TWI833719B - 來自細針抽吸物及小活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞（ｔｉｌ）擴增 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供從含有少量TIL之細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片擴增TIL族群之方法，包括在較短的時間期間在導致改善TIL的表型及增加代謝健康的密閉系統中使用在本文中揭示之方法。
Description
本案係關於來自細針抽吸物及小活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療大體積、難治性癌症對於預後不良病患代表一種強大的治療方案。Gattinoni,et al.
,Nat. Rev. Immunol.
2006,6,
383-393。成功免疫療法需要大量的TIL，而商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增的技術、後勤及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2的TIL擴增然後「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al.
,Science
2002,298,
850-54; Dudley,et al.
,J. Clin.Oncol.
2005,23,
2346-57；Dudley,et al.
,J. Clin.Oncol.
2008,26,
5233-39; Riddell,et al.
,Science
1992,257,
238-41; Dudley,et al.
,J. Immunother.
2003,26,
332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如
，200倍)的經輻照的通常來自多個供體之異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量的IL-2。Dudley,et al., J. Immunother.
2003,26,
332-42。經歷REP程序的TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤病患中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受參數依賴TIL之組成的讀數(例如
，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的TIL製造過程受限於TIL如何自病患獲得。在一些當腫瘤太小或位於腫瘤切除不可行的位置之情況下，仍需要其他獲得TIL以用於擴增及治療的方法。本發明藉由提供用於自含有少量TIL之細針抽吸物(FNA)或核心針吸活體組織切片擴增TIL之方法，以及在治療方法中使用這些擴增TIL來符合此需求。
本發明提供用於擴增自細針抽吸物或核心活體組織切片單離之TIL及產生治療性TIL族群的改良及/或縮短方法。
本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i)自病患的腫瘤的至少一種細針抽吸物(FNA)或至少一種小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約10天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增。
如請求項1或2之方法，其中在步驟(iii)後，將該等細胞自該細胞培養移除且在執行步驟(iv)之前冷凍保存於儲存介質中。
在一些實施態樣中，該等細胞在執行步驟(iv)之前解凍。
在一些實施態樣中，步驟(iv)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約17天至約24天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約18天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約20天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約22天之內執行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(iv)之該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
在一些實施態樣中，該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該等PBMC係於步驟(ii)之第3至12天中任一天及/或步驟(iii)之第11至14天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中步驟(iv)之該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該病患先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養來自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片之第一TIL族群來執行第一擴增以獲得第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(ii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增步驟。
在一些實施態樣中，將來自步驟(ii)之該細胞培養基之該等細胞移走且在步驟(iii)之前冷凍保存於儲存介質中。
在一些實施態樣中，該等細胞在步驟(iii)之前解凍。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(iii)之該額外的第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該病患先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(ii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(i)從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv)投予治療有效劑量的該第三TIL族群至該病患。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增步驟。
在一些實施態樣中，在步驟(ii)後，將該等細胞自該細胞培養基移走且在步驟(iv)之前冷凍保存於儲存介質中。
在一些實施態樣中，該等細胞在步驟(iv)之前解凍。
在一些實施態樣中，步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
本發明亦提供一種如請求項50至66中任一項之方法，其中該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(i)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養來自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片之第一TIL族群來執行第一擴增以獲得第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；
(ii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iii)投予治療有效劑量的該治療性TIL族群至該病患。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增步驟。
在一些實施態樣中，將來自步驟(ii)之該細胞培養基之該等細胞移走且在步驟(iii)之前冷凍保存於儲存介質中。
在一些實施態樣中，該等細胞在步驟(iii)之前解凍。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(ii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b) 將該第一族群加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增步驟。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含使用冷凍保存過程將步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施態樣中，該冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對CS10介質執行。
在一些實施態樣中，該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該等PBMC經輻照且為異體的。
在一些實施態樣中，該等PBMC係於步驟(c)之第3至12天中任一天及/或步驟(d)之第3至12天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞(aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施態樣中，步驟(c)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(d)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(a)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(a)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(e)之該收集使用LOVO細胞處理系統執行。
在一些實施態樣中，該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施態樣中，步驟(f)之該輸注袋係HypoThermosol輸注袋。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約17天至約24天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約18天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在一段約20天至約22天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)至(f)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
在一些實施態樣中，步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致增加每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係於步驟(d)之該第二期間添加至該等TIL而無需打開該系統。
在一些實施態樣中，該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，獲自該第三TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
在一些實施態樣中，微生物污染之風險相較於開放系統減少。
在一些實施態樣中，來自步驟(g)之該等TIL係輸注至病患。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(a) 從自個體所切除的腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b) 將該第一族群加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3天至約14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 可選地使用冷凍保存過程將步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存；及
(h) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該病患。
在一些實施態樣中，步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對步驟(h)之投予治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL。
在一些實施態樣中，步驟(ii)之該包含IL-2之細胞培養基進一步包含OKT-3且並非在第1至3天中任一天可選地補充OKT-3，且其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟且步驟(ii)係快速第二擴增步驟。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群係輸注至病患。
在一些實施態樣中，步驟(c)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(d)之該第二擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
在一些實施態樣中，步驟(a)之該FNA包含至少400,000個TIL。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
在一些實施態樣中，該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
在一些實施態樣中，該FNA使用25至18號針頭獲得。
在一些實施態樣中，步驟(i)之該等TIL獲自小活體組織切片。
在一些實施態樣中，該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
在一些實施態樣中，對步驟(h)之投予治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施態樣中，該等PBMC係於步驟(c)之第3至12天中任一天及/或步驟(d)之第3至12天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，在步驟(h)之投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該病患投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)。
在一些實施態樣中，該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含始於步驟(h)之向該病患投予該等TIL細胞之後當天使用高劑量IL-2方案(regimen)治療該病患的步驟。
在一些實施態樣中，該高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在一些實施態樣中，該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a)從病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)、小活體組織切片、核心活體組織切片(core biopsy)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行預備性第一擴增而產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行約1至14天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(c)藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至約14天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(d)收集步驟(c)之該治療性TIL族群。
在一些實施態樣中，該第一期間係約6至12天。
在一些實施態樣中，該第二期間係約6至12天。
在一些實施態樣中，該第一期間係選自由下列所組成之群組：5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。
在一些實施態樣中，該第二期間係選自由下列所組成之群組：5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。
在一些實施態樣中，該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，步驟(b)使用之APC對步驟(c)使用之APC的比例係約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1、或較佳地約1比2。
在一些實施態樣中，該第一TIL族群獲自核心活體組織切片。
在一些實施態樣中，該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤:黑色素瘤腫瘤、卵巢癌腫瘤、子宮頸癌腫瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤、肺癌腫瘤、膀胱癌腫瘤、乳癌腫瘤、來自由人乳突瘤病毒所造成的癌症之腫瘤、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))腫瘤、神經膠質母細胞瘤腫瘤、胃腸道癌症腫瘤及腎癌腫瘤。
本發明亦提供組成物，其包含使用如本文所述之方法擴增的TIL。
在一些實施態樣中，該組成物進一步包含冷凍保存劑。
在一些實施態樣中，該冷凍保存劑包含二甲亞碸。
在一些實施態樣中，該組成物進一步包含冷凍保存劑及等張劑。
在一些實施態樣中，該組成物進一步包含：包含二甲亞碸之冷凍保存劑及包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉之等張劑。
在一些實施態樣中，該組成物進一步包含：包含二甲亞碸及葡聚糖40之冷凍保存劑及包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉之等張劑。
在一些實施態樣中，該組成物包含提供於無菌輸注袋中之TIL。
序列表簡單說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係重組人IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6係重組人IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係重組人IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8係重組人IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9係人4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係鼠類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab) (PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:12係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:13係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:14係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:15係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:16係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:17係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:18係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:19係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:20係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:21係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab) (BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:22係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:23係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:24係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:25係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:26係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:27係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:28係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:29係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:30係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:31係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:32係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:33係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:34係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:35係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:36係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:37係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:38係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:39係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:40係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:41係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:42係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:43係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:44係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:45係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:46係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:47係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:54係人OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:57係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:58係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:59係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:60係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:61係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:62係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:63係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:64係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:65係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:66係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:67係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:68係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:69係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:70係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:71係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:72係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:73係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:74係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:75係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:76係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:77係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:78係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:79係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:80係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:81係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:82係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:83係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:84係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:85係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:86係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:102係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:103係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:104係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:117係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:118係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:119係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:120係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:121係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:122係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:123係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:124係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
I.介紹
利用快速擴增規程(REP)離體(ex vivo
)培養之TIL的過繼性細胞療法已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤病患中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的REP規程對於將被輸注至病患的TIL之健康少有深入了解。T細胞從它們的初始狀態(naïve)到效應T細胞的成熟過程期間經歷重大代謝偏移(見Chang,et al.
,Nat. Immunol.
2016,17,
364，特此明白將全文併入，且特別是關於厭氧及有氧代謝之標誌的討論)。例如，初始T細胞依賴粒線體呼吸來產生ATP，然而成熟、健康的效應T細胞諸如TIL具有高度醣解性，依賴有氧醣解作用來提供它們增生、遷移、活化及抗腫瘤療效所需的生物能基質。
先前文獻報告，在TIL轉移之前限制醣解作用及促進粒線體代謝是所欲的，因為高度依賴醣解作用的細胞在過繼性轉移時將經歷營養素剝奪，此可導致大部分轉移細胞死亡。因此，先前技術揭示促進粒線體代謝可能促進體內(in vivo
)壽命且事實上建議在誘導免疫反應之前使用醣解作用抑制劑。見Chang et al. (Chang,et al.
,Nat. Immunol.
2016, 17(364)。
本發明在一些實施態樣中進一步關於用於評估及定量此代謝健康增加的方法。因此，本發明提供測定TIL族群相對健康之方法，使用一或多種常規代謝評估，包括但不限於醣解作用的速率及量、氧化磷酸化、備用呼吸量(SRC)及醣解儲備。
另外，本發明在一些實施態樣中進一步關於用於評估及定量此代謝健康增加的方法。因此，本發明提供測定TIL族群相對健康之方法，使用一或多種常規代謝評估，包括但不限於醣解作用的速率及量、氧化磷酸化、備用呼吸量(SRC)及醣解儲備。
此外，可選的額外評估包括但不限於ATP產生、粒線體質量及葡萄糖攝取。
II.定義
用語「體內(in vivo
)」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「體外(in vitro
)」係指發生在個體身體以外的事件。體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球的一細胞族群，這些細胞離開個體的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL(bulk TIL)及擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106
至1×1010
，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108
個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109
至1.5×1010
個用於輸注的細胞族群。
在本文中「小活體組織切片(small biopsy)」包括核心活體組織切片、穿孔活體組織切片及類似物。任何小活體組織切片包括例如體積小於約1 mm3
、2 mm3
、約5 mm3
、約10 mm3
、約25 mm3
、約50 mm3
、或約100 mm3
或截面積小於約1 mm2
、2 mm2
、約5 mm2
、約10 mm2
、約25 mm2
、約50 mm2
、或約100 mm2
的任何活體組織切片。小活體組織切片亦可包括採集自身體相同或多個位置的多個活體組織切片，包括來自轉移性疾病中的不同癌性病灶。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的冷凍保存TIL(thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL族群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至病患的溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106
至1×1010
，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108
個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109
至1.5×1010
個用於輸注的細胞族群。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人中為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7hi
)及CD62L(CD62hi
)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞」係指人或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo
)且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo
)。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至病患為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC是一種抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞係經輻照的異體周邊血液單核細胞。
用語「周邊血液淋巴細胞」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施態樣中，PBL係自供體的全血或血球分離產物分離。在一些實施態樣中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+CD45+的T細胞表型)來自供體的全血或血球分離產物分離。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人、人化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為目標的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人、人化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3(30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如Nelson,J. Immunol.
2004,172,
3983-88及Malek,Annu.Rev. Immunol.
2008,26,
453-79，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人IL-2)係非糖基化人重組形式的IL-2，分子量大約為15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214(可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2配方係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)幫手T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir. Res.
2001,2,
66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1
。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall,Blood
2002,99,
3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri,Blood
2001,97,
14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard,Nat. Rev. Drug.Disc.
2014,13,
379-95，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。IL-21主要由天然殺手T細胞及活化的人CD4+
T細胞產生。重組人IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及病患(個體)病況差異判定。通常說明本文所述之包含基因修飾的細胞毒性淋巴細胞的醫藥組成物可以104
至1011
細胞/kg體重(例如
105
至106
、105
至1010
、105
至1011
、106
至1010
、106
至1011
、107
至1011
、107
至1010
、108
至1011
、108
至1010
、109
至1011
或109
至1010
細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。基因修飾的細胞毒性淋巴細胞組成物亦可以這些劑量投予多次。基因修飾的細胞毒性淋巴細胞可使用在免疫療法中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberget al.
,New Eng. J. of Med.
319: 1676, 1988)。對特定病患而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測病患的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病(hematological malignancy、hematologic malignancy)」或有相關意義之用語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「細針抽吸物(fine needle aspirate)」或FNA係指一種活體組織切片程序，其可用於取樣或診斷程序，包括腫瘤取樣，其中採集樣本但不移除或切除腫瘤。在細針抽吸中，將中空針頭(例如25至18號)插入腫瘤或含有腫瘤的區域，且獲得流體及細胞(包括組織)以用於進一步分析或如本文所述之擴增。進行FNA時，細胞係經移走且不保留組織細胞的組織學結構。FNA可包含TIL。在一些例子中，細針抽吸活體組織切片係使用超音波引導細針抽吸活體組織切片針頭執行。FNA針頭可購自Becton Dickinson, Covidien及類似者。
用語「核心活體組織切片(core biopsy)」或「核心針吸活體組織切片(core needle biopsy)」係指一種活體組織切片程序，其可用於取樣或診斷程序，包括腫瘤取樣，其中採集樣本但不移除或切除腫瘤。在核心活體組織切片中，將中空針頭(例如16至11號)插入腫瘤或含有腫瘤的區域，且獲得流體及細胞(包括組織)以用於進一步分析或如本文所述之擴增。進行核心活體組織切片時，細胞可在保留一些組織細胞的組織學結構下移走，因為其相較於FNA有較大的針頭大小。核心活體組織切片針頭通常是能夠保留至少一些部分的腫瘤組織學結構的號規大小。核心活體組織切片可包含TIL。在一些例子中，核心針吸活體組織切片係使用可購自Bard Medical, Becton Dickinson及類似者之活體組織切片儀器、真空輔助核心針吸活體組織切片儀器、立體定位引導核心針吸活體組織切片儀器、超音波引導核心針吸活體組織切片儀器、MRI引導核心針吸活體組織切片儀器執行。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。獲自液體腫瘤之TIL(包括在周邊血液循環之液體腫瘤)在本文中亦稱為PBL。用語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且只有細胞衍生出自之組織類型的差別。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz,et al., Cancer Res.,
2012,72,
2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
在一實施態樣中，本發明包括用殘餘TIL (rTIL)族群治療癌症之方法，其中病患在根據本發明輸注rTIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一些實施態樣中，rTIL族群可具備正常新生TIL(emigrant TIL, eTIL)族群，其中病患在根據本發明輸注rTIL及eTIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(rTIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(rTIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及rTIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施態樣在導入本發明之rTIL之前，對病患進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施態樣中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於個體中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二或更多種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(體外或體內)或所欲治療之個體及疾病病況(例如個體的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括:(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展或進展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二或更多個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施態樣中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考抗體的胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
用語「體內(in vivo
)」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「體外(in vitro
)」係指發生在個體身體以外的事件。體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球的一細胞族群，這些細胞離開個體的血流且遷移至腫瘤中。TIL包括但不限於CD8+
細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+
T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自病患組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮收集(freshly harvested)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL、擴增TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)定義，或可藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療(effect treatment)的能力之功能性定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入病患體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TILS可進一步藉由效力表徵-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TILS可被認為有效。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106
至1×1010
，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108
個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109
至1.5×1010
個用於輸注的細胞族群。
用語「醫藥上可接受之鹽」係指衍生自所屬技術領域中已知之多種有機及無機反離子之鹽。醫藥上可接受之酸加成鹽可由無機酸及有機酸形成。可衍生出鹽之較佳無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸及磷酸。可衍生出鹽之較佳有機酸包括例如乙酸、丙酸、甘醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、桂皮酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸及柳酸。醫藥上可接受之鹼加成鹽可由無機及有機鹼形成。可衍生出鹽之無機鹼可包括例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳及鋁。可衍生出鹽之有機鹼包括例如一級、二級及三級胺、經取代的胺包括天然發生之經取代的胺、環狀胺及鹼性離子交換樹脂。特定實例包括異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺及乙醇胺。在一些實施態樣中，醫藥上可接受之鹼加成鹽係選自銨、鉀、鈉、鈣及鎂鹽。用語「共晶體(cocrystal)」係指衍生自所屬技術領域中已知之一些共晶體形成劑的分子複合物。不像鹽，共晶體一般不涉及共晶體與藥物之間的氫轉移，而是涉及晶體結構中之共晶體形成劑與藥物之間的分子間交互作用諸如氫鍵結、芳環堆疊或分散力。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散介質、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習用醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所包含之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、配方、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、配方、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施態樣可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施態樣中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。
III.TIL製造過程-過程2A(第2代過程)
稱為過程2A的例示性TIL過程及含有一些這些特徵的小活體組織切片過程係描繪於圖7，且本發明之此實施態樣的一些優於過程1C的優點係描述於圖5及6。過程2A之實施態樣係顯示於圖1。另外，例示性核心活體組織切片過程之概覽以及其與過程2A之比較係提供於圖7。過程2A(第2代)、使用來自過程2A之TIL的治療方法及過程2A製備之TIL的組成物可搭配小活體組織切片核心活體組織切片且視需要調整擴增期期限以達成所需之細胞計數使用，如本文以下及本申請案全文提供。
如本文中所討論，本發明可包括關於再刺激冷凍保存的TIL的步驟，以增加彼等的代謝活性及因此在移植至病患中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自病患樣本且經操作以在移植至病患中之前擴增彼等之數量。在一些實施態樣中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。
在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至病患中之前增加彼等之代謝。
在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增(包括稱為REP前之過程以及圖7步驟A所示之過程)係1至19天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖7步驟B所示之過程)縮短為11至14天。在一些實施態樣中，如實例所討論及圖4、5及7所示的，第一擴增(例如，圖7步驟B所描述之擴增)係分成1至2天及3至19天、或在一些情況下1至2天及3至10天的二個期間，且第二擴增(例如，圖7步驟D所描述之擴增)係11至14天。在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增與第二擴增(例如，如圖7步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合縮短為22天。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖7。以下及圖7中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。
A.步驟A：獲得病患腫瘤樣本
一般來說，TIL最初藉由核心活體組織切片或類似程序獲自病患腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數。
病患腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由外科切除、核心活體組織切片、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。在一些實施態樣中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之單一腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之一、二、三或四個腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施態樣中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施態樣中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
一般來說，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。在某些實施態樣中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施態樣中，如果腫瘤係轉移性且原發病灶已在過去有效地治療/移除，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施態樣中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮膚病灶或頸部或腋域淋巴結。在一些實施態樣中，移除皮膚病灶或移除彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，移除淋巴結或彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，可採用肺或肝臟轉移性病灶或腹部內或胸部淋巴結或彼等之小活體組織切片。
在一些實施態樣中，腫瘤係黑色素瘤。在一些實施態樣中，黑色素瘤的小活體組織切片包含黑痣或其一部分。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得且移除一片圓形皮膚。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且連同小邊緣的正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分的黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且切開式活體組織切片係於其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係肺活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。通常，支氣管鏡檢是在病患麻醉下，使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入枝氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施態樣中，其中腫瘤或生長無法經由支氣管鏡檢達到，可以採用經胸針吸活體組織切片。通常，經胸針吸活體組織切片也是在病患麻醉下，將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施態樣中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如，使用x光或CT掃描引導針頭)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經內視鏡超音波(例如，附燈的內視鏡經口放入食道)獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係頭頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片，其中從外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施態樣中，如果異常區域容易接近，樣本採集可不需要住院。在一些實施態樣中，如果腫瘤在口或咽喉內較深之處，活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭從腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑部位。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡之附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於活體組織切片一小部分的子宮頸表面。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術移除較大片的子宮頸組織。在一些實施態樣中，錐狀活體組織切片除了幫助確診之外，錐狀活體組織切片可作為初始治療。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組:子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
在一些實施態樣中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、核心活體組織切片、小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)獲得。在一些實施態樣中，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有1或2個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 100。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 500。
FNA可獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施態樣中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)病患的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC病患先前已經歷外科治療。
本文所述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用從18號針頭到25號針頭範圍之細號規針頭自病患獲得或單離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施態樣中，來自病患之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施態樣中，本文所述之TIL係獲自核心活體組織切片樣本。在一些情況下，核心活體組織切片樣本係使用從11號針頭到16號針頭範圍之外科或醫用針頭自病患獲得或單離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施態樣中，來自病患之核心活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施態樣中，TIL不是獲自腫瘤消化物。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施態樣中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶介質後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再孵養30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施態樣中，細胞可在樣本收集後可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖7中例示。
B.步驟B：第一擴增
在一些實施態樣中，本方法提供獲得年輕TIL，該年輕TIL在投予至個體/病患後能夠增加複製循環且因此相較於較老TIL(即在投予至個體/病患之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia,et al.
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, J Immunother, 31:742-751 (2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段:V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖A中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程1C之方法(如在圖E及/或圖F所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在例如諸如圖7步驟A所述獲得小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤片段(其可稱為「核心」或「片段」)後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將腫瘤消化物孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常3至14天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養7至14天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至149天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養約3至19天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，IL-2包括在第一擴增的第1至2天期間且OKT3及餵養細胞在第一擴增的第3天添加。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至19天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至18天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至17天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至16天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至15天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至14天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至13天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至12天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至11天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至10天。在一些實施態樣中，OKT3及餵養細胞包括在第3至9天。在一較佳實施態樣中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖7步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數表徵。
在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養板(Corning Incorporated, Corning, NY))的實施態樣中，各孔可接種1×106
個小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤細胞或一個小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤片段於含IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)的2 mL完全培養基(CM)中。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2
氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106
存活小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤細胞或5至30個小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤片段於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2
的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數介質。
在收集小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤片段後，將所得細胞(即片段)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將腫瘤片段孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞族群存在下)及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常10至14天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，在第一擴增期間的生長介質包含IL-2或其變體。在一些實施態樣中，該IL係重組人IL-2(rhIL-2)。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有4至8×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有5至7×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有6×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液係如實例4所述製備。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。例如，第二TIL族群之細胞培養基補充有:OKT3、IL-15、OX40促效性抗體、4-1BB促效性抗體、OKT3與IL-15之組合、OKT3與OX40促效性抗體之組合、OKT3與4-1BB促效性抗體之組合、IL-15與OX40促效性抗體之組合、IL-15與4-1BB促效性抗體之組合、OX40促效性抗體與4-1BB促效性抗體之組合、OKT3、IL-15與OX40促效性抗體之組合、OKT3、IL-15與4-1BB促效性抗體之組合、OKT3、OX40促效性抗體與4-1BB促效性抗體之組合、IL-15、OX40促效性抗體4-1BB促效性抗體之組合、OKT3、IL-15、OX40促效性抗體與4-1BB促效性抗體之組合及彼等之任何組合。在一些實施態樣中，不包括IL-15。
在例如諸如圖7A步驟A所述獲得小活體組織切片、核心活體組織切片或細針抽吸物腫瘤片段後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將腫瘤片段孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至19天)，導致到至少第11天至第19天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至18天，導致到至少第18天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至17天，導致到至少第17天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至16天，導致到至少第16天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至15天，導致到至少第15天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至14天，導致到至少第14天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至13天，導致到至少第13天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至12天，導致到至少第12天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，將此初代細胞族群培養1至11天，導致到至少第11天至少5×107
(即5千萬)個TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，到第一擴增步驟結束時(例如諸如該些圖7步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)，TIL族群係至少約5×107
個(即5千萬)個TIL細胞。
在一較佳實施態樣中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖7步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數表徵。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2
氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中，各培養瓶裝載1至2個活體組織切片核心於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆孵養於37℃下5% CO2
的增濕孵養箱中，在培養起始後5天，將半數介質移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第2天後，每2至3天更換半數介質。在一些實施態樣中，當核心活體組織切片係來自卵巢腫瘤(例如卵巢來源)時，核心係孵養於CM及IL-2中1至2天。在一些實施態樣中，當核心活體組織切片係來自胰腫瘤細胞(例如胰來源)時，核心係孵養於CM及IL-2/IL-15/IL-21中1至2天。在一些實施態樣中，在第3天時，將OKT3及餵養細胞添加至核心。在一些實施態樣中，在第3天時，將30 ng OKT3及106
個餵養細胞添加至核心。
將小活體組織切片片段或核心在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施態樣中，將小活體組織切片片段或核心孵養於2 mL孔中的包含去活化人AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞族群存在下)及6000 IU/mL IL-2的介質中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至19天)，導致在第11天時至少約5×107
個TIL細胞，且在一些實施態樣中，在第19至28天時1×108
個TIL的主體TIL族群。在一些實施態樣中，在第一擴增期間的生長介質包含IL-2或其變體。在一些實施態樣中，該IL係重組人IL-2 (rhIL-2)。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL- 2儲備溶液具有4至8×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有5至7×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL- 2儲備溶液具有6×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液係如實例E所述製備。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，當核心係來自胰腫瘤(例如胰來源)時，包括IL-15。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，當核心係來自胰腫瘤(例如胰來源)時，包括IL-21。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基不包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施態樣中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2
氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施態樣中。在一些實施態樣中，CM係實例(見實例1)中所述的CM1。在一些實施態樣中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。
在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖7步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程係約1至19天(足以獲得5×107
(即5千萬)個TIL的時間期間)，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖7步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)被分成二期:1至2天及3至19天，如圖7及38中提供。在一些實施態樣中，步驟B的第一擴增被分成二期:1至2天(用IL-2或IL2/IL-15/IL-21培養)及3至19天(用OKT3及餵養細胞培養)，如圖7及38中提供。
在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、14天、14天、14天、14天、14天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行12天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行13天至19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行16天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行17天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行18天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行19天，以獲得至少5×107
(即5千萬)個TIL。在一些實施態樣中，小活體組織切片(例如，核心活體組織切片)在約第1、2或3天自培養移走。在一些實施態樣中，小活體組織切片(例如，核心活體組織切片)在第3天自培養移走。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第一擴增期間，包括例如在根據圖7步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖7步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，IL-15及/或IL-21在第1天添加。在一些實施態樣中，如果核心活體組織切片係來自胰腫瘤(例如胰來源)，IL-15及/或IL-21在第1天添加。在一些實施態樣中，不包括IL-15。在一些實施態樣中，不包括IL-21。在一些實施態樣中，不包括IL-15及IL-21。
在一些實施態樣中，第一擴增(例如根據圖7之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施態樣中，第一TIL擴增產製至少50×106
個TIL，例如50×106
(即5×107
)、55×106
、60×106
、65×106
、70×106
、75×106
、80×106
、85×106
、90×106
、95×106
、100×106
、105×106
、110×106
、115×106
、120×106
、125×106
、150×106
、200×106
、300×106
、400×106
或更多個。
C.步驟C：第一擴增至第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自第一擴增的主體TIL族群包括例如獲自例如圖7所示之步驟B的TIL族群可使用本文以下討論的規程立即冷凍保存。替代地，獲自第一擴增的TIL族群(稱為第二TIL族群)可進行第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增)且接著如以下討論進行冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，第一TIL族群(有時稱為主體TIL族群)或第二TIL族群(其在一些實施態樣中可包括稱為REP TIL族群的族群)可在擴增之前或在第一擴增之後且在第二擴增之前經受基因修飾以用於合適治療。
在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖7所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施態樣中，獲自第一擴增(例如圖7所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行第二擴增。在一些實施態樣中，獲自第一擴增的TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天或19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約3天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約4天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約4天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約7天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約10天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約11天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約12天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約13天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約14天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約15天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約16天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約17天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約18天至19天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約10天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約11天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約12天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約13天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約14天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約15天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約16天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約17天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約18天發生。在一些實施態樣中，從第一擴增轉變至第二擴增在核心添加至第一擴增之培養基後約19天發生。
在一些實施態樣中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施態樣中，在如圖7所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施態樣中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施態樣中，來自第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行第二擴增而無轉變期。
在一些實施態樣中，從第一擴增至第二擴增的轉變(例如根據圖7之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
D.步驟D：第二擴增
在一些實施態樣中，TIL細胞族群於數量上在收集及初始主體處理(例如圖7所示之步驟A及步驟B)及轉變(稱為步驟C)之後擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(REP；如圖7步驟D所示之過程)的擴增過程。第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。
在一些實施態樣中，TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖7步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施態樣中，第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖7步驟D所示之過程)執行。例如，TIL可在介白素2 (IL-2)或介白素15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如約30 ng/mL的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1:26-35(27 L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的癌症相同抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經輻照的自體淋巴細胞或用經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施態樣中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施態樣中，第二擴增在經輻照的自體淋巴細胞或經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。在一些實施態樣中，13×106
個餵養細胞在第二擴增期間添加。在一些實施態樣中，13×106
個餵養細胞在第二擴增開始時添加。
在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT3抗體。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖7步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖7步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施態樣中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施態樣中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施態樣中，第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充第二擴增之TIL族群(有時稱為第二TIL族群)之細胞培養基來執行。例如，第二擴增之TIL族群之細胞培養基補充有IL-15、OX40促效性抗體、4-1BB促效性抗體、IL-15與OX40促效性抗體之組合、IL-15與4-1BB促效性抗體之組合、OX40促效性抗體與4-1BB促效性抗體之組合、IL-15、OX40促效性抗體與4-1BB促效性抗體之組合及彼等之任何組合。在一些實施態樣中，當核心係來自卵巢腫瘤(例如卵巢來源)時，包括OX40。在一些實施態樣中，OKT-3在第一及/或第二擴增期間添加。在一些實施態樣中，OKT-3在第3天連同抗原呈現餵養細胞(APC)添加。在一些實施態樣中，當樣本係來自FNA時，OKT-3在第1天連同抗原呈現餵養細胞(APC)添加。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。置換介質(通常經由抽吸新鮮介質置換2/3介質)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括GREX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)係11至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第二擴增係11天。在一些實施態樣中，第二擴增係12天。在一些實施態樣中，第二擴增係13天。在一些實施態樣中，第二擴增係14天。
在一實施態樣中，REP及/或第二擴增可使用T-175培養瓶及如先前描述之氣體可通透袋子(Tran,et al.
,J. Immunother.
2008,31,
742-51; Dudley,et al.
,J. Immunother.
2003,26,
332-42)或氣體可通透培養器皿(G-Rex培養瓶)執行。在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係於T-175培養瓶中執行，且可將懸浮於150 mL的介質中之約1×106
TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可培養於CM及AIM-V介質的1比1混合物中，補充有每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3。T-175培養瓶可在37℃下在5% CO2
中孵養。一半的介質可在第5天使用含有每mL 3000 IU的IL-2之50/50介質交換。在一些實施態樣中，在第7天可將來自二個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中並將300 mL含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2之AIM V添加至300 ml的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量每天或每二天計算一次，且添加新鮮介質以保持細胞計數介於0.5與2.0×106
個細胞/mL之間。
在一實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖7步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106
或10×106
TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3(OKT3)之50/50介質中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2
中孵養。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm (491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2之新鮮介質再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。當TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-Rex 100培養瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL之含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2
中孵養，且在4天之後可將150 mL之含有每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶。細胞可在培養的第11天收集。細胞可在培養的第12天收集。細胞可在培養的第13天收集。細胞可在培養的第14天收集。在一些實施態樣中，培養係在G-Rex 500中擴增。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合。在一些實施態樣中，進行置換介質直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施態樣中，藉由抽吸新鮮介質置換掉2/3的介質。在一些實施態樣中，替代性生長室包括GRex培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍(trypan blue)排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施態樣中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施態樣中，存活性係根據細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
在一些實施態樣中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前描述之T-175培養瓶及氣體可通透袋子(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH,et al.
, 2008,J Immunother.
, 31:742-751及Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE,et al.
2003,J Immunother.
