CN115697044A

CN115697044A - 西瓜和其他葫芦科中内源罗汉果苷途径基因的调控

Info

Publication number: CN115697044A
Application number: CN202180039203.XA
Authority: CN
Inventors: 黄腾芳; 周菁; H·R·李; J·Q·威尔金森; F·卡奇
Original assignee: Arlo Biosystems Co ltd
Current assignee: Arlo Biosystems Co ltd
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-02-03
Also published as: US20230263121A1; WO2021202513A1

Abstract

本文提供了用于通过基因修饰植物以调控内源罗汉果苷途径基因的表达来增加植物(诸如葫芦科植物(例如西瓜))中的罗汉果苷水平的方法。本文还公开了具有增加的罗汉果苷水平的植物，来自此类植物的提取物(例如甜味剂)，来自此类植物的部分(例如汁液、种子、果肉等)，以及产生此类植物的方法。

Description

西瓜和其他葫芦科中内源罗汉果苷途径基因的调控

技术领域

本发明涉及用于通过基因修饰植物以调控内源罗汉果苷(mogroside)途径基因的表达来增加植物中罗汉果苷水平的方法。本发明还涉及含有增加水平的罗汉果苷的植物、植物部分和植物产品。

以通过EFS-WEB文本提交的序列表的引用

本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，在此将其全文引入作为参考。于2021年3月30日创建的所述ASCII拷贝被命名为PBIO-0101.8WO_Seq_List_3-31，大小为95,189字节。

背景技术

甜味是人类最基本的享乐之一，甚至比如海洛因和可卡因等药物更强和更有吸引力(Madsen和Ahmed Addict Biol 20:433-444(2015))。然而，为满足这种需求，糖的消耗从近250年前起呈指数增长，且荟萃分析暗示了在肥胖症、糖尿病、代谢综合征和心血管疾病发展中的糖消耗(Bray和Popkin,Diabetes Care 37:950-956(2014))。鉴于与可替代的天然甜味剂相关的潜在优势，人们对于开发替代的天然非糖甜味剂以满足人类对甜味风味的需求非常感兴趣。

具有强增甜能力的天然化合物属于许多化学家族，包括蛋白质、类黄酮和萜类(Kim和Kinghorn,Arch Pharm Res 25:725-746(2002))。罗汉果苷三萜系化合物，源自葫芦科(Cucurbitaceae family)植物罗汉果(Siraitia grosvenorii)(luo-han-guo或monkfruit，最初在20世纪30年代发现并分类(Swingle,J Arnold Arbor 22:197-203(1941))的成熟果实，在中国用作天然甜味剂，其甜味强度是蔗糖的250倍(Kasai et al.,Agric BiolChem 53:3347-3349(1989))。此外，最近的研究揭示了罗汉果苷的其他健康益处(Li etal.,Chin J Nat Med 12:89-102(2014))。总之，源自罗汉果的罗汉果苷被认为是应用于食品和饮料的可接受的天然零卡路里甜味剂，且目前具有GRAS状态(Ibrahim,EC Nutrition1:57-56(2015)；参见网站fda.gov/media/109982/download)。

然而，由于各种原因，人们对罗汉果苷的日常消费及其在食品工业中的使用一直很迟缓。首先，罗汉果原产于亚洲部分地区，大部分生产在中国。此外，罗汉果使用传统方法种植，导致生产成本非常高。此外，罗汉果的低产率，果实中不同水平的罗汉果苷和对罗汉果生物学知识贫乏等因素也阻碍了罗汉果苷的广泛使用。由于罗汉果这些植物很难在其本土栖息地以外种植，基于罗汉果在植物生产中遇到的困难，在广泛适应的植物系统中生产罗汉果苷的需求尚未得到满足。

发明简述

本文提供了用于通过基因修饰植物的基因组以调控罗汉果苷生物合成的内源途径的表达来增加植物(诸如葫芦科植物)中罗汉果苷产量的方法。本文还公开了具有增加的罗汉果苷产量的植物(例如，属于葫芦科的植物，诸如西瓜植物)，来自此类植物的提取物(例如，甜味剂)，来自此类植物的部分(例如，汁液、种子、果肉等)，来自此类植物的植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)，来自此类植物的植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)，来自此类植物的植物生物质(例如，干燥的生物质，诸如粉碎的和/或粉末状的生物质)，以及产生此类植物或此类植物后代的方法。

因此，在一方面，本发明提供了用于通过基因修饰细胞基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达来增加细胞中一种或多种罗汉果苷水平的方法。

