；
(d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中添加至該快速第二擴增之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群；
(f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋；及
(g) 投予治療有效劑量的來自步驟(f)之該TIL至該個體。
在一些實施例中，足夠對步驟(g)之投予治療有效劑量的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，步驟(b)之該選擇包含下列步驟：(i)使該第一TIL族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，(ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，及(iii)實施基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，該單株抗PD-1 IgG4抗體係尼沃魯單抗或其變體、片段或接合物。
在一些實施例中，該抗IgG4抗體係抗人IgG4選殖株HP6023選殖株。
在一些實施例中，抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施例中，在步驟(g)投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該病患投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包含始於步驟(g)之投予該TIL細胞至該病患之後當天使用高劑量IL-2方案以治療該病患的步驟。
在一些實施例中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在一些實施例中，步驟(c)中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，步驟(d)中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自步驟(d)之該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(c)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。
在一些實施例中，癌症係HNSCC。
在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。
在一些實施例中，癌症係NSCLC。
在一些實施例中，癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在一些實施例中，癌症係胃腸道癌。
在一些實施例中，癌症係高突變癌症。
在一些實施例中，癌症係小兒高突變癌症。
在一些實施例中，容器係GREX-10。
在一些實施例中，密閉容器包含GREX-100。
在一些實施例中，密閉容器包含GREX-500。
在一些實施例中，個體先前已經接受抗PD-1抗體的治療。
在一些實施例中，個體先前未曾接受抗PD-1抗體的治療。
在一些實施例中，在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係選自藉由實施使該第一TIL族群與抗PD-1抗體接觸以形成該抗PD-1抗體與該第一TIL族群中之TIL細胞之第一複合物之步驟且接著實施單離該第一複合物之步驟以獲得該富含PD-1之TIL族群的該第一TIL族群。
在一些實施例中，該抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在單離該第一複合物之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中單離該第一複合物之步驟係藉由單離該第二複合物實施。
在一些實施例中，用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體係選自由下列所組成之群組：EH12.2H7、PD1.3.1、M1H4、尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(pembrolizumab)(來伯里茲單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(Pidilizumab)(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)、人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)及RMP1-14(大鼠IgG) - BioXcell cat# BP0146。
在一些實施例中，用於選擇之抗PD-1抗體係EH12.2H7。
在一些實施例中，用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體與尼沃魯單抗或派姆單抗結合不同之表位。
在一些實施例中，用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體與EH12.2H7或尼沃魯單抗結合相同之表位。
在一些實施例中，用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體係尼沃魯單抗。
在一些實施例中，該個體先前已經接受第一抗PD-1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸來選擇，且其中該第二抗PD-1抗體不被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
在一些實施例中，該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸來選擇，且其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
在一些實施例中，該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由實施使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸以形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL族群之第一複合物之步驟且接著實施單離該第一複合物以獲得該富含PD-1之TIL族群之步驟而選擇，其中該第二抗PD-1抗體不被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
在一些實施例中，該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在單離該第一複合物之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該第一抗PD-1抗體之該Fc區及該第二抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中單離該第一複合物之步驟係藉由單離該第二複合物實施。
在一些實施例中，該第二抗PD-1抗體包含Fc區，該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由實施使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸以形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL族群之第一複合物之步驟來選擇，其中該第二抗PD-1抗體不被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合，且其中在形成該第一複合物之步驟之後，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該第二抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且接著實施單離該第二複合物之步驟以獲得該富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由實施使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸以形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL族群之第一複合物之步驟來選擇，其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該PD-1陽性TIL結合，其中該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在獲得該富含PD-1之TIL族群之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該第二抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且使該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體與該抗Fc抗體接觸以形成該抗Fc抗體與該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體之第三複合物，且實施單離該第二及第三複合物之步驟以獲得該富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效及/或增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效及/或增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16至22天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，自該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群包含自第一TIL族群選擇至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之TIL族群。
在一些實施例中，步驟之該選擇包含下列步驟：
(i) 使該第一TIL族群及PBMC族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，
(ii) 添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，
(iii) 基於如螢光激活細胞分選(FACS) 所實施之該第一TIL族群中該PD-1陽性TIL之該螢光團的強度相較於該PBMC族群的強度以獲得該富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，在該第一族群及該PBMC族群兩者中的該螢光團的強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應PD-1陰性TIL、PD-1中度TIL及PD-1陽性TIL之低、中及高強度水準。
在一些實施例中，該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，至少80%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；
(b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群，其中至少10%至80%範圍之該第一TIL族群係PD-1陽性TIL；
(c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增；
(e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群；及
(f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
在一些實施例中，步驟(b)之該選擇包含下列步驟：
(i) 使該第一TIL族群及PBMC族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，
(ii) 添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，
(iii) 基於如螢光激活細胞分選(FACS) 所實施之該第一TIL族群中該PD-1陽性TIL之該螢光團的強度相較於該PBMC族群的強度以獲得該富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，在該第一族群及該PBMC族群兩者中的該螢光團的強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應PD-1陰性TIL、PD-1中度TIL及PD-1陽性TIL之低、中及高強度水準。
在一些實施例中，該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，至少80%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，該第三TIL族群在該容器中包含至少約1 x 108
個TIL。
在一些實施例中，該第三TIL族群在該容器中包含至少約1 x 109
個TIL。
在一些實施例中，在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約1×104
至約1×106
個。
在一些實施例中，在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約5×104
至約1×106
個。
在一些實施例中，在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約2×105
至約1×106
個。
在一些實施例中，該方法進一步包含在實施步驟(a)之前冷凍保存來自該個體所切除的該腫瘤之該第一TIL族群之步驟。
I.
定義
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案全文以引用方式併入本文中。
用語「活體內(in vivo
)」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「活體外(in vitro
)」係指發生在個體身體以外的事件。活體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「離體(ex vivo
)」係指涉及在從個體身體移除之細胞、組織及/或器官上所進行處理或實施程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療的方法回到個體體內。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮獲得(freshly obtained)」或「新鮮單離(freshly isolated)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL (bulk TIL)及經擴增之TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞族群可包括基因修飾的TIL。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1 x 106
至1 x 1010
，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1 × 108
個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5 × 109
至1.5 × 1010
個用於輸注的細胞族群。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的經冷凍保存之TIL (thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL族群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至病患之溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
用語「冷凍保存培養基」係指任何可用於冷凍保存細胞的培養基。該培養基可包括包含7%至10% DMSO的培養基。例示性培養基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及彼等之組合。用語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷凍保存培養基。CS10培養基可以其商品名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10培養基是不含血清、不含動物組分的包含DMSO之培養基。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7hi
)及CD62L (CD62hi
)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞」係指人或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo
)且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo
)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127 (IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至病患為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC是一種抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞較佳地係經照射的異體周邊血液單核細胞。
用語「周邊血液淋巴細胞」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施例中，PBL係自供體的全血或血球分離產物分離。在一些實施例中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+ CD45+的T細胞表型)來自供體的全血或血球分離產物分離。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為標靶的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人、人化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1選殖株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為標靶的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人、人化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如Nelson,J. Immunol. 2004, 172,
3983-88及Malek,Annu. Rev. Immunol. 2008, 26,
453-79，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人IL-2)係非糖基化人重組形式的IL-2，分子量為大約15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214(可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir. Res. 2001, 2,
66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1
。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall,Blood 2002, 99,
3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001, 97,
14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard,Nat. Rev. Drug.Disc. 2014, 13,
379-95，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及經活化之人CD4+
T細胞產生。重組人IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當表示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及病患(個體)病況差異判定。通常說明本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(例如繼代TIL或基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)的醫藥組成物可以104
至1011
細胞/kg體重(例如105
至106
、105
至1010
、105
至1011
、106
至1010
、106
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,107
至1011
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至1011
、108
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、109
至1011
或109
至1010
細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)組成物亦可以這些劑量投予多次。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因的)可使用在免疫療法中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med.
319: 1676, 1988)。對特定病患而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測病患的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病(hematological
malignancy、hematologic malignancy)」或有相關意義之用語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。獲自液體腫瘤之TIL(包括在周邊血液循環之液體腫瘤)在本文中亦稱為PBL。用語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且只有細胞衍生出自之組織類型的差別。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz,et al., Cancer Res., 2012, 72,
2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中病患在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一些實施例中，可提供TIL族群，其中病患在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
實驗發現表示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之rTIL之前，對病患進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二種或超過二種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施例中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於個體中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二種或超過二種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(活體外或活體內)或所欲治療之個體及疾病病況(例如個體的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展或進展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二個或超過二個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二個或超過二個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二個或超過二個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二個或超過二個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施例中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考抗體的胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本(有時稱為「新鮮獲得(freshly obtained)」或「新鮮單離(freshly isolated)」)的TIL，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL、經擴增之TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖27步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TIL可進一步藉由效力鑑定-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可被認為有效。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散培養基、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習知醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所涵蓋之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施例可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施例中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。
用語「高PD-1 (PD-1 high或PD-1high)」或「PD-1高
」係指細胞諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴細胞或T細胞相對於來自健康個體之對照細胞之高量的PD-1蛋白質表現。在一些實施例中，PD-1表現的量係使用所屬技術領域中具有通常知識者已知用於測量存在細胞之蛋白質的量之標準方法判定，諸如流動式細胞測量術、螢光激活細胞分選(FACS)、免疫細胞化學法及類似法。在一些情況下，高PD-1 TIL相較於來自健康個體之免疫細胞表現較高量的PD-1。在一些情況下，高PD-1 TIL族群相較於來自健康個體或一群健康個體之免疫細胞(例如周邊血液單核細胞)族群表現較高量的PD-1。高PD-1細胞可稱為PD-1明亮(bright)細胞。
用語「中間PD-1 (PD-1 intermediate)」或「PD-1int」或「PD-1int
」係指細胞諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴細胞或T細胞相對於來自健康個體之對照細胞之中間或中等量的PD-1蛋白質表現。例如，PD-1int T細胞所表現之PD-1蛋白質的量或範圍係類似於或實質上相當於來自健康個體之對照細胞(例如周邊血液單核細胞)所表現之PD-1蛋白質的最高範圍。換句話說，PD-1int TIL具有的PD-1表現量類似於或實質上相當於來自健康個體之對照免疫細胞的PD-1表現背景量。PD-1int細胞可稱為PD-1黯淡(dim)細胞。所屬技術領域中具有通常知識者辨識PD-1陽性TIL可為高PD-1 TIL或PD-1int TIL。
用語「PD-1陰性(PD-1 negative)」或「PD-1neg」或「PD-1neg
」係指細胞諸如但不限於腫瘤浸潤性淋巴細胞或T細胞相對於來自健康個體之對照細胞之陰性或低量的PD-1蛋白質表現。例如，PD-1neg T細胞不表現PD-1蛋白質。在一些情況下，PD-1neg T細胞所表現之PD-1蛋白質的量係類似於或實質上相當於來自健康個體之對照細胞(例如周邊血液單核細胞)所表現之PD-1蛋白質的最低量。PD-1neg淋巴細胞可如同對照族群中大部分淋巴細胞以相同的量或範圍表現PD-1。
高PD-1、PD-1int及PD-1neg TIL係根據本文所述之方法經離體擴增之獨特且不同的TIL子集。在一些實施例中，經離體擴增之TIL族群包含高PD-1 TIL、PD-1int TIL及PD-1neg TIL。II. TIL 製程 ( 第 3 代過程之實施例，可選地包括確定培養基 )
在不受任何特定理論限制下，據信如本發明之方法所述之起動T細胞的活化之初始第一擴增，隨後加強T細胞的活化之快速第二擴增，允許製備保留「較年輕」表型之經擴增的T細胞，且因此預期本發明之經擴增的T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞可對癌細胞展現較高細胞毒性。特別是，據信如本發明之方法所教示之藉由暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及可選地抗原呈現細胞(APC)來起動T細胞的活化且接著藉由後續暴露於額外的抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC來加強，限制或避免培養中T細胞的成熟，產生具有較不成熟表型的T細胞族群，該等T細胞較不因培養擴增而耗竭且對癌細胞展現較高細胞毒性。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大(scaling up)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效小規模培養中的T細胞轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的T細胞約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大(scaling out)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養T細胞約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的T細胞部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約5天。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化開始降低、趨緩、衰退或消退之後實施。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約(at or about) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後實施。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至100%的範圍中之百分比之後實施。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%的範圍中之百分比之後實施。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化已降低至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之後實施。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化已降低至多在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後實施。
在一些實施例中，藉由初始第一擴增所致效的T細胞活化的降低係藉由T細胞因應抗原刺激所釋放之干擾素γ的量之減少來判定。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於至多在或約7天或約8天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約11天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約11天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或約11天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於自在或約1天至在或約8天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約9天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於8天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於9天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約9天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞的初始第一擴增係於7天的期間實施且T細胞的快速第二擴增係於9天的期間實施。
在一些實施例中，T細胞是腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在一些實施例中，T細胞是骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
在一些實施例中，T細胞是周邊血液淋巴細胞(PBL)。
在一些實施例中，T細胞係獲自罹癌供體。
在一些實施例中，T細胞係獲自罹癌病患所切除之腫瘤的TIL。
在一些實施例中，T細胞係獲自血液惡性病病患骨髓的MIL。
在一些實施例中，T細胞係獲自來自供體之周邊血液單核細胞(PBMC)之PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞例如T細胞可自一單位收集自個體之血液，使用該領域之技藝人士所知之任何數量之技術諸如FICOLL分離獲得。在一較佳之態樣中，來自個體之循環血液中的細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物一般含有淋巴細胞包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球、及血小板。在一態樣中，藉由血球分離所收集之細胞可經洗滌以去除血漿部分且可選地將細胞放置於適當緩衝液或培養基以供進行後續處理步驟。在一實施例中，細胞係經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代性實施例中，該洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多若非所有二價陽離子。在一態樣中，T細胞係自周邊血液淋巴細胞分離，其可藉由例如離心通過PERCOLL梯度或藉由逆流離心淘析以裂解紅血球並除盡單核球。
在一些實施例中，T細胞係自供體的全血或富含淋巴細胞之血球分離產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係液體腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞例如T細胞可自一單位收集自個體之血液，使用該領域之技藝人士所知之任何數量之技術諸如FICOLL分離獲得。在一較佳之態樣中，來自個體之循環血液中的細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物一般含有淋巴細胞包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球、及血小板。在一態樣中，藉由血球分離所收集之細胞可經洗滌以去除血漿部分且可選地將細胞放置於適當緩衝液或培養基以供進行後續處理步驟。在一實施例中，細胞係經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代性實施例中，該洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多若非所有二價陽離子。在一態樣中，T細胞係自周邊血液淋巴細胞分離，其可藉由例如離心通過PERCOLL梯度或藉由逆流離心淘析以裂解紅血球並除盡單核球。
在一些實施例中，T細胞係自供體的全血或富含淋巴細胞之血球分離產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係液體腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。在一些實施例中，PBL係藉由使用正向或負向選擇方法而自全血或富含淋巴細胞之血球分離產物單離，即，使用T細胞表型標誌例如CD3+ CD45+移除PBL，或移除非T細胞表型細胞而留下PBL。在其他實施例中，PBL係藉由梯度離心單離。在單離來自供體組織之PBL後，PBL之初始第一擴增可根據本文所述之任何方法中之初始第一擴增步驟，藉由將合適數量的經單離之PBL(在一些實施例中，大約1x107
個PBL)接種於初始第一擴增培養中來起始。
含有一些這些特徵之稱為過程3(在本文中亦稱為第3代)的例示性TIL過程係描繪於圖1(特別是例如圖1B)，且本發明之此實施例的一些優於過程2A的優點係描述於圖1、2、30及31(特別是例如圖1B)。過程3的二個實施例顯示於圖1及30(特別是例如圖1B)。過程2A或第2代亦描述於美國專利公開案2018/0280436，其全文以引用方式併入本文中。第3代過程亦描述於USSN 62/755,954(2018年11月5日提出)(116983-5045-PR)。
如本文中所討論及大致概述的，TIL係取自病患樣本且使用本文所述且稱為第3代之TIL擴增過程操作以在移植至病患中之前擴增彼等之數量。在一些實施例中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。在一些實施例中，TIL可在擴增之前或之後經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至病患中之前增加彼等之代謝。
在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，初始第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至8天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，初始第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至8天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至8天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，初始第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至7天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，初始第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)係1至7天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)係1至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8至9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係9天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係9至10天。在一些實施例中，初始第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，初始第一擴增與快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B及步驟D所述之擴增)之組合係14至16天。特別是，所考慮的是本發明之某些實施例包含初始第一擴增步驟，其中TIL藉由在IL-2存在下暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露於抗原來活化。在某些實施例中，如上述在初始第一擴增步驟中被活化的TIL係第一TIL族群，即初代細胞族群。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)的非限制性實例且參照本文所述之某些非限制性實施例。以下及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。A. 步驟 A ：獲得病患腫瘤樣本
一般來說，TIL最初係獲自病患腫瘤樣本(「初代TIL」)或循環淋巴細胞(諸如周邊血液淋巴細胞，包括具有類TIL特徵之周邊血液淋巴細胞)，且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地經冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
病患腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術切除、細針活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高量的TIL。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3
之間的小片(small pieces)，且約2至3 mm3
特別有用。TIL係自這些片段使用酶催化性腫瘤碎解物培養。該等腫瘤碎解物可藉由在酶性培養基(例如Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中培育，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤碎解物可藉由將腫瘤放入酶催化性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣實施密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施例中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
如上所指示，在一些實施例中，TIL係衍生自實質腫瘤。在一些實施例中，實質腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實質腫瘤未經碎斷且以全腫瘤進行酶催化性碎解。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中碎解。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2
下碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2
、旋轉下碎解1至2小時。在一些實施例中，腫瘤在恆定旋轉下碎解整夜。在一些實施例中，腫瘤在37℃、5% CO2
、恆定旋轉下碎解整夜。在一些實施例中，全腫瘤與酶組合以形成腫瘤碎解反應混合物。
在一些實施例中，腫瘤係以經冷凍乾燥之酶於無菌緩衝劑中重構。在一些實施例中，緩衝劑係無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包含膠原酶。在一些實施例中，膠原酶係膠原酶IV。在一些實施例中，膠原酶的工作原液係100 mg/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶的工作原液係10,000IU/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含玻璃酸酶。在一些實施例中，玻璃酸酶的工作原液係10-mg/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原酶、1000 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻璃酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原酶、500 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻璃酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包含約10mg/ml膠原酶、約1000 IU/ml DNA酶及約1 mg/ml玻璃酸酶。
一般來說，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。在某些實施例中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及碎解。在一些實施例中，碎斷係物理碎斷。在一些實施例中，碎斷係分割。在一些實施例中，碎斷係藉由碎解。在一些實施例中，TIL最初可自獲自病患的酶催化性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養。在一實施例中，TIL最初可自獲自病患的酶催化性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，碎斷步驟係活體外或離體過程。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40個或超過40個片段或片放入各容器進行初始第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行初始第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行初始第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3
的體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3
至約1500 mm3
。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3
。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3
與10 mm3
之間。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3
與8 mm3
之間。在一些實施例中，腫瘤片段係約1 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約2 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約3 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約4 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約5 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約6 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約7 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約8 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約9 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係約10 mm3
。在一些實施例中，腫瘤片段係1-4 mm
x 1-4 mm x 1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係1 mm
x 1 mm x 1 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係2 mm
x 2 mm x 2 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係3 mm
x 3 mm x 3 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係4 mm
x 4 mm x 4 mm。
在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上出血性、壞死及/或脂肪組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上出血性組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上壞死性組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上脂肪性組織的量。在某些實施例中，碎斷腫瘤步驟係活體外或離體方法。
在一些實施例中，腫瘤碎斷的實施是為了維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，腫瘤碎斷的實施不包括使用解剖刀實施鋸切動作。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，腫瘤碎解物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll實施密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施例中，將初始第一擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。
在一些實施例中，細胞可在樣本單離後(例如，在獲得腫瘤樣本後及/或自腫瘤樣本獲得細胞懸浮液後)可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中例示。1.
粗針/小活體組織切片衍生之TIL
在一些實施例中，TIL最初藉由粗針活體組織切片或類似程序獲自病患腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數。
在一些實施例中，病患腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由小活體組織切片、粗針活體組織切片、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。在一些實施例中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片。在一些實施例中，樣本可包含來自相同病患之單一腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包含來自相同病患之一、二、三或四個腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包含來自相同病患之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高量的TIL。
一般來說，獲自腫瘤粗針切片或片段之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得的」或「新鮮單離的」細胞族群。在某些實施例中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，如果腫瘤係轉移性且原發病灶已在過去有效地治療/移除，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施例中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮膚病灶或頸部或腋域淋巴結。在一些實施例中，移除皮膚病灶或移除彼之小活體組織切片。在一些實施例中，移除淋巴結或彼之小活體組織切片。在一些實施例中，可採用肺或肝臟轉移性病灶或腹部內或胸部淋巴結或彼等之小活體組織切片。
在一些實施例中，腫瘤係黑色素瘤。在一些實施例中，黑色素瘤的小活體組織切片包含黑痣或其一部分。
在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得且移除一片圓形皮膚。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且連同小邊緣的正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長。
在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分的黑痣或生長。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且切開式活體組織切片係於其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時。
在一些實施例中，小活體組織切片係肺活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。通常，支氣管鏡檢是在病患麻醉下，使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入枝氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施例中，其中腫瘤或生長無法經由支氣管鏡檢達到，可以採用經胸針吸活體組織切片。通常，經胸針吸活體組織切片也是在病患麻醉下，將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施例中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如，使用x光或CT掃描引導針頭)。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經內視鏡超音波(例如，附燈的內視鏡經口放入食道)獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施例中，小活體組織切片係頭頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片，其中從外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施例中，如果異常區域容易接近，樣本採集可不需要住院。在一些實施例中，如果腫瘤在口或咽喉內較深之處，活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施例中，小活體組織切片係細針抽吸。在一些實施例中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭從腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑部位。
在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡之附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於活體組織切片一小部分的子宮頸表面。在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術移除較大片的子宮頸組織。在一些實施例中，錐狀活體組織切片除了幫助確診之外，錐狀活體組織切片可作為初始治療。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
在一些實施例中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、粗針活體組織切片、小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)獲得。在一些實施例中，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施例中，當有1或2個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施例中，當有3、4、5、6、8、9或10個或超過10個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 100。在一些實施例中，當有3、4、5、6、8、9或10個或超過10個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 500。
FNA可獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施例中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)病患的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC病患先前已經歷外科治療。
本文所述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用從18號針頭到25號針頭範圍之細號規針頭自病患獲得或單離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施例中，來自病患之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或超過950,000個TIL。
在一些實施例中，本文所述之TIL係獲自粗針活體組織切片樣本。在一些情況下，粗針活體組織切片樣本係使用從11號針頭到16號針頭範圍之外科或醫用針頭自病患獲得或單離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施例中，來自病患之粗針活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或超過950,000個TIL。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，TIL不是獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，實質腫瘤粗針切片未經碎斷。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，腫瘤碎解物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll實施密度梯度分離以移除這些細胞。
2.
擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴細胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本發明之一實施例中，PBL係使用本文所述之過程擴增。在本發明之一實施例中，方法包含獲得來自全血之PBMC樣本。在一實施例中，方法包含藉由使用負向選擇非CD19+組分以自PBMC單離純的T細胞來富集T細胞。在一實施例中，方法包含藉由使用基於磁珠之負向選擇非CD19+組分以自PBMC單離純的T細胞來富集T細胞。
在本發明之一實施例中，PBL方法1係實施如下：在第0天，將經冷凍保存之PBMC樣本解凍且計數PBMC。使用人泛T細胞單離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)單離T細胞。
PBL方法2。在本發明之一實施例中，使用PBL方法2擴增PBL，該方法包含獲得來自全血之PBMC樣本。藉由在37℃下培育PBMC至少三小時且接著單離非附著細胞來富集來自PBMC之T細胞。
在本發明之一實施例中，PBL方法2係實施如下：在第0天，將經冷凍保存之PMBC樣本解凍且將PBMC細胞以每孔6百萬個細胞接種於6孔板於CM-2培養基中且在攝氏37℃下培育3小時。在3小時後，移出非附著細胞(其係PBL)且計數。
PBL方法3。在本發明之一實施例中，使用PBL方法3擴增PBL，該方法包含獲得來自周邊血液之PBMC樣本。B細胞係使用CD19+選擇單離且T細胞係使用負向選擇PBMC樣本之非CD19+組分選擇。
在本發明之一實施例中，PBL方法3係實施如下：在第0天，將衍生自周邊血液之經冷凍保存之PBMC解凍及計數。使用CD19 Multisort人套組(Miltenyi Biotec)分選CD19+ B細胞。在非CD19+細胞組分中，使用人泛T細胞單離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)純化T細胞。
在一實施例中，PBMC係單離自全血樣本。在一實施例中，使用PBMC樣本作為擴增PBL之起始材料。在一實施例中，樣本在擴增過程之前係經冷凍保存。在另一實施例中，使用新鮮樣本作為擴增PBL之起始材料。在本發明之一實施例中，使用所屬技術領域中已知之方法自PBMC單離T細胞。在一實施例中，使用人泛T細胞單離套組及LS管柱單離T細胞。在本發明之一實施例中，使用所屬技術領域中已知之抗體選擇方法(例如CD19負向選擇)自PBMC單離T細胞。
在本發明之一實施例中，PBMC樣本係在有效識別非附著細胞之所欲溫度下培育一段時間。在本發明之一實施例中，培育時間係約3小時。在本發明之一實施例中，溫度係約37℃。非附著細胞接著使用上述過程擴增。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已可選地先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療的個體或病患。在一些實施例中，腫瘤樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療的個體或病患。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或1年以上的個體或病患。在另一實施例中，PBMC係衍生自目前正在接受ITK抑制劑方案諸如依魯替尼(ibrutinib)治療的病患。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療且對激酶抑制劑或ITK抑制劑諸如依魯替尼治療呈現難治性的個體或病患。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑治療的個體或病患。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑治療且無接受治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或1年以上的個體或病患。在另一實施例中，PBMC係衍生自先前暴露於ITK抑制劑但已無治療至少3個月、至少6個月、至少個月或至少1年的病患。
在本發明之一實施例中，在第0天，細胞係經CD19+選擇且據此分選。在本發明之一實施例中，選擇係使用抗體結合珠進行。在本發明之一實施例中，純的T細胞係在第0天自PBMC單離。
在本發明之一實施例中，以未先經依魯替尼或其他ITK抑制劑治療之病患而言，10至15ml之白血球層將產生約5×109
個PBMC，其進而將產生約5.5×107
個PBL。
在本發明之一實施例中，以先經依魯替尼或其他ITK抑制劑治療之病患而言，擴增過程將產生約20×109
個PBL。在本發明之一實施例中，40.3×106
個PBMC將產生約4.7×105
個PBL。
在任何前述實施例中，PBMC可衍生自全血樣本、藉由血球分離、來自白血球層或來自所屬技術領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法。3.
擴增來自骨髓衍生之PBMC之骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本發明之一實施例中，方法包含獲得來自骨髓之PBMC樣本。在第0天，PBMC係經CD3+/CD33+/CD20+/CD14+選擇及分選，且非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+細胞組分係經超音波振盪且將一部分經超音波振盪之細胞組分添加回經選擇之細胞組分。
在本發明之一實施例中，MIL方法3係實施如下：在第0天，將PBMC之經冷凍保存之樣本解凍且計數PBMC。將細胞使用CD3、CD33、CD20及CD14抗體染色且使用S3e細胞分選器(Bio-Rad)分選。細胞經分選成二個組分：免疫細胞組分(或MIL組分)(CD3+CD33+CD20+ CD14+)及AML胚細胞組分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本發明之一實施例中，PBMC係獲自骨髓。在一實施例中，PBMC係經由血球分離、抽吸、細針活體組織切片或所屬技術領域中已知之其他類似手段獲自骨髓。在一實施例中，PBMC係新鮮的。在另一實施例中，PBMC係經冷凍保存的。
在本發明之一實施例中，MIL係自10至50 ml之骨髓抽吸物擴增。在本發明之一實施例中，自病患獲得10ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自病患獲得20ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自病患獲得30ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自病患獲得40ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自病患獲得50ml之骨髓抽吸物。
在本發明之一實施例中，自約10至50ml之骨髓抽吸物產生的PBMC數量係約5×107
至約10×107
個PBMC。在另一實施例中，所產生的PMBC數量係約7×107
個PBMC。
在本發明之一實施例中，約5×107
至約10×107
個PBMC產生約0.5×106
至約1.5×106
個MIL。在本發明之一實施例中，產生約1×106
個MIL。
在本發明之一實施例中，骨髓抽吸物衍生之12×106
個PBMC產生大約1.4×105
個MIL。
在任何前述實施例中，PBMC可衍生自全血樣本、骨髓、藉由血球分離、來自白血球層或來自所屬技術領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法。4.
PD-1的預先選擇(如圖1步驟A2所例示)
根據本發明之方法，TIL在初始第一擴增之前係經預先選擇而呈PD-1陽性(PD-1+)。
在一些實施例中，最少需要接種3,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種4,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種5,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種6,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種7,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種8,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種9,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，最少需要接種10,000個TIL至第一擴增。在一些實施例中，預先選擇步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成200,000之密度。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成200,000之密度以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成150,000之密度。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成150,000之密度以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成250,000之密度。在一些實施例中，細胞係經生長或擴增成250,000之密度以提供約2e8個TIL來起始快速第二擴增。在一些實施例中，最小細胞密度係10,000個細胞以給出10e6來起始快速第二擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二擴增之10e6接種密度可產生高於1e9個TIL。
在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL係PD-1陽性(PD-1+)(例如，在預先選擇之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL係至少75% PD-1陽性、至少80% PD-1陽性、至少85% PD-1陽性、至少90% PD-1陽性、至少95% PD-1陽性、至少98% PD-1陽性或至少99% PD-1陽性(例如，在預先選擇之後且在初始第一擴增之前)。在一些實施例中，PD-1族群係高PD-1。在一些實施例中，用於初始第一擴增之TIL係至少25%高PD-1、至少30%高PD-1、至少35%高PD-1、至少40%高PD-1、至少45%高PD-1、至少50%高PD-1、至少55%高PD-1、至少60%高PD-1、至少65%高PD-1、至少70%高PD-1、至少75%高PD-1、至少80%高PD-1、至少85%高PD-1、至少90%高PD-1、至少95%高PD-1、至少98%高PD-1或至少99%高PD-1(例如，在預先選擇之後且在初始第一擴增之前)。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL之預先選擇係藉由使用抗PD-1抗體染色初代細胞族群、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來實施。在一些實施例中，抗PD-1抗體係多株抗體例如小鼠抗人PD-1多株抗體、山羊抗人PD-1多株抗體等。在一些實施例中，抗PD-1抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括例如但不限於EH12.2H7、PD1.3.1、M1H4、尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(來伯里茲單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell cat# BP0146。其他用於預先選擇用於根據本發明之方法(如本文所述之步驟A至F所例示)擴增TIL之PD-1陽性TIL的合適抗體係揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)中之抗PD-1抗體。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與派姆單抗(來伯里茲單抗、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與人單株抗體REGN2810 (Regeneron)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)結合不同之表位。在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell cat# BP0146結合不同之表位。尼沃魯單抗之結合及派姆單抗與PD-1結合之結構係已知且描述於例如Tan, S. et al.(Tan, S. et al.,Nature Communications
, 8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369 (2017)；全文以引用方式併入本文中以符合所有目的)。在一些實施例中，抗PD-1抗體係EH12.2H7。在一些實施例中，抗PD-1抗體係PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體係M1H4。在一些實施例中，抗PD-1抗體不是M1H4。
在一些實施例中，用於預先選擇之抗PD-1抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%表現PD-1之細胞結合。
在一些實施例中，病患已經接受抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未曾接受抗PD-1抗體的治療。在一些實施例中，個體先前已經接受化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已經接受化學治療劑治療但目前不再接受該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療或接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，病患未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療但未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療及接受過化學治療劑治療但未接受過抗PD-1抗體治療。
在病患先前已經接受第一抗PD-1抗體治療之一些實施例中，預先選擇係藉由使用第二抗PD-1抗體染色初代細胞族群、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL來實施，該第二抗PD-1抗體與初代細胞族群TIL之表面上的PD-1之結合不被第一抗PD-1抗體阻斷。
在病患先前已經接受抗PD-1抗體治療之一些實施例中，預先選擇係藉由使用抗體(「抗Fc抗體」)染色初代細胞族群TIL來實施，該抗Fc抗體與該初代細胞族群TIL之表面上不經溶解之抗PD-1抗體的Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體係多株抗體例如小鼠抗人Fc多株抗體、山羊抗人Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體係單株抗體。在一些實施例中，病患先前已經接受抗PD-1人或人化IgG抗體的治療且初代細胞族群TIL係經抗人IgG抗體染色。在病患先前已經接受抗PD-1人或人化IgG1抗體治療之一些實施例中，初代細胞族群TIL係經抗人IgG1抗體染色。在病患先前已經接受抗PD-1人或人化IgG2抗體治療之一些實施例中，初代細胞族群TIL係經抗人IgG2抗體染色。在病患先前已經接受抗PD-1人或人化IgG3抗體治療之一些實施例中，初代細胞族群TIL係經抗人IgG3抗體染色。在病患先前已經接受抗PD-1人或人化IgG4抗體治療之一些實施例中，初代細胞族群TIL係經抗人IgG4抗體染色。
在病患先前已經接受抗PD-1抗體治療之一些實施例中，預先選擇係藉由使初代細胞族群TIL與相同的抗PD-1抗體接觸且接著使用抗Fc抗體染色該初代細胞族群TIL來實施，該抗Fc抗體與該初代細胞族群TIL之表面上不經溶解之抗PD-1抗體的Fc區結合。
在一些實施例中，預先選擇使用細胞分選方法實施。在一些實施例中，細胞分選方法係流動式細胞測量術方法，例如流動式激活細胞分選(FACS)。在一些實施例中，在該第一族群及該PBMC族群兩者中的該螢光團的強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應PD-1陰性TIL、PD-1中度TIL及PD-1陽性TIL之低、中及高強度水準。在一些實施例中，實施細胞分選方法，其中圈選使用PBMC、FMO對照及樣本本身設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區別三個族群。在一些實施例中，PBMC係用來作為圈選對照。在一些實施例中，高PD-1族群係定義為超過在PBMC中觀察到之PD-1陽性之細胞族群。在一些實施例中，TIL中之中間PD-1+族群涵蓋PBMC中之PD-1+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，預先選擇涉及自該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群，其包含自第一TIL族群選擇至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之TIL族群。在一些實施例中，第一TIL族群係至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少30%至80% PD-1陽性TIL、至少40%至80% PD-1陽性TIL、至少50%至80% PD-1陽性TIL、至少10%至70% PD-1陽性TIL、至少20%至70% PD-1陽性TIL、至少30%至70% PD-1陽性TIL或至少40%至70% PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如，預先選擇及/或選擇PD-1陽性細胞)包含下列步驟：
(i) 使該第一TIL族群及PBMC族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，
(ii) 添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，
(iii) 基於如螢光激活細胞分選(FACS)所實施之該第一TIL族群中該PD-1陽性TIL之該螢光團的強度相較於該PBMC族群的強度以獲得該富含PD-1之TIL族群。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
在一些實施例中，至少70%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少80%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少90%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少95%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少99%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。在一些實施例中，100%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。
不同的抗PD-1抗體展現與PD-1內不同表位之不同的結合特徵。在一些實施例中，抗PD-1抗體與派姆單抗結合不同之表位。在一些實施例中，抗PD1抗體與在PD-1 IgV結構域外的N端環中之表位結合。在一些實施例中，抗PD1抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環結合。在一些實施例中，抗PD-1抗體係經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體係經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合之單株抗PD-1抗體。在一些實施例中，單株抗PD-1抗體係經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合之抗PD-1 IgG4抗體。見例如Tan, S. Nature Comm. Vol 8, Argicle 14369: 1-10 (2017)。
在一些實施例中，如圖1步驟A2所例示之選擇步驟包含下列步驟：(i)使該第一TIL族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，(ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，及(iii)實施基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL族群。在一些實施例中，該單株抗PD-1 IgG4抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)或其變體、片段或接合物。在一些實施例中，該抗IgG4抗體係抗人IgG4選殖株HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體與EH12.2H7或尼沃魯單抗結合相同之表位。
在一些實施例中，採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了判定衍生自腫瘤樣本之TIL是否為高PD-1，所屬技術領域中具有通常知識者可利用對應獲自一或多個健康人個體之血液樣本的周邊T細胞之PD-1表現量之參考值。參考樣本中之PD-1陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照定義。在一些實施例中，PD-1表現量係於來自健康個體之CD3+/PD-1+周邊T細胞(例如參考細胞)中測量且係用於建立獲自腫瘤之TIL中之PD-1的免疫染色強度之臨限值或截留值。臨限值可定義為高PD-1 T細胞之PD-1免疫染色的最小強度。因此，PD-1表現與臨限值相同或高於臨限值之TIL可被認為是高PD-1細胞。在一些情況下，高PD-1 TIL代表該些具有最高PD-1免疫染色強度者且對應最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，高PD-1 TIL代表該些具有最高PD-1免疫染色強度者且對應最多0.75%或少於1%之總CD3+細胞。在一些情況下，高PD-1 TIL代表該些具有最高PD-1免疫染色強度者且對應最多0.50%或少於1%之總CD3+細胞。在一情況下，高PD-1 TIL代表該些具有最高PD-1免疫染色強度者且對應最多0.25%或少於1%之總CD3+細胞。
a.螢光團
在一些實施例中，初代細胞族群TIL係經包括與螢光團連接之抗PD-1抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的雞尾酒染色。在一些實施例中，初代細胞族群TIL係經包括與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗PD-1抗體及抗CD3-FITC的雞尾酒染色。在一些實施例中，初代細胞族群TIL係經包括抗PD-1-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(ThermoFisher, MA, Cat #L23105)的雞尾酒染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇PD-1陽性細胞以根據本文所述之初始第一擴增(例如步驟B)進行擴增。
在一些實施例中，螢光團包括但不限於PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包括但不限於PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包括但不限於螢光染料。螢光染料之實例包括但不限於5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸酯、羧基螢光素GABA、5’(6’)-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光基團係玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包括但不限於四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚(rhodol)衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®販售)。在一些實施例中，螢光基團係花青染料。花青染料之實例包括但不限於Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。B. 步驟 B ：初始第一擴增
在一些實施例中，本方法提供較年輕TIL，該較年輕TIL相較於較老TIL(即在投予至個體/病患之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology,
75:157-167 (2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res,
16:6122-6131 (2010)；Huang et al.,J Immunother
, 28(3):258-267 (2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res
, 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al.,J Immunother
32:415-423 (2009)；Robbins, et al.,J Immunol
2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al.,J Immunother
, 28:53-62 (2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在例如諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟A所述之腫瘤片段及/或腫瘤片段的分割或碎解(例如為了獲得全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液)之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、OKT-3及餵養細胞(例如抗原呈現餵養細胞或同種異體經照射PBMC)的血清中。在一些實施例中，IL-2、OKT-3及餵養細胞在培養起始時連同腫瘤碎解物及/或腫瘤片段添加(例如在第0天)。在一些實施例中，腫瘤碎解物及/或腫瘤片段以每容器至多60個片段(在採用片段之實施例中)及6000 IU/mL的IL-2培育於容器中。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至8天)，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至7天)，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至8天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，初始第一擴增發生1至7天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生5至8天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生5至7天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約6至8天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約6至7天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約7至8天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約7天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此初始第一擴增發生約8天，導致通常約1 × 108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一些實施例中，
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010
個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一較佳實施例中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始第一擴增步驟(例如諸如該些圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B中所述者，其可包括稱為REP前或初始REP的過程且其從第0天及/或從培養起始含有餵養細胞)實施，隨後實施如以下步驟D及本文所述的快速第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後實施可選的冷凍保存，及隨後實施如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數鑑定。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3
與10 mm3
之間。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。
在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段。在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段被放入少於或等於4個容器中。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，少於或等於60個腫瘤片段被放入1個容器中。在一些實施例中，各容器包含每容器小於或等於500 mL的培養基。在一些實施例中，培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，培養基包含抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在一些實施例中，培養基包含每容器2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器30 ng/mL的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。
在製備腫瘤片段、全腫瘤碎解物及/或全腫瘤細胞懸浮液後，將所得細胞(即，係初代細胞族群之片段及/或碎解物)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、抗原呈現餵養細胞及OKT-3的培養基中且其允許從第0天培養起始開始TIL起動及加速生長。在一些實施例中，腫瘤碎解物及/或腫瘤片段係與6000 IU/mL的IL-2以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3一起培育。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至8天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在初始第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至7天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在初始第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，該IL-2係重組人IL-2 (rhIL-2)。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20至30×106
IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20×106
IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有25×106
IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有30×106
IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液具有4至8×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有5至7×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有6×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液係如實例C所述製備。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於15 ng/ml與30 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含30 ng/mL的OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施例中，初始第一擴增細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約6000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施例中，初始第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在一些實施例中，CM係實例(見實例A)中所述的CM1。在一些實施例中，初始第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始第一擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為餵養細胞)。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，該確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，該確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L的碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al.
, “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology
, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係1至8天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係2至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係3至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係4至8天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係1至7天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係2至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係2至7天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係3至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係3至7天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係4至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係4至7天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係5至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係5至7天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係6至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係6至7天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係7至8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係8天。在一些實施例中，初始第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或初始REP者)過程係7天。
在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行1天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行1天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行2天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行2天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行3天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行3天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行4天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行4天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行5天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行5天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行6天至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行6天至7天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行7至8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行8天。在一些實施例中，初始第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後可進行7天。
在一些實施例中，TIL的初始第一擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在初始第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在初始第一擴增期間，包括例如在根據圖1(特別是例如圖1B)步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在初始第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，初始第一擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟B)係於密閉系統生物反應器中實施。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-10。1.
餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增(初始REP)期間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第4至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第4至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第5至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第5至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第6至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第6至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第7或8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一擴增期間第8天期間的任何時間添加。
在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或初始REP者)在TIL擴增起始時及初始第一擴增期間需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用2.5 × 108
個餵養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每容器2.5 × 108
個餵養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每GREX-10 2.5 × 108
個餵養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增期間使用每GREX-100 2.5 × 108
個餵養細胞。
一般來說，同種異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估照射同種異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第14天存活細胞總數小於在初始第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在初始第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在初始第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序需要約2.5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序需要約2.5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，初始第一擴增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用於快速第二擴增的餵養細胞數量。
在一些實施例中，初始第一擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，初始第一擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增之培養基包含每容器2.5 x 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，初始第一擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器30 ng的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器每2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、15 µg的OKT-3及2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器每2.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。
在一實施例中，本文所述之初始第一擴增程序在第二擴增期間需要多於TIL的過量餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施例中，在初始第一擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。2.