, 26:332-342)或氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施態樣中，第二擴增係於T-175培養瓶中執行，且約1×106
TIL懸浮於150 mL的介質中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經輻照(50 Gy)的異體PBMC以1比100的比例培養，且將細胞培養於補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之CM與AIM-V介質的1比1混合物(50/50介質)中。T-175培養瓶在37℃下在5% CO2
中孵養。在一些實施態樣中，一半的介質在第5天使用含有3000 IU/mL的IL-2之50/50介質更換。在一些實施態樣中，在第7天將來自2個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中，並將300 mL含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2之AIM-V添加至300 mL的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量可每天或每二天計算一次，且可添加新鮮介質以保持細胞計數介於約0.5與約2.0×106
個細胞/mL之間。在一些實施態樣中，培養係在G-Rex 500中擴增。
在一些實施態樣中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm2
氣體可通透矽底之培養瓶(G-Rex100, Wilson Wolf)中執行(圖1)，將約5×106
或10×106
個TIL與經輻照的異體PBMC以1至100的比例培養於400 mL的補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之50/50介質中。G-Rex100培養瓶在37℃下在5% CO2
中孵養。在一些實施態樣中，在第5天將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm(491 xg)下離心10分鐘。接著可將TIL團塊用150 mL的含有3000 IU/mL的IL-2之新鮮50/50介質再懸浮，並添加回原始G-Rex100培養瓶。在將TIL在G-Rex100培養瓶中連續擴增的實施態樣中，在第7天將各G-Rex100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的介質中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-Rex100培養瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL之含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex100培養瓶在37℃下在5% CO2
中孵養，且在4天之後將150 mL之含有3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex100培養瓶。細胞在培養的第14天收集。在一些實施態樣中，培養係在G-Rex 500中擴增。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施態樣中，第二擴增(例如根據圖7之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
1.餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序(例如包括諸如該些圖7步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，異體PBMC係經由輻照或熱處理去活化，且如實例(特別是實例4)所述用於REP程序，其提供用於評估輻照異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施態樣中，如果第14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。見例如實例3及/或4。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。見例如實例3及/或4。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在5至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在10至50 ng/mL OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在20至40 ng/mL OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施態樣中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由輻照或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在例如圖7中所述之例示性程序。
在一實施態樣中，在第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。
E.步驟E：收集TIL
在第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施態樣中，在例如圖7所提供之一、二、三、四或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施態樣中，在例如圖7所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施態樣中，使用自動化系統收集TIL。
在一些實施態樣中，收集(例如根據圖7之步驟E)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
F.步驟F：最終調配/轉移至輸注袋
在如圖7以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至病患。在一些實施態樣中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至病患。
在一實施態樣中，使用本揭露之過程擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用過程擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。
在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑之組成物投予。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予，該冷凍保存劑包含二甲亞碸，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予，該冷凍保存劑包含二甲亞碸及葡聚糖40，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為於無菌輸注袋中遞送之組成物投予，該等組成物進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物，該冷凍保存劑包含二甲亞碸及葡聚糖40，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。
1.醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施態樣中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用過程擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施態樣中，合適劑量需要治療足夠數量的TIL。在一些實施態樣中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施態樣中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7.8×1010
個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、1.25%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。
IV.TIL製造過程-第3代過程
在不受任何特定理論限制下，據信如本發明之一些方法所述之預備(獲自供體腫瘤核心或片段的)T細胞的活化之預備性第一擴增，隨後加強T細胞的活化之快速第二擴增，允許製備保留「較年輕」表型之經擴增的T細胞，且因此預期本發明之經擴增的T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞可對癌細胞展現較高細胞毒性。特別是，據信如本發明之方法所教示之藉由暴露至抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及可選地抗原呈現細胞(APC)來預備T細胞的活化且接著藉由後續暴露至額外的抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC來加強，限制或避免培養中T細胞的成熟，產生具有較不成熟表型的T細胞族群，該等T細胞較不因培養擴增而耗竭且對癌細胞展現較高細胞毒性。因此，在一些實施態樣中，本發明提供擴增TIL之方法，該方法包含：(a)藉由培養獲自供體腫瘤核心或片段的第一T細胞族群以致效生長及預備第一T細胞族群的活化來執行第一T細胞族群的預備性第一擴增；(b)在步驟(a)所預備的第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養第一T細胞族群以致效生長及加強第一T細胞族群的活化來執行第一T細胞族群的快速第二擴增，以獲得第二T細胞族群；及(c)收集第二T細胞族群。第3代過程、使用來自第3代過程之TIL的治療方法及第3代製備之TIL的組成物可搭配小活體組織切片/核心活體組織切片且視需要調整擴增期期限以達成所需之細胞計數使用，如本文以下及本申請案全文提供。
在一些實施態樣中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模垂直擴大(scaling up):(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效小規模培養中的T細胞轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的T細胞約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大(scaling out):(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的T細胞部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約5天。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化開始降低、趨緩、衰退或消退之後執行。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約(at or about) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至100%的範圍中之百分比之後執行。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%的範圍中之百分比之後執行。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之後執行。
在一些實施態樣中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低至多在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。
在一些實施態樣中，藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化的降低係藉由T細胞因應抗原刺激所釋放之干擾素γ的量之減少來判定。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約7天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約11天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的快速第二擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約11天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約9天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞的預備性第一擴增係於7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於9天的期間執行。
在一些實施態樣中，T細胞是腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
在一些實施態樣中，T細胞是骨髓浸潤淋巴細胞(MIL)。
在一些實施態樣中，T細胞係獲自罹癌供體。
在一些實施態樣中，T細胞係獲自罹癌病患腫瘤核心活體組織切片或細針抽吸物的TIL。
在一些實施態樣中，T細胞係獲自血液惡性病病患骨髓的MIL。
在一些實施態樣中，供體罹患癌症。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，供體罹患腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係液體腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施態樣中，供體罹患血液惡性病。
含有一些這些特徵之稱為過程3(在本文中亦稱為第3代)的例示性TIL過程係描繪於圖85(特別是例如圖85B)，且本發明之此實施態樣的一些優於過程2A的優點係描述於圖1、2、30及31(特別是例如圖85B)。過程3的二個實施態樣顯示於圖1及30(特別是例如圖85B)。過程2A或第2代亦描述於美國專利公開案2018/0280436，其全文以引用方式併入本文中。第3代過程亦描述於USSN 62/755,954 (2018年11月5日提出)(116983-5045-PR)。
如本文中所討論及大致概述的，TIL係取自病患樣本且使用本文所述且稱為第3代之TIL擴增過程操作以在移植至病患中之前擴增彼等之數量。在一些實施態樣中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。在一些實施態樣中，TIL可在擴增之前或之後經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至病患中之前增加彼等之代謝。
在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖85(特別是圖85B)步驟B所示之過程)縮短為1至7天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖85(特別是圖85B)步驟D所示之過程)縮短為1至9天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(例如，圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之擴增)縮短為7天且快速第二擴增(例如，圖85(特別是例如圖85B)步驟D所述之擴增)係7至9天。在一些實施態樣中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增與快速第二擴增(例如，如圖85(特別是例如圖85B)步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合係14至16天。特別是，所考慮的是本發明之某些實施態樣包含預備性第一擴增步驟，其中TIL藉由在IL-2存在下暴露至抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露至抗原來活化。在某些實施態樣中，如上述在預備性第一擴增步驟中被活化的TIL係第一TIL族群，即初代細胞族群。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖85 (特別是例如圖85B)的非限制性實例且參照本文所述之某些非限制性實施態樣。以下及圖85(特別是例如圖85B)中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。
在一些實施態樣中，如果腫瘤係轉移性且原發病灶已在過去有效地治療/移除，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施態樣中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮膚病灶或頸部或腋域淋巴結。在一些實施態樣中，移除皮膚病灶或移除彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，移除淋巴結或彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，可採用肺或肝臟轉移性病灶或腹部內或胸部淋巴結或彼等之小活體組織切片。
在一些實施態樣中，腫瘤係黑色素瘤。在一些實施態樣中，黑色素瘤的小活體組織切片包含黑痣或其一部分。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得且移除一片圓形皮膚。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且連同小邊緣的正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分的黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且切開式活體組織切片係於其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係肺活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。通常，支氣管鏡檢是在病患麻醉下，使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入支氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施態樣中，其中腫瘤或生長無法經由支氣管鏡檢達到，可以採用經胸針吸活體組織切片。通常，經胸針吸活體組織切片也是在病患麻醉下，將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施態樣中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如，使用x光或CT掃描引導針頭)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經內視鏡超音波(例如，附燈的內視鏡經口放入食道)獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係頭頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片，其中從外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施態樣中，如果異常區域容易接近，樣本採集可不需要住院。在一些實施態樣中，如果腫瘤在口或咽喉內較深之處，活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭從腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑部位。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡之附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於活體組織切片一小部分的子宮頸表面。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術移除較大片的子宮頸組織。在一些實施態樣中，錐狀活體組織切片除了幫助確診之外，錐狀活體組織切片可作為初始治療。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組:子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
在一些實施態樣中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、核心活體組織切片或小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)獲得。在一些實施態樣中，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有1或2個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 100。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 500。
FNA可獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施態樣中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)病患的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC病患先前已經歷外科治療。
本文所述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用從18號針頭到25號針頭範圍之細號規針頭自病患獲得或單離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施態樣中，來自病患之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施態樣中，本文所述之TIL係獲自核心活體組織切片樣本。在一些情況下，小活體組織切片或核心活體組織切片樣本係使用從11號針頭到16號針頭範圍之外科或醫用針頭自病患獲得或單離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施態樣中，來自病患之核心活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施態樣中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 µg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶介質後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再孵養30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施態樣中，細胞可在樣本收集後可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖85中例示。
A.步驟A：獲得病患腫瘤樣本
一般來說，TIL最初藉由核心活體組織切片或類似程序獲自病患腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數。
病患腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由外科切除、核心活體組織切片、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。在一些實施態樣中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之單一腫瘤的多個腫瘤樣本(諸如多個核心)。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之一、二、三或四個腫瘤的多個腫瘤樣本(諸如獲自轉移性疾病中之多個病灶的核心活體組織切片)。在一些實施態樣中，樣本可包含來自相同病患之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施態樣中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施態樣中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
如上所指示，在一些實施態樣中，TIL係衍生自實質腫瘤核心或片段。在一些實施態樣中，使實質腫瘤核心或片段如同全腫瘤般經受酶消化。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中消化。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施態樣中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2
下消化1至2小時。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2
、旋轉下消化1至2小時。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段在恆定旋轉下消化整夜。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段在37℃、5% CO2
、恆定旋轉下消化整夜。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。
在一些實施態樣中，TIL不是獲自腫瘤消化物。在一些實施態樣中，實質腫瘤核心未經碎斷。
在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段用冷凍乾燥酶於無菌緩衝劑中重構。在一些實施態樣中，緩衝劑係無菌HBSS。
在一些實施態樣中，酶混合物包含膠原酶。在一些實施態樣中，膠原酶係膠原酶IV。在一些實施態樣中，膠原酶的工作原液係100 mg/mL 10X工作原液。
在一些實施態樣中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施態樣中，DNA酶的工作原液係10,000IU/mL 10X工作原液。
在一些實施態樣中，酶混合物包含玻璃酸酶。在一些實施態樣中，玻璃酸酶的工作原液係10 mg/mL 10X工作原液。
在一些實施態樣中，酶混合物包含10 mg/mL膠原酶、1000 IU/mL DNA酶及1 mg/mL玻璃酸酶。
在一些實施態樣中，酶混合物包含10 mg/mL膠原酶、500 IU/mL DNA酶及1 mg/mL玻璃酸酶。
一般來說，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。在某些實施態樣中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施態樣中，TIL最初可自酶性腫瘤核心或片段消化物及獲自病患的腫瘤核心或片段培養。在一實施態樣中，TIL最初可自酶性腫瘤核心或片段消化物及獲自病患的腫瘤核心或片段培養。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤片段或核心消化物。在一些實施態樣中，腫瘤片段或核心消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤片段或核心放入酶介質後，可將腫瘤片段或核心機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再孵養30分鐘後，可將腫瘤片段或核心機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，如果腫瘤係轉移性且原發病灶已在過去有效地治療/移除，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施態樣中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮膚病灶或頸部或腋域淋巴結。在一些實施態樣中，移除皮膚病灶或移除彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，移除淋巴結或彼之小活體組織切片。在一些實施態樣中，可採用肺或肝臟轉移性病灶或腹部內或胸部淋巴結或彼等之小活體組織切片。
在一些實施態樣中，腫瘤係黑色素瘤。在一些實施態樣中，黑色素瘤的小活體組織切片包含黑痣或其一部分。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚獲得。在一些實施態樣中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得且移除一片圓形皮膚。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且連同小邊緣的正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分的黑痣或生長。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且切開式活體組織切片係於其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係肺活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。通常，支氣管鏡檢是在病患麻醉下，使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入枝氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施態樣中，其中腫瘤或生長無法經由支氣管鏡檢達到，可以採用經胸針吸活體組織切片。通常，經胸針吸活體組織切片也是在病患麻醉下，將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施態樣中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如，使用x光或CT掃描引導針頭)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經內視鏡超音波(例如，附燈的內視鏡經口放入食道)獲得。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係頭頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切開式活體組織切片，其中從外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施態樣中，如果異常區域容易接近，樣本採集可不需要住院。在一些實施態樣中，如果腫瘤在口或咽喉內較深之處，活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)。在一些實施態樣中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭從腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑部位。
在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡之附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於活體組織切片一小部分的子宮頸表面。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施態樣中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術移除較大片的子宮頸組織。在一些實施態樣中，錐狀活體組織切片除了幫助確診之外，錐狀活體組織切片可作為初始治療。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組:子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
在一些實施態樣中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、核心活體組織切片、小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)獲得。在一些實施態樣中，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有1或2個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 100。在一些實施態樣中，當有3、4、5、6、8、9或10或更多個核心活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 500。
FNA可獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施態樣中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)病患的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC病患先前已經歷外科治療。
本文所述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用從18號針頭到25號針頭範圍之細號規針頭自病患獲得或單離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施態樣中，來自病患之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施態樣中，本文所述之TIL係獲自核心活體組織切片樣本。在一些情況下，核心活體組織切片或小活體組織切片樣本係使用從11號針頭到16號針頭範圍之外科或醫用針頭自病患獲得或單離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施態樣中，來自病患之核心活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施態樣中，TIL係獲自腫瘤核心或片段消化物。在一些實施態樣中，腫瘤核心或片段消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 µg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶介質中孵養，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤核心或片段放入酶介質後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2
中再孵養30分鐘後，可將腫瘤核心或片段機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施態樣中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2
中孵養30分鐘。在一些實施態樣中，在最終孵養結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施態樣中，將預備性第一擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。
在一些實施態樣中，細胞可在樣本單離後(例如，在獲得腫瘤樣本後及/或自腫瘤樣本獲得細胞懸浮液後)可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖85(特別是例如圖85B)中例示。
B.步驟B:預備性第一擴增
在一些實施態樣中，本方法提供較年輕TIL，該較年輕TIL相較於較老TIL(即在投予至個體/病患之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia,et al.
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在例如諸如圖85(特別是例如圖85B)步驟A所述之分割或消化腫瘤片段及/或腫瘤核心之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、OKT-3及餵養細胞(例如抗原呈現餵養細胞)的血清中。在一些實施態樣中，IL-2、OKT-3及餵養細胞在培養起始時連同腫瘤消化物及/或腫瘤片段添加(例如在第0天)。在一些實施態樣中，腫瘤消化物及/或腫瘤片段以每容器至多60個片段及6000 IU/mL的IL-2孵養於容器中。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至7天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，預備性第一擴增發生1至7天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，此預備性第一擴增發生5至7天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，此預備性第一擴增發生約6至7天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，此預備性第一擴增發生約7天，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一較佳實施態樣中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的預備性第一擴增步驟(例如諸如該些圖85步驟B(特別是例如圖85B)中所述者，其可包括稱為REP前或預備性REP的過程且其從第0天及/或從培養起始含有餵養細胞)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的快速第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數表徵。在一些實施態樣中，腫瘤片段係介於約1 mm3
與10 mm3
之間。
在一些實施態樣中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 µg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。
在一些實施態樣中，有小於或等於240個腫瘤片段或核心。在一些實施態樣中，有小於或等於240個腫瘤片段或核心被放入小於或等於4個容器中。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，小於或等於60個腫瘤片段或核心被放入1個容器中。在一些實施態樣中，各容器包含每容器小於或等於500 mL的介質。在一些實施態樣中，介質包含IL-2。在一些實施態樣中，介質包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，介質包含抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在一些實施態樣中，介質包含每容器2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含OKT-3。在一些實施態樣中，介質包含每容器30 ng/mL的OKT-3。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，介質包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。
在製備腫瘤片段或核心後，將所得細胞(即，其係來自片段或核心且其構成初代細胞族群)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、抗原呈現餵養細胞及OKT-3的介質中且其允許從第0天培養起始開始TIL預備及加速生長。在一些實施態樣中，腫瘤片段或核心消化物及/或腫瘤片段或核心係與6000 IU/mL的IL-2以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3一起孵養。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至7天)，導致通常約1×108
個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施態樣中，在預備性第一擴增期間的生長介質包含IL-2或其變體以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3。在一些實施態樣中，該IL-2係重組人IL-2(rhIL-2)。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20至30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有20×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有25×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液的1 mg小瓶具有30×106
IU/mg的比活性。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有4至8×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有5至7×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液具有6×106
IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施態樣中，IL-2儲備溶液係如實例C所述製備。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於15 ng/ml與30 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含30 ng/mL的OKT-3抗體。在一些實施態樣中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約6000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施態樣中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施態樣中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 µg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在一些實施態樣中，CM係實例中所述的CM1，見實例1及14。在一些實施態樣中，預備性第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為餵養細胞)。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係1至7天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係2至7天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係3至7天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係4至7天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係5至7天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係6至7天。在一些實施態樣中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖85(特別是例如圖85B)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係7天。
在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行1天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行2天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行3天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行4天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行5天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行6天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行1天至10天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行2天至10天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行3天至10天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行4天至7天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行5天至10天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行6天至10天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行8天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行9天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行10天。在一些實施態樣中，小活體組織切片(例如，核心活體組織切片)在約第1、2或3天自培養移走。在一些實施態樣中，小活體組織切片(例如，核心活體組織切片)在第3天自培養移走。
在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行8天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行9天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行10天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行11天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行12天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行13天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行14天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行15天至17天。在一些實施態樣中，預備性第一TIL擴增在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行16天至17天。
在一些實施態樣中，TIL的預備性第一擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行1天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行2天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行3天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行4天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行5天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行6天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至10天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行7天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天。
在一些實施態樣中，TIL的預備性第一擴增可進行8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天或17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行8天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行9天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行10天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行11天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行12天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行13天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行14天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行15天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行16天至17天。在一些實施態樣中，第一TIL擴增可進行17天。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在預備性第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在預備性第一擴增期間，包括例如在根據圖85(特別是例如圖85B)步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在預備性第一擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖85(特別是例如圖85B)步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增(例如根據圖85(特別是例如圖85B)之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用生物反應器。在一些實施態樣中，採用生物反應器作為容器。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-10。
1.餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖85(特別是例如圖85B)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時及預備性第一擴增期間需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施態樣中，預備性第一擴增期間使用2.5×108
個餵養細胞。在一些實施態樣中，預備性第一擴增期間使用每容器2.5×108
個餵養細胞。在一些實施態樣中，預備性第一擴增期間使用每GREX-10 2.5×108
個餵養細胞。在一些實施態樣中，預備性第一擴增期間使用每GREX-100 2.5×108
個餵養細胞。
一般來說，異體PBMC係經由輻照或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估輻照異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施態樣中，如果第14天存活細胞總數小於在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在5至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在10至50 ng/mL OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在20至40 ng/mL OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在25至35 ng/mL OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增程序需要約2.5×108
個餵養細胞對約100×106
個TIL的比例。在另一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增程序需要約2.5×108
個餵養細胞對約50×106
個TIL的比例。在又一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108
個餵養細胞對約25×106
個TIL。在又一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108
個餵養細胞。在又一實施態樣中，預備性第一擴增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用於快速第二擴增的餵養細胞數量。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增之介質包含IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增之介質包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，預備性第一擴增之介質包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，預備性第一擴增之介質包含每容器2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，預備性第一擴增之介質包含OKT-3。在一些實施態樣中，介質包含每容器30 ng的OKT-3。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，介質包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器每2.5×108
個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 ug的OKT-3。在一些實施態樣中，介質包含每容器500 mL的培養基及15 ug的OKT-3。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，介質包含500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、15 ug的OKT-3及2.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器每2.5×108
個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 ug的OKT-3。
在一實施態樣中，本文所述之預備性第一擴增程序在第二擴增期間需要多於TIL的過量餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施態樣中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由輻照或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施態樣中，在預備性第一擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。
2.細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的預備性第一擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。
C.步驟C:預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自預備性第一擴增(其可包括有時稱為REP前的擴增)的主體TIL族群包括例如獲自例如圖85(特別是例如圖85B)所示之步驟B的TIL族群可經受快速第二擴增(其可包括有時稱為快速擴增規程(REP)之擴增)且接著如以下討論冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，來自預備性第一擴增之經擴增的TIL族群或來自快速第二擴增之經擴增的TIL族群可在擴增步驟之前或在預備性第一擴增之後且在快速第二擴增之前經受基因修飾以用於合適治療。
在一些實施態樣中，獲自預備性第一擴增(例如圖85(特別是例如圖85B)所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施態樣中，獲自預備性第一擴增(例如圖85(特別是例如圖85B)所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行快速第二擴增。在一些實施態樣中，獲自預備性第一擴增的TIL在預備性第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在腫瘤核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約2天、3天、4天、5天、6天或7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約3天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約4天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約5天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約6天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後約7天發生。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、至多10天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後1天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後2天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後3天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後4天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後5天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後6天至7天發生。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變在核心或片段添加至細胞培養後及/或第一預備性擴增步驟起始後7天發生。
在一些實施態樣中，TIL在初級(primary)第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行快速第二擴增(例如在一些實施態樣中，在如圖85(特別是例如圖85B)所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施態樣中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施態樣中，來自預備性第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行快速第二擴增而無轉變期。
在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變(例如根據圖85(特別是例如圖85B)之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用單一生物反應器。在一些實施態樣中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施態樣中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。在一些實施態樣中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變涉及容器大小的規模擴大。在一些實施態樣中，預備性第一擴增係於比起快速第二擴增較小的容器中執行。在一些實施態樣中，預備性第一擴增係於GREX-100中執行且快速第二擴增係於GREX-500中執行。
D.步驟D:快速第二擴增
在一些實施態樣中，TIL細胞族群在如圖85所示(特別是例如圖85B)之收集及預備性第一擴增(步驟A及步驟B)及稱為步驟C之轉變之後於數量上進一步擴增。此進一步擴增在本文中稱為快速第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(快速擴增規程或REP；如圖85(特別是例如圖85B)步驟D所示之過程)的擴增過程。快速第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。在一些實施態樣中，在快速第二擴增起始後1天、2天、3天或4天(即整體第3代過程的第8、9、10或11天)，將TIL轉移至較大體積容器。
在一些實施態樣中，TIL的快速第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖85(特別是例如圖85B)步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約10天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約9天。在一些實施態樣中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約10天。
在一實施態樣中，快速第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖85(特別是例如圖85B)步驟D所示之過程)執行。在一些實施態樣中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)存在下擴增。在一些實施態樣中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞存在下擴增，其中將餵養細胞添加至最終濃度，該最終濃度是存在於預備性第一擴增中之餵養細胞濃度的兩倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在介白素2(IL-2)或介白素15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/mL的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35(27 L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的癌症相同抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經輻照的自體淋巴細胞或用經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施態樣中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施態樣中，第二擴增在經輻照的自體淋巴細胞或經輻照的HLA-A2+異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施態樣中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含介於30 ng/ml與60 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施態樣中，細胞培養基包含約30 ng/mL OKT-3。在一實施態樣中，細胞培養基包含約60 ng/mL OKT-3。在一些實施態樣中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含IL-2。在一些實施態樣中，介質包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含每容器7.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含OKT-3。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含每容器500 mL的培養基及30 ug的OKT-3。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及7.5×108
個抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 ug的OKT-3及7.5×108
個抗原呈現餵養細胞。
在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含IL-2。在一些實施態樣中，介質包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，介質包含每容器介於5×108
與7.5×108
個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含OKT-3。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含每容器500 mL的培養基及30 µg的OKT-3。在一些實施態樣中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及介於5×108
與7.5×108
個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，快速第二擴增之介質包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 µg的OKT-3及介於5×108
與7.5×108
個之間的抗原呈現餵養細胞。
在一些實施態樣中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施態樣中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施態樣中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖85(特別是例如圖85B)步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施態樣中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施態樣中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖85(特別是例如圖85B)步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施態樣中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈現餵養細胞及可選地TNFRSF促效劑的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施態樣中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施態樣中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施態樣中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施態樣中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施態樣中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施態樣中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施態樣中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比10、約1比15、約1比20、約1比25、約1比30、約1比35、約1比40、約1比45、約1比50、約1比75、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，REP及/或快速第二擴增係於培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2在150 ml介質中混合，其中餵養細胞細胞濃度是預備性第一擴增中之餵養細胞細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。置換介質(通常經由抽吸2/3用過的介質且用相等體積的新鮮介質置換來置換2/3介質)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施態樣中，快速第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)係7至10天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，快速第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)係7至9天，如實例及圖式中所討論。在一些實施態樣中，第二擴增係7天。在一些實施態樣中，第二擴增係8天。在一些實施態樣中，第二擴增係9天。在一些實施態樣中，第二擴增係10天。
在一實施態樣中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖85(特別是例如圖85B)步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106
或10×106
TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50介質中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2
中孵養。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm(491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 6000 IU的IL-2之新鮮介質再懸浮，並添加回原始GREX-100培養瓶。當TIL於GREX-100培養瓶中連續擴增時，在第10或11天可將TIL移至較大培養瓶，諸如GREX-500。細胞可在培養的第14天收集。細胞可在培養的第15天收集。細胞可在培養的第16天收集。在一些實施態樣中，進行置換介質直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施態樣中，藉由抽吸用過的介質且用相等體積的新鮮介質置換來置換掉2/3的介質。在一些實施態樣中，替代性生長室包括GREX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施態樣中，快速第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在快速第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施態樣中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施態樣中，存活性係根據標準細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段:V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR) β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施態樣中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施態樣中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 µg/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之7.5×108
個抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施態樣中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施態樣中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 µg/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之5×108
個抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施態樣中，快速第二擴增(例如根據圖85(特別是例如圖85B)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用生物反應器。在一些實施態樣中，採用生物反應器作為容器。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-500。
1.餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施態樣中，本文所述之快速第二擴增程序(例如包括諸如該些圖85(特別是例如圖85B)步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，異體PBMC係經由輻照或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估輻照異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施態樣中，如果第7或14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在60 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施態樣中，PBMC在30至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30至60 ng/mL OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30至60 ng/mL OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30至60 ng/mL OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施態樣中，PBMC在30至60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施態樣中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比10、約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施態樣中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108
個餵養細胞對約100×106
個TIL的比例。在一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108
個餵養細胞對約100×106
個TIL的比例。在另一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108
個餵養細胞對約50×106
個TIL的比例。在另一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108
個餵養細胞對約50×106
個TIL的比例。在又一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108
個餵養細胞對約25×106
個TIL。在又一實施態樣中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108
個餵養細胞對約25×106
個TIL。在又一實施態樣中，快速第二擴增需要快速第二擴增的兩倍數量的餵養細胞。在又一實施態樣中，當本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約5×108
個餵養細胞。在又一實施態樣中，當本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108
個餵養細胞時，快速第二擴增需要約7.5×108
個餵養細胞。在又一實施態樣中，快速第二擴增需要預備性第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數量的餵養細胞。
在一實施態樣中，本文所述之快速第二擴增程序在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施態樣中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施態樣中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。在一些實施態樣中，PBMC係以添加至預備性第一擴增之PBMC濃度的兩倍添加至快速第二擴增。
一般來說，異體PBMC經由輻照或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施態樣中，在快速第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。
2.細胞介素
本文所述之快速第二擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速第二擴增是額外可能的，如同大致上在WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施態樣中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。
E.步驟E：收集TIL
在快速第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施態樣中，在例如圖85(特別是例如圖85B)所提供之一、二、三、四或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施態樣中，在例如圖85(特別是例如圖85B)所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施態樣中，在例如圖85(特別是例如圖85B)所提供之二個擴增步驟(一個預備性第一擴增及一個快速第二擴增)之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施態樣中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施態樣中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施態樣中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施態樣中，快速第二擴增(例如根據圖85(特別是例如圖85B)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施態樣中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施態樣中，採用生物反應器。在一些實施態樣中，採用生物反應器作為容器。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施態樣中，所採用的生物反應器係G-REX-500。
在一些實施態樣中，根據圖85(特別是例如圖85B)之步驟E係根據本文所述之過程執行。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用本文所述的密閉系統。
在一些實施態樣中，根據本文所述之方法收集TIL。在一些實施態樣中，使用本文所述之方法收集介於第14與16天之間的TIL。在一些實施態樣中，使用本文所述之方法在14天收集TIL。在一些實施態樣中，使用本文所述之方法在15天收集TIL。在一些實施態樣中，使用本文所述之方法在16天收集TIL。
F.步驟F：最終調配/轉移至輸注袋
在如圖85(特別是例如圖85B)以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至病患。在一些實施態樣中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至病患。
在一實施態樣中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。如本文揭露擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，TIL係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。
在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑之組成物投予。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予，該冷凍保存劑包含二甲亞碸，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物投予，該冷凍保存劑包含二甲亞碸及葡聚糖40，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。在一實施態樣中，使用前述揭露之過程擴增之TIL可作為於無菌輸注袋中遞送之組成物投予，該等組成物進一步包含冷凍保存劑及等張劑之組成物，該冷凍保存劑包含二甲亞碸及葡聚糖40，該等張劑包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉。
G.PBMC餵養細胞比
在一些實施態樣中，用於本文所述之擴增方法(見例如圖85(特別是例如圖85B))的培養基包括抗CD3抗體例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如
Tsoukaset al.
,J. Immunol.
1985,135,
1719，全文特此以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，PBMC餵養細胞層的數量如下計算:
A. T細胞體積(直徑10 µm):V
=(4/3) πr3
=523.6 µm3
B. 具有40 µm(4個細胞)高度之G-Rex 100 (M)體積：V
=(4/3) πr3
=4×1012
µm3
C. 需要填滿B體積的細胞數量：4×1012
µm3
/523.6 µm3
=7.6×108
µm3
* 0.64=4.86×108
D. 可在4D空間中被最佳活化的細胞數量：4.86×108
/24= 20.25×106
E. 外推至G-Rex 500之餵養細胞及TIL數量：TIL:100×106
及餵養細胞:2.5×109
在此計算中，使用在具有100 cm2
基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數量。計算得到約5×108
的實驗結果為T細胞活化臨限，其密切反映NCI實驗資料。(1)
(C)乘數(0.64)是如Jaeger及Nagel在1992年計算的當量球體隨機填充密度(2)
。(D)除數24是4維空間中可接觸類似物體的當量球體數量「牛頓數」(3)
。(1)
Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment.J Immunother.2012 Apr; 35(3): 283-292.(2)
Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31.(3)
O. R. Musin (2003).“The problem of the twenty-five spheres”.Russ.Math.Surv.58 (4): 794-795.
在一實施態樣中，在預備性第一擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量大約是在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量的一半。在某些實施態樣中，方法包含在相較於快速第二擴增的細胞培養基包含大約50%較少抗原呈現細胞的細胞培養基中執行預備性第一擴增。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞(APC)數量大於預備性第一擴增期間外源供應的APC數量。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約2:1。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約4×108
個APC至在或約7.5×108
個APC的範圍。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約2×108
個APC至在或約2.5×108
個APC的範圍，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係選自在或約4.5×108
個APC至在或約5.5×108
個APC的範圍。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約2.5×108
個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約5×108
個APC。
在一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)數量係在預備性第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC數量的大約一半。在某些實施態樣中，方法包含在預備性第一擴增第0天添加抗原呈現細胞至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞的數量係在預備性第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加之抗原呈現細胞數量的大約50%。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量大於預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以選自在或約2×106
個APC/cm2
至在或約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
的密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至約6.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增外源供應的APC係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106
、1.1×106
、1.2×106
、1.3×106
、1.4×106
、1.5×106
、1.6×106
、1.7×106
、1.8×106
、1.9×106
、2×106
、2.1×106
、2.2×106
、2.3×106
、2.4×106
、2.5×106
、2.6×106
、2.7×106
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
或4.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106
個APC/cm2
、2.6×106
個APC/cm2
、2.7×106
個APC/cm2
、2.8×106
、2.9×106
、3×106
、3.1×106
、3.2×106
、3.3×106
、3.4×106
、3.5×106
、3.6×106
、3.7×106
、3.8×106
、3.9×106
、4×106
、4.1×106
、4.2×106
、4.3×106
、4.4×106
、4.5×106
、4.6×106
、4.7×106
、4.8×106
、4.9×106
、5×106
、5.1×106
、5.2×106
、5.3×106
、5.4×106
、5.5×106
、5.6×106
、5.7×106
、5.8×106
、5.9×106
、6×106
、6.1×106
、6.2×106
、6.3×106
、6.4×106
、6.5×106
、6.6×106
、6.7×106
、6.8×106
、6.9×106
、7×106
、7.1×106
、7.2×106
、7.3×106
、7.4×106
或7.5×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以選自在或約2×106
個APC/cm2
至在或約3×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以選自在或約4×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
的範圍之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以在或約2×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以在或約4×106
個APC/cm2
之密度接種於培養瓶中。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約2:1。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC(包括例如PBMC)。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約3.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約3.5×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約1×109
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約4×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約7.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約2×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約2.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係選自在或約4.5×108
個APC(包括例如PBMC)至在或約5.5×108
個APC(包括例如PBMC)的範圍。
在另一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約2.5×108
個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約5×108
個APC(包括例如PBMC)。
在一實施態樣中，在預備性第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)層數係在快速第二擴增第7天添加的APC(包括例如PBMC)層數的大約一半。在某些實施態樣中，方法包含在預備性第一擴增第0天添加抗原呈現細胞層至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞層至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞層的數量係在第7天添加之抗原呈現細胞層數量的大約50%。
在另一實施態樣中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數大於在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1個細胞層至在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層至在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、2或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:10的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:8的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:7的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:6的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:5的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:4的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:3的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:2的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.2至在或約1:8的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.3至在或約1:7的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.4至在或約1:6的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.5至在或約1:5的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.6至在或約1:4的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.8至在或約1:3的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係在或約1:2。
在另一實施態樣中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係選自在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
V.可選的細胞介質組分
1.抗CD3抗體
在過程2A的一些實施態樣中，用於本文所述之擴增方法(包括該些稱為REP者，見例如圖A)中之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如
Tsoukaset al.