在所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码葫芦二烯醇合酶(CDS)的内源基因、编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)的内源基因、编码环氧化物水解酶3(EPH3)的内源基因、编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)的内源基因、编码UDP糖基转移酶720(UGT720)的内源基因、编码UDP糖基转移酶94(UGT94)的内源基因，或其一种或多种同源物。

在所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽序列的内源基因。

在一些实施方案中，所述方法包括调控葫芦科植物基因组中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。在所述方法的这些实施方案中，所述葫芦科植物是西瓜植物或黄瓜植物。在所述方法的这些实施方案中，西瓜是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的启动子序列。在所述方法的这些实施方案中，启动子序列的修饰包括：(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。在所述方法的某些实施方案中，启动子序列的修饰包括通过以下增强、改善或增加启动子序列的活性：(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。在所述方法的这些实施方案中，启动子序列的修饰包括用顺式或转基因核酸序列(诸如顺式或转基因启动子)替换启动子序列。

在所述方法的这些实施方案中，启动子序列的修饰包括启动子序列的校正或编辑。在所述方法的某些实施方案中，启动子序列的修饰包括：(i)检测限制启动子序列活性的一种或多种多态性或突变；和(ii)通过多态性或突变的缺失或校正来校正启动子序列。

在所述方法的一些实施方案中，启动子序列的修饰包括一个或多个上游核苷酸序列的插入、缺失和/或修饰。在所述方法的某些实施方案中，启动子序列的修饰包括通过一个或多个上游核苷酸序列的插入、缺失和/或修饰来增强或改善或增加启动子序列的活性。

在所述方法的这些实施方案中，启动子序列的修饰包括顺式作用因子的添加、插入和/或工程化。在所述方法的某些实施方案中，顺式作用因子与启动子序列相互作用并修饰启动子序列。在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。在所述方法的这些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。在所述方法的这些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的负调控序列。在所述方法的这些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括在顺式或反式位点修饰所述基因的负调控序列。在所述方法的某些实施方案中，负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括转录因子结合位点或增强子元件的插入、修饰和/或工程化。在所述方法的某些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括新的转录因子结合位点或增强子元件的插入。在所述方法的某些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括现有的转录因子结合位点或增强子元件的修饰和/或工程化。

在所述方法的一些实施方案中，基因修饰所述细胞的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括将一种或多种功能性启动子插入所述细胞的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种功能性启动子是同源启动子。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种功能性启动子是异源启动子。

在所述方法的这些实施方案中，所述启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。在所述方法的某些实施方案中，CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

在所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIA1。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在所述方法的一些实施方案中，当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的一种或多种罗汉果苷；和/或当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多的一种或多种罗汉果苷。

在所述方法的这些实施方案中，当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的罗汉果苷V；和/或当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多的罗汉果苷V。

在所述方法的一些实施方案中，基因修饰细胞的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括增加所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在另一个方面，本发明提供了用于产生包含增加水平的一种或多种罗汉果苷的植物的方法，其通过基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，并从所述植物细胞或植物部分种植植物，其中与对照植物相比，所述植物包含增加水平的一种或多种罗汉果苷。

在所述方法的一些实施方案中，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括所述基因的启动子序列的修饰。在所述方法的这些实施方案中，启动子序列的修饰包括：(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。

在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括调控一种或多种转录因子基因的表达。在所述方法的这些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。在所述方法的这些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在所述方法的一些实施方案中，调控一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的负调控序列。在所述方法的一些实施方案中，负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。

在所述方法的一些实施方案中，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括将一种或多种功能性启动子插入所述植物细胞或植物部分的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种功能性启动子是同源启动子。在所述方法的某些实施方案中，所述一种或多种功能性启动子是异源启动子。

在所述方法的这些实施方案中，启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。在所述方法的某些实施方案中，CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

在所述方法的一些实施方案中，调控所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达包括增加所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在所述方法的一些实施方案中，所述植物是葫芦科植物。在所述方法的这些实施方案中，植物是西瓜植物或黄瓜植物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

在另一方面，本发明提供了与对照植物相比包含增加水平的至少一种罗汉果苷的植物或植物部分，其中所述植物的基因组包含基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在植物或植物部分的一些实施方案中，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码葫芦二烯醇合酶(CDS)的内源基因、编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)的内源基因、编码环氧化物水解酶3(EPH3)的内源基因、编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)的内源基因、编码UDP糖基转移酶720(UGT720)的内源基因、编码UDP糖基转移酶94(UGT94)的内源基因，或其一种或多种同源物。