細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的初始第一擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二種或多於二種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。
C. 步驟 C ：初始第一擴增至快速第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自初始第一擴增(其可包括有時稱為REP前的擴增)的主體TIL族群包括例如獲自例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B的TIL族群可經受快速第二擴增(其可包括有時稱為快速擴增規程(REP)之擴增)且接著如以下討論冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，來自初始第一擴增之經擴增的TIL族群或來自快速第二擴增之經擴增的TIL族群可在擴增步驟之前或在初始第一擴增之後且在快速第二擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。
在一些實施例中，獲自初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施例中，獲自初始第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行快速第二擴增。在一些實施例中，獲自初始第一擴增的TIL在初始第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在腫瘤碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約6天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後約8天發生。
在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後1天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後2天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後2天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後6天至7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後7天發生。在一些實施例中，初始第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一初始擴增步驟起始後8天發生。
在一些實施例中，TIL在初級(primary)第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行快速第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自初始第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行快速第二擴增而無轉變期。
在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增的轉變(例如根據圖1(特別是例如圖1B)之步驟C)係於密閉系統生物反應器中實施。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。在一些實施例中，初始第一擴增至快速第二擴增的轉變涉及容器大小的規模縱向擴大(scale-up)。在一些實施例中，初始第一擴增係於比起快速第二擴增較小的容器中實施。在一些實施例中，初始第一擴增係於GREX-100中實施且快速第二擴增係於GREX-500中實施。
在一些實施例中，在初始第一擴增結束時獲得最多1x106
個細胞TIL。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時獲得0.1 x106
、0.2 x106
、0.3 x106
、0.4 x106
、0.5 x106
、0.6 x106
、0.7 x106
、0.8 x106
、0.9 x106
、1.0 x106
、1.1 x106
、1.2 x106
、1.3 x106
、1.4 x106
或0.5 x106
個TIL。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約9%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約10%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約15%至約30% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約20%至約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約20%至約30% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約10%至約20% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40% PD-1+。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約9%至約40%高PD-1。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約15%至約30%高PD-1。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約20%至約40%高PD-1。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約20%至約30%高PD-1。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約10%至約20%高PD-1。在一些實施例中，在初始第一擴增結束時之TIL係約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%高PD-1。D. 步驟 D ：快速第二擴增
在一些實施例中，TIL細胞族群在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之收集及初始第一擴增(步驟A及步驟B)及稱為步驟C之轉變之後於數量上進一步擴增。此進一步擴增在本文中稱為快速第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(快速擴增規程或REP；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)的擴增過程。快速第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透性容器中完成。在一些實施例中，在快速第二擴增起始後1天、2天、3天或4天(即整體第3代過程的第8、9、10或11天)，將TIL轉移至較大體積容器。
在一些實施例中，在快速第二擴增開始時添加最多1x106
個細胞TIL。在一些實施例中，在快速第二擴增開始時添加0.1 x106
、0.2 x106
、0.3 x106
、0.4 x106
、0.5 x106
、0.6 x106
、0.7 x106
、0.8 x106
、0.9 x106
、1.0 x106
、1.1 x106
、1.2 x106
、1.3 x106
、1.4 x106
或0.5 x106
個TIL。在一些實施例中，來自初始第一擴增之最大細胞密度係1e6個細胞以提供1e9來起始快速第二擴增。
在一些實施例中，TIL的快速第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器實施。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約9天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約10天。
在一實施例中，快速第二擴增可在氣體可通透性容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)實施。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)存在下擴增。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞存在下擴增，其中將餵養細胞添加至最終濃度，該最終濃度是存在於初始第一擴增中之餵養細胞濃度的2倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在介白素-2 (IL-2)或介白素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ or Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35 (27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射的自體淋巴細胞或用經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施例中，第二擴增在經照射的自體淋巴細胞或經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於30 ng/ml與60 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約60 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器7.5 x 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及30 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及7.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 µg的OKT-3及7.5 × 108
個抗原呈現餵養細胞。
在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器介於5 × 108
與7.5 x 108
個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及30 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及介於5 × 108
與7.5 × 108
個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 µg的OKT-3及介於5 × 108
與7.5 × 108
個之間的抗原呈現餵養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈現餵養細胞及可選地TNFRSF促效劑的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比10、約1比15、約1比20、約1比25、約1比30、約1比35、約1比40、約1比45、約1比50、約1比75、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，REP及/或快速第二擴增係於培養瓶中實施，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合，其中餵養細胞細胞濃度是初始第一擴增中之餵養細胞細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。置換培養基(通常經由抽吸2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基置換來置換2/3培養基)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透性容器。
在一些實施例中，快速第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)係7至9天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第二擴增係7天。在一些實施例中，第二擴增係8天。在一些實施例中，第二擴增係9天。
在一實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透性矽底之氣體可通透性培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中實施，5 × 106
或10 × 106
TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 60 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2
中培育。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491 × g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 6000 IU的IL-2之新鮮培養基再懸浮，並添加回原始GREX-100培養瓶。當TIL於GREX-100培養瓶中連續擴增時，在第10或11天可將TIL移至較大培養瓶，諸如GREX-500。細胞可在培養的第14天收集。細胞可在培養的第15天收集。細胞可在培養的第16天收集。在一些實施例中，進行置換培養基直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施例中，藉由抽吸2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基置換來置換掉2/3的培養基。在一些實施例中，替代性生長室包括GREX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透性容器。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，該確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM (ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，該確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+
、Al3+
、Ba2+
、Cd2+
、Co2+
、Cr3+
、Ge4+
、Se4+
、Br、T、Mn2+
、P、Si4+
、V5+
、Mo6+
、Ni2+
、Rb+
、Sn2+
及Zr4+
之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L的碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al.
, “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology
, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一實施例中，快速第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經實施且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在快速第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定實施細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施例中，存活性係根據標準細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之7.5 x 108
個抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之5 x 108
個抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中實施。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-500。1.
餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之快速第二擴增程序(例如包括諸如該些圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，同種異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估照射同種異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第7或14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比10、約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的兩倍數量的餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約7.5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，快速第二擴增需要初始第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數量的餵養細胞。
在一些實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的相同數量的餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約7.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約7.5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，快速第二擴增需要初始第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數量的餵養細胞。
在一些實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約100 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約50 x 106
個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5 x 108
個餵養細胞對約25 x 106
個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的相同數量的餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約2.5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約5 x 108
個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之初始第一擴增需要約7.5 x 108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約7.5 x 108
個餵養細胞。
在一實施例中，本文所述之快速第二擴增程序在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。在一些實施例中，PBMC係以添加至初始第一擴增之PBMC濃度的兩倍添加至快速第二擴增。
一般來說，同種異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施例中，在快速第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010
個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
2.
細胞介素
本文所述之快速第二擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二種或多於二種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。E. 步驟 E ：收集 TIL
在快速第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所提供之一、二、三、四個或超過四個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B)所提供之二個擴增步驟(一個初始第一擴增及一個快速第二擴增)之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中實施細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中實施。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-500。
在一些實施例中，根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟E係根據本文所述之過程實施。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施例中，採用本文所述的密閉系統。
在一些實施例中，根據本文所述之方法收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法收集介於第14與16天之間的TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在14天收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在15天收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在16天收集TIL。F. 步驟 F ：最終調配 / 轉移至輸注袋
在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至病患。在一些實施例中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至病患。
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。如本文揭露擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，TIL係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。G.PBMC
餵養細胞比
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(見例如圖1(特別是例如圖1B及 / 或圖 1C)
)的培養基包括抗CD3抗體例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如Tsoukaset al.
,J. Immunol.
1985,135,
1719，全文特此以引用方式併入本文中。
在一實施例中，PBMC餵養細胞層的數量如下計算：
A. T細胞體積(直徑10 µm)：V
=(4/3) πr3
=523.6 µm3
B.具有40 µm(4個細胞)高度之G-Rex 100 (M)體積：V
=(4/3) πr3
=4×1012
µm3
C.需要填滿B體積的細胞數量：4×1012
µm3
/523.6 µm3
=7.6×108
µm3
* 0.64=4.86×108
D.可在4D空間中被最佳活化的細胞數量：4.86×108/
24=20.25×106
E.外推至G-Rex 500之餵養細胞及TIL數量：TIL：100×106
及餵養細胞：2.5×109
在此計算中，使用在具有100 cm2
基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數量。計算得到約5×108
的實驗結果為T細胞活化臨限，其密切反映NCI實驗資料。(1)
(C)乘數(0.64)是如Jaeger及Nagel在1992年計算的當量球體隨機填充密度(2)
。(D)除數24是4維空間中可接觸類似物體的當量球體數量「牛頓數」(3)
。
(1)
Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2)
Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3)
O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
在一實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量大約是在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量的一半。在某些實施例中，方法包含在相較於快速第二擴增的細胞培養基包含大約50%較少抗原呈現細胞的細胞培養基中實施初始第一擴增。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞(APC)數量大於初始第一擴增期間外源供應的APC數量。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約2:1。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在初始第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在另一實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約4×108
個APC至在或約7.5×108
個APC的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約2×108
個APC至在或約2.5×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約4.5×108
個APC至在或約5.5×108
個APC的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約2.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約5×108
個APC。
在一實施例中，在初始第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)數量係在初始第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC數量的大約一半。在某些實施例中，方法包含在初始第一擴增第0天添加抗原呈現細胞至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞的數量係在初始第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加之抗原呈現細胞數量的大約50%。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量大於初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數量。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以選自在或約2×106
個APC/cm2
至在或約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以在或約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
的密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至約6.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約2×106
個APC/cm2
至在或約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約4×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在初始第一擴增中外源供應的APC係以在或約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以在或約4×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約2:1。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC(包括例如PBMC)。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1x108
個APC(包括例如PBMC)至在或約3.5x108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約3.5x108
個APC(包括例如PBMC)至在或約1x109
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1.5x108
個APC至在或約3x108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約4x108
個APC(包括例如PBMC)至在或約7.5x108
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約3.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約3.5×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約1×109
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約4×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約7.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約2×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約2.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約4.5×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約5.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施例中，在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約2.5×108
個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約5×108
個APC(包括例如PBMC)。
在一實施例中，在初始第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)層數係在快速第二擴增第7天添加的APC(包括例如PBMC)層數的大約一半。在某些實施例中，方法包含在初始第一擴增第0天添加抗原呈現細胞層至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞層至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞層的數量係在第7天添加之抗原呈現細胞層數量的大約50%。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數大於在初始第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約1個細胞層至在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層至在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、2或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:10的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:8的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:7的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:6的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:5的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:4的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:3的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:2的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.2至在或約1:8的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.3至在或約1:7的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.4至在或約1:6的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.5至在或約1:5的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.6至在或約1:4的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.8至在或約1:3的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係在或約1:2。
在另一實施例中，初始第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約1.0×106
個APC/cm2
至約4.5×106
個APC/cm2
的範圍，且該快速第二擴增中APC數量係選自約2.5×106
個APC/cm2
至約7.5×106
個APC/cm2
的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約1.5×106
個APC/cm2
至約3.5×106
個APC/cm2
的範圍，且該快速第二擴增中APC數量係選自約3.5×106
個APC/cm2
至約6.0×106
個APC/cm2
的範圍。
在一些實施例中，該初始第一擴增中APC數量係選自約2.0×106
個APC/cm2
至約3.0×106
個APC/cm2
的範圍，且該快速第二擴增中APC數量係選自約4.0×106
個APC/cm2
至約5.5×106
個APC/cm2
的範圍。H. 可選的細胞培養基組分 1.
抗CD3抗體
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(見例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C))的培養基包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如Tsoukaset al.
,J. Immunol. 1985, 135,
1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ or Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。
2.
4-1BB (CD137)促效劑
在一實施例中，初始第一擴增及/或快速第二擴增之細胞培養基包含TNFRSF促效劑。在一實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB (CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB粘連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al.
,PLOS One 2013
,8,
e69677。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施例中，4-1BB促效劑係EU-101 (Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二個或超過二個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al.
,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12,
2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，4-1BB促效劑係由以高親和性及促效性活性與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合來鑑定。在一實施例中，4-1BB促效劑係與人4-1BB (SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB (SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表6中。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約7.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約8 × 105
l/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約8.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約9 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約9.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合或以約1 × 106
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.1 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.2 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.3 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.4 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.5 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.6 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合或以約2.7 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.8 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.9 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合或以約3 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(全人)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表7所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之糖基化位點；位於位置22-96 (VH
-VL
)、143-199 (CH
1-CL
)、256-316 (CH
2)及362-420 (CH
3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’-87’ (VH
-VL
)及136’-195’ (CH
1-CL
)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218-218、219-219、222-222及225-225、位於IgG2A/B異構體位置218-130、219-219、222-222及225-225、及位於IgG2B異構體位置219-130 (2)、222-222及225-225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130-213’ (2)、IgG2A/B異構體位置218-213’及130-213’及位於IgG2B異構體位置218-213’ (2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及性質係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al.
,Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61,
1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。https://en.wikipedia.org/wiki/Single-chain_variable_ fragment在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(全人)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表EE所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298’’)之N-糖基化位點；位於位置22-95 (VH
-VL
)、148-204 (CH
1-CL
)、262-322 (CH
2)及368-426 (CH
3)(及位於位置22’’-95’’、148’’-204’’、262’’-322’’及368’’-426’’)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’-88’ (VH
-VL
)及136’-196’ (CH
1-CL
)(及位於位置23’’’-88’’’及136’’’-196’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227-227’’及230-230’’之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135-216’及135’’-216’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及性質係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al.
,Clin. Cancer Res. 2016, available at
http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。https://en.wikipedia.org/wiki/Single-chain_variable_fragment在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
在一實施例中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組：1D8、3Elor、4B4 (BioLegend 309809)、H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532)、BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX)、145501 (Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4 (BioLegend 31 1503)、C65-485 (BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl (BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係如圖131所提供之結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL(4-1BB配體、CD137配體(CD137L)或腫瘤壞死因子超家族成員9 (TNFSF9))或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二個三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH
3及CH
2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH
及VL
鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories
,2011, 10
, 44；Ahmad,et al.
,Clin. & Dev. Immunol. 2012,
980250；Monnier,et al.
,Antibodies, 2013, 2,
193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF促效劑融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表10所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表11給出之VH
及VL
序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH
結構域連接至任何前述者之VL
結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施例中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。3.
OX40 (CD134)促效劑
在一實施例中，TNFRSF促效劑係OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施例中，OX40促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，OX40促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40粘連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施例中，OX40促效劑係促效性抗OX40人化或全人類單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al.
,J. Immunother. 2009, 182,
1481-89。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二個或超過二個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al.
,Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12,
2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al.
,Cancer Res. 2013
,73,
7189-98。在一較佳實施例中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，OX40促效劑係由以高親和性及促效性活性與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合來鑑定。在一實施例中，OX40促效劑係與人OX40 (SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施例中，OX40促效劑係與鼠OX40 (SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表12中。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約7.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約8 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約8.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約9 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約9.5 × 105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合或以約1 × 106
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.1 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.2 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.3 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.4 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.5 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.6 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合或以約2.7 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.8 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.9 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合或以約3 × 10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人
TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表13所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301’’之N-糖基化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚糖；位於位置22-95 (VH
-VL
)、148-204 (CH
1-CL
)、265-325 (CH
2)及371-429 (CH
3)(及位於位置22’’-95’’、148’’-204’’、265’’-325’’及371’’-429’’)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’-88’ (VH
-VL
)及134’-194’ (CH
1-CL
)(及位於位置23’’’-88’’’及134’’’-194’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230-230’’及233-233’’之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224-214’及224’’-214’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。https://en.wikipedia.org/wiki/Single-chain_variable_fragment在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
在一些實施例中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。11D4之製備及性質係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。https://en.wikipedia.org/wiki/Single-chain_variable_fragment在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
在一些實施例中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。18D8之製備及性質係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表15所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。https://en.wikipedia.org/wiki/Single-chain_variable_fragment在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu119-122之製備及性質係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表16所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu106-222之製備及性質係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表17所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
在一些實施例中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al.
,J. Immunother
.2006
,29
, 575-585。在一些實施例中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al.
,J. Immunother
.2006
,29
, 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施例中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(OX86選殖株)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施例中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括20E5及12H3選殖株)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之性質係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表17所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表14給出之VH
及VL
序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施例中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH
結構域連接至任何前述者之VL
結構域。
在一實施例中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性抗體選殖株Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。I.
可選的細胞存活性分析
可選地，在初始第一擴增(有時稱為初始主體擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定實施細胞存活性測定。因此，在某些實施例中，方法包含在初始第一擴增後實施細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。其他用於測試存活性之測定可包括但不限於阿爾瑪藍測定及MTT測定。1.
細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施例中，測量細胞計數及/或存活性。標誌之表現(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文揭示或描述者)可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCantoTM
流動式細胞測量儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於該些可購自BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA)者)測量。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且存活性可使用任何所屬技術領域中已知之方法包括但不限於台盼藍染色評估。細胞存活性亦可基於USSN 15/863,634測定，其全文以引用方式併入本文中。細胞存活性亦可基於美國專利公開號2018/0280436或國際專利公開號WO/2018/081473測定，兩者全文皆併入本文中以符合所有目的。
在一些情況下，主體TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可如以下討論進行REP且接著冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，主體或REP TIL族群可進行基因修飾以用於合適治療。2.
細胞培養
在一實施例中，用於擴增TIL之方法(包括該些以上討論以及圖1特別是例如圖1B及/或圖1C例示者)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞培養基。在一些實施例中，培養基係不含血清培養基。在一些實施例中，在初始第一擴增中之培養基係無血清。在一些實施例中，在第二擴增中之培養基係不含血清。在一些實施例中，在初始第一擴增及第二擴增(亦稱為快速第二擴增)中之培養基皆無血清。在一實施例中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的培養基的量及培養基類型的數量。在一實施例中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在氣體可通透性容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透性容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透性容器中培養達一段約1至8天(例如，約8天)的期間作為初始第一擴增，該第一氣體可通透性容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透性容器且於該第二氣體可通透性容器中擴增TIL數量達一段約7至9天(例如，約7天、約8天或約9天)的期間，該第二氣體可通透性容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透性容器中培養達一段約1至7天(例如，約7天)的期間作為初始第一擴增，該第一氣體可通透性容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透性容器且於該第二氣體可通透性容器中擴增TIL數量達一段約7至9天(例如，約7天、約8天或約9天)的期間，該第二氣體可通透性容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透性容器中培養達一段約1至7天(例如，約7天)的期間作為初始第一擴增，該第一氣體可通透性容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透性容器且於該第二氣體可通透性容器中擴增TIL數量達一段約7至10天(例如，約7天、約8天、約9天或約10天)的期間，該第二氣體可通透性容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，TIL係在氣體可通透性容器中擴增。已使用氣體可通透性容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，TIL係在氣體可通透性袋子中擴增。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透性袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25 (GE Healthcare)。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透性袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5 (GE Healthcare)。在一實施例中，細胞擴增系統包括氣體可通透性細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施例中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施例允許細胞族群自約5 x 105
個細胞/cm2
擴增至介於10 x 106
與30 x 106
個細胞/cm2
之間。在一實施例中，此係未進行餵養。在一實施例中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的培養基位在約10 cm的高度。在一實施例中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施例中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與培養基混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al.
,J. Immunotherapy, 2012
, 35:283-292。J. 可選的 TIL 基因工程改造
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL在擴增步驟之前、之期間或之後包括在密閉、無菌製程期間(各提供於本文中)經進一步操作以用暫時性方式改變蛋白質表現。在一些實施例中，暫時性改變的蛋白質表現是因為暫時性基因編輯。在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施例中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在某些實施例中，方法包含基因編輯TIL族群。在某些實施例中，方法包含基因編輯第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。
在一些實施例中，本發明包括經由核苷酸插入TIL族群之基因編輯，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包括插入傳訊RNA (mRNA)或小(或短)干擾RNA (siRNA)，以促進一或多個蛋白質的表現或抑制一或多個蛋白質的表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質的組合。
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL經歷蛋白質表現的暫時性改變。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖1(特別是圖1B及圖1C)所示之步驟A的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增期間，包括例如在例如圖1(例如圖1B)所示之步驟B擴增的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之後，包括例如在第一至第二擴增之間轉變的TIL族群中(例如本文所述之第二TIL族群)、獲自例如圖1所示之步驟B且包括於步驟C之TIL族群。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖1所示之步驟C且在彼之步驟D擴增之前的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增期間，包括例如在例如圖1所示之步驟D擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之後，包括例如在獲自例如圖1所示之步驟D擴增的TIL族群中。
在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括電穿孔的步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J.
1991,60,
297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括磷酸鈣轉染的步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面包覆及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology
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456-467; Wigler,et al.
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1987,7,
2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括脂質體轉染的步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N
-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n
,n
,n
-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al.
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7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致幹記憶T細胞(TSCM)增加。TSCM是抗原經歷中央記憶T細胞的早期祖細胞。TSCM通常顯示定義幹細胞的長期存活、自我再生及多能能力，且通常為產製有效TIL產物之所欲。TSCM在過繼性細胞轉移的小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集增強的抗腫瘤活性(Gattinoniet al
. Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieriet al
. Blood 2013)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有包含高比例的TSCM組成的TIL族群。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIL族群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的TIL族群。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的治療性TIL族群。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施例中，回春包括例如增加增生、增加T細胞活化及/或增加抗原辨識。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現改變一大部分T細胞的表現，以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤衍生之TCR貯庫。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質導致改變特定基因的表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向包括但不限於下列基因：PD-1(亦稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A (PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB (CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A (PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4/5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2 (MCP-1)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3 (MIP-1α)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4 (MIP1-β)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5 (RANTES)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白質激酶A (PKA)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施例中，因暫時性蛋白質表現而過度表現的趨化激素受體包括配體包括但不限於CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17之受體。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及/或TGFβ的表現降低及/或減少(包括導致例如TGFβ途徑阻斷)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CBLB (CBL-B)的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL移動或運動至腫瘤部位。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CCR(嵌合共刺激受體)增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3所組成之群組的趨化激素受體增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致介白素增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21所組成之群組的介白素增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致VHL增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CD44增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致cAMP蛋白質激酶A (PKA)的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的二個分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (Br3)及彼等之組合所組成之群組的一個分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及PD-1的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CBLB的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合所組成之群組的黏著性分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群(例如黏著性分子的表現增加)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。
在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
在一些實施例中，表現增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%。在一些實施例中，表現增加至少約85%。在一些實施例中，表現增加至少約90%。在一些實施例中，表現增加至少約95%。在一些實施例中，表現增加至少約99%。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現係藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理TIL來誘導。在一些實施例中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子的細胞內遞送。該等證實遞送蛋白質(包括轉錄因子)至多種初代人細胞(包括T細胞)之能力的方法(Shareiet al
. PNAS 2013以及Shareiet al.
PLOS ONE 2015及Greisbecket al.
J. Immunology vol. 195, 2015)已經描述；見例如，國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/ 123663A1，所有全文皆以引用方式併入本文中。該等描述於國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1之方法可為本發明所採用，以暴露TIL族群至轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子，其中該等TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子提供增加腫瘤抗原的表現及/或增加TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量，因此導致TIL族群的重新編程及經重新編程之TIL族群相較於未重新編程之TIL族群的治療療效增加。在一些實施例中，重新編程導致效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群相對於如本文所述之TIL的起始或先前(即在重新編程之前)族群增加。
在一些實施例中，轉錄因子(TF)包括但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係TCF-1。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係與誘導多能幹細胞培養(iPSC)諸如市售KNOCKOUT Serum Replacement (Gibco/ThermoFisher)一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係與iPSC雞尾酒一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施例中，轉錄因子(TF)不與iPSC雞尾酒一起投予。在一些實施例中，重新編程導致TSCM的百分比增加。在一些實施例中，重新編程導致TSCM的百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的TSCM。
在一些實施例中，如上述之暫時性改變蛋白質表現如上述之方法可與基因修飾TIL族群之方法組合，包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在某些實施例中，方法包含基因修飾TIL族群的步驟。在某些實施例中，方法包含基因修飾第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al.
,Proc. Nat’l Acad. Sci.
2006,103,
17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol.
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1998,72
, 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol.
1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al.
,Mol. Therapy
2010,18,
674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現係指由自我遞送RNA干擾(sdRNA)所誘導之表現減少，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2′-OH取代(一般為氟或-OCH3
)之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3′端接合至膽固醇。在一些實施例中，方法包含暫時性改變TIL族群中之蛋白質表現，包含使用自我遞送RNA干擾(sdRNA)，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3
)之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3′端接合至膽固醇。使用sdRNA之方法已描述於Khvorova and Watts,Nat. Biotechnol.
2017,35,
238-248；Byrne,et al.
,J. Ocul. Pharmacol. Ther.
2013,29,
855-864；及Ligtenberg,et al.
,Mol. Therapy,
2018(印製中)，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群不需使用電穿孔、SQZ或其他方法完成，而是使用1至3天期間使TIL族群暴露於濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA。在某些實施例中，方法包含遞送sdRNA至TIL族群，包含使TIL族群暴露於濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA介於1至3天之間的期間。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露於濃度為10 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露於濃度為50 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露於濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露於濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間之sdRNA完成，其中暴露於sdRNA藉由添加新鮮sdRNA至培養基來實施二、三、四或五次。其他合適過程係描述於例如美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1、US 2013/0131141 A1及US 2013/0131142 A1號及美國專利第9,080,171號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，在製造期間將sdRNA插入TIL族群中。在一些實施例中，sdRNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白質激酶A (PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施例中，表現減少係基於基因靜默的百分比判定，例如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評估。在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
基於化學修飾siRNA之可自我遞送RNAi技術可為本發明之方法所採用，以成功遞送sdRNA至如本文所述之TIL。組合不對稱siRNA結構對主鏈的修飾與疏水性配體(見例如Ligtenberg,et al.
,Mol. Therapy,
2018及US20160304873)允許sdRNA藉由簡單添加至培養基而穿透培養的哺乳動物細胞，不需要額外調配物及方法，充分利用sdRNA的核酸酶穩定性。此穩定性允許在只需維持sdRNA於培養基中的有效濃度下，支持恆定量的RNAi媒介之目標基因活性減少。雖然不受理論限制，sdRNA的主鏈穩定化提供延長減少基因表現效應，其在非分裂細胞中可持續數月。
在一些實施例中，超過95%的TIL轉染效率及目標的表現減少藉由各種特異性sdRNA發生。在一些實施例中，含有數個未經修飾的核糖殘基之sdRNA係經完全修飾的序列置換，以增加RNAi效應的效力及/或壽命。在一些實施例中，表現減少效應係維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或超過8天。在一些實施例中，表現減少效應在TIL經sdRNA處理後10天或超過10天降低。在一些實施例中，目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施例中，TIL中的目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施例中，PD-1/PD-L1途徑的表現減少允許TIL展現更強效的體內效應，這在一些實施例中是因為避免PD-1/PD-L1途徑的抑制效應。在一些實施例中，因sdRNA之PD-1表現減少導致增加TIL增生。
小干擾RNA (siRNA)(有時稱為短干擾RNA或靜默RNA)是一種雙股RNA分子，長度通常為19至25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其利用互補核苷酸序列干擾特定基因的表現。
雙股DNA (dsRNA)通常可用於定義包含一對RNA互補股(通常為同義(乘客)及反義(引導)股)之任何分子且可包括單股懸端區。相對於siRNA，用語dsRNA通常係指包括siRNA分子序列的前驅物分子，該siRNA分子係藉由切割酶系統包括Dicer酶的作用從較大dsRNA分子釋放。
sdRNA(可自我遞送RNA)是一種新類型的經共價修飾的RNAi化合物，其不需要遞送媒劑即可進入細胞且相較於傳統siRNA具有改善的藥理學。「可自我遞送RNA」或「sdRNA」是經疏水性修飾的RNA干擾-反義雜交物，經證實在體外初代細胞及體內局部投予時高度有效。已證實強健攝取及/或靜默且無毒性。sdRNA是大致上不對稱的經化學修飾的核酸分子，具有極少雙股區域。sdRNA分子一般含有單股區域及雙股區域，且在分子的單股及雙股區域內皆可含有多種化學修飾。此外，sdRNA分子可附接至疏水性接合物，諸如本文所述之習知及先進的固醇類分子。sdRNA及製造該等sdRNA之相關方法亦廣泛描述於例如US20160304873、WO2010033246、WO2017070151、WO2009102427、WO2011119887、WO2010033247A2、WO2009045457、WO2011119852，彼等所有全文皆以引用方式併入本文中以用於所有目的。為了最佳化sdRNA結構、化學、靶向位置、序列優先性等，發展了專用演算法且運用於sdRNA的效力預測(見例如，US 20160304873)。基於這些分析，功能性sdRNA序列通常被定義為在1 µM濃度下具有超過70%的表現減少，且機率超過40%。
在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM至約4 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。
在一些實施例中，寡核苷酸劑包含一或多種修飾以增加治療劑的穩定性及/或有效性及致效寡核苷酸至所欲治療之細胞或組織的有效遞送。該等修飾可包括2'-O-甲基修飾、2'-O-氟基修飾、二硫代磷酸酯修飾、2' F修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的及/或2'去氧核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸係經修飾以包括一或多種疏水性修飾，包括例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在額外特定實施例中，經化學修飾的核苷酸係硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施例中，糖可經修飾且經修飾的糖可包括但不限於D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基及2'-0-乙基)，即2'-烷氧基、2'-胺基、2'-S-烷基、2'-鹵基(包括2'-氟基)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙基氧基(-OCH2
CH=CH2
)、2'-丙炔基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及類似物。在一實施例中，糖部份可為己糖且如所述併入寡核苷酸中(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992))。
在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸的全長係雙股，即分子任一端不具有懸端單股序列，即為鈍端。在一些實施例中，個別核酸分子可具有不同長度。換句話說，本發明之雙股寡核苷酸不是全長雙股。例如，當使用二個分開的核酸分子時，其中一個分子例如包含反義序列的第一分子可比與其雜交之第二分子更長(留下一部分的分子為單股)。在一些實施例中，當使用單一核酸分子時，一部分的分子在任一端可維持單股。
在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在寡核苷酸至少約70%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約80%的長度中為雙股。在另一實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約90%至95%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約96%至98%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施例中，寡核苷酸可藉由修飾例如3'或5'鍵聯(例如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526)而實質上不受核酸酶作用。例如，可藉由納入「阻斷基團」而使寡核苷酸具有抗性。本文中使用之用語「阻斷基團」係指可附接至寡核苷酸或核單體(nucleomonomer)作為合成之保護基或偶合基團(例如FITC、丙基(CH2
-CH2
-CH3
)、二醇(-0-CH2
-CH2
-O-)磷酸鹽(PO3 2"
)、氫膦酸鹽或胺基磷酸酯(phosphoramidite))之取代基(例如除OH基團以外)。「阻斷基團」亦可包括保護寡核苷酸的5'及3'末端的「末端阻斷基團」或「核酸外切酶阻斷基團」，其包括經修飾的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。
在一些實施例中，sdRNA內之至少一部分毗連多核苷酸係藉由取代基鍵聯例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施例中，化學修飾可導致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500種細胞攝取增強(enhancements in cellular uptake)。在一些實施例中，C或U殘基中之至少一者包括疏水性修飾。在一些實施例中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的C及U可含有疏水性修飾。在一些實施例中，所有C及U含有疏水性修飾。
在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA經由併入可質子化胺展現增強的胞內體釋放sd-rxRNA分子。在一些實施例中，可質子化胺被併入同義股(在RISC裝載後被棄置的分子部分)。在一些實施例中，本發明之sdRNA化合物包含不對稱化合物，該不對稱化合物包含雙股區域(有效RISC進入所需，10至15個鹼基長)及4至12個核苷酸長的單股區域；具有13個核苷酸雙股。在一些實施例中，採用6個核苷酸的單股區域。在一些實施例中，sdRNA之單股區域包含2至12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施例中，採用6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明之sdRNA化合物亦包括獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。
舉例來說，引導股亦可藉由任何證實穩定性且不干擾RISC進入的化學修飾來修飾。在一些實施例中，引導股中的化學修飾模式包括大部分C及U核苷酸是2' F修飾的，且5'端經磷酸化。
在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%的核苷酸是經修飾的。在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸是經修飾的。在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中100%的核苷酸是經修飾的。
在一些實施例中，sdRNA分子具有極少雙股區域。在一些實施例中，雙股的分子區域從8至15個核苷酸長不等。在一些實施例中，雙股的分子區域是8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施例中，雙股區域是13個核苷酸長。引導與乘客股之間可有100%互補性，或者引導與乘客股之間可有一或多個錯配。在一些實施例中，在雙股分子的一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸懸端。分子的單股區域在一些實施例中是介於4至12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區域可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區域亦可少於4個或大於12個核苷酸長。在某些實施例中，單股區域是6或7個核苷酸長。
在一些實施例中，sdRNA分子具有降低的穩定性。在一些情況下，經化學修飾的sdRNA或sd-rxRNA分子在培養基中具有長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時或超過24小時(包括任何中間值)的半衰期。在一些實施例中，sd-rxRNA在培養基中具有長於12小時的半衰期。
在一些實施例中，sdRNA係經最佳化以增加效力及/或減少毒性。在一些實施例中，引導及/或乘客股的核苷酸長度及/或引導及/或乘客股中的硫代磷酸酯修飾數量在一些態樣可影響RNA分子的效力，然而以2'-0-甲基(2'OMe)修飾置換2'-氟基(2'F)修飾在一些態樣中可影響分子的毒性。在一些實施例中，預期減少分子的2'F含量可減少分子的毒性。在一些實施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾的數量可影響細胞的分子攝取，例如被動攝取分子至細胞中的效率。在一些實施例中，sdRNA不具有2'F修飾，但仍藉由相等的細胞攝取性及組織穿透效率來鑑定。
在一些實施例中，引導股的長度大約是18至19個核苷酸且具有大約2至14個磷酸鹽修飾。例如，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或超過14個經磷酸鹽修飾的核苷酸。引導股可含有一或多個授予增加的穩定性且不干擾RISC進入的修飾。經磷酸鹽修飾的核苷酸(諸如經硫代磷酸酯修飾的核苷酸)可位於3'端、5'端或分布在整個引導股。在一些實施例中，引導股3'末端之10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2'F及/或2'OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施例中，在引導股位置一之核苷酸(引導股最5'位置的核苷酸)是經2'OMe修飾的及/或經磷酸化的。引導股內的C及U核苷酸可經2'F修飾。例如，19個nt之引導股的位置2至10(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2'F修飾。引導股內的C及U核苷酸亦可經2'OMe修飾。例如，19個nt之引導股的位置11至18(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2'OMe修飾。在一些實施例中，在引導股最3’端的核苷酸未經修飾。在某些實施例中，在引導股內大部分C及U係經2'F修飾且引導股的5'端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1及在位置11至18的C或U係經2'OMe修飾且引導股的5'端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1及在位置11至18的C或U係經2'OMe修飾，引導股的5'端係經磷酸化且在位置2至10的C或U係經2'F修飾。
可自我遞送RNAi技術提供用RNAi劑直接轉染細胞之方法，無須額外調配物或技術。轉染難以轉染細胞系的能力、高體內活性及易於使用是這類組成物及方法的特徵，相較於基於siRNA之傳統技術呈現顯著功能優點，且因此在數個關於在本發明之TIL中目標基因表現減少的方法之實施例中採用sdRNA方法。sdRNAi方法允許直接遞送化學合成化合物至廣泛範圍的離體(ex-vivo
)及體內初代細胞及組織。在本發明的一些實施例中描述的sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
sdRNA係形成為經疏水性修飾的siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，sdRNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所述之TIL。在某些實施例中，方法包含無菌電穿孔TIL族群以遞送sdRNA寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合以遞送至細胞。在一些實施例中，此跨膜遞送系統包含脂質、病毒載體及類似物。在一些實施例中，寡核苷酸劑係自我遞送RNAi劑，不需要任何遞送劑。在某些實施例中，方法包含使用跨膜遞送系統遞送sdRNA寡核苷酸至TIL族群。
寡核苷酸及寡核苷酸組成物接觸(例如，使接觸，在本文中亦稱為投予或遞送至)本文所述之TIL且被攝入，包括經由TIL被動攝取。sdRNA可在第一擴增期間(例如，步驟B)、在第一擴增之後(例如，步驟C期間)、第二擴增之前或期間(例如，步驟D之前或期間)、步驟D之後及步驟E收集之前、步驟F收集期間或之後、步驟F最終調配物及/或轉移至輸注袋之前或期間、以及步驟F任何可選的冷凍保存步驟之前添加至本文所述之TIL。另外，sdRNA可在從步驟F任何冷凍保存步驟解凍後添加。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM所組成之群組的濃度添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由0.1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.75 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.25 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、2 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基或10 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA在REP前或REP階段期間，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。
本發明之寡核苷酸組成物包括sdRNA可在擴增過程期間與本文所述之TIL接觸，例如以高濃度溶解sdRNA於細胞培養基中且允許足夠時間讓被動攝取發生。在某些實施例中，本發明之方法包含使TIL族群與如本文所述之寡核苷酸組成物接觸。在某些實施例中，方法包含將寡核苷酸例如sdRNA溶解於細胞培養基中且使細胞培養基與TIL族群接觸。TIL可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。
在一些實施例中，遞送寡核苷酸至細胞中可藉由合適的本領域認可方法增強，包括磷酸鈣、DMSO、甘油或葡聚糖、電穿孔，或藉由使用例如陽離子、陰離子或中性脂質組成物或脂質體使用所屬技術領域中已知之方法轉染(見例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美國專利第4,897,355號；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21 :3567)。
在一些實施例中，使用超過一個sdRNA來減少目標基因的表現。在一些實施例中，一起使用一或多個靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH之sdRNA。在一些實施例中，使用PD-1 sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者，以減少超過一個基因目標的表現。在一些實施例中，使用LAG3 sdRNA與靶向CISH之sdRNA的組合，以減少兩個目標的基因表現。在一些實施例中，在本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者之sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
在一些實施例中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且另一個sdRNA靶向選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的基因。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向CISH且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向PD-1。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CBLB。
如上所討論，本發明之實施例提供經由基因編輯以增強治療效應之經基因修飾的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。本發明之實施例包含經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL族群之基因編輯，以促進一或多種蛋白質的表現及抑制一或多種蛋白質的表現以及彼等之組合。本發明之實施例亦提供用於擴增TIL成治療性族群之方法，其中該方法包含基因編輯TIL。有數種可用來基因修飾TIL族群之基因編輯技術，彼等適用於本發明。
在一些實施例中，方法包含基因修飾TIL族群之方法，其包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al.
,Proc. Nat’l Acad. Sci.
2006,103,
17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol.
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871-75；Dull,et al.
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1998,72
, 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol.
1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al.
,Mol. Therapy
2010,18,
674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，方法包含基因修飾TIL族群例如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群之方法。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括穩定併入基因以產生或抑制(例如靜默)一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J.
1991,60,
297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。可使用其他所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，電穿孔方法係無菌電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以在TIL中誘導孔洞形成的步驟，包含施加至少三次具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同，以使得經誘導的孔洞持續相對長的期間，且使得TIL的存活性得以維持。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面包覆及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology
1973,52,
456-467; Wigler,et al.
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1979,76,
1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol.
1987,7,
2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N
-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n
,n
,n
-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體調配物的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al.
,Biotechniques
1991,10,
520-525及Felgner,et al.
,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 1987,84,
7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。TIL可為如本文所述之TIL第一族群、第二族群及/或第三族群。
根據實施例，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。該等可編程核酸酶藉由在特定基因座導入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，即彼等依賴辨識基因體內特定DNA序列以將核酸酶結構域靶向此位置且在靶向序列媒介產生雙股斷裂。DNA中的雙股斷裂後續吸引內源性修復機轉至斷裂部位，以藉由非同源末端聯結(NHEJ)或同源引導修復(HDR)媒介基因體編輯。因此，斷裂修復可導致導入破壞(例如靜默、阻抑或增強)目標基因產物的插入/刪除突變。
經發展而能夠進行定點基因體編輯的主要核酸酶類型包括鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。這些核酸酶系統可基於彼等之DNA辨識模式大致分為兩大類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA交互作用達成特異性DNA結合，然而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由與目標DNA直接鹼基配對的短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA交互作用來靶向特定DNA序列。見例如Coxet al.
,Nature Medicine,
2015, Vol. 21, No. 2。
可用於本發明之TIL擴增方法之基因編輯方法的非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，彼等在以下更詳細描述。根據一實施例，用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者基因編輯至少一部分的TIL，以產生可提供增強治療效應的TIL。根據一實施例，可藉由體外比較經基因編輯的TIL與未經修飾的TIL來評估彼等之改善的治療效應，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之體外效應功能、細胞介素輪廓等。在某些實施例中，方法包含使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法基因編輯TIL族群。
在本發明之一些實施例中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例的合適流式電穿孔系統實例係市售MaxCyte STX系統。有數種可供選擇之市售電穿孔儀器可能適用於本發明，諸如可得自BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra (Cellectricon)之AgilePulse系統或ECM 830、Nucleofector (Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell (BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96 (Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
CRISPR代表「叢聚規律間隔短迴文重複(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」。使用CRISPR系統進行基因編輯的方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型的CRISPR系統，其中併入RNA及Cas蛋白質且可用於本發明：第I、II及III型。第II型CRISPR(由Cas9例示)是最廣為表徵的系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物的結構域)的天然防衛機制。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA及各種Cas蛋白質(包括Cas9)，藉由切碎並摧毀外來入侵者的DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR是具有二個獨特特徵的DNA特化區域：有核苷酸重複及間隔子存在。核苷酸的重複序列分布在整個CRISPR區域，且在重複序列之間穿插有短區段的外來DNA(間隔子)。在第II型CRISPR/Cas系統中，間隔子係整合在CRISPR基因座內且經轉錄及處理成短CRISPR RNA (crRNA)。這些crRNA與反式活化crRNA (tracrRNA)黏合且引導Cas蛋白質進行序列特異性切割及靜默致病性DNA。Cas9蛋白質進行的目標辨識需要位在crRNA內的「種子」序列及在crRNA結合區域上游的含有二核苷酸之保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向，可切割幾乎任何DNA序列。天然系統中的crRNA及tracrRNA可被簡化成大約100個核苷酸的單一導引RNA (sgRNA)以用於基因工程改造。CRISPR/Cas系統藉由共遞送表現Cas9內切核酸酶及必要crRNA組分之質體可直接移動至人細胞。可使用Cas蛋白質的不同變體以減少靶向限制(例如Cas9同源基因，諸如Cpf1)。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由CRISPR方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,697,359；8,993,233；8,795,965；8,771,945；8,889,356；8,865,406；8,999,641；8,945,839；8,932,814；8,871,445；8,906,616及8,895,308號，彼等以引用方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體可購自公司諸如GenScript。
在一實施例中，如本文所述之TIL族群的基因修飾可使用如美國專利第US 9790490號所述之CRISPR/Cpf1系統實施，其揭露以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018 /012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由TALE方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
TALE代表「類轉錄活化因子效應物(Transcription Activator-Like Effector)」蛋白質，其包括TALEN(「類轉錄活化因子效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)」)。使用TALE系統進行基因編輯的方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE是來自植物致病性細菌黃單胞菌屬(Xanthomonas
)的天然存在蛋白質，含有由一系列33至35個胺基酸的重複結構域構成的DNA結合結構域，該等重複結構域各辨識單一鹼基對。TALE特異性係由二個被稱為重複可變雙殘基(RVD)的超變異胺基酸判定。模組化TALE重複連接在一起以辨識毗連DNA序列。DNA結合結構域中的特定RVD辨識目標基因座中的鹼基，提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合結構域。TALE的DNA結合結構域與IIS型FokI內切核酸酶的催化結構域融合，以製造一可靶向的TALE核酸酶。為了誘導定點突變，二個藉由14至20個鹼基對間隔基因區域分離的個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚化且產生目標雙股斷裂。
數個利用各種總成方法的大型、系統性研究已指示TALE重複可經組合以辨識幾乎任何使用者定義的序列。客製化設計的TALE陣列亦可經由Cellectis Bioresearch(Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies(Grand Island, NY, USA)的商業途徑獲得。適用於本發明之TALE及TALEN方法係描述於美國專利申請公開案號US 2011/0201118 A1；US 2013/0117869 A1；US 2013/0315884 A1；US 2015/0203871 A1及US 2016/0120906 A1，彼等揭露以引用方式併入本文中。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由TALE方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,586,526號，其以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018 /012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α螺旋表面上的數個胺基酸一般接觸DNA主溝槽中3 bp，且具有不同的選擇性水準。鋅指具有二個蛋白質結構域。第一結構域是DNA結合結構域，包括真核轉錄因子且含有鋅指。第二結構域是核酸酶結構域，包括FokI限制酶且負責催化切割DNA。
個別ZFN的DNA結合結構域一般含有介於三與六個之間的個別鋅指重複且各可辨識介於9與18個之間的鹼基對。如果鋅指結構域對彼等之意圖目標位點具有特異性，則即使一對總共辨識18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中的單一基因座。一種產生新的鋅指陣列之方法是組合較小的已知特異性之鋅指「模組」。最常見的模組總成過程涉及組合三個各可辨識3個鹼基對DNA序列之分開的鋅指，以產生可辨識9個鹼基對目標位點的3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方式諸如寡聚池工程改造(OPEN)以從隨機分組庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組庫考慮鄰近指之間的上下文依賴(context-dependent)交互作用。經工程改造鋅指可自商業途徑獲得；Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA)已與Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)合作發展鋅指建構之專用平台(CompoZr®)。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185及6,479,626號，彼等以引用方式併入本文中。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物的其他實例係描述於Beane,et al.