,J. Immunol.
1985,135,
1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施態樣中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。
2.4-1BB (CD137)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係4-1BB (CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB黏連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al.
,PLOS One
2013,8,
e69677。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人化或全人單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al.
,Mol. Cancer Therapeutics
2013,12,
2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，4-1BB促效劑係由以高親和性及促效性活性與人4-1BB(SEQ ID NO:9)結合來表徵。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與人4-1BB(SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB(SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表DD中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD
結合人或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約7.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約8×105
l/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約8.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約9×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合、以約9.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合或以約1×106
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.1×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.2×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.3×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.4×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.5×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.6×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合或以約2.7×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.8×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合、以約2.9×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合或以約3×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50
與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(全人)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表EE所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之醣化位點；位於位置22至96(VH
-VL
)、143至199(CH
1-CL
)、256至316(CH
2)及362至420(CH
3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’至87’(VH
-VL
)及136’至195’(CH
1-CL
)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218至218、219至219、222至222及225至225、位於IgG2A/B異構體位置218至130、219至219、222至222及225至225、及位於IgG2B異構體位置219至130(2)、222至222及225至225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130至213’(2)、IgG2A/B異構體位置218至213’及130至213’及位於IgG2B異構體位置218至213’(2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al.
,Cancer Immunolog. & Immunother.
2012, 61,
1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
在較佳實施態樣中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人
TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人
(全人)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表EE所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298”)之N-醣化位點；位於位置22至95(VH
-VL
)、148至204(CH
1-CL
)、262至322(CH
2)及368至426(CH
3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、262”至322”及368”至426”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’(VH
-VL
)及136’至196’(CH
1-CL
)(及位於位置23”’至88”’及136”’至196”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227至227”及230至230”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135至216’及135”至216”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及特性係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al.
,Clin. Cancer Res.
2016,available at
http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係藥物管理機構參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組:1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物：
在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH
3及CH
2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH
及VL
鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories
, 2011,10
, 44; Ahmad,et al.
,Clin. & Dev. Immunol.
2012, 980250；Monnier,et al.
,Antibodies,
2013,2,
193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表GG中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域:烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表GG所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表II給出之VH
及VL
序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH
結構域連接至任何前述者之VL
結構域。
在一實施態樣中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施態樣中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。
3.OX40 (CD134)促效劑
在一實施態樣中，TNFRSF促效劑係OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施態樣中，OX40促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施態樣中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40黏連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係促效性抗OX40人化或全人單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施態樣中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al.
,J. Immunother.
2009,182,
1481-89。在一較佳實施態樣中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二或更多個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al.
,Mol. Cancer Therapeutics
2013,12,
2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al.
,Cancer Res.
2013,73,
7189-98。在一較佳實施態樣中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施態樣中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係由以高親和性及促效性活性與人OX40(SEQ ID NO:54)結合來表徵。在一實施態樣中，OX40促效劑係與人OX40(SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施態樣中，OX40促效劑係與鼠OX40(SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表11中。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD
結合人或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約7.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約8×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約8.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約9×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合、以約9.5×105
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合或以約1×106
1/M·s或更快之k締合
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.1×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.2×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.3×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.4×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.5×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.6×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合或以約2.7×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.8×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合、以約2.9×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合或以約3×10-5
1/s或更慢之k解離
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50
與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人
TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表KK所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301”之N-醣化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚醣；位於位置22至95 (VH
-VL
)、148至204(CH
1-CL
)、265至325 (CH
2)及371至429 (CH
3)(及位於位置22”至95”、148”至204”、265”至325”及371”至429”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’至88’(VH
-VL
)及134’至194’ (CH
1-CL
)(及位於位置23”’至88”’及134”’至194”’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230至230”及233至233”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224至214’及224”至214”’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。11D4之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表13所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。18D8之製備及特性係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu119-122之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表15所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu106-222之製備及特性係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表16所示。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施態樣中，OX40促效劑重鏈可變區(VH
)包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL
)包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH
及VL
區。在一實施態樣中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區。
在一實施態樣中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施態樣中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施態樣中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：醣化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施態樣中，生物類似物係經核准或申請核准之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之配方不同的配方，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可由藥物管理機構諸如美國FDA及/或歐盟的EMA核准。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施態樣中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
在一些實施態樣中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al.
,J. Immunother
.2006,29
, 575-585。在一些實施態樣中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc. (Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al.
,J. Immunother
. 2006,29
, 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施態樣中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施態樣中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體L106 (BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施態樣中，OX40促效劑包含抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施態樣中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施態樣中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括克隆20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之特性係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表GG中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施態樣，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施態樣。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域:塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表OO所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。在一實施態樣中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表17給出之VH
及VL
序列具有至少95%一致性之VH
及VL
區的scFv結構域，其中該VH
及VL
結構域藉由連接子連接。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施態樣中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH
結構域連接至任何前述者之VL
結構域。
在一實施態樣中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施態樣中，OX40促效劑係OX40促效性抗體克隆Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。
VI.可選的細胞存活性分析
可選地，在過程2A(第2代)或第3代過程第一擴增步驟B之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。其他用於測試存活性之測定可包括但不限於阿爾瑪藍測定及MTT測定。
1.細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在過程2A(第2代)或第3代的一些實施態樣中，測量細胞計數及/或存活性。標誌之表現(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文揭示或描述者)可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCantoTM
流動式細胞測量儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於該些可購自BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA)者)測量。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且存活性可使用任何所屬技術領域中已知之方法包括但不限於台盼藍染色評估。在過程2A(第2代)及/或第3代的一些實施態樣中，TIL在第一擴增、第二擴增、預備性第一擴增或快速第二擴增後展現增加的CD8+細胞。在過程2A(第2代)的一些實施態樣中，TIL在第一擴增及/或第二擴增後展現增加的CD8+細胞。在第3代的一些實施態樣中，TIL在預備性第一擴增或快速第二擴增後展現增加的CD8+細胞。
在一些情況下，主體TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可如以下討論進行REP且接著冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，主體或REP TIL族群可經受基因修飾以用於合適治療。
2.細胞培養
在一實施態樣中，用於擴增TIL之方法可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞介質、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞介質或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞介質。在一實施態樣中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞介質(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的介質的量及介質類型的數量。在一實施態樣中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地添加新鮮細胞培養基至細胞(亦稱為餵養細胞)。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質係未經過濾。使用未經過濾細胞介質可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施態樣中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞介質缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)。在一實施態樣中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)。在一實施態樣中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。在一實施態樣中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施態樣允許細胞族群自約5×105
個細胞/cm2
擴增至介於10×106
與30×106
個細胞/cm2
之間。在一實施態樣中，此擴增係於不添加新鮮細胞培養基至細胞(亦稱為餵養細胞)下進行。在一實施態樣中，只要GRex培養瓶中的介質位在約10 cm的高度，即不進行餵養。在一實施態樣中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施態樣中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與介質混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al.
,J. Immunotherapy,
2012, 35:283-292。
VII.擴增TIL的代謝健康
備用呼吸量(SRC)及醣解儲備可在用本文中揭示之方法擴增的TIL評估。海馬XF細胞粒線體壓力測試使用靶向粒線體電子傳遞鏈組分的呼吸調節劑，藉由直接測量細胞的氧消耗速率(OCR)來測量粒線體功能。連續注射測試化合物(寡黴素、FCCP及毒魚藤素與抗黴素A之混合物，描述於下)以分別測量ATP產生、最大呼吸及非粒線體呼吸。接著使用這些參數及基礎呼吸計算質子漏及備用呼吸量。各調節劑靶向電子傳遞鏈的特定組分。寡黴素抑制ATP合成酶(複合物V)且在注射寡黴素後的OCR降低與和細胞性ATP產生有關的粒線體呼吸相關。羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)是一種解偶劑，其瓦解質子梯度且破壞粒線體膜電位。結果，通過電子傳遞鏈的電子流未受抑制且氧被複合物IV最大限度地消耗。接著，可使用FCCP刺激之OCR來計算備用呼吸量，其被定義為最大呼吸和基礎呼吸之間的差異。備用呼吸量(SRC)為細胞對能量需求增加而作出反應之能力的測量。第三注射是毒魚藤素(複合物I抑制劑)與抗黴素A(複合物III抑制劑)之混合物。此組合關閉粒線體呼吸因而能夠計算由粒線體以外的過程驅動之非粒線體呼吸。
在一些實施態樣中，代謝測定係基礎呼吸。
一般來說，TIL具有的基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約50%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約60%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約70%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約80%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約90%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的約95%至約99%。在一些實施態樣中，TIL具有的基礎呼吸率與新鮮收集TIL之基礎呼吸率並無統計顯著差異。
在一些實施態樣中，代謝測定係備用呼吸量。
在一些實施態樣中，代謝測定係醣解儲備。在一些實施態樣中，代謝測定係備用呼吸量。為了測量細胞性(呼吸)代謝，將細胞用粒線體呼吸及醣解作用抑制劑處理，以判定由下列測量組成的TIL的代謝輪廓:基線氧化磷酸化(藉由OCR測量)、備用呼吸量、基線醣解活性(藉由ECAR測量)及醣解儲備。代謝輪廓使用海馬組合粒線體/醣解作用壓力測試測定(包括可購自Agilent®之套組)執行，其允許在阻斷粒線體ATP產生時判定細胞執行醣解作用的能力。在一些實施態樣中，使細胞處於葡萄糖飢餓，接著注射葡萄糖，隨後注射壓力劑。在一些實施態樣中，壓力劑係選自由寡黴素、FCCP、毒魚藤素、抗黴素A及/或2-去氧葡萄糖(2-DG)所組成之群組以及彼等之組合。在一些實施態樣中，寡黴素係以10 mM添加。在一些實施態樣中，FCCP係以10 mM添加。在一些實施態樣中，毒魚藤素係以2.5 mM添加。在一些實施態樣中，抗黴素A係以2.5 mM添加。在一些實施態樣中，2-去氧葡萄糖(2-DG)係以500 mM添加。在一些實施態樣中，測量醣解能力、醣解儲備及/或非醣解酸化。一般來說，TIL具有的醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約60%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約70%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約80%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約90%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約95%至約99%。
在一些實施態樣中，代謝測定係基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加至少二倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少7倍、至少八倍、至少九倍或至少十倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約十倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約八倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約三倍至約七倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約四倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約三倍的基礎醣解作用。
一般來說，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約60%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約70%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約80%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約90%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約95%至約99%。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的備用呼吸量與新鮮收集TIL之基礎呼吸率
並無統計顯著差異。
VIII.TIL的功能表徵
顆粒溶解酶B產生:顆粒溶解酶B是TIL殺死目標細胞的能力的另一種測量。如上述使用抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體再刺激之介質上清液的顆粒溶解酶B水準亦根據廠商說明使用人顆粒溶解酶B DuoSet ELISA套組(R & D Systems, Minneapolis, MN)評估。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加的顆粒溶解酶B產生。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加的細胞毒性活性。
在一些實施態樣中，端粒長度可用來作為細胞存活性及/或細胞性功能的測量。端粒長度測量：多種方法已用於測量基因體DNA及細胞學製劑的端粒長度。端粒限制片段(TRF)分析是測量端粒長度的黃金標準(de Langeet al.
, 1990)。然而，TRF的重大限制在於需要大量DNA (1.5 µg)。二種廣泛用於測量端粒長度的方法，也就是螢光原位雜交(FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)及定量PCR可為本發明所採用。在一些實施態樣中，如圖7中提供之步驟A最初收集的TIL與例如步驟D擴增的TIL之間並無端粒長度變化。
在一些實施態樣中，TIL健康係藉由IFN-γ分泌測量。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激的TIL介質中的細胞介素IFN-γ水準來測量。來自這些受刺激TIL之介質中的IFN-γ水準可使用測量IFN-γ釋放來判定。在一些實施態樣中，例如在圖7中提供之步驟D的TIL相較於例如在圖7中提供之步驟A的最初收集TIL之IFN-γ產生增加，指示步驟D TIL的細胞毒性潛力增加。
在一些實施態樣中，生物發光重定向裂解測定:根據TIL測定的生物發光重定向裂解測定(效力測定)，使用TIL與生物發光細胞系P815(殖株G6)之共培養測定來評估TIL裂解目標細胞的細胞毒性潛力，其以高度敏感劑量依賴性方式測量TIL細胞毒性。
在一些實施態樣中，本方法包括使用以上及本文描述之方法用於評估TIL存活性之測定，包括例如在實例及圖式中所述者。在一些實施態樣中，TIL的擴增如上所討論，包括例如圖7所提供者。在一些實施態樣中，TIL在評估存活性之前經冷凍保存。在一些實施態樣中，存活性評估包括在執行第一擴增、第二擴增及額外第二擴增之前解凍TIL。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與TIL族群存活性有關之用語的測定。存活性可藉由任何上述之TIL代謝測定以及任何所屬技術領域中已知用於評估細胞存活性之方法來測量。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與使用本文所述之方法(包括該些例示於圖7者)擴增之TIL的存活性有關之用語的測定。
在一些實施態樣中，代謝測定係基礎呼吸。一般來說，第二擴增TIL具有的基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約50%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約60%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約70%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約80%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約90%至約99%。在一些實施態樣中，基礎呼吸率是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的約95%至約99%。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的基礎呼吸率與2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率並無統計顯著差異。
一般來說，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約60%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約70%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約80%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約90%至約99%。在一些實施態樣中，備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約95%至約99%。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的備用呼吸量與2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
並無統計顯著差異。
一般來說，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的備用呼吸量是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，所測量的代謝測定係醣解儲備。在一些實施態樣中，代謝測定係備用呼吸量。為了測量細胞性(呼吸)代謝，將細胞用粒線體呼吸及醣解作用抑制劑處理，以判定由下列測量組成的TIL的代謝輪廓:基線氧化磷酸化(藉由OCR測量)、備用呼吸量、基線醣解活性(藉由ECAR測量)及醣解儲備。代謝輪廓使用海馬組合粒線體/醣解作用壓力測試測定(包括可購自Agilent®之套組)執行，其允許在阻斷粒線體ATP產生時判定細胞執行醣解作用的能力。在一些實施態樣中，使細胞處於葡萄糖飢餓，接著注射葡萄糖，隨後注射壓力劑。在一些實施態樣中，壓力劑係選自由寡黴素、FCCP、毒魚藤素、抗黴素A及/或2-去氧葡萄糖(2-DG)所組成之群組以及彼等之組合。在一些實施態樣中，寡黴素係以10 mM添加。在一些實施態樣中，FCCP係以10 mM添加。在一些實施態樣中，毒魚藤素係以2.5 mM添加。在一些實施態樣中，抗黴素A係以2.5 mM添加。在一些實施態樣中，2-去氧葡萄糖(2-DG)係以500 mM添加。在一些實施態樣中，測量醣解能力、醣解儲備及/或非醣解酸化。一般來說，TIL具有的醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是新鮮收集TIL之基礎呼吸率
的約60%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約70%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約80%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約90%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約95%至約99%。
在一些實施態樣中，代謝測定係基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加至少二倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少7倍、至少八倍、至少九倍或至少十倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約十倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約八倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約三倍至約七倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約四倍的基礎醣解作用。在一些實施態樣中，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有增加約二倍至約三倍的基礎醣解作用。
一般來說，第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖7步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)具有的醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約50%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約60%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約70%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約80%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約90%至約99%。在一些實施態樣中，醣解儲備是2A過程TIL(見例如圖7)之基礎呼吸率
的約95%至約99%。
顆粒溶解酶B產生:顆粒溶解酶B是TIL殺死目標細胞的能力的另一種測量。如上述使用抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體再刺激之介質上清液的顆粒溶解酶B水準亦根據廠商說明使用人顆粒溶解酶B DuoSet ELISA套組(R & D Systems, Minneapolis, MN)評估。
在一些實施態樣中，本方法提供使用上述方法用於評估TIL存活性的測定。在一些實施態樣中，TIL的擴增如上所討論，包括例如圖7所提供者。在一些實施態樣中，TIL在評估存活性之前經冷凍保存。在一些實施態樣中，存活性評估包括在執行第一擴增、第二擴增及額外第二擴增之前解凍TIL。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與TIL族群存活性有關之用語的測定。存活性可藉由任何上述之TIL代謝測定以及任何所屬技術領域中已知用於評估細胞存活性之方法來測量。在一些實施態樣中，本方法提供用於評估細胞增生、細胞毒性、細胞死亡及/或其他與使用本文所述之方法(包括該些例示於圖7者)擴增之TIL的存活性有關之用語的測定。
本發明亦提供用於判定TIL存活性之測定方法。本揭露提供藉由擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成為較大TIL族群而用於測定TIL存活性之方法，其包含：
(i)獲得先前已擴增之第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少100倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，且其中該第三族群經進一步存活性測定。在一些實施態樣中，該方法進一步包含：
(iv)藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的TIL族群，其中該較大的TIL族群包含相對於該第三TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，且其中該第三族群經進一步存活性測定。
在一些實施態樣中，在步驟(i)之前，細胞係經冷凍保存。
在一些實施態樣中，該等細胞在執行步驟(i)之前解凍。
在一些實施態樣中，重複步驟(iv)一至四次以獲得足夠的TIL以供分析。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約33天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約30天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約28天的期間之內執行。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(iii)或(iv)在約24天之內執行。
在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(iv)之該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施態樣中，該等PBMC係於步驟(iii)之第9至17天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，在步驟(iv)之較大TIL族群中的效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼高親和性T細胞受體之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，方法進一步包含用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸之表現載體轉導第一TIL族群之步驟，該嵌合抗原受體包含與T細胞傳訊分子之至少一個胞內域融合之單鏈可變片段抗體。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，在冷凍保存後及在步驟(iv)後測定TIL存活性。
在一些實施態樣中，本揭露提供一種治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：(i)從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片獲得第一TIL族群；(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(iv)投予治療有效劑量的該第三TIL族群至該病患。
根據本揭露，一種用於測定TIL存活性及/或投予至個體之進一步用途的方法。在一些實施態樣中，用於測定腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之方法包含：
(i)獲得第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少50倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群；
(iv)收集、洗滌及冷凍保存第三TIL族群；
(v)儲存冷凍保存TIL在冷凍溫度下；
(vi)解凍第三TIL族群以提供解凍的第三TIL族群；及
(vii)執行一部分解凍的第三TIL族群的額外第二擴增，其藉由將第三族群的細胞培養基補充IL-2、OKT-3及APC一段至少3天的reREP期間，其中執行第三擴增以獲得第四TIL族群，其中比較第四TIL族群中的TIL數量與第三TIL族群中的TIL數量以獲得比例；
(viii)基於步驟(vii)中的比例判定解凍的TIL族群是否適用於投予至病患；
(ix)當步驟(viii)中之第四TIL族群中的TIL數量對第三TIL族群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，投予治療有效劑量的解凍的TIL族群至病患。
在一些實施態樣中，reREP期間係執行直到第四TIL族群中的TIL數量對第三TIL族群中的TIL數量之比例大於50:1。
在一些實施態樣中，對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約21天至約33天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約21天至約30天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在一段約21天至約28天的期間之內執行。在一些實施態樣中，步驟(i)至(vii)在約24天之內執行。在一些實施態樣中，來自步驟(iii)或(vii)之該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。在一些實施態樣中，細胞是TIL。
在一些實施態樣中，該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，該等PBMC係於步驟(ii)之第3至12天中任一天及/或步驟(iii)之第11至14天中任一天添加至該細胞培養。
在一些實施態樣中，在步驟(iii)或(vii)之較大TIL族群中的效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
在一些實施態樣中，該等APC係人工APC (aAPC)。
在一些實施態樣中，轉導第一TIL族群之步驟用包含編碼高親和性T細胞受體之核酸之表現載體進行。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，轉導第一TIL族群之步驟用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸之表現載體進行，該嵌合抗原受體包含與T細胞傳訊分子之至少一個胞內域融合之單鏈可變片段抗體。
在一些實施態樣中，轉導步驟發生在步驟(i)之前。
在一些實施態樣中，在步驟(vii)後測定TIL存活性。
本揭露亦提供測定TIL之進一步方法。在一些實施態樣中，本揭露提供一種測定TIL之方法，其包含：
(i)獲得一部分的獲自核心活體組織切片樣本之第一冷凍保存TIL族群；
(ii)將該部分的第一冷凍保存TIL族群解凍；
(iii)執行第一擴增，其藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該部分的第一TIL族群一段至少3天的reREP期間，以產生第二TIL族群，其中比較來自第一TIL族群的該部分與第二TIL族群以獲得TIL數量的比例，其中第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群的該部分中的TIL數量的比例係大於5:1，其中第二TIL族群到約10天至約19天包含至少5×107
個TIL；
(iv)基於步驟(iii)中的比例及步驟(iii)中的TIL數量，判定第一TIL族群是否適用於治療性投予至病患；
(v)當步驟(iv)中之第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群中的TIL數量之比例判定為大於5:1，判定該第一TIL族群適用於治療性投予。
在一些實施態樣中，第二TIL族群中的TIL數量對第一TIL族群的該部分中的TIL數量之比例係大於50:1。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含根據本文提供之任何實施態樣所述之方法，執行來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL族群的擴增。
在一些實施態樣中，該方法進一步包含投予來自步驟(i)之整個第一冷凍保存TIL族群至病患。
IX.用於TIL製造的密閉系統
本發明提供在使用第2代過程或第3代過程的TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施態樣中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施態樣中，密閉系統包括魯爾鎖及熱封系統。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用密閉系統。在一些實施態樣中，將TIL調配到最終產物配方容器中。
在一些實施態樣中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到準備將TIL投予至病患或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施態樣中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施態樣中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之介質係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施態樣中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施態樣中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施態樣中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。
X.可選的TIL基因工程改造
在第2代或第3代過程的一些實施態樣中，本發明之擴增TIL在擴增步驟之前、之期間或之後包括在密閉、無菌製造過程期間經進一步操作，各提供於本文，以用暫時性方式改變蛋白質表現。在一些實施態樣中，暫時性改變的蛋白質表現是因為暫時性基因編輯。在一些實施態樣中，本發明之擴增TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施態樣中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供改變的腫瘤抗原表現及/或改變TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在某些實施態樣中，方法包含基因編輯TIL族群。在某些實施態樣中，方法包含基因編輯第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。
在一些實施態樣中，本發明包括經由核苷酸插入TIL族群之基因編輯，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA (siRNA)，以促進一或多個蛋白質的表現或抑制一或多個蛋白質的表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質的組合。
在一些實施態樣中，本發明之擴增TIL經歷蛋白質表現的暫時性改變。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖85(特別是圖85B)所示之步驟A的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增期間，包括例如在例如圖85(例如圖85B)所示之步驟B擴增的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之後，包括例如在第一至第二擴增之間轉變的TIL族群中(例如本文所述之第二TIL族群)、獲自例如圖85所示之步驟B且包括於步驟C之TIL族群。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖85所示之步驟C且在彼之步驟D擴增之前的TIL族群中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增期間，包括例如在例如圖85所示之步驟D擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)中。在一些實施態樣中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之後，包括例如在獲自例如圖85所示之步驟D擴增的TIL族群中。
在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括電穿孔的步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J.
1991,60,
297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括磷酸鈣轉染的步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面塗層及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology
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1987,7,
2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括脂質體轉染的步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N
-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n
,n
,n
-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體配方的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al.
,Biotechniques
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7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致幹記憶T細胞(TSCM)增加。TSCM是抗原經歷中央記憶T細胞的早期祖細胞。TSCM通常顯示定義幹細胞的長期存活、自我再生及多能能力，且通常為產製有效TIL產物之所欲。TSCM在過繼性細胞轉移的小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集增強的抗腫瘤活性(Gattinoniet al
. Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieriet al
. Blood 2013)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有包含高比例的TSCM之組成物的TIL族群。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIL族群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的TIL族群。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的治療性TIL族群。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施態樣中，回春包括例如增加增生、增加T細胞活化及/或增加抗原辨識。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現改變T細胞一大組份的表現，以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤衍生之TCR貯庫。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質導致改變特定基因的表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向包括但不限於下列基因：PD-1(亦稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A (PKA)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A(PKA)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4/5。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2 (MCP-1)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3(MIP-1α)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4(MIP1-β)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5(RANTES)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白質激酶A(PKA)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，因暫時性蛋白質表現而過度表現的趨化激素受體包括配體包括但不限於CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17之受體。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及/或TGFβ的表現降低及/或減少(包括導致例如TGFβ途徑阻斷)。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CBLB(CBL-B)的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL移動或運動至腫瘤部位。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CCR(嵌合共刺激受體)增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3所組成之群組的趨化激素受體增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致介白素增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21所組成之群組的介白素增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致VHL增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CD44增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致cAMP蛋白質激酶A(PKA)的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的二個分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的一個分子的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及PD-1的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CBLB的表現降低及/或減少。
在一些實施態樣中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合所組成之群組的黏著性分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群(例如黏著性分子的表現增加)。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。
在一些實施態樣中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%。在一些實施態樣中，表現減少至少約90%。在一些實施態樣中，表現減少至少約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約99%。
在一些實施態樣中，表現增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約80%。在一些實施態樣中，表現增加至少約85%。在一些實施態樣中，表現增加至少約90%。在一些實施態樣中，表現增加至少約95%。在一些實施態樣中，表現增加至少約99%。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現係藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理TIL來誘導。在一些實施態樣中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子的細胞內遞送。該等證實遞送蛋白質(包括轉錄因子)至多種初代人細胞(包括T細胞)之能力的方法(Shareiet al
. PNAS 2013以及Shareiet al.
PLOS ONE 2015及Greisbecket al.
J. Immunology vol. 195, 2015)已經描述；見例如，國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1，所有全文皆以引用方式併入本文中。該等描述於國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1之方法可為本發明所採用，以暴露TIL族群至轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子，其中該等TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子提供增加腫瘤抗原的表現及/或增加TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量，因此導致TIL族群的重新編程及經重新編程之TIL族群相較於未重新編程之TIL族群的治療療效增加。在一些實施態樣中，重新編程導致效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群相對於如本文所述之TIL的起始或先前(即在重新編程之前)族群增加。
在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)包括但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係TCF-1。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係NOTCH 1/2 ICD。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係MYB。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係與誘導多能幹細胞培養(iPSC)諸如市售KNOCKOUT Serum Replacement(Gibco/ThermoFisher)一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)係與iPSC雞尾酒一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施態樣中，轉錄因子(TF)不與iPSC雞尾酒一起投予。在一些實施態樣中，重新編程導致TSCM的百分比增加。在一些實施態樣中，重新編程導致TSCM的百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的TSCM。
在一些實施態樣中，如上述之暫時性改變蛋白質表現如上述之方法可與基因修飾TIL族群之方法組合，包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在某些實施態樣中，方法包含基因修飾TIL族群的步驟。在某些實施態樣中，方法包含基因修飾第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導的步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al.
,Proc. Nat’l Acad. Sci.
2006,103,
17372-77; Zufferey,et al., Nat. Biotechnol.
1997,15,
871-75; Dull,et al.
,J. Virology
1998,72
, 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導的步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol.
1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移的步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al.
,Mol. Therapy
2010,18,
674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，暫時性改變蛋白質表現係指由自我遞送RNA干擾(sdRNA)所誘導之表現減少，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3
)之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3’端接合至膽固醇。在一些實施態樣中，方法包含暫時性改變TIL族群中之蛋白質表現，包含使用自我遞送RNA干擾(sdRNA)，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3
)之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3’端接合至膽固醇。使用sdRNA之方法已描述於Khvorova and Watts,Nat. Biotechnol.
2017,35,
238-248; Byrne,et al.
,J. Ocul. Pharmacol. Ther.
2013,29,
855-864; 及Ligtenberg,et al.
,Mol. Therapy,
2018(印製中)，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，遞送sdRNA至TIL族群不需使用電穿孔、SQZ或其他方法完成，而是使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為1 µM/10,000個TIL於介質中之sdRNA。在某些實施態樣中，方法包含遞送sdRNA至TIL族群，包含使TIL族群暴露至濃度為1 µM/10,000個TIL於介質中之sdRNA介於1至3天之間的期間。在一實施態樣中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為10 µM/10,000個TIL於介質中之sdRNA完成。在一實施態樣中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為50 µM/10,000個TIL於介質中之sdRNA完成。在一實施態樣中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於介質中之間之sdRNA完成。在一實施態樣中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於介質中之間之sdRNA完成，其中暴露至sdRNA藉由添加新鮮sdRNA至介質來執行二、三、四或五次。其他合適過程係描述於例如美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1、US 2013/0131141 A1及US 2013/0131142 A1號及美國專利第9,080,171號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，在製造期間將sdRNA插入TIL族群中。在一些實施態樣中，sdRNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白質激酶A (PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施態樣中，表現減少係基於基因靜默的百分比判定，例如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評估。在一些實施態樣中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約80%。在一些實施態樣中，表現減少至少約85%。在一些實施態樣中，表現減少至少約90%。在一些實施態樣中，表現減少至少約95%。在一些實施態樣中，表現減少至少約99%。
基於化學修飾siRNA之可自我遞送RNAi技術可為本發明之方法所採用，以成功遞送sdRNA至如本文所述之TIL。組合不對稱siRNA結構對主鏈的修飾與疏水性配體(見例如Ligtenberg,et al.