,Mol. Therapy
, 2015, 23 1380-1390，其揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，TIL可選地經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施例中，方法包含基因工程改造TIL族群，以包括高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。適當地，TIL族群可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。K. 用於 TIL 製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包括例如實例G所述之魯爾鎖及熱封系統。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施例中，採用如實例G所述的密閉系統。在一些實施例中，將TIL根據實例G「最終調配物及填充」章節所述之方法調配到最終產物調配物容器中。
在一些實施例中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到TIL即將投予至病患或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施例中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施例中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之培養基係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施例中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施例中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。L. 可選的 TIL 冷凍保存
主體TIL族群(
例如第二TIL族群)或經擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)可經可選地冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存發生於治療性TIL族群。在一些實施例中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施例中，冷凍保存發生於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)的例示性步驟F中的TIL。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施例中，冷凍保存使用冷凍保存培養基實施。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52,
978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施例中，TIL族群係使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用約1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
如上所討論且例示於如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施例中，在第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013, 52,
978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例D所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可進行步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL族群可進行基因修飾以用於合適治療。M. 經擴增之 TIL 的表型特徵
在一些實施例中，分析TIL在擴增後的許多表型標誌的表現，包括該些在本文及實例中描述者。在一實施例中，檢查一或多個表型標誌的表現。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在步驟B的第一擴增之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在步驟C的轉變期間分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟C的轉變期間及冷凍保存之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的第二擴增之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的二次或超過二次擴增之後分析。
在一些實施例中，標誌係選自由CD8及CD28所組成之群組。在一些實施例中，檢查CD8的表現。在一些實施例中，檢查CD28的表現。在一些實施例中，CD8及/或CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1B)提供的2A過程)。在一些實施例中，CD8的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供的2A過程)。在一些實施例中，CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1A)提供的2A過程)。在一些實施例中，高CD28表現指示較年輕、更持久的TIL表型。在一實施例中，測量一或多個調節標誌的表現。
在一實施例中，在本文所述之用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法中的任何步驟期間，並未實施基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群或經收集的TIL族群。
在一些實施例中，中央記憶細胞之百分比在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1A)提供的2A過程)。在一些實施例中，中央記憶細胞的記憶標誌係選自由CCR7及CD62L所組成之群組。
在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL記憶子集可分成不同記憶子集。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含初始(CD45RA+CD62L+) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含中央記憶(CM; CD45RA-CD62L+) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含效應記憶(EM; CD45RA-CD62L-) TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包含RA+效應記憶/效應細胞(TEMRA/TEFF; CD45RA+CD62L+) TIL。
在一些實施例中，TIL表現一或多種選自由顆粒溶解酶B、穿孔素及顆粒溶解素所組成之群組的標誌。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解酶B。在一些實施例中，TIL表現穿孔素。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解素。
在一實施例中，亦可使用細胞介素釋放測定，評估再刺激的TIL的細胞介素釋放。在一些實施例中，可評估TIL的干擾素γ (IFN-γ)分泌。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定測量。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定在快速第二擴增步驟之後、在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供的步驟D之後測量。在一些實施例中，TIL健康係藉由IFN-γ分泌測量。在一些實施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激的TIL培養基中的細胞介素IFN-γ的量來測量。來自這些受刺激TIL之培養基中的IFN-γ的量可使用測量IFN-γ釋放來判定。在一些實施例中，例如在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供之第3代過程之步驟D的TIL相較於例如在圖1(特別是例如圖1A)中提供之2A過程之步驟D的IFN-γ產生增加，指示步驟D TIL的細胞毒性潛力增加。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或多於5倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，測量離體TIL的IFN-γ。在一些實施例中，測量離體TIL的IFN-γ，包括藉由本發明之方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或多於5倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於1倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於2倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於3倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於4倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少多於5倍的IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程2A之方法(如在圖1(特別是例如圖1A)所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。在一些實施例中，如本文所述之過程(例如第3代過程)相較於其他過程(例如稱為第2代的過程)基於樣本中獨特肽CDR的數量(見例如圖12至14)顯示較高的殖株多樣性。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖1中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖1例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性表示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可表示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加1000倍。
在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可藉由檢查一或多種標誌判定。在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可使用多色流動式細胞測量術判定。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103及/或LAG-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT及/或TIM-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT及/或TIM-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，T細胞標誌(包括活化及耗竭標誌)可經判定及/或分析以檢查T細胞活化、抑制或功能。在一些實施例中，T細胞標誌可包括但不限於一或多種選自由TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4及/或CD59所組成之群組的標誌。
在一些實施例中，表型特徵是在冷凍保存之後檢查。N.
額外過程實施例
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來實施初始第一擴增，其中該初始第一擴增實施約1至8天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至10天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約5至7天。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來實施初始第一擴增，其中該初始第一擴增實施約1至8天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至8天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至6天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至6天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至5天。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來實施初始第一擴增，其中該初始第一擴增實施約1至7天以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至11天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約4天來實施快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由使第一TIL族群與進一步包含外源性抗原呈現細胞(APC)之培養基接觸來實施，其中步驟(c)之培養基的APC數量係大於步驟(b)之培養基的APC數量。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，培養基補充有額外的外源性APC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約1×108
個APC至在或約3.5×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約3.5×108
個APC至在或約1×109
個APC的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約4×108
個APC至在或約7.5×108
個APC的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約2×108
個APC至在或約2.5×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約4.5×108
個APC至在或約5.5×108
個APC的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在或約2.5×108
個APC係添加至初級第一擴增且在或約5×108
個APC係添加至快速第二擴增。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤片段係分布至複數個分開的容器中，在各該等分開的容器中，第一TIL族群係於步驟(a)中獲得，第二TIL族群係於步驟(b)中獲得且第三TIL族群係於步驟(c)中獲得，且將來自步驟(c)之複數個容器的TIL治療性族群組合以產生來自步驟(d)的經收集的TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤平均分布於複數個分開的容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至十五個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中初始第一擴增係針對各容器中步驟(b)的第一TIL族群實施，步驟(c)之快速第二擴增係於相同容器中針對自該第一TIL族群產生的第二TIL族群實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中分開的容器之各者包含第一氣體可通透性表面區域。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤片段分布於單一容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中單一容器包含第一氣體可通透性表面區域。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係於包含第一氣體可通透性表面區域的第一容器中實施，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於包含第二氣體可通透性表面區域的第二容器中實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二容器大於第一容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初始第一擴增係於包含第一氣體可通透性表面區域的第一容器中實施，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於第一容器中實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面區域上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:10的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:9的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:8的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:7的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:6的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:5的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:4的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:3的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:2的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.2至在或約1:8的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.3至在或約1:7的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.4至在或約1:6的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.5至在或約1:5的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.6至在或約1:4的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.8至在或約1:3的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:2的範圍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來實施，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中TIL數量對第一TIL族群中TIL數量之比例係在或約1.5:1至在或約100:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中TIL數量對第一TIL族群中TIL數量之比例係在或約50:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中TIL數量對第一TIL族群中TIL數量之比例係在或約25:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中TIL數量對第一TIL族群中TIL數量之比例係在或約20:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中TIL數量對第一TIL族群中TIL數量之比例係在或約10:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約50倍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中的第二期間開始後在或約2天或在或約3天，對細胞培養基補充額外的IL-2。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以進一步包含在步驟(d)中使用冷凍保存過程將經收集的TIL族群冷凍保存的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(d)後實施將來自步驟(d)之經收集的TIL族群轉移至可選地含有HypoThermosol之輸注袋的額外步驟(e)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(e)中使用冷凍保存過程將包含經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中使用呈1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基以實施該冷凍保存過程。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且為異體的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中添加至細胞培養的APC總數係2.5 × 108
個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中添加至細胞培養的APC總數係5 × 108
個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中APC係PBMC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且為異體的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(d)中之收集係使用基於膜的細胞處理系統實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(d)中之收集係使用LOVO細胞處理系統實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約5至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約10至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約15至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約20至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約25至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約30至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約35至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約40至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約45至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約50至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約27 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約20 mm3
至在或約50 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約21 mm3
至在或約30 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約22 mm3
至在或約29.5 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約23 mm3
至在或約29 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約24 mm3
至在或約28.5 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約25 mm3
至在或約28 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約26.5 mm3
至在或約27.5 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mm3
的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約30至在或約60個片段且總體積為在或約1300 mm3
至在或約1500 mm3
。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約50個片段且總體積為在或約1350 mm3
。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約50個片段且總質量為在或約1克至在或約1.5克。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基係提供於其係為G容器或Xuri細胞袋之容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間內實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第二期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間內實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間內實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約5天、6天或7天的期間內實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約7天的期間內實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約18天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約18天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天至在或約18天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約17天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約17天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約16天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約16天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約17天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約18天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天或少於14天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天或少於15天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天或少於16天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約17天或少於17天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約18天或少於18天實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(d)中收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係在或約2.3×1010
個至在或約13.7×1010
個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中獲自步驟(c)第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為密閉容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為G容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-10。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-100。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-500。
在另一實施例中，本發明提供藉由如上適用之任何前述段落描述之方法所製造的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)或OKT3下實施的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下實施的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下實施的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加的抗原呈現細胞(APC)且無添加的OKT3下實施的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的干擾素γ生產。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的療效。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下實施的過程所製備的TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下實施的過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包含：(a)藉由培養獲自供體的第一T細胞族群來實施該第一T細胞族群的初始第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及起動該第一T細胞族群的活化；(b)在步驟(a)所起動的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來實施該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及(c)收集該第二T細胞族群。在另一實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效從小規模培養中轉移第一T細胞族群至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞族群約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效從小規模培養中轉移第一T細胞族群至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞族群約5至7天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞族群部分係於第二小規模培養中培養約5至7天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5至7天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5至6天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約6天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來實施快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約7天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於至多7天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多8天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多11天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於7天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於7天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於7天或8天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於7天或8天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於8天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之初始第一擴增係於8天的期間實施且步驟(b)之快速第二擴增係於至多8天的期間實施。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3及IL-2。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透性表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透性表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透性表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透性表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透性表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二APC族群中APC的數量對第一APC族群中APC的數量的比例係約2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一APC族群中APC的數量係約2.5 x 108
個且第二APC族群中APC的數量係約5 x 108
個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以2層APC的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以選自4至8層APC範圍的平均厚度層疊在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中經層疊在第一氣體可通透性表面上的APC之平均層數對在步驟(a)中經層疊在第一氣體可通透性表面上的APC之平均層數的比例係2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約2.0×106
個APC/cm2
至在或約3.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約2.0×106
個APC/cm2
至在或約3.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透性表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透性表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且對第一T細胞族群的供體而言是外源性的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係周邊血液淋巴細胞(PBL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由自供體的全血分離獲得。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由自供體的血球分離產物分離獲得。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由正向或負向選擇T細胞表型而自供體的全血或血球分離產物分離。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞表型係CD3+及CD45+。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在實施第一T細胞族群的初始第一擴增之前，T細胞係與NK細胞分離。在另一實施例中，藉由自第一T細胞族群移除CD3- CD56+細胞而使T細胞與第一T細胞族群中之NK細胞分離。在另一實施例中，CD3- CD56+細胞係藉由使第一T細胞族群進行細胞分選而自第一T細胞族群移除，該細胞分選使用移除CD3- CD56+細胞組分且回收負向組分之圈選策略。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高百分比NK細胞之第一T細胞族群中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高百分比CD3- CD56+細胞之第一T細胞族群中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為存在高數量NK細胞之腫瘤組織中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高數量CD3- CD56+細胞之腫瘤組織中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患特徵為存在高數量NK細胞之腫瘤的病患。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患特徵為存在高數量CD3- CD56+細胞之腫瘤的病患。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患卵巢癌之病患。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中來自第一T細胞族群之在或約1x107
個T細胞接種於容器中，以於該容器中起始初級第一擴增培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群分布在複數個容器中，且在各容器中接種來自第一T細胞族群之在或約1x107
個T細胞，以於該容器中起始初級第一擴增培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中收集之第二T細胞族群係治療性TIL族群。III. 醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010
個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年1次、2次、3次、4次、5次、6次或超過6次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施例中，TIL的有效劑量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之輸注袋。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及醫藥上可接受之載劑之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之輸注袋。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之冷凍保存製劑。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及冷凍保存培養基之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中冷凍保存培養基含有DMSO。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中冷凍保存培養基含有7至10% DMSO。
在另一實施例中，本發明提供適用之任何前述段落描述之TIL組成物之冷凍保存製劑。IV. 治療病患之方法
治療方法始於初始TIL收集及培養TIL。該等方法皆已由所屬技術領域例如Jinet al., J. Immunotherapy
,2012
, 35(3):283-292描述，其全文以引用方式併入本文中。治療方法之實施例係描述於以下所有章節，包括實例。
根據本文所述之方法包括例如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如例如圖1(特別是例如圖1B)所述)產生的經擴增之TIL有治療癌症病患的具體用途(例如Goff, et al.,J. Clinical Oncology
,2016
, 34(20):2389-239以及補充內容所述)；其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，TIL係如先前描述生長自轉移性黑色素瘤的經切除之寄存物(見Dudley, et al.,J Immunother
.,2003
, 26:332-342；其全文以引用方式併入本文中)。新鮮腫瘤可在無菌條件下分割。可收集代表性樣本進行正式病理分析。可使用2 mm3
至3 mm3
的單一片段。在一些實施例中，獲得每病患5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施例中，獲得每病患20、25或30個樣本。在一些實施例中，獲得每病患20、22、24、26或28個樣本。在一些實施例中，獲得每病患24個樣本。樣本可放入24孔板之個別孔中，維持於含有高劑量IL-2 (6,000 IU/mL)之生長培養基中且監測腫瘤的破壞及/或TIL的增生。任何在處理後仍有存活細胞的腫瘤可如本文所述經酶碎解成單一細胞懸浮液且經冷凍保存。
在一些實施例中，成功生長的TIL可經取樣進行表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)且當可用時在自體腫瘤測試。如果整夜共培養產生干擾素-γ (IFN-γ)的量˃ 200 pg/mL且為背景的二倍，則TIL可被視為反應性。(Goff, et al.,J Immunother.
,2010
, 33:840-847；其全文以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，可選擇具有自體反應性或足夠生長模式證據的培養進行第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B)步驟D提供的第二擴增)，包括有時稱為快速擴增(REP)的第二擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在第二擴增期間高增生)的經擴增之TIL進行額外第二擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在圖1(特別是例如圖1B)步驟D提供的第二擴增期間的高增生)的TIL進行根據圖1(特別是例如圖1B)步驟D的額外第二擴增。
在一些實施例中，病患並不直接移入ACT(過繼性細胞轉移)，例如，在一些實施例中，不立即利用在腫瘤收集及/或第一擴增後的細胞。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前2天解凍。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前1天解凍。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前立即解凍。
經冷凍保存之輸注袋TIL樣本的細胞表型可藉由流動式細胞測量術(例如FlowJo)分析表面標誌CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA (BD BioSciences)，以及藉由本文所述之任何方法分析。使用標準連結酶免疫吸收測定技術測量血清細胞介素。血清IFN-g上升定義為˃100 pg/mL且大於4 3基線的量。
在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B)例示者)產生之TIL提供意外改善TIL的臨床療效。在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)例示之方法以外的方法)產生之TIL展現增加的臨床療效。在一些實施例中，除該些在本文中描述之方法以外的方法包括稱為過程1C及/或第1代(Gen 1)的方法。在一些實施例中，增加療效係藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應測量。在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)例示之方法以外的方法，例如第1代過程)產生之TIL展現類似的發生反應所需時間(time to response)及安全性輪廓。
在一些實施例中，IFN-γ表示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施例中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ表示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ的量來測量。在一些實施例中，IFN-γ增加表示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的治療療效。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ增加1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或多於5倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的離體TIL中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的TIL血清中測量。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖1(特別是例如圖1B)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性表示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可表示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加1000倍。
療效的測量可包括疾病控制率(DCR)以及整體反應率(ORR)，如所屬技術領域中已知及本文中所述。1. 治療癌症及其他疾病之方法
本文所述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一實施例中，彼等用於治療過度增生性病症。彼等亦可用於治療其他如本文及以下段落所述之病症。
在一些實施例中，過度增生性病症係癌症。在一些實施例中，過度增生性病症係實質腫瘤癌症。在一些實施例中，實質腫瘤癌症係選自由下列所組成之群組：神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施例中，實質腫瘤癌係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。
在一些實施例中，癌症係高突變
(hypermutated)癌症表型。高突變癌症係廣泛描述於Campbell, et al.(Cell, 171:1042-1056 (2017)；其全文以引用方式併入本文中以達所目的)。在一些實施例中，高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於9與10個之間的突變。在一些實施例中，小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb) 9.91個突變。在一些實施例中，成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb) 9個突變。在一些實施例中，增強高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，增強小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，增強成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，超高突變(ultra-hypermutated)腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，小兒超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，成人超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。
在一些實施例中，高突變腫瘤在複製修復途徑中具有突變。在一些實施例中，高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有微小衛星體不穩定性。在一些實施例中，超高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變且具有微小衛星體不穩定性。在一些實施例中，腫瘤之高突變與對免疫檢查點抑制劑的反應有關。在一些實施例中，高突變腫瘤對免疫檢查點抑制劑治療具有抗性。在一些實施例中，高突變腫瘤可使用本發明之TIL治療。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由環境因素(外在暴露)造成。例如，UV光可為惡性黑色素瘤之高數量突變的主因(見例如Pfeifer, G.P., You, Y.H., and Besaratinia, A. (2005). Mutat. Res. 571, 19-31.; Sage, E. (1993). Photochem. Photobiol. 57, 163-174)。在一些實施例中，以肺及喉腫瘤來說，腫瘤之高突變可由香菸煙霧中大於60種致癌物造成，以及其他腫瘤因直接致突變原暴露所致(見例如Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O’Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C., et al. (2010). Nature 463, 184-190)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣(APOBEC)家族成員失調造成，其已顯示在多種癌症導致增加C轉變成T的量(見例如Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G., et al. (2013). Nat. Genet. 45, 970-976)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由破壞除錯(proofreading)之突變所致之缺陷性DNA複製修復造成，除錯係由主要複製酶Pol3及Pold1實施。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由DNA錯配修復的缺陷造成，其與結直腸癌、子宮內膜癌症及其他癌症的高突變相關(見例如Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C., et al.; (2013). Nature 497, 67-73；Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F., et al.; (2012). Nature 487, 330-337)。在一些實施例中，DNA複製修復突變亦見於癌症素質症候群(cancer predisposition syndrome)，諸如體質性或雙等位錯配修復缺陷(CMMRD)、Lynch氏症候群及聚合酶除錯相關息肉症(PPAP)。
在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係高突變癌症。在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係增強的高突變癌症。在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係超高突變癌症。
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中病患在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2
/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
在本文中描述之化合物及化合物之組合在治療、預防及/或處理所示疾病或病症的療效可使用各種所屬技術領域中已知之模型測試，該等模型提供人疾病治療之指南。例如，用於判定卵巢癌治療療效的模型係描述於例如Mullany,et al.
,Endocrinology 2012, 153,
1585-92；及Fong,et al.
,J. Ovarian Res. 2009, 2,
12。用於判定胰癌治療療效的模型係描述於Herreros-Villanueva,et al.
,World J. Gastroenterol. 2012, 18,
1286-1294。用於判定乳癌治療療效的模型係描述於例如Fantozzi,Breast Cancer Res. 2006, 8,
212。用於判定黑色素瘤治療療效的模型係描述於例如Damsky,et al.
,Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23,
853-859。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Meuwissen,et al.
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643-664。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Kim,Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2,
55-60；及Sano,Head Neck Oncol. 2009, 1,
32。
在一些實施例中，IFN-γ指示過度增生性病症治療的治療療效。在一些實施例中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ表示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中之細胞介素IFN-γ的量來測量。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL提供經本方法之TIL治療之個體相較於經使用稱為第3代過程(如圖1(特別是例如圖1B)及本說明書中各處例示)之方法所製備的TIL治療之個體的血液中增加之IFN-γ。在一些實施例中，IFN-γ增加表示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的治療療效。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ增加1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或多於5倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係於來自經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的離體TIL中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的血液中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的血清中測量。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖1(特別是例如圖1B)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖1(特別是例如圖1B)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性表示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可表示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加1000倍。2. 共投方法
在一些實施例中，如本文所述產生之TIL(包括例如衍生自圖1(特別是例如圖1B)之步驟A至F所述之方法的TIL)可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(來伯里茲單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell cat# BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且破壞PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中的抗體包括BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A (Genentech)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、破壞PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。在一些實施例中，當個體具有的癌症類型為單獨投予抗PD-1抗體所難治時，對於投予根據步驟A至F產生之TIL組合的個體共投抗PD-1抗體。在一些實施例中，當病患具有難治性黑色素瘤時，對病患投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施例中，當病患具有非小細胞肺癌(NSCLC)時，對病患投予TIL與抗PD-1之組合。3. 可選的病患淋巴細胞耗盡前處理
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中病患在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，本發明包括用於治療已先經非骨髓清除式化療治療之病患的癌症之TIL族群。在一實施例中，TIL族群係用於輸注投予。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2
/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2(阿地介白素，以PROLEUKIN市售)的靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施例中，TIL族群係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL族群之後投予。
實驗發現表示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之TIL之前，對病患進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
一般來說，淋巴細胞耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。此類方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother
.2011
,60,
75-85、Muranski,et al.
,Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3,
668-681、Dudley,et al.
,J. Clin. Oncol. 2008
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5233-5239及Dudley,et al.
,J. Clin. Oncol. 2005
,23,
2346-2357中，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或超過7天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或超過7天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100 mg/m2
/天、150 mg/m2
/天、175 mg/m2
/天、200 mg/m2
/天、225 mg/m2
/天、250 mg/m2
/天、275 mg/m2
/天或300 mg/m2
/天之劑量投予。在一些實施例中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2
/天i.v.投予4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2
/天i.v.投予4天。
在一些實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至病患實施。在一些實施例中，氟達拉濱係以25 mg/m2
/天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2
/天i.v.投予4天。
在一實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2
/天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2
/天共五天實施。4.IL-2 方案
在一實施例中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包含靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體，始於投予治療有效部分的治療性TIL族群之後當天，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(病患身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸液投予直到耐受為止，最多14劑。在休息9天之後，可重複此時程再投予14劑，最多總共28劑。
在一實施例中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day,et al.
,J. Clin. Oncol. 1999, 17,
2752-61及Eton,et al.
,Cancer 2000, 88,
1703-9，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，漸減IL-2方案包含在6小時內靜脈內投予18 × 106
IU/m2
，隨後在12小時內靜脈內投予18 × 106
IU/m2
，隨後在24小時內靜脈內投予18 × 106
IU/m2
，隨後在72小時內靜脈內投予 4.5 × 106
IU/m2
。此治療週期可每28天重複一次，最多可達四個週期。在一實施例中，漸減IL-2方案包含第1天18,000,000 IU/m2
，第2天9,000,000 IU/m2
及第3及4天4,500,000 IU/m2
。
在一實施例中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。5. 過繼性細胞轉移
過繼性細胞轉移(ACT)是一種非常有效的免疫治療形式且涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移至癌症病患。ACT是涉及活體外識別具有抗腫瘤活性之淋巴細胞、活體外擴增這些細胞至大量及將彼等輸注至荷癌宿主的治療方式。用於過繼性轉移之淋巴細胞可衍生自經切除之腫瘤的基質(腫瘤浸潤性淋巴細胞或TIL)。用於ACT之TIL可如本文所述製備。在一些實施例中，TIL係根據例如圖1(特別是例如圖1B)描述之方法製備。如果彼等經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)、經混合之淋巴細胞腫瘤細胞培養(MLTC)濃化或使用自體抗原呈現細胞及腫瘤衍生肽選殖，則彼等亦可衍生自或來自血液。其中淋巴細胞源自待輸注荷癌宿主的ACT稱為自體ACT。美國專利公開號2011/0052530關於一種用於實施過繼性細胞療法以促進癌症消退之方法，主要用於治療罹患轉移性黑色素瘤的病患，該案全文以引用方式併入本文中以用於這些方法。在一些實施例中，TIL可如本文所述投予。在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL及/或細胞毒性淋巴細胞可以多個劑量投予。給藥可為每年1次、2次、3次、4次、5次、6次或超過6次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL及/或細胞毒性淋巴細胞的投予可視需要持續進行。6.
額外治療方法
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中在如上適用之任何前述段落描述之分別投予治療有效劑量之治療性TIL族群及TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以進一步包含以始於向個體投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療個體之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中在向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以進一步包含以始於向病患投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療病患之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案且接著向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以進一步包含以始於向病患投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療病患之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係小兒高突變癌症。
實例
在本文中涵蓋的實施例現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。
實例1：製備用於REP前及REP過程的培養基
此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基使用於涉及培養衍生自各種腫瘤類型包括但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之規程。此培養基可用於製備本申請案及實例中所述之任何TIL。CM1 之製備
將下列試劑移出冷藏並使彼等在37℃水浴中溫熱：(RPMI1640、人AB血清、200mM L-麩醯胺酸)。根據下表19，藉由添加各成分至所欲過濾之體積適當的0.2µm過濾器單位的頂部，製備CM1培養基。儲存在4℃下。
在使用當天，在37℃水浴中預熱所需量的CM1並添加6000 IU/ml IL-2。
額外補充 - 根據表20視需要補充。
CM2 之製備
將製備好的CM1自冰箱移出或如上表19所示製備新鮮CM1。自冰箱移出AIM-V®，將製備好的CM1與等體積的AIM-V®在無菌培養基瓶中混合來製備所需量的CM2。在使用當天添加3000 IU/ml IL-2至CM2培養基。在使用當天製備足量的含3000 IU/ml IL-2之CM2。將CM2培養基瓶標示名稱、製備者首字母、過濾/製備日期、二週到期日並儲存在4℃下直到需要用於組織培養為止。CM3 之製備
在需要使用的當天製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由直接添加IL-2原液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM3量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IU/ml IL-2」。如果有過量的CM3，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示培養基名稱、製備者首字母、培養基製備日期及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之培養基在4℃下儲存7天後丟棄。CM4 之製備
CM4與CM3相同，但額外補充2mM GlutaMAXTM
(最終濃度)。在每1L的CM3中添加10ml的200mM GlutaMAXTM
。藉由直接添加IL-2原液及GlutaMAXTM
原液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM4量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IL/nil IL-2及G1utaMAX」。如果有過量的CM4，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示培養基名稱、「G1utaMAX」及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之培養基在4℃下儲存7天後丟棄。
實例2：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例A至G之TIL過程之組合。
使用在本文中描述之過程，在實驗的一組中，TIL係在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J.,
J Transl Med.,2013, 11:
37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+
及CD8+
兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+
族群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL的IFN-γ及CD107a上升。實例 3 ：製備 IL-2 原液 (CELLGENIX)
此實例描述將經純化、冷凍乾燥的重組人介白素-2溶解成適用於進一步組織培養規程之原液樣本的過程，包括所有該些於本申請案及實例所述者，包括該些涉及使用rhIL-2者。程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29mL無菌水轉移至50ml錐形管。添加lmL 1N乙酸至50ml錐形管。倒轉管2至3次以混合均勻。將HAc溶液藉由使用Steriflip過濾器過濾滅菌。
製備含1% HSA的PBS。添加4mL的25% HSA原液至於150mL無菌過濾器單位中之96mL PBS。過濾溶液。儲存在4℃下。對於所製備的各小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2原液(6 x 106
IU/mL最終濃度)。每批rh1L-2皆不同且需要廠商檢驗證明書(COA)中提供的資訊，諸如：1) rhIL-2的每小瓶質量(mg)、2) rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)建議0.2% HAc重構體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批量所需的1% HSA體積：
例如，根據CellGenix的rhIL-2批量10200121 COA，1mg小瓶的比活性為25 x 106
lU/mg。建議將rhIL-2重構於2mL 0.2% HAc中。
用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡膠瓶塞。使用附接至3mL注射器的16G針頭，注射建議體積的0.2% HAc至小瓶中。在抽出針頭時，小心不要使瓶塞脫出。倒轉小瓶3次且渦漩直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。添加經計算體積的1% HSA至小瓶。
RhIL-2溶液的儲存。短期儲存時(＜72hrs)，將小瓶儲存在4℃下。長期儲存時(＞72hrs)，將小瓶等分成更小體積且儲存在-20℃冷凍小瓶中，直到準備使用為止。避免冷凍/解凍循環。記錄製備日期之後6個月的到期日。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄編號、批號、到期日、作業者首字母、等分試樣的濃度及體積。實例 4 ：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed控速冷凍器型號7454 (Thermo Scientific)，將實例G中所述之簡化密閉程序製備的TIL冷凍保存的過程方法。
使用的設備如下：鋁盒固定架(與CS750冷凍袋相容)、750 mL袋子的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液態氮瓶、冰箱、熱電偶感測器(用於袋子的帶型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供0.5℃速率從成核到-20℃及每分鐘1℃到-80℃終末溫度的冷卻速率。程式參數如下：步驟1 -在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)到-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫度)到-45℃；步驟4：10.0℃/min(室溫度)到-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫度)到-20℃；及步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)到-80℃。實例 5 ：第 3 代例示性過程
本實例提供第2代與第3代過程之間的比較。此實例描述發展強健的TIL擴增平台。對第2代過程的改良藉由減少作業者介入次數而減少風險且簡化製程、減少整體製造時間、最佳化試劑使用且促進適於商業規模高通量製造之彈性的半密閉及半自動化細胞生產過程。
第2代及第3代過程之TIL係由經過外科切除腫瘤且接著離體擴增之衍生自個別病患的自體TIL構成。第3代過程的初始第一擴增步驟係在介白素-2 (IL-2)及單株抗體OKT3(其靶向經照射的周邊血液單核細胞(PBMC)之支架上的T細胞共受體CD3)存在下的細胞培養。
第2代TIL產物的製造係由二期組成：1)快速擴增前(REP前)及2)快速擴增規程(REP)。在REP前期間，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤ 50個片段，將彼等與含血清培養基(含有10% HuSAB補充之RPMI 1640培養基)及6,000 IU/mL的介白素-2 (IL-2)培養11天。在第11天，TIL係經收集及導入大規模第二REP擴增中。REP係由於補充有3000 IU/mL的rhIL-2之5L體積的CM2中與載有150ug的單株抗CD3抗體(OKT3)之5x109
個經照射的異體PBMC餵養細胞共培養來活化≤200x106
個來自REP前之存活細胞5天所組成。在第16天，將培養的體積減少90%且將細胞組分以≥ 1x109
個存活淋巴細胞/培養瓶分瓶至多個G-REX-500培養瓶且用CM4補足至5L。將TIL再培育6天。REP在第22天經收集、洗滌、調配，且在以-150o
C運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
第3代TIL產物的製造係由三期組成：1)初始第一擴增規程、2)快速第二擴增規程(亦稱為快速擴增期或REP)及3)繼代培養分瓶。為了致效初始第一擴增TIL增殖，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤ 120個片段。在初始第一擴增的第0天，在3個100 MCS容器各者中大約100 cm2
的表面區域上建立大約2.5x108
個經照射的異體PBMC餵養細胞之餵養細胞層。將腫瘤片段分布於且培養於3個各具有500 mL含血清CM1培養基及6,000 IU/mL的介白素-2 (IL-2)及15 ug OKT-3之100 MCS容器中7天。在第7天，REP藉由導入大約5x108
個經照射的異體PBMC餵養細胞之額外餵養細胞層至3個100 MCS容器各者中之腫瘤碎斷培養期且用500 mL CM2培養基及6,000 IU/mL IL-2及30 ug OKT-3培養起始。REP起始藉由活化相同容器中的整個初始第一擴增培養來增強，其中使用密閉系統將OKT3裝載餵養細胞流體轉移至100MCS容器。以第3代而言，TIL的規模縱向擴大或分瓶涉及將全細胞培養經由密閉系統流體轉移擴充且轉移至較大容器(從100 M培養瓶至500 M培養瓶)且添加額外4L的CM4培養基的過程步驟。REP細胞在第16天經收集、洗滌、調配，且在以-150o
C運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
整體而言，第3代過程是一時間較短、更可擴充且易於改良之擴增平台，可調適以適合強健製造及過程可相比性。
在第0天，二個過程的腫瘤皆洗滌3次並將片段隨機分組分至二池；每個過程一池。以第2代過程而言，將片段轉移至一個具有1 L含有6,000IU/mL rhIL-2之CM1培養基之GREX 100MCS培養瓶中。以第3代過程而言，將片段轉移至一個具有500 mL含有6,000IU/mL rhIL-2、15 ug OKT-3及2.5 x 108
個餵養細胞之CM1之GREX100MCS培養瓶中。
接種TIL用於Rep起始日根據各過程發生在不同天。以第2代過程而言，其中G-REX 100MCS培養瓶經90%體積減少，在第11天將收集的細胞懸浮液轉移至一個新的G-REX 500MCS以在含有IL-2 (3000 IU/mL)加上5e9個餵養細胞及OKT-3 (30 ng/mL)之CM2培養基中開始REP起始。細胞經擴增且按規程在第16天分瓶至多個具有含IL-2 (3000 IU/mL)之CM4培養基的GREX 500 MCS培養瓶。接著收集培養且按規程在第22天冷凍保存。以第3代過程而言，REP起始發生在第7天，其中使用相同的G-REX 100MCS於REP起始。簡言之，將500 mL含有IL-2 (6000 IU/mL)及5 x 108
個餵養細胞及30ug OKT-3之CM2培養基添加至各培養瓶。在第9至11天，將培養規模縱向擴大。將G-Rex100M的整個體積(1L)轉移至G-REX 500MCS且添加4L含有IL-2 (3000 IU/mL)的CM4。將培養瓶培育5天。收集培養並在第16天冷凍保存。
比較包括三個不同腫瘤，二個肺腫瘤(L4054及L4055)及一個黑色素瘤腫瘤(M1085T)。
事先製備用於L4054及L4055之CM1(培養基1)、CM2(培養基2)及CM4(培養基4)培養基且保持在4℃下。製備無過濾的CM1及CM2培養基以比較有或無過濾培養基的細胞生長。
事先將用於L4055腫瘤REP起始及規模縱向擴大之培養基在37℃下溫熱至多24小時。結果摘要
在達成的總存活細胞方面，第3代將落在第2代的30%以內。第3代最終產物在再刺激後展現較高的INF-γ產生。第3代最終產物展現增加的殖株多樣性，如存在的總獨特CDR3序列所測量。第3代最終產物展現較長的平均端粒長度。達成的結果 細胞計數及存活性 % ：
第2代及第3代過程的REP前及REP擴增遵循上述細節。
表 22 ： REP 前細胞計數。
以每個腫瘤而言，二池含有相等數量的片段。由於腫瘤大小較小，因此沒有達成每個培養瓶最大數量的片段。收集總REP前細胞(TVC)，且第2代過程在第11天及第3代過程在第7天計數。為了比較二個REP前組，將細胞計數除以提供於培養的片段數量，以計算每片段的平均存活細胞。如下表所示，第2代過程相較於第3代過程一致地生長每片段較多細胞。外推計算第3代過程第11天的預期TVC數量，其係藉由將REP前TVC除以7再乘以11計算。
表 23 ： TIL 最終產物的總存活細胞計數及擴增倍數：
以第2代及第3代過程而言，按過程條件計數TVC且產製過程每一天的存活細胞百分比。收集時，收集第22天(第2代)及第16天(第3代)細胞且建立TVC計數。接著將TVC除以第0天提供的片段數量，以計算每片段的存活細胞平均數。擴增倍數係藉由將收集的TVC除以REP起始的TVC計算。如表中所展現，比較第2代及第3代，L4054的擴增倍數類似；以L4055為例，第2代過程之擴增倍數較高。具體而言，此例的培養基在REP起始日之前溫熱至多24小時。在M1085T亦觀察到第3代的較高擴增倍數。外推計算第3代過程第22天的預期TVC數量，其係藉由將REP TVC除以16再乘以22計算。
表 24 ： TIL 最終產物之存活性 % ：
在收集時，最終TIL REP產物的存活性%與放行標準比較。第2代及第3代過程的所有條件超過70%存活性標準且在所有過程及腫瘤中為可相比的。
表25：第3代過程每額外培養瓶之估計細胞計數。由於每培養瓶片段數量低於最大所需數量，因此計算各腫瘤在收集日的估計細胞計數。估計係基於預期臨床腫瘤夠大可在第0天接種2或3個培養瓶。
免疫表型分析： TIL 最終產物之表型標誌比較：
三個腫瘤L4054、L4055及M1085T經歷第2代及第3代過程的TIL擴增。在收集後，使REP TIL最終產物進行流動式細胞測量術分析以測試純度、分化及記憶標誌。在所有條件下，TCR a/b+細胞的百分比皆超過90%。
自第3代過程收集的TIL相較於自第2代過程收集的TIL顯示較高的CD8及CD28表現。第2代過程顯示較高百分比的CD4+。見圖 3(A 、 B 、 C)
。TIL 最終產物之記憶標誌比較：
自第3代過程收集的TIL相較於來自第2代過程的TIL顯示較高的中央記憶區室表現。見圖 4(A 、 B 、 C)
。TIL 最終產物之活化及耗竭標誌比較：
分析來自二個腫瘤L4054及L4055之TIL的活化及耗竭標誌，以比較來自第2代及第3代TIL擴增過程之最終TIL產物。第2代與第3代過程之間的活化及耗竭標誌是可相比的。見圖 5(A 、 B) ；圖 6(A 、 B) 。 再刺激時的干擾素 γ 分泌：
在第2代收集日第22天及第3代收集日第16天，L4054及L4055之TIL經歷塗佈抗CD3板之整夜再刺激。對M1085T之再刺激使用抗CD3、CD28及CD137珠實施。所有條件中再刺激24小時後收集上清液且將上清液冷凍。在相同時間使用相同的ELISA板評估來自兩個過程之上清液的IFNγ ELISA分析。在三個分析的腫瘤中，觀察到第3代過程有較高的IFNγ產生。見圖 7(A 、 B 、 C) 。 測量培養基中之 IL-2 的量：
為了比較第2代與第3代過程之間的IL-2消耗，收集腫瘤L4054及L4055在REP起始、規模縱向擴大及收集日的細胞上清液。IL-2在細胞培養上清液中的量係藉由來自R&D的Quantitate ELISA套組測量。整體趨勢表示第3代過程相較於第2代過程維持較高的IL-2濃度。這可能是因為第3代在REP起始時較高的IL-2濃度(6000 IU/mL)加上培養基在整個過程中的留存效應所致。見圖 8(A 、 B) 。 代謝受質及代謝物分析
測量代謝受質諸如D-葡萄糖及L-麩醯胺酸的量來作為整體培養基消耗的替代指標。測量它們的對等代謝物諸如乳酸及氨。葡萄糖是培養基中為粒線體所利用以產生ATP能量形式的單糖。當葡萄糖經氧化時，會產生乳酸(乳酸酯是乳酸的酯)。乳酸酯在細胞指數生長期期間高度產生。高量的乳酸酯對細胞培養過程具有負面影響。見圖 9(A 、 B) 。
在REP起始、規模縱向擴大及收集日，收集L4054及L4055在第2代及第3代過程中用過的培養基。用過的培養基收集日為：第2代第11天、第16天及第22天；第3代第7天、第11天及第16天。在CEDEX生物分析儀上分析上清液的葡萄糖、乳酸、麩醯胺酸、glutamax及氨濃度。
L-麩醯胺酸是細胞培養基調配物所需的不穩定必需胺基酸。麩醯胺酸含有胺，且此醯胺結構性基團可運送及遞送氮至細胞。當L-麩醯胺酸氧化時，細胞會產生毒性氨副產物。為了抵銷L-麩醯胺酸的降解，第2代及第3代過程的培養基補充有Glutamax，其在水溶液中較為穩定且不會自發降解。在二個腫瘤細胞系中，第3代組在過程中顯示L-麩醯胺酸及Glutamax的降低及氨在整個REP的增加。在第2代組中，觀察到恆定濃度的L-麩醯胺酸及Glutamax及稍微增加的氨產生。第2代及第3代過程的氨在收集日可相比，且顯示L-麩醯胺酸降解有稍微差異。見圖 10(A 、 B 、 C) 。 流式 -FISH 的端粒重複：
流式-FISH技術係用於測量在第2代及第3代過程下，L4054及L4055上的端粒重複平均長度。相對端粒長度(RTL)的判定係使用DAKO流動式細胞測量術分析之端粒PNA套組/FITC計算。第3代顯示與第2代可相比的端粒長度。CD3 分析
為了判定各過程所產製之細胞產物的殖株多樣性，取樣L4054及L4055所收集之TIL最終產物且經由定序T細胞受體的CDR3部分來測定殖株多樣性分析。
表26：比較第2代及第3代L4054 TIL收集細胞產物所共享之獨特CDR3序列的百分比。第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
表27：比較第2代及第3代L4055 TIL收集細胞產物所共享之獨特CDR3序列的百分比。第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
事先製備無過濾的CM1及CM2培養基且保持在4℃下直到用於腫瘤L4055以用於第2代及第3代過程。
將用於腫瘤L4055的培養基在第2代及第3代過程之REP起始日之前在37℃下溫熱24小時。
LDH沒有在過程中收集的上清液中測量到。
M1085T TIL細胞計數使用K2細胞計數器進行。
在腫瘤M1085T方面，無法取得樣本，諸如用於代謝分析之上清液、用於活化及耗竭標誌分析、端粒長度及CD3 - TCR vb分析之TIL產物。結論
此實例比較3個獨立的供體腫瘤組織的功能品質屬性加上擴大表型鑑定及第2代及第3代過程的培養基消耗。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
第3代過程的外推細胞數量是假設REP前收集發生在第11天而非第7天且REP收集在第22天而非第16天來計算。兩種情況皆顯示相較於第2代過程較接近的TVC數量，表示早期活化可允許TIL生長的整體較佳表現。表4及5底端列。
以第3代過程額外培養瓶(2或3個)的外推值為例，假設處理較大大小的腫瘤且達到如所述之過程所需之最大片段數量。觀察到可在第3代過程的第16天收集達到相較於第2代過程第22天類似劑量的TVC。此觀察很重要且指示培養的早期活化可允許TIL在較少處理時間中有較佳表現。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
就表型鑑定而言，第3代過程相較於第2代過程觀察到三個腫瘤較高的CD8+及CD28+表現。此資料指示第3代過程相較於第2代具有改善的最終TIL產物屬性。
第3代過程相較於第2代過程顯示稍微較高的中央記憶區室。
第2代及第3代過程顯示可相比的活化及耗竭標誌，儘管第3代過程的持續時間較短。
在所分析的三個腫瘤中，第3代最終產物的IFN γ (IFNγ)產生高於第2代3倍。此資料指示第3代過程相較於第2代過程產製具有高度功能性且更有效的TIL產物，有可能是因為第3代的CD8及CD28表現之較高表現所致。表型鑑定暗示第3代在三個腫瘤的CD8+、CD28+表現上相較於第2代過程有正面趨勢。
第2代與第3代之間的TIL最終產物之端粒長度是可相比的。
第2代與第3代最終產物之間的葡萄糖及乳酸酯的量是可相比的，暗示第3代過程之培養基的營養素的量不受影響，因為相較於第2代，過程中不每天實施體積減少移除且過程中整體培養基體積較少。
整體第3代過程顯示處理時間相較於第2代過程減少幾乎兩倍，其將造成藉由第3代過程擴增之TIL產物的商品成本(COG)大幅減少。
IL-2消耗指示第2代過程之IL-2消耗整體趨勢，且在第3代過程中IL-2較高，因為不移除舊的培養基。
第3代過程顯示由CDR3 TCRab序列分析所測量之較高的殖株多樣性。
在REP前第0天添加餵養細胞及OKT3允許使用第3代過程之早期活化TIL及整體較佳的TIL生長表現。
表28描述第3代過程之各種實施例及結果並與目前的第2代過程比較：
實例6：直接離體選擇及擴增PD-1+細胞：增強用於ACT療法之腫瘤反應性TIL之過程
介紹
使用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性T細胞療法已於轉移性黑色素瘤病患研究世代中顯示持久的反應率[1]。用於治療之TIL產物包含異質性T細胞，該異質性T細胞辨識腫瘤特異性抗原、突變衍生性病患特異性新抗原及非腫瘤相關抗原[2, 3]。研究顯示新抗原特異性T細胞顯著促成TIL的抗腫瘤活性[4]。預期富集具有腫瘤反應性之TIL的策略可產生更有效的治療性產物，特別是在已知含有高比例旁路T細胞的上皮癌症中[5]。數個研究顯示，在TIL上PD1(一種通常與T細胞耗竭相關的標誌)的表現識別自體腫瘤反應性T細胞[6, 7, 8]。本發明呈現經設計以選擇PD1+細胞及富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物的新規程之發展。本實例提供一種分選及擴增PD1+ TIL及鑑定所得產物之規程。
此規程涉及使用2-REP規程，離體擴增經分選之來自黑色素瘤、肺癌、乳癌(三陰性及ER/PR腫瘤)及肉瘤之PD1+ TIL。評估經擴增之TIL的生長、存活性、表型、功能(IFNγ分泌、CD107a移動)、腫瘤殺滅(X-CELLigence)及TCR Vβ貯庫(藉由流動式細胞測量術及RNA定序)。例示性方法係描述於圖7提供之圖。
此實例涵蓋PD1選擇計畫，目標係富集TAA特異性TIL之TIL產物。其係基於腫瘤/新抗原特異性T細胞負責TIL產物之治療活性且TIL之PD1+子集包含腫瘤反應性T細胞的想法。
方法-程序腫瘤製備
收到來自研究聯盟(UPMC, Moffitt)及組織採購供應商(Biotheme及MTG group)的新鮮切除的腫瘤樣本。腫瘤係隔夜運送於HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104)(含有抗生素)或RPMI 1640 (Fisher Scientific, Pennsylvania, Cat # 11875-085) +男性人AB血清(Access Biologicals, California, A13012)中。
將腫瘤自其主要及次要包裝移出，秤重含有腫瘤及運送培養基之小瓶並記錄質量。將腫瘤自小瓶移出並重新秤重小瓶及運送培養基。計算腫瘤的質量：(小瓶+運送培養基+腫瘤的質量) - (小瓶+運送培養基)。
將整個腫瘤碎斷成大約4至6-mm3
片段進行腫瘤碎解。如果腫瘤夠大，準備四個3 mm3
片段進行處理。用於腫瘤碎解之酶製劑
將經冷凍乾燥之酶重構於以下各種碎解酶所示之量的無菌HBSS中。這些酶係經製備為10X。確定捕捉瓶壁及瓶口保護蓋上之任何殘餘粉末。上下吸放數次且渦旋以確保完全重構。
重構1-g的膠原酶IV (Sigma, MO, C5138)於10-ml HBSS中(以製備100-mg/ml原液)。藉由上下吸放混合以溶解。如果重構之後未溶解，放置於37℃ H2
O浴中5分鐘。等分至1-ml小瓶中。此係膠原酶之100 mg/ml 10X工作原液。
製備DNA酶(Sigma, MO, D5025)原液(10,000-IU/ml)。每批DNA酶之單位係提供於隨附之資料表。計算適當體積之HBSS以重構100-mg的經冷凍乾燥之DNA酶原液。例如，如果DNA酶原液係2000-U/mg，則原液中之總DNA酶係200,000-IU (2000-IU/mg X 100-mg)。要稀釋成10,000IU的工作原液，添加20-ml的HBSS至100mg的DNA酶(200,000IU/20ml=10,000U/ml)。等分至1-ml小瓶中。此係DNA酶之10,000IU/ml 10X工作原液。
製備玻璃酸酶10-mg/ml (Sigma, MO, H2126)原液。使用50-ml的HBSS重構500-mg小瓶以製備10-mg/ml原液。等分至1-ml小瓶中。此係玻璃酸酶之10-mg/ml 10X工作原液。腫瘤處理及碎解
將原液碎解酶稀釋至1X。要製備1X工作溶液，將500-μl之膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶各者添加至3.5-ml的HBSS中。
如果使用GentleMACS OctoDissociator，將腫瘤片段轉移至GentleMACS C試管(C試管)或50-ml錐形管於5-ml如上所示之碎解雞尾酒(於HBSS中)。將2至3個片段(4至6 mm)轉移至各C試管。
將各C試管(Miltenyi Biotec, Germany, 130-096-334)轉移至GentleMACS OctoDissociator (Miltenyi Biotec, Germany, 130-095-937)。根據製造商指示使用。請注意，各種腫瘤組織學具有建議的腫瘤解離程式。為各別腫瘤組織學選擇適當程式。解離將為大約一小時。
如果無GentleMACS OctoDissociator可用，則使用標準轉子。將2至3個腫瘤片段放入50-ml錐形管(使用石蠟膜密封以避免滲漏)並固定至轉子。將轉子放置在37℃、5% CO2
增濕培育箱中恆定旋轉1至2小時。替代地，腫瘤片段可在RT下隔夜碎解(亦採用恆定旋轉)。
碎解後，將C試管自Octodissociator或轉子移出。將0.22 µm過濾器連接至無菌Falcon錐形管。使用移液管，使C試管/或50-ml錐形管中之所有內容物(5ml)通過0.22-µm過濾器進入50-ml錐形管。使用10-ml的HBSS洗滌C試管/50-ml錐形管並施加至過濾器。使用無菌注射器推筒的平坦端經由過濾器解離任何剩餘未經碎解之腫瘤。添加CM1或HBSS至50-ml並蓋上試管。
藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使樣本成團塊。小心移出液體，將團塊重懸於5-ml之CM1中以進行細胞計數及存活性評估。
為下列保留全腫瘤碎解物：1.細胞培養(PD1+及PD1-之對照)；2. FMO流動式細胞測量術對照；3.分選前全腫瘤碎解物表型分析測定；4.經冷凍用於腫瘤反應性/細胞殺滅測定。經保留之細胞數量將取決於總碎解產率及腫瘤組織學。細胞計數及存活性
使用Nexcelom細胞計數器K2 (Nexcelom, MA)獲得細胞及存活性計數之程序已有描述。染色經碎解之腫瘤以進行流動式細胞測量術分析及細胞分選
腫瘤碎解物將使用雞尾酒染色，其根據下列方法包括使用尼沃魯單抗培育及使用活/死紫色抗IgG4 Fc-PE(尼沃魯單抗之二級抗體)及CD3-FITC染色。
計數後，將細胞重懸於10-ml HBSS中。藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使細胞成團塊(加速及減速9)。將團塊重懸於5-ml之HBSS中。添加5 μl之活/死藍色染料(ThermoFisher, MA, Cat #L23105)以達1/1000之最終濃度。在冰上培育20至30 min。藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使細胞成團塊。
將團塊重懸於FACS緩衝劑(1 X HBSS，1mM EDTA，2%胎牛血清)中。添加至團塊之FACS緩衝劑的量係基於團塊的大小。染色體積應為約團塊大小3倍。因此，如果有300 μl的細胞，則緩衝劑的體積應為至少900 μl。添加1μg/ml之尼沃魯單抗(Creative Biolabs, NY, Cat #TAB-770)。稀釋將取決於抗體原液。在4℃下培育30分鐘。將團塊重懸於5-ml之冷HBSS中。
藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使細胞成團塊(加速及減速9)。重複洗滌2X。將團塊重懸於5ml之冷HBSS中。添加5 μl之活/死藍色染料(ThermoFisher, MA, Cat #L23105)以達1/1000之最終濃度。在4℃下培育20至30 min。
藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使細胞成團塊(加速及減速9)。如上所示，將團塊重懸於FACS緩衝劑(1 X HBSS，1mM EDTA，2%胎牛血清)中。添加至團塊之FACS緩衝劑的量係基於團塊的大小。染色體積應為約團塊大小3倍。因此，如果有300 μl的細胞，則緩衝劑的體積應為至少900 μl。
就抗體添加而言，各100-μl之體積相當於一次測試(抗體經滴定之量)，即如果有1-ml之體積，則需要10X量的經滴定之抗體。每100-μl之樣本添加3-μl之抗CD3-FITC (BD Biosciences, NJ, Cat #561807)。以1:500添加抗IgG4 Fc-PE (Southern Biotech, AL, Cat #9200-09)。因此，每500μl之FACS緩衝劑添加1μl之抗IgG4 Fc-PE。在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。在培育期間攪拌兩次。將細胞重懸於20-ml之FACS緩衝液中。使溶液通過70-μm細胞過濾器進入新的50-ml錐形管。在RT下以1500rpm離心5 min(加速及減速9)。抽吸。將細胞以至多10e6
個總(活+死)重懸於FACS緩衝劑中。最小體積係300-μl。
轉移至無菌聚丙烯FACS試管。3-ml/試管進行FACS分選。FACS 分選 (FX500 啟動 )
當設定系統及等待校正完成時，準備下列：
‧ 準備五個含有10-ml無菌D.I.水之無菌15-ml錐形管。
‧ 準備五個含有4-ml無菌D.I.水之無菌5-ml FACS試管。
‧ 準備五個含有12-ml 70% EtOH之無菌15-ml錐形管。
‧ 準備五個含有12-ml 10%次氯酸鈉之無菌15-ml錐形管。樣本收集
驗證樣本及收集室係在5℃下且選擇渦流作為攪動樣本。視需要調整PD1圈選。
當滿意圈選時，記錄盡可能多起事件(或最多20,000起CD3事件)。您可設定樣本壓力為10以加速此收集。停止收集且移出試管。
打開樣本室的門且將15-ml收集室嵌塊(collection chamber block)裝載至該室。將含有收集緩衝劑之收集管裝載至室嵌塊中。調整樣本壓力以維持至少85%之分選效率。記錄50,000起CD3事件。如果任一組分收集超過4.5 x 106
個細胞，將需要更換收集管。持續分選直到消耗樣本試管中之所有樣本。REP1 起始 ( 起始初始第一擴增步驟 )
具有最少數量的細胞(PD1+或PD1-)的條件係用於判定用於REP1起始之CD3+細胞數量。CD3細胞%(在分選期間判定)將用於計算起始REP1所需之全碎解物中之細胞總數，其中CD3細胞的數量與PD1+及PD1-樣本相同。用於REP1起始之全碎解細胞的總數=REP1接種之分選細胞的數量/CD3細胞%。
將大約1000至100,000個細胞CD3+細胞放入分別含有7-ml或40-ml之CM2(50%RPMI 1640+10%人血清、glutamax、建它黴素及50% AimV)且含有3000-IU/ml之IL-2之G-Rex 24或G-Rex10中達11天。起始至少一個G-Rex培養瓶用於PD1+及PD1-分選族群及全腫瘤碎解物。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3)(30 ng/ml)及餵養細胞(1:100比例(TIL:餵養細胞))至各培養瓶。
在板/培養瓶中培育細胞11天，不實施培養基更換(REP1)。
在REP1完成時，移出G-Rex 24大約5-ml之培養基及G-Rex 10大約30-ml之培養基。藉由上下吸放，將細胞重懸於剩餘培養基中。將細胞放入50-ml錐形管且以1500rpm離心5 min。
抽吸培養基且將細胞重懸於10至20-ml之CM2中以進行計數及存活性評估。REP2 起始 ( 起始第二快速擴增 )
以迷你REP2起始而言，將1e5個細胞放入含有40-ml的CM2培養基及3000-IU/ml的IL-2之G-Rex 10中。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3)(30 ng/ml)及餵養細胞(1:100比例，TIL:餵養細胞)。
以「完整規模運行」而言，2e6至30e6個細胞係於G-Rex 100M中於1-L的CM2培養基及3000-IU/ml的IL-2中擴增。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3)(30 ng/ml)及餵養細胞(1:100比例，TIL:餵養細胞)。
培養基更換(用於迷你規模)或培養基更換+分瓶(用於完整規模運行)係於REP2的第5天(過程的第16天)實施。將培養瓶的體積減少至大約10-ml (G-Rex 10)或100-ml (G-Rex 100M)且使用CM2或AimV+3000-IU/ml IL-2補充至40-ml (G-Rex 10)或1-L (G-Rex 100M)。以「完整規模運行」而言，培養瓶係經1:2分瓶。
在REP2的第11天(或過程的第22天)，將培養瓶的體積減少，在RT下以1500 rpm離心5 min。
評估最終產物的細胞計數、存活性、表型(TIL1、TIL2(TIL表面抗原染色之TIL2項目)、TIL3及功能(CD107a(藉由CD107a移動及IFNγ測定來評估TIL功能))。根據製造商指示，Vβ貯庫係藉由FACS (Beckman Coulter, California, Cat # Im3497)評估，其評估24種特異性(70%的總Vβ家族)。使額外細胞(1e6至5e6個細胞)形成團塊且冷凍進行RNA定序及分析。最終產物亦於共培養測定中評估腫瘤反應性且評估IFNγ。當可能時，經解凍的全腫瘤碎解物將與TIL共培養且藉由使用xCELLigence系統(ACEA Biosciences, CA)來共培養及/或殺滅(細胞裂解%)而評估腫瘤反應性。
材料及方法
PD1陽性(PD1+
)細胞係經由流動式細胞測量術直接自新鮮腫瘤碎解物分選且在活體外擴增。
評估來自六個黑色素瘤、三個肉瘤、六個乳癌及八個肺癌的樣本。
研究3個族群：
‧ PD1+
分選TIL
‧ PD-分選TIL
‧ 主體TIL(全腫瘤未經分選碎解物)
評估TIL的產率(細胞計數)、表型(流動式細胞測量術)、TCR Vβ貯庫(RNA定序)、非特異性功能性(抗CD3及PMA)、腫瘤反應性及腫瘤殺滅(共培養測定)。
已發展用於擴增來自黑色素瘤、肺癌、乳癌及肉瘤之經PD1選擇之TIL至臨床相關數量之規程。
活體外擴增經PD1選擇之TIL導致表型上與主體TIL可相比的產物。
T細胞標誌相對於分選前TIL係經上調，暗示高活化量。相對於分選前TIL，在經擴增之PD1+ TIL表面經調節之T細胞標誌包括PD1及CD25且暗示高活化量。重要的是，活體外擴增PD1+ TIL導致表型上與主體TIL可相比的產物，表示強治療潛力。經擴增之PD1+ TIL的功能性係藉由因應非特異性刺激之強健IFNγ及CD107a表現而證實。經擴增之PD1+ TIL相較於PD1-衍生性TIL及主體TIL顯示寡株性，此係在腫瘤部位的經抗原驅使之殖株擴增之跡象。初步資料顯示PD1+殺滅自體腫瘤細胞，但PD1-衍生性TIL則否。
PD1+衍生性TIL相較於PD1-衍生性TIL及主體TIL顯示寡株性。
所有TIL產物藉由非特異性刺激評估皆具功能性。
在PD1+衍生性TIL觀察到自體黑色素瘤細胞殺滅，但在PD1-衍生性TIL及主體TIL則否。
結果及接受標準
PD1+分選細胞將顯示增生能力缺陷。最終產物產率將為＞或=1e9。PD1+細胞相較於PD1-係寡株性。基於PD1+細胞較可能具有抗原特異性的前提，PD1+細胞相較於彼等之PD1-對應體將可能展現增強的腫瘤特異性殺滅能力。
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實例7：直接離體選擇及擴增PD-1+細胞：增強用於ACT療法之腫瘤反應性TIL之過程的進一步實施例
研究：使用M1H4及EH12.2H7選殖株偵測PD1
抗PD1 MIH4 mAb基於先前資料係用於早期研究工作。使用經M1H4分選之細胞顯示經PD1選擇之TIL擴增的可行性及產物功能性：
染色規程係經製備以：
‧ 確保所有PD1+ TIL的染色。
‧ 併入經接合之抗IgG4以用於偵測預結合受體。
‧ 使用抗PD1 EH12.2H7 mAb之規程係經使用。
進一步鑑定PD1分選規程是為了驗證適當的PD1+族群係經選擇，已起始新的分選策略以選擇PD1高
TIL，使用
策略：
a) 16個H&N (n=4)、黑色素瘤(n=4)及肺部(n=7)腫瘤
○ 5個實驗係直接比較(即PD1+
對比PD1高
)
b) 分析(包括功能性及TCRvβ貯庫)
初步結果及摘要：
經擴增之TIL(在REP1及REP2之後)對比經分選之PD1高族群的表型及功能性差異提供新穎的選擇/分選策略。
研究顯示，來自肺部及黑色素瘤之經PD1+
選擇之TIL具有抗原特異性且具有較高效應功能。
不具PD1活性(PD1/PD-L1軸)之冷腫瘤不適用於PD1選擇。
PD1高
TIL腫瘤用於選擇是理想的，因為PD1高
細胞與新抗原/腫瘤特異性之相關性。
進一步分析將包括表型分析、功能性、生理學、殖株性及雜質分析。表型分析：
T細胞子集(記憶/α-β對比γ-δ)功能性
‧ IFNg及顆粒溶解酶(珠刺激)
‧ CD107a(PMA/IO刺激)
‧ 藉由IFNg或CD107a/TNF或顆粒溶解酶B之腫瘤反應性
-(腫瘤碎解物或HLA匹配或HLA失配或其他癌症抗原)
‧腫瘤殺滅測定(Xcelligence)
‧多功能性(IsoLight)？生理學
‧
端粒長度
‧
細胞擴增倍數
‧
細胞週期分析，有絲分裂指數
‧
耗竭/老化/活化標誌殖株性
‧
多樣性(獨特選殖株#)
‧
獨特選殖株iREP之鑑別性的重疊
‧
Shannon熵指數雜質
‧
污染的腫瘤細胞、NK細胞、其他細胞、過程殘餘物
實例8：使用確定培養基之腫瘤擴增過程。
實施實例1至實例7揭示之過程，但將CM1及CM2培養基取代為根據本發明之確定培養基(例如，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM，ThermoFisher，包括例如DM1及DM2)。
實例9：選擇及擴增用於完整規模製造之PD-1+ TIL
目的
此實例描述在如此實例所描述之小規模及完整規模製造實驗中選擇及擴增PD-1+ TIL的結果。
資訊
數個研究顯示，PD-1(一種通常與T細胞耗竭相關的標誌)的表面表現識別腫瘤微環境中之自體腫瘤反應性T細胞。規程係經設計以自腫瘤碎解物選擇PD-1陽性(PD-1+)細胞以富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物。規程係經調適及修改以用於小規模及完整規模製造。
範疇
小規模經PD-1+選擇之第2代過程(PD-1+Gen2)係用於自一個肺部腫瘤碎解物及一個黑色素瘤腫瘤碎解物擴增經PD-1+選擇之TIL。TIL最終產物係按照規程TP-19-004鑑定。
完整規模經PD-1+選擇之第2代過程(PD-1+Gen2)係用於自二個頭頸部腫瘤碎解物及一個黑色素瘤腫瘤碎解物擴增經PD-1+選擇之TIL。TIL最終產物係按照規程TP-19-004鑑定。
實驗設計
小規模及完整規模製程的說明顯示於下表30、31。
小規模研究(第1期)係將TIL擴增過程規模縱向擴大及最佳化至臨床規模的可行性研究。額外條件係經測試以探察在PD-1+ TIL擴增中使用確定培養基及早期REP(縮短REP 1)。
下表31列出本研究所使用之腫瘤及相關組織學。
接受標準
針對這些批量實施僅供參考之下表3及4列出之參數的鑑定測試。
下表33指明用於評估第2期/完整規模批量表現的接受標準。
下表34指明針對第2期完整規模批量所實施僅供參考之額外最終產物鑑定測試。
結果 第 1 期小規模可行性結果
第1期研究使用肺部(L4093)及黑色素瘤(M1135)腫瘤。簡言之，各腫瘤係經酶催化性碎解，藉由FACS分選PD-1+細胞，且在第0天起始下列培養作為測試條件：
(1) PD-1+研究
(2) PD-1+第2代
(3) PD-1+確定培養基
(4) PD-1+早期REP。
各腫瘤亦起始二個額外培養作為對照。這二個條件係與PD-1+條件比較擴增動力學及TCR-Vβ殖株類型。
(5) PD-1neg
第2代
(6) 主體TIL第2代
在第17天收集PD-1+早期REP培養，然而所有其他培養在第22天收集(見表1a)。細胞分選輸出
第1期研究使用之二個腫瘤的FACS輸出係總結於下表35。
兩個腫瘤的PD-1+細胞產率%及分選後純度皆高。這些結果指示小規模可行性研究所使用的實驗參數是滿意的。REP1 及 REP2 輸出
在REP-1及REP-2之後使用NC 200測量總存活細胞(TVC)且顯示於下表36。表中呈現的TVC數量使用因子外推至完整規模過程。
過程產率：
本實驗的PD-1+第2代組在REP-1收集時產生超過200e6個且在REP-2收集時超過90e9個TIL具有＞ 98%存活性及94% CD45+CD3+細胞，暗示PD1+第2代係可產生完整規模製造足夠細胞的可行過程。REP-1自PD-1+第2代條件收集之TIL當相較於PD-1neg
或主體TIL條件時顯示降低的擴增倍數。此發現與先前研究發現一致。
功能：
自PD-1+第2代過程擴增之TIL因應抗CD3/CD28/CD137珠刺激所釋放之IFNγ及顆粒溶解酶B的量與使用研究過程產製之TIL類似(表34)。來自PD-1+確定培養基條件之REP-1及REP-2產物與PD-1+第2代條件之對應產物在所有測試的參數中皆類似。有趣的是，總培養持續時間為17天(對比PD-1+第2代過程的22天)之PD-1+早期REP條件產生對應之PD-1+第2代條件的57% (Rep-1)及37% (REP-2)。另外，PD-1+早期REP TIL當相較於其他條件時產生超過2倍IFNγ及顆粒溶解酶B的量，表示PD-1+早期REP TIL比起使用其他條件產製之TIL可能更為活性生長及更具代謝活性。由於TIL在培養中之倍增時間一般係＜ 1天，連同上述此暗示藉由稍微增加PD-1+早期REP培養持續時間至18或19天(對比PD-1+第2代的22天)可達成可相比的細胞輸出(關於細胞數量)及較高功能性(關於IFNγ及顆粒溶解酶B釋放)。經活化之T細胞表面上之CD107A表現係T淋巴細胞功能之衡量。當以PMA/IO刺激時，所有PD1+ TIL表現高量的CD107A(CD4+及CD8+ TIL皆然)。
TIL 壽命：
表37描述REP-2收集藉由螢光原位雜交流動式細胞測量術(FISH Flow)所判定之TIL端粒長度。
L4093及M1135樣本之端粒長度係與對照細胞系(1301白血病)比較。對照係具有允許計算相對端粒長度之長穩定端粒之四倍體細胞系。當相較於主體TIL時，PD1+ TIL之端粒在一例中較長且在另一例中稍短，暗示PD-1+ TIL相對於主體TIL維持彼等之壽命。
TIL 殖株性：
表38描述藉由TCR Vβ貯庫所測量之來自REP 2收集之TIL的殖株性。
肺部及黑色素瘤TIL兩者之PD-1+第2代條件之獨特CDR3序列數量係可相比的。此外，PD-1+第2代條件之TCR V貯庫顯示與主體TIL之對應貯庫超過10%的重疊。PD-1+第2代條件之多樣性指標(Shanon熵)小於主體TIL之多樣性指標，暗示PD1+第2代條件之TCR V貯庫比起主體TIL之對應貯庫較不具多株性且較為寡株性。
擴大表型分析：
表39至41描述來自TIL擴大表型分析之結果。多色流動式細胞測量術係用於鑑定REP-2 TIL之TIL純度、鑑別性、記憶子集、活化及耗竭狀態。
PD-1+第2代TIL主要包含TCR αβ及小於0.2%的TCR γ□細胞。包括B細胞、單核球及NK細胞之非T細胞族群各＜ 0.3%。所有條件包括PD-1+第2代TIL主要為效應記憶表型且較低分化，具有高量的CD28+、BTLA+、CD95+表現。
PD-1+條件之TIL的活化(CD69+)及耗竭(KLRG1+)狀態與使用第2代製程產製之黑色素瘤TIL的歷史結果係可相比的。
基於過程產率、功能、表型，PD-1+第2代當相較於PD-1+確定培養基及PD-1+早期REP時顯示有希望的品質屬性。第 2 期完整規模實驗結果
第2期研究使用一個黑色素瘤(M1137)及二個頭頸(H3032及H3034)腫瘤。簡言之，各腫瘤係經酶碎解、經流動式分選PD-1+細胞，且在第0天使用表31描述之PD-1+第2代過程以完整規模起始培養。流動式分選輸出
第2期研究使用之三個腫瘤的流動式分選輸出係總結於下表42。
所有三個腫瘤的分選後純度(PD-1+%)符合＞ 80%之標準。黑色素瘤腫瘤相對於頭頸腫瘤所觀察到稍微較低之純度最有可能是因為分選時PD-1+細胞的較低表現(附件1)。REP-1 及 REP-2 輸出
表43總結來自三個完整規模實驗之總存活細胞計數及產物屬性。
過程產率：
在REP-1結束時，所有三個PD-1+ TIL擴增至高於80e6(＞1500擴增倍數)，具有足夠起始REP-2培養之產率。在REP-2接種的5至200e6個TVC之範圍係基於目前的第2代REP過程。在REP-2收集時，所有培養產生＞ 26 e9 TVC且Lovo後回收率＞ 90%。
劑量：
最終產物劑量係＞ 26e9 TVC且具有＞ 94%存活性及93% CD45+CD3+細胞，即經高度富集之TIL族群。
功能：
TIL之功能係基於使用Dynabeads隔夜再刺激PD-1+ TIL來鑑定。再刺激24小時後收集上清液且冷凍。對上清液實施IFNγ及顆粒溶解酶B ELISA。IFNγ釋放符合接受標準，且所有三個TIL培養經刺激後分泌高量的顆粒溶解酶B。與第1期研究所產製之TIL產物類似的是，所有三個PD1+ TIL當使用PMA/IO刺激時表現顯著CD107A(CD4+及CD8+ TIL兩者)。
TIL 壽命：
H3032、M1137、H3034之PD-1+ TIL的相對端粒長度分別為7、4.1及5.2，且與第2代係可相比的(QP-17-011R01)。
TIL 殖株性：
資料等待中。
擴大表型分析：
表44及45描述TIL之擴大表型分析。多色流動式細胞測量術係用於鑑定REP-2 TIL之TIL純度、鑑別性、記憶子集、活化及耗竭狀態。
無可偵測的B細胞、單核球或NK細胞存在於最終收集的TIL(表14)。REP TIL大多是由效應記憶分化之TCRαβ組成。
所有三個PD-1+ TIL似乎是CD4顯性表型，且具有效應記憶表型及高CD27表現(表44)。
除了M1137，耗竭標誌KLRG1小於13%(表45)。CD57、BTLA4、LAG3、PD1+、TIGIT的量與使用第2代製程產製之黑色素瘤TIL的歷史結果類似。
代謝物分析：
所有條件用過的培養基在收集的最終日收集。上清液在CEDEX生物分析儀上分析葡萄糖、乳酸鹽、氨、麩醯胺酸、Glutamax及膽固醇的量(附錄3)。PD-1+第2代條件之葡萄糖、麩醯胺酸及膽固醇的量與主體TIL條件係可相比的。PD-1+第2代條件之Glutamax的量稍微高於主體TIL，暗示營養素的可用性不限制培養的生長。副產物諸如乳酸鹽及氨係與主體TIL可相比的。
差異及偏離
來自完整規模實驗之PD-1+ TIL最終產物樣本被送至iRepertoire進行TCR Vβ定序。報告將待資料可得之後修改。
由於材料限制，L4093及M1135所實施之小規模係以1/50規模進行，而非1/100規模。轉移20%的體積(最多4e6個細胞)而非轉移10%的體積(最多2e6個細胞)進入G-Rex 5M培養瓶。規模擴大受到規模擴大公式從TVC/10e6，進位，最多5變更成TVC/20e6，進位，最多5的影響。這些變化使最終外推為50X，而非100X的外推至完整規模。本報告前述章節中的詳細資訊反映此變化。
結論
發展完整規模的PD-1+第2代過程以在22天將PD-1+ TIL擴增至＞ 25e9。使用PD-1+第2代過程產製之TIL的所有品質屬性諸如表型鑑定包括純度、記憶、活化、耗竭標誌及功能與黑色素瘤第2代係可相比的。
選擇PD-1+第2代過程以進一步發展經PD-1選擇之TIL產物。
基於小規模獲得之結果，使用PD-1+早期REP條件實施額外實驗以鑑定PD-1+擴增過程為17至19天之較短持續時間而未破壞劑量或產物功能。見圖156。
實例10之參考文獻：
實例10：直接離體選擇及擴增PD1high
細胞：增強用於ACT療法之腫瘤反應性TIL之過程
介紹
使用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性T細胞療法已於轉移性黑色素瘤病患研究世代中顯示持久的反應率[1]。用於治療之TIL產物包含異質性T細胞，該異質性T細胞辨識腫瘤特異性抗原、突變衍生性病患特異性新抗原及非腫瘤相關抗原[2, 3]。研究顯示新抗原特異性T細胞顯著促成TIL的抗腫瘤活性[4]。預期富集具有腫瘤反應性之TIL的策略可產生更有效的治療性產物，特別是在已知含有高比例旁路T細胞的上皮癌症中[5]。數個研究顯示，在TIL上PD1(一種通常與T細胞耗竭相關的標誌)的表現識別自體腫瘤反應性T細胞[6, 7, 8]。本實例呈現經設計以選擇PD1高
細胞及富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物的新規程之發展。
目的
本實例提供一種分選及擴增PD1高
TIL及鑑定所得產物之規程。
範疇
本探討涉及使用2-REP規程離體擴增來自黑色素瘤、肺癌及頭頸癌之經分選之PD1高
TIL。評估經擴增之TIL的生長、存活性、表型、功能(IFNγ分泌、CD107a移動)、腫瘤殺滅及反應性(X-CELLigence)及TCRvβ貯庫(藉由流動式細胞測量術及RNA定序)。規程方法概覽提供於圖131。材料
腫瘤組織
收到來自UPMC、Moffitt、Biotheme及MT group的各種組織學的腫瘤。
用於TIL生長之標準試劑包括：G-Rex 24孔板及10及100M培養瓶(Wilson Wolf, Minnesota, Cat# P/N 80192M; #80040S; #P/N 80500)；CM2培養基；RPMI 1640培養基(Life Tech, California, Cat# 11875093)；AIMV培養基(Gibco, Massachusetts, Cat# 0870112-DK)；麩胺酸(Gibco, Massachusetts, Cat# 30050-061)；β-巰乙醇(Gibco, Massachusetts, Cat # 21985-023)；人AB血清(Gemini, California, Cat# 100-512)；0.5mg/ml建它黴素(Gibco, Massachusetts, Cat # 15750-060)；及GMP重組IL-2 (Cell-Genix, Germany, Cat#1020-1000)。
分析試劑