,Mol. Therapy,
2018及US20160304873)允許sdRNA藉由簡單添加至培養基而穿透培養的哺乳動物細胞，不需要額外配方及方法，充分利用sdRNA的核酸酶穩定性。此穩定性允許支持RNAi媒介之目標基因活性減少的恆定水準，只需維持sdRNA於介質中的有效濃度。雖然不受理論限制，sdRNA的主鏈穩定化提供延長減少基因表現效應，其在非分裂細胞中可持續數月。
在一些實施態樣中，超過95%的TIL轉染效率及目標的表現減少藉由各種特異性sdRNA發生。在一些實施態樣中，含有數個未經修飾的核糖殘基之sdRNA係經完全修飾的序列置換，以增加RNAi效應的效力及/或壽命。在一些實施態樣中，表現減少效應係維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更多天。在一些實施態樣中，表現減少效應在TIL經sdRNA處理後10天或更多天降低。在一些實施態樣中，目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施態樣中，TIL中的目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施態樣中，PD-1/PD-L1途徑的表現減少允許TIL展現更有效的體內效應，這在一些實施態樣中是因為避免PD-1/PD-L1途徑的抑制效應。在一些實施態樣中，因sdRNA之PD-1表現減少導致增加TIL增生。
小干擾RNA (siRNA)(有時稱為短干擾RNA或靜默RNA)是一種雙股RNA分子，長度通常為19至25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其利用互補核苷酸序列干擾特定基因的表現。
雙股DNA (dsRNA)通常可用於定義包含一對RNA互補股(通常為同義(乘客)及反義(引導)股)之任何分子且可包括單股懸端區。相對於siRNA，用語dsRNA通常係指包括siRNA分子序列的前驅物分子，該siRNA分子係藉由切割酶系統包括Dicer酶的作用從較大dsRNA分子釋放。
sdRNA(可自我遞送RNA)是一種新類型的經共價修飾的RNAi化合物，其不需要遞送媒劑即可進入細胞且相較於傳統siRNA具有改善的藥理學。「可自我遞送RNA」或「sdRNA」是經疏水性修飾的RNA干擾-反義雜交物，經證實在體外初代細胞及體內局部投予時高度有效。已證實強健攝取及/或靜默且無毒性。sdRNA是大致上不對稱的經化學修飾的核酸分子，具有極少雙股區域。sdRNA分子一般含有單股區域及雙股區域，且在分子的單股及雙股區域內皆可含有多種化學修飾。此外，sdRNA分子可附接至疏水性接合物，諸如本文所述之習知及先進的固醇類分子。sdRNA及製造該等sdRNA之相關方法亦廣泛描述於例如US20160304873、WO2010033246、WO2017070151、WO2009102427、WO2011119887、WO2010033247A2、WO2009045457、WO2011119852，彼等所有全文皆以引用方式併入本文中以用於所有目的。為了最佳化sdRNA結構、化學、靶向位置、序列優先性等，開發了專用演算法且運用於sdRNA的效力預測(見例如，US 20160304873)。基於這些分析，功能性sdRNA序列通常被定義為在1 µM濃度下具有超過70%的表現減少，且機率超過40%。
在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現75%的目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM至約4 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施態樣中，本發明使用之sdRNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。
在一些實施態樣中，寡核苷酸劑包含一或多種修飾以增加治療劑的穩定性及/或有效性及致效寡核苷酸至所欲治療之細胞或組織的有效遞送。該等修飾可包括2’-O-甲基修飾、2’-O-氟基修飾、二硫代磷酸酯修飾、2’F修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的及/或2’去氧核苷酸。在一些實施態樣中，寡核苷酸係經修飾以包括一或多種疏水性修飾，包括例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在額外特定實施態樣中，經化學修飾的核苷酸係硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施態樣中，糖可經修飾且經修飾的糖可包括但不限於D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基及2’-0-乙基)，即2’-烷氧基、2’-胺基、2’-S-烷基、2’-鹵基(包括2’-氟基)、T-甲氧基乙氧基、2’-烯丙基氧基(-OCH2
CH=CH2
)、2’-丙炔基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及類似物。在一實施態樣中，糖部份可為己糖且如所述併入寡核苷酸中(Augustyns, K.,et al.
, Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992))。
在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸的全長係雙股，即分子任一端不具有懸端單股序列，即為鈍端。在一些實施態樣中，個別核酸分子可具有不同長度。換句話說，本發明之雙股寡核苷酸不是全長雙股。例如，當使用二個分開的核酸分子時，其中一個分子例如包含反義序列的第一分子可比與其雜交之第二分子更長(留下一部分的分子為單股)。在一些實施態樣中，當使用單一核酸分子時，一部分的分子在任一端可維持單股。
在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在寡核苷酸至少約70%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約80%的長度中為雙股。在另一實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約90%至95%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約96%至98%的長度中為雙股。在一些實施態樣中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施態樣中，寡核苷酸可藉由修飾例如3’或5’鍵聯(例如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526)而實質上不受核酸酶作用。例如，可藉由包含「阻斷基團」而使寡核苷酸具有抗性。本文中使用之用語「阻斷基團」係指可附接至寡核苷酸或核單體(nucleomonomer)作為合成之保護基或偶合基團(例如FITC、丙基(CH2
-CH2
-CH3
)、二醇(-0-CH2
-CH2
-O-)磷酸鹽(PO3 2+
)、氫膦酸鹽或胺基磷酸酯(phosphoramidite))之取代基(例如除OH基團以外)。「阻斷基團」亦可包括保護寡核苷酸的5’及3’末端的「末端阻斷基團」或「外核酸酶阻斷基團」，其包括經修飾的核苷酸及非核苷酸外核酸酶抗性結構。
在一些實施態樣中，sdRNA內之至少一部分毗連多核苷酸係藉由取代基鍵聯例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施態樣中，化學修飾可導致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500種細胞攝取增強(enhancements in cellular uptake)。在一些實施態樣中，C或U殘基中之至少一者包括疏水性修飾。在一些實施態樣中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施態樣中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的C及U可含有疏水性修飾。在一些實施態樣中，所有C及U含有疏水性修飾。
在一些實施態樣中，sdRNA或sd-rxRNA經由併入可質子化胺展現增強的胞內體釋放sd-rxRNA分子。在一些實施態樣中，可質子化胺被併入同義股(在RISC裝載後被棄置的分子部分)。在一些實施態樣中，本發明之sdRNA化合物包含不對稱化合物，該不對稱化合物包含雙股區域(有效RISC進入所需，10至15個鹼基長)及4至12個核苷酸長的單股區域；具有13個核苷酸雙股。在一些實施態樣中，採用6個核苷酸的單股區域。在一些實施態樣中，sdRNA之單股區域包含2至12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施態樣中，採用6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，本發明之sdRNA化合物亦包括獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。
舉例來說，引導股亦可藉由任何證實穩定性且不干擾RISC進入的化學修飾來修飾。在一些實施態樣中，引導股中的化學修飾模式包括大部分C及U核苷酸是2’ F修飾的，且5’端經磷酸化。
在一些實施態樣中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%的核苷酸是經修飾的。在一些實施態樣中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸是經修飾的。在一些實施態樣中，sdRNA或sd-rxRNA中100%的核苷酸是經修飾的。
在一些實施態樣中，sdRNA分子具有極少雙股區域。在一些實施態樣中，雙股的分子區域從8至15個核苷酸長不等。在一些實施態樣中，雙股的分子區域是8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施態樣中，雙股區域是13個核苷酸長。引導與乘客股之間可有100%互補性，或者引導與乘客股之間可有一或多個錯配。在一些實施態樣中，在雙股分子的一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸懸端。分子的單股區域在一些實施態樣中是介於4至12個核苷酸長。在一些實施態樣中，單股區域可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施態樣中，單股區域亦可少於4個或大於12個核苷酸長。在某些實施態樣中，單股區域是6或7個核苷酸長。
在一些實施態樣中，sdRNA分子具有降低的穩定性。在一些例子中，經化學修飾的sdRNA或sd-rxRNA分子在介質中具有長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時(包括任何中間值)的半衰期。在一些實施態樣中，sd-rxRNA在介質中具有長於12小時的半衰期。
在一些實施態樣中，sdRNA係經最佳化以增加效力及/或減少毒性。在一些實施態樣中，引導及/或乘客股的核苷酸長度及/或引導及/或乘客股中的硫代磷酸酯修飾數量在一些態樣可影響RNA分子的效力，然而以2’-0-甲基(2’OMe)修飾置換2’-氟基(2’F)修飾在一些態樣中可影響分子的毒性。在一些實施態樣中，預期減少分子的2’F含量可減少分子的毒性。在一些實施態樣中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾的數量可影響細胞的分子攝取，例如被動攝取分子至細胞中的效率。在一些實施態樣中，sdRNA不具有2’F修飾，但仍以相等的細胞攝取性及組織穿透效率為表徵。
在一些實施態樣中，引導股的長度大約是18至19個核苷酸且具有大約2至14個磷酸鹽修飾。例如，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或超過14個經磷酸鹽修飾的核苷酸。引導股可含有一或多個授予增加的穩定性且不干擾RISC進入的修飾。經磷酸鹽修飾的核苷酸(諸如經硫代磷酸酯修飾的核苷酸)可位於3’端、5’端或分布在整個引導股。在一些實施態樣中，引導股3’末端之10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2’F及/或2’OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施態樣中，在引導股位置一之核苷酸(引導股最5’位置的核苷酸)是經2’OMe修飾的及/或經磷酸化的。引導股內的C及U核苷酸可經2’F修飾。例如，19個nt之引導股的位置2至10(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’F修飾。引導股內的C及U核苷酸亦可經2’OMe修飾。例如，19個nt之引導股的位置11至18(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’OMe修飾。在一些實施態樣中，在引導股最3’端的核苷酸未經修飾。在某些實施態樣中，在引導股內大部分C及U係經2’F修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施態樣中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施態樣中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾，引導股的5’端係經磷酸化且在位置2至10的C或U係經2’F修飾。
可自我遞送RNAi技術提供用RNAi劑直接轉染細胞之方法，無須額外配方或技術。轉染難以轉染細胞系的能力、高體內活性及易於使用是這類組成物及方法的特徵，相較於基於siRNA之傳統技術呈現顯著功能優點，且因此在數個關於在本發明之TIL中目標基因表現減少的方法之實施態樣中採用sdRNA方法。sdRNAi方法允許直接遞送化學合成化合物至廣泛範圍的離體(ex-vivo
)及體內初代細胞及組織。在本發明的一些實施態樣中描述的sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
sdRNA係形成為經疏水性修飾的siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrneet al.
, December 2013,J. Ocular Pharmacology and Therapeutics
, 29(10): 855-864，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，sdRNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所述之TIL。在某些實施態樣中，方法包含無菌電穿孔TIL族群以遞送sdRNA寡核苷酸。
在一些實施態樣中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合以遞送至細胞。在一些實施態樣中，此跨膜遞送系統包含脂質、病毒載體及類似物。在一些實施態樣中，寡核苷酸劑係自我遞送RNAi劑，不需要任何遞送劑。在某些實施態樣中，方法包含使用跨膜遞送系統遞送sdRNA寡核苷酸至TIL族群。
寡核苷酸及寡核苷酸組成物接觸(例如，使接觸，在本文中亦稱為投予或遞送至)本文所述之TIL且被攝入，包括經由TIL被動攝取。sdRNA可在第一擴增期間(例如，圖7及/或圖85步驟B)、在第一擴增之後(例如，步驟C期間)、第二擴增之前或期間(例如，步驟D之前或期間)、步驟D之後及步驟E收集之前、步驟F收集期間或之後、步驟F最終配方及/或轉移至輸注袋之前或期間、以及步驟F任何可選的冷凍保存步驟之前添加至本文所述之TIL。另外，sdRNA可在從步驟F任何冷凍保存步驟解凍後添加。在一實施態樣中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM所組成之群組的濃度添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由0.1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、0.75 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.25 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、1.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、2 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質、5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質或10 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL介質所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施態樣中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA在REP前或REP階段期間，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。
本發明之寡核苷酸組成物包括sdRNA可在擴增過程期間與本文所述之TIL接觸，例如以高濃度溶解sdRNA於細胞培養基中且允許足夠時間讓被動攝取發生。在某些實施態樣中，本發明之方法包含使TIL族群與如本文所述之寡核苷酸組成物接觸。在某些實施態樣中，方法包含將寡核苷酸例如sdRNA溶解於細胞培養基中且使細胞培養基與TIL族群接觸。TIL可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。
在一些實施態樣中，遞送寡核苷酸至細胞中可藉由合適的本領域認可方法增強，包括磷酸鈣、DMSO、甘油或葡聚糖、電穿孔，或藉由使用例如陽離子、陰離子或中性脂質組成物或脂質體使用所屬技術領域中已知之方法轉染(見例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美國專利第4,897,355號；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567)。
在一些實施態樣中，使用超過一個sdRNA來減少目標基因的表現。在一些實施態樣中，一起使用一或多個靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH之sdRNA。在一些實施態樣中，使用PD-1 sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者，以減少超過一個基因目標的表現。在一些實施態樣中，使用LAG3 sdRNA與靶向CISH之sdRNA的組合，以減少兩個目標的基因表現。在一些實施態樣中，在本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者之sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
在一些實施態樣中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向PD-1且另一個sdRNA靶向選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施態樣中，sdRNA靶向選自PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的基因。在一些實施態樣中，sdRNA靶向選自PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的基因。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向CISH且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向PD-1。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施態樣中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CBLB。
如上所討論，本發明之實施態樣提供經由基因編輯經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，以增強彼等之治療效應。本發明之實施態樣包含經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL族群之基因編輯，以促進一或多個蛋白質的表現及抑制一或多個蛋白質的表現以及彼等之組合。本發明之實施態樣亦提供將TIL擴增成治療性族群之方法，其中該等方法包含基因編輯TIL。有數種可用來基因修飾TIL族群之基因編輯技術，彼等適用於本發明。
在一些實施態樣中，方法包含基因修飾TIL族群之方法，其包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導的步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al.
,Proc. Nat’l Acad. Sci.
2006,103,
17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol.
1997,15,
871-75；Dull,et al.
,J. Virology
1998,72
, 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導的步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol.
1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移的步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al.
,Mol. Therapy
2010,18,
674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施態樣中，方法包含基因修飾TIL族群例如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群之方法。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括穩定併入基因以產生或抑制(例如靜默)一或多種蛋白質的步驟。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括電穿孔的步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J.
1991,60,
297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。可使用其他所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，電穿孔方法係無菌電穿孔方法。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施態樣中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以誘導TIL中孔洞形成的步驟，包含施加至少三次具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同，以使得經誘導的孔洞持續相對長的時間期間，且使得TIL的存活性得以維持。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括磷酸鈣轉染的步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面塗層及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology
1973,52,
456-467; Wigler,et al.
,Proc. Natl. Acad. Sci.
1979,76,
1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol.
1987,7,
2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括脂質體轉染的步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N
-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n
,n
,n
-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1 (w/w)脂質體配方的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al.
,Biotechniques
1991,10,
520-525及Felgner,et al.
,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 1987,84,
7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，基因修飾TIL族群之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。TIL可為如本文所述之TIL第一族群、第二族群及/或第三族群。
根據實施態樣，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶在一或多個免疫檢查點基因媒介產生雙股或單股斷裂。該等可編程核酸酶藉由在特定基因座導入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，即彼等依賴辨識基因體內特定DNA序列以將核酸酶結構域靶向此位置且在靶向序列媒介產生雙股斷裂。DNA中的雙股斷裂後續吸引內源性修復機轉至斷裂部位，以藉由非同源性末端接合(NHEJ)或同源引導修復(HDR)媒介基因體編輯。因此，斷裂修復可導致導入破壞(例如靜默、壓抑或增強)目標基因產物的插入/刪除突變。
經開發而能夠進行定點基因體編輯的主要核酸酶類型包括鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。這些核酸酶系統可基於彼等之DNA辨識模式大致分為兩大類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA交互作用達成特異性DNA結合，然而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由與目標DNA直接鹼基配對的短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA交互作用來靶向特定DNA序列。見例如Coxet al.
,Nature Medicine,
2015, Vol. 21, No. 2。
可用於本發明之TIL擴增方法之基因編輯方法的非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，彼等在以下更詳細描述。根據一實施態樣，用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施態樣或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者基因編輯至少一部分的TIL，以產生可提供增強治療效應的TIL。根據一實施態樣，可藉由體外比較基因編輯的TIL與未經修飾的TIL來評估彼等之改善的治療效應，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之體外效應功能、細胞介素輪廓等。在某些實施態樣中，方法包含使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法基因編輯TIL族群。
在本發明之一些實施態樣中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施態樣中，電穿孔系統係流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施態樣的合適流式電穿孔系統實例係市售MaxCyte STX系統。有數種可供選擇之市售電穿孔儀器可能適用於本發明，諸如可得自BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra (Cellectricon)之AgilePulse系統或ECM 830、Nucleofector (Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell (BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96 (Ambion)。在本發明之一些實施態樣中，電穿孔系統與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施態樣中，電穿孔系統係如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施態樣或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施態樣，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
CRISPR代表「叢聚規律間隔短迴文重複(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」。使用CRISPR系統進行基因編輯的方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型的CRISPR系統，其中併入RNA及Cas蛋白質且可用於本發明：第I、II及III型。第II型CRISPR(由Cas9例示)是最廣為表徵的系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物的結構域)的天然防衛機制。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA及各種Cas蛋白質(包括Cas9)，藉由切碎並摧毀外來入侵者的DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR是具有二個獨特特徵的DNA特化區域:有核苷酸重複及間隔子存在。核苷酸的重複序列分布在整個CRISPR區域，且在重複序列之間穿插有短區段的外來DNA(間隔子)。在第II型CRISPR/Cas系統中，間隔子係整合在CRISPR基因座內且經轉錄及處理成短CRISPR RNA (crRNA)。這些crRNA與轉錄活化crRNA (tracrRNA)黏合且引導Cas蛋白質進行序列特異性切割及靜默致病性DNA。Cas9蛋白質進行的目標辨識需要位在crRNA內的「種子」序列及在crRNA結合區域上游的含有二核苷酸之保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向，可切割幾乎任何DNA序列。天然系統中的crRNA及tracrRNA可被簡化成大約100個核苷酸的單一引導RNA (sgRNA)以用於基因工程改造。CRISPR/Cas系統藉由共遞送表現Cas9內切核酸酶之質體及必要crRNA組分，可直接移動至人細胞。可使用Cas蛋白質的不同變體以減少靶向限制(例如Cas9同源基因，諸如Cpf1)。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由CRISPR方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施態樣的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,697,359；8,993,233；8,795,965；8,771,945；8,889,356；8,865,406；8,999,641；8,945,839；8,932,814；8,871,445；8,906,616及8,895,308號，彼等以引用方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體可購自公司諸如GenScript。
在一實施態樣中，如本文所述之TIL族群的基因修飾可使用如美國專利第US 9790490號所述之CRISPR/Cpf1系統執行，其揭露以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施態樣或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由TALE方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施態樣，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
TALE代表「類轉錄活化因子效應物(Transcription Activator-Like Effector)」蛋白質，其包括TALEN(「類轉錄活化因子效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)」)。使用TALE系統進行基因編輯的方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE是來自植物致病性細菌黃單胞菌屬(Xanthomonas
)的天然發生蛋白質，含有由一系列33至35個胺基酸的重複結構域構成的DNA結合結構域，該等重複結構域各辨識單一鹼基對。TALE特異性係由二個被稱為重複可變雙殘基(RVD)的超變異胺基酸判定。模組化TALE重複連接在一起以辨識毗連DNA序列。DNA結合結構域中的特定RVD辨識目標基因座中的鹼基，提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合結構域。TALE的DNA結合結構域與第IIS型FokI內切核酸酶的催化結構域融合，以製造一可靶向的TALE核酸酶。為了誘導定點突變，二個藉由14至20個鹼基對間隔基因區域分離的個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚化且產生目標雙股斷裂。
數個利用各種總成方法的大型、系統性研究已指示TALE重複可經組合以辨識幾乎任何使用者定義的序列。客製化的TALE陣列亦可經由Cellectis Bioresearch (Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington, KY, USA)及Life Technologies(Grand Island, NY, USA)的商業途徑獲得。適用於本發明之TALE及TALEN方法係描述於美國專利申請公開案號US 2011/0201118 A1；US 2013/0117869 A1；US 2013/0315884 A1；US 2015/0203871 A1及US 2016/0120906 A1，彼等揭露以引用方式併入本文中。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由TALE方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施態樣的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,586,526號，其以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施態樣或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施態樣，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α螺旋表面上的數個胺基酸一般接觸DNA主溝槽中3 bp，且具有不同的選擇性水準。鋅指具有二個蛋白質結構域。第一結構域是DNA結合結構域，包括真核轉錄因子且含有鋅指。第二結構域是核酸酶結構域，包括FokI限制酶且負責催化切割DNA。
個別ZFN的DNA結合結構域一般含有介於三與六個之間的個別鋅指重複且各可辨識介於9與18個之間的鹼基對。如果鋅指結構域對彼等之意圖目標位點具有特異性，則即使一對總共辨識18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中的單一基因座。一種產生新的鋅指陣列之方法是組合較小的已知特異性之鋅指「模組」。最常見的模組總成過程涉及組合三個各可辨識3個鹼基對DNA序列之分開的鋅指，以產生可辨識9個鹼基對目標位點的3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方式諸如寡聚池工程改造(OPEN)以從隨機分組庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組庫考慮鄰近指之間的上下文依賴(context-dependent)交互作用。經工程改造鋅指可自商業途徑獲得；Sangamo Biosciences(Richmond, CA, USA)已與Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)合作開發鋅指建構之專用平台(CompoZr®)。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施態樣的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185及6,479,626號，彼等以引用方式併入本文中。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施態樣的系統、方法及組成物的其他實例係描述於Beane,et al.
,Mol. Therapy
, 2015, 23 1380-1390，其揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，TIL可選地經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施態樣中，方法包含基因工程改造TIL族群，以包括高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。適當地，TIL族群可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。
XI. 用於TIL製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間例如搭配第2代或第3代過程使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施態樣中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施態樣中，密閉系統包括所述之魯爾鎖及熱封系統。在一些實施態樣中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施態樣中，採用本文所述的密閉系統。在一些實施態樣中，將TIL根據本文所述之方法調配到最終產物配方容器中。
在一些實施態樣中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到準備將TIL投予至病患或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施態樣中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施態樣中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施態樣中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之介質係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施態樣中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施態樣中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施態樣中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。
XII. 可選的TIL冷凍保存
藉由第2代或第3代過程製備的主體TIL族群(例如第二TIL族群)或經擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)可經可選地冷凍保存。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於治療性TIL族群。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施態樣中，冷凍保存發生於圖85(特別是例如圖85B)的例示性步驟F中的TIL。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施態樣中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施態樣中，冷凍保存使用冷凍保存介質執行。在一些實施態樣中，冷凍保存介質含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica
2013,52,
978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用CS10冷凍保存介質(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存介質冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用1:1(體積：體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施態樣中，TIL族群係使用約1:1(體積：體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
如上所討論且例示於如圖85(特別是例如圖85B)中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施態樣中，在第二擴增(例如根據圖85(特別是例如圖85B)步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica
2013,52,
978-986。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施態樣中，TIL係根據本文所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施態樣中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可經受步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL族群可經受基因修飾以用於合適治療。
XIII.擴增TIL之表型特徵
在一些實施態樣中，分析TIL在擴增後的許多表型標誌的表現，包括該些在本文及實例中描述者。在一實施態樣中，檢查一或多個表型標誌的表現。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是在步驟B的第一擴增之後分析。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是在步驟C的轉變期間分析。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是在根據步驟C的轉變期間及冷凍保存之後分析。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的第二擴增之後分析。在一些實施態樣中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的二或更多次擴增之後分析。
在一些實施態樣中，標誌係選自由CD8及CD28所組成之群組。在一些實施態樣中，檢查CD8的表現。在一些實施態樣中，檢查CD28的表現。在一些實施態樣中，CD8及/或CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖85(特別是例如圖85B)提供之第3代過程相較於在例如圖85(特別是例如圖85B)提供的2A過程)。在一些實施態樣中，CD8的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖85(特別是例如圖85B)提供之第3代過程相較於在例如圖85(特別是例如圖85B)提供的2A過程)。在一些實施態樣中，CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖85(特別是例如圖85B)提供之第3代過程相較於在例如圖85(特別是例如圖85A)提供的2A過程)。在一實施態樣中，測量一或多個調節標誌的表現。
在一實施態樣中，在本文所述之用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之方法中的任何步驟期間，並未執行基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群或經收集的TIL族群。
在一些實施態樣中，中央記憶細胞之百分比在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖85(特別是例如圖85B)提供之第3代過程相較於在例如圖85(特別是例如圖85A)提供的2A過程)。在一些實施態樣中，中央記憶細胞的記憶標誌係選自由CCR7及CD62L所組成之群組。
在一實施態樣中，亦可使用細胞介素釋放測定，評估再刺激的TIL的細胞介素釋放。在一些實施態樣中，可評估TIL的干擾素γ (IFN-γ)分泌。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定測量。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定在快速第二擴增步驟之後、在例如圖85(特別是例如圖85B)提供的步驟D之後測量。在一些實施態樣中，TIL健康係藉由IFN-γ分泌測量。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激的TIL介質中的細胞介素IFN-γ水準來測量。來自這些受刺激TIL之介質中的IFN-γ水準可使用測量IFN-γ釋放來判定。在一些實施態樣中，例如在圖85(特別是例如圖85B)中提供之第3代過程之步驟D的TIL相較於例如在圖85(特別是例如圖85A)中提供之2A過程之步驟D的IFN-γ產生增加，指示步驟D TIL的細胞毒性潛力增加。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，測量離體TIL的IFN-γ。在一些實施態樣中，測量離體TIL的IFN-γ，包括藉由本發明之方法(包括例如圖85B方法)產生之TIL。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段:V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程2A之方法(如在圖85(特別是例如圖85A)所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施態樣中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施態樣中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施態樣中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施態樣中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。在一些實施態樣中，如本文所述之過程(例如第3代過程)相較於其他過程(例如稱為第2代的過程)基於樣本中獨特肽CDR的數量(見例如圖12至14)顯示較高的殖株多樣性。
在一些實施態樣中，表型特徵是在冷凍保存之後檢查。
XIV.額外過程實施態樣
在一些實施態樣中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)自個體一或多個腫瘤片段或核心獲得第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行預備性第一擴增，其中該預備性第一擴增執行約1至17天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集步驟(c)獲得之該治療性TIL族群。在一些實施態樣中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模垂直擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100 MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500 MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由使第一TIL族群與進一步包含外源性抗原呈現細胞(APC)之培養基接觸來執行，其中步驟(c)之培養基的APC數量係大於步驟(b)之培養基的APC數量。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，培養基補充有額外的外源性APC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約20:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約9:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約8:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約7:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約6:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任一前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約1.1:1至在或約2:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約10:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約5:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約4:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約3:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.9:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.8:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.7:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.6:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.5:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.4:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.3:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.2:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係選自在或約2:1至在或約2.1:1的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約2:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在初級第一擴增中添加之APC數量係在或約1×108
、1.1×108
、1.2×108
、1.3×108
、1.4×108
、1.5×108
、1.6×108
、1.7×108
、1.8×108
、1.9×108
、2×108
、2.1×108
、2.2×108
、2.3×108
、2.4×108
、2.5×108
、2.6×108
、2.7×108
、2.8×108
、2.9×108
、3×108
、3.1×108
、3.2×108
、3.3×108
、3.4×108
或3.5×108
個APC，且使得在快速第二擴增中添加之APC數量係在或約3.5×108
、3.6×108
、3.7×108
、3.8×108
、3.9×108
、4×108
、4.1×108
、4.2×108
、4.3×108
、4.4×108
、4.5×108
、4.6×108
、4.7×108
、4.8×108
、4.9×108
、5×108
、5.1×108
、5.2×108
、5.3×108
、5.4×108
、5.5×108
、5.6×108
、5.7×108
、5.8×108
、5.9×108
、6×108
、6.1×108
、6.2×108
、6.3×108
、6.4×108
、6.5×108
、6.6×108
、6.7×108
、6.8×108
、6.9×108
、7×108
、7.1×108
、7.2×108
、7.3×108
、7.4×108
、7.5×108
、7.6×108
、7.7×108
、7.8×108
、7.9×108
、8×108
、8.1×108
、8.2×108
、8.3×108
、8.4×108
、8.5×108
、8.6×108
、8.7×108
、8.8×108
、8.9×108
、9×108
、9.1×108
、9.2×108
、9.3×108
、9.4×108
、9.5×108
、9.6×108
、9.7×108
、9.8×108
、9.9×108
或1×109
個APC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約1×108
個APC至在或約3.5×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約3.5×108
個APC至在或約1×109
個APC的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約1.5×108
個APC至在或約3×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約4×108
個APC至在或約7.5×108
個APC的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在初級第一擴增中添加之APC數量係選自在或約2×108
個APC至在或約2.5×108
個APC的範圍，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係選自在或約4.5×108
個APC至在或約5.5×108
個APC的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在或約2.5×108
個APC係添加至初級第一擴增且在或約5×108
個APC係添加至快速第二擴增。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個腫瘤片段係分布至複數個分開的容器中，在各該等分開的容器中，第一TIL族群係於步驟(a)中獲得，第二TIL族群係於步驟(b)中獲得且第三TIL族群係於步驟(c)中獲得，且將來自步驟(c)之複數個容器的TIL治療性族群組合以產生來自步驟(d)的經收集的TIL族群。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個腫瘤平均分布於複數個分開的容器中。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含二至十五個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使複數個分開的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個分開的容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在各容器中，預備性第一擴增係於步驟(b)中在第一TIL族群上執行，步驟(c)中之快速第二擴增係於相同容器中在產生自該第一TIL族群的第二TIL族群上執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各分開的容器包含第一氣體可通透表面積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個腫瘤片段分布於單一容器中。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使單一容器包含第一氣體可通透表面積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於包含第二氣體可通透表面積的第二容器中執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二容器大於第一容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，預備性第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於第一容器中執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:10的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:9的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:8的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:7的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:6的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:5的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:4的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:3的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1至在或約1:2的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.2至在或約1:8的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.3至在或約1:7的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.4至在或約1:6的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.5至在或約1:5的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.6至在或約1:4的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.8至在或約1:3的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:2的範圍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約1.5:1至在或約100:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約50:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約25:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約20:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約10:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約50倍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中的第二期間開始後在或約2天或在或約3天，細胞培養基補充額外的IL-2。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以進一步包含在步驟(d)中使用冷凍保存過程將經收集的TIL族群冷凍保存的步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(d)後執行將來自步驟(d)之經收集的TIL族群轉移至可選地含有HypoThermosol之輸注袋的額外步驟(e)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(e)中使用冷凍保存過程將包含經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使冷凍保存過程係使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存介質執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使PBMC係經輻照且為異體的。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中添加至細胞培養的APC總數係2.5×108
個。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中添加至細胞培養的APC總數係5×108
個。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使APC係PBMC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使PBMC係經輻照且為異體的。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(d)中之收集係使用基於膜的細胞處理系統執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(d)中之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約5至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約10至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約15至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約20至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約25至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約30至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約35至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約40至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約45至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約50至在或約60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使多個核心或片段包含在步驟(b)中每容器在或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核心或片段。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各核心或片段具有在或約1 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各核心或片段具有在或約1 mm3
至在或約10 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各核心片段具有在或約1 mm3
至在或約9 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約8 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約7 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約6 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約5 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約4 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約3 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1 mm3
至在或約2 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使各片段具有在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mm3
的體積。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使細胞培養基係提供於其係為G容器或Xuri細胞袋之容器中。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使細胞培養基中之IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使細胞培養基中之IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使冷凍保存介質包含二甲亞碸(DMSO)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使冷凍保存介質包含7%至10% DMSO。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中之第一期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天或17天的期間內執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中之第二期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間內執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天的期間內執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天的期間內執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約7天的期間內執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約16天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約17天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約18天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約19天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約20天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約21天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約22天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約23天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約24天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約25天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約26天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約27天至在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約14天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約15天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約16天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約17天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約18天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約19天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約20天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約21天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約22天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約23天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約24天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約25天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約26天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約27天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約28天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約16天或更少天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約20天或更少天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約24天或更少天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)至(d)係於總共在或約28天或更少天執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(d)中收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係在或約2.3×1010
個至在或約13.7×1010
個。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中之第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使獲自步驟(c)第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使方法中引述之各容器為密閉容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使方法中引述之各容器為G容器。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使方法中引述之各容器為GREX-10。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使方法中引述之各容器為GREX-100。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使方法中引述之各容器為GREX-500。
在另一實施態樣中，本發明提供藉由如上適用之任何前述段落描述之方法所製造的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群。
在另一實施態樣中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)或OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加的抗原呈現細胞(APC)且無添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供從病患的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的多株性。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的療效。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，以使治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，以使治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，以使治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。
在另一實施態樣中，本發明提供擴增T細胞之方法，該方法包含：(a)藉由培養獲自供體腫瘤片段或核心的第一T細胞族群以致效生長及預備第一T細胞族群的活化來執行第一T細胞族群的預備性第一擴增；(b)在步驟(a)所預備的第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養第一T細胞族群以致效生長及加強第一T細胞族群的活化來執行第一T細胞族群的快速第二擴增，以獲得第二T細胞族群；及(c)收集第二T細胞族群。在另一實施態樣中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模垂直擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效從小規模培養中轉移第一T細胞族群至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞族群約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施態樣中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模垂直擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)之預備性第一擴增係於至多17天的期間執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(b)之快速第二擴增係於至多11天的期間執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使步驟(a)之預備性第一擴增係於17天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第一T細胞族群係於包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)之第二培養基中培養。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第二APC族群中之APC的數量對第一APC族群中之APC的數量的比例係約2:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使第一APC族群中之APC的數量係約2.5×108
個且第二APC族群中之APC的數量係約5×108
個。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以2層APC的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第二APC族群係以選自4至8層APC範圍的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中經層疊在第一氣體可通透表面上的APC之平均層數對在步驟(a)中經層疊在第一氣體可通透表面上的APC之平均層數的比例係2:1。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約2.0×106
個APC/cm2
至在或約3.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.0×106
個APC/cm2
至在或約4.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約2.5×106
個APC/cm2
至在或約7.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約1.5×106
個APC/cm2
至在或約3.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約3.5×106
個APC/cm2
至在或約6.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以選自在或約2.0×106
個APC/cm2
至在或約3.0×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以選自在或約4.0×106
個APC/cm2
至在或約5.5×106
個APC/cm2
之範圍的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106
個APC/cm2
的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使PBMC係經輻照且對第一T細胞族群的供體而言是外源性的。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使T細胞係腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使T細胞係骨髓浸潤淋巴細胞(MIL)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以使T細胞表型係CD3+及CD45+。
XV.醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施態樣中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至病患。在一實施態樣中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施態樣中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施態樣中，投予約2.3×1010
至約13.7×1010
個TIL，平均約7.8×1010
個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施態樣中，投予約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，投予約7×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7.8×1010
個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約1.2×1010
至約4.3×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約3×1010
至約12×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約4×1010
至約10×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約5×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約6×1010
至約8×1010
個TIL。在一些實施態樣中，治療有效劑量係約7×1010
至約8×1010
個TIL。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施態樣中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係約1×106
、2×106
、3×106
、4×106
、5×106
、6×106
、7×106
、8×106
、9×106
、1×107
、2×107
、3×107
、4×107
、5×107
、6×107
、7×107
、8×107
、9×107
、1×108
、2×108
、3×108
、4×108
、5×108
、6×108
、7×108
、8×108
、9×108
、1×109
、2×109
、3×109
、4×109
、5×109
、6×109
、7×109
、8×109
、9×109
、1×1010
、2×1010
、3×1010
、4×1010
、5×1010
、6×1010
、7×1010
、8×1010
、9×1010
、1×1011
、2×1011
、3×1011
、4×1011
、5×1011
、6×1011
、7×1011
、8×1011
、9×1011
、1×1012
、2×1012
、3×1012
、4×1012
、5×1012
、6×1012
、7×1012
、8×1012
、9×1012
、1×1013
、2×1013
、3×1013
、4×1013
、5×1013
、6×1013
、7×1013
、8×1013
及9×1013
。在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在1×106
至5×106
、5×106
至1×107
、1×107
至5×107
、5×107
至1×108
、1×108
至5×108
、5×108
至1×109
、1×109
至5×109
、5×109
至1×1010
、1×1010
至5×1010
、5×1010
至1×1011
、5×1011
至1×1012
、1×1012
至5×1012
及5×1012
至1×1013
的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施態樣中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。
在另一實施態樣中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之輸注袋。
在另一實施態樣中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及醫藥上可接受之載劑之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之輸注袋。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之冷凍保存製劑。
在另一實施態樣中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及冷凍保存介質之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，以使冷凍保存介質含有DMSO。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，以使冷凍保存介質含有7至10% DMSO。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之冷凍保存製劑。
XVI.治療病患之方法
治療方法始於初始TIL收集及培養TIL。該等方法皆已由所屬技術領域例如Jinet al., J. Immunotherapy
, 2012, 35(3):283-292描述，其全文以引用方式併入本文中。治療方法之實施態樣係描述於以下所有章節，包括實例。
根據本文所述之方法包括例如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如例如圖85(特別是例如圖85B)所述)產生的擴增TIL有治療癌症病患的具體用途(例如Goff,et al.