流動式細胞測量術補償珠：胺反應性補償珠套組(ARC) (Life Technologies, California, Cat# A10346)及VersaComp抗體捕捉套組(Beckman Coulter, California , Cat# B22804)。
流動式細胞測量術抗體(TIL1、TIL2(TIL表面抗原染色之TIL2項目，v1及v2)、TIL3及CD107a(藉由CD107a移動評估TIL功能))；ArC胺反應性補償珠套組(Fisher Scientific, Massachusetts, Cat # A10346)；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA) (Sigma, Missouri, Cat# P1586)；Corning Bio-Coat T細胞活化板抗CD3 (Fisher Scientific, Massachusetts, Cat# NC9937781)；Corning Bio-Coat T細胞活化對照板抗CD3 (Fisher Scientific, Massachusetts, Cat# NC1108453)；R&D Systems人IFNγ Quantikine套組(R&D Systems, Minnesota, Cat #SIF50)；殘渣移除溶液(Miltenyi Biotec, Germany, Cat#130-109-398)；及R&D Systems人IFNγ Quantikine套組(R&D Systems, Minnesota, Cat #SIF50)。
程序腫瘤製備
收到來自研究聯盟(UPMC, Moffitt)及組織採購供應商(Biotheme及MTG group)的新鮮切除的腫瘤樣本。腫瘤係隔夜運送於HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104)(含有抗生素)中。
將腫瘤自其主要及次要包裝移出，秤重含有腫瘤及運送培養基之小瓶並記錄質量。將腫瘤自小瓶移出並重新秤重小瓶及運送培養基。計算腫瘤的質量：(小瓶+運送培養基+腫瘤的質量) - (小瓶+運送培養基)。
將整個腫瘤碎斷成大約4至6-mm3
片段進行腫瘤碎解。如果腫瘤夠大，準備四個3mm3
片段進行Gen2。腫瘤可使用本文所述之任何規程碎解。用於腫瘤碎解之酶製備 ( 使用研究等級 DNA 酶、膠原酶及玻璃酸酶 )
將經冷凍乾燥之酶重構於以下各種碎解酶所示之量的無菌HBSS中。這些酶係經製備為10X。上下吸放數次且渦旋以確保完全重構。
將1-g的膠原酶IV (Sigma, MO, C5138)重構於10-ml HBSS中(以製備100-mg/ml原液)。藉由上下吸放混合以溶解。如果重構之後未溶解，放置於37℃
H2
O浴中5分鐘。等分至1-ml小瓶中。此係膠原酶之100 mg/ml 10X工作原液。
製備DNA酶(Sigma, MO, D5025)原液(10,000-IU/ml)。每批DNA酶之單位係提供於隨附之資料表。計算適當體積之HBSS以重構100-mg的經冷凍乾燥之DNA酶原液。例如，如果DNA酶原液係2000-U/mg，則原液中之總DNA酶係200,000-IU (2000-IU/mg X 100-mg)。要稀釋成10,000IU的工作原液，添加20-ml的HBSS至100mg的DNA酶(200,000IU/20ml=10,000U/ml)。等分至1-ml小瓶中。此係DNA酶之10,000IU/ml 10X工作原液。
製備玻璃酸酶10-mg/ml (Sigma, MO, H2126)原液。使用50-ml的HBSS重構500-mg小瓶以製備10-mg/ml原液。等分至1-ml小瓶中。此係玻璃酸酶之10-mg/ml 10X工作原液。
將原液碎解酶稀釋至1X。要製備1X工作溶液，將500-ml之膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶各者添加至3.5-ml的HBSS中。將碎解雞尾酒直接添加至C試管。用於腫瘤碎解之酶製備 ( 使用 GMP 膠原酶及中性蛋白酶 )
將經冷凍乾燥之酶重構於以下各種碎解酶所示之量的無菌HBSS中。上下吸放數次且渦旋以確保完全重構。
將膠原酶AF-1 (Nordmark, Sweden, N0003554)重構於10-ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係2892 PZ U/小瓶。因此，在重構後膠原酶原液係289.2 PZ U/ml。請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量。
將中性蛋白酶(Nordmark, Sweden, N0003553)重構於1-ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係175 DMC U/小瓶。因此，在重構後中性蛋白酶原液係175 DMC U/ml。請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量。
將DNA酶I (Roche, Switzerland, 03724751)重構於1-ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係4KU/小瓶。因此，在重構後DNA酶原液係4KU/小瓶。請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量。
製備工作GMP碎解雞尾酒。添加10.2-μl之中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3-μl之膠原酶AF-1 (1.2 PZ/ml)及250-μl之DNA酶I (200 U/ml)至4.7-ml之無菌HBSS。將碎解雞尾酒直接放入C試管。腫瘤處理及碎解
如果使用GentleMACS OctoDissociator，將腫瘤片段轉移至GentleMACS C試管(C試管)或50-ml錐形管於5-ml如上所示之碎解雞尾酒(於HBSS中)。將2至3個片段(4至6 mm)轉移至各C試管。
將各C試管(Miltenyi Biotec, Germany, 130-096-334)轉移至GentleMACS OctoDissociator (Miltenyi Biotec, Germany, 130-095-937)。根據製造商指示使用。請注意，各種腫瘤組織學具有建議的腫瘤解離程式。為各別腫瘤組織學選擇適當程式。解離為大約一小時。
如果無GentleMACS OctoDissociator可用，則使用標準轉子。將2至3個腫瘤片段放入50-ml錐形管(使用石蠟膜密封以避免滲漏)並固定至轉子。將轉子放置在37℃、5% CO2
增濕培育箱中恆定旋轉1至2小時。替代地，腫瘤片段可在RT下隔夜碎解(亦採用恆定旋轉)。
碎解後，將C試管自Octodissociator或轉子移出。將0.22 µm過濾器連接至無菌Falcon錐形管。使用移液管，使C試管/或50-ml錐形管中之所有內容物(5ml)通過0.22-µm過濾器進入50-ml錐形管。使用10-ml的HBSS洗滌C試管/50-ml錐形管並施加至過濾器。使用無菌注射器推筒的平坦端經由過濾器解離任何剩餘未經碎解之腫瘤。添加CM1或HBSS至50-ml並蓋上試管。
藉由在RT下以1500 rpm離心5 min使樣本成團塊(使用加速及減速9)。
小心移出液體，將團塊重懸於5-ml之CM1中以進行細胞計數及存活性評估。
為下列保留全腫瘤碎解物：1.細胞培養(未經選擇之TIL對照)；2. FMO流動式細胞測量術對照；3.分選前全腫瘤碎解物表型分析測定；4.經冷凍用於腫瘤反應性/細胞殺滅測定。經保留之細胞數量取決於總碎解產率及腫瘤組織學。使用殘渣移除套組清潔碎解物
根據製造商指示，殘渣係使用殘渣移除溶液(Miltenyi Biotec, Germany, Cat#130-109-398)自腫瘤碎解物移除。將腫瘤細胞懸浮液在4℃下以300Xg離心10分鐘且將上清液抽吸完全。根據下表使用適當體積之冷緩衝劑小心重懸細胞懸浮液且將細胞懸浮液轉移至15ml錐形管。不進行渦流。
添加適當體積之冷殘渣移除溶液且藉由使用5-ml移液管緩慢上下吸放10至20次混合均勻。使用4-ml之冷緩衝劑非常輕柔地覆蓋。傾斜試管且非常緩慢地移液以確保PBS/D-PBS相覆蓋細胞懸浮液且相不混合。將腫瘤細胞懸浮液在4℃下以3000Xg離心10分鐘，使用全速加速及全速煞車。形成三相。將上方二相抽吸完全且丟棄。底部相含有殘渣移除溶液及細胞。至少留下和所添加之殘渣移除溶液一樣多的底部體積(即，如果添加1ml的溶液，則在試管底部留下至少1-ml)。使用冷緩衝劑補至15-ml且倒轉試管至少三次。不進行渦流。在4℃下以1000Xg離心10分鐘，使用全速加速及全速煞車。將細胞重懸於HBSS或培養基中以進行細胞計數。染色經碎解之腫瘤以進行流動式細胞測量術分析及細胞分選
腫瘤碎解物根據下列規程使用包括PD1-PE、抗IgG4 Fc-PE(尼沃魯單抗及派姆單抗之二級抗體)及CD3-FITC之染色雞尾酒染色。計數後，將細胞重懸於10-ml HBSS中。
將團塊重懸於FACS緩衝劑(1 X HBSS，1mM EDTA，2%胎牛血清)中。添加至團塊之FACS緩衝劑的量係基於團塊的大小。染色體積應為團塊大小的約3倍(300-μl的細胞，緩衝劑之體積應為至少900-μl)。
就抗體添加而言，各100-μl之體積相當於一次測試(抗體經滴定之量)，即如果有1-ml之體積，則需要10X量的經滴定之抗體。
每100-μl之體積添加3-μl之抗CD3-FITC (BD Biosciences, NJ, Cat #561807)、2.5-μl抗PD1-PE (Biolegend, CA, Cat #329906)。亦以1:500添加抗IgG4 Fc-PE (Southern Biotech, AL, Cat #9200-09)。每500-μl之FACS緩衝劑添加1μl之抗IgG4 Fc-PE。
在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。在培育期間攪拌兩次。將細胞重懸於20-ml之FACS緩衝液中。使溶液通過70-μm細胞過濾器進入新的50-ml錐形管。在RT下以400Xg離心5 min(加速及減速9)。抽吸。將細胞以至多10e6
/ml總(活+死)重懸於FACS緩衝劑中。最小體積係300-μl。轉移至無菌聚丙烯FACS試管或15-ml錐形管。3-ml/試管進行FACS分選。準備用於經分選之族群之15-ml收集管。將2-ml之FACS緩衝劑放入試管。細胞計數及存活性
Nexcelom細胞計數器K2 (Nexcelom, MA)係用於獲得細胞及存活性計數。
FACS分選(FX500啟動)
開啟機器且運行細胞分選器軟體。運行自動校正。
準備五個含有10-ml無菌D.I.水之無菌15-ml錐形管。準備五個含有4-ml無菌D.I.水之無菌5-ml FACS試管。準備五個含有12-ml 70% EtOH之無菌15-ml錐形管。準備五個含有12-ml 10%次氯酸鈉之無菌15-ml錐形管。樣本收集
驗證樣本及收集室係在5℃下且選擇攪動樣本圖示。進行樣本收集軟體程序。
將含有PBMC對照之試管放在樣本收集平台上。
在以上顯示之兩個下拉式選單選擇100,000個細胞收集。驗證細胞族群係經正確圈選。藉由使用PBMC、FMO對照及樣本本身，將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區別三個族群。見圖132。
可能需要調整BSC或FSC設定。未調整任何其他通道的電壓。裝載PE FMO對照試管及運行樣本。視需要調整PD1圈選。見圖133。
當滿意圈選時，記錄盡可能多起事件(或最多20,000起CD3事件)。可設定樣本壓力為10以加速此收集。停止收集且移出試管。將先前製備的15-ml錐形管的無菌dH2O裝載至樣本平台上。樣本壓力選擇10。運行軟體。收集樣本達一分鐘。重複直到CD3圈選已無事件。移除dH2O樣本試管且丟棄。使用油性筆在待收集的試管上之彎液面底部及中點畫一條線。將待收集之樣本添加至裝載平台上。注意：總共有四個組分待收集-陰性、中、高及CD3。先收集PD-1組分。接著CD3組分最後收集。
樣本壓力選擇4。運行軟體。等待細胞出現在螢幕上。約15秒。當可見到3個PD-1組分時，壓下「暫停」。先收集3個組分中最低的2個。
打開樣本室的門且將15-ml收集室嵌塊裝載至該室。將含有收集緩衝劑之收集管裝載至室嵌塊中。將加蓋試管倒轉數次以使收集緩衝劑包覆試管頂部。在BSC表面上輕敲試管以移除試管頂部及蓋子的多餘緩衝劑。將二個試管標示樣本名稱及neg、中或高。選擇具有最低百分比之PD-1細胞的組分。移除蓋子且將試管放入樣本室嵌塊中。選擇正確的右/左定向以符合試管位置。進行裝載收集。調整樣本壓力，以使每秒的總事件低於5,000。調整樣本壓力以維持至少85%之分選效率。記錄50,000起CD3事件。
當樣本達到大約空2/3時，停止分選。移除含有最多事件之收集樣本。重新蓋上蓋子且放在冰上或4℃下。將具有較低量之樣本留在收集室中，以使較多細胞可在收集最高百分比PD-1樣本期間收集。標示收集管且移除蓋子。將其放入收集室中。選擇分選收集的適當左/右定向。裝載收集管。壓下播放、記錄且開始分選。當樣本達到大約空三分之一時，停止分選。移出經收集之組分。重新蓋上蓋子且放在冰上或4℃下且將CD3收集管放入固定器左側。使左側用於CD3及右側分選空白。持續分選直到消耗樣本試管中之所有樣本。如果試管「乾掉(runs dry)」是可以的。自樣本室移出樣本試管。丟棄。自收集室移出經分選之組分。將試管蓋上蓋子且輕柔倒轉數次以將靠近試管頂部之液滴併入溶液中。在BSC表面上輕敲試管以移除試管頂部及蓋子的多餘溶液。將試管放在冰上。驗證PD1組分的純度百分比。將14-ml錐形管的無菌dH2O放置在樣本室上。洗滌。重複。移除dH2O試管且添加陽性組分試管。將樣本壓力值變更為10。記錄75起CD3陽性事件。立即停止試管且將其自樣本室卸載。重複用於剩餘樣本。輸出資料且關閉儀器。REP1 起始
具有最少數量的細胞(PD1high、PD1int或PD1neg)的條件係用於判定用於REP1起始之細胞數量。CD3細胞%(在分選期間判定)係用於計算在未經選擇之TIL條件下起始REP1所需之全碎解物中之細胞總數，其中CD3細胞的數量與PD1high、PD1int或PD1neg樣本相同。用於REP1起始之全碎解細胞的總數=REP1接種之分選細胞的數量/CD3細胞%。
將大約1000至100,000個細胞CD3+細胞放入分別含有7-ml或40-ml之CM2(50% RPMI 1640+10%人血清、glutamax、建它黴素及50% AimV)且含有3000-IU/ml之IL-2之G-Rex10中達11天。起始至少一個G-Rex培養瓶用於PD1high、PD1int及PD1neg分選族群及未經選擇之TIL。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3)(30 ng/ml)及餵養細胞(1:100比例(TIL:餵養細胞))至各培養瓶。
在板/培養瓶中培育細胞11天，不實施培養基更換(REP1)。
在REP1完成時，移出G-Rex 10大約30-ml之培養基。藉由上下吸放，將細胞重懸於剩餘培養基中。將細胞放入50-ml錐形管且以1500rpm離心5 min(加速及減速9)。
抽吸培養基且將細胞重懸於10至20-ml之CM2中以進行計數及存活性評估。REP2 起始
以迷你REP2起始而言，將1e5個細胞放入含有40-ml的CM2培養基及3000-IU/ml的IL-2之G-Rex 10中。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3，30 ng/mL)及餵養細胞(1:100比例，TIL:餵養細胞)。
以「完整規模運行」而言，2e6至30e6個細胞係於G-Rex 100M中於1-L的CM2培養基及3000-IU/ml的IL-2中擴增。在培養起始時添加抗CD3(選殖株：OKT3，30 ng/mL)及餵養細胞(1:100比例，TIL:餵養細胞)。
培養基更換(用於迷你規模)或培養基更換+分瓶(用於完整規模運行)係於REP2的第5天(過程的第16天)實施。將培養瓶的體積減少至大約10-ml (G-Rex 10)或100-ml (G-Rex 100M)且使用CM2或AimV+3000-IU/ml IL-2補充至40-ml (G-Rex 10)或1-L (G-Rex 100M)。以「完整規模運行」而言，培養瓶係經1:2分瓶。
在REP2的第11天(或過程的第22天)，將培養瓶的體積減少，在RT下以1500 rpm離心5 min(加速及減速9)。
評估最終產物的細胞計數、存活性、表型(TIL1, (DIG1))及功能(IFNγ及CD107a)。就Vβ貯庫分析而言，使1e6至5e6個細胞成團塊及冷凍。RNA定序係由iRepertoire實施。最終產物亦於共培養測定中評估腫瘤反應性且評估IFNγ。經解凍的全腫瘤碎解物與TIL共培養且藉由使用xCELLigence系統(ACEA Biosciences, CA)來評估腫瘤反應性(由IFNγ分泌)及殺滅(細胞裂解%)。
結果
高PD1分選細胞顯示增生能力缺陷。預期最終產物產率預期為＞或=1e9。相較於PD1int、PD1neg及未經選擇之TIL，經擴增之PD1高細胞亦為寡株性。基於PD1+/PD1high細胞較可能具有抗原特異性的前提，PD1high細胞相較於彼等之未經選擇之TIL對應體展現增強的腫瘤特異性殺滅能力。
實例10之參考文獻
實例11：分析經PD1選擇之TIL的TCR貯庫
目的
為了判定經程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)選擇之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的多株性及多樣性及與未經選擇之TIL比較。
範疇
分析來自人頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)及非小細胞肺癌(NSCLC)樣本之七對相匹配的經PD1選擇及未經選擇之TIL產物的T細胞受體(TCR)貯庫。
資訊
癌症免疫治療利用免疫系統來辨識及摧毀腫瘤細胞。靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原4及PD1之免疫檢查點抑制劑(CPI)所取得的成功已使癌症治療轉型且建立免疫治療，連同手術、化學療法及放射療法，成為標準治療性方案的其中之一。CPI療法導致顯著持久的臨床反應，但只在一些癌症類型的病患子集且通常導致嚴重不良反應[1, 2]。
利用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性細胞療法(ACT)已成為數種癌症強大及潛在治癒療法(Geukes Foppen et al. Mol Oncol 2015)。ACT所使用之TIL產物係直接自腫瘤組織回收且在離體大量擴增之未經選擇、非基因操作的多株T細胞製劑[3]。此過程確保在事先未知抗原的特性或鑑別性之下回收病患腫瘤特異性記憶T細胞之潛在多樣性貯庫[4]。綜上所述，ACT相較於標靶單一組織或腫瘤特異性抗原且需要插入轉殖基因之其他細胞療法諸如嵌合抗原受體(CAR)及TCR T細胞係較簡單、較少偏差、較安全且可能較有效之方案。然而，目前的TIL過程亦可允許回收及擴增各種與癌症非相關(所謂的旁路TIL)且辨識諸如該些來自Epstein-Barr病毒(EBV)、人巨細胞病毒(CMV)或流感病毒之抗原的T細胞組分[5]。
多線證據支持新抗原辨識隨後腫瘤細胞殺滅作為TIL療法的主要作用機制[6]。富集富含腫瘤新抗原特異性T細胞之TIL同時維持無偏差以保留一些程度的多樣性且避免抗原識別之需要代表一種有吸引力的最佳化產物之手段。
作為一種活化誘導之T細胞調節劑，PD1顯示因應最近抗原遭遇而特異性表現且以浸潤癌症組織之T細胞為例，PD1特異性標示新抗原特異性細胞[7, 8]。我們因此實施一種在離體擴增之前選擇TIL之PD1表現的方案，以相對於旁路TIL富集相關TIL。
在目前的實例中，經PD1選擇之TIL的T細胞殖株組成係與相匹配的未經選擇之TIL的T細胞殖株組成比較，以驗證選擇過程產製具有獨特組成且對應未經選擇之主體TIL族群之子集的病患特異性TIL產物。
實驗設計
7對經PD1選擇及未經選擇之TIL的殖株組成係藉由TCR之β次單位可變區(vβ)之互補決定區3 (CDR3)的RNA定序建立。TIL產物中各T細胞選殖株表現可藉由其CDR3vβ來識別之獨特的TCR。獨特的CDR3vβ序列因此提供殖株鑑別性，可藉以定義及研究TIL產物的T細胞貯庫。
材料
本研究所使用之腫瘤樣本及TIL產物係描述於表53。
根據程序實例10，經PD1選擇之TIL係獲自2個HNSCC及5個NSCLC樣本。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。使經PD1分選之細胞及未經選擇之全腫瘤碎解物進行二個11天快速擴增期(REP)以分別獲得經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL。將TIL產物冷凍儲存且在以下程序使用前解凍。
方法
RNA萃取
根據製造商規程(QIAGEN, Germantown, MD)，使用RNeasy® Mini套組自1至2e6個TIL萃取總RNA。
RNA定序
CDR3vβ係以半定量方式擴增，使用iRepertoire專有之arm-PCR(擴增子救援多工PCR)技術及他們的HTBIvc測定(iRepertoire, Huntsville, AL)。HTBIvc測定係捕捉來自白血球之VDJ重排，特別是來自T細胞之β鏈VDJ重排的巢式、逆轉錄多工PCR測定。自輸入RNA產製所得之庫使用Illumina次世代定序(NGS)平台(Illumina, San Diego, CA)以每庫大約1百萬次讀取之標準讀取深度定序。如圖134所示，最終資料涵蓋自架構3內至恆定基因起始處之可變基因區。可變基因區之CDR3部分對應在基因體層級的「DJ」重排位點。Illumina MiSeq平台係用於所有樣本。所有實驗皆使用iRepertoire進行。
定序資料分析
定序結果之初步分析係藉由iRepertoire使用過濾定序及擴增錯誤及按照各樣本識別CDR3vβ序列及彼等之頻率的流程實施(iRepertoire, Huntsville, AL)。以Python撰寫之客製化腳本係用於標準化資料及實施獨特CDR3vβ輪廓的額外分析，包括識別重疊的CDR3選殖株。
獨特CDR3vβ之數量係定義為樣本內獨特肽CDR3之數量。各個別殖株類型之頻率係藉由計數通過解多工及庫內之過濾器之定序讀數(含有獨特殖株類型)的數量計算。Shannon多樣性指標(H)係使用式
計算，其中S係群落中選殖株總數(豐富度)，且
係由選殖株
構成之S的比例。來自相同腫瘤樣本之經PD1選擇及未經選擇之TIL之間的重疊係藉由識別兩種樣本中發現之選殖株來判定且以兩種方式報告：共享選殖株百分比係藉由將共享選殖株數量除以各類型產物中報告之總獨特選殖株數量來報告；共享總TCR族群百分比係藉由標準化樣本之間的頻率及加總按照各TIL產物共享選殖株之頻率來判定。
預期結果
預期成對之經PD1選擇及未經選擇之TIL的TCR貯庫比較分析可顯示經選擇之TIL代表一部分未經選擇之TIL且係寡株性。預期經PD1選擇及未經選擇之產物之間共享的TIL選殖株可顯示2種產物中的不同頻率，反映改變之競爭動力學。
達成的結果
經PD1選擇及未經選擇之TIL中獨特CDR3vβ的數量及多樣性
活體內TIL包含不只對腫瘤特異性抗原(例如新抗原)具特異性，但也辨識廣泛範圍之與癌症非相關之表位(諸如該些來自EBV、CMV或流感病毒之表位)的T細胞[5]。這些非癌症相關或旁路TIL在產製足夠用於病患治療之T細胞數量所需的長時間活體外培養期期間可生長超越腫瘤特異性細胞且可導致產生具有低頻率腫瘤反應性T細胞之TIL產物[9]。
為了測試在活體外擴增之前分選PD1表現性TIL比起非預分選之TIL是否允許回收含有不同T細胞貯庫之產物，比較兩種過程之產物的TCR組成。對14個樣本實施如實例所述之CDR3vβ定序。資料係根據所述之方法分析以產生各樣本之獨特CDR3vβ數量及多樣性指標。結果顯示於圖134及表54。
獨特CDR3vβ數量在經PD1選擇及未經選擇之TIL中分別從1,027變為2,778及648變為1,975(圖134A)。HNSCC對比NSCLC並未注意到特定模式。7個經PD1選擇之樣本中的4個比起彼等之相匹配的未經選擇之樣本呈現較不獨特的CDR3vβ選殖株，暗示經PD1選擇之TIL相對於未經選擇之TIL較低多株性之趨勢，此將需要測試額外樣本才能證實。與獨特CDR3vβ選殖株數量類似的是，代表經PD1選擇及未經選擇之TIL選殖株多樣性的指標並無顯著不同(圖134B)。
報告指出黑色素瘤及NSCLC的活體內PD1+ TIL具有寡株性且認為反映新抗原特異性TIL在腫瘤微環境內之選擇性擴增[7, 8]。這些結果與該些報告部分一致，可能是因為來自本研究之TIL在定序前所進行的擴增期允許原本在擴增前偵測不到的低頻率選殖株出現。在發表報告中分析的TIL沒有經過擴增，因此可能沒有計入最低頻率的選殖株。在此實例中之觀察的潛在暗示在於，在TME中可能有比起初假設更多的PD1+或腫瘤特異性T細胞。在原始7個腫瘤碎解物中偵測到相對高(平均38.4%，範圍21至78%)的PD1+ TIL與此假設一致(報告SR-19-009-000)。替代地，經PD1選擇之TIL產物的明顯多株性可能因為污染的PD1- TIL之擴增所致。分選純度大約為93%(研究資料)且考慮初始增生優點，少數PD1- TIL可能在擴增期間增生至可偵測的量[8, 10, 11]。
由於經PD1選擇及未經選擇之TIL中獨特CDR3vβ選殖株的數量及頻率可在活體外培養期間追平，我們著手比較包含經PD1選擇及未經選擇之TIL之T細胞殖株類型的鑑別。經 PD1 選擇及未經選擇之 TIL 之間重疊 T 細胞選殖株的數量及百分比
在TME中，經顯示PD1特異性識別腫瘤抗原辨識性TIL，其代表一部分浸潤組織的T細胞[7, 8]。如上所述，廣泛範圍的非癌症相關T細胞亦可在不預期具有最近上調之PD1表現及我們的PD1分選策略意圖進行選擇之任何給定時間存在於TME中。我們因此想要判定存在於未經選擇之產物中之哪個部分的TIL殖株類型包含經PD1選擇之產物。為此，評估每一對TIL樣本經PD1選擇及未經選擇之產物之間的殖株重疊程度。表現為重疊選殖株之數量、百分比及部分之結果顯示於分析中。
經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL分別計數平均5.4%及5.36%共享uCDR3vβ□選殖株□，構成26.9%及26.23%的總CDR3vβ讀數(圖2)。這些數字指示，經PD1選擇之選殖株貯庫僅部分與未經選擇之選殖株貯庫重疊，且在經PD1選擇之TIL中所識別之顯著殖株類型族群無法在相匹配的未經選擇之TIL中偵測到。由於經PD1選擇及未經選擇之TIL兩者原本來自相同的腫瘤碎解物，因此重疊分析之結果指示：1)大部分假定之旁路TIL並未進入經PD1選擇之TIL產物，及2)經PD1選擇之產物回收可變部分之TIL(可能包含腫瘤特異性細胞)，其在未經選擇之TIL擴增期期間喪失。存在培養初期之旁路TIL在未經選擇之細胞池中可能能夠生長超越低增生性PD1+ TIL，然而當以經PD1選擇之條件在旁路細胞不存在下培養時，這些相同的PD1+ TIL得到擴增機會。在此處研究之2種組織學之間注意到顯著差異。雖然所有5個NSCLC樣本之經PD1選擇之產物中的共享殖株類型之部分相對於未經選擇之產物增加，但在2個HNSCC樣本中觀察到相反結果。此外，對應這2個樣本的未經選擇之製劑係由相對高比例的共享TIL構成。有鑑於樣本數有限，此差異可能並不正確；亦可能反映存在於該些潛在HPV相關癌症之腫瘤抗原類型的差異。整體而言，我們的結果有一致的選擇步驟對經擴增之TIL產物之組成的顯著效應且暗示所得之經PD1選擇之TIL可為高度富含原本將在擴增期期間減少之腫瘤特異性TIL。見圖135。比較經 PD1 選擇之最常見 TIL 選殖株於經 PD1 選擇及未經選擇之產物中的頻率
先前兩個評估的結果指出PD1表現性、腫瘤特異性TIL易受非腫瘤相關、旁路T細胞選殖株的競爭及自池單離腫瘤相關TIL之優點。為了進一步評估腫瘤特異性T細胞於經PD1選擇及未經選擇之TIL中之差別代表性，判定在未經選擇之TIL中前10個最高頻率之經PD1選擇之TIL選殖株的排名。結果顯示於圖136及表56。
在所有成對TIL產物中，大部分具高度代表性之經PD1選擇之TIL選殖株在未經選擇之產物中為低度或不具代表性，證實選擇步驟對擴增產物之最終組成的顯著影響及腫瘤特異性T細胞在經PD1選擇之TIL中之可能富集。
結論及建議
所評估之經PD1選擇之TIL的獨特CDR3vβ序列數量及多樣性指標與相匹配的未經選擇之TIL係可相比的，暗示多株且高度多樣產物可在PD1分選後擴增。
經PD1選擇之TIL選殖株貯庫與未經選擇之TIL部分重疊，表示當使用選擇過程時可能回收較高數量之腫瘤特異性TIL。
經PD1選擇之高頻率TIL選殖株以較低頻率存在於未經選擇之TIL產物中，再次支持腫瘤特異性TIL富集於新產物中。
整體而言，本研究表示擴增經PD1分選之TIL所導致之TIL產物在它們的組成上與未經選擇之TIL不同。此差異可能反映出腫瘤特異性TIL的中度代表性及旁路TIL在PD1選擇不存在下發生的產物。
實例11之參考文獻
實例12：腫瘤碎解物中之PD1表現性細胞
目的
此實例評估程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)於全腫瘤碎解物中之表現。
範疇
評估下列腫瘤組織學之全腫瘤碎解物的PD1：黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌(OC)、三陰性乳癌(TNBC)、前列腺癌(PC)及結直腸癌(CRC)。
資訊
PD1係多面向的表型標誌，其與活化、抗原特異性及耗竭相關。其在活化時被快速誘導且在慢性疾病環境(包括癌症)中維持在經歷抗原細胞(antigen-experienced cell)上[1, 2]。在分子上，PD1係調節性細胞表面受體之CD28家族成員且表現在慢性活化之T細胞、NKT細胞、B細胞及單核球上[3-5]。與其配體PD-L1及PD-L2結合誘導傳訊級聯，導致降低T細胞的活化、增生、生存及細胞介素產生[6]。
儘管PD1的免疫抑制性角色，PD1表現性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之存在與頭及HNSCC及NSCLC中之較佳臨床結果相關，暗示這些TIL可能涉及控制腫瘤進展[7] [8, 9]。
黑色素瘤及NSCLC之研究顯示大部分腫瘤反應性TIL包含在PD1+ T細胞子集內[4, 8, 10]。
基於PD1+ TIL係新抗原/腫瘤特異性淋巴細胞之概念，Iovance正在發展一種新穎的經PD1選擇之TIL產物LN-145-S1，其富含直接自全腫瘤碎解物分選之PD1+ TIL。
雖然PD1表現為抗PD1療法之反應所需，但光是PD1表現無法預測對療法的反應性。舉例來說，PD1係存在於OC之TIL上且其表現與生存有關[11]。然而，最近OC的臨床試驗顯示抗PDL1藥物艾維路單抗(Avelumab)與化學療法之組合無法增強無進展存活[12]。在腫瘤微環境表現PD1+之本研究連同許多對抗PD1療法具有抗藥性之病患顯示活體內阻斷PD1/PDL1軸不足以控制大部分癌症。
使用lifileucel之過繼性T細胞療法在抗PD1難治性黑色素瘤病患中顯示顯著療效，表示TIL過程擴增了無法藉由活體內PD1阻斷而被重新賦活之T細胞族群[13]。
在離體擴增之前分選PD1+ TIL可能進一步在所有PD1+癌症組織學中改善TIL療法之反應率。
本實例之目的在於調查多個腫瘤組織學中PD1+ TIL之存在以支持臨床上利用這些TIL靶向該等腫瘤組織學。
實驗設計
藉由流動式細胞測量術評估來自多個腫瘤組織學之腫瘤碎解物的PD1表現。
材料
在此實例中使用之腫瘤碎解物係描述於圖137。
方法
腫瘤處理
將重量0.2g至1.5g之組織樣本部分分割成4至6-mm片段且碎解成包含腫瘤、基質及免疫細胞之單一細胞懸浮液。使用包括DNA酶(500 IU/ml)、玻璃酸酶(1 mg/ml)及膠原酶IV (10 ng/ml)之三重酶催化性雞尾酒在37℃下在輕柔攪動下碎解組織1小時。
PD1染色
全腫瘤碎解物根據下表染色。細胞以100µl/1e6個細胞染色。
PD1選擇及圈選策略
將經染色之細胞放在FX500細胞分選器(SONY, New-York)或ZE5細胞分析儀(BioRad, CA)上且基於下列圈選策略分析。首先，單一細胞係基於前向及後向或側向散射光識別。接下來，活細胞係基於負向/低7-AAD或活-死藍色螢光圈選。TIL係使用CD3識別。PD1細胞係使用正常供體周邊血液(ND-PBL)作為對照組識別。PD1之選擇圈選係放在ND-PBL中之PD1表現基線之上。
資料分析係利用FlowJo v8.1軟體(FlowJo LLC, OR)實施。結果使用GraphPad v8作圖。
預期結果
預期PD1表現於大多數經測定之腫瘤碎解物。預期各腫瘤亞型內及不同的腫瘤組織學之間PD1之百分比係可變。
達成的結果
腫瘤碎解物中之PD1表現
為了識別哪些組織學係適合進行PD1選擇之候選物，使用流動式細胞測量術評估來自數種癌症組織學之多個腫瘤樣本的PD1表現。根據程序TMP-18-015(縮寫於第5.2節)，總共測試4個黑色素瘤、7個NSCLC、5個HNSCC、3個OC、5個TNBC、2個PC及8個CRC。CRC係由微小衛星體穩定性(MSS) (n=6)及微小衛星體不穩定性(MSI) (n=2)兩種腫瘤構成。在碎解後，一部分所得之單一細胞懸浮液進行PD1染色，進行流動式分析，且當可得到＞5e6個細胞時，分選以獲得PD1+細胞。使經PD1分選之細胞進行二個11天快速擴增期(REP)以獲得經PD1選擇之TIL。腫瘤ID、組織學及實驗結果係列出於圖137。流動式分析之結果係顯示於圖138。
所有經測定之腫瘤碎解物表現在CD3族群內某百分比之PD1+細胞。PD1%係可變且在所測定之組織學中的範圍自11%至78%，平均為35%。黑色素瘤(n=4)及PC(n=2)產生最低平均值的PD1表現，分別為27%及21%。PD1表現之平均百分比與該些組織學所觀察到的臨床反應率無相關。對於抗PD1阻斷有反應之組織學諸如黑色素瘤及NSCLC比起對於抗PD1阻斷無反應之組織學(即OC及PC)不具有較高量/表現的PD1。
重要的是，經PD1選擇之產物可在所有可起始培養之情況中經活體外擴增PD1+細胞而獲得(圖138)。因此，基於PD1的表現，所有經測定之組織學係適合進行PD1選擇之潛在候選物。
結論
在所有經測定之腫瘤碎解物中，PD1係表現於CD3細胞上。
PD1表現有廣泛的腫瘤內及腫瘤間變異性。
PD1表現與組織學是否顯示對於抗PD1療法之反應性無相關。
實例12之參考文獻
實例13：經PD1選擇之TIL的擴增
目的
此實例評估經程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)分選之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)相較於相匹配的未經選擇之TIL的擴增。
範疇
來自黑色素瘤(n=4)、非小細胞肺癌(NSCLC) (n=7)及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)(n=2)之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL係使用二個循環的Iovance快速擴增規程(REP)擴增。在REP1 (D11)及REP2 (D22)完成時，評估經選擇及未經選擇之TIL的擴增。
資訊
PD1係CD28家族之成員且表現在慢性活化之T細胞、NKT細胞、B細胞及單核球上[1, 2]。PD1以在T細胞的表現為最大特點，其中PD1在TCR刺激時被誘導[2, 3]，且在慢性疾病環境中維持在抗原特異性細胞上[4, 5]。
在與其配體PD-L1及PD-L2結合時，經由PD1之傳訊導致抑制T細胞的增生、生存及細胞介素產生。數個在慢性疾病模型包括HIV、C型肝炎及癌症中的研究顯示，PD1+細胞的擴增倍數相較於PD1- TIL大幅減少[1, 6, 7]。在鼠多發性骨髓瘤模型中，當與彼等之PD1對應體比較時，經PD1選擇之TIL如所示以低10倍的擴增速率較無效率地增生。
儘管經PD1選擇之TIL的增生能力減少，但PD1+細胞已顯示在活體外在抗CD3及同種異體餵養細胞與IL-2存在下增生[5-7]。再者，小鼠PD1+ TIL在活體外殺滅自體腫瘤且在活體內產生抗腫瘤反應[8]。
經分選之PD1+ TIL(經PD1選擇)及衍生自全腫瘤碎解物之TIL(未經選擇之TIL)係使用二個依序11天REP擴增。計算TIL擴增倍數以判定經PD1選擇之TIL是否可擴增且與相匹配的未經選擇之TIL相比如何。在REP1 (D11)及REP2 (D22)完成時，基於初始CD3接種計數及收集時的細胞數量計算擴增倍數。
實驗設計
經PD1選擇及未經選擇之TIL係於22天過程中擴增，使用二步驟擴增過程，包括11天活化步驟及隨後的11天REP。計算擴增倍數以評估二種TIL產物的增生能力。
材料
本研究所使用之腫瘤樣本及TIL產物係描述於圖139。
根據實例10，經PD1選擇及未經選擇之TIL產物係獲自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。使經PD1分選之細胞及未經選擇之全腫瘤碎解物進行22天擴增過程以分別獲得經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL。
方法
腫瘤處理
將重量0.2g至1.5g之組織樣本部分分割成4至6-mm片段且碎解成包含腫瘤、基質及免疫細胞之單一細胞懸浮液。使用包括DNA酶(500 IU/ml)、玻璃酸酶(1 mg/ml)及膠原酶IV (10 ng/ml)之三重酶催化性雞尾酒在37℃下在輕柔攪動下碎解組織1小時。為了確保捕捉原位表型，在碎解後直接選擇PD1細胞[2]。
PD1染色
全腫瘤碎解物根據下表染色。細胞以100µl/1e6個細胞染色。
PD1選擇及圈選策略
將經染色之細胞放在FX500細胞分選器(SONY, New-York)上且基於下列圈選策略分析。首先，單一細胞係基於前向及後向散射光圈選，接著活細胞基於負向或低7-AAD螢光圈選，隨後藉由CD3及PD1表現圈選。PD1細胞係使用正常供體周邊血液(ND-PBL)作為對照組識別。PD1之選擇圈選係放在ND-PBL中之PD1表現基線之上。
經PD1選擇之TIL快速擴增規程
經PD1選擇及未經選擇之TIL係使用二步驟過程擴增，該過程包括11天活化步驟及隨後的11天REP，總共22天。TIL係使用OKT3 (30ng/ml, Miltenyi Biotec)及經照射的同種異體周邊血液單核細胞(1:100 TIL:餵養細胞比例)擴增。TIL接種數量的範圍介於5,000至100,000個CD3+，且取決於預分選細胞數量、CD3浸潤及PD1表現。
計算TIL擴增倍數
在D11(活化收集)及D22(REP收集)，使用細胞計數器K2螢光存活性細胞計數器(Nexcelom, MA)收集及計數TIL。經PD1選擇及未經選擇之族群的擴增倍數係基於經接種之CD3計數及收集細胞計數計算(即，活化擴增倍數=D11細胞計數/D0細胞計數及REP擴增倍數=D22細胞計數/D11接種計數)。在未經選擇之TIL條件下用於活化步驟之接種細胞數量係標準化至在D0經PD1選擇中CD3細胞的數量。資料使用GraphPad Prism v8作圖。
結果
經PD1選擇之TIL在抗CD3及餵養細胞存在下擴增，但程度比起相匹配的未經選擇之TIL為低。
達成的結果
經PD1選擇及未經選擇之TIL的擴增倍數
典型地，已顯示PD1+細胞具有經損害之細胞介素產生及經減少之增生[3, 4]。已顯示原位阻斷PD1或其配體PD-L1部分反轉TIL中之增生性功能異常[2, 9]。在活體外，PD1+細胞在IL2存在下經抗CD3及同種異體餵養細胞刺激後可增生[1]，但程度不及PD1- TIL [8]。
為了判定經PD1選擇之TIL是否可在活體外增生且產生用於輸注之治療適當數量之TIL，使用具有11天活化步驟及隨後11天REP的二步驟過程擴增來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇及未經選擇之TIL且評估擴增倍數。
在活化步驟期間，經PD1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL具有減少之擴增量。活化步驟平均擴增倍數係833，相較之下未經選擇之TIL係2650。有趣的是，在REP步驟中，經PD1選擇之TIL克服活化步驟的初始增生缺陷，因為經PD1選擇之TIL的擴增倍數(1308)與未經選擇之TIL (1418)類似。在黑色素瘤及NSCLC兩者中皆觀察到活化步驟REP1減少之增生，但在HNSCC則否。然而，經測定之HNSCC腫瘤數量為低(n=2)。再者，三種組織學的TIL族群之間在REP中之增生能力類似。
結論
經PD1選擇之TIL係成功地自黑色素瘤、NSCLC及HNSCC之腫瘤碎解物擴增。見圖141。
經PD1選擇之TIL在REP1相較於未經選擇之TIL具有顯著減少之擴增。
經PD1選擇之TIL的減少增生並不存在於REP2期間。
經PD1選擇之TIL儘管衍生自經分選之碎解物，但在Iovance的第2代產物lifileucel之REP擴增倍數範圍內(54至28,214)擴增良好。
儘管經PD1選擇之TIL在REP1期間減少增生能力，使用2-REP過程產製之13/13個經PD1選擇之TIL超越lifileucel的輸注臨限(即＞ 1e9)。
由於PD1+ TIL富含腫瘤/新抗原特異性細胞，因此以大量存在於最終產物中是必需的[10, 11]。經PD1選擇之TIL的較低增生能力暗示它們在未經選擇之TIL製備中將被勝過，因此進一步強化在擴增之前選擇的理論。
實例13之參考文獻
實例14：經PD1選擇之TIL的功能評估
目的
此實例評估經擴增之經程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)選擇之TIL的效應功能且與未經選擇之TIL比較。
範疇
評估來自黑色素瘤及非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL因應非特異性刺激的IFNγ分泌、顆粒溶解酶B釋放及CD107a移動。
資訊
PD1係多面向的表型標誌，其與活化、抗原特異性及耗竭相關。其在活化時被快速誘導且在慢性疾病環境(包括癌症)中維持在抗原特異性細胞上[1, 2]。在分子上，PD1係調節性細胞表面受體之CD28家族之成員且表現在慢性活化之T細胞、NKT細胞、B細胞及單核球上[3-5]。與其配體PD-L1及PD-L2結合誘導傳訊級聯，導致降低T細胞的活化、增生、生存及細胞介素產生[6]。
儘管PD1的免疫抑制性角色，PD1表現性TIL之存在與HNSCC [7]、NSCLC [8]及卵巢癌[9]中之較佳臨床結果相關。遭遇腫瘤微環境中之抗原導致PD1上調。數個研究顯示新抗原/腫瘤反應性TIL大多包含在PD1+ T細胞子集內[3, 10]。因此，選擇表現PD1之TIL預期富集富含腫瘤/新抗原特異性T細胞之TIL產物。
評估自腫瘤病灶回收之經選擇之PD1+ TIL因應非特異性刺激之功能性。未經培養之經分選之PD1+TIL相對於彼等之PD1-對應體顯示具有大幅減少之IFNγ產生[3, 8, 11]。然而，在活體外培養時，經擴增之PD1+ TIL恢復效應功能[4, 8]。
基於PD1表現(經PD1選擇)，發展富含腫瘤特異性T細胞之TIL產物。經PD1選擇之TIL及衍生自全腫瘤碎解物之TIL(未經選擇之TIL)係使用具有11天活化步驟及隨後11天快速擴增規程(REP)的二步驟過程擴增。為了判定所得之經擴增之經PD1選擇之TIL是否展現效應功能，TIL係於一系列活體外功能測定中評估且與相匹配的未經選擇之TIL比較。
實驗設計
經PD1選擇及未經選擇之TIL係於22天過程中擴增，該過程係具有11天活化步驟及隨後11天REP的二步驟過程。就IFNγ及顆粒溶解酶B分泌方面，評估最終TIL產物因應非特異性刺激的功能性。
材料
本研究所使用之腫瘤樣本及TIL產物係描述於圖14。
方法
腫瘤處理
將重量0.2g至1.5g之組織樣本部分分割成4至6-mm片段且碎解成包含腫瘤、基質及免疫細胞之單一細胞懸浮液。使用包括DNA酶(500 IU/ml)、玻璃酸酶(1 mg/ml)及膠原酶IV (10 ng/ml)之三重酶催化性雞尾酒在37℃下在輕柔攪動下碎解組織1小時。為了確保捕捉原位表型，在碎解後直接選擇PD1細胞[2]。
PD1染色
全腫瘤碎解物根據下表染色。細胞以100µl/1e6個細胞染色。PD-1流動式細胞測量術染色項目係提供於上述實例13之表58中。
PD1選擇及擴增
PD1+細胞係使用FX500細胞儀(SONY, New-York)選擇。經PD1選擇及未經選擇之TIL係使用具有11天活化步驟及隨後11天REP的二步驟過程擴增。TIL係使用OKT3 (30ng/ml, Miltenyi Biotec)及經照射的同種異體周邊血液單核細胞(1:100 TIL:餵養細胞比例)擴增。
IFNγ及顆粒溶解酶B分泌
將TIL以5e5個細胞/每孔接種於48孔板之1ml+300IU/ml IL2中(CellGenix, NJ)。TIL係經刺激+/- 100µl/孔之αCD3/αCD28/α41BB珠(ThermoFisher Scientific, MA)達12至18小時。收集上清液且藉由ELISA評估IFNγ (R&D Systems, MN)及顆粒溶解酶B (Life Technologies, CA)。ELISA板係於BioTek微量板讀取儀(BioTek, VT)上讀取且使用Gen5資料分析軟體評估。資料使用GraphPad Prism v8作圖。
CD107移動
在莫能星(monensin)存在下(以預防蛋白質分泌)，經PD1選擇及未經選擇之TIL使用PMA/離子黴素(BioLegend, CA)刺激2小時。接著使用活/死染料及抗CD3及CD107a之抗體染色TIL。經染色之細胞藉由流動式細胞測量術偵測。使用FlowJo軟體(Beckman Dickinson)分析CD107a於CD3+細胞中之表現。圈選策略如下：單一細胞(FSC及SSC)、活細胞、CD3及CD107。所有資料使用GraphPad Prism v8作圖。
結果
經擴增之經PD1選擇之TIL因應非特異性刺激產生IFNγ及顆粒溶解酶B。
經PD1選擇及未經選擇之TIL中之IFNγ及顆粒溶解酶B分泌
先前報告顯示，PD1+/PD1high細胞因應PMA及離子黴素[4]或抗CD3/抗CD28刺激[8, 11]時減少或完全無法產生IFNγ。這些研究使用未經培養之PD1+ TIL實施，除了PD1之外，其亦表現高量的共抑制性受體LAG3及Tim3 [8, 10, 12]。由於彼等之「耗竭(exhausted)」表型(即高表現的抑制性受體)及彼等無法產生效應功能，預培養之PD1+被認為「不具功能性(dysfunctional)」。然而，一旦PD1+/PD1high細胞在活體外(經由抗CD3及同種異體餵養細胞)擴增之後，TIL重新獲得彼等產生IFNγ之能力[3, 4, 8]。增強的效應功能亦與PD1表現大幅減少相關[3, 4, 8, 13]。這些研究暗示，觀察到之未經培養之PD1+/PD1high TIL的失效可藉由活體外培養逆轉。
為了評估PD1+ TIL就擴增後的細胞介素產生方面是否具有功能性，將來自13個腫瘤之經PD1選擇及相匹配的未經選擇之TIL使用非特異性αCD3/αCD28/α41BB活化珠刺激且評估IFNγ及顆粒溶解酶B分泌。
經PD1選擇之TIL因應非特異性刺激(αCD3/αCD28/αCD137珠)分泌可觀量的IFNγ及顆粒溶解酶B，暗示在擴增後確實具功能性。見圖143。
儘管彼等在擴增後產生IFNγ之能力，經PD1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL分泌顯著較少之IFNγ。因此，經PD1選擇之TIL因應非特異性刺激具有經減少之產生IFNγ之能力。然而，在與自體腫瘤共培養時，經PD1選擇之TIL相較於PD1- TIL顯示產生顯著較高量的IFNγ [3, 8, 13]。經擴增之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL係與自體腫瘤共培養且評估IFNγ。經PD1選擇之TIL比起未經選擇之TIL分泌較高量的IFNγ，不僅顯示彼等分泌IFNγ之能力，且係以腫瘤特異性方式進行。
當相較於未經選擇之TIL時，經PD1選擇之TIL產生類似但稍微上升量的顆粒溶解酶B，此與在HNSCC中之先前研究一致[11]。由於顆粒溶解酶B被認為是活化標誌，這些結果進一步顯示經擴增之經PD1選擇之TIL在擴增後不是處於耗竭或失效狀態。
經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL使用PMA/離子黴素刺激之CD107a移動
CD107a細胞表面表現被認為是TIL效應功能的可靠標誌。CD107a (LAMP1)在經刺激後移動至細胞表面且係用來作為一種細胞去顆粒之能力的衡量。去顆粒係穿孔素-顆粒溶解酶媒介之殺滅的先決條件且係藉由有反應的抗原特異性CD8+ T細胞媒介之立即裂解功能所必要[14, 15]。
為了進一步評估經PD1選擇之TIL的功能性能力，評估10個擴增後TIL的CD107a移動且與相匹配的未經選擇之TIL比較。
當與未經選擇之TIL比較時，經PD1選擇之TIL的CD107表現類似。見圖144。這些結果進一步支持經PD1選擇之TIL在擴增後具高度功能性且非耗竭細胞族群的概念。
結論
經PD1選擇之TIL因應非特異性刺激產生IFNγ及顆粒溶解酶B且移動CD107a。
與未經培養之PD1+/PD1high細胞所顯示者相反的是，經擴增之經PD1選擇之TIL係高度活化且具功能性，因此一旦在活體內能夠產生抗腫瘤效應。
實例14之參考文獻
實例15：經PD1選擇之TIL的自體腫瘤反應性
目的
此實例評估經擴增之經程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)分選之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)相較於相匹配的未經選擇之TIL的自體腫瘤反應性/殺滅。
範疇
評估來自黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)之13個相匹配的經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL因應自體腫瘤刺激的反應性及殺滅能力。反應性及細胞毒性分別測量IFNγ分泌及腫瘤細胞死亡(細胞毒性%)。
資訊
使用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性T細胞療法(ACT)被認為是轉移性黑色素瘤及其他實質腫瘤的有效治療，其誘導持久且完全的反應，即使在先前經重度治療的病患亦然[1-6]。在腫瘤發生期間，惡性腫瘤獲得非同義突變(稱為新抗原)[7, 8]。最近研究強調腫瘤新抗原於腫瘤辨識及有效活體內抗腫瘤T細胞反應的重要性[8, 9]。腫瘤特異性T細胞之存在與腫瘤消退及TIL療法之臨床療效相關[10]。具體而言，經選擇之新抗原反應性T細胞之ACT媒介結腸癌[8]及乳癌[11]病患的實質客觀臨床消退。
直到最近，關於腫瘤特異性TIL於腫瘤中之貯庫及頻率的知識有限[12, 13]。ACT之關鍵目標係衍生富含腫瘤反應性T細胞選殖株之多株TIL產物。最近研究顯示，TIL中之PD1表現可被用來作為識別新抗原特異性淋巴細胞之標誌及選擇工具。PD1在遭遇抗原時表現且在對腫瘤抗原有反應且在腫瘤部位進行殖株擴增之T細胞上上調[13-20]。
基於PD1+ TIL係新抗原特異性淋巴細胞之概念，評估PD1+ TIL在離體辨識自體腫瘤系的能力。為了測定腫瘤反應性，將TIL與自體腫瘤細胞系共培養且測定IFNγ。IFNγ係腫瘤微環境(TME)中必要的效應細胞介素，其被視為用於識別抗原特異性T細胞之代理標誌。有趣的是，在NSCLC及黑色素瘤兩者中，PD1+TIL當與自體碎解物共培養時相較於彼等之PD1-對應體分泌較高量的IFNγ [14, 17]。
亦使用腫瘤細胞裂解/殺滅來識別抗原特異性T細胞，然而這些測定不是經常實施，因為有衍生及維持自體存活腫瘤細胞系的問題。一項黑色素瘤的研究評估經分選之PD1+ TIL的殺滅且顯示PD1+ TIL相較於PD1- TIL具有較高裂解自體腫瘤系的能力[13]。
基於上述證據，選擇表現PD1的TIL預期富集腫瘤/新抗原特異性T細胞，在活體外顯示較高的自體反應性。為了捕捉腫瘤特異性細胞，在擴增之前使用螢光激活細胞分選(FACS)將PD1+ TIL自新鮮碎解的腫瘤分選(經PD1選擇)。經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL使用二個依序11天之REP擴增。
評估腫瘤反應性及細胞裂解以判定選擇PD1+是否能富集抗原特異性T細胞。將經PD1選擇之TIL與自體腫瘤細胞共培養且評估IFNγ產生及腫瘤細胞死亡。將結果與相匹配的未經選擇之TIL製劑比較。
實驗設計
使用TIL與自體腫瘤之共培養以評估13個成對之經PD1選擇及未經選擇之TIL中之腫瘤細胞殺滅及反應性。腫瘤裂解及IFNγ分泌係用於測量TIL產物中之抗原特異性。
材料
本研究所使用之腫瘤樣本及TIL產物係描述於圖145。
根據程序TMP-18-015，經PD1選擇及未經選擇之TIL產物係獲自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。將剩餘碎解物冷凍且在使用於以下指示之測定之前解凍。使經PD1分選之細胞及未經選擇之全腫瘤碎解物進行二個11天快速擴增期(REP)以分別獲得經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL。
方法
腫瘤處理及接種
自體全腫瘤碎解物係使用死亡細胞移除套組(Miltenyi, Germany)處理。將1e5個活細胞接種至96孔板的每孔且允許在xCELLigence儀器(ACEA Biosciences Inc, CA)中在37℃下附著18小時。
共培養設定
將1e5個經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL衍生性自體TIL添加至彼等各別之孔，導致1:1(TIL:標靶)細胞比例且培育48小時。
腫瘤細胞裂解定量
將自體標靶細胞殺滅記錄為因細胞脫附導致之阻抗增加。細胞殺滅(細胞裂解%)係使用下式計算：細胞裂解%=[1-(NCIst)/(AvgNCIRt)]x100，其中NCIst係樣本的標準化細胞指數，且NCIRt係相匹配的參照孔(僅碎解物)之標準化細胞指數平均值。細胞裂解%係使用RTCA軟體Pro (ACEA Biosciences Inc, CA)計算。
IFNγ分泌
在TIL添加後24小時收集上清液且藉由ELISA (R&D systems)評估IFNγ釋放。ELISA板係於BioTek微量板讀取儀(BioTek, VT)上讀取且使用Gen5資料分析軟體評估。資料使用GraphPad Prism v8作圖。
結果
此實例檢查經PD1選擇之TIL當與自體腫瘤碎解物共培養時比起未經選擇之TIL是否具有較高殺滅能力及分泌IFNγ之能力。
達成的結果
於經PD1選擇之TIL中的腫瘤反應性及殺滅
小鼠及人的臨床前資料皆顯示在腫瘤內之T細胞上表現PD1可識別新抗原特異性淋巴細胞貯庫[13, 14, 17-20]。數個研究顯示活體外經擴增之經純化的PD1+ TIL當與自體腫瘤共培養時相較於PD1- TIL分泌顯著較高量的IFNγ[14, 17]。基於這些研究，選擇表現PD1的TIL預期富集腫瘤/新抗原特異性T細胞，當在活體外評估時其將顯示較高的自體反應性。
評估十三個相匹配的經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的自體腫瘤反應性及殺滅。使用腫瘤細胞指數測量腫瘤細胞裂解。細胞指數係一種細胞附著的衡量，其自孔之細胞表面阻抗計算。當腫瘤細胞附著時阻抗增加，因此細胞指數增加。當腫瘤細胞死亡且脫附時細胞指數降低，因為阻抗減少。因此，如果TIL裂解腫瘤細胞，細胞指數將下降且經計算之細胞裂解百分比將增加。然而，如果細胞指數在共培養期間的任何時間下降至低於零，則無法計算該樣本的細胞裂解。
在13個經評估之腫瘤中，只可評估一個黑色素瘤腫瘤的腫瘤細胞裂解，因為腫瘤細胞存活性不良且缺乏腫瘤細胞附著至板。可評估之黑色素瘤的細胞指數及腫瘤細胞細胞裂解%分別顯示於下圖146A及146B。
測定來自上述共培養細胞裂解測定之上清液的IFNγ。在13個經評估之腫瘤中，3個黑色素瘤及2個NSCLC偵測到IFNγ分泌(圖146C)。
由於技術困難，僅在1/13共培養腫瘤中評估腫瘤細胞裂解%。在具有適當未經選擇之TIL對照之可評估腫瘤中，經PD1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL展現較高殺滅自體腫瘤的能力，如細胞指數之較大下降(圖1A)(表示較多細胞脫附及腫瘤細胞死亡)及較高百分比的細胞裂解(圖1B)所判定。這些結果受到黑色素瘤研究支持，該黑色素瘤研究使用自體腫瘤細胞系而非全腫瘤碎解物之替代測定亦顯示經PD1+選擇子集增強細胞裂解[13]。儘管可評估腫瘤的數量低，我們的結果除其他外顯示經PD1選擇之TIL比起彼等之未經選擇或PD1-對應體具有較高殺滅自體腫瘤之能力。
在13個經測定之共培養腫瘤中，5個腫瘤可偵測到IFNγ分泌。在5/5經測定之腫瘤中，經PD1選擇之TIL當與自體腫瘤碎解物共培養時比起未經選擇之TIL分泌較高量的IFNγ。IFNγ的分泌具腫瘤特異性，因為使用抗HLA-A、-B及-C阻斷減少IFNγ分泌的量(圖1C)。在自體腫瘤存在下產生較高量的IFNγ暗示經PD1選擇之TIL比起未經選擇之TIL具有較高比例的抗原特異性TIL。
結論
經PD1選擇之TIL相對於未經選擇之TIL顯示增強自體腫瘤細胞殺滅。
因應自體腫瘤之IFNγ分泌在經PD1選擇之TIL顯著高於未經選擇之TIL。
這些結果顯示相較於未經選擇之TIL，經PD1選擇之TIL在活體外對自體腫瘤具有優異的反應性。
ACT之臨床療效與腫瘤特異性TIL之存在有直接相關。因此，經由PD1選擇及擴增來富集腫瘤特異性TIL可增強TIL在活體內起始強力且有效的抗腫瘤效應之能力。
實例15之參考文獻
實例16：經PD1選擇之TIL的表型鑑定
目的
為了鑑定經程序性細胞死亡蛋白質1 (PD1)選擇之TIL的表型。
範疇
此實例涉及鑑定經PD1選擇之TIL所表現的顯示各種T細胞狀態之細胞表面標誌，且比較彼等之表型與相匹配的未經選擇之TIL的表型。
資訊
癌症免疫治療利用免疫系統來辨識及摧毀腫瘤細胞。靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原4及PD-1之免疫檢查點抑制劑(CPI)所取得的成功已使癌症治療轉型且建立免疫治療，連同手術、化學療法及放射療法，成為標準治療性方案的其中之一。CPI療法導致顯著持久的臨床反應，但只在一些癌症類型的病患子集且通常導致嚴重不良反應[1,2]。
利用自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之過繼性細胞療法(ACT)已成為數種癌症強大及潛在治癒療法[3]。ACT所使用之TIL產物係直接自腫瘤組織回收且在離體大量擴增之未經選擇、非基因操作的多株T細胞製劑[4]。此過程確保在事先未知抗原的特性或鑑別性之下回收病患腫瘤特異性記憶T細胞之潛在多樣性貯庫[5]。綜上所述，ACT相較於標靶單一組織或腫瘤特異性抗原且需要插入轉殖基因之其他細胞療法諸如嵌合抗原受體(CAR)及TCR T細胞係較簡單、較少偏差、較安全且可能較有效之方案。然而，目前的TIL過程亦可允許回收及擴增各種與癌症非相關(所謂的旁路TIL)且辨識諸如該些來自Epstein-Barr病毒(EBV)、人巨細胞病毒(CMV)或流感病毒之抗原的T細胞組分[6]。
多線證據支持新抗原辨識隨後腫瘤細胞殺滅作為TIL療法的主要作用機制[7]。富集富含腫瘤新抗原特異性T細胞之TIL同時維持無偏差以保留一些程度的多樣性且避免抗原識別之需要代表一種有吸引力的最佳化產物之手段。
作為一種活化誘導之T細胞調節劑，PD-1顯示因應最近抗原遭遇之特異性表現且以浸潤癌症組織之T細胞為例，PD1特異性標示新抗原特異性細胞[8, 9]。我們因此實施一種在離體擴增之前選擇TIL之PD-1表現的方案，以相對於旁路TIL富集相關TIL。本規程涉及直接自經新鮮碎解之腫瘤使用螢光激活細胞分選(FACS)分選PD-1+ TIL，且使它們進行包括11天活化步驟及隨後11天快速擴增規程(REP)之二步驟過程，以獲得治療適當數量之經PD-1選擇之TIL。
在目前研究中，經PD-1選擇之TIL係經表型鑑定以驗證1)新產物符合LN-145放行規定且2)與未經選擇之TIL產物係可相比的。藉由流動式細胞測量術評估經PD-1選擇之TIL的細胞表面標誌關於譜系、分化、記憶、活化、耗竭及常駐記憶的表現。
實驗設計
經PD-1選擇及未經選擇之TIL係於包括11天活化步驟及隨後11天REP的22天過程(二步驟過程)中擴增。最終TIL產物使用流動式細胞測量術鑑定表型。重要的是，未經選擇之TIL產物係獲自與經PD-1選擇之TIL相同的全腫瘤碎解物。有限的腫瘤組織防止未經選擇之TIL對照自腫瘤片段衍生，該等腫瘤片段係用於衍生Iovance的LN-145 TIL產物。此外，為了擴增小數量的經分選之PD-1族群，使未經選擇之TIL進行2-REP過程，而非用於產製LN-145的REP前及單一REP。因此，雖然未經選擇之TIL代表經PD-1分選之TIL的真正對照，但它們無法反映LN-145 TIL。
材料