,J. Clinical Oncology
, 2016, 34(20):2389-239以及補充內容所述)；其全文以引用方式併入本文中。在一些實施態樣中，TIL係如先前描述生長自轉移性黑色素瘤的經切除之寄存物(見Dudley,et al.
,J Immunother
., 2003, 26:332-342；其全文以引用方式併入本文中)。新鮮腫瘤可在無菌條件下分割。可收集代表性樣本進行正式病理分析。可使用2 mm3
至3 mm3
的單一片段。在一些實施態樣中，獲得每病患5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施態樣中，獲得每病患20、25或30個樣本。在一些實施態樣中，獲得每病患20、22、24、26或28個樣本。在一些實施態樣中，獲得每病患24個樣本。樣本可放入24孔板之個別孔中，維持於含有高劑量IL-2 (6,000 IU/mL)之生長介質中且監測腫瘤的破壞及/或TIL的增生。任何在處理後仍有存活細胞的腫瘤可如本文所述經酶消化成單一細胞懸浮液且經冷凍保存。
在一些實施態樣中，成功生長的TIL可經取樣進行表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)且當可用時在自體腫瘤測試。如果整夜共培養產生干擾素-γ(IFN-γ)水準˃200 pg/mL且為背景的二倍，則TIL可被視為反應性。(Goff,et al.
,J Immunother.
, 2010, 33:840-847；其全文以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，可選擇具有自體反應性或足夠生長模式證據的培養進行第二擴增(例如根據圖85(特別是例如圖85B)步驟D提供的第二擴增)，包括有時稱為快速擴增(REP)的第二擴增。在一些實施態樣中，選擇具有高自體反應性(例如在第二擴增期間高增生)的擴增TIL進行額外第二擴增。在一些實施態樣中，選擇具有高自體反應性(例如在圖85(特別是例如圖85B)步驟D提供的第二擴增期間的高增生)的TIL進行根據圖85(特別是例如圖85B)步驟D的額外第二擴增。
在一些實施態樣中，病患並不直接移入ACT (過繼性細胞轉移)，例如，在一些實施態樣中，不立即利用在腫瘤收集及/或第一擴增後的細胞。在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前2天解凍。在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前1天解凍。在一些實施態樣中，TIL可經冷凍保存且在投予至病患之前立即解凍。
輸注袋TIL冷凍保存樣本的細胞表型可藉由流動式細胞測量術(例如FlowJo™)分析表面標誌CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA(BD BioSciences)，以及藉由本文所述之任何方法分析。使用標準連結酶免疫吸收測定技術測量血清細胞介素。血清IFN-g上升定義為˃100 pg/mL且大於4 3基線水準。
在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖85(特別是例如圖85B)例示者)產生之TIL提供意外改善TIL的臨床療效。在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖85(特別是例如圖85B)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)例示之方法以外的方法)產生之TIL展現增加的臨床療效。在一些實施態樣中，除該些在本文中描述之方法以外的方法包括稱為過程1C及/或第1代(Gen 1)的方法。在一些實施態樣中，增加療效係藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應測量。在一些實施態樣中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖85(特別是例如圖85B)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)例示之方法以外的方法，例如第1代過程)產生之TIL展現類似的發生反應所需時間(time to response)及安全性輪廓。
在一些實施態樣中，IFN-γ指示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施態樣中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ水準來測量。在一些實施態樣中，IFN-γ增加指示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的治療療效。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的離體TIL中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的TIL血清中測量。
在一些實施態樣中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖85(特別是例如圖85B)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施態樣中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性指示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施態樣中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施態樣中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加100倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加500倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加1000倍。
療效的測量可包括疾病控制率(DCR)以及整體反應率(ORR)，如所屬技術領域中已知及本文中所述。
1.治療癌症及其他疾病之方法
本文所述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一實施態樣中，彼等用於治療過度增生性病症。彼等亦可用於治療其他如本文及以下段落所述之病症。
在一些實施態樣中，過度增生性病症係癌症。在一些實施態樣中，過度增生性病症係實質腫瘤癌症。在一些實施態樣中，實質腫瘤癌症係選自由下列所組成之群組:神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施態樣中，實質腫瘤癌係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。
在一些實施態樣中，癌症係高突變(hypermutated)癌症表型。高突變癌症係廣泛描述於Campbell,et al.
(Cell, 171:1042-1056(2017)；其全文以引用方式併入本文中以達所目的)。在一些實施態樣中，高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於9與10個之間的突變。在一些實施態樣中，小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)9.91個突變。在一些實施態樣中，成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)9個突變。在一些實施態樣中，增強高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施態樣中，增強小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施態樣中，增強成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施態樣中，超高突變(ultra-hypermutated)腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施態樣中，小兒超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施態樣中，成人超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。
在一些實施態樣中，高突變腫瘤在複製修復途徑中具有突變。在一些實施態樣中，高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變。在一些實施態樣中，高突變腫瘤具有微小衛星體不穩定性。在一些實施態樣中，超高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變且具有微小衛星體不穩定性。在一些實施態樣中，腫瘤之高突變與對免疫檢查點抑制劑的反應有關。在一些實施態樣中，高突變腫瘤對免疫檢查點抑制劑治療具有抗性。在一些實施態樣中，高突變腫瘤可使用本發明之TIL治療。在一些實施態樣中，腫瘤之高突變係由環境因素(外在暴露)造成。例如，UV光可為惡性黑色素瘤之高數量突變的主因(見例如，Pfeifer, G.P., You, Y.H., and Besaratinia, A.(2005).Mutat. Res.
571, 19-31.；Sage, E.(1993).Photochem. Photobiol.
57, 163-174.)。在一些實施態樣中，以肺及喉腫瘤來說，腫瘤之高突變可由香菸煙霧中大於60種致癌物造成，以及其他腫瘤因直接致突變原暴露所致(見例如Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O’Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C.,et al.
(2010).Nature
463, 184-190)。在一些實施態樣中，腫瘤之高突變係由載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣(APOBEC)家族成員失調造成，其已顯示在多種癌症導致增加C轉變成T的水準(見例如，Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G.,et al.
(2013).Nat. Genet.
45, 970-976)。在一些實施態樣中，腫瘤之高突變係由破壞除錯(proofreading)之突變所致之缺陷性DNA複製修復造成，除錯係由主要複製酶Pol3及Pold1執行。在一些實施態樣中，腫瘤之高突變係由DNA錯配修復的缺陷造成，其與結直腸癌、子宮內膜癌症及其他癌症的高突變相關(見例如Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C.,et al.
; (2013).Nature
497, 67-73.; Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F.,et al.
; (2012).Nature
487, 330-337)。在一些實施態樣中，DNA複製修復突變亦見於癌症素質症候群(cancer predisposition syndrome)，諸如體質性或雙等位錯配修復缺陷(CMMRD)、Lynch氏症候群及聚合酶除錯相關息肉症(PPAP)。
在一實施態樣中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係高突變癌症。在一實施態樣中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係增強的高突變癌症。在一實施態樣中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係超高突變癌症。
在一實施態樣中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中病患在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2
/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
在本文中描述之化合物及化合物之組合在治療、預防及/或處理所示疾病或病症的療效可使用各種所屬技術領域中已知之模型測試，該等模型提供人疾病治療之指南。例如，用於判定卵巢癌治療療效的模型係描述於例如Mullany,et al.
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2012,153,
1585-92；及Fong,et al.
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12。用於判定胰癌治療療效的模型係描述於Herreros-Villanueva,et al.
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643-664。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Kim,Clin. Exp. Otorhinolaryngol.
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55-60；及Sano,Head Neck Oncol.
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32。
在一些實施態樣中，IFN-γ指示過度增生性病症治療的治療療效。在一些實施態樣中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些實施態樣中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中之細胞介素IFN-γ水準來測量。在一些實施態樣中，藉由本方法獲得之TIL提供經本方法之TIL治療之個體相較於經使用稱為第3代過程(如圖85(特別是例如圖85B)及本說明書中各處例示)之方法所製備的TIL治療之個體的血液中增加之IFN-γ。在一些實施態樣中，IFN-γ增加指示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的治療療效。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於來自經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的離體TIL中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的血液中測量。在一些實施態樣中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之病患的血清中測量。
在一些實施態樣中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖85(特別是例如圖85B)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖85(特別是例如圖85B)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施態樣中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性指示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施態樣中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施態樣中，多株性增加可指示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施態樣中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加一倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加二倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加十倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加100倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加500倍。在一些實施態樣中，相較於未治療病患及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖85(特別是例如圖85B)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的病患，多株性增加1000倍。
2.共投方法
在一些實施態樣中，如本文所述產生之TIL (包括例如衍生自圖85(特別是例如圖85B)之步驟A至F所述之方法的TIL)可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(lambrolizumab, MK03475或MK-3475, Merck; Keytruda®)、人化抗PD-1抗體JS001(ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210(ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810(Regeneron)、人單株抗體MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001 (Novartis)。在一些實施態樣中，PD-1抗體係來自殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell cat# BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施態樣中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且破壞PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中的抗體包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A(Genentech)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、破壞PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。在一些實施態樣中，當個體具有的癌症類型為單獨投予抗PD-1抗體所難治時，對於投予根據步驟A至F產生之TIL組合的個體共投抗PD-1抗體。在一些實施態樣中，當病患具有難治性黑色素瘤時，對病患投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施態樣中，當病患具有非小細胞肺癌(NSCLC)時，對病患投予TIL與抗PD-1之組合。
3.可選的病患淋巴細胞耗盡前處理
在一實施態樣中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中病患在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施態樣中，本發明包括用於治療已先經非骨髓清除式化療治療之病患的癌症之TIL族群。在一實施態樣中，TIL族群係用於輸注投予。在一實施態樣中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2
/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施態樣中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，病患每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2(阿地介白素，以PROLEUKIN市售)的靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施態樣中，TIL族群係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL族群之後投予。
實驗發現指示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施態樣在導入本發明之TIL之前，對病患進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
一般來說，淋巴細胞耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。該等方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother
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5233-5239及Dudley,et al.
,J. Clin.Oncol.
2005,23,
2346-2357，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施態樣中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施態樣中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施態樣中，環磷醯胺係以100 mg/m2
/天、150 mg/m2
/天、175 mg/m2
/天、200 mg/m2
/天、225 mg/m2
/天、250 mg/m2
/天、275 mg/m2
/天或300 mg/m2
/天之劑量投予。在一些實施態樣中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2
/天i.v.投予4至5天。在一些實施態樣中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2
/天i.v.投予4天。
在一些實施態樣中，淋巴細胞耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至病患執行。在一些實施態樣中，氟達拉濱係以25 mg/m2
/天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2
/天i.v.投予4天。
在一實施態樣中，淋巴細胞耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2
/天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2
/天共五天執行。
4.IL-2方案
在一實施態樣中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包含靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體，始於投予治療有效部分的治療性TIL族群之後當天，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(病患身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸液投予直到耐受為止，最多14劑。在休息9天之後，可重複此時程再投予14劑，最多總共28劑。
在一實施態樣中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day,et al.
,J. Clin. Oncol.
1999,17,
2752-61及Eton,et al.
,Cancer
2000,88,
1703-9，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施態樣中，漸減IL-2方案包含在6小時內靜脈內投予18×106
IU/m2
，隨後在12小時內靜脈內投予18×106
IU/m2
，隨後在24小時內靜脈內投予18×106
IU/m2
，隨後在72小時內靜脈內投予 4.5×106
IU/m2
。此治療週期可每28天重複一次，最多可達四個週期。在一實施態樣中，漸減IL-2方案包含第1天18,000,000 IU/m2
，第2天9,000,000 IU/m2
及第3及4天4,500,000 IU/m2
。
在一實施態樣中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。
5.過繼性細胞轉移
過繼性細胞轉移(ACT)是一種有效的免疫療法形式且涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移至癌症病患。ACT是涉及體外辨識具有抗腫瘤活性之淋巴細胞、體外擴增這些細胞至大量及將彼等輸注至荷癌宿主的治療方式。用於過繼性轉移之淋巴細胞可衍生自經切除之腫瘤的基質(腫瘤浸潤淋巴細胞或TIL)。用於ACT之TIL可如本文所述製備。在一些實施態樣中，TIL係根據例如圖85(特別是例如圖85B)描述之方法製備。如果彼等經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)、經混合之淋巴細胞腫瘤細胞培養(MLTC)濃化或使用自體抗原呈現細胞及腫瘤衍生肽選殖，則彼等亦可衍生自或來自血液。其中淋巴細胞源自待輸注荷癌宿主的ACT稱為自體ACT。美國專利公開號2011/0052530關於一種用於執行過繼性細胞療法以促進癌症消退之方法，主要用於治療罹患轉移性黑色素瘤的病患，該案全文以引用方式併入本文中以用於這些方法。在一些實施態樣中，TIL可如本文所述投予。在一些實施態樣中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施態樣中，TIL及/或細胞毒性淋巴細胞可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL及/或細胞毒性淋巴細胞的投予可視需要持續進行。
6.額外治療方法
在另一實施態樣中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群。
在另一實施態樣中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使在如上適用之任何前述段落描述之分別投予治療有效劑量之治療性TIL族群及TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以進一步包含以始於向個體投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療個體之步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係實質腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係黑色素瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係HNSCC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係子宮頸癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係NSCLC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係高突變癌症。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以使癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施態樣中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，以使在向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以進一步包含以始於向病患投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療病患之步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係實質腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係黑色素瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係HNSCC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係子宮頸癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係NSCLC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係高突變癌症。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，以使癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案且接著向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群的用途或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物的用途，以進一步包含以始於向病患投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療病患之步驟。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係實質腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係黑色素瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係HNSCC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係子宮頸癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係NSCLC。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係胃腸道癌。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係高突變癌症。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，以使癌症係小兒高突變癌症。
7.例示性治療實施態樣
在一些實施態樣中，本揭露提供一種以腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群治療癌症之方法，該方法包含步驟:(a)從獲自病患的腫瘤片段或核心獲得第一TIL族群；(b)在第一細胞培養基中執行第一TIL族群的初始擴增以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少5倍，且其中該第一細胞培養基包含IL-2；(c)在第二細胞培養基中使用骨髓樣人工抗原呈現細胞(骨髓樣aAPC)族群執行第二TIL族群的快速擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群在快速擴增開始7天後於數量上高於第二TIL族群至少50倍；且其中該第二細胞培養基包含IL-2及OKT-3；(d)投予治療有效部分的該第三TIL族群至癌症病患。在一些實施態樣中，該IL-2係以約3000 IU/mL的初始濃度存在且OKT-3抗體係以約30 ng/mL的初始濃度存在於該第二細胞培養基中。在一些實施態樣中，第一擴增係於不超過14天的期間執行。在一些實施態樣中，第一擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對aAPC族群的比例係介於1至80與1至400之間。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對aAPC族群的比例係約1至300。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌及子宮頸癌所組成之群組。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係黑色素瘤。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係卵巢癌。在一些實施態樣中，欲治療之癌症係子宮頸癌。在一些實施態樣中，治療癌症之方法進一步包含在向病患投予第三TIL族群之前用非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案治療該病患的步驟。在一些實施態樣中，該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。
在一些實施態樣中，本揭露提供一種治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：(i)從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自小活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(iv)投予治療有效劑量的該第三TIL族群至該病患。在一些實施態樣中，該IL-2係以約3000 IU/mL的初始濃度存在且OKT-3抗體係以約30 ng/mL的初始濃度存在於該第二細胞培養基中。在一些實施態樣中，第一擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，第二擴增使用氣體可通透容器執行。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對APC族群的比例係介於1至80與1至400之間。在一些實施態樣中，在快速擴增中第二TIL族群對APC族群的比例係約1至300。在一些實施態樣中，APC是PBMC。在一些實施態樣中，該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，待治療之癌症係選自由胰癌、黑色素瘤、乳癌及卵巢癌所組成之群組。在一些實施態樣中，該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施態樣中，待治療之癌症係選自由肺癌、黑色素瘤、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌、胰癌、神經膠質母細胞瘤、結直腸癌及肉瘤所組成之群組。在一些實施態樣中，治療癌症之方法進一步包含在向病患投予第三TIL族群之前用非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案治療該病患的步驟。在一些實施態樣中，該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。在一些實施態樣中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg的阿地介白素或其生物類似物或變體直到耐受為止。
XVII.例示性實施態樣
1.一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i)從來自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或小活體組織切片獲得第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群。
2.如請求項1之方法，其中該方法進一步包含：
(iv)藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中該較大的治療性TIL族群包含相對於該第三TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群。
3.如請求項2之方法，其中在步驟(iii)後，將該等細胞自該細胞培養移除且在執行步驟(iv)之前冷凍保存於儲存介質中。
4.如請求項3之方法，其中該等細胞在執行步驟(iv)之前解凍。
5.如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(iv)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
6.如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約33天的期間之內執行。
7.如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約30天的期間之內執行。
8.如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(i)至(iii)或(iv)在一段約21天至約28天的期間之內執行。
9.如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(i)至(iii)或(iv)在約28天之內執行。
10.如前述請求項中任一項之方法，其中來自步驟(iii)或(iv)之該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
11.如請求項1之方法，其中該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
12.如請求項11之方法，其中該等PBMC係於步驟(ii)之第3至19天中任一天及/或步驟(iii)之第11至14天中任一天添加至該細胞培養。
13.如請求項2至12之方法，其中步驟(iv)之該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
14.如請求項13之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
15.如前述請求項中任一項之方法，其中該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
16.如前述請求項中任一項之方法，其中該治療性TIL族群係輸注至病患。
17.如請求項1之方法，其中步驟(ii)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
18.如請求項1之方法，其中步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
19.如請求項2之方法，其中步驟(iv)之該額外的第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
20.如請求項1之方法，其中步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
21.如請求項1之方法，其中該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
22.如請求項1之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
23.如請求項22之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該病患先前已經歷外科治療。
24.如請求項1之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
25.如請求項1之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
26.如請求項1之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
27.如請求項1之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
28.如請求項1之方法，其中步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
29.如請求項28之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
30.一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(i)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養來自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片之第一TIL族群來執行第一擴增以獲得第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；及
(ii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群。
31.如請求項30之方法，其中該方法進一步包含：
(iii)藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行該第三TIL族群的額外第二擴增，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(ii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中該較大的治療性TIL族群展現相對於該第三TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群。
32.如請求項31之方法，其中將來自步驟(ii)之該細胞培養基之該等細胞移走且在步驟(iii)之前冷凍保存於儲存介質中。
33.如請求項32之方法，其中該等細胞在步驟(iii)之前解凍。
34.如請求項30至33中任一項之方法，其中該等APC係人工APC(aAPC)或自體APC。
35.如請求項30至34中任一項之方法，其中該治療性TIL族群係輸注至病患。
36.如請求項30之方法，其中步驟(i)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
37.如請求項30之方法，其中步驟(ii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
38.如請求項30之方法，其中步驟(iii)之該額外的第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
39.如請求項30之方法，其中步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
40.如請求項30之方法，其中該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
41.如請求項30之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
42.如請求項41之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該病患先前已經歷外科治療。
43.如請求項30之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
44.如請求項30之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
45.如請求項30之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
46.如請求項30之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
47.如請求項30之方法，其中步驟(ii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
48.如請求項47之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
49.如請求項30至48中任一項之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
50.如請求項49之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
51.一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(i)從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片獲得第一TIL族群；
(ii)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；
(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iv)投予治療有效劑量的該第三TIL族群至該病患。
52.如請求項51之方法，其中該方法進一步包含在步驟(iv)之前，藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行額外第二擴增之步驟，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(iii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中該較大的治療性TIL族群包含相對於該第三TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群。
53.如請求項51之方法，其中在步驟(ii)後，將該等細胞自該細胞培養基移走且在如請求項52之額外第二擴增之前冷凍保存於儲存介質中。
54.如請求項51之方法，其中該等細胞在如請求項52之額外第二擴增之前解凍。
55.如請求項51之方法，其中步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
56.如請求項51至55之方法，其中該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
57.如請求項51之方法，其中步驟(ii)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
58.如請求項51之方法，其中步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
59.如請求項52之方法，其中額外的第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
60.如請求項51之方法，其中步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
61.如請求項51之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
62.如請求項61之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
63.如請求項51之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
64.如請求項51之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
65.如請求項51之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
66.如請求項51之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
67.如請求項51之方法，其中步驟(iii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
68.如請求項67之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
69.如請求項51至68中任一項之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
70.如請求項69之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
71.請求項51至70中任一項之方法，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。
72.一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(i)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養來自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片之第一TIL族群來執行第一擴增以獲得第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL；
(ii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群於數量上高於該第二TIL族群至少25倍，且其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(iii)投予治療有效劑量的該治療性TIL族群至該病患。
73.如請求項72之方法，其中該方法進一步包含在步驟(iii)之前，藉由用額外的IL-2、額外的OKT-3及額外的APC補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行額外第二擴增之步驟，其中該額外第二擴增執行至少14天以獲得比起步驟(ii)所獲得者較大的治療性TIL族群，其中該較大的治療性TIL族群包含相對於該第三TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群。
74.如請求項72之方法，其中將來自步驟(ii)之該細胞培養基之該等細胞移走且在如請求項73之額外第二擴增之前冷凍保存於儲存介質中。
75.如請求項74之方法，其中該等細胞在如請求項73之額外第二擴增之前解凍。
76.如請求項74之方法，其中該等細胞在步驟(iii)之前解凍。
77.如請求項72至76中任一項之方法，其中該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
78.如請求項72至77中任一項之方法，其中該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
79.如請求項72至78中任一項之方法，其中該治療性TIL族群係輸注至病患。
80.如請求項72之方法，其中步驟(i)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
81.如請求項72之方法，其中步驟(iii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
82.如請求項81之方法，其中額外的第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
83.如請求項72之方法，其中步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
84.如請求項72之方法，其中該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
85.如請求項72之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
86.如請求項85之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
87.如請求項72之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
88.如請求項72之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
89.如請求項72之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
90.如請求項72之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
91.如請求項72之方法，其中步驟(ii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL。
92.如請求項91之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
93.如請求項72至92中任一項之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第三細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
94.如請求項93之方法，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
95.一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a) 從獲自病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b) 將該第一族群加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3天至約14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約11天至約14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生。
96.如請求項95之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程將步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟。
97.如請求項96之方法，其中該冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對CS10介質執行。
98.如請求項96之方法，其中該等抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
99.如請求項98之方法，其中該等PBMC經輻照且為異體的。
100.如請求項98之方法，其中該等PBMC係於步驟(c)之第3至19天中任一天及/或步驟(d)之第11至14天中任一天添加至該細胞培養。
101.如請求項95之方法，其中該等抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞(aAPC)或自體APC。
102.如請求項95至101中任一項之方法，其中該治療性TIL族群係輸注至病患。
103.如請求項95之方法，其中步驟(c)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
104.如請求項95之方法，其中步驟(d)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
105.如請求項95之方法，其中步驟(a)之該FNA包含至少400,000個TIL。
106.如請求項95之方法，其中該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
107.如請求項95之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
108.如請求項107之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
109.如請求項95之方法，其中步驟(a)之該等TIL獲自FNA。
110.如請求項95之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
111.如請求項95之方法，其中步驟(a)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
112.如請求項95之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
113.如請求項95之方法，其中步驟(e)之該收集使用LOVO細胞處理系統執行。
114.如請求項95之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
115.如請求項95之方法，其中步驟(f)之該輸注袋係HypoThermosol輸注袋。
116.如請求項95之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約21天至約33天的期間之內執行。
117.如請求項95之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約21天至約30天的期間之內執行。
118.如請求項95之方法，其中步驟(a)至(f)在一段約21天至約28天的期間之內執行。
119.如請求項95之方法，其中步驟(a)至(f)在22天或更少天內執行。
120.如請求項96之方法，其中步驟(a)至(f)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
121.如請求項95至120中任一項之方法，其中步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL。
122.如請求項121之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
123.如請求項95至122中任一項之方法，其中步驟(b)至(e)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(b)至(e)相較於在超過一個容器中執行步驟(b)至(e)導致增加每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率。
124.如請求項95至123中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞係於步驟(d)之該第二期間添加至該等TIL而無需打開該系統。
125.如請求項95至124中任一項之方法，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
126.如請求項95至125中任一項之方法，其中獲自該第三TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
127.如請求項95至126中任一項之方法，其中微生物污染之風險相較於開放系統減少。
128.如請求項95至128中任一項之方法，其中來自步驟(g)之該等TIL係輸注至病患。
129.一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該投予經擴增的TIL包含：
(a) 從自個體所切除的腫瘤的細針抽吸物(FNA)或核心活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b) 將該第一族群加入密閉系統；
(c) 藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基在第3天補充OKT-3，其中該第一擴增執行約3天至約19天以獲得該第二TIL族群，其中當該第一TIL族群係來自核心活體組織切片時，到約10天至約19天該第二TIL族群包含至少5×107
個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第一擴增執行約3天至約14天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；
(d) 藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約7至14天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，該治療性TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；
(e) 收集自步驟(d)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(d)轉變至步驟(e)無需打開該系統而發生；及
(f) 將得自步驟(e)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(e)轉移至步驟(f)無需打開該系統而發生；
(g) 可選地使用冷凍保存過程將步驟(f)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存；及
(h) 投予治療有效劑量的來自步驟(g)之該輸注袋的該第三TIL族群至該病患。
130.如請求項129之方法，其中步驟(e)所收集之該治療性TIL族群包含對步驟(h)之投予治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL。
131.如請求項129或130之方法，其中該等APC係人工APC (aAPC)或自體APC。
132.如請求項129至131中任一項之方法，其中該治療性TIL族群係輸注至病患。
133.如請求項129之方法，其中步驟(c)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
134.如請求項129之方法，其中步驟(d)之該第二擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
135.如請求項129之方法，其中步驟(a)之該FNA包含至少400,000個TIL。
136.如請求項129之方法，其中該核心活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤及卵巢腫瘤。
137.如請求項129之方法，其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。
138.如請求項137之方法，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且可選地其中該個體先前已經歷外科治療。
139.如請求項129之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自FNA。
140.如請求項139之方法，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
141.如請求項129之方法，其中步驟(i)之該等TIL獲自核心活體組織切片。
142.如請求項141之方法，其中該核心活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
143.如請求項129之方法，其中對步驟(h)之投予治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010
至約13.7×1010
個。
144.如請求項129之方法，其中該等抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
145.如請求項144之方法，其中該等PBMC係於步驟(c)之第3至19天中任一天及/或步驟(d)之第9至14天中任一天添加至該細胞培養。
146.如請求項129至145中任一項之方法，其中在步驟(h)之投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該病患投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)。
147.如請求項146之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2
/天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2
/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
148.如請求項129至147中任一項之方法，其進一步包含始於步驟(h)之向該病患投予該等TIL細胞之後當天使用高劑量IL-2方案治療該病患的步驟。
149.如請求項148之方法，其中該高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
150.如請求項129至149中任一項之方法，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現。
151.如請求項129至150中任一項之方法，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
152.一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：
(a)從病患腫瘤的細針抽吸物(FNA)、小活體組織切片或核心活體組織切片獲得第一TIL族群；
(b)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行預備性第一擴增而產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行約1至7天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群；
(c)藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至約11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及
(d)收集步驟(c)之該治療性TIL族群。
實例
在本文中涵蓋的實施態樣現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。
實例1：製備用於REP前及REP過程的介質
此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基使用於涉及衍生自各種腫瘤類型包括但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)培養之規程。此介質可用於製備本申請案及實例中所述之任何TIL。
CM1之製備
將下列試劑移出冷藏並使彼等在37℃水浴中溫熱：(RPMI1640、人AB血清、200mM L-麩醯胺酸)。根據下表32，藉由添加各成分至所欲過濾之體積適當的0.2 µm過濾器單位的頂部來製備CM1介質。儲存在4℃下。
在使用當天，在37℃水浴中預溫熱所需量的CM1並添加6000 IU/mL IL-2。
額外補充-根據表33視需要補充。
CM2之製備
將製備好的CM1自冰箱移出或如上7.3節所示製備新鮮CM1。自冰箱移出AIM-V®，將製備好的CM1與等體積的AIM-V®在無菌介質瓶中混合來製備所需量的CM2。在使用當天添加3000 IU/mL IL-2至CM2介質。在使用當天製作足量的含3000 IU/mL IL-2之CM2。將CM2介質瓶標示名稱、製備者首字母、過濾/製備日期、二週到期日並儲存在4℃下直到需用於組織培養時。
CM3之製備
在需要使用的當天製備CM3。CM3與AIM-V®介質相同，在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由直接添加IL-2儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM3量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IU/mL IL-2」。如果有過量的CM3，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、製備者首字母、介質製備日期及其到期日(製備後7天)。丟棄在4℃下儲存7天後之補充有IL-2之介質。
CM4之製備
CM4與CM3相同，但具有額外的2mM GlutaMAXTM
(最終濃度)補充物。每1 L的CM3，添加10 ml的200 mM GlutaMAXTM
。藉由直接添加IL-2儲備溶液及GlutaMAXTM
儲備溶液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM4量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IL/ml IL-2及GlutaMAX」。如果有過量的CM4，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示介質名稱、「GlutaMAX」及其到期日(製備後7天)。丟棄在4℃下儲存7天後之補充有IL-2之介質。
實例2：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例之TIL過程之組合。
使用在本文中描述之過程，在實驗的一組中，TIL係在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFNg)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J.,
J Transl Med., 2013,11:
37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+
及CD8+
兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL中偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+
族群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中的IFNg及CD107a上升。
實例3：合格化經γ輻照的周邊單核細胞個別批量
此實例描述使經γ輻照的周邊單核細胞(PBMC，亦稱為MNC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為異體餵養細胞。
各批經輻照的MNC餵養細胞係自個別供體製備。各批或供體在經純化的抗CD3(克隆OKT3)抗體及介白素2 (IL-2)存在下在REP中擴增TIL的能力係經個別篩檢。此外，各批餵養細胞在不添加TIL下測試，以驗證所接受的γ輻射劑量足以使彼等複製不能。
背景
經γ輻照、生長停頓的MNC餵養細胞係TIL之REP所需。餵養細胞MNC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與REP培養瓶中的TIL交聯，刺激TIL擴增。餵養細胞批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、輻照並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的病患不得輸注存活餵養細胞，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此餵養細胞藉由接受細胞γ-輻照來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失MNC細胞的細胞存活性。
評估標準及實驗設置
以二個標準評估餵養細胞批量：1)彼等在共培養中擴增TIL的能力＞100倍，及2)彼等之複製不能性。
餵養細胞批量在迷你REP格式中利用二個在直立式T25組織培養培養瓶中生長的初代REP前TIL細胞系測試。餵養細胞批量係以二個不同的TIL細胞系測試，其中各TIL細胞系在REP中因應活化而增生的能力不同。一批過去已顯示符合以上標準的經輻照的MNC餵養細胞在測試批量旁一起運行作為對照組。
為了確保所有單一實驗中的測試批量接受等效測試，相同REP前TIL細胞系的足夠原液可用於測試所有條件及所有餵養細胞批量。
每批測試的餵養細胞總共有六個T25培養瓶：REP前TIL細胞系#1(2個培養瓶)；REP前TIL細胞系#2(2個培養瓶)；及餵養細胞對照組(2個培養瓶)。評估含有TIL細胞系#1及#2的培養瓶中之餵養細胞批量擴增TIL的能力。評估餵養細胞對照組培養瓶中之餵養細胞批量的複製不能性。
實驗規程
第-2/3天，解凍TIL細胞系
製備CM2介質。在37℃水浴中溫熱CM2。製備含40 mL的補充有3000 IU/ml IL-2之CM2。保持溫熱直到使用。將20 mL不含IL-2的預熱CM2放入二個標示有所使用的TIL細胞系名稱之50 mL錐形管中之各者。自LN2
儲存移出二個指定的REP前TIL細胞系並將小瓶轉移至組織培養室。將小瓶放在密封夾鏈儲存袋中在37℃水浴中解凍，直到剩下少量的冰。
使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至經製備、標示的50 mL錐形管中的20 mL CM2中。使用不含IL-2的CM2補足(QS)至40 mL以洗滌細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於補充有3000 IU/mL IL-2之5 mL溫熱CM2中。
移出雙份小等分試樣(20 µL)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。當計數時，將含有TIL細胞的50 mL錐形管放入增濕37℃、5% CO2
孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。判定細胞濃度並將TIL稀釋至1×106
個細胞/mL於補充有3000 IU/mL IL-2之CM2中。
在增濕37℃孵養箱中視需要培養於24孔組織培養板中盡可能多孔的2 mL/孔中直到迷你REP的第0天。在分開的24孔組織培養板上培養不同的TIL細胞系，以避免混淆及可能的交叉污染。
第0天，起始迷你REP
為欲測試的餵養細胞批量數製備足夠的CM2介質。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備800 mL的CM2介質)。取等分試樣的一部分上述製備之CM2並補充3000 IU/mL IL-2以用於培養細胞。(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備500 mL的含3000 IU/mL IL-2之CM2介質)。
分開處理各TIL細胞系以預防交叉污染，自孵養箱移出有TIL培養的24孔板且轉移至BSC。
使用無菌移液吸管或100至1000 µL吸量管及吸管尖，自所欲使用的TIL各孔移出約1 mL的介質並放入24孔組織培養板之未使用孔中。
使用新的無菌移液吸管或100至1000 µL吸量管及吸管尖，將剩餘介質與TIL在孔中混合以重懸細胞，接著將細胞懸浮液轉移至標示TIL名稱且記錄體積的50 mL錐形管中。
用儲備介質洗滌孔，並將該體積轉移至相同的50 mL錐形管。將細胞在400 x CF下離心以收集細胞團塊。抽吸掉介質上清液並將細胞團塊重懸於含有3000 IU/ml IL-2之2至5 mL的CM2介質中，所欲使用的體積基於收集的孔數及團塊大小而定，該體積應足以確保＞1.3×106
個細胞/mL的濃度。
使用血清吸管，將細胞懸浮液徹底混合並記錄體積。移出200 µL，使用自動細胞計數器進行細胞計數。當計數時，將含有TIL細胞的50 mL錐形管放入增濕、5% CO2
、37℃孵養箱中，且將蓋子鬆開以允許氣體交換。記錄計數。
自孵養箱移出含有TIL細胞之50 ml錐形管，並將細胞以1.3×106
個細胞/mL之濃度重懸於補充有3000 IU/mL IL-2之溫熱CM2中。將50 mL錐形管放回孵養箱，蓋子鬆開。
第二TIL細胞系重複以上步驟。
在將TIL接種至T25培養瓶進行實驗之前，將TIL如以下所示稀釋1:10以達1.3×105
個細胞/mL之最終濃度。
製備MACS GMP CD3 pure (OKT3)工作溶液
自4℃冰箱取出OKT3儲備溶液(1 mg/mL)並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30 ng/mL的OKT3。
在實驗的各T25培養瓶中，20 ml需要600 ng的OKT3；此相當於每20 mL需要60 µL的10 µg/mL溶液，或每批餵養細胞的所有6個測試培養瓶需要360 µL。
就每批測試的餵養細胞而言，製備400 µL的1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液，工作濃度為10 µg/mL(例如為了一次測試4批餵養細胞，製備1600 µL的1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液：16 µL的1 mg/mL OKT3+1.584 mL的含3000 IU/mL IL-2之CM2介質)。
製備T25培養瓶
在製備餵養細胞之前，標示各培養瓶並用CM2介質填充培養瓶。將培養瓶放入37℃增濕5% CO2
孵養箱以保持介質溫熱，等待添加剩餘組分。一旦餵養細胞製備好，將組分添加至各培養瓶中的CM2中。
製備餵養細胞
此規程測試的每批最少需要78×106
個餵養細胞。由SDBB冷凍的每1 ml小瓶在冷凍時具有100×106
個存活細胞。假設自LN2
儲存解凍後有50%回收率，建議每批解凍至少二個1 mL小瓶的餵養細胞，各REP給出預估100×106
個存活細胞。替代地，如果供應1.8 ml小瓶，僅一個小瓶提供足夠的餵養細胞。
在解凍餵養細胞之前，為每批欲測試的餵養細胞預熱大約50 mL的不含IL-2之CM2。自LN2
儲存移出指定的餵養細胞批量小瓶、放入夾鏈儲存袋中並放在冰上。將密封夾鏈儲存袋內的小瓶浸入37℃水浴中解凍。自夾鏈袋移出小瓶、噴灑或擦拭70% EtOH並將小瓶轉移至BSC。
使用移液吸管，立即將餵養細胞小瓶的內容物轉移至50 mL錐形管中的30 mL溫熱CM2中。用小體積的CM2洗滌小瓶，以移除小瓶中的任何殘餘細胞。在400 x CF下離心5分鐘。抽吸上清液並重懸於4 mL溫熱CM2加上3000 IU/mL IL-2中。移出200 µL，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。
將細胞以1.3×107
個細胞/mL重懸於溫熱CM2加上3000 IU/mL IL-2中。將TIL細胞自1.3×106
個細胞/mL稀釋至1.3×105
個細胞/mL。
設置共培養
將TIL細胞自1.3×106
個細胞/mL稀釋至1.3×105
個細胞/mL。添加4.5 ml的CM2介質至15 mL錐形管。自孵養箱移出TIL細胞並使用10 mL血清吸管重懸均勻。自1.3×106
個細胞/mL TIL懸浮液移出0.5 mL的細胞並添加至15 mL錐形管中4.5 mL的介質。將TIL原液小瓶放回孵養箱。混合均勻。第二TIL細胞系重複進行。
將含有預熱介質之單一餵養細胞批量培養瓶從孵養箱轉移至BSC。用1 mL吸管尖吸放混合餵養細胞數次並轉移1 mL(1.3×107
細胞)的餵養細胞批量至各培養瓶。添加60 µL的OKT3工作原液(10 µg/mL)至各培養瓶。將二個對照培養瓶放回孵養箱。
將1 mL(1.3×105
)的各TIL批量轉移至對應標示的T25培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養。不要擾動直到第5天。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
第5天，介質更換
製備含3000 IU/mL IL-2之CM2。各培養瓶需要10 ml。使用10 mL吸量管，將含3000 IU/mL IL-2的10 mL溫熱CM2轉移至各培養瓶。將培養瓶放回孵養箱並直立孵養直到第7天。重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
第7天，收集
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不要擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各測試培養瓶移出10 ml的介質且從各對照組培養瓶移出15 ml的介質。
使用10 mL血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200 µL進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。在第7天記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
根據下表TT，評估餵養細胞對照組培養瓶中之複製不能性及評估含有TIL之培養瓶自第0天的擴增倍數。
第7天，持續餵養細胞對照組培養瓶至第14天
在完成餵養細胞對照組培養瓶的第7天計數後，添加含有3000 IU/mL IL-2之15 mL的新鮮CM2介質至各對照組培養瓶。將對照組培養瓶放回孵養箱並以直立位置孵養直到第14天。
第14天，餵養細胞對照組培養瓶的延長不增生
自孵養箱移出培養瓶並轉移至BSC，小心不要擾動培養瓶底部的細胞層。在不擾動生長在培養瓶底部的細胞下，從各對照組培養瓶移出大約17 ml的介質。使用5 mL血清吸管，將細胞重懸於剩餘介質中並混合均勻以打斷任何細胞結塊。記錄各培養瓶的體積。
在藉由吸量管吸放徹底混合細胞懸浮液之後，移出200 µl進行細胞計數。使用適當標準作業程序搭配自動化細胞計數器設備計數TIL。記錄計數。
重複進行於所有測試的餵養細胞批量。
結果及接受標準
結果
γ輻照的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，且亦證實REP培養第7天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。
預期所有餵養細胞批量到REP培養第7天皆符合TIL生長100倍擴增之評估標準。
預期餵養細胞對照組培養瓶的第14天計數持續第7天所見之不增生趨勢。
接受標準
每批餵養細胞測試的每個複製TIL細胞系皆符合下列接受標準。
接受如下為兩面向(如下表35所概述)。
評估輻射劑量是否足以使MNC餵養細胞在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養時複製不能。複製不能係藉由在REP第7天及第14天的自動化細胞計數判定的總存活細胞計數(TVC)評估。
接受標準為「無生長」，表示在第7天及第14天的總存活細胞數量相較於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量並未增加。
評估餵養細胞支持TIL擴增的能力。TIL生長係以存活細胞從REP的第0天開始培養到REP的第7天的擴增倍數測量。在第7天，TIL培養達成最小100倍擴增(即大於在REP第0天放入培養中的總存活TIL細胞數量的100倍)，如自動化細胞計數所評估。
不符合接受標準的MNC餵養細胞批量之列聯測試(Contingency Testing)
如果MNC餵養細胞批量不符合上述任一接受標準，將採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其原因。
如果該批量有二或更多個剩餘衛星測試小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星測試小瓶，則該批量根據上列接受標準為失敗。
為了合格，有問題的批量及對照組批量必須達成上述接受標準。符合這些標準後，該批量才可提供使用。
實例4：合格化經γ輻照的周邊血液單核細胞個別批量
此實例描述使經γ輻照的周邊血液單核細胞(PBMC)個別批量合格的新穎的簡化程序，該等細胞在本文所述之例示性方法用來作為異體餵養細胞。此實例提供評估用於產生TIL臨床批量之經輻照的PBMC細胞批量之規程。各批經輻照的PBMC係自個別供體製備。在超過100個合格化規程期間，已顯示在所有情況下，來自SDBB (San Diego Blood Bank)之經輻照的PBMC批量在REP第7天擴增TIL ＞100倍。此經改良的合格化規程意圖用於來自SDBB之經輻照的供體PBMC批量，該等批量接著經過進一步測試以驗證接受γ輻射劑量足以使彼等複製不能。一旦證實彼等在14天期間維持複製不能，即認為供體PBMC批量「合格」，可用於產生TIL臨床批量。
背景
經γ輻照、生長停頓的PBMC係目前TIL之標準REP所需。PBMC上的膜受體與抗CD3(克隆OKT3)抗體結合且與培養中的TIL交聯，刺激TIL擴增。PBMC批量係從採自個別供體之全血的白血球分離術製備。將白血球分離術產物進行Ficoll-Hypaque離心、洗滌、輻照並在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，接受TIL療法的病患不得輸注存活PBMC，因為其可導致移植物抗宿主病(GVHD)。因此供體PBMC藉由接受細胞γ-輻照來使生長停頓，導致雙股DNA斷裂且在再培養時喪失PBMC的細胞存活性。
評估標準
7.2.1經輻照的PBMC批量之複製不能性的評估標準。
實驗設置
餵養細胞批量在迷你REP格式中如同彼等將與TIL共培養般測試，使用直立式T25組織培養培養瓶。對照組批量：一批過去已顯示符合7.2.1標準的經輻照的PBMC在實驗批量旁一起運行作為對照組。每批測試的經輻照的供體PBMC皆以雙份培養瓶運行。
實驗方案
第0天
為欲測試的每批供體PBMC製備約90 ml的CM2介質。將CM2於37℃水浴中保持溫熱。解凍等分試樣的6×106
IU/mL IL-2。將CM2介質放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。就每批測試的PBMC而言，移出約60 mL的CM2至分開的無菌瓶。添加解凍的6×106
IU/mL IL-2儲備溶液至此介質以達最終濃度3000 IU/mL。將此瓶標示為「CM2/IL2」(或類似用語)以與未經補充的CM2區別。
製備OKT3
自4℃冰箱取出抗CD3(OKT3)儲備溶液並放在BSC中。在迷你REP的介質中使用最終濃度30 ng/mL的OKT3。從1 mg/mL儲備溶液製備10 µg/mL的抗CD3(OKT3)工作溶液。需要前放在冰箱中。
就每批測試的PBMC而言，製備150 µL的抗CD3(OKT3)原液之1:100稀釋液。例如，為了一次測試4批PBMC，添加6 µL的1 mg/mL儲備溶液至594 µL的補充有3000 IU/mL IL-2之CM2，製備600 µL的10 µg/mL抗CD3 (OKT3)。
製備培養瓶
添加每培養瓶19 mL的CM2/IL-2至經標示的T25培養瓶，並將培養瓶放入37℃、增濕、5% CO2
孵養箱中，同時製備細胞。
製備輻照的PBMC
自LN2
儲存取出欲測試的PBMC批量小瓶。在解凍之前將其等放在-80℃下或保持在乾冰上。對於每個欲解凍的批量，將30 mL的CM2(不含IL-2補充物)放入50 mL錐形管。在各管標示欲解凍的PBMC之不同批號。在使用前將管的蓋子蓋緊並放入37℃水浴中。視需要，將50 mL錐形管放回BSC，在放入通風櫥之前用70% EtOH擦拭。
自冷藏移出PBMC小瓶並放入在37℃水浴中之漂浮式管架以解凍。允許解凍進行，直到小瓶中剩下少量的冰。使用無菌移液吸管，立即將小瓶內容物轉移至50 ml錐形管中的30 mL CM2中。自管中移出約1 mL的介質以潤洗小瓶；將潤洗液放回50 mL錐形管中。將蓋子蓋緊並輕柔渦漩以洗滌細胞。
在400 x g下在室溫下離心5min。使用1000 µL吸管尖抽吸上清液並將細胞團塊重懸於1 mL的溫熱CM2/IL-2中。替代地，在添加介質之前，藉由將加蓋管沿著空管架拖行使細胞團塊重懸。在重懸細胞團塊之後，使用CM2/IL-2介質將體積加至4 mL。記錄體積。
移出小等分試樣(例如100 µL)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。根據特定自動細胞計數器SOP，執行雙份計數。極有可能必須在執行細胞計數之前執行PBMC稀釋。建議起始稀釋為1:10，但此將視所使用的細胞計數器類型而異。記錄計數。
使用CM2/IL-2介質，將PBMC濃度調整至1.3×107
個細胞/mL。藉由輕柔渦漩或藉由使用血清吸管輕柔上下抽吸來混合均勻。
設置培養瓶
將二個經標示的T25培養瓶從組織培養孵養箱放回BSC。將10 µg/mL小瓶的抗CD3/OKT3放回BSC。添加1 mL的1.3×107
PBMC細胞懸浮液至各培養瓶。添加60 µL的10 µg/mL抗CD3/OKT3至各培養瓶。將加蓋培養瓶放回組織培養孵養箱，在不擾動下生長14天。將抗CD3/OKT3小瓶放回冰箱中，直到下一批需要時。重複於欲評估的各批PBMC。
第14天，測量PBMC的不增生
將雙份T25培養瓶放回BSC。對於各培養瓶，使用新的10 mL血清吸管，自每個培養瓶移出約17 mL，接著小心抽起剩餘介質以測量培養瓶中剩餘的體積。記錄體積。
使用同一支血清吸管上下吸放，均勻混合樣本。
自各培養瓶移出200 µL樣本進行計數。使用自動細胞計數器計數細胞。重複步驟，評估每批PBMC。
結果及接受標準
結果
預期γ輻照的劑量足以使餵養細胞複製不能。預期所有批量皆符合評估標準，證實REP培養第14天剩餘的餵養細胞總存活數量相較於第0天減少。
接受標準
每批測試的經輻照的供體PBMC皆符合下列接受標準：「無生長」，表示第14天存活細胞總數小於在REP的第0天放入培養中的初始存活細胞數量。
不符合接受標準的PBMC批量之列聯測試。
如果經輻照的供體PBMC批量不符合上述接受標準，採取下列步驟重新測試批量以排除簡單實驗誤差為其失敗原因。如果該批量有二或更多個剩餘衛星小瓶，則將該批量重新測試。如果該批量有一個或沒有剩餘衛星小瓶，則該批量根據上述接受標準為失敗。
為了合格，進行列聯測試的PBMC批量中的兩個對照組批量及兩個有問題的批量複製皆需達成接受標準。符合此標準後，該批量才可提供使用。
實例5：製備IL-2儲備溶液(CELLGENIX)
此實例描述將經純化、冷凍乾燥的重組人介白素-2溶解成適用於進一步組織培養規程之原液樣本的過程，包括所有該些於本申請案及實例所述者，包括該些涉及使用rhIL-2者。
程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29 mL無菌水轉移至50 mL錐形管。添加1 mL 1 N乙酸至50 mL錐形管。倒轉管2至3次以混合均勻。將HAc溶液藉由使用Steriflip過濾器過濾滅菌。
製備含1% HSA的PBS。添加4 mL的25% HSA儲備溶液至於150 mL無菌過濾器單位中之96 mL PBS。過濾溶液。儲存在4℃下。對於所製備的各小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2儲備溶液(6×106
IU/mL最終濃度)。每批rh1L-2皆不同且需要廠商檢驗證明書(COA)中提供的資訊，諸如：1) rhIL-2的每小瓶質量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)建議0.2% HAc重構體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批量所需的1% HSA體積：
例如，根據CellGenix的rhIL-2批量10200121 COA，1 mg小瓶的比活性為25×106
lU/mg。建議將rhIL-2重構於2 mL 0.2% HAc中。
用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡膠瓶塞。使用附接至3 mL注射器的16G針頭，注射建議體積的0.2% HAc至小瓶中。在抽出針頭時，小心不要使瓶塞脫出。倒轉小瓶3次且渦漩直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。添加經計算體積的1% HSA至小瓶。
儲存rhIL-2溶液。短期儲存時(＜72 hrs)，將小瓶儲存在4℃下。長期儲存時(＞72 hrs)，將小瓶等分成更小體積且儲存在-20℃冷凍小瓶中，直到準備使用為止。避免冷凍/解凍循環。製備日期後6個月到期。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄編號、批號、到期日、作業者首字母、等分試樣的濃度及體積。
實例6：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed控速冷凍器型號7454(Thermo Scientific)，將實例G中所述之簡化密閉程序製備的TIL冷凍保存的過程方法。
使用的設備如下：鋁盒固定架(與CS750冷凍袋相容)、750 mL袋子的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液態氮瓶、冰箱、熱電偶感測器(用於袋子的帶型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供0.5℃速率從成核到-20℃及每分鐘1℃到-80℃終末溫度的冷卻速率。程式參數如下：步驟1-在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)到-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫度)到-45℃；步驟4：10.0℃/min (室溫度)到-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫度)到-20℃；及步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)到-80℃。
實例7：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例1至6之TIL過程之組合。
使用實例1至9之過程，TIL係在實驗的一組中在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFNg)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J.,
J Transl Med., 2013,11:
37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+
及CD8+
兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL中偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+
族群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中的IFNg及CD107a上升。
實例8：來自細針抽吸物(FNA)及核心針吸活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增
I.背景
此實例提供與擴增來自細針抽吸或核心針吸活體組織切片所獲得的腫瘤樣本之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)相關之資料。
研究目標是要發展一種擴增來自核心針吸活體組織切片或細針抽吸物之TIL的方法。在一些情況下，3至5個腫瘤樣本係獲自癌症病患，諸如肺癌(n=3)、黑色素瘤(n=1)、頭頸癌(n=1)、子宮頸癌(n=1)、卵巢癌(n=3)、胰癌(n=2)、神經膠質母細胞瘤(GBM)、及結直腸癌(n=1)。
II.來自胰癌病患核心活體組織切片之擴增TIL(P7015)。
收到用於研究的胰核心活體組織切片。將一個核心放入24孔板的一孔中，總共5孔。當二個核心放入二孔中時，在這些孔中觀察到很少或沒有生長。三孔用補充有IL-2的培養基處理，且二孔用補充有含有IL-2、IL-15、及IL-21之細胞介素雞尾酒的培養基處理。在僅用IL-2處理的孔中(圖8A)及用細胞介素雞尾酒處理的孔中(圖8B)觀察到存活細胞。用IL-2處理獲得約1.3×106
個存活細胞/孔(平均1.2×106
個存活細胞/孔)。用細胞介素雞尾酒處理獲得約2.3×106
個存活細胞/孔(平均2.0×106
個存活細胞/孔)。