本研究所使用之腫瘤樣本及TIL產物係描述於圖147。
方法
PD1選擇及擴增
根據程序TMP-18-015，經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物係獲自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD-1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。使經PD-1選擇及未經選擇之TIL在OKT3 (30ng/ml, Miltenyi Biotec)及同種異體經照射的周邊血液單核細胞(1:100 TIL:餵養細胞比例)存在下進行11天活化步驟及隨後11天REP。
抗體染色
TIL係以活/死標誌染色，並經CD3表現及定義T細胞譜系、記憶、分化、活化及耗竭之表型標誌的染色(圖147)。使用二組流動式細胞測量術項目(稱為1及2)以涵蓋受到關注之標誌。抗體及經接合之螢光團係列於下表59，其中按照表型參數配置。括弧中的數字代表彼等各別之組別。
FACS分析
經染色之細胞在ZE5細胞分析儀(BioRad, CA)上運行，之後進行標準實驗室程序。簡言之，可評估之事件藉由圈選係為活的(活/死染料陰性或低)及CD3+
之單一細胞(使用前向散射光及側向散射光參數)識別。個別表型標誌係基於FMO(螢光減一)及對照正常供體周邊血液單核T細胞圈選。
資料分析係利用FlowJo v8.1軟體(FlowJo LLC, OR)實施。結果使用GraphPad v8作圖。
預期結果
預期經PD-1選擇之TIL與未經選擇之TIL在大部分表型標誌上係可相比的且符合LN-145表型放行標準。基於發表的報告，預期經PD-1選擇之TIL的PD-1表現隨著活體外擴增步驟降低[10-12]。經PD-1選擇之TIL的PD-1量是否維持高於未經選擇之TIL則未知。
結果
經PD1選擇之TIL中之CD4及CD8表現
PD-1係表現於CD3+ T細胞，但大多以在CD8+ T細胞中為特徵，儘管其表現於CD4+及CD8+兩種譜系當中[10, 13]。為了判定分選PD-1+是否改變經擴增之經PD-1選擇之TIL相對於未經選擇之TIL中CD4+及CD8+ T細胞譜系之比例，比較13個成對樣本之2個標誌的表現。結果顯示於圖148。
經擴增之TIL中CD4+及CD8+細胞的平均百分比在經PD-1選擇及未經選擇之產物中類似。在經PD-1選擇及未經選擇之兩種TIL產物中，CD4+ T細胞的百分比高於CD8+ T細胞。
這些結果暗示在經PD-1選擇之T細胞族群內CD4+及CD8+ TIL的比例相對於未經選擇之TIL產物並無顯著不同。這些結果暗示選擇PD-1不改變最終擴增產物中之T細胞譜系。
經PD1選擇之TIL中之年輕/分化標誌
ACT之反應需要效應功能(通常在分化的T細胞中)與持續性(與T細胞年輕及中央記憶表型相關)的平衡[14, 15]。典型地，高CD27及CD28表現係與T細胞年輕相關，而CD56、CD57及KLRG1表現識別終末分化細胞。將十三個成對之經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物針對這些標誌染色且藉由流動式細胞測量術分析。結果顯示於圖149。
經PD-1選擇及未經選擇之TIL表現類似的分化表型，如低量的CD27、CD56及KLRG1及中等量的CD28及CD57所示。然而，經PD-1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL具有顯著較高量的CD27及降低量的KLRG1，此可能翻譯為經PD-1選擇之TIL的較低分化表型。這些結果與來自NSCLC之經選擇之高PD-1 TIL的報告一致，其中TIL相較於彼等之PD-1-對應體係CD27+及KLRG1- [2]。CD27+ TIL亦與活體內抗腫瘤活性相關且KLRG1+ T與減少T細胞活體內持續性相關[16]。這些結果暗示經PD-1選擇之TIL可能可以支持活體內持久反應所需之持續的抗腫瘤活性[7]。
經PD1選擇之TIL中之記憶T細胞族群
T細胞記憶子集可基於2種細胞表面標誌CD45RA及CCR7的差別表現識別。效應記憶T細胞(TEM)係定義為CD45RA-及CCR7，中央記憶T細胞(TCM)為CD45RA-及CCR7+，幹細胞記憶T細胞(TSCM)為CD45RA+及CCR7+，且CD45RA+效應記憶T細胞或終末分化T細胞(TEMRA)為CD45RA+及CCR7- [17]。
發表的研究顯示PD-1+ TIL大多包含效應記憶T細胞(TEM) [11, 18]。另外，已顯示這些TEM代表顯示臨床活性之未經選擇之TIL產物的主要族群[19]。為了判定各記憶T細胞子集於經PD-1選擇之TIL中的比例，藉由流動式細胞測量術評估13個產物的CD45RA及CCR7表現。結果顯示於圖150。
如Iovance目前的TIL產品lifileucel及LN-145以及其他顯示臨床療效之TIL產品，經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL兩者主要包含TEM [20]。選擇PD-1似乎不改變經擴增之TIL的記憶貯庫。
經PD1選擇之TIL的活化狀態
在T細胞活化時，數種各在活化過程的不同階段之細胞表面標誌係經上調。其中最早的活化標誌之一係CD69，其係經由TCR活化時表現的誘導性細胞表面糖蛋白[21]。CD25(IL-2受體之α次單位)的上調稍微晚於CD69，且在調節T細胞增生中扮演關鍵角色[21]。此外，共刺激受體諸如CD134及CD137亦被認為是T細胞活化之標誌且通常用於識別浸潤性腫瘤中之抗原特異性T細胞[21, 22]。
基於這些標誌的表現輪廓，已顯示REP後TIL顯示經活化之表型，與TIL產物在輸注後起始強力抗腫瘤T細胞反應之能力一致[3]。
大量研究已評估PD-1+及PD-1- TIL於小鼠及人中之活化狀態。在小鼠中的資料顯示，PD-1+ TIL相較於PD-1- TIL表現較高百分比的CD134及CD137 [11, 23]。在人研究中獲得類似結果，其中發現CD137在黑色素瘤及NSCLC病患的PD-1+/高PD-1 TIL中較高[8, 12]。
額外研究評估PD-1+ TIL中之CD69及CD25表現。已顯示顯著部分之PD-1+ TIL共表現CD69 [24]，然而大部分PD-1+缺乏CD25表現[13]。
為了驗證經PD-1選擇之TIL在擴增後表現經活化之表型，藉由流動式細胞測量術分析13個TIL產物表現的CD25、CD69、CD134及CD137且與未經選擇之TIL比較。結果顯示於圖151。
4個活化標誌在平均3.34至22.28%之經PD-1選擇之TIL中偵測到，表示在所有經測試之產物中，一部分的TIL表現至少一個指示活化之標誌。CD25+、CD69+及CD134+之百分比與未經選擇之TIL中之該些者係可相比的，暗示PD-1選擇步驟不改變在活體外經擴增之細胞的活化狀態。然而，未經選擇之TIL比起經PD-1選擇之TIL呈現顯著較低量之CD137+ T細胞，此可能反映出經PD-1選擇之TIL稍微較高的活化狀態。綜上所述，這些結果顯示REP一致地活化經PD-1選擇及未經選擇之TIL，且暗示PD-1+ TIL在活體外培養後表現經活化之表型[10]。
經PD-1選擇之TIL中之耗竭標誌
大量研究已評估PD-1與其他共抑制性/耗竭標誌之共表現。PD-1+ TIL之子集一致性地共表現TIM3、LAG3、TIGIT、BTLA及CTLA4 [8、11、12、18、23]。然而，這些標誌係於經新鮮單離之PD-1+ TIL中評估，有關彼等在經擴增之PD-1+ TIL中之狀態的可用資訊則較少。
有趣的是，在經擴增之PD-1+ TIL中的PD-1表現經顯示隨著培養及擴增降低且被解讀為TIL離體重新賦活之跡象[10, 12]。
為了更理解經PD-1選擇之TIL的耗竭/抑制性狀態，藉由流動式細胞測量術分析13個相匹配的未經選擇及經PD-1選擇之TIL產物所表現的四個耗竭/抑制性標誌LAG3、PD-1、TIM3及CD101。CD101已與晚期TIL功能異常相關且被添加至我們的耗竭標誌標準清單[25]。結果顯示於圖152。
經PD-1選擇之TIL表現所有經測定之4種耗竭/抑制性標誌。LAG3被發現在1.75至37.8%上，PD-1在9.06至53.8%上，TIM3在8.65至54.9%上，且CD101在9.16至91.1%上。未經選擇之TIL相對於經選擇之產物表現類似量的LAG3、TIM3及CD101，再次暗示分選PD-1+ TIL不顯著偏離在活體外擴增之最終產物的表型。2個產物之間只有PD-1的量有顯著不同，其中經PD-1選擇之產物比起未經選擇之細胞表現較高百分比之PD-1+細胞。然而，經PD-1選擇之TIL中之PD-1+細胞的數量自分選後的92.8%大幅下降至REP後的平均27.1%。此與他人報告之黑色素瘤及NSCLC TIL資料一致且暗示活體外重新賦活[10, 12]。
為了比較活體外擴增所誘導之PD-1下調在經PD-1選擇及未經選擇之TIL之間的程度，評估兩種產物之擴增前及後的PD-1+ TIL百分比。結果顯示於圖153。
PD-1的表現在經PD-1選擇之TIL(平均27.1%，範圍自9.06至43.6)及未經選擇之TIL產物(平均10.6%，範圍自4.93至29.3)兩者中相對於分別為92.8%及37.3%之初始平均PD-1的量顯著減少。因此，擴增TIL之過程同樣影響兩種TIL製劑，其中PD-1的表現減少＞3倍。
經PD1選擇之TIL中之常駐記憶T細胞標誌
整合素媒介淋巴細胞留滯於周邊組織中。這些整合素中的一些係表現於被稱為常駐記憶T細胞之T細胞子集上。這些細胞在表型上與效應記憶T細胞強烈相似，但不循環且常駐於組織內。
數種整合素諸如αEβ7 (CD103)、α1β1 (CD49a)係表現於經新鮮單離之TIL的不同組分上[7, 8]。連同CD39(一種涉及腺苷途徑且與抑制性信號相關之T細胞表面分子)，CD49及CD103已在顯示具有腫瘤反應性之PD-1+ TIL上識別[2, 8, 10]。另外，PD-1及CD103共表現與卵巢癌之較佳臨床結果相關[9]。
為了判定經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL產物是否表現與常駐記憶T細胞相關之標誌，分析13個腫瘤所表現之CD39、CD49a及CD103。見圖153。
觀察到CD49a+及CD103+細胞之百分比在經PD-1選擇之TIL相對於未經選擇之TIL中無差異，然而CD39表現在經PD-1選擇之TIL比起未經選擇之TIL顯著較高。如此標誌與新抗原特異性之相關性所暗示，此差異可能與CD39在未經擴增之PD-1+ TIL中之較高量有關[6]。整體而言，3個標誌差別表現於TIL產物中。
結論
觀察到的經測定之細胞表面標誌表型表現差異係表示於下表60。除了KLRG1以外，所列出之表型標誌在經PD1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL中係經顯著上調。
如較高表現的CD27及較低量的KLRG1所顯示，經PD-1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL似乎為較低分化。TIL的療效及治癒潛力取決於彼等殺滅及持續存在夠久以清除腫瘤中所有惡性細胞的能力[14, 24]。因此，經中度分化的表型可為經PD-1選擇之TIL的正面特徵。
當相較於未經選擇之TIL，經PD-1選擇之TIL表現較高百分比的CD137及CD39。這些發現暗示經PD-1選擇之TIL係處於活化狀態，其可具有一旦轉移至活體內之後增強彼等之效應功能的潛力。
整體而言，我們的結果暗示經擴增之經PD-1選擇之TIL大多係由具有低表現耗竭標誌之非分化的TEM構成，暗示這些細胞在活體外擴增後被重新賦活。
經PD-1選擇之TIL的表型特徵與Iovance之未經選擇之TIL產品lifileucel及LN-145係可相比的，該等產品已分別顯示對轉移性黑色素瘤及子宮頸癌的臨床療效。
實例16之參考文獻
實例17：使用尼沃魯單抗藉由流動式細胞測量術分選選擇PD1 TIL及以完整規模擴增以進行臨床製造介紹
本實例係關於經設計以自腫瘤碎解物選擇PD1 TIL以富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物的規程之發展。本實例提供使用尼沃魯單抗作為PD1染色抗體而非經PE接合之選殖株# EH12.2H7以獲得經PD1選擇之TIL之規程。目的
此規程之目的在於發展一種使用尼沃魯單抗作為選擇劑來分選PD1 TIL及擴增以用於製造臨床試驗材料之過程。範疇
研究範疇在於使用為了完整規模臨床製造所設計之2-REP規程來擴增來自黑色素瘤或肺部或頭頸或卵巢腫瘤之經分選之PD1 TIL(圖154)。
進行二個小規模及一個完整規模實驗。
在第0天，將腫瘤碎解物相等分布以使用新的染色方法(使用尼沃魯單抗)及使用抗PD1 (EH12.2H7)之染色方法純化PD1 TIL及流動式分選PD1 TIL。
以小規模過程(1/100規模)而言，REP-1係藉由計算10%之具有最低分選結果之PD1 TIL而於第0天起始，並將該數量之來自各分選之TIL轉移至含有餵養細胞及OKT-3及IL-2培養基之各別G-Rex-10M培養瓶中。REP-2按照實例9起始。相關時間點之簡短解釋概述於以下方法章節(圖155)。
以完整規模過程而言，REP-1係於第0天起始且使用經分選之PD1 TIL與100e6個同種異體餵養細胞及30 ng/mL OKT3達11天。REP-2將使用經收集之REP-1產物於第11天起始。REP-2(第11天)及後續的第16天及第22天過程係按照IOVA製造批次記錄實施。相關時間點之簡短解釋概述於以下方法章節(圖154)。
以所有條件而言，第22天收集係藉由體積減少起始，隨後在NC-200上進行細胞計數。
評估經擴增之TIL及最終產物之細胞生長、存活性、表型、端粒長度及功能(IFNγ及顆粒溶解酶B分泌、CD107a移動)。4. 方法
碎解後PD1第2代小規模及完整規模過程概覽
圖 155 ：小規模過程概覽：
PD1-A係使用此規程中概述之尼沃魯單抗染色程序之條件。PD1-B係使用抗PD1-PE (Clone# EH12.2H7)染色方法之條件。主體條件作為對照組。材料 腫瘤組織
收到來自研究聯盟及組織採購供應商的各種組織學的腫瘤。用於TIL生長之標準試劑包括：G-Rex 100MCS及500 MCS培養瓶(Wilson Wolf，分別為Cat # 81100-CS、85500S-CS)；GMP重組IL-2 (Cell-Genix, Germany, Cat#1020-1000)；GlutaMAX 100X (Thermofisher, Cat# 35050061)；及建它黴素50mg/mL (Thermofisher, Cat# 15750060)。流動式細胞測量術染色及分析試劑 流動式細胞測量術抗體
抗PD1 PE，選殖株EH12.2H7，Biolegend, Cat# 329906
抗CD3 FITC，選殖株OKT3，Biolegend,Cat# 317306
抗IgG4 Fc-PE，選殖株HP6025，Southern Biotech, Cat# 9200-09
尼沃魯單抗[商品名稱：Opdivo] 10 mg/mL (Bristol-Myers Squibb, New York)
PE抗人IgG4，HP6023選殖株，0.5 mg/mL (BioLegend, San Diego, Cat# 98155)分選緩衝劑
含有2% FBS之HBSS。收集緩衝劑
含有50% hAB血清之HBSS。程序 腫瘤組織製備
收到來自研究聯盟及組織採購供應商的新鮮切除的腫瘤樣本。腫瘤係隔夜運送於在2至8℃下之HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104)(含有建它黴素(10 mg/mL)及兩性黴素B(250 µg/mL))中。
將小瓶/試管中之腫瘤照相。將腫瘤自包裝移出，且於腫瘤洗滌緩衝液(含有50 µg/mL建它黴素之經過濾之HBSS)中洗滌3次每次洗滌2分鐘。
將整個腫瘤碎斷成4至6-mm3片段準備進行腫瘤碎解。將4至6-mm3
片段保持在6孔板之每孔含有10 mL之腫瘤洗滌緩衝劑之孔中。用於腫瘤碎解之酶製劑
使用如本文所述之GMP膠原酶、中性蛋白酶及DNA酶I碎解腫瘤。
將經冷凍乾燥之酶重構於以下各種碎解酶所示之量的無菌HBSS中。確定捕捉瓶壁及瓶口保護蓋上之任何殘餘粉末。上下吸放數次且渦旋以確保完全重構。
將膠原酶AF-1(Nordmark, Sweden, N0003554)重構於10 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係2892 PZ U/小瓶。因此，在重構後膠原酶原液係289.2 PZ U/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成100 µl等分試樣且儲存在-20℃下。
將中性蛋白酶(Nordmark, Sweden, N0003553)重構於1 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係175 DMC U/小瓶。因此，在重構後中性蛋白酶原液係175 DMC U/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成20 µl等分試樣且儲存在-20℃下。
將DNA酶I (Roche, Switzerland, 03724751)重構於1 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係4 KU/小瓶。因此，在重構後DNA酶原液係4 KU/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成250 µl等分試樣且儲存在-20℃下。
解凍GMP碎解雞尾酒的3個組分且製備工作GMP碎解雞尾酒如下：添加10.2 µl的中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3 µl的膠原酶AF-1 (1.2 PZ/ml)及250 µl的DNA酶I (200 U/ml)至4.7 ml的無菌HBSS。將碎解雞尾酒直接放入C試管。腫瘤處理及碎解
在GentleMACS OctoDissociator中，將4至6 mm腫瘤片段轉移至各GentleMACS C試管(C試管)於5 ml如上所示之碎解雞尾酒。額外腫瘤片段使用額外的GentleMACS C試管。
將各C試管轉移至GentleMACS OctoDissociator。根據下表61所列之各別腫瘤組織學設定解離器之適當程式進行碎解。解離為大約一小時。
碎解後，將C試管自Octodissociator或轉子移出且放在BSC中。使用25-mL血清移液管自各C試管移出碎解物且使主體碎解物通過70-µm細胞過濾器進入50-mL錐形管中。
注意：不要讓碎解物因為移液器的壓力噴濺。將溶液輕輕倒至70-µm細胞過濾器。避免移液管尖碰觸過濾器。
未經碎解之腫瘤部分無法通過過濾器。使用額外10 mL的HBSS洗滌C試管且使洗滌液通過細胞過濾器。使用HBSS將50-mL錐形管補足至50 mL。
將碎解物在RT下以400 x G離心5分鐘(全速加速及全速煞車)。
將錐形管轉移至BSC且抽吸或傾析上清液。將團塊重懸於5 mL之熱CM1+6000 IU/mL IL-2中且上下吸放5至6次。未稀釋下在NC-200上實施2次細胞計數。
保留0.5至1 mL的碎解物作為主體對照且冷凍保存2 x 500 µl等分試樣的碎解物進行腫瘤反應性測定。將碎解物保持在冰上。
注意：一觀察到冰水漿液應盡速以碎冰或冰塊置換。
將剩餘細胞相等分布以進行抗PD1 -PE (Clone# EH12.2H7)及尼沃魯單抗染色程序。使用抗 PD1-PE (Clone# EH12.2H7) 染色之腫瘤碎解物流動式細胞測量術及細胞分選
前半的腫瘤碎解物係使用抗PD1-PE染色。使用尼沃魯單抗染色之腫瘤碎解物流動式細胞測量術及細胞分選
在第二部分，移出約1e5個用於未經染色之陰性對照組、PE及FITC單一顏色補償對照之細胞至經標示之15-mL錐形管中。剩餘腫瘤碎解物將使用尼沃魯單抗及抗IgG4-PE(尼沃魯單抗之二級抗體)染色。
製備分選緩衝劑(2% FBS)：自新鮮500 mL HBSS瓶抽出2 ml的HBSS且添加10 ml的FBS。將分選緩衝劑保持在冰中直到進一步使用。
製備工作尼沃魯單抗溶液：為了製備工作溶液，藉由添加10-µl之尼沃魯單抗[10 mg/mL]至990-µl之分選緩衝劑來實施1:100稀釋。製備中間 1:50 IgG4 稀釋液：
添加10 uL之抗IgG4-PE至490 uL之分選緩衝劑於微量離心管中且溫和渦流5秒鐘以徹底混合。將中間稀釋液放在冰上直到進一步使用。製備用於流動式分選之腫瘤碎解物樣本：
使用上述之細胞計數資料，計算腫瘤碎解物試管中剩餘之細胞數量。
添加10 mL之HBSS至碎解物且在RT下以400 x G離心5分鐘(全速加速及全速煞車)。
將錐形管轉移至BSC且傾析上清液。計算體積(參考表#之TVC濃度、重懸分選緩衝劑體積、尼沃魯單抗體積)以使用分選緩衝劑重懸細胞為10e6個細胞/mL。
每1ml的細胞添加10-µL之工作尼沃魯單抗。
使用1-mL微量移液器輕輕混合碎解物且在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。在培育期間每10分鐘藉由輕彈攪動以確保徹底染色。
在培育後，添加10 mL之分選緩衝劑至樣本碎解物、單一顏色補償及未經染色之陰性對照組。
在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
輕柔傾析樣本。
將團塊重懸於400-µL之分選緩衝劑中且使用血清移液管測量樣本的總體積。每100 µl添加3-µL之抗CD3-FITC且每500 µl添加50µL中間稀釋之抗IgG4-PE(見第9.5.3節)。
使用1-mL微量移液器輕輕混合碎解物且在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。在培育期間每10分鐘藉由輕彈攪動以確保徹底染色。
在培育後，添加10-mL之分選緩衝劑至樣本碎解物。
使樣本碎解物過濾通過70-µm細胞過濾器進入經標示之50-mL錐形管中。
在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
將細胞以至多10e6個細胞/mL重懸於分選緩衝劑中。最小體積係300-µl且轉移至新的15 mL錐形管。
將試管儲存在冰上，在進一步使用前以鋁箔覆蓋。製備單一顏色補償：
PE補償對照係使用尼沃魯單抗加上抗IgG4-PE二級染色，且FITC補償對照將使用抗CD3-FITC染色。
添加10 mL之HBSS至未經染色、PE及FITC補償試管且在RT下以400 x G離心5分鐘(全速加速及全速煞車)。未經染色試管：
將細胞重懸於500 µL之分選緩衝劑中且儲存在冰中直到其他樣本準備好進行分選。FITC 補償試管：
將細胞重懸於100 µL之分選緩衝劑中。
每100-µL添加3-µL之抗CD3-FITC。
使用1-mL微量移液器輕輕混合碎解物且在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間以鋁箔覆蓋冰桶避光。
在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
將細胞重懸於500 µl之分選緩衝劑中且儲存在冰中直到其他樣本準備好進行分選，在進一步使用前以鋁箔覆蓋。PE 補償試管：
將錐形管轉移至BSC且傾析上清液。將細胞重懸於1 mL之分選緩衝劑中。
每1ml的細胞添加10-µL之工作尼沃魯單抗。
在培育後，添加10 mL之分選緩衝劑。在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
輕柔輕析樣本且將團塊重懸於500 µL之分選緩衝劑中且使用血清移液管測量樣本的總體積。每500 µL之細胞添加50 µL中間稀釋之抗IgG4-PE(見第9.5.3節)。
使用1-mL微量移液器輕輕混合碎解物且在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。
在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
將細胞重懸於500 µl之分選緩衝劑中且儲存在冰中直到其他樣本準備好進行分選，在進一步使用前以鋁箔覆蓋。製備收集管：
準備用於經分選之族群之15-mL收集管。將2-mL之收集緩衝劑(含有50% hAB血清之50% HBSS)放入試管中。將收集管儲存在冰上直到進一步使用。細胞計數及存活性評估
使用Chemometec NC-200細胞計數器獲得細胞及存活性計數之程序在本文中描述。使用 Sony FX500 之 FACS 分選
流動式細胞測量術分選來自用於分選程序及維持之腫瘤碎解物之經PD1選擇之TIL。PD1 快速擴增規程 - 完整規模 REP 第 0 天 (REP-1) 培養基製備
製備1 L之CM1+6000 IU/mL IL-2於37℃培育箱中至少24 h。
PBMC
餵養細胞製備及
TIL
接種
TIL
進行
REP-1
實例9提供關於起始完整規模第0天(REP-1)之指示，但有下列例外：
得自兩個分選之經PD1選擇之TIL的最低數量將被用來作為添加至PD1-A及PD1-B兩種條件之經PD1選擇之TIL的數量。計算各別分選之體積以在PD1-A及PD1-B兩種條件中達成該數量。將TIL體積轉移至彼等各別之G-Rex 100M培養瓶中。PD1 快速擴增規程 - 小規模 REP 第 0 天 (REP-1) 培養基製備
製備及預熱1 L之CM1+6000 IU/mL IL-2於37℃培育箱中至少24 h。PBMC 餵養細胞製備
解凍適當數量的小瓶以進行REP-1(將需要每培養瓶10e6個PBMC；假設每1 mL小瓶60e6至80e6個PBMC)。
將40 mL之熱CM1+6000 IU/mL IL-2放入50 mL錐形管中且將1 mL PBMC餵養細胞小瓶移液至錐形管中。
上下吸放經解凍之PBMC餵養細胞以徹底混合且在NC-200上實施2次細胞計數。
計算及轉移所需體積以將10e6個PBMC轉移至G-Rex 10M。
添加3-µL之aCD3 (OKT-3)至G-Rex 10M。將培養瓶放入培育箱中。接種 TIL 以進行 REP-1
計算10%之最低PD1分選結果且計算各別分選之體積以在PD1-A及PD1-B兩種條件中達成該數量。將TIL體積轉移至彼等各別之G-Rex 10M培養瓶中。
在主體TIL對照條件中，添加與PD1細胞相等數量之CD3+細胞。為了獲得適當體積之碎解物，遵照以下步驟：
藉由將所獲得之碎解物TVC乘以獲自最低分選報告之活細胞的CD3+ %來計算碎解物中之CD3+ TVC/mL(即，10e6*10%=1e6)。
在獲得此數字後，將所使用之PD1細胞數量除以此數字(即，1e5/1e6=0.1 mL)。
將此體積(0.1 mL)之碎解物添加至主體TIL培養瓶，且使用CM1+6000 IU/mL IL-2填充至100 mL。
將所有培養瓶放入37℃、5% CO2培育箱中9.10。PD1快速擴增規程-完整規模第11、16及22天
按照製造批次記錄，遵照完整規模過程。主體TIL條件的處理類似於實例9所述之步驟。接受標準
下表63指明用於評估小規模(外推TVC)及完整規模實驗表現的接受標準。
下表64指明所實施之額外最終產物鑑定測試。
實例 17 參考文獻
實例 6 及 7
，直接離體選擇及擴增PD1+細胞：增強用於ACT療法之腫瘤反應性TIL之過程。
實例 9
，選擇及擴增用於完整規模製造之PD1+
TIL。
實例 10
，選擇及擴增用於完整規模製造之PD1high
TIL。
實例18：腫瘤碎解物中之PD-1表現性細胞目的
為了評估程序性細胞死亡蛋白質1 (PD-1)於全腫瘤碎解物中之表現。範疇
評估來自下列腫瘤組織學之全腫瘤碎解物的PD-1表現：黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌(OC)、三陰性乳癌(TNBC)、前列腺癌(PC)及結直腸癌(CRC)。背景資訊
PD-1係多面向的表型標誌，其與活化、抗原特異性及耗竭相關。其在活化時被快速誘導且在慢性疾病環境(包括癌症)中維持在經歷抗原細胞(antigen-experienced cell)上[1, 2]。在分子上，PD-1係調節性細胞表面受體之CD28家族成員且表現在慢性活化之T細胞、NKT細胞、B細胞及單核球上[3-5]。與其配體PD-L1及PD-L2結合誘導傳訊級聯，導致降低T細胞的活化、增生、生存及細胞介素產生[6]。
儘管PD-1的免疫抑制性角色，PD-1表現性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之存在與HNSCC及NSCLC中之較佳臨床結果相關，暗示這些TIL可能涉及控制腫瘤進展[7-9]。
黑色素瘤及NSCLC之研究顯示大部分腫瘤反應性TIL包含在PD-1+
T細胞子集內[4, 8, 10]。
基於PD-1+
TIL係新抗原/腫瘤特異性淋巴細胞之概念，Iovance正在發展一種新穎的經PD-1選擇之TIL產物LN-145-S1，其富含直接自全腫瘤碎解物分選之PD-1+
TIL。
雖然PD-1表現為抗PD-1療法之反應所需，但光是PD-1表現無法預測對療法的反應性。舉例來說，PD-1係存在於OC之TIL上且其表現與生存有關[11]。然而，最近OC的臨床試驗顯示抗PD-L1藥物艾維路單抗(Avelumab)與化學療法之組合無法增強無進展存活[12]。在腫瘤微環境表現PD-1+
之本研究連同許多對抗PD-1療法具有抗藥性之病患顯示活體內阻斷PD-1/PD-L1軸不足以控制大部分癌症。
使用TIL之過繼性T細胞療法在對抗PD-1呈現難治性之黑色素瘤病患中顯示顯著療效，表示用於離體擴增TIL之規程而非活體內PD-1阻斷能夠重新賦活TIL [13]。
在此實例中，在離體擴增之前分選PD-1+
TIL就進一步在所有PD-1+
癌症組織學中改善TIL療法之反應率方面檢查。
本研究之目的在於調查多個腫瘤組織學中PD-1+
TIL之存在以支持臨床上利用經擴增之TIL產物靶向該等腫瘤組織學。
實驗設計
藉由流動式細胞測量術評估來自多個腫瘤組織學之腫瘤碎解物的PD-1表現。
材料
在此研究中使用之腫瘤碎解物係描述於表65。縮寫：CRC，結直腸癌；HNSCC，頭頸鱗狀細胞癌；MSI，微小衛星體不穩定性；MSS，微小衛星體穩定性；ND-PBL，正常供體周邊血液淋巴細胞；NSCLC，非小細胞肺癌；OC，卵巢癌；PD-1，程序性細胞死亡蛋白質1；REP，快速擴增規程；TIL，腫瘤浸潤性T細胞；及TNBC，三陰性乳癌。
方法 腫瘤處理
將重量0.2g至1.5g之組織樣本部分分割成4至6-mm片段且碎解成包含腫瘤、基質及免疫細胞之單一細胞懸浮液。使用包括DNA酶(500 IU/ml)、玻璃酸酶(1 mg/ml)及膠原酶IV (10 ng/ml)之三重酶催化性雞尾酒在37℃下在輕柔攪動下碎解組織1小時。PD-1 染色
全腫瘤碎解物根據下表染色。細胞以100µl/1e6個細胞染色。
D-1 選擇及圈選策略
將經染色之細胞放在FX500細胞分選器(SONY, New-York)或ZE5細胞分析儀(BioRad, CA)上且基於下列圈選策略分析。首先，單一細胞係基於前向及後向或側向散射光識別。接下來，活細胞係基於負向/低7-AAD或活-死藍色螢光圈選。TIL係使用CD3識別。PD-1細胞係使用正常供體周邊血液(ND-PBL)作為對照組識別。PD-1之選擇圈選係放在ND-PBL中之PD-1表現基線之上。資料分析係利用FlowJo v8.1軟體(FlowJo LLC, OR)實施。結果使用GraphPad v8作圖。結果 腫瘤碎解物中之 PD-1 表現
為了識別哪些組織學係適合進行PD-1選擇之候選物，使用流動式細胞測量術評估來自數種癌症組織學之多個腫瘤樣本的PD-1表現。根據程序TMP-18-015(縮寫於第5.2節)，總共測試4個黑色素瘤、7個NSCLC、5個HNSCC、3個OC、5個TNBC、2個PC及8個CRC。CRC係由微小衛星體穩定性(MSS) (n=6)及微小衛星體不穩定性(MSI) (n=2)兩種腫瘤構成。在碎解後，一部分所得之單一細胞懸浮液進行PD-1染色，進行流動式分析，且若可得到＞5e6個細胞時，分選以獲得PD-1+
細胞。使經PD-1分選之細胞進行二步驟過程，該二步驟過程包括11天活化步驟及隨後11天快速擴增規程(REP)，以獲得經PD-1選擇之TIL。腫瘤ID、組織學及實驗結果係列出於表65。流動式分析之結果係顯示於圖157。
所有經測定之腫瘤碎解物表現在CD3族群內某百分比之PD-1+
細胞。PD-1%係可變且在所測定之組織學中的範圍自11%至78%，平均為35%。黑色素瘤(n=4)及PC(n=2)產生最低平均值的PD-1表現，分別為30.1%及25.8%。PD-1表現之平均百分比與該些組織學所觀察到的臨床反應率無相關。對於抗PD-1阻斷有反應之組織學諸如黑色素瘤及NSCLC比起對於抗PD-1阻斷無反應之組織學(即OC及PC)不具有較高量/表現的PD-1。
經PD-1選擇之產物可在所有可起始培養之情況中經活體外擴增PD1+
細胞而獲得(表1)。本研究之結果於文件實例13中報告。因此，基於PD-1的表現，所有經測定之組織學係適合進行PD-1選擇之潛在候選物。
結論
在所有經測定之腫瘤碎解物中，PD-1係表現於CD3細胞上。
PD-1表現有廣泛的腫瘤內及腫瘤間變異性。
PD-1表現與組織學是否顯示對於抗PD-1療法之反應性無相關。
實例18參考文獻
實例19：使用尼沃魯單抗藉由流動式細胞測量術分選選擇PD-1+
TIL及以完整規模擴增以進行臨床製造
目的
此報告描述經PD-1選擇之TIL擴增之結果，其中使用尼沃魯單抗在本實例所述之完整規模製造實驗中進行選擇。
範疇
研究範疇在於擴增來自黑色素瘤或肺部或頭頸或卵巢腫瘤之經PD-1選擇之TIL。
在第0天，將腫瘤碎解物相等分布至二組，且實驗各組中之腫瘤碎解物係使用尼沃魯單抗或抗PD1選殖株# EH12.2H7(研究等級)作為一級抗體及經FITC接合之抗IgG4二級抗體染色。接著藉由流動式分選來選擇來自經染色族群之PD-1表現性TIL。使用二步驟擴增過程擴增經PD-1選擇之TIL以用於完整規模臨床製造。擴增的第一步驟(「活化」)係自第0天至11天進行。擴增過程之第二步驟(「快速擴增期」或「REP」，包括第16天分瓶)係自第11天至第22天進行。最終產物在第22天收集。
以小規模過程(1/100規模)而言，活化係使用10%之具有最低分選結果之經PD1選擇之TIL而於第0天起始，並將該數量之來自各分選之TIL轉移至含有餵養細胞及OKT-3及IL-2培養基之各別G-Rex-10M培養瓶中。REP、分瓶及收集係按照TP-19-004起始。相關時間點之簡短解釋概述於以下方法章節(表67)。
以完整規模過程而言，活化係於第0天起始且使用類似細胞數量之經PD-1選擇之TIL與100e6個同種異體餵養細胞及30 ng/mL OKT3達11天。REP係於第11天自收集產物起始。REP(第11天)及後續的第16天(分瓶)及第22天(收集)過程係按照IOVA製造批次記錄實施。相關時間點之簡短解釋概述於以下實驗設計(表2)。
評估經擴增之最終產物TIL的細胞生長、存活性、表型及功能(經刺激後之IFN-γ及顆粒溶解酶B分泌、CD107a移動)。
對擴大鑑定資料實施額外分析以建立EH12.2H7及尼沃魯單抗之等效物。
背景資訊
一種先前發展之設計來使用經PE接合之抗PD-1抗體(Clone# EH12.2H7)自腫瘤碎解物選擇PD-1表現性TIL以富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物的規程係於實例9及實例21提供。
在目前的研究中，調整實例9及實例21以使用尼沃魯單抗而非經PE接合之clone# EH12.2H7作為抗PD1抗體且使用經FITC接合之抗IgG4抗體作為二級染色抗體來獲得經PD1選擇之TIL。
實驗設計
按照TP-19-004進行二個小規模實驗及主體對照條件。
按照實例19進行一個完整規模的實驗。
小規模及完整規模之概覽提供於表67及68。
結果
下表69指明用於評估按照實例19之小規模(外推TVC)及完整規模實驗表現的接受標準。
達成的結果
下表70列出本研究所使用之腫瘤及相關組織學。
流動式分選輸出
所有三個腫瘤的分選後純度(PD-1+%)符合＞ 80%之標準。
活化及REP收集輸出
下表72總結來自二個小完整規模及一個完整規模實驗以及彼等之主體對應體(在括弧中註明)之總存活細胞計數及產物屬性。
過程產率：在活化結束時，使用尼沃魯單抗或EH12染色選擇之TIL產生高於100e6之細胞數量(＞1200擴增倍數，平均9.1次細胞倍增)，具有可起始REP培養之足夠產率。
在REP收集時，所有培養產生＞ 80e9個TVC。在第11天至第22天之間觀察到平均9次細胞倍增。細胞倍增次數與先前臨床前實驗(TP-19-004R及實例21R)觀察到的結果非常類似。
劑量：從完整規模運行(H3046)，使用尼沃魯單抗染色之最終產物劑量係88.5e9個TVC且具有85%存活性及99.7% CD45+CD3+細胞。最終產物係經高度富集之TIL產物。
功能：TIL之功能性係基於使用aCD3/ aCD28/aCD137 Dynabeads隔夜刺激最終產物來鑑定(LAB-016)。刺激24小時後收集上清液且冷凍。實施ELISA以測定釋放至上清液中之IFNγ及顆粒溶解酶B之濃度。IFNγ釋放符合接受標準，且所有TIL培養經刺激後分泌高量的顆粒溶解酶B。與先前研究(TP-19-004R，實例21)所產製之TIL產物類似，來自最終產物高比例之TIL當以PMA/IO刺激時表現CD107A(CD4+及CD8+ TIL兩者皆然)。
TIL 端粒長度及端粒酶活性：
資料等待中。當資料可得時，將修改報告以包括此資料。
TIL 殖株性：
資料等待中。當資料可得時，將修改報告以包括此資料。
擴大表型分析：
表73、74、75描述TIL之擴大表型分析。多色流動式細胞測量術係用於鑑定REP TIL之TIL純度、鑑別性、記憶子集、活化及耗竭狀態。＜ 1%可偵測的B細胞、單核球或NK細胞存在於最終收集的TIL(表7)。REP TIL大多是由主要效應記憶分化之TCRα□β組成。尼沃魯單抗與EH12.2H7之間的CD8/CD4比例係可相比的，但卵巢腫瘤例外。CD8/CD4比例的偏離可能是因為卵巢腫瘤類型的異質性及選擇程序中缺乏CD4及CD8的選擇標誌。
由於TIL的TCR刺激增生，所有經PD-1選擇之TIL條件顯示CD28表現上調及CD27表現下調。此外，所有經PD-1選擇之TIL顯示較低分化表型且具有較低的KLRG1表現。
CD27、CD28、CD56、CD57、BTLA、CD25及CD69的量與使用第2代製程產製之黑色素瘤TIL的結果類似(表74)。
尼沃魯單抗與EH12.2H7選擇程序之間就分化、活化及耗竭狀態而言無明顯差異。
對表型鑑定資料進行額外分析以建立EH12.2H7及尼沃魯單抗之等效物。
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製經PD-1選擇之TIL所獲得PD-1+
TIL係藉由流動式細胞測量術評估CD4、CD8、CCR7、CD45RA及PD-1的表現。使用尼沃魯單抗及EH12.2H7所衍生之經PD-1選擇者在CD4及CD8的表現上未觀察到顯著差異。以三個經測定之腫瘤而言，兩種TIL產物產生相對於CD4+
T細胞較高比例的CD8+
T細胞(圖1)。在三個經PD-1選擇之TIL產物中CD4及CD8表現之類似性暗示使用尼沃魯單抗選擇PD-1+相較於EH12.2H7不改變CD4/CD8的比例。見圖159。
如同T細胞譜系，TIL的記憶狀態在使用EH12.2H7及尼沃魯單抗所產製之經PD-1選擇之TIL中類似。TIL族群主要是由效應記憶T細胞構成。使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL與Iovance之LN-145研究性產品相似，暗示使用任一抗PD-1選殖株選擇PD-1不使TIL之記憶表型偏離(圖160)。
為了評估PD-1表現是否在培養後類似地減少，在擴增前及後評估使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL。在分選後，兩種經新鮮分選之TIL製劑中之PD-1+TIL的百分比接近100%(表71)。在使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製之經PD-1選擇者中，PD-1表現在擴增後顯著且可相比地減少(圖161)。如預期般，在擴增後PD-1表現的減少暗示在使用EH12.2H7及尼沃魯單抗之PD-1+分選TIL中的先前高PD-1表現者大多隨著擴增回復成PD-1-。
由經EH12.2H7及尼沃魯單抗分選之PD-1+ TIL所產製之經PD-1選擇之TIL的功能鑑定
為了評估使用尼沃魯單抗衍生之經擴增之PD-1+ TIL就功能方面是否類似於使用EH12.2H7選殖株衍生之TIL，將來自3個腫瘤之經PD1選擇之TIL使用非特異性αCD3/αCD28/α41BB活化珠刺激且評估IFNγ及顆粒溶解酶B分泌。尼沃魯單抗及EH12.2H7衍生之經PD-1選擇之TIL因應刺激產生類似量的IFNγ及顆粒溶解酶B(圖161)。使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL因應非特異性刺激(αCD3/αCD28/αCD137珠)分泌可觀量的IFNγ及顆粒溶解酶B，暗示經選擇之TIL在擴增後具高度功能性。
資訊
在第0天，由於後勤問題，無法收到本實例之新鮮腫瘤。所有實驗使用經冷凍之腫瘤碎解物而非新鮮腫瘤進行。研究性試驗之資料暗示當測試新鮮或冷凍腫瘤時，PD-1的表現並無差異。
結論及建議
發展完整規模的經PD-1選擇之TIL過程以在22天將PD-1+ TIL擴增至＞ 80 e9。以發展規模製造的所有六批(尼沃魯單抗及EH12兩種染色方法，2個完整規模及4個小規模)符合放行參數之接受標準。
整體而言，此實例顯示自使用尼沃魯單抗分選PD-1 TIL所產製之經PD-1選擇之TIL與使用EH12.2H7選殖株所產製之TIL係可相比的，藉此支持在臨床製造上使用尼沃魯單抗進行PD-1選擇。亦見圖162、163及164。
實例20：PD-1非臨床研究概覽
非臨床概覽
介紹
在此實例中描述之TIL係一種基於程序性細胞死亡蛋白質-1 (PD-1)生物標記之表現而進行選擇之自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之製劑。因此，該等TIL係經選擇具有較高PD-1表現之TIL細胞以進行離體擴增之子集。在實例各處描述之製程提供一種製造方法，其中將PD-1陽性(PD-1+
) T細胞在進行彼等之離體擴增之前使用流動式細胞測量術自主體TIL族群選擇。所得之TIL經鑑定且在以下總結之離體研究中顯示活性。此TIL可使用如實例及本申請案所述之用於過繼性細胞轉移(ACT)之TIL方案向病患投予。
本實例總結非臨床資料以支持將探討TIL於頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)病患之安全性及初步療效的第2期臨床試驗。TIL產物具有病患特異性且無法跨物種作用，因此無法在傳統非臨床藥理學、藥物動力學及毒物學研究中測試。其他將被包括於TIL治療方案之藥劑(IL-2、環磷醯胺及氟達拉濱)的非臨床及臨床安全性已廣為表徵。
由Iovance所進行以支持經擴增之TIL產物的臨床探討之非臨床研究係列於表78。這些研究的報告提供於以上實例中。
在離體擴增之前的TIL製程中選擇PD-1+
TIL應富集新抗原特異性T細胞，同時保存TIL多樣性且因此展現辨識各種腫瘤新抗原之潛力。此策略代表一種有吸引力的進一步最佳化TIL製程治療用途之手段。基於以下概述之非臨床研究，發展一種可靠地產製高度功能性經PD-1選擇之TIL產物的製程。
將檢查經PD-1選擇之TIL產物用於治療復發/難治性HNSCC，已針對這種難以治療的惡性病在PD-1+
細胞的量與臨床結果之間的相關性方面實施研究(Badoual et al., 2013)。
非臨床研究
經PD-1選擇之TIL產物的組成及離體抗腫瘤活性已受到廣泛表徵。在這些分析之前進行多個腫瘤類型之浸潤性PD-1+
T細胞的調查及經分選之PD-1+
TIL擴增過程的測試。所有非臨床研究的實施皆使用研究級PD-1特異性單株抗體(選殖株EH12.2H7)以進行PD-1+
TIL的偵測及選擇。因此，進行銜接性研究以建立EH12.2H7與將用於產生TIL產物之抗PD-1單株抗體尼沃魯單抗(見實例19)之可相比性。整體而言，此工作顯示經PD-1選擇之TIL係自多種腫瘤組織學製備，且彼等在表型上類似未經選擇之TIL；且彼等顯示許多與新抗原特異性相關之特性，包括起初減少之增生能力及重要的腫瘤反應性。
PD-1+
TIL在多個癌症類型中之盛行率(報告編號實例18)
PD-1+
淋巴細胞的存在係於來自數種癌症組織學之多個腫瘤樣本中評估。總共評估34個具有下列組織學之腫瘤：黑色素瘤(n=4)、非小細胞癌(NSCLC)(n=7)、頭及HNSCC (n=5)、OC (n=3)、TNBC (n=4)、PC (n=2)及CRC (n=8)。CRC樣品包括微小衛星體穩定性(MSS)腫瘤(n=6)及微小衛星體不穩定性(MSI)腫瘤(n=2)兩者。
腫瘤樣本使用酶催化性碎解解離，且將一部分所得之單細胞懸浮液進行PD-1染色且藉由流動式細胞測量術分析。流動式分析研究的結果概述於圖165。
所有經測定之腫瘤碎解物在CD3+
細胞族群內含有可觀部分之PD-1+
細胞。PD-1+
細胞之百分比係可變且在所測定之組織學中的範圍自11%至78%，平均為35%。黑色素瘤(n=4)及PC(n=2)產生最低平均值的PD-1表現，分別為27%及21%。顯示臨床上對於抗PD-1阻斷有反應之組織學(諸如黑色素瘤及NSCLC)比起其他組織學(即OC及PC)不具有較高量/表現的PD1。
重要的是，經PD-1選擇之產物可在所有在分選之前有大於2 x 106
個細胞的情況中經離體擴增PD-1+
細胞而獲得，在13個檢查的組織學之腫瘤樣本中12個達成該條件。本研究之結果於實例13中討論。因此，基於TIL的PD-1表現，所有經測定之組織學係適用於製備TIL產物之潛在候選物。
經PD-1選擇之TIL的增生能力(實例13)
已顯示PD-1+細胞具有經損害之細胞介素產生及經減少之增生[3, 4]。活體內阻斷PD-1或其配體PD-L1可恢復該些細胞觸發抗腫瘤反應的功能性(Schmacher et al., 2015, Shang et al, 2018)。我們測試在PD-1+
細胞中觀察到的缺陷是否可藉由將細胞移出免疫抑制微環境且在抗CD3及同種異體餵養細胞存在下離體擴增該細胞而逆轉，如數個出版物所述(Inozume et al., 2010; Thommen et al., 2018)。
為了判定經PD-1選擇之TIL是否可離體擴增成高數量，使來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之腫瘤樣本之經PD-1分選之TIL進行由二步驟規程所組成之過程(該二步驟規程由11天活化步驟及隨後的11天快速擴增規程(REP)所組成)且評估擴增倍數。使用在類似條件下自全腫瘤碎解物擴增之相匹配的未經選擇之TIL作為對照。
經PD-1選擇之TIL的增生能力起初相較於未經選擇之TIL減少，導致活化步驟中較低量的擴增。經PD-1選擇之TIL在活化步驟中的平均擴增倍數係833，相較之下未經選擇之TIL係2650。然而，在REP步驟中計算經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL分別為1308及1418之可相比的平均擴增倍數(圖166)。
在經PD-1選擇之TIL的活化步驟中之延遲擴增導致13個成對樣本中之9個較低的總存活細胞產率(表表79)。由於REP係以小規模進行，因此製造規模可達成之細胞計數係基於REP中之擴增倍數及活化步驟中之總細胞產率估計(即，外推細胞計數=REP擴增倍數*活化總存活產率)。重要的是，這些外推數量可能低估潛在總產率，因為PD-1分選僅使用一部分的細胞碎解物。
經PD-1選擇之TIL的外推細胞產率範圍介於2.32 x 107
至209 x 109
之間，平均細胞產率為47.46 x 109
個細胞。重要的是，自經PD-1選擇之TIL擴增之13個培養中的12個在REP之後產生的總細胞數係在LN-145研究性產品所指明的範圍內(1 x 109
至150 x 109
個總存活細胞)。
總結來說，在活化步驟期間減少PD-1+
TIL之增生能力不防止經PD-1選擇之TIL產物在最終產物達到高細胞計數。事實上，使用意圖之擴增TIL產物的製程在13個製劑中之12個產生＞ 1 x 109
個總存活細胞。這些產率在該些經指明之標準LN-145研究性產品的放行範圍內。
經PD-1選擇之TIL的表型鑑定(實例16)
藉由流動式細胞測量術進行表型分析以鑑定T細胞譜系及記憶子集之細胞表面標誌的表現。此外，評估經PD-1選擇之TIL中之PD-1的量。將來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC腫瘤樣本之13個相匹配的經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物的相同樣本組使用活/死標誌染色，隨後以抗體染色多個標誌。CD4、CD8、CCR7、CD45RA及PD-1之結果係呈現於圖167、168及169。關於額外活化、耗竭、分化及組織駐留標誌的更詳細結果可見完整報告實例16。經 PD-1 選擇之 TIL 中之 CD4 及 CD8 表現
PD-1大多表現在CD8+
T細胞中，儘管其表現於CD4+
及CD8+
兩種譜系中(Ahmadzadeh et al., 2009; Inozume et al., 2010)。為了判定選擇及擴增PD-1+
細胞是否改變CD4+
及CD8+
細胞的比例，評估最終經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物的CD4及CD8之細胞表面表現。
CD4及CD8在經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物中的表現並無顯著差異(167)。不同樣本及組織學之間的CD4+
及CD8+
T細胞比例係可變的(報告實例16)，但整體而言，兩種TIL產物產生較高比例的CD4+
T細胞相對於CD8+
T細胞。
多個經PD-1選擇及相匹配的未經選擇之TIL產物之間之CD4及CD8表現的類似性暗示分選PD-1不改變最終擴增產物之T細胞譜系。經 PD-1 選擇之 TIL 及未經選擇之 TIL 中的記憶 T 細胞族群
發表的研究顯示PD-1+
TIL大多包含效應記憶T細胞(TEM) (Fernandez-Poma et al., 2017; Kansy et al., 2017)。另外，已顯示這些TEM代表顯示臨床活性之未經選擇之TIL產物的主要族群(Gros et al., 2014)。T細胞記憶子集一般使用下列標誌區別：
‧ 效應記憶T細胞(TEM)：CD45RA-
及CCR7-
；
‧ 中央記憶T細胞(TCM)：CD45RA-
及CCR7+
；
‧ 初始/幹細胞記憶T細胞(TSCM)：CD45RA+
及CCR7+
；及
‧ 效應T細胞(TEMRA)：CD45RA+
及CCR7-
(Golubovskaya and Wu, 2016)。
為了判定經PD-1選擇之TIL是否大多包含TEM，評估衍生自12個獨特腫瘤樣本之經PD-1選擇及相匹配的未經選擇之TIL產物的CD45RA及CCR7表現以定義如上所示之個別記憶子集。
經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物係由類似比例的各種記憶T細胞子集構成，其中TEM細胞代表各產物內的大部分細胞(圖168)。
有鑑於與記憶相關之表型標誌的類似表現，在擴增之前選擇PD-1似乎不改變TIL產物中記憶T細胞子集之相對比例。重要的是，經PD-1選擇之TIL的記憶T細胞子集輪廓與LN-145密切相似。經 PD-1 選擇及未經選擇之 TIL 中之 PD-1 表現
經擴增之PD-1+
TIL中之PD-1表現已顯示隨著離體培養及擴增而降低，其被認為是TIL重新賦活之跡象(Inozume et al., 2010; Thommen et al., 2018)。
為了判定PD-1表現是否隨著擴增改變，分析衍生自12個獨特腫瘤樣本之經PD-1選擇及相匹配的未經選擇之TIL產物在擴增之前及擴增後的PD-1表現。
未經選擇之TIL在擴增之前的PD-1+
細胞百分比代表全腫瘤碎解物中的PD-1表現性細胞族群(平均37.3%)。如預期的，分選PD-1+
細胞導致高純度的PD-1+
族群，其中平均分選純度為92.8%。在擴增後，經PD-1選擇及未經選擇之兩種TIL產物的PD-1表現相對於擴增前PD-1的量顯著減少。在經PD-1選擇及未經選擇之兩種TIL製劑中觀察到PD-1+
細胞的比例減少大於3倍(圖169)。
亦評估經PD-1選擇及未經選擇之TIL額外與耗竭相關之共抑制性受體的表現。經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL表現類似量的TIM3、LAG3及CD101(實例16)。
在原位表現高量的PD-1之TIL中之PD-1表現的顯著減少，暗示這些細胞隨著擴增回復成PD-1-
T細胞，且因此較不可能在輸注後經由PD-1/PD-L1軸來抑制。
總結來說，經PD-1選擇之TIL的表型分析顯示大多由低PD-1表現之TEM細胞構成的產物，暗示這些細胞在離體擴增後重新賦活。
經PD-1選擇之TIL的TCR貯庫(實例11)
一項NSCLC的研究探討稱為PD-1T
(「腫瘤相關PD-1」，即超過在健康供體之PBMC所觀察到之PD-1的量)之PD-1表現性TIL選殖株是否與PD-1-
TIL共享。雖然可觀察到選殖株的一些重疊，但在PD-1T
TIL中的主要TCR不存在於PD-1-
子集(Thommen et al., 2018)。在PD-1T
及PD-1-
TIL中TCRvβ選殖株之低度殖株類型共享暗示離體產製之產物含有具有獨特抗原特異性之TCR。
預期在TIL的離體擴增相之前實施的PD-1選擇步驟導致富含腫瘤特異性T細胞之TIL產物。為了判定擴增經PD-1分選之TIL是否產製獨特產物，比較經PD-1選擇及未經選擇之TIL的TCRvβ組成物。為達此目的，評估存在於經PD-1選擇之TIL產物中的前10個TCRvβ選殖株在對應之相匹配的未經選擇之TIL產物中的代表性。
在所有成對TIL產物中，大部分具高度代表性之經PD-1選擇之TIL選殖株在相匹配的未經選擇之產物中以大幅減少的量存在或無法被偵測到(圖170)。
經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL產物含有不同的高頻率TCR。因此，預期二種產物在T細胞反應性的離體測試中展現可測量的差異。
整體而言，我們的結果顯示PD-1選擇步驟如何改變經擴增之TIL產物的組成且暗示所得之經PD-1選擇之TIL可高度富含具有潛在腫瘤反應性之特定TCRvβ貯庫。
經PD-1選擇之TIL的增加腫瘤反應性(實例15)
小鼠及人的發表資料皆顯示在腫瘤內之T細胞上表現PD1可識別腫瘤反應性淋巴細胞貯庫，包括腫瘤新抗原特異性淋巴細胞(Donia et al., 2017; Fernandez-Poma et al., 2017; Gros et al., 2014; Inozume et al., 2010; Jing et al., 2017; Thommen et al., 2018)。在這些研究中，經離體擴增之經純化的PD-1+
TIL之腫瘤反應性係在與自體腫瘤細胞共培養後測試，且顯示PD1+
TIL相較於PD-1-
TIL分泌顯著較大量的IFNγ。
基於這些研究，選擇表現PD-1的TIL預期富集腫瘤/新抗原特異性T細胞，當在離體評估時其應顯示較高的自體腫瘤反應性。經 PD-1 選擇之 TIL 中之腫瘤反應性
為了評估TIL腫瘤反應性，IFNγ之釋放係在與自體腫瘤碎解物共培養後用ELISA測量。
在評估的10對經PD-1選擇及未經選擇之TIL產物(對應13個腫瘤樣本中係本摘要之焦點的5個，並補充5個最近獲得的樣本)中，7對在與自體腫瘤碎解物共培養後產生可偵測量的IFNγ。三對(2對卵巢及1對TNBC)在任何條件下經共培養後不產生IFNγ。在7個可評估之共培養中，經PD-1選擇之TIL比起彼等之未經選擇之對應體產生實質上較高量的IFNγ，平均超過4.57倍(1.22至11.65)([ 圖 171
)。在7個對應之經PD-1選擇之TIL中之5個，此增加的反應性係抗原特異性，如在HLA第I型阻斷時IFNγ產生減少所示。如圖所示，正值反映HLA特異性抗腫瘤反應，而空或負值反映非特異性反應。
因此，選擇PD-1表現性TIL導致富含腫瘤反應性T細胞之TIL產物。
在自體腫瘤存在下增強IFNγ產生暗示經PD‑1選擇之TIL當在ACT的環境中向病患投予時相對於未經選擇之TIL可能具有較高抗腫瘤效應的潛力。ACT之臨床療效與腫瘤特異性TIL之存在有直接相關。因此，經由PD-1選擇及擴增來富集腫瘤特異性TIL可增強TIL經投予病患後起始強力且有效的抗腫瘤效應之能力。自體腫瘤細胞殺滅
評估十個相匹配的經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL的自體腫瘤殺滅。腫瘤細胞裂解係藉由xCELLigence即時細胞分析測定來定量，其監測腫瘤細胞剝離作為腫瘤細胞死亡的衡量(Peper et al., 2014)。
在10個經評估之腫瘤中，只可評估1個黑色素瘤腫瘤的腫瘤細胞裂解，因為腫瘤細胞附著不良及低存活性。腫瘤細胞裂解係使用腫瘤細胞指數估計，其係將板阻抗作為細胞附著或剝離的衡量。如果細胞指數在共培養期間的任何時間下降至低於零，則無法計算該樣本的細胞裂解。在經測試之10個腫瘤中的9個，細胞指數下降至低於零，導致無法適當評估腫瘤細胞裂解。
在可評估之腫瘤中，經PD-1選擇之TIL相較於未經選擇之TIL展現較大殺滅自體腫瘤的能力，如細胞指數(一種當增加時反映細胞增生及降低時反映細胞剝離/死亡之參數)的較大下降及較高百分比之細胞裂解所判定(圖172)。
此分析之結果顯示經PD-1選擇之TIL當相較於彼等之未經選擇之對應體時具有較大殺滅自體腫瘤之能力。此結果與新鮮單離及經離體擴增之PD-1+
TIL相較於PD-1-
TIL皆具有優異抗腫瘤活性的發表報告一致(Gros et al., 2014; Inozume et al., 2010)。單離自NSCLC之PD-1+
TIL也有類似觀察，暗示該發現並非黑色素瘤特異性(Thommen et al., 2018)。
EH12.2H7及尼沃魯單抗用於選擇PD-1+
TIL的等效性(實例19)
為了建立等效性，比較衍生自使用研究(EH12.2H7)及GMP(尼沃魯單抗)抗PD-1單株抗體分選之PD-1+
的經PD-1選擇之TIL。三個腫瘤碎解物(1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC)係使用EH12.2H7或尼沃魯單抗染色以識別PD-1+
族群。經尼沃魯單抗及EH12.2H7分選之PD1+
細胞係使用二步驟過程擴增，該過程包括11天活化步驟及11天REP，總共22天。
整體而言，此工作顯示自使用尼沃魯單抗分選PD-1 TIL所產製之經PD-1選擇之TIL與使用EH12.2H7選殖株所產製之TIL係可相比的，藉此支持在製造經擴增之TIL產物研究性產品上使用尼沃魯單抗進行PD-1選擇。
使用尼沃魯單抗及EH12.2H7之經PD-1分選之TIL的離體擴增
為了判定使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL是否類似地增生，使來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之經PD-1分選之TIL進行11‑天活化步驟及隨後的11天REP且評估產率及擴增。
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗染色之腫瘤碎解物表現類似量的CD3+
PD-1+
細胞且在流動式細胞測量儀上似乎為無法區別之點狀圖(圖172及表79)。當比較二個TIL族群時，活化步驟及REP中之擴增倍數及總外推/實際細胞產率類似。
總結來說，EH12.2H7及尼沃魯單抗識別腫瘤碎解物中類似百分比之PD-1+
細胞。TIL擴增倍數及總外推細胞計數在三種經尼沃魯單抗及EH12.2H7染色之腫瘤樣本係可相比的。使用 EH12.2H7 及尼沃魯單抗進行 PD-1+ 分選所產製之經 PD-1 選擇之 TIL 的表型鑑定
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製經PD-1選擇之TIL所獲得PD-1+
TIL係藉由流動式細胞測量術評估CD4、CD8、CCR7、CD45RA及PD-1的表現。更廣泛的表型評估可見實例19。
使用尼沃魯單抗及EH12.2H7所衍生之經PD-1選擇者在CD4及CD8的表現上未觀察到顯著差異。以三個經測定之腫瘤而言，兩種TIL產物產生相對於CD4+
T細胞較高比例的CD8+
T細胞(圖174)。
在三個經PD-1選擇之TIL產物中CD4及CD8表現之類似性暗示使用尼沃魯單抗選擇PD-1+
相較於EH12.2H7不改變CD4/CD8的比例。
如同T細胞譜系，TIL的記憶狀態在使用EH12.2H7及尼沃魯單抗所產製之經PD-1選擇之TIL中類似。TIL族群主要由效應記憶T細胞構成(圖175)。
使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL與LN-145研究性產品相似，暗示使用任一抗PD-1選殖株選擇PD-1不使TIL之記憶表型偏離。
為了評估PD-1表現是否在培養後類似地減少，在擴增前及後評估使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL。在分選後，兩種經新鮮分選之TIL製劑中之PD-1+
TIL的百分比接近100%(表79)。在使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製之經PD-1選擇者中，PD-1表現在擴增後顯著且可相比地減少(圖176)。
如圖169所討論，在擴增後PD-1表現的減少證實使用EH12.2H7及尼沃魯單抗分選之PD-1+
TIL隨著擴增大多回復成PD-1-
。由經EH12.2H7及尼沃魯單抗分選之PD-1+
TIL所產製之經PD-1選擇之TIL的功能鑑定
為了評估使用尼沃魯單抗衍生之經擴增之PD-1+
TIL就功能方面是否類似於使用EH12.2H7選殖株衍生之TIL，將來自3個腫瘤之經PD1選擇之TIL使用非特異性αCD3/αCD28/α41BB活化珠刺激且評估IFNγ及顆粒溶解酶B分泌。
尼沃魯單抗及EH12.2H7衍生之經PD-1選擇之TIL因應刺激產生類似量的IFNγ及顆粒溶解酶B(圖177)。
使用尼沃魯單抗及EH12.2H7產製之經PD-1選擇之TIL因應非特異性刺激(αCD3/αCD28/αCD137珠)分泌可觀量的IFNγ及顆粒溶解酶B，暗示經選擇之TIL在擴增後具高度功能性。結論
總結來說，PD-1+
TIL係獲自所有34個經測試之腫瘤樣品，其包括CRC、NSCLC、HNSCC、TNBC、黑色素瘤、OC及PC之樣本。表現高量的PD-1之TIL的百分比在給定腫瘤類型內係可變的，且與對於抗PD-1療法具有已知臨床反應性之腫瘤類型無相關性。
重要的是，經PD-1選擇之TIL在離體擴增之後的預期產率在LN-145研究性產品所指明之臨床劑量範圍內。再者，經擴增之經PD-1選擇之TIL的表型與相匹配的未經選擇之TIL產物以及LN-145產物所展現之表型類似，雖然經PD-1選擇之TIL產物保留低等至中等量的PD-1表現。
最後，當與相匹配的未經選擇之TIL比較時，經PD-1選擇之TIL產物顯示優異的自體腫瘤反應性及腫瘤細胞殺滅。此觀察與在經PD-1選擇之產物中見到最盛行的TCRvβ序列相對於這些序列在相匹配的未經選擇之TIL產物中的量之戲劇性富集一致。預期增強的腫瘤反應性，因為發表研究顯示自表現PD-1之腫瘤獲得新抗原反應性T細胞(6, 8)。
概述之經PD-1選擇之TIL的非臨床研究強力支持用於實質腫瘤ACT之經擴增之TIL產物的臨床發展。
實例20之參考文獻
實例21：用於製造之高PD-1的選擇及擴增
介紹
數個研究顯示，PD-1(一種通常與T細胞耗竭相關的標誌)的高量表面表現識別腫瘤微環境中之自體腫瘤反應性T細胞(第11.10節)。此實例提供的規程係經設計以自腫瘤碎解物選擇PD-1陽性(PD-1+)細胞以富集富含自體腫瘤反應性T細胞之TIL產物(實例15)。此規程係經調適以選擇性地獲得具有高量的PD-1之TIL。
目的
此實例之目的在於發展一種分選及擴增PD1High
TIL以用於製造臨床試驗材料之過程。
範疇
本實例提供使用為了完整規模臨床製造所設計之2-REP規程所擴增之來自黑色素瘤、肺部及頭頸腫瘤之經分選之PD-1高
TIL。
三個完整規模之PD-1高
選擇第2代過程培養係如下述擴增。
在第0天，腫瘤碎解物使用含有中性蛋白酶、DNA酶I及膠原酶之GMP碎解雞尾酒單離。將碎解物洗滌、染色及藉由FACS分選以純化PD-1高
TIL。
REP-1係於第0天起始且使用經分選之PD-1高
TIL與100e6個同種異體餵養細胞及30 ng/mL OKT3達11天。
REP-2使用經收集之REP-1產物於第11天起始。REP-2(第11天)及後續的第16天及第22天過程係按照IOVA製造批次記錄實施(參考章節12附件)。相關時間點之簡短解釋概述於下。
評估經擴增之TIL之細胞生長、存活性、表型、端粒長度及功能(IFNγ及顆粒溶解酶B分泌、CD107a移動)。
方法
材料
腫瘤組織
將收到來自研究聯盟及組織採購供應商的各種組織學的腫瘤。
用於TIL生長之標準試劑包括：G-Rex 100MCS及500 MCS培養瓶(Wilson Wolf，分別為Cat # 81100-CS、85500S-CS)；GMP重組IL-2 (Cell-Genix, Germany, Cat#1020-1000)；所有用於CM1、CM2及CM4之培養基試劑可見如附件5至7所示之製造批次記錄；GlutaMAX 100X (Thermofisher, Cat# 35050061)；建它黴素50mg/mL (Thermofisher, Cat# 15750060)
流動式細胞測量術染色及分析試劑
流動式細胞測量術抗體：抗PD-1 PE選殖株EH12.2H7，Biolegend，Cat# 329906；抗CD3 FITC選殖株OKT3，Biolegend，Cat# 317306；及抗-IgG4 Fc-PE選殖株HP6025，Southern Biotech，Cat# 9200-09。
分選緩衝劑：含有2% FBS、1mM EDTA之HBSS，且經sterileGemini過濾。
收集緩衝劑：含有50% hAB血清之HBSS。
程序
腫瘤組織製備
將收到來自研究聯盟及組織採購供應商的新鮮切除的腫瘤樣本。腫瘤係隔夜運送於HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104)(含有抗生素)中。
將小瓶/試管中之腫瘤照相。將腫瘤自包裝移出，且於腫瘤洗滌緩衝液(含有50 ug/mL建它黴素之經過濾之HBSS)中洗滌3次每次洗滌2分鐘。
將整個腫瘤碎斷成4至6-mm片段準備進行腫瘤碎解。將6-mm片段保持在6孔板之含有10 mL之腫瘤洗滌緩衝劑之孔中。
用於腫瘤碎解之酶製劑
使用如以下所述之GMP膠原酶及中性蛋白酶碎解腫瘤。
將經冷凍乾燥之酶重構於以下各種碎解酶所示之量的無菌HBSS中。確定捕捉瓶壁及瓶口保護蓋上之任何殘餘粉末。上下吸放數次且渦旋以確保完全重構。
將膠原酶AF-1 (Nordmark, Sweden, N0003554)重構於10 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係2892 PZ U/小瓶。因此，在重構後膠原酶原液係289.2 PZ U/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成100 uL等分試樣且儲存在-20℃下。
將中性蛋白酶(Nordmark, Sweden, N0003553)重構於1 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係175 DMC U/小瓶。因此，在重構後中性蛋白酶原液係175 DMC U/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成20 uL等分試樣且儲存在-20℃下。
將DNA酶I (Roche, Switzerland, 03724751)重構於1 ml之無菌HBSS中。經冷凍乾燥之原液酶的濃度係4 KU/小瓶。因此，在重構後DNA酶原液係4 KU/ml。**請注意，酶之原液可經變更以驗證經冷凍乾燥之原液的濃度及據此修改添加至碎解雞尾酒的酶之最終量**。等分成250 uL等分試樣且儲存在-20℃下。
解凍GMP碎解雞尾酒的3個組分且製備工作GMP碎解雞尾酒如下：添加10.2 μl的中性蛋白酶(0.36 DMC U/ml)、21.3 μl的膠原酶AF-1 (1.2 PZ/ml)及250 μl的DNA酶I (200 U/ml)至4.7 ml的無菌HBSS。將碎解雞尾酒直接放入C試管。
腫瘤處理及碎解
在GentleMACS OctoDissociator中，將4至6 mm腫瘤片段轉移至各GentleMACS C試管(C試管)於5 ml如上所示之碎解雞尾酒。額外腫瘤片段使用額外的GentleMACS C試管。
將各C試管轉移至GentleMACS
OctoDissociator。根據下表80所列之各別腫瘤組織學設定解離器之適當程式進行碎解。解離將為大約一小時。
碎解後，將C試管自Octodissociator或轉子移出且放在BSC中。使用25-mL血清移液管自各C試管移出碎解物且使主體碎解物通過70-µm細胞過濾器進入50-mL錐形管中。未經碎解之腫瘤部分無法通過過濾器，不要讓碎解物因為移液器的壓力噴濺。使用額外10 mL的HBSS洗滌C試管且使洗滌液通過細胞過濾器。使用HBSS將50-mL錐形管補足至50 mL。
將碎解物在RT下以400 x G離心5分鐘(全速加速及全速煞車)。
將錐形管轉移至BSC且抽吸或傾析上清液。將團塊重懸於5 mL之熱CM-1+6000 IU/mL IL-2中且上下吸放5至6次。按照WRK LAB-056在未稀釋下在NC-200上實施2次細胞計數。
保留1 mL的碎解物作為CD3+主體對照且冷凍保存2 x 500 uL等分試樣的碎解物進行腫瘤反應性測定。將碎解物保持在冰上。
染色經碎解之腫瘤以進行流動式細胞測量術分析及細胞分選
保留小樣本(約1e5個細胞)用於PE及FITC單一顏色補償對照至15-mL錐形管中。
剩餘腫瘤碎解物根據下列規程使用包括抗PD-1-PE、抗IgG4 Fc-PE(尼沃魯單抗及派姆單抗之二級抗體)及抗CD3-FITC之雞尾酒染色。PE單一顏色補償對照係使用抗PD-1-PE加上IgG4二級染色，且FITC顏色補償對照係使用僅抗CD3-FITC染色。
在細胞計數後，添加10 mL之HBSS至碎解物且在RT下以400 x G離心5分鐘(全速加速及全速煞車)。
將錐形管轉移至BSC且傾析上清液。使用微量移液器獲得在傾析後剩餘之碎解物的體積。添加3x此體積之分選緩衝劑至試管，即如果獲得之體積係150 uL，則添加450 uL分選緩衝劑使總體積達600 uL。
每100 μL添加3 μl之抗CD3-FITC(即如果體積係600 uL，則添加6 X 3=18 uL之抗體)。 ( 添加至兩個樣本 ) 。
每100 μL添加2.5 μl抗PD-1-PE(即如果體積係600 uL，則添加6 X 2.5=15.0 uL之抗體)。 ( 不添加至 FMO) 。
以1:500稀釋添加抗IgG4-Fc-PE(即每500 uL之體積，添加1 uL之抗體)。
使用1-mL微量移液器輕輕混合碎解物且在冰上培育細胞30分鐘。在培育期間避光。在培育期間每10分鐘藉由輕彈攪動以確保徹底染色。
將經完全染色之細胞重懸於10 mL之分選緩衝劑中，添加10 mL分選緩衝劑至FMO。
使經完全染色之溶液通過30-μm細胞過濾器進入15-mL錐形管。也使FMO通過30-μm細胞過濾器進入15-mL錐形管。
在RT下以400 x G離心5 min(全速加速及全速煞車)。
將細胞以至多10e6/mL總細胞(活及死)重懸於分選緩衝劑中。最小體積係300 µl。
轉移至15-mL錐形管。將試管儲存在冰上，在進一步使用前以鋁箔覆蓋。
準備用於經分選之族群之15-mL收集管。將2 mL之收集緩衝劑(含有2% hAB血清之D-PBS)放入試管中。將收集管儲存在冰上直到進一步使用。
細胞計數及存活性評估
使用獲得細胞及存活性計數之程序，使用Chemometec NC-200細胞計數器。
FACS分選(FX500啟動)
開啟BSC。開啟JUN-AIR真空泵。藉由按壓儀器正面之電源/待機按鈕來開啟FX500。藉由雙擊桌面上之圖示打開細胞分選器軟體，登入且運行程式。
運行自動校正。
當提示要裝載校正珠時，添加15滴的自動化設置珠至5-mL、無菌FACS試管。接著遵照提示進行。當提示要選擇自動校正之設定時，選擇「標準」選項按鈕。在等待校正完成時，準備下列：準備五個含有10 mL之無菌D.I.水之無菌15-mL錐形管；準備五個含有4 mL之無菌D.I.水之無菌5-mL FACS試管；準備五個含有12 mL之70% EtOH之無菌15-mL錐形管；及準備五個含有12 mL之10%次氯酸鈉之無菌15-mL錐形管。
樣本收集
驗證樣本及收集室係在5℃下且選擇攪動樣本圖示。點擊螢幕上方的「Cytometer」頁面。點擊「收集5℃」圖示以及「樣本5℃」圖示。點擊「攪動」圖示。
驗證樣本係經補償。點擊螢幕上方的「補償」頁面。「補償」圖示應為淡藍色。將含有PBMC對照之試管(5-mL FACS試管或15-mL錐形管)放在樣本收集平台上。將樣本收集壓力設定6。點擊play以開始樣本收集。點擊「圈選及統計學」表格使下列顯示在螢幕上方。
在以上顯示之兩個下拉式選單選擇100,000。驗證細胞族群係經正確圈選。見以下實例。可能需要調整BSC或FSC設定。未調整任何其他通道的電壓。不調整PD-1圈選。記錄盡可能多起事件(或最多20,000起CD3事件)。您可設定樣本壓力為10以加速此收集。停止收集且移出試管。將先前製備的15-mL錐形管的無菌dH2O裝載至樣本平台上。樣本壓力選擇10。點擊「運行」圖示。收集樣本達一分鐘。點擊「重新開始」圖示。重複直到CD3圈選已無事件。移除dH2O樣本試管且丟棄。添加待收集樣本至裝載平台上。驗證設定係如下圖所示：
打開樣本室的門且將15-mL收集室嵌塊裝載至該室。將含有收集緩衝劑之收集管裝載至室嵌塊中。將加蓋試管倒轉數次以使收集緩衝劑包覆試管頂部。在BSC表面上輕敲試管以移除試管頂部及蓋子的多餘緩衝劑。將一個試管標示樣本名稱及+符號。移除蓋子且將這一個放入左室。將第二個試管標示樣本名稱及-符號。移除蓋子且將這一個放入右室。
點擊上圖所見之「裝載收集」圖示。樣本壓力選擇4。點擊「運行」圖示。等待細胞出現在螢幕上。約15秒。調整樣本壓力，以使每秒的總事件低於5,000。點擊開始分選圖示。調整樣本壓力以維持至少85%之分選效率。記錄50,000起CD3事件。見下圖。記錄將自動停止。當對話框出現時，點擊OK按鈕。
如果任一組分收集超過4.5 x 106
個細胞，將需要更換收集管。點擊停止分選圖示。點擊「暫時」圖示。打開收集室的門且將原始收集管更換為新的收集管；關上門並將原始收集管放在冰上。點擊「下一管」圖示。點擊「裝載收集」圖示。點擊「Play」圖示。點擊「開始分選」圖示。
持續分選直到消耗樣本試管中之所有樣本。如果試管「乾掉(runs dry)」是可以的。自樣本室移出樣本試管。丟棄。自收集室移出經分選之組分。將試管蓋上蓋子且輕柔倒轉數次以將靠近試管頂部之液滴併入溶液中。在BSC表面上輕敲試管以移除試管頂部及蓋子的多餘溶液。將試管放在冰上。驗證PD-1組分的選擇性百分比。將14-mL錐形管的EtOH放置在樣本室上。點擊「探針洗滌」圖示。重複。移除EtOH試管且添加陽性組分試管。將樣本壓力值變更為7。點擊下一管圖示。將試管命名樣本名稱及「pos select」。點擊play且記錄75起CD3陽性事件。立即停止試管且將其自樣本室卸載。重複步驟用於負向選擇樣本。
輸出資料。雙擊以選擇PD-1 FMO試管。選擇檔案/列印。列印至PDF格式而非印表機。此將提供樣本的完整6頁報告。重複用於所收集的各試管。將儀器關機。PD-1 高 快速擴增規程
第0天- REP1
培養基製備：製備或溫熱1 L之CM-1+6000 IU/mL IL-2。
PBMC餵養細胞製備：解凍適當數量之用於REP-1的小瓶(完整規模需要100e6個PBMC，且主體CD3+對照將需要10e6，假設每1 mL小瓶60e6至80e6個PBMC)。將40 mL之熱CM1+IL-2放入50 mL錐形管中且將1 mL PBMC餵養細胞小瓶移液至錐形管中。上下吸放經解凍之PBMC餵養細胞以徹底混合且在NC-200上實施2次細胞計數。
計算欲轉移至G-Rex 100M及G-Rex 10M之適當體積以分別轉移100e6及10e6個PBMC。
添加30 uL之aCD3 (OKT-3)至G-Rex 100M及3 uL至G-rex 10M。將培養瓶放入培育箱中。
接種TIL以進行REP-1
將所有PD-1高
分選物放入G-Rex 100M中。CD3+主體TIL對照條件將添加相等數量之CD3+細胞至以1/10比例完整規模的PD-1高
細胞。為了獲得適當體積之碎解物，遵照以下步驟：1)藉由將步驟9.3.5獲得之碎解物TVC乘以獲自分選報告之活細胞的CD3+ %來計算碎解物中之CD3+ TVC/mL(即，10e6*10%=1e6)；2)在獲得此數量後，將接種至完整規模條件之PD-1高
細胞數量除以此數量(即，1e5/1e6=0.1 mL)；及3)添加此體積(0.1 mL)之碎解物至主體CD3+ TIL培養瓶且使用CM1+IL-2填充至100 mL。將所有培養瓶放入37℃、5% CO2
培育箱中。
第11天、第16天、第22天
遵照完整規模過程。主體CD3+ TIL條件的處理類似於實例9所述之步驟。
接受標準
下表81指明將用於評估三個完整規模批量表現的接受標準。
下表82指明所實施僅供參考之額外最終產物鑑定測試。
實例 21 參考文獻 
上述實例係經提供以給出如何實施及使用本發明之組成物、系統及方法的實施例的完整揭露及說明給所屬技術領域中具有通常知識者，並非意圖限制發明人對於他們的發明之主張範圍。用於實施本發明之上述模式的修飾為該領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於下列權利要求範圍之內。說明書中所提及的所有專利及公開案指示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文所引證之所有參考文獻皆以引用方式且出於所有目的完整併入本文中，猶如個別公開案或專利或專利申請案係特別且個別明示以全文引用方式併入本文中以用於所有目的。
如所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行許多修改及變化。本文所述之特定實施例及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之用語以及申請專利範圍有權主張之等效物的全部範疇限制。
序列表簡單說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係重組人IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6係重組人IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係重組人IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8係重組人IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9係人4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係鼠4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab) (PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:12係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:13係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:14係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:15係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:16係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:17係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:18係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:19係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:20係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:21係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab) (BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:22係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:23係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:24係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:25係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:26係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:27係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:28係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:29係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:30係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:31係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:32係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:33係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:34係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:35係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:36係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:37係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:38係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:39係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:40係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:41係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:42係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:43係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:44係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:45係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:46係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:47係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:54係人OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(tavolixizumab) (MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:57係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:58係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:59係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:60係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:61係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:62係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:63係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:64係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:65係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:66係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:67係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:68係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:69係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:70係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:71係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:72係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:73係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:74係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:75係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:76係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:77係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:78係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:79係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:80係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:81係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:82係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:83係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:84係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:85係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:86係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:102係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:103係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:104係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:117係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:118係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:119係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:120係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:121係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:122係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:123係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:124係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
[ 圖 1A 至圖 1C ] ： A)
顯示2A過程(大約22天過程)及用於TIL製造之第3代過程實施例(大約14天至16天過程)之比較。B)
例示性PD-1第3代過程之圖提供步驟A至F之概覽(大約14天至16天過程)。C)
該圖提供三種例示性第3代過程及步驟A至F(大約14天至16天過程)三種過程變化各者的概覽。
[ 圖 2 ] ：
提供第2代(2A過程)與PD-1第3代之間可相比性的實驗流程圖。
[ 圖 3A 至 3C ] ： A)
L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。B)
L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。C)
M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。
[ 圖 4A 至 4C ] ： A)
L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。B)
L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。C)
M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。
[ 圖 5 ] ：
L4054活化及耗竭標誌(A)
CD4+圈選，(B)
CD8+圈選。
[ 圖 6 ] ：
L4055活化及耗竭標誌(A)
CD4+圈選，(B)
CD8+圈選。
[ 圖 7 ] ：
IFNγ產生(pg/mL)：(A) L4054、(B) L4055及(C) M1085T的第2代及第3代過程：此處表示的各槓是指經刺激、未經刺激及培養基對照之IFNγ的量的平均值+ SEM。光學密度在450 nm下測量。
[ 圖 8 ] ：
細胞培養上清液中IL-2濃度的ELISA分析：(A) L4054
及(B) L4055
。此處表示的各槓是指用過的培養基之IL-2量的平均值+ SEM。光學密度在450 nm下測量。
[ 圖 9 ] ：
定量用過的培養基中之葡萄糖及乳酸酯(g/L)：(A)葡萄糖及(B)乳酸酯：在二個腫瘤細胞系及二個過程中，觀察到整個REP擴增中之葡萄糖降低。相反地，觀察到乳酸酯如預期般增加。第2代與第3代過程之間的葡萄糖降低及乳酸酯增加是可相比的。
[ 圖 10 ] ：
A)定量L4054及L4055用過的培養基中之L-麩醯胺酸。B)定量L4054及L4055用過的培養基中之Glutamax。C)定量L4054及L4055用過的培養基中之氨。
[ 圖 11 ] ：端粒長度分析：
上述RTL值指示使用DAKO套組在第2代及第3代過程中每染色體/基因組平均端粒螢光相對於對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組端粒螢光。
[ 圖 12 ] ：
L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的獨特CDR3序列分析。長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集日收集的1 × 106
個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。
[ 圖 13 ] ：
L4054 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
[ 圖 14 ] ：
L4055 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
[ 圖 15 ] ：
L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的多樣性指標。Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代L4054及L4055相較於第2代顯示稍微較高多樣性。
[ 圖 16 ] ：
第7天：第3代REP起始之細胞計數原始資料呈現於表22(見以下實例5)。
[ 圖 17 ] ：
第11天：第2代REP起始及第3代規模縱向擴大(Scale Up)之細胞計數原始資料呈現於表22(見以下實例5)。
[ 圖 18 ] ：
第16天-第2代規模縱向擴大及第3代收集(例如，第16天)之細胞計數原始資料呈現於表23(見以下實例5)。
[ 圖 19 ] ：
第22天：第2代收集(例如，第22天)之細胞計數原始資料呈現於表23(見以下實例5)。以L4054第2代而言，LOVO後計數外推至4個培養瓶，因為是研究總數。1個培養瓶受到污染，且進行外推總計=6.67E+10。
[ 圖 20 ] ：
繪示於圖3A、4A及4B之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[ 圖 21 ] ：
繪示於圖3C及4C之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[ 圖 22 ] ：
繪示於圖5及6之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[ 圖 23 ] ：
繪示於圖7之L4054樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[ 圖 24 ] ：
繪示於圖7之L4055樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[ 圖 25 ] ：
繪示於圖7之M1085T樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[ 圖 26 ] ：
繪示於圖8之IL-2 ELISA測定結果的原始資料。
[ 圖 27 ] ：
呈現於圖9及10之代謝受質及代謝物分析結果的原始資料。
[ 圖 28 ] ：
呈現於圖11之相對端粒長度分析結果的原始資料。
[ 圖 29 ] ：
呈現於圖12及15之獨特CD3序列及殖株多樣性分析結果的原始資料。
[ 圖 30 ] ：
顯示各種第2代(2A過程)與第3.1代過程實施例之間的比較。
[ 圖 31 ] ：
表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[ 圖 32 ] ：
第3代過程之實施例(稱為第3.1代)的培養基條件概覽。
[ 圖 33 ] ：
表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[ 圖 34 ] ：
表格比較第2代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[ 圖 35 ] ：
表格提供所述擴增過程之各種實施例的培養基使用。
[ 圖 36 ] ：
表型比較：第3.0代及第3.1代過程實施例顯示可相比的CD28、CD27及CD57表現。
[ 圖 37 ] ：
第3代最終產物有較高的IFNγ產生。在培養冷凍上清液中評估IFNγ分析(藉由ELISA)以比較兩種過程。使用各第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第16天)的新鮮TIL產物，在各腫瘤以塗佈抗CD3板整夜刺激。此處表示的各槓是指經刺激、未經刺激及培養基對照之IFNγ的量。
[ 圖 38 ] ：
上圖：TIL最終產物的獨特CDR3序列分析：長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集的1×106
個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。下圖：TIL最終產物的多樣性指標：Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代相較於第2代顯示稍微較高多樣性。
[ 圖 39 ] ：
第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[ 圖 40 ] ：
第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[ 圖 41 ] ：
第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 42 ] ：
在擴增之前的PD-1選擇之示意圖。
[ 圖 43 ] ：
尼沃魯單抗與PD-1之結合結構。見Tan, S. et al. (Tan, S. et al.,Nature Communications
, 8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369 (2017))之圖5。
[ 圖 44 ] ：
派姆單抗與PD-1之結合結構。見Tan, S. et al. (Tan, S. et al.,Nature Communications
, 8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369 (2017))之圖5。
[ 圖 45 ] ：
發展簡化規程以擴增PD1+ TIL至臨床相關的量。腫瘤係自病患切除且運送至研究實驗室。抵達後將腫瘤碎解並將單一細胞懸浮液進行CD3及PD1染色。藉由使用FX500儀器(Sony)之FACS分選PD1+ TIL。將PD1+細胞組分放入含有抗人CD3抗體(OKT3; 30ng/ml)及經照射之同種異體PBMC(餵養細胞，TIL:餵養細胞比例為1:100)之培養瓶中且快速擴增22天(REP)。
[ 圖 46 ] ：
PD1+ TIL的頻率隨腫瘤樣本而異，但活體外擴增過程可靠地產生超過10億個TIL。經選擇及主體TIL係自黑色素瘤(n=6)、肺癌(n=7)、乳癌(n=6)及肉瘤(n=3)擴增。(A)顯示PD1+細胞於各個別樣本之新鮮腫瘤碎解物中之頻率。水平及垂直線分別代表平均值及標準誤。(B) PD1+及PD1-分選細胞及主體碎解物係如圖1所述擴增。細胞在完成REP時計數且計算擴增倍數(最終細胞計數/接種細胞計數)以用於外推總細胞數。以主體TIL而言，使用腫瘤碎解物中T細胞百分比估計接種細胞數。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 47 ] ：
PD1+ TIL相較於PD1- TIL顯示不同表型輪廓。在分選之前，經碎解之來自黑色素瘤(n=2)、肺部(n=2)及乳房(n=2)之腫瘤係藉由流動式細胞測量術進行表型評估。(A)來自經碎解之黑色素瘤腫瘤的TIL之表面標誌表現的代表性圖表。樣品首先於陽性及陰性PD1事件之二軸圖表圈選CD3。接著使二個組分進行無監督viSNE叢聚。頂列含有PD1陽性事件，及底列含有PD1陰性事件。(B-C)在CD3+細胞上圈選活淋巴細胞且評估PD1+及PD1-。評估PD1+及PD1-族群的細胞表面所表現之(B)活化及(C)耗竭標誌。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估，****P＜0.0001，*p＜0.05。
[ 圖 48 ] ：
PD1+
TIL在活體外擴增後PD1表現降低。來自黑色素瘤(n=1)、肺部(n=4)及乳房(n=2)之PD1+分選前TIL及經活體外擴增之PD1+TIL(PD1+衍生性TIL)係藉由流動式細胞測量術評估T細胞標誌的細胞表面表現。長條代表2個TIL製劑中各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估，***P＜0.001，**p＜0.01。
[ 圖 49 ] ：
經活體外擴增之PD1+ TIL在表型上類似於主體TIL。來自黑色素瘤(n=5)、肺部(n=7)、乳房(n=6)及肉瘤(n=3)之PD1+衍生性TIL、PD1-衍生性TIL及主體TIL係藉由流動式細胞測量術進行T細胞標誌之細胞表面表現的表型評估。(A)四個效應/記憶子集係基於CD3+細胞上(CD45RA及CCR7)的量識別。TEM=效應記憶(CD45RA-, CCR7-)，TCM=中央記憶(CD45RA-, CCR7+)，TSCM=幹細胞記憶(CD45RA+, CCR7+)，TEMRA=效應T細胞(CD45RA+,CCR7-)。亦評估(B)分化、(C)耗竭及(D)活化標誌。長條代表所有3個TIL製劑中各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 50 ] ：
經擴增之PD1+ TIL係寡株性且包含一部分存在主體TIL中之選殖株。來自黑色素瘤(n=2)、乳房(n=2)及肺部(n=2)之經PD1選擇及主體TIL係藉由RNA定序分析。(A)獨特CDR3 (uCDR3)肽序列係經編號且使用Python 3.6.3 (Anaconda, Inc.)之pandas及matplotlib庫產製箱形圖。(B)藉由iRepertoire計算各樣本的Shannon多樣性指標且使用Python 3.6.3 (Anaconda, Inc)之pandas及matplotlib庫產製箱形圖。長條代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估，***P＜0.001，**p＜0.01。(C)各經定序之樣本的uCDR3頻率係以漸減順序排名且以所示間隔(排名第一之uCDR3、排名2至10、11至20等之CDR3)報告或加總。接著依組別求出頻率的平均數並使用Excel v. 1803作圖。(D)在互補性主體TIL及PD1+
衍生性樣本中識別共享的uCDR3選殖株。各共享的獨特CDR3選殖株之頻率總和係報告於「共享%」欄。
[ 圖 51 ] ：
經擴增之PD1+ TIL具功能性，如因應非特異性刺激之IFN分泌及CD107a移動所判定。A)來自黑色素瘤(n=5)、肺部(n=6)及乳房(n=6)之PD1+衍生性TIL、PD1-衍生性TIL及主體TIL經板結合抗CD3刺激18小時。藉由ELISA評估上清液的IFNγ分泌。將個別樣本的結果作圖。(B)藉由流動式細胞測量術評估來自黑色素瘤(n=5)、肺部(n=7)、乳房(n=6)及肉瘤(n=1)之PD1+衍生性TIL、PD1-衍生性TIL及主體TIL因應PMA刺激4小時後在CD4+及CD8+細胞上的CD107a細胞表面表現將個別樣本的結果作圖。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 52 ] ：
經擴增之PD1+ TIL相對於PD1- TIL顯示增強自體黑色素瘤細胞殺滅及腫瘤反應性。評估來自一個黑色素瘤樣本之經PD1選擇之TIL產物的腫瘤反應性。(A)使用死亡細胞移除套組(Miltenyi)清潔全腫瘤碎解物。將1e5個活細胞接種至96孔板的每孔且允許在xCELLigence儀器(ACEA Biosciences, Inc.)中在37℃下附著18小時。將1e5個PD1+及PD1-衍生性自體TIL添加至彼等各別之孔，導致1:1(TIL:標靶)細胞比例且培育48小時。將自體標靶細胞殺滅記錄為因細胞脫附導致之阻抗增加。細胞殺滅(細胞裂解%)(最左側的圖)係使用下式計算：細胞裂解%=[1-(NCIst)/(AvgNCIRt)]x100，其中NCIst係樣本的標準化細胞指數，且NCIRt係相匹配的參照孔(僅碎解物)之標準化細胞指數平均值。右圖顯示樣本之標準化細胞指標。(B)將來自全腫瘤碎解物之1e5個細胞與1e5個TIL(或單獨的碎解物及TIL)共培養18小時。藉由ELISA (R&D systems)評估上清液的IFNγ釋放。長條代表二重複(duplicate)孔的平均值且垂直線代表標準誤。
[ 圖 53 ]
：使用螢光激活細胞分選自腫瘤碎解物選擇PD1+細胞。
[ 圖 54 ] ：
識別腫瘤組織碎解方法。
[ 圖 55 ] ：
使用GMP可用試劑識別腫瘤組織碎解方法。
[ 圖 56 ] ：
使用GMP可用試劑識別腫瘤組織碎解方法。
[ 圖 57 ] ：
使用GMP可用試劑識別腫瘤組織碎解方法。
[ 圖 58 ] ：
新鮮腫瘤碎解物的分選產率高於經冷凍之腫瘤碎解物。
[ 圖 59 ] ：
PD1於新鮮及經冷凍之TIL中之類似表現。
[ 圖 60 ]
：PD1抗體力價：使用市售選殖株之PD1的可變表現。
[ 圖 61 ] ：
尼沃魯單抗抑制5種市售PD1染色抗體的結合。
[ 圖 62 ] ：
派姆單抗差別地抑制5種市售PD1染色抗體的結合。
[ 圖 63 ] ：
當細胞與派姆單抗預培育時PD-1 MFI顯著減少。
[ 圖 64 ] ：
當相較於EH12.2H7選殖株時，與Pembro及Nivo共培育且使用IgG4二級染色之TIL顯示類似的PD-1表現。
[ 圖 65 ] ：
使TIL與Pembro及Nivo培育不改變偵測表面PD1表現之能力。
[ 圖 66 ] ：
PD1選擇之分選及擴增結果。
[ 圖 67] ：
PD1選擇之分選及擴增結果。
[ 圖 68 ] ：
PD1選擇之分選及擴增結果。
[ 圖 69] ：
PD1+衍生性TIL之最佳接種密度高於10,000個細胞。
[ 圖 70 ] ：
PD1+
TIL相較於PD1- TIL顯示不同表型輪廓。
[ 圖 71 ] ：
PD1+
TIL相較於PD1- TIL顯示不同表型輪廓。
[ 圖 72 ] ：
PD1+ TIL頻率隨腫瘤樣本而異且需要2個REP循環以克服低初始增生速率。
[ 圖 73 ] ：
PD1+ TIL頻率隨腫瘤樣本而異且需要2個REP循環以克服初始增生速缺陷。
[ 圖 74 ] ：
經活體外擴增之PD1+ TIL在表型上類似於主體TIL。
[ 圖 75 ] ：
PD1+ TIL在活體外擴增後PD1表現降低。
[ 圖 76 ] ：
經PD1+
選擇之TIL係寡株性且包含一部分存在主體TIL中之選殖株。
[ 圖 77 ]
：經PD1+
選擇之TIL係寡株性且包含一部分存在主體TIL中之選殖株。
[ 圖 78 ] ：
經PD1+
選擇之TIL係寡株性且包含一部分存在主體TIL中之選殖株。
[ 圖 79] ：
經PD1+
選擇之TIL係寡株性且包含一部分存在主體TIL中之選殖株。
[ 圖 80] ：
PD1+
衍生性TIL具功能性，如因應非特異性刺激之IFN分泌及CD107a移動所判定。
[ 圖 81] ：
黑色素瘤中之PD1+
衍生性TIL相較於PD1-
衍生性TIL及主體TIL顯示增強殺滅。
[ 圖 82] ：
黑色素瘤中之PD1+
衍生性TIL相較於PD1-
及主體衍生性TIL顯示增強腫瘤細胞殺滅。
[ 圖 83] ：
使用第3代擴增平台擴增來自造血惡性病之TIL之方法的例示性實施例。
[ 圖 84] ：
經離體(ex vivo)擴增之PD1+ TIL在數個活體外測定中顯示效應物活性。資料表示經PD1+選擇之TIL具抗原特異性且具有較高效應功能。
[ 圖 85] ：
腫瘤碎解及PD-1+選擇步驟(包括高PD-1選擇)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 86] ：
經PD-1選擇之TIL的資料及資訊，包括uCDR數量以及擴增資料。
[ 圖 87 ] ：
使用EH12.2H7抗PD-1抗體而非M1H4抗PD-1抗體之經PD-1選擇之TIL分選策略及資料。
[ 圖 88] ：
經PD-1選擇之TIL分選資料顯示在使用使用EH12.2H7抗PD-1抗體之高PD-1圈選策略中的族群。
[ 圖 89] ：
PD1+分選策略資料顯示用於分選之抗PD1抗體M1H4抗PD-1抗體及EH12.2H7抗PD-1抗體的評估。
[ 圖 90] ：
用於TIL選擇之PD-1染色。資料顯示EH12.2H7及M1H4顯示在PBMC及TIL中不同的PD1輪廓。
[ 圖 91] ：
M1H4衍生性TIL相較於EH12.2H7衍生性TIL之比較性分析。增加PD1+在經EH12.2H7分選之TIL中頻率。
[ 圖 92] ：
使用M1H4選殖株之PD1+衍生性TIL在REP1期間減少擴增倍數。
[ 圖 93] ：
M1H4衍生性TIL及EH12.2H7衍生性TIL之比較性分析。在經M1H4分選之TIL中觀察到較高寡株性(降低多樣性)。(Shannon熵係反映有多少不同類型的物種存在之標準衡量法。)
[ 圖 94] ：
相較於EH12.2H7選殖株，在M1H4選殖株中觀察到PD1+衍生性TIL相較於主體TIL具有較高寡株性(降低多樣性)。(Shannon熵係反映有多少不同類型的物種存在之標準衡量法。)
[ 圖 95] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 96] ：
發展用於經PD1選擇之TIL的經改良之第2代過程之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 97] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：以小規模(上圖)及大規模(下圖)圈選不同腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 98] ：
發展用於經PD1選擇之TIL的經改良之擴增過程之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 99] ：
資料顯示PD1+條件之第17天早期REP收集產生55e9及37e9個TIL。
[ 圖 100] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的IFNγ分泌。
[ 圖 101] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的顆粒溶解酶B分泌。
[ 圖 102 ] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下一個腫瘤樣本的CD3+CD45+族群。PD1+第2代條件係＞ 90% CD3+CD45+。
[ 圖 103 ] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下一個腫瘤樣本的CD3+CD45+族群。PD1+第2代條件係＞ 90% CD3+CD45+。
[ 圖 104] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下一個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。純度：＞ 90% TCR a/b +且無可偵測的NK或單核球或B細胞。
[ 圖 105] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下一個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。純度：＞ 90% TCR a/b +且無可偵測的NK或單核球或B細胞。
[ 圖 106A 至 B] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。分化：PD1+第2代分化狀態係可相比的。
[ 圖 107A 至 B] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。記憶：PD1+第2代大多係效應記憶TIL。
[ 圖 108A 至 B] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。CD4+之活化及耗竭狀態類似。
[ 圖 109] ：
顯示如圖96及98所述之多個擴增過程條件下二個腫瘤樣本的TIL輪廓特徵。CD8+之活化及耗竭狀態類似。
[ 圖 110] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：比較分選前及分選後，圈選不同腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 111 ] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4097腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 112] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4089腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 113] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選H3035腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 114] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選M1139腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 115] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4100腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 116] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選OV8030腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 117] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4104腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 118] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選M1132腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 119] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選M1136腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 120] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選H3037腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 121] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4106腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 122] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L1141腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 123] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4096腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 124] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選H3038腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 125] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4101腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。(注意：在第三圖中潛在CD8圈選問題。)
[ 圖 126] ：
顯示PD1+
選擇之例示性資料：圈選L4097腫瘤樣本之高PD1+(高PD-1)。
[ 圖 127] ：
資料顯示各種經PD-1選擇之族群之擴增。高PD-1擴增細胞在REP1中可具有減少的擴增。
[ 圖 128] ：
PD-1選擇之分選及擴增結果摘要。使用EH12.2H7抗PD-1抗體分選PD1high
細胞。
[ 圖 129] ：
PD-1選擇之分選及擴增結果摘要。使用EH12.2H7抗PD-1抗體分選PD1high
細胞。
[ 圖 130] ：
來自圖128及129之PD-1選擇的分選及擴增結果之摘要資料圖示。使用EH12.2H7抗PD-1抗體分選PD1high
細胞。
[ 圖 131 ]
：提供結構I-A及I-B，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，該三價蛋白質接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH3及CH2結構域)連接，該IgG1-Fc用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，藉以穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH及VL鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。
[ 圖 132 ] ：
資料顯示上方見到之下拉式選單皆選擇100,000個細胞收集。驗證細胞族群係經正確圈選。藉由使用PBMC、FMO對照及樣本本身，將圈選設定為高、中及低以區別三個族群。
[ 圖 133 ] ：
左上：此係FMO對照。確保int及high圈選係小於0.5%。右上：其中high及mid之分離並不清楚之代表性圖表。此日之背景較高，造成陰性圈選較高。底部：high及mid之清楚代表圖。資料顯示可能需要調整BSC或FSC設定。未調整任何其他通道的電壓。視需要調整PD1圈選。
[ 圖 134] ：
經PD1選擇及未經選擇之TIL的獨特CDR3vβ組成。分析來自2個HNSCC及5個NSCLC之經擴增之未經選擇及經PD1選擇之TIL的CDR3vβ貯庫。將各個別樣本標註為uCDR3計數之獨特CDR3β (A)及表現為Shannon熵之多樣性指標(B)作圖。成對樣本係以色線連接。藉由成對t檢定所計算之P值標註在彼等各別的圖上。
[ 圖 135 ] ：
圖顯示經PD1選擇及未經選擇之TIL之間的選殖株重疊。分析來自2個HNSCC及5個NSCLC之經擴增之TIL的CDR3vβ貯庫。經PD1選擇(藍色)及未經選擇(紅色)之TIL樣本之間共享的獨特CDR3vβ數量顯示於各個別腫瘤樣本之Venn圖的相交處。B及C，將各個別樣本之未經選擇及經PD1選擇之TIL中共享TIL之百分比及比例作圖。成對樣本係以色線連接。藉由成對t檢定所計算之P值標註在彼等各別的圖上。
[ 圖 136 ] ：
未經選擇之TIL產物中前10個經PD1選擇之TIL選殖株的頻率。分析來自2個HNSCC及5個NSCLC之經擴增之經PD1選擇及未經選擇之TIL的CDR3vβ貯庫。將經PD1選擇之TIL產物中所識別之獨特CDR3vβ序列自最常見至最少見排名。將成對產物各者中各個別前10個經PD1選擇之TIL選殖株的頻率作圖。成對樣本係以實線連接。藉由成對t檢定所計算之P值標註在彼等各別的圖上。
[ 圖 137 ] ：
這些研究所使用之腫瘤碎解物的說明。
[ 圖 138 ]
：偵測各種組織學之腫瘤碎解物中的PD1+
細胞。圖例：多個組織學中之PD1表現。將各組織學內個別樣本之CD3+
TIL族群中之PD1+
TIL的百分比作圖。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 139 ] ：
此研究所使用之經PD1選擇及未經選擇之TIL的說明。
[ 圖 140 ] ：
經PD1選擇之TIL在REP1而非REP2期間減少擴增倍數。圖例：來自(A)黑色素瘤、(B) NSCLC及(C) HNSCC之經PD1分選及未經選擇者經由二個11天REP擴增。所有經測定之腫瘤的擴增倍數顯示於(D)。在REP1及REP2完成時的總細胞計數係用於計算TIL族群中之擴增倍數。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表經PD1選擇之TIL及灰色三角形代表未經選擇之TIL。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；*代表p值＜0.05。