圖17A、17B及17C顯示衍生自胰腫瘤核心活體組織切片之TIL的表型分析及功能狀態。TIL係自胰腫瘤擴增且培養於含有IL-2之介質或補充有細胞培養添加劑之介質中。TIL係於補充IL-2之培養基及含有細胞培養添加劑之培養基中自胰腫瘤擴增(圖17D)。圖17A顯示CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD3+/CD56+、或CD3‑/CD56+之細胞百分比。圖17B顯示CD4+亞族群在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激後相較於未刺激條件下之CD107a細胞的百分比。圖17C顯示來自胰核心活體組織切片之擴增TIL的功能分析。該圖顯示CD8+亞族群在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激後相較於未刺激條件下之CD107a細胞的百分比。
大部分自胰核心活體組織切片擴增的細胞係T細胞(CD4+細胞及CD8+細胞)。PMA刺激證實CD8+去顆粒的能力，如CD107a+之表現所示，藉此暗示這些細胞具功能性。表現CD107a+之CD8+的%在用培養添加劑孔處理之孔中高於僅IL-2(圖17C)。
III.來自子宮頸癌病患細針抽吸物之擴增TIL(C2005)。
收到用於研究的子宮頸腫瘤。使用22號針頭及注射器，自腫瘤單離五個細針抽吸物。將各FNA樣本放入24孔板的至少三孔中。各樣本的二孔用IL-2處理，且各樣本的一孔用細胞介素雞尾酒處理(IL-2、IL-15及IL-21)。
圖10A顯示CD4+及CD8+ T細胞存在於用IL-2處理之FNA。平均來說，3.45×105
個存活細胞/孔存在於IL-2處理孔中。圖10B顯示CD4+及CD8+ T細胞存在於用細胞介素雞尾酒處理之FNA。平均來說，8.69×105
個存活細胞/孔存在於該些孔中。IL-2、IL-15及IL-21處理抽吸物相較於IL-2處理抽吸物證實較多個細胞/孔。雞尾酒處理孔(20.1%)中的CD8+細胞百分比高於IL-2處理孔(8.58%)。
IV.來自肺癌病患細針抽吸物之擴增TIL(L4032)。
收到用於研究的三個肺腫瘤。使用22號針頭及注射器，自腫瘤單離細針抽吸物。一個FNA樣本包括1.6×106
個細胞，其中有28%存活細胞。二孔(各條件)用補充有(1)僅IL-2或(2)細胞介素雞尾酒之培養基處理。此外，肺腫瘤片段培養於24孔板(各二孔)作為對照組。在第13天收集細胞並用FACS分析。
圖11A顯示自IL-2處理之FNA樣本擴增的T細胞。平均有約4.64×105
個存活細胞/孔。圖11B顯示自含有IL-2、IL-15及IL-21之雞尾酒處理之FNA樣本擴增的T細胞。平均有約7.75×105
個存活細胞/孔。圖11C顯示自IL-2處理之肺腫瘤片段擴增的T細胞。平均有約4.28×105
個存活細胞/孔。
接下來，培養自FNA樣本的TIL使用快速擴增規程(例如
，第二擴增規程或步驟D)擴增。在第14天收集細胞並用FACS分析。圖12A顯示來自用(i) IL-2、(ii) IL-2、IL-15及IL-21、及(iii) IL-2、IL-15及IL-21變成IL-2處理之FNA樣本的擴增TIL之總細胞數。圖12A顯示在第二擴增後，TIL包括CD4+及CD8+ T細胞(分別為84.1%及10.3%)。
V.來自肺癌病患細針抽吸物之擴增TIL(L4033)。
使用22號針頭及注射器，自肺腫瘤單離細針抽吸物。FNA樣本包括5.5×106
個細胞，其中有76%存活細胞。一個G-Rex 10培養瓶(各條件)用含有(1)僅IL-2或(2)細胞介素雞尾酒之培養基處理。此外，四個肺腫瘤片段培養於G-Rex 10培養瓶作為對照組。在第12天收集細胞並用FACS分析。圖13A顯示獲自用IL-2處理之FNA樣本的CD4+ T細胞(4.25%)及CD8+ T細胞(55.1%)。圖13B顯示獲自用IL-2處理之腫瘤片段的CD4+ T細胞(7.76%)及CD8+ T細胞(54.5%)。
接下來，培養自FNA樣本的TIL使用快速擴增規程(例如
，第二擴增規程或步驟D)擴增。前6天將抽吸物孵養於錐形管。在第14天收集細胞並用FACS分析。圖14顯示來自用IL-2處理之FNA樣本及腫瘤片段之擴增TIL的總細胞數。該圖顯示來自FNA樣本之TIL與來自腫瘤片段之TIL的擴增類似。
在一類似實驗中，FNA樣本係自肺癌病患的三個肺腫瘤樣本單離(L4034)。約1.0×106
個來自FNA樣本之細胞係培養於G-Rex 10培養瓶中僅補充有IL-2的培養基中15天。作為對照組，四個腫瘤片段係培養於G-Rex 10培養瓶中僅補充有IL-2的培養基中。少數至無可偵測細胞係收集自FNA培養。
VI.來自卵巢癌病患細針抽吸物之擴增TIL(OV8011、OV8012及OV8013)。
收到用於研究的三個卵巢腫瘤(OV8011、OV8012、及OV8013)。使用22號針頭及注射器，自腫瘤單離細針抽吸物。
來自OV8011之FNA樣本包括3.19×105
個細胞，其中有28%存活細胞。此FNA樣本分成四孔；二孔培養於含有IL-2之培養基中及二孔培養於含有IL-2、IL-15及IL-21之培養基中。來自OV8012之FNA樣本包括8.3×105
個細胞，其中有11%存活細胞。此FNA樣本分成二孔；一孔培養於含有IL-2之培養基中及另一孔培養於含有IL-2、IL-15及IL-21之培養基中。來自OV8013之FNA樣本包括1.5×105
個細胞，其中有7%存活細胞。此FNA樣本分成二孔；一孔培養於含有IL-2之培養基中及另一孔培養於含有IL-2、IL-15及IL-21之培養基中。FNA樣本沒有觀察到擴增。
作為對照組，來自各腫瘤的四個腫瘤片段係培養於G-Rex 10培養瓶中。一些培養瓶接受僅含有IL-2之培養基及其他培養瓶接受含有IL-2、Il-15及IL-21之培養基。圖15顯示衍生自培養於含有(1)僅IL-2或(2)細胞介素雞尾酒之培養基中之卵巢腫瘤片段之細胞的總細胞數。結果顯示卵巢腫瘤在第一擴增中擴增不良。
VII.來自黑色素瘤病患細針抽吸物之擴增TIL(M1101)。
收到用於研究的黑色素瘤腫瘤(M1101)。FNA樣本係獲自腫瘤。樣本包括1.96×106
個細胞，其中有65%存活細胞。將樣本放入G-Rex 10培養瓶且用補充有IL-2的培養基處理。作為對照組，四個黑色素瘤腫瘤片段係放入G-Rex 10培養瓶中且用補充有IL-2的培養基處理。在第12天收集細胞。圖16A顯示自IL-2處理之FNA樣本擴增的CD4+ T細胞(21.4%)及CD8+ T細胞(52.8%)。圖16B顯示自IL-2處理之腫瘤片段擴增的CD4+ T細胞(18.0%)及CD8+ T細胞(71.5%)。
圖18A及18B提供獲自核心活體組織切片及細針抽吸物之結果摘要。
VIII.來自黑色素瘤病患細針抽吸物之擴增TIL (M1101)。
在REP前的第11天，對含有抽吸物及片段的培養瓶執行細胞計數(n=2)。在第11天收集含有片段的REP前培養(Gen2)。繼續含有抽吸物的REP前培養，因為第11天的細胞數低。第18天重新計數抽吸物且接著第21天再次重新計數(圖19A)。在第21天，培養達到幾乎60×106
個細胞，此時收集細胞且經由流動式細胞測量術評估。顯示來自片段及抽吸物之REP前TIL的表型(圖19B)及功能(CD107a表現，圖19C)是可相比的。
圖19A、19B及19C顯示來自另一名黑色素瘤病患之FNA樣本的TIL擴增(M1107)。圖19A顯示擴增期間不同時間的總細胞數。圖19B顯示擴增TIL之表型。圖19C顯示來自片段及抽吸物之擴增TIL的功能分析。該圖顯示CD4+及CD8+亞族群在PMA刺激後相較於未刺激條件下之CD107a細胞的百分比。
實例9：來自細針抽吸物(FNA)及核心針吸活體組織切片之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)擴增
I.胰核心：資料顯示於圖20至29。
報告十五個腫瘤(胰、肺、子宮頸、間皮瘤、結直腸)。到目前為止，已收到37個不同組織學之腫瘤樣本，包括胰癌、子宮頸癌、肺癌、口腔及食道癌、肉瘤癌症。
腫瘤一抵達即經碎斷並與IL-2一起放入培養瓶/板進行快速擴增規程(REP)前。REP前TIL在經輻照的PBMC、抗CD3抗體(30 ng/mL)及IL-2(3000 IU/mL)存在下以REP規程進一步增殖。肺及肉瘤REP前TIL係以24孔板格式自4個腫瘤片段擴增22天。其他癌症係於G-REX TIL中自4個腫瘤片段擴增至多22天。
II.TIL可自胰癌核心活體組織切片擴增：資料顯示於圖30至37。
整體結論
P7028及P7031在第11至12天的生長動力學皆證實非常少細胞，然而在第21至28天證實顯著擴增。
大部分自胰核心活體組織切片擴增的細胞係T細胞且表型為CD4+。自胰腫瘤單離之TIL一般為CD4+。
PMA刺激證實CD4+去顆粒的能力，如CD107a+之表現所示，藉此暗示這些細胞具功能性，如早先P7015的研究所示。在衍生自片段的TIL中CD107a的表現類似。
在板結合抗CD3的再刺激測定中，衍生自核心的TIL分泌顯著水準的IFNg，類似於衍生自片段的TIL。
大規模表型分析證實在衍生自腫瘤片段之TIL中所評估的大部分標誌表現類似，暗示自核心生長TIL與片段的結果類似。
耗竭/活化項目證實CD4+細胞中之PD-1、Tim3及KLRG1及CD8+細胞中之LAG3、Tim3及KLRG1有顯著差異。需要進行額外的胰核心研究以驗證這些發現。
整體提議:
這些結果暗示，自胰核心(及其他組織學)成功生長TIL的過程可能需要額外培養時間(超過第2代的REP前需求)，除非利用額外的「調整策略(tweaking strategies)」來增強生長(見下)。
基於胰核心的初步生長資料，建議第21至28天應為REP前過程，以獲得足夠細胞。
以此過程而言，REP前應於G-Rex 10或G-Rex 10M中起始，使用CM1介質及IL-2/IL-15/IL-21。
REP應於G-Rex 100M或G-Rex 500M中起始，取決於REP前細胞計數。
G-Rex 500M:如果細胞計數為5×107
。
G-Rex 100M:如果細胞計數介於1至5×107
之間。
將使用將來的實驗來判定各容器中有足夠細胞生長所需的最小細胞數量。
將來的實驗將比較在僅IL-2/IL-15/IL-21或在IL-2/IL-15/IL-21加上OKT3及餵養細胞中擴增之胰核心的生長、表型及功能。
實例10：使用核心活體組織切片擴增TIL
原理：
腫瘤移除/切除並不適用或可行於所有病患。在此病患研究世代中，核心活體組織切片可作為用於ACT(過繼性細胞療法)之TIL的來源。該等核心活體組織切片允許取樣多個病灶且可能獲得較廣的TIL貯庫。
策略：
本實例提供一種自核心活體組織切片、自多個組織學擴增TIL的方法且發展一種用於自核心活體組織切片生產TIL的可行明確過程。見例如圖38，其提供二個例示性過程的示意圖。
資料
自活體組織切片擴增TIL的能力已在胰核心使用第2代證實，其亦顯示獲自活體組織切片之TIL於表型及功能上與獲自片段之TIL可相比。
七組胰核心(介於7至10個核心)用IL-2/IL-15/IL-21處理且經REP前處理並評估擴增。三組成功擴增，然而生長差異極大。REP前培養需要至少21至28天以獲得足夠數量的細胞(例如
，圖7的步驟A至E共21至28天)。大規模表型分析證實在衍生自胰腫瘤片段之TIL中所評估的大部分標誌表現類似。在衍生自片段的TIL中CD107a及IFNγ的表現類似
目前規程：
在培養第3天添加OKT3及餵養細胞增強TIL產率。培養較少核心/培養瓶且評估生長(例如，培養1至2個核心)。
使1至2個核心活體組織切片(3個胰臟、4個黑色素瘤、1個乳房、及1個卵巢)經受改良的研究規模過程，包括在第3天添加OKT3+餵養細胞(見圖39至40)。
･ 使TIL經受第二REP(例如
，第二擴增)。
･ 胰核心在+/-IL15及21下擴增(三重雞尾酒；REP1及REP2；例如
，第一擴增及第二擴增)
･ 卵巢核心在+/-OX40(BMS)下處理(n=1，初步資料)。
･ 使所有TIL經受第二REP。
胰
來自胰核心之TIL在OKT3+餵養細胞存在下成功擴增。在第一擴增的第11至17天之間獲得＞50e6個細胞。
通常需要二個核心以獲得適當細胞數量。
添加三重雞尾酒(TC:IL-2、IL-15/IL-21)至第二REP(不論先前於IL-2或TC中培養)相較於僅IL-2不顯著改變TIL的擴增。
在第3天添加OKT3+餵養細胞至核心活體組織切片，相較於使用類第2代條件生長的核心，不顯著改變TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)。經過2個REP擴增之TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)與使用第2代條件生長之TIL並無顯著差異。
CD107a表現不隨著添加OKT3及餵養細胞而有顯著變化。經過2個REP擴增之TIL維持對非特異性刺激有反應的能力，如CD107a誘導所評估。
經過2個REP擴增之TIL維持對非特異性刺激有反應的能力，如CD107a誘導所評估。
IFNg分泌係經評估。TIL在受到OKT3刺激時產生IFNg。
胰TIL可自胰癌核心活體組織切片擴增。
P7028及P7031之REP前實驗摘要及結果
將核心活體組織切片與三重雞尾酒(IL-2/IL-15/IL-21)放入G-Rex 10。
在第12天評估P7028 TIL且保持培養直到第19天
細胞計數：第12天=1.61×106
個存活細胞；第21天，3.49×107
個存活細胞
在第12天評估P7030 TIL且保持培養直到第27天
細胞計數：第12天=1.52×105
個存活細胞；第27天：1.14×107
個存活細胞
黑色素瘤
衍生自黑色素瘤核心之TIL在OKT3+餵養細胞存在下成功擴增(n=4)。到第一擴增的第12天獲得＞50×106
個細胞。
通常需要一至二個核心以獲得適當細胞數量。在第3天添加OKT3+餵養細胞至核心活體組織切片，相較於使用類第2代條件的片段，不顯著改變TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)。
經過2個REP擴增之TIL對非特異性刺激有反應，如CD107a移動及IFNg分泌所評估。
肺臟
來自肺的1個核心之TIL在第0天在IL-2+ OKT3+餵養細胞存在下成功擴增。第11天獲得＞50×106
個細胞。
經過2個REP擴增之TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)與自培養起始的第3天用OKT3+餵養細胞處理之核心擴增之TIL有稍微不同。第3天處理核心中的CD8+/CD4+比例增加。
在第0天與第3天的培養條件之間觀察到CD28、CD69、CD39、CD49a、Tim3及CD101的表現有稍微差異。
TIL在受到抗CD3刺激時產生IFNg。相較於第3天OKT3+餵養細胞處理肺核心，第0天OKT3+餵養細胞處理肺核心具有較高水準的IFNg。
經過2個REP擴增之TIL維持對非特異性刺激有反應的能力，如CD107a誘導所評估。
來自第3天OKT3+餵養細胞處理肺核心之CD8+TIL相較於第0天OKT3+餵養細胞處理肺核心TIL為寡株，指示取決於OKT3+餵養細胞添加時間之不同的TCR貯庫。
結論
在培養第3天添加OKT3+餵養細胞至核心顯著改善TIL產率。在所有評估的組織學(胰、黑色素瘤、乳房及卵巢)之第一擴增的11至15天內獲得＞50×106
個細胞(REP2起始臨限)。二個核心(在所測定的組織學中)足以獲得所需的細胞數量。
來自乳房的至少2個核心之TIL在第0天在IL-2+OKT3+餵養細胞存在下成功擴增，但在僅IL-2下則否。第11天獲得＞50×106
個細胞。一至二個核心足以獲得所需的細胞數量。
資料暗示自核心(早期OKT3+餵養細胞)擴增之TIL的表型及功能類似於在第2代條件(僅IL-2)下擴增的核心/片段。添加OX40於卵巢核心相較於僅IL-2改善TIL的擴增。
1至2個胰核心無法在僅IL-2中擴增。
對比實驗(Side to side experiments)以片段在第3天+/-OKT3+餵養細胞執行。TIL在受到OKT3刺激時產生IFNg且繼續進一步實驗。在+/-OX40處理之卵巢核心(治療性TIL族群)觀察到KLRG1、CD25及PD1之差異。
表型、功能(效力)及TCR貯庫經評估且持續評估(目前正在進行)。在第3天添加OKT3+餵養細胞至核心活體組織切片，相較於使用類第2代條件的片段，不顯著改變TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)。經過2個REP擴增之TIL對非特異性刺激有反應，如CD107a移動及IFNγ分泌所評估。經過2個REP擴增之TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)與使用1-REP過程(即第1擴增期間無OKT3+餵養細胞)於乳房核心擴增之TIL並無顯著差異。
觀察到KLRG1及PD1表現有稍微差異。
經過2個REP擴增之TIL維持對非特異性刺激有反應的能力，如CD107a誘導所評估。
進一步評估將包括第3天+/-移走核心，且將執行抗OX40對擴增TIL之效應的進一步評估。
實例11：使用OKT3+餵養細胞自乳房及卵巢核心活體組織切片擴增TIL：實例9至10之摘要
來自乳房的至少2個核心之TIL在第0天在IL-2+OKT3+餵養細胞存在下成功擴增，但在僅IL-2下則否。第11天獲得＞50×106
個細胞。
添加OX40於卵巢核心相較於僅IL-2改善TIL的擴增。
經過2個REP擴增之TIL的表型(記憶、CD27/CD28、耗竭、活化)與使用1-REP過程(即
第1擴增期間無OKT3+餵養細胞)於乳房核心擴增之TIL並無顯著差異。
觀察到KLRG1及PD1表現有稍微差異。
在+/-OX40處理之卵巢核心(最終產物)觀察到KLRG1、CD25及PD1之差異。
TIL在受到OKT3刺激時產生IFNg。
經過2個REP擴增之TIL維持對非特異性刺激有反應的能力，如CD107a誘導所評估。
在第3天添加OKT3 +餵養細胞至核心顯著改善TIL產率。在所有評估的組織學(胰、黑色素瘤、乳房及卵巢)之11至15天內獲得＞50×106
個細胞(在第2代條件下之REP起始臨限)。二個核心(在所測定的組織學中)足以獲得所需的細胞數量。初步資料暗示自核心(早期OKT3+餵養細胞)擴增之TIL的表型及功能類似於在對照條件下擴增的核心/片段。
實例12：自針抽吸物擴增TIL
策略：
自針抽吸物、自多個組織學擴增TIL，且發展一種用於生產TIL的可行明確過程。初步研究證實TIL可自「一些」在最佳條件下執行的抽吸物(即
，直接從腫瘤活體組織切片取出)擴增。
22個抽吸物係在Iovance使用第2代條件(即
，第3天無OKT3及餵養細胞)單離自各種組織學的腫瘤活體組織切片。在6個腫瘤(1個子宮頸、2個肺及3個黑色素瘤)觀察到生長。在REP前期間單離的細胞數量遠低於50×106
個細胞臨限。
此外，收到10個針抽吸物，包括三個來自黑色素瘤(n-3)及七個來自乳房(n-7)。抽吸物用OKT3及餵養細胞處理。
由於初始細胞數量較小，因此大部分實驗於96孔板起始。第11天所有抽吸物獲得＜50×106
個細胞。需要數個繼代培養以獲得所需的細胞數量。
實例13：自腫瘤核心活體組織切片擴增TIL
介紹
自體腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的過繼性T細胞療法(ACT)已在轉移性黑色素瘤及子宮頸癌病患證實臨床療效。TIL目前係自外科移除的碎斷腫瘤擴增。不幸的是，患有無法切除之腫瘤的病患目前不符合TIL療法的資格。如果來自醫師為了診斷及分期目的、關聯研究及生物標記分析所使用之小腫瘤樣本類型之TIL擴增係可行的，則TIL療法將可用於更多數量的癌症病患。
核心針吸活體組織切片係該等小腫瘤樣本的一個實例。其係一種不昂貴、安全、簡單且相較於外科切除較少侵入性的程序。核心活體組織切片使用小切口及針移走一小圓柱體的腫瘤組織。一般而言，針可插入切口至多5倍，以切除適當量的組織。核心活體組織切片係完整腫瘤微環境的小型取樣，因此含有腫瘤細胞、基質及免疫細胞包括TIL。到目前為止，有一個黑色素瘤的臨床研究使用衍生自核心針吸活體組織切片的組織來擴增TIL (Ullenhag, G.J.,et al.
,Cancer Immunol Immunother
, 61(5): 725-732 (2014))。衍生自外科切除之TIL與衍生自核心活體組織切片之TIL之間的絕對細胞數量及擴增倍數類似。有趣的是，本研究中大部分客觀反應(4/5)是用衍生自核心活體組織切片的細胞處理。沒有進一步研究證實這些發現。
在一些實施態樣中，採用2-REP過程來擴增衍生自核心活體組織切片之TIL，如上及本實例所述。
目的
本實例提供一種自小腫瘤樣本擴增TIL至ACT(過繼性細胞轉移)臨床適當數量的規程。此規程係使用來自胰、黑色素瘤、乳房及卵巢腫瘤之腫瘤核心活體組織切片發展。評估擴增TIL的生長、存活性、表型、功能(IFNγ分泌、CD107a移動)及TCR Vβ貯庫(RNA定序)。
材料
腫瘤核心組織。收到來自UPMC、Biotheme及MT group的胰臟、黑色素瘤、乳房及卵巢腫瘤核心。
程序
核心處理及培養起始
收到來自研究聯盟(UPMC)及組織採購供應商(Biotheme及MTG group)的新鮮切除的腫瘤核心活體組織切片。隔夜運送於HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104)(含有抗生素)或RPMI 1640 (Fisher Scientific, Pennsylvania, Cat # 11875-085) +男性人AB血清(Access Biologicals, California, A13012)中的腫瘤核心活體組織切片。
使用在50-mL錐形管上方的0.22-µM過濾器，將包含腫瘤核心活體組織切片之運送容器內容物小心且緩慢地傾倒通過過濾器。核心被保留在過濾器中。藉由輕柔添加10至20 mL的HBSS至核心來洗滌核心。
輕柔地自過濾器膜移走各核心，同時盡量保持核心完整。使用無菌塑膠鑷子或輕柔吸量管吸放(大約200 µL的HBSS於1-mL吸量管中)，將核心與40 mL的CM2及6000 IU/mL的IL-2轉移至G-Rex 10。
REP1起始(例如
預備性第一擴增)
在培養後第3天，將OKT3 (30 ng/mL) (Miltenyi Biotec, Germany, Cat # 170-076-116)及餵養細胞(1:100)添加至G-Rex 10，且添加時不擾動培養。
每天用顯微鏡評估培養的生長。REP1在添加OKT3+餵養細胞後進行8天且結束於第11天。整個培養期間維持不碰觸細胞。
為了計數，移走大約30 mL的介質且將細胞藉由吸量管上下吸放重懸於剩餘的10 mL介質。將細胞放入50-mL錐形管且在Sorvell Legend XFR離心機及懸翼式轉籃(ThermoScientific, CA, Cat #75003180)中在RT下以1500 rpm離心5 min。
使用Nexcelom細胞計數器K2(Nexcelom, MA)，判定細胞數及存活細胞數。
如果離心後沒有團塊或團塊＜200 µL，則將團塊重懸於2 mL的介質進行計數。如果團塊＞200 µL，則重懸於5 mL的CM2介質進行計數。
實驗係於培養起始後第11天(OKT3 +餵養細胞添加後8天)收集。評估REP1產物的細胞計數、存活性、表型(TIL1、TIL2及TIL3(TIL表面抗原染色之TIL2及TIL3項目)、TIL3)及功能(CD107a(藉由CD107a移動來評估TIL功能)、IFNγ(WRK LAB-059))。剩餘細胞經冷凍且儲存於液態氮中。
REP2起始(例如
第二快速擴增)
以迷你REP2起始而言，將1×105
個細胞與40 mL的CM2介質及3000 IU/mL的IL-2放入G-Rex 10中。在培養起始時添加抗CD3(克隆：OKT3，30 ng/mL)及餵養細胞(1:100比例，TIL：餵養細胞)。所有在REP2中的培養瓶用OKT3+餵養細胞處理，即使如果在REP1期間未添加OKT3 +餵養細胞。
介質更換係於REP2的第5至7天(過程的第16至18天)執行。將G-Rex 10培養瓶中的介質體積減少至大約10 mL且用CM2或AimV+3000 IU/mL IL-2補充至40 mL。
在REP2的第11天，將體積如上指示減少且將細胞在RT下以1500 rpm離心5 min。
評估最終產物的細胞計數、存活性、表型(TIL1、TIL2(TIL表面抗原染色之TIL2項目，v1及v2)、TIL3)及功能(CD107a(藉由CD107a移動、IFNγ來評估TIL功能))。將額外細胞(1×106
至5×106
個細胞)形成團塊且冷凍進行RNA定序及分析。剩餘細胞經冷凍且儲存於液態氮中。
結果及接受標準
預期到D11，用OKT3+餵養細胞處理之培養瓶中的REP1產率為＞50×106
。預期REP2期間的擴增倍數不受REP1期間添加OKT3及餵養細胞的影響且與第2代REP擴增倍數的數目一致。預期衍生自腫瘤核心活體組織切片且早期暴露於OKT3 +餵養細胞的TIL之表型與衍生自外科切除(或小活體組織切片)且根據第2代過程擴增之TIL類似。
實例14：第3代例示性過程
本實例提供第2代與第3代過程之間的比較。此實例描述發展強健的TIL擴增平台。對第2代過程的改良藉由減少作業者介入次數而減少風險且簡化製造過程、減少整體製造時間、最佳化試劑使用且促進適於商業規模高通量製造之彈性的半密閉及半自動化細胞生產過程。
第2代及第3代過程之TIL係由經過外科切除腫瘤且接著離體(ex vivo
)擴增之衍生自個別病患的自體TIL構成。第3代過程的預備性第一擴增步驟係在介白素-2 (IL-2)及單株抗體OKT3(其靶向經輻照的周邊血液單核細胞(PBMC)之支架上的T細胞共受體CD3)存在下的細胞培養。
第2代TIL產物的製造係由二期組成:1)快速擴增前(REP前)及2)快速擴增規程(REP)。在REP前期間，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤50個片段，將彼等與含血清培養基(含有10% HuSAB補充之RPMI 1640介質)及6,000 IU/mL的介白素-2(IL-2)培養11天。在第11天，TIL係經收集及導入大規模第二REP擴增中。REP係由於補充有3000 IU/mL的rhIL-2之5L體積的CM2中與載有150 µg的單株抗CD3抗體(OKT3)之5×109
個經輻照的異體PBMC餵養細胞共培養來活化≤200×106
個來自REP前之存活細胞5天所組成。在第16天，將培養的體積減少90%且將細胞組份以≥1×109
個存活淋巴細胞/培養瓶分瓶至多個G-REX-500培養瓶且用CM4補足至5L。將TIL再孵養6天。REP在第22天經收集、洗滌、調配，且在以-150℃運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
第3代TIL產物的製造係由三期組成:1)預備性第一擴增規程、2)快速第二擴增規程(亦稱為快速擴增期或REP)及3)繼代培養分瓶。為了致效預備性第一擴增TIL增殖，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤120個片段。在預備性第一擴增的第0天，在3個100 MCS容器各者中大約100 cm2
的表面積上建立載有OKT-3之大約2.5×108
個經輻照的異體PBMC餵養細胞之餵養細胞層。將腫瘤片段分布於且培養於3個各具有500 mL含血清CM1培養基及6,000 IU/mL的介白素-2(IL-2)及15 ug OKT-3之100 MCS容器中7天。在第7天，REP藉由導入載有OKT-3之大約5×108
個經輻照的異體PBMC餵養細胞之額外餵養細胞層至3個100 MCS容器各者中之腫瘤碎斷培養期且用500 mL CM2培養基及6,000 IU/mL IL-2及30 ug OKT-3培養起始。REP起始藉由活化相同容器中的整個預備性第一擴增培養來增強，其中使用密閉系統將OKT3裝載餵養細胞流體轉移至100MCS容器。以第3代而言，TIL的規模垂直擴大或分瓶涉及將全細胞培養經由密閉系統流體轉移擴充且轉移至較大容器(從100 M培養瓶至500 M培養瓶)且添加額外4L的CM4介質的過程步驟。REP細胞在第16天經收集、洗滌、調配，且在以-150℃運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
整體而言，第3代過程是一時間較短、更可擴充且易於改良之擴增平台，可調適以適合強健製造及過程可相比性。
在第0天，二個過程的腫瘤皆洗滌3次並將片段隨機分組分至二池；每個過程一池。以第2代過程而言，將片段轉移至一個具有1 L含有6,000IU/mL rhIL-2之CM1介質之GREX 100MCS培養瓶中。以第3代過程而言，將片段轉移至一個具有500 mL含有6,000IU/mL rhIL-2、15 µg OKT-3及2.5×108
個餵養細胞之CM1之GRE x 100MCS培養瓶中。接種TIL用於Rep起始日根據各過程發生在不同天。以第2代過程而言，其中G-REX 100MCS培養瓶經90%體積減少，在第11天將收集的細胞懸浮液轉移至一個新的G-REX 500MCS以在含有IL-2(3000 IU/mL)加上5×109
個餵養細胞及OKT-3(30 ng/mL)之CM2介質中開始REP起始。細胞經擴增且按規程在第16天分瓶至多個具有含IL-2(3000 IU/mL)之CM4介質的GREX 500 MCS培養瓶。接著收集培養且按規程在第22天冷凍保存。以第3代過程而言，REP起始發生在第7天，其中使用相同的G-REX 100MCS於REP起始。簡言之，將500 mL含有IL-2(6000 IU/mL)及5×108
個餵養細胞及30 µg OKT-3之CM2介質添加至各培養瓶。在第9至11天，將培養規模垂直擴大。將整個體積的G-Re×100M (1L)轉移至G-REX 500MCS且添加4L含有IL-2(3000 IU/mL)的CM4。將培養瓶孵養5天。收集培養並在第16天冷凍保存。
比較包括三個不同腫瘤，二個肺腫瘤(L4054及L4055)及一個黑色素瘤腫瘤(M1085T)。
事先製備用於L4054及L4055之CM1(培養基1)、CM2(培養基2)及CM4(培養基4)介質且保持在4℃下。製備無過濾的CM1及CM2介質以比較有或無過濾介質的細胞生長。
事先將用於L4055腫瘤REP起始及規模垂直擴大之介質在37℃下溫熱至多24小時。
結果摘要
在達成的總存活細胞方面，第3代掉落至第2代的30%以內。第3代最終產物在再刺激後展現較高的INF-γ產生。第3代最終產物展現增加的殖株多樣性，如存在的總獨特CDR3序列所測量。第3代最終產物展現較長的平均端粒長度。
達成的結果
細胞計數及存活性%：
第2代及第3代過程的REP前及REP擴增遵循上述細節。
表37：REP前細胞計數。以每個腫瘤而言，二池含有相等數量的片段。由於腫瘤大小較小，因此沒有達成每個培養瓶最大數量的片段。收集總REP前細胞(TVC)，且第2代過程在第11天及第3代過程在第7天計數。為了比較二個REP前組，將細胞計數除以提供於培養的片段數量，以計算每片段的平均存活細胞。如下表所示，第2代過程相較於第3代過程一致地生長每片段較多細胞。外推計算第3代過程第11天的預期TVC數量，其係藉由將REP前TVC除以7再乘以11計算。
表38：TIL最終產物的總存活細胞計數及擴增倍數:以第2代及第3代過程而言，按過程條件計數TVC且產製過程每一天的存活細胞百分比。收集時，收集第22天(第2代)及第16天(第3代)細胞且建立TVC計數。接著將TVC除以第0天提供的片段數量，以計算每片段的存活細胞平均數。擴增倍數係藉由將收集的TVC除以REP起始的TVC計算。如表中展現，比較第2代及第3代，L4054的擴增倍數類似；就L4055而言，第2代過程的擴增倍數較高。具體而言，此例的介質在REP起始日之前溫熱至多24小時。在M1085T亦觀察到第3代的較高擴增倍數。外推計算第3代過程第22天的預期TVC數量，其係藉由將REP TVC除以16再乘以22計算。
表39：TIL最終產物之存活性%：在收集時，最終TIL REP產物的存活性%與放行標準比較。第2代及第3代過程的所有條件超過70%存活性標準且在所有過程及腫瘤中為可相比的。
表40：第3代過程每額外培養瓶之估計細胞數。由於每培養瓶片段數量低於最大所需數量，因此計算各腫瘤在收集日的估計細胞數。估計係基於預期臨床腫瘤夠大可在第0天接種2或3個培養瓶。
免疫表型分析：
TIL最終產物之表型標誌比較：
三個腫瘤L4054、L4055及M1085T經歷第2代及第3代過程的TIL擴增。在收集時，使REP TIL最終產物經受流動式細胞測量術分析以測試純度、分化及記憶標誌。在所有條件下，TCR a/b+細胞的百分比皆超過90%。
自第3代過程收集的TIL相較於自第2代過程收集的TIL顯示較高的CD8及CD28表現。第2代過程顯示較高百分比的CD4+。見圖3(A、B、C)。
TIL最終產物之記憶標誌比較:
自第3代過程收集的TIL相較於來自第2代過程的TIL顯示較高的中央記憶區室表現。見圖4(A、B、C)。
TIL最終產物之活化及耗竭標誌比較：
分析來自二個腫瘤L4054及L4055之TIL的活化及耗竭標誌，以比較來自第2代及第3代TIL擴增過程之最終TIL產物。第2代與第3代過程之間的活化及耗竭標誌是可相比的。見圖5(A、B)；圖6(A、B)。
再刺激時的干擾素γ分泌：
在收集日(第2代第22天及第3代第16天)，L4054及L4055之TIL經歷塗佈抗CD3板之整夜再刺激。對M1085T之再刺激使用抗CD3、CD28及CD137珠執行。所有條件中再刺激24小時後收集上清液且將上清液冷凍。在相同時間使用相同的ELISA板評估來自兩個過程之上清液的IFNγ ELISA分析。在三個分析的腫瘤中，觀察到第3代過程有較高的IFNγ產生。見圖7(A、B、C)。
測量培養基中之IL-2水準：
為了比較第2代與第3代過程之間的IL-2消耗，收集腫瘤L4054及L4055在REP起始、規模垂直擴大及收集日的細胞上清液。IL-2在細胞培養上清液中的量係藉由來自R&D的Quantitate ELISA套組測量。整體趨勢指示，相較於第2代過程，第3代過程維持較高的IL-2濃度。這可能是因為第3代在REP起始時較高的IL-2濃度(6000 IU/mL)加上介質在整個過程中的留存效應所致。見圖8(A、B)。
代謝基質及代謝物分析
測量代謝基質諸如D-葡萄糖及L-麩醯胺酸的水準來作為整體介質消耗的替代指標。測量它們的對等代謝物諸如乳酸及氨。葡萄糖是介質中為粒線體所利用以產生ATP能量形式的單糖。當葡萄糖經氧化時，會產生乳酸(乳酸酯是乳酸的酯)。乳酸酯在細胞指數生長期期間高度產生。高水準的乳酸酯對細胞培養過程具有負面影響。見圖9(A、B)。
在REP起始、規模垂直擴大及收集日，收集L4054及L4055在第2代及第3代過程中用過的介質。用過的介質收集係於第2代的第11天、第16天及第22天；第3代的第7天、第11天及第16天進行。在CEDEX生物分析儀上分析上清液的葡萄糖、乳酸、麩醯胺酸、glutamax及氨濃度。
L-麩醯胺酸是細胞培養基配方所需的不穩定必需胺基酸。麩醯胺酸含有胺，且此醯胺結構性基團可運送及遞送氮至細胞。當L-麩醯胺酸氧化時，細胞會產生毒性氨副產物。為了抵銷L-麩醯胺酸的降解，第2代及第3代過程的介質補充有Glutamax，其在水溶液中較為穩定且不會自發降解。在二個腫瘤細胞系中，第3代組在過程中顯示L-麩醯胺酸及Glutamax的降低及氨在整個REP的增加。在第2代組中，觀察到恆定濃度的L-麩醯胺酸及Glutamax及稍微增加的氨產生。第2代及第3代過程的氨在收集日可相比，且顯示L-麩醯胺酸降解有稍微差異。見圖10(A、B、C)。
流式-FISH的端粒重複：
流式-FISH技術係用於測量在第2代及第3代過程下，L4054及L4055上的端粒重複平均長度。相對端粒長度(RTL)的判定係使用DAKO流動式細胞測量術分析之端粒PNA套組/FITC計算。第3代顯示與第2代可相比的端粒長度。
CD3分析
為了判定各過程所產製之細胞產物的殖株多樣性，取樣L4054及L4055所收集之TIL最終產物且經由定序T細胞受體的CDR3部分來測定殖株多樣性分析。
表41：第2代及第3代的TIL收集細胞產物共享L4054之獨特CDR3序列之百分比的比較。第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
表42：第2代及第3代的TIL收集細胞產物共享L4055之獨特CDR3序列之百分比的比較。第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
事先製備無過濾的CM1及CM2介質且保持在4℃下直到用於腫瘤L4055以用於第2代及第3代過程。
將用於腫瘤L4055的介質在第2代及第3代過程之REP起始日之前在37℃下溫熱24小時。
LDH沒有在過程中收集的上清液中測量到。
M1085T TIL細胞計數使用K2細胞計數器進行。
在腫瘤M1085T方面，無法取得樣本，諸如用於代謝分析之上清液、用於活化及耗竭標誌分析、端粒長度及CD3-TCR vb分析之TIL產物。
結論
此實例比較3個獨立的供體腫瘤組織的功能品質屬性加上擴大表型表徵及第2代及第3代過程的介質消耗。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
第3代過程的外推細胞數量是假設REP前收集發生在第11天而非第7天且REP收集在第22天而非第16天來計算。兩種情況皆顯示相較於第2代過程較靠近的TVC數量，指示早期活化可允許TIL生長的整體較佳表現。表4及5底端列。
在第3代過程額外培養瓶(2或3個)的外推值的情況中，假設處理較大大小的腫瘤且達到如所述之過程所需之最大片段數量。觀察到可在第3代過程的第16天收集達到相較於第2代過程第22天類似劑量的TVC。此觀察很重要且指示培養的早期活化可允許TIL在較少處理時間中有較佳表現。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
就表型表徵而言，第3代過程相較於第2代過程觀察到三個腫瘤較高的CD8+及CD28+表現。此資料指示第3代過程相較於第2代具有改善的最終TIL產物屬性。
第3代過程相較於第2代過程顯示稍微較高的中央記憶區室。
第2代及第3代過程顯示可相比的活化及耗竭標誌，儘管第3代過程的持續時間較短。
在所分析的三個腫瘤中，第3代最終產物的IFN γ(IFNγ)產生高於第2代3倍。此資料指示第3代過程相較於第2代過程產製具有高度功能性且更有效的TIL產物，有可能是因為第3代的CD8及CD28表現之較高表現所致。表型表徵暗示第3代在三個腫瘤的CD8+、CD28+表現上相較於第2代過程有正面趨勢。
第2代與第3代之間的TIL最終產物之端粒長度是可相比的。
第2代與第3代最終產物之間的葡萄糖及乳酸酯水準是可相比的，暗示第3代過程之介質的營養素水準不受影響，因為相較於第2代，過程中不每天執行體積減少移除且過程中整體介質體積較少。
整體第3代過程顯示處理時間相較於第2代過程減少幾乎兩倍，其將造成藉由第3代過程擴增之TIL產物的商品成本(COG)大幅減少。
IL-2消耗指示第2代過程之IL-2消耗整體趨勢，且在第3代過程中IL-2較高，因為不移除舊的介質。
第3代過程顯示由CDR3 TCRab序列分析所測量之較高的殖株多樣性。
在REP前第0天添加餵養細胞及OKT-3允許使用第3代過程之早期活化TIL及整體較佳的TIL生長表現。
表43描述第3代過程之各種實施態樣及結果並與目前的第2代過程比較：
上述實例係經提供以給出如何實施及使用本發明之組成物、系統及方法的實施態樣的完整揭露及說明給所屬技術領域中具有通常知識者，並非意圖限制發明人對於他們的發明之主張範圍。用於實施本發明之上述模式的修飾為該領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於下列權利要求範圍之內。說明書中所提及的所有專利及公開案指示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技能水準。本揭露中所引證的所有參考文獻以引用方式併入本文中，該引用程度如同各參考文獻已經個別地以全文引用方式併入本文中。
TIL已自單離自胰腫瘤之核心活體組織切片成功擴增。TIL亦自來自某些腫瘤類型的FNA擴增。在研究中，沒有觀察到來自卵巢腫瘤(n=3)及結直腸腫瘤(n=1)的TIL生長。觀察到來自獲自肺腫瘤、黑色素瘤及子宮頸腫瘤之FNA的TIL生長。來自第一擴增及來自第二擴增之TIL族群的表型分析及功能測定目前正在進行。研究資料顯示顯著的CD4+及CD8+T細胞族群存在於REP前抽吸物中。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文所引證之所有參考文獻皆以引用方式且出於所有目的完整併入本文中，猶如個別公開案或專利或專利申請案係特別且個別明示以全文引用方式併入本文中以用於所有目的。
如所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行許多修改及變化。本文所述之特定實施態樣及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之用語以及申請專利範圍有權主張之等效物的全部範疇限制。
圖1：例示性過程2A之圖提供步驟A至F之概覽。
圖2：過程2A之程序流程圖。
圖3：顯示冷凍保存TIL例示性製造過程(約22天)之實施態樣的圖。
圖4：顯示過程2A(22天TIL製造過程)之實施態樣的圖。
圖5：過程1C及過程2A之例示性實施態樣的步驟A至F之比較表。
圖6：過程1C的實施態樣與過程2A的實施態樣之詳細比較。
圖7：例示性小活體組織切片之圖提供小活體組織切片擴增過程步驟A至F之概覽。
圖8：自採集自胰癌患者之核心活體組織切片擴增之存活細胞(P7015)影像。A)用IL-2處理之核心活體組織切片，及B)用IL-2、IL-15及IL-21之組合處理之核心活體組織切片。
圖9：自胰核心活體組織切片擴增之TIL的FACS分析。A)自IL-2處理之核心活體組織切片擴增的T細胞係CD4+及CD8+。B)自IL-2處理之核心活體組織切片擴增的CD8+ T細胞係CD107a+。C)自IL-2、IL-15及IL-21之組合處理之核心活體組織切片擴增的T細胞係CD4+及CD8+。D)自IL-2、IL-15及IL-21之組合處理之核心活體組織切片擴增的CD8+ T細胞係CD107a+。
圖10：自子宮頸癌病患細針抽吸物擴增之TIL (C2005)的FACS分析。A)用IL-2處理之細針抽吸物，及B)用IL-2、IL-15及IL-21之組合處理之細針抽吸物。
圖11：自肺癌病患細針抽吸物擴增之TIL (L4032)的FACS分析。A)用IL-2處理之細針抽吸物，及B)用IL-2、IL-15及IL-21之組合處理之細針抽吸物。C)作為對照組，肺腫瘤片段係用IL-2培養且經擴增以產生CD4+及CD8+T細胞。
圖12：來自肺癌患者FNA樣本之TIL(L4032)使用快速擴增規程進一步擴增。A)自抽吸物擴增之TIL在快速擴增後的總細胞數，該抽吸物最初用僅IL-2；IL-2、IL-15及IL-21之組合；或最初IL-2、IL-15及IL-21之組合接著僅IL-2處理。B) CD4+及CD8+T細胞存在於用IL-2處理之經擴增的TIL族群。
圖13：自肺癌病患細針抽吸物擴增之TIL (L4033)的FACS分析。A)來自用IL-2處理之細針抽吸物的T細胞，及B)來自用IL-2培養之肺腫瘤片段的T細胞作為對照組。
圖14：自肺癌患者細針抽吸物擴增之TIL (L4033)使用快速擴增規程進一步擴增。A)獲自用IL-2處理之細針抽吸物的TIL在快速擴增後的總細胞數。
圖15：來自採集自卵巢癌病患之卵巢腫瘤細針抽吸物之TIL(OV8011、OV8012及OV8013)。用IL-2或IL-2、IL-15及IL-21之組合培養細針抽吸物後的總細胞數。
圖16：自黑色素瘤病患細針抽吸物擴增之TIL(M1101)的FACS分析。A)來自用IL-2處理之細針抽吸物的T細胞，及B)來自用IL-2培養之肺腫瘤片段的T細胞作為對照組。
圖17：衍生自藉由核心活體組織切片獲得之胰腫瘤樣本的TIL之表型及功能狀態。A)培養於含有IL-2之培養基或含有IL-2及細胞培養添加劑之培養基之胰腫瘤的結果。B及C)在不同的培養基(IL-2補充培養基對添加劑補充培養基)中之CD4+細胞及CD8+細胞在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激後的CD107a表現結果。
圖18：核心活體組織切片及細針抽吸物之結果摘要表。A)來自胰癌及肺癌樣本之結果。B)來自結直腸癌、卵巢癌、子宮頸癌及黑色素瘤樣本之結果。
圖19：衍生自藉由細針抽吸物活體組織切片獲得之黑色素瘤樣本的TIL之表型及功能狀態。A)細胞培養0天、11天、18天及21天後之總細胞數。B)衍生自片段及抽吸物之細胞的表型分析。B)在PMA刺激後衍生自片段及抽吸物之細胞的功能分析(CD107a表現)。
圖20：摘要資料顯示TIL可自獲自UPMC(匹茲堡大學醫學中心)之胰癌核心活體組織切片擴增。
圖21：資料顯示衍生自胰腫瘤之TIL的常規表型分析。
圖22：自胰核心REP前及REP單離的TIL具功能性，如IFNg及CD107a所判定。
圖23：在低擴增的REP前肺TIL中觀察到CD3+/NK細胞族群增加。
圖24：在大部分的REP前肺TIL中CD4/8比例高於1。
圖25：在高及低產率皆觀察到REP期間可相比的擴增倍數。
圖26：關於肉瘤(UPMC 58)的資料。
圖27：關於子宮頸癌(UPMC45)的資料。REP前TIL係於G-REX 10中自4個片段擴增21天。
圖28：關於ES19001 (UPMC46)的資料。REP前TIL係於G-REX 10中自4個片段擴增21天。
圖29：關於硬齶(UPMC 67)及口腔癌(UPMC 68)的資料。REP前TIL係於G-REX 10中自4個片段擴增21天。
圖30：摘要資料顯示TIL可自UPMC所提供之胰癌核心活體組織切片擴增。
圖31：胰核心活體組織切片:TIL可自胰癌核心活體組織切片擴增。P7015實驗摘要及結果:將一個核心放入24孔板的一孔中，總共5孔。將二個核心放入二孔中，然而這些孔中很少或沒有生長。三孔用1) IL-2處理及二孔用2) IL-2/IL-15/IL-21處理。
圖32：資料顯示大部分自胰核心擴增的細胞係CD4及CD8+T細胞，且由CD107a表現判定具有功能性(P7015)。P7015實驗結果：大部分自胰核心活體組織切片擴增的細胞係T細胞(大約80%為CD4+及CD8+)。PMA/I刺激證實CD8+去顆粒的能力，如CD107a+之表現所示，藉此暗示這些細胞具功能性。表現CD107a+之CD8+的%在IL-2/IL-15/IL-21三重雞尾酒條件中高於僅IL-2。
圖33：胰核心活體組織切片：TIL可自胰癌核心活體組織切片擴增。P7028及P7031 REP前實驗摘要及結果：將11個核心活體組織切片放入具有三重雞尾酒(IL-2/IL-15/IL-21)的G-Rex 10中。在第12天評估P7028 TIL且保持培養直到第19天。細胞計數：第12天=1.61e6個存活細胞；第21天，3.49e7個存活細胞。在第12天評估P7028 TIL且保持培養直到第27天。細胞計數：第12天=1.52e5個存活細胞；第27天：1.14e7個存活細胞。
圖34：胰核心活體組織切片:TIL可自用IL-2/IL-15/IL-21處理的胰癌核心活體組織切片及片段擴增。衍生自片段的TIL收集日從第11至21天不等。衍生自核心的TIL收集日自第21至28天不等。
圖35：衍生自核心及腫瘤活體組織切片的TIL之表型表徵。衍生自片段的TIL收集日自第11至21天不等。衍生自核心的TIL收集日自第21至28天不等。
圖36：衍生自核心及腫瘤活體組織切片的TIL之表型表徵。
圖37：來自核心活體組織切片之TIL可類似於自片段單離之TIL的表現CD107a及分泌IFNγ。
圖38：A)核心活體組織切片擴增程序之例示性過程。使1至2個核心活體組織切片(3個胰臟、4個黑色素瘤、1個乳房、及1個卵巢)經受例示性過程，包括在第3天添加OKT3+餵養細胞。將胰核心在+/-IL-15及IL-21下擴增(REP1及REP2；即
，第一擴增及第二擴增)。卵巢核心在+/-OX40(BMS)下處理(n=1)。使所有TIL經受第二REP (第二擴增)。B)核心活體組織切片擴增程序之例示性過程。使1至2個核心活體組織切片經受一過程，包括在第3天添加OKT3+餵養細胞。
圖39：胰核心活體組織切片擴增程序之摘要表。
圖40：關於胰核心活體組織切片擴增之細胞數量的資料。
圖41：黑色素瘤核心活體組織切片擴增程序之摘要表。
圖42：關於黑色素瘤核心活體組織切片擴增之細胞數量的資料。
圖43：REP1與REP2(即
，第一擴增及第二擴增)之間的耗竭及活化標誌之表型表現類似。
圖44：相較於自片段衍生之第2代(即
，過程2A)TIL，在第3天添加OKT3+餵養細胞至核心不顯著改變TIL的表型。
圖45：乳房及卵巢核心活體組織切片擴增程序之摘要表。
圖46：關於乳房(左)及卵巢(右圖)核心活體組織切片擴增之細胞數量的資料。