[ 圖 141 ] ：
來自各種腫瘤樣本之擴增結果。
[ 圖 142 ] ：
此研究所使用之經PD1選擇及未經選擇之TIL的說明。根據程序TMP-18-015，經PD1選擇及未經選擇之TIL產物係獲自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。使經PD1分選之細胞及未經選擇之全腫瘤碎解物進行二個11天快速擴增期(REP)以分別獲得經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL。
[ 圖 143 ] ：
經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL因應活化珠刺激而產生IFNγ及顆粒溶解酶B。圖例：評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL所分泌之(A) IFNγ及(B)顆粒溶解酶。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表未經刺激之條件及灰色三角形代表αCD3/αCD28/α41BB刺激條件。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；**代表p值＜0.01。
[ 圖 144 ] ：
經PD1選擇及未經選擇之TIL因應PMA/離子黴素(Ionomycin)刺激移動CD107a。圖例：來自4個黑色素瘤、5個NSCLC及1個HNSCC之經PD1選擇及未經選擇之TIL係藉由流動式細胞測量術評估因應PMA及離子黴素(BioLegend, CA)刺激的CD107a之細胞表面表現。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表未經刺激之條件及灰色三角形代表PMA/離子黴素刺激條件。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 145 ] ：
此研究所使用之經PD1選擇及未經選擇之TIL的說明。
[ 圖 146 ] ：
經PD1選擇及未經選擇之TIL顯示活體外自體腫瘤反應性。腫瘤殺滅及反應性係於經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL中評估。顯示黑色素瘤樣本之(A)細胞指標及(B)腫瘤細胞殺滅(細胞裂解%)。藉由ELISA評估來自2個NSCLC及3個黑色素瘤之上清液的(C) IFNγ釋放。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；**代表p值＜0.01。
[ 圖 147 ] ：
實例16所使用之經PD1選擇及未經選擇之TIL的說明。根據程序TMP-18-015，經PD1選擇及未經選擇之TIL產物係獲自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC。簡言之，使用DNA酶、玻璃酸酶及膠原酶IV之雞尾酒碎解全腫瘤活體組織切片。將所得之單一細胞懸浮液的一部分進行PD1染色且在FX500儀器(Sony, HQ, New York)上分選。使經PD1選擇及未經選擇之TIL進行二個11天REP。
[ 圖 148 ]
：圖1：比較在經PD1選擇及未經選擇之TIL中之CD4+
及CD8+
T細胞的量。圖例：使用流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇及未經選擇之TIL的T細胞譜系(CD4及CD8)。結果表現為CD3+
細胞之百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 149 ] ：
比較經PD1選擇之TIL與未經選擇之TIL的分化狀態。圖例：使用流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的CD27、CD28、CD56、CD57及KLRG1表現。結果表現為CD3+
細胞之百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；*代表p值＜0.05。
[ 圖 150 ]
：比較在經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL中記憶T細胞子集的分布。圖例：藉由流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的記憶標誌CD45RA及CCR7表現。T細胞記憶子集係如所示判定且將經PD1選擇之TIL的各子集之平均百分比作圖為黑色長條及未經選擇之TIL為灰色長條。標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 151 ] ：
比較經PD1選擇之TIL與未經選擇之TIL的活化狀態。圖例：評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的CD25、CD69、CD134及CD137表現。將經PD1選擇之TIL的CD3+
T細胞的平均百分比作圖為黑色長條及未經選擇之TIL為灰色長條。標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；*代表p值＜0.05。
[ 圖 152 ] ：
比較在經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL中耗竭/抑制標誌的表現。圖例：藉由流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的LAG3、PD1、TIM3及CD101表現。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；***代表p值＜0.001。
[ 圖 153 ] ：
比較在經PD1選擇及未經選擇之TIL中常駐記憶T細胞標誌的表現。藉由流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC之經PD1選擇之TIL及未經選擇之TIL的CD39、CD49a及CD103表現。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；**代表p值＜0.01。
[ 圖 154 ] ：
PD1 TIL培養之完整規模過程實施例。
[ 圖 155 ] ：
小規模過程概覽：PD1-A係使用此規程中概述之尼沃魯單抗染色程序之條件。PD1-B係使用抗PD1-PE (Clone# EH12.2H7)染色方法之條件。主體條件作為對照組。
[ 圖 156 ] ：
所有三個腫瘤的分選後純度(PD-1+%)符合＞ 80%之標準。黑色素瘤腫瘤相對於頭頸腫瘤所觀察到稍微較低之純度最有可能是因為分選時PD-1+細胞的較低表現。
[ 圖 157 ] ：圖 1 。偵測各種組織學之腫瘤碎解物中的 PD-1+ 細胞。
多個組織學中之PD-1表現。將各組織學內個別樣本之CD3+
TIL族群中之PD-1+
TIL的百分比作圖。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 158 ] ：
FACS資料圖。
[ 圖 159 ] ：
使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之PD-1+ TIL的經PD-1選擇之TIL係使用流動式細胞測量術評估T細胞譜系(CD4及CD8)。結果表現為CD3+細胞之百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 160 ] ：
來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1選擇之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+ TIL)係藉由流動式細胞測量術評估記憶標誌CD45RA及CCR7的表現。T細胞記憶子集(TN/TSCM)係如所示判定且將經尼沃魯單抗PD-1選擇之TIL的各子集之平均百分比作圖為黑色長條及經EH12.2H7 PD-1選擇之TIL為灰色長條。標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 161A ] ：
評估來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之經PD-1分選之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+
TIL)在擴增前及後的PD-1表現。經PD-1分選之產物的分選後純度係用於判定在擴增之前PD-1+
的百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；**代表p值＜0.01。
[ 圖 161B ]
：評估來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之經PD-1選擇之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+ TIL)的(A) IFNγ及(B)顆粒溶解酶B分泌。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表未經刺激之條件及灰色三角形代表αCD3/αCD28/α41BB刺激條件。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 162 ] ：
經尼沃魯單抗及EH12.2H7染色之TIL中分選前PD-1的量。將全腫瘤碎解物分瓶且使用尼沃魯單抗或EH12.2H7染色且藉由流動式細胞測量術評估。接著使用FX500細胞分選器(SONY, NY)分選來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC的使用各抗體識別之PD-1+
細胞。
[ 圖 163 ] ：
經尼沃魯單抗及EH12.2H7染色之TIL中分選後PD-1的量。
[ 圖 164 ] ：
將全腫瘤碎解物分瓶且使用尼沃魯單抗或EH12.2H7染色且藉由流動式細胞測量術評估。接著使用FX500細胞分選器(SONY, NY)分選來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC的使用各抗體識別之PD-1+
細胞。
[ 圖 165 ]
：偵測各種組織學之腫瘤碎解物中的PD-1+
細胞。多個組織學中之PD-1表現。將各組織學內個別樣本之CD3+ TIL族群中之PD-1+ TIL的百分比作圖。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 166 ] ：
經PD-1選擇之TIL在活化相但非REP期間的擴增倍數減少。使用二步驟過程擴增來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1分選之TIL及全腫瘤碎解物，該過程係由11天活化步驟及隨後的11天REP所組成。顯示所有經測定之腫瘤的擴增倍數。在活化及REP步驟完成時的總細胞計數係用於計算TIL族群中之擴增倍數。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表經PD-1選擇之TIL及灰色三角形代表未經選擇之TIL。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 167 ]
：在經PD-1選擇及未經選擇之TIL中之CD4+
及CD8+
T細胞的量。使用流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1選擇及未經選擇之TIL的T細胞譜系(CD4及CD8)。結果表現為CD3+
細胞之百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 168 ]
：比較在經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL中記憶T細胞子集的分布。藉由流動式細胞測量術評估來自4個黑色素瘤、6個NSCLC及2個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL的記憶標誌CD45RA及CCR7表現。T細胞記憶子集係如所示判定且將經PD-1選擇之TIL的各子集之平均百分比作圖為黑色長條及未經選擇之TIL為灰色長條。標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 169 ] ：
PD-1+
分選TIL及未經選擇之TIL在擴增之前及之後的PD-1表現。評估來自3個黑色素瘤、7個NSCLC及2個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1分選之TIL及全腫瘤碎解物在擴增前及後的PD-1表現。PD1+
分選產物的分選後純度係用於判定在擴增之前PD-1+
TIL的百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；***及****分別代表p值＜0.001及＜0.0001。
[ 圖 170 ]
：未經選擇之TIL中前10個經PD-1選擇之TCRvβ選殖株的頻率。圖例：分析來自2個HNSCC及5個NSCLC腫瘤樣本之經擴增之經PD-1選擇及未經選擇之TIL的CDR3vβ貯庫。將經PD-1選擇之TIL產物中所識別之獨特CDR3vβ序列自最常見至最少見排名。將成對產物各者中「前10個」(即10個最常的選殖株)經PD-1選擇之TIL選殖株的頻率作圖。成對樣本係以實線連接。藉由成對t檢定所計算之P值標註在彼等各別的圖上。
[ 圖 171 ] ：
相較於相匹配的未經選擇之TIL，經PD-1選擇之TIL顯示優異的自體腫瘤反應性。獲自3個黑色素瘤、2個NSCLC、1個PC及1個TNBC樣本之經PD-1選擇及相匹配的未經選擇之TIL係藉由ELISA測試因應自體腫瘤碎解物18至24小時培育後的IFNγ分泌。顯示各個別樣本在有或無HLA第I型阻斷抗體下所測量之IFNγ濃度的差異。正值反映HLA特異性抗腫瘤反應，而空或負值反映非特異性反應。
[ 圖 172 ] ：
經PD-1選擇及未經選擇之TIL顯示自體腫瘤殺滅。使用xCELLigence即時細胞分析系統評估經PD-1選擇之TIL及未經選擇之TIL的腫瘤殺滅及反應性。顯示黑色素瘤樣本之(A)細胞指標及(B)腫瘤細胞殺滅(細胞裂解%)。
[ 圖 172 ] ：
經尼沃魯單抗及EH12.2H7染色之TIL中PD-1的量。將全腫瘤碎解物分瓶且使用尼沃魯單抗或EH12.2H7染色且藉由流動式細胞測量術評估。接著使用FX500細胞分選器(SONY, NY)分選來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC的使用各抗體識別之PD-1+
細胞。
[ 圖 173 ] ：
尼沃魯單抗及EH12.2H7染色之經PD-1分選之TIL的最終產物產率。來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之衍生自使用尼沃魯單抗及EH12.2H7染色TIL之經PD-1分選之TIL係使用11天活化步驟及隨後11天REP擴增。顯示接種之CD3+
細胞數量、擴增倍數及外推/實際細胞計數。標示*之卵巢及黑色素瘤腫瘤係小規模實驗，且標示**之HNSCC係以完整規模實施。
[ 圖 174 ] ：
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗之經PD-1選擇之TIL中CD4+及CD8+ TIL的表現。使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之PD-1+
TIL的經PD-1選擇之TIL係使用流動式細胞測量術評估T細胞譜系(CD4及CD8)。結果表現為CD3+
細胞之百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 175 ] ：
EH12.2H7及尼沃魯單抗分選之PD-1+ TIL中的記憶族群。來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC腫瘤樣本之經PD-1選擇之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+
TIL)係藉由流動式細胞測量術評估記憶標誌CD45RA及CCR7的表現。T細胞記憶子集係如所示判定且將經尼沃魯單抗PD-1選擇之TIL的各子集之平均百分比作圖為黑色長條及經EH12.2H7 PD-1選擇之TIL為灰色長條。標準誤顯示為垂直線。
[ 圖 176 ] ：
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製之經PD-1分選之TIL在擴增之前及之後的TIL表現PD-1表現。評估來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之經PD-1分選之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+
TIL)在擴增前及後的PD-1表現。經PD-1分選之產物的分選後純度係用於判定在擴增之前PD-1+
的百分比。平均值係作圖為長條且標準誤顯示為垂直線。統計顯著性係藉由成對學生t檢定評估；**代表p值＜0.01。
[ 圖 177 ] ：
使用EH12.2H7及尼沃魯單抗產製之經PD-1選擇之TIL經分選之PD-1+
TIL因應非特異性刺激產生IFNγ及顆粒溶解酶B。評估來自1個卵巢、1個黑色素瘤及1個HNSCC之經PD-1選擇之TIL(使用尼沃魯單抗或EH12.2H7分選以識別PD-1+
TIL)的(A) IFNγ及(B)顆粒溶解酶B分泌。針對個別樣本之結果作圖，黑色點代表未經刺激之條件及灰色三角形代表αCD3/αCD28/α41BB刺激條件。水平線代表各子集的平均百分比且垂直線代表標準誤。
[ 圖 178 ] ：
PD-1+High第2代過程之實施例概覽。
[ 圖 179 ] ：
FACS作圖資料。
Claims (205)
- 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含: (a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群； (c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群； (d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群；及 (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
- 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含: a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群； c) 藉由在包含IL-2、OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群； d) 藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群。
- 如請求項2之方法，其中在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係大於步驟(b)之培養基中APC數量。
- 如請求項2之方法，其中在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係等於步驟(b)之培養基中APC數量。
- 如請求項1或2之方法，其中該PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
- 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含: (a) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養經選擇呈PD-1陽性之第一TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，該第一TIL族群可藉由腫瘤碎解以處理來自個體之腫瘤樣本且選擇PD-1陽性TIL而獲得，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群； (b) 藉由使該第二TIL族群與含有額外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL族群之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中之APC數量係步驟(a)中之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增；及 (c) 收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
- 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含: (a) 藉由在包含IL-2、OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群以實施經選擇呈PD-1陽性之TIL的初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群； (b) 藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (c) 收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
- 如請求項6之方法，其中在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係大於步驟(b)之培養基中APC數量。
- 如請求項6之方法，其中在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中APC數量係等於步驟(b)之培養基中APC數量。
- 如請求項6或7之方法，其中該PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(b)之該選擇包含下列步驟:(i)使該第一TIL族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，(ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，及(iii)實施基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL族群。
- 如請求項11之方法，其中該單株抗PD-1 IgG4抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)或其變體、片段或接合物。
- 如請求項12之方法，其中該抗IgG4抗體係抗人IgG4選殖株HP6023選殖株。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該快速第二擴增中APC數量對該初始第一擴增中APC數量之比例係選自約1.5:1至約20:1的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該比例係選自約1.5:1至約10:1的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該比例係選自約2:1至約5:1的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該比例係選自約2:1至約3:1的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該比例係約2:1。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC數量係選自約1x108 個APC至約3.5x108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約3.5x108 個APC至約1x109 個APC的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC數量係選自約1.5x108 個APC至約3x108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約4x108 個APC至約7.5x108 個APC的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該初始第一擴增中APC數量係選自約2x108 個APC至約2.5x108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中APC數量係選自約4.5x108 個APC至約5.5x108 個APC的範圍。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中將約2.5x108 個APC添加至該初始第一擴增且將5x108 個APC添加至該快速第二擴增。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約1.5:1至約100:1。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約50:1。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約25:1。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約20:1。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群中TIL數量對該第一TIL族群中TIL數量之比例係約10:1。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍。
- 如請求項2至28中任一項之方法，其中該方法包含在收集該治療性TIL族群之步驟之後實施下列額外步驟: 將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋。
- 如請求項1至28中任一項之方法，其中該多個腫瘤片段係分布於複數個分開的容器中，在該分開的容器之各者中，該第二TIL族群係獲自該初始第一擴增步驟之該第一TIL族群，且該第三TIL族群係獲自該快速第二擴增步驟之該第二TIL族群，且其中獲自該第三TIL族群之該治療性TIL族群係自該複數個容器之各者收集且合併以產生該經收集之TIL族群。
- 如請求項30之方法，其中該複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
- 如請求項30之方法，其中該複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
- 如請求項30之方法，其中該複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
- 如請求項30之方法，其中該複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
- 如請求項30至34中任一項之方法，其中該分開的容器之各者包含第一氣體可通透性表面區域。
- 如請求項1至29中任一項之方法，其中該多個腫瘤片段係分布於單一容器中。
- 如請求項36之方法，其中該單一容器包含第一氣體可通透性表面區域。
- 如請求項33或37之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項36之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項38之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項38至40中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項41之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項42之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項2至29中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該初始第一擴增係於包含第一氣體可通透性表面區域的第一容器中實施，且在該快速第二擴增步驟中，該快速第二擴增係於包含第二氣體可通透性表面區域的第二容器中實施。
- 如請求項44之方法，其中該第二容器係大於該第一容器。
- 如請求項42或43之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項46之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項48之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項44至48中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項49之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項49之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項2至43中任一項之方法，其中該初始第一擴增係針對各容器中的第一TIL族群實施，該快速第二擴增係於相同容器中針對自該第一TIL族群產生的該第二TIL族群實施。
- 如請求項52之方法，其中各容器包含第一氣體可通透性表面區域。
- 如請求項53之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約1個細胞層至約3個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項54之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項55之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項53至56中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項57之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項58之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透性表面區域上。
- 如請求項2至36、44、46及52中任一項之方法，其中該初始第一擴增係在該初始第一擴增步驟中於各容器中針對第一TIL族群實施，該第一容器包含第一表面區域，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係層疊在該第一氣體可通透性表面區域上，且其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.1至約1:10的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.2至約1:8的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.3至約1:7的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.4至約1:6的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.5至約1:5的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.6至約1:4的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.7至約1:3.5的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.8至約1:3的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.9至約1:2.5的範圍。
- 如請求項60之方法，其中該初始第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係約1:2。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中於2至3天後，對該細胞培養基補充額外的IL-2。
- 如前述請求項中任一項之方法，其在收集該治療性TIL族群之步驟中進一步包含使用冷凍保存過程以冷凍保存該經收集之TIL族群。
- 如請求項1或29之方法，其進一步包含冷凍保存該輸注袋之步驟。
- 如請求項71或72之方法，其中使用呈1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基以實施該冷凍保存過程。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項74之方法，其中該PBMC經照射且為同種異體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該初始第一擴增步驟中，該細胞培養基包含周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該初始第一擴增步驟中該細胞培養基中PBMC總數係2.5×108 個。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，在該細胞培養基中該抗原呈現細胞(APC)係周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該快速第二擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係5×108 個。
- 如請求項1至70中任一項之方法，其中該抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在收集該治療性TIL族群之步驟中，該收集係使用基於膜之細胞處理系統實施。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(d)之該收集係使用LOVO細胞處理系統實施。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟之該多個片段包含每容器約60個片段，其中各片段具有約27 mm3 之體積。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
- 如請求項82之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(d)中於2至3天後，對該細胞培養基補充額外的IL-2。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
- 如請求項1或29之方法，其中在將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋之步驟中，該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
- 如請求項71至73中任一項之方法，其中該冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
- 如請求項90之方法，其中該冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟之該第一期間係在一段5天、6天或7天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟之該第二期間係在一段7天、8天或9天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約14天至約16天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約15天至約16天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約14天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約15天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟係在一段約16天的期間內實施。
- 如請求項1至92中任一項之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程以冷凍保存該經收集之治療性TIL族群之步驟，其中該初始第一擴增至該收集該治療性TIL族群及冷凍保存之步驟係於16天或少於16天內實施。
- 如請求項1至101中任一項之方法，其中收集該治療性TIL族群之步驟所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
- 如請求項102之方法，其中對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
- 如請求項1至103中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
- 如請求項1至103中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項1至103中任一項之方法，其中獲自該快速第二擴增步驟之該第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該初始第一擴增步驟之該第二TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
- 如請求項1至106中任一項之方法，其中來自該收集該治療性TIL族群之步驟之該治療性TIL族群係輸注至病患。
- 如請求項1或2或5或6之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程將步驟(f)之包含該經收集之TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟。
- 如請求項1或2或5或6之方法，其中使用呈1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基以實施該冷凍保存過程。
- 如請求項1或2或5或6之方法，其中該抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項110之方法，其中該PBMC經照射且為同種異體。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(e)之該收集係使用基於膜之細胞處理系統實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(e)之該收集係使用LOVO細胞處理系統實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(c)之該多個片段包含每第一氣體可通透性表面區域約60個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
- 如請求項116之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(d)之該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
- 如請求項122之方法，其中該冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
- 如請求項123之方法，其中該冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(c)之該第一期間及步驟(c)之該第二期間各自個別地在一段5天、6天或7天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(c)之該第一期間在一段5天、6天或7天的期間內實施。
- 如請求項1之方法，其中步驟(d)之該第二期間在一段7天、8天或9天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(c)之該第一期間及步驟(c)之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約14天至約16天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約15天至約16天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約14天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約15天的期間內實施。
- 如請求項1或2或6或7之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約16天的期間內實施。
- 如請求項133之方法，其中步驟(a)至(f)及冷凍保存在16天或少於16天內實施。
- 如請求項1至134中任一項之方法，其中步驟(f)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
- 如請求項135之方法，其中對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
- 如請求項1至136中任一項之方法，其中步驟(c)之該容器係大於步驟(b)之該容器。
- 如請求項1至137中任一項之方法，其中步驟(d)中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
- 如請求項1至138中任一項之方法，其中步驟(d)中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項1至139中任一項之方法，其中獲自步驟(d)之該第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(c)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
- 如請求項1至140中任一項之方法，其中來自步驟(f)之該TIL係輸注至病患。
- 一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含: (a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群； (c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少50倍； (d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中添加至該快速第二擴增之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群； (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋；及 (g) 投予治療有效劑量的來自步驟(f)之該TIL至該個體。
- 如請求項142之方法，其中足夠對步驟(g)所投予之治療有效劑量的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
- 如請求項142或143之方法，其中該PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
- 如請求項142至144中任一項之方法，其中步驟(b)之該選擇包含下列步驟:(i)使該第一TIL族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合，(ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體，及(iii)實施基於該螢光團之流式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL族群。
- 如請求項145之方法，其中該單株抗PD-1 IgG4抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)或其變體、片段或接合物。
- 如請求項146之方法，其中該抗IgG4抗體係抗人IgG4選殖株HP6023選殖株。
- 如請求項147之方法，其中該抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
- 如請求項145至148中任一項之方法，其中在步驟(g)投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該病患投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
- 如請求項151之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
- 如請求項145至150中任一項之方法，其進一步包含始於步驟(g)之投予該TIL細胞至該病患之後當天使用高劑量IL-2方案以治療該病患的步驟。
- 如請求項151之方法，其中該高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
- 如請求項145至152中任一項之方法，其中步驟(c)中該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
- 如請求項145至153中任一項之方法，其中步驟(d)中該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
- 如請求項145至154中任一項之方法，其中獲自步驟(d)之該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(c)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係黑色素瘤。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係HNSCC。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係子宮頸癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係NSCLC。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係神經膠母細胞瘤(包括GBM)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係胃腸道癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係高突變癌症。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症係小兒高突變癌症。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該容器係GREX-10。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該密閉容器包含GREX-100。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該密閉容器包含GREX-500。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該個體先前已經接受抗PD-1抗體的治療。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該個體先前未曾接受抗PD-1抗體的治療。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係選自藉由實施使該第一TIL族群與抗PD-1抗體接觸以形成該抗PD-1抗體與該第一TIL族群中之TIL細胞之第一複合物之步驟且接著實施單離該第一複合物之步驟以獲得該富含PD-1之TIL族群的該第一TIL族群。
- 如請求項165之方法，其中該抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在單離該第一複合物之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中單離該第一複合物之步驟係藉由單離該第二複合物實施。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體係選自由下列所組成之群組:EH12.2H7、PD1.3.1、M1H4、尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(pembrolizumab)(來伯里茲單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人化抗PD-1抗體JS001 (ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042 (Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(Pidilizumab)(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317 (BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210 (ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810 (Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)、人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)及RMP1-14(大鼠IgG) - BioXcell cat# BP0146。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體係EH12.2H7。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體與尼沃魯單抗或派姆單抗結合不同之表位。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體與EH12.2H7或尼沃魯單抗結合相同之表位。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中用於步驟(b)之該選擇之該抗PD-1抗體係尼沃魯單抗。
- 如請求項1至177中任一項之方法，其中該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸來選擇，且其中該第二抗PD-1抗體不被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
- 如請求項1至177之方法，其中該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸來選擇，且其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
- 如請求項1至177中任一項之方法，其中該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由實施使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸以形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL族群之第一複合物之步驟且接著實施單離該第一複合物以獲得該富含PD-1之TIL族群之步驟而選擇，其中該第二抗PD-1抗體不被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該第一TIL族群結合。
- 如請求項1至177之方法，其中該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在單離該第一複合物之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該第一抗PD-1抗體之該Fc區及該第二抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且其中單離該第一複合物之步驟係藉由單離該第二複合物實施。
- 如請求項1至177中任一項之方法，其中該個體先前已經接受第一抗PD1抗體的治療，其中在步驟(b)中，該PD-1陽性TIL係藉由實施使該第一TIL族群與第二抗PD-1抗體接觸以形成該第二抗PD-1抗體與該第一TIL族群之第一複合物之步驟來選擇，其中該第二抗PD-1抗體被該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體阻斷與該PD-1陽性TIL結合，其中該第一抗PD-1抗體及該第二抗PD-1抗體包含Fc區，其中在形成該第一複合物之步驟之後且在獲得該富含PD-1之TIL族群之步驟之前，該方法進一步包含使該第一複合物與抗Fc抗體接觸之步驟，該抗Fc抗體與該第二抗PD-1抗體之該Fc區結合以形成該抗Fc抗體與該第一複合物之第二複合物，且使該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體與該抗Fc抗體接觸以形成該抗Fc抗體與該第一TIL族群上不經溶解之該第一抗PD-1抗體之第三複合物，且實施單離該第二及第三複合物之步驟以獲得該富含PD-1之TIL族群。
- 一種自選自病患之腫瘤組織的PD-1陽性細胞所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效及/或增加的干擾素-γ產生。
- 如請求項183之治療性TIL族群，其提供增加的干擾素-γ產生。
- 如請求項183或184之治療性TIL族群，其提供增加的療效。
- 如請求項183至185中任一項之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
- 如請求項183至186中任一項之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16至22天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中自該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群包含自第一TIL族群選擇至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之TIL族群。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中步驟之該選擇包含下列步驟: (i)使該第一TIL族群及PBMC族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合， (ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體， (iii)基於如螢光激活細胞分選(FACS)所實施之該第一TIL族群中該PD-1陽性TIL之該螢光團的強度相較於該PBMC族群的強度以獲得該富含PD-1之TIL族群。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在該第一族群及該PBMC族群兩者中的該螢光團的強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應PD-1陰性TIL、PD-1中度TIL及PD-1陽性TIL之低、中及高強度水準。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中該PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中至少80%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。
- 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含: (a) 藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b) 自(a)之該第一TIL族群選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL族群，其中至少10%至80%範圍之該第一TIL族群係PD-1陽性TIL； (c) 藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該富含PD-1之TIL族群以實施初始第一擴增而產生第二TIL族群，其中該初始第一擴增在包含第一氣體可通透性表面區域的容器中實施，其中該初始第一擴增實施約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群； (d) 藉由額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基以實施快速第二擴增而產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增實施約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中在包含第二氣體可通透性表面區域的容器中實施該快速第二擴增； (e) 收集獲自步驟(d)之該治療性TIL族群；及 (f) 將來自步驟(e)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
- 如請求項194之方法，其中步驟(b)之該選擇包含下列步驟: (i)使該第一TIL族群及PBMC族群暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該單株抗PD-1 IgG4抗體經由在PD-1 IgV結構域外的N端環與PD-1結合， (ii)添加過量之與螢光團接合之抗IgG4抗體， (iii)基於如螢光激活細胞分選(FACS)所實施之該第一TIL族群中該PD-1陽性TIL之該螢光團的強度相較於該PBMC族群的強度以獲得該富含PD-1之TIL族群。
- 如請求項194至195中任一項之方法，其中在該第一族群及該PBMC族群兩者中的該螢光團的強度係用於設定FACS圈選以建立分別對應PD-1陰性TIL、PD-1中度TIL及PD-1陽性TIL之低、中及高強度水準。
- 如請求項194至196中任一項之方法，其中該FACS圈選係在步驟(a)之後設定。
- 如請求項194至197中任一項之方法，其中該PD-1陽性TIL係高PD-1 TIL。
- 如請求項194至198中任一項之方法，其中至少80%之該富含PD-1之TIL族群係PD-1陽性TIL。
- 如請求項194至199中任一項之方法，其中該第三TIL族群在該容器中包含至少約1 x 108 個TIL。
- 如請求項194至200中任一項之方法，其中該第三TIL族群在該容器中包含至少約1 x 109 個TIL。
- 如請求項194至201中任一項之方法，其中在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約1×104 至約1×106 個。
- 如請求項194至202中任一項之方法，其中在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約5×104 至約1×106 個。
- 如請求項194至203中任一項之方法，其中在該初始第一擴增中富含PD-1之TIL的數量係約2×105 至約1×106 個。
- 如請求項194至204中任一項之方法，其進一步包含在實施步驟(a)之前冷凍保存來自該個體所切除的該腫瘤之該第一TIL族群之步驟。
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