圖47：實驗顯示TIL可自胰癌核心活體組織切片擴增。P7028及P7031之REP前實驗摘要及結果。將核心活體組織切片與三重雞尾酒(IL-2/IL-15/IL-21)放入G-Rex 10。在第12天評估P7028 TIL且保持培養直到第19天。細胞計數：第12天=1.61×106
個存活細胞；第21天，3.49×107
個存活細胞。在第12天評估P7030 TIL且保持培養直到第27天。細胞計數：第12天=1.52×105
個存活細胞；第27天：1.14×107
個存活細胞。
圖48：TIL可自IL-2/IL-15/IL-21處理的來自胰癌之核心活體組織切片及片段擴增。圖顯示片段及核心的細胞擴增數量。衍生自片段的TIL收集日自第11至21天不等。衍生自核心的TIL收集日自第21至28天不等。
圖49：衍生自核心及片段的TIL在表型上類似。衍生自片段的TIL收集日自第11至21天不等。衍生自核心的TIL收集日自第21至28天不等。
圖50：當比較來自核心及片段的TIL時，「耗竭標誌」有不同表現。
圖51：來自核心活體組織切片之TIL可類似於自片段單離之TIL的表現CD107a及分泌IFNγ。
圖52：TC(三重雞尾酒；IL-2/IL-15/IL-21)不顯著改變胰核心於REP2(第二擴增)中的總細胞數，無論初始培養條件為何(REP1；第一擴增)。
圖53：TC(三重雞尾酒；IL-2/IL-15/IL-21)不顯著改變胰核心於REP2(第二擴增)中之CD4/CD8比例或記憶子集。
圖54：CD107a在來自胰核心所有處理條件中之REP2(第二擴增)的CD4及CD8族群中類似。
圖55：IFNg分泌無論胰核心的REP2(第二擴增)處理條件為何者皆類似。
圖56：在第3天添加OKT3及餵養細胞(REP1；第一擴增)相較於胰核心的REP前條件不顯著改變表型表現。
圖57：在第3天添加OKT3及餵養細胞(REP1；第一擴增)不顯著改變胰核心之「耗竭標誌」的表型表現。
圖58：在第3天添加OKT3及餵養細胞(REP1；第一擴增)不顯著改變胰核心之活化標誌的表型表現。
圖59：CD107a在胰核心之REP前、REP1(第一擴增)及REP2(第二擴增)的CD4及CD8族群中類似。
圖60：IFNg在胰核心REP2(第二擴增)的分泌相較於REP1(第一擴增)減少。
圖61：在黑色素瘤REP2(第二擴增)中，TCM(中央記憶T細胞)族群增加且TEM(效應記憶T細胞)降低，但CD27及CD28沒有改變。TEMRA:再表現CD45RA之終末分化效應記憶細胞。TSCM：幹記憶T細胞。
圖62：IFNγ及CD107a在黑色素瘤核心REP1 (第一擴增)及REP2(第二擴增)中類似。
圖63：資料顯示黑色素瘤片段對黑色素瘤核心中之CD4及CD8表型標誌。
圖64：資料顯示黑色素瘤片段對黑色素瘤核心中之CD4及CD8表型標誌。
圖65：資料顯示黑色素瘤片段對黑色素瘤核心中之CD4及CD8的CD107a水準。
圖66：用OX40處理增強卵巢核心中之CD8+細胞的百分比。
圖67：在用OX40處理之卵巢核心中有類似的CD107a表現及IFNγ分泌。
圖68：在REP1(第一擴增)及REP2(第二擴增)乳房核心中有增強的TCM及耗竭及活化標誌之分化表現。
圖69:CD107a及IFNγ在乳房核心之REP1(第一擴增)及REP2(第二擴增)中類似。
圖70：例示性腫瘤核心活體組織切片TIL擴增程序的示意圖。
圖71：衍生自OKT3+餵養細胞處理胰核心之TIL在再刺激下分泌IFNg。
圖72：衍生自黑色素瘤核心之TIL在再刺激下表現CD107a及分泌IFNg。
圖73：自乳房及卵巢核心活體組織切片擴增TIL。
圖74：衍生自在REP1期間用OKT3+餵養細胞處理之乳房核心的TIL最終產物表型與在REP1期間僅用IL-2處理之核心類似。
圖75：衍生自在REP1期間用OKT3+餵養細胞處理之乳房核心的TIL最終產物表型與在REP1期間僅用IL-2處理之核心類似。
圖76：在REP1期間用OKT3+餵養細胞處理之乳房核心相較於在REP1期間僅用IL-2處理之核心有增強的IFNγ分泌表現。
圖77：用OX40處理增強REP2中卵巢核心中之CD8+細胞的百分比。
圖78：在兩個REP期間用OX40處理改變REP2中PD-1、KLRG1及CD25的表現。
圖79：用OX40處理之卵巢核心最終產物(REP2)中的IFNγ分泌稍微較高。
圖80：在用OX40處理之卵巢核心中的CD107a表現。
圖81：在2個REP用OX40處理改變與T細胞「年紀」相關之標誌的表現。
圖82：在兩個REP期間用OX40處理稍微改變REP2中PD-1、KLRG1及CD25的表現。
圖83：REP1及REP2乳房核心中耗竭及活化標誌之分化表現。
圖84：CD107a及IFNγ在乳房核心之REP1及REP2中類似。
圖85A至85B：A)顯示2A過程(大約22天過程)及用於TIL製造之小活體組織切片第3代過程實施態樣(大約17天至24天過程)之比較。B)例示性第3代過程之圖提供步驟A至F之概覽(大約17天至24天過程)。
圖86：提供第2代(2A過程)與第3代之間可相比性的實驗流程圖。
圖84A至87C：A) L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的表型表徵。B) L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的表型表徵。C) M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的表型表徵。
圖88A至88C：A) L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。B) L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。C) M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。
圖89：L4054活化及耗竭標誌(A) CD4+圈選，(B) CD8+圈選。
圖90：L4055活化及耗竭標誌(A) CD4+圈選，(B) CD8+圈選。
圖91：IFNγ產生(pg/mL)：(A) L4054、(B) L4055及(C) M1085T的第2代及第3代過程:此處表示的各槓是指刺激、未刺激及介質對照之IFNγ水準的平均值+ SEM。光學密度在450 nm下測量。
圖92：細胞培養上清液中IL-2濃度的ELISA分析:(A) L4054及(B) L4055。此處表示的各槓是指用過的介質之IL-2水準的平均值+SEM。光學密度在450 nm下測量。
圖93：定量用過的介質中之葡萄糖及乳酸酯(g/L):(A)葡萄糖及(B)乳酸酯：在二個腫瘤細胞系及二個過程中，觀察到整個REP擴增中之葡萄糖降低。相反地，觀察到乳酸酯如預期般增加。第2代與第3代過程之間的葡萄糖降低及乳酸酯增加是可相比的。
圖94：A)定量L4054及L4055用過的介質中之L-麩醯胺酸。B)定量L4054及L4055用過的介質中之Glutamax。C)定量L4054及L4055用過的介質中之氨。
圖95：端粒長度分析：相對端粒長度(RTL)值使用DAKO套組指示對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組的端粒螢光中的第2代及第3代過程中每染色體/基因組的平均端粒螢光。
圖96：L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的獨特CDR3序列分析。長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集日收集的1×106
個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。
圖97：L4054 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
圖98：L4055 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
圖99：L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的多樣性指標。Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代L4054及L4055相較於第2代顯示稍微較高多樣性。
圖100：第7天：第3代REP起始之細胞計數原始資料呈現於表37(見以下實例14)。
圖101：第11天：第2代REP起始及第3代規模垂直擴大(Scale Up)之細胞計數原始資料呈現於表37(見以下實例14)。
圖102：第16天：第2代規模垂直擴大及第3代收集(例如，第16天)之細胞計數原始資料呈現於表38(見以下實例14)。
圖103：第22天：第2代收集(例如，第22天)之細胞計數原始資料呈現於表38(見以下實例14)。以L4054第2代而言，LOVO後計數外推至4個培養瓶，因為是研究總數。1個培養瓶受到污染，且進行外推總計=6.67×1010
個。
圖104：繪示於圖87A、87A及87B之流動式細胞測量術結果的原始資料。
圖105：繪示於圖87C及87C之流動式細胞測量術結果的原始資料。
圖106：繪示於圖89及90之流動式細胞測量術結果的原始資料。
圖107：繪示於圖91之L4054樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
圖108：繪示於圖91之L4055樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
圖109：繪示於圖91之M1085T樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
圖110：繪示於圖92之IL-2 ELISA測定結果的原始資料。
圖111：呈現於圖93及94之代謝基質及代謝物分析結果的原始資料。
圖112：呈現於圖95之相對端粒長度分析結果的原始資料。
圖113：呈現於圖96及99之獨特CD3序列及殖株多樣性分析結果的原始資料。
圖114：顯示各種第2代(2A過程)與第3.1代過程實施態樣之間的比較。
圖115：表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施態樣的各種特徵。
圖116：第3代過程之實施態樣(稱為第3.1代)的介質條件概覽。
圖117：表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施態樣的各種特徵。
圖118：表格比較第2代及第3.0代過程之實施態樣的各種特徵。
圖119：表格提供所述擴增過程之各種實施態樣的介質使用。
圖120：表型比較：第3.0代及第3.1代過程實施態樣顯示可相比的CD28、CD27及CD57表現。
圖121：第3代最終產物有較高的IFNγ產生。在培養冷凍上清液中評估IFNγ分析(藉由ELISA)以比較兩種過程。使用各第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第16天)的新鮮TIL產物，在各腫瘤以塗佈抗CD3板整夜刺激。此處表示的各槓是指刺激、未刺激及介質對照之IFNγ水準。
圖122：上圖：TIL最終產物的獨特CDR3序列分析:長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集的1×106
個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。下圖：TIL最終產物的多樣性指標：Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代相較於第2代顯示稍微較高多樣性。
圖123：第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
圖124：第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
圖125：第3代過程(16天過程)之例示性實施態樣的示意圖。
圖126：使用第3代擴增平台，自造血惡性病擴增TIL之方法的例示性實施態樣的示意圖。
圖127：提供資料顯示，在第3天添加OKT3+餵養細胞至核心相較於第2代不顯著改變TIL的表型，指示TIL是健康TIL。
圖128：提供資料顯示，黑色素瘤核心衍生TIL的耗竭及活化標誌表現遵循類似胰核心衍生TIL的趨勢。在REP1及REP2中，沒有觀察到IL-2與三重雞尾酒之間之表型表現的差異。
圖129：提供關於自肺核心活體組織切片擴增TIL的資料。
圖130：提供資料顯示，在第0天與第3天(OKT3+餵養細胞)處理肺核心中觀察到類似的表型輪廓。
圖131：提供資料顯示，第3天用OKT3及餵養細胞處理之核心中的活化及駐留T細胞標誌的表型表現增強。
圖132：來自肺核心的TIL具功能性，如因應非特異性刺激之IFNg分泌及CD107a移動所判定。
圖133：來自第3天處理肺核心之CD8+TIL相較於第0天處理TIL為寡株。
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<223> 莫羅單抗重鏈
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<220>
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<223> 鼠4-1BB，腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (家鼷鼠(Mus musculus))
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏圖木單抗重鏈CDR2
<400> 16
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏圖木單抗重鏈CDR3
<400> 17
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏圖木單抗輕鏈CDR1
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏圖木單抗輕鏈CDR2
<400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏圖木單抗輕鏈CDR3
<400> 20
<210> 21
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗重鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗輕鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗可變重鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗可變輕鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗重鏈CDR1
<400> 25
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗重鏈CDR2
<400> 26
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗重鏈CDR3
<400> 27
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗輕鏈CDR1
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗輕鏈CDR2
<400> 29
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烏瑞魯單抗輕鏈CDR3
<400> 30
<210> 31
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc結構域
<400> 31
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 32
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 33
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 34
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 35
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 36
<210> 37
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 37
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 38
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 39
<210> 40
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 40
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 41
<210> 42
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc結構域
<400> 42
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 43
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 44
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 45
<210> 46
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 46
<210> 47
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL可溶性結構域
<400> 47
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4-1-1版本1之可變重鏈
<400> 48
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4-1-1版本1之可變輕鏈
<400> 49
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4-1-1版本2之可變重鏈
<400> 50
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B4-1-1版本2之可變輕鏈
<400> 51
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H39E3-2可變重鏈
<400> 52
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H39E3-2可變輕鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40(智人)
<400> 54
<210> 55
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠OX40(家鼷鼠)
<400> 55
<210> 56
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗(tavolixizumab)重鏈
<400> 56
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗輕鏈
<400> 57
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗重鏈可變區
<400> 58
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗輕鏈可變區
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗重鏈CDR1
<400> 60
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗重鏈CDR2
<400> 61
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗重鏈CDR3
<400> 62
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗輕鏈CDR1
<400> 63
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLIYYTSKLH S
<400> 64
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 塔伏利西單抗輕鏈CDR3
<400> 65
<210> 66
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4重鏈
<400> 66
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4輕鏈
<400> 67
<210> 68
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4重鏈可變區
<400> 68
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4輕鏈可變區
<400> 69
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4重鏈CDR1
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4重鏈CDR2
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4重鏈CDR3
<400> 72
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4輕鏈CDR1
<400> 73
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4輕鏈CDR2
<400> 74
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D4輕鏈CDR3
<400> 75
<210> 76
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8重鏈
<400> 76
<210> 77
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8輕鏈
<400> 77
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8重鏈可變區
<400> 78
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8輕鏈可變區
<400> 79
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8重鏈CDR1
<400> 80
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8重鏈CDR2
<400> 81
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8重鏈CDR3
<400> 82
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8輕鏈CDR1
<400> 83
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8輕鏈CDR2
<400> 84
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18D8輕鏈CDR3
<400> 85
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122重鏈可變區
<400> 86
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122輕鏈可變區
<400> 87
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122重鏈CDR1
<400> 88
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122重鏈CDR2
<400> 89
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122重鏈CDR3
<400> 90
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122輕鏈CDR1
<400> 91
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122輕鏈CDR2
<400> 92
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu119-122輕鏈CDR3
<400> 93
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222重鏈可變區
<400> 94
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222輕鏈可變區
<400> 95
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222重鏈CDR1
<400> 96
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222重鏈CDR2
<400> 97
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222重鏈CDR3
<400> 98
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222輕鏈CDR1
<400> 99
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222輕鏈CDR2
<400> 100
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu106-222輕鏈CDR3
<400> 101
<210> 102
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L
<400> 102
<210> 103
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L可溶性結構域
<400> 103
<210> 104
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L可溶性結構域(替代性)
<400> 104
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 008可變重鏈
<400> 105
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 008可變輕鏈
<400> 106
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 011可變重鏈
<400> 107
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 011可變輕鏈
<400> 108
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 021可變重鏈
<400> 109
<210> 110
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 021可變輕鏈
<400> 110
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 023可變重鏈
<400> 111
<210> 112
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 023可變輕鏈
<400> 112
<210> 113
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區
<400> 113
<210> 114
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈可變區
<400> 114
<210> 115
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區
<400> 115
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈可變區
<400> 116
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之重鏈可變區
<400> 117
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之重鏈可變區
<400> 118
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之輕鏈可變區
<400> 119
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之輕鏈可變區
<400> 120
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之重鏈可變區
<400> 121
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之重鏈可變區
<400> 122
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之輕鏈可變區
<400> 123
<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化抗體之輕鏈可變區
<400> 124
<210> 125
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈可變區
<400> 125
<210> 126
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈可變區
<400> 126
Claims (33)
- 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(i)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養來自病患的腫瘤的至少一種細針抽吸物(FNA)或至少一種小活體組織切片的第一TIL族群來執行第一擴增以產生第二TIL族群，其中該細胞培養基補充OKT-3及抗原呈現細胞(APC)，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107個TIL；及(ii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行第二擴增以產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群。
- 如請求項1之方法，其中步驟(i)係預備性(priming)第一擴增步驟，其中步驟(i)之該包含IL-2之細胞培養基並非在第1至3天中任一天補充OKT-3，且其中步驟(ii)係快速第二擴增，其中在步驟(ii)後，將該等細胞自該細胞培養移除且冷凍保存於儲存介質中。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其中步驟(i)至(ii)在一段約17天至約24天的期間之內執行、在一段約18天至約 22天的期間之內執行、進一步地在一段約20天至約22天的期間之內執行、且進一步地在約22天的期間之內執行。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其中來自步驟(ii)之治療性TIL族群的該等細胞以類似於新鮮收集的細胞的水準表現CD4、CD8及TCR α β。
- 如請求項1或2之方法，其中該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該等PBMC係於步驟(i)中於步驟(i)中的培養開始後的第3至12天中的任一天和/或在步驟(ii)中於步驟(i)中的培養開始後的第11至12天中的任一天添加至該細胞培養。
- 如請求項1或2之方法，其中該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中步驟(ii)之該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27、表現CD28、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現，其中該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加CD57表現及降低CD56表現。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(i)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性 抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行和/或步驟(ii)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(i)之該FNA包含至少400,000個TIL。
- 如請求項1或2之方法，其中該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰癌、黑色素瘤、乳癌及卵巢癌，且其中該FNA獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺癌、黑色素瘤、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌、胰癌、神經膠質母細胞瘤、結直腸癌及肉瘤，其中該肺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)，且其中該病患先前已經歷外科治療。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(i)之該等第一TIL族群獲自FNA，其中該FNA使用25至18號針頭獲得。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(i)之該等第一TIL族群獲自小活體組織切片，或獲自核心活體組織切片(core biopsy)，且其中該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
- 如請求項1或2之方法，其中步驟(ii)重複一至四次，以獲得對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的該治療性TIL族群之TIL，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010個。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其中該第一擴增執行約3天至約10天。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其中該第一擴增包含將該細胞培養基在第1至3天中任一天補充OKT-3。
- 如請求項14之方法，其進一步包含在步驟(ii)之該額外的第二擴增，其係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第三TIL族群之該細胞培養基來執行。
- 一種治療性TIL族群之經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞之用途，其用於製備供治療癌症個體的藥物，其中該經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞可如請求項1至15中任一項之方法獲得。
- 如請求項16之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及 非小細胞肺癌。
- 如請求項1至2中任一項之方法，其包含：(a)將該第一TIL族群加入密閉系統；(b)藉由在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行該第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基補充OKT-3及抗原呈現細胞(APC)，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍，且其中自步驟(a)轉變至步驟(b)無需打開該系統而發生；(c)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及APC以執行該第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；(d)收集自步驟(c)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(c)轉變至步驟(d)無需打開該系統而發生；及(e)將得自步驟(d)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(d)轉移至步驟(e)無需打開該系統而發生。
- 一種用於擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由來自個體的腫瘤的至少一個細針抽吸物(FNA)或至少一個小活體組織切片在包含IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL族群以執行第一擴增而產生第二TIL族群，其中該細胞培養基補充OKT-3及抗原呈現細胞(APC)，其中該第一擴增執行約3天至約12天以獲得該第二TIL族群，其中到約3天至約12天該第二TIL族群包含至少5×107個TIL，其中該第一擴增是在提供第一氣體可通透表面積的密閉容器中執行，其中該第二TIL族群於數量上高於該第一TIL族群至少25倍；(b)藉由對該第二TIL族群的該細胞培養基補充額外的IL-2、OKT-3及APC以執行第二擴增而產生第三TIL族群，其中該第二擴增執行約3天至約12天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該第二擴增是在提供第二氣體可通透表面積的密閉容器中執行，且其中自步驟(a)轉變至步驟(b)無需打開該系統而發生；(c)收集自步驟(b)獲得的該治療性TIL族群，其中自步驟(b)轉變至步驟(c)無需打開該系統而發生；及(d)將得自步驟(c)的該經收集的TIL族群轉移至輸液袋，其中自步驟(c)轉移至步驟(d)無需打開該系統而發生。
- 如請求項19之方法，其中步驟(a)之該包含IL-2之細胞培養基並非在第1至3天中任一天補充OKT-3，且其中步驟(a)係預備性第一擴增步驟且步驟(b)係快速第二擴增步驟，其中該方法進一步包含使用冷凍保存過程將步驟(d)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存的步驟，且其中該冷凍保存過程使用1：1比例的經收集的TIL族群對CS10介質執行。
- 如請求項19或20之方法，其中該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該等PBMC經輻照且為異體的，且其中該等PBMC係於步驟(a)中第一期間的第3至12天中任一天及/或步驟(b)中第二期間之第3至12天中任一天添加至該細胞培養。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)之該第一擴增係藉由用OKT-3、IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行，和/或其中步驟(b)之該第二擴增係藉由用IL-15、OX40促效性抗體及/或4-1BB促效性抗體進一步補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)之該等TIL是自FNA所獲得，且其中步驟(a)之該FNA包含至少400,000個TIL，其中該FNA使用25至18號針頭獲得，其中該FNA獲 自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺癌、黑色素瘤、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌、胰癌、神經膠質母細胞瘤、結直腸癌及肉瘤，其中該肺腫瘤係非小細胞肺癌(NSCLC)，且其中該病患先前已經歷外科治療。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)之該等TIL獲自小活體組織切片，其中該小活體組織切片獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：胰癌、黑色素瘤、乳房癌及卵巢癌，且其中該小活體組織切片使用16至11號針頭獲得。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(c)之該收集使用LOVO®細胞處理系統執行，其中該細胞培養基提供於選自由G容器TM及XuriTM細胞袋所組成之群組之容器中，且進一步其中步驟(d)之該輸注袋係HypoThermosol輸注袋。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)至(d)在一段約17天至約24天的期間之內執行，其中步驟(a)至(d)在一段約18天至約22天的期間之內執行，或其中步驟(a)至(d)在一段約20天至約22天的期間之內執行。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)至(d)及冷凍保存在22天或更少天內執行。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(c)所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL，且其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係約2.3×1010至約13.7×1010個。
- 如請求項19或20之方法，其中步驟(a)至(c)在單一容器中執行，其中在單一容器中執行步驟(a)至(c)相較於在超過一個容器中執行步驟(a)至(c)導致增加每個經切除之腫瘤(resected tumor)的TIL產率，且其中該等抗原呈現細胞係於步驟(b)之該第二擴增添加至該等TIL而無需打開該系統，其中該第三TIL族群包含相對於該第二TIL族群增加的效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群，其中該治療性TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現一或多種選自由下列所組成之群組之特徵：表現CD27+、表現CD28+、較長端粒、增加CD57表現及降低CD56表現，且進一步其中獲自該第三TIL族群之該等效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD57表現及降低的CD56表現。
- 一種經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)用於製造供治療癌症個體的藥物之用途，其中該等經擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞是可如請求項19至29中任一項之方法所獲得之治療 性TIL族群，其中該方法進一步包含：包含：(e)使用冷凍保存過程將步驟(d)之包含該經收集的TIL族群之該輸注袋冷凍保存，其中治療有效劑量的來自步驟(e)之該輸注袋的該第三TIL族群是用於投予至該病患。
- 如請求項30之用途，其中步驟(c)所收集之該治療性TIL族群包含對投予治療有效劑量的該等TIL而言足夠的TIL。
- 如請求項30或31之用途，其中在投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該病患投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案(non-myeloablative lymphodepletion regimen)，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60mg/m2/天之環磷醯胺計二天且同時投予劑量為25mg/m2/天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟，且進一步其中該病患是以該等TIL細胞投予該病患之後當天開始的高劑量IL-2方案來治療，其中該高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000IU/kg直到耐受為止。
- 一種組成物，其包含使用如請求項1至15及18至29中任一項之方法擴增的TIL，其中該組成物進一步包含冷凍保存劑，其中該冷凍保存劑包含二甲亞碸且進一步包含冷 凍保存劑及等張劑，其中該組成物進一步包含：包含二甲亞碸之冷凍保存劑及包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉之等張劑，或其中該組成物包含：包含二甲亞碸及葡聚糖40之冷凍保存劑及包含氯化鈉、葡萄糖酸鈉及乙酸鈉之等張劑，且進一步其中該組成物提供於無菌輸注袋中。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762588044P | 2017-11-17 | 2017-11-17 | |
| US62/588,044 | 2017-11-17 | ||
| US201862621515P | 2018-01-24 | 2018-01-24 | |
| US62/621,515 | 2018-01-24 | ||
| US201862756038P | 2018-11-05 | 2018-11-05 | |
| US62/756,038 | 2018-11-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201932594A TW201932594A (zh) | 2019-08-16 |
| TWI833719B true TWI833719B (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110052530A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Adoptive cell therapy with young t cells |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110052530A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Adoptive cell therapy with young t cells |
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