在植物或植物部分的一些实施方案中，一种或多种罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽序列的内源基因。

在植物或植物部分的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的基因修饰包括一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列的基因修饰。在植物或植物部分的这些实施方案中，启动子序列的基因修饰包括：(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。

在植物或植物部分的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括调控一种或多种转录因子基因的表达。在植物或植物部分的这些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。在植物或植物部分的一些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在植物或植物部分的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的负调控序列。在植物或植物部分的这些实施方案中，负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。

在植物或植物部分的一些实施方案中，调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的基因修饰包括将一种或多种功能性启动子插入植物细胞或植物部分的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种功能性启动子是同源启动子。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种功能性启动子是异源启动子。

在植物或植物部分的这些实施方案中，启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。在植物或植物部分的某些实施方案中，CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

在植物或植物部分的一些实施方案中，一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在所述植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A1。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在植物或植物部分的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在植物或植物部分的一些实施方案中，与对照植物或植物部分相比，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达增加。

在植物或植物部分的一些实施方案中，植物是葫芦科植物。在植物或植物部分的这些实施方案中，植物是西瓜植物或黄瓜植物。在植物或植物部分的某些实施方案中，植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

另一方面，本发明提供来自上述植物或植物部分的提取物。

在提取物的一些实施方案中，提取物包含一种或多种罗汉果苷。在提取物的这些实施方案中，一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A1。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在提取物的具体实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在提取物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在提取物的一些实施方案中，与蔗糖相比，所述提取物具有200-450X的甜度指数。在提取物的一些实施方案中，提取物具有5或更低的升糖指数(GI)。在提取物的这些实施方案中，提取物具有1或更低的GI。在提取物的某些实施方案中，提取物的GI为0。

在该植物部分的一些实施方案中，与蔗糖相比，所述植物部分具有200-450X的甜度指数。在植物部分的一些实施方案中，植物部分具有5或更低的升糖指数(GI)。在植物部分的某些实施方案中，植物部分具有1或更低的GI。在植物部分的某些实施方案中，植物部分的GI为0。在所述植物部分的一些实施方案中，所述植物部分是果肉。在所述植物部分的一些实施方案中，所述植物部分是汁液。

另一方面，本发明提供了来自上述植物的种子，其中所述种子包含基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。另一方面，本发明提供了上述植物或植物部分的植物浓缩物。

在植物浓缩物的一些实施方案中，与由对照植物产生的植物浓缩物相比，植物浓缩物包含增加量的一种或多种罗汉果苷。在植物浓缩物的这些实施方案中，一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷IIIA2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A1。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在植物浓缩物的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在植物浓缩物的一些实施方案中，与蔗糖相比，植物浓缩物具有200-450X的甜度指数。在植物浓缩物的一些实施方案中，植物浓缩物具有5或更低的升糖指数(GI)。在植物浓缩物的这些实施方案中，植物浓缩物具有1或更低的GI。在植物浓缩物的某些实施方案中，植物浓缩物的GI为0。

另一方面，本发明提供了上述植物或植物部分的植物粉末。在植物粉末的一些实施方案中，与从对照植物产生的植物粉末相比，所述植物粉末包含增加量的一种或多种罗汉果苷。在植物粉末的这些实施方案中，一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在植物粉末的某些实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A1。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在植物粉末的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在植物粉末的一些实施方案中，与蔗糖相比，所述植物粉末具有200-450X的甜度指数。在植物粉末的一些实施方案中，植物粉末具有5或更低的升糖指数(GI)。在植物粉末的这些实施方案中，植物粉末具有1或更低的GI。在植物粉末的某些实施方案中，植物粉末的GI为0。在植物粉末的一些实施方案中，所述植物粉末是配制的植物粉末。

另一方面，本发明提供了上述植物的植物生物质。在植物生物质的一些实施方案中，与从对照植物产生的植物生物质相比，植物生物质包含增加量的一种或多种罗汉果苷。在植物生物质的这些实施方案中，一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果醇。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-A1。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷I-E1。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIA。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIB。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIE。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷IIE。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷A1。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A1。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷III A2。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IIIx。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-脱氧罗汉果苷III。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷IV-A。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷IV-A。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是赛门苷I。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是7-氧代罗汉果苷V。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是11-氧代罗汉果苷V。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VI。在植物生物质的某些实施方案中，一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷VII。

在植物生物质的一些实施方案中，与蔗糖相比，植物生物质具有200-450X的甜度指数。在植物生物质的一些实施方案中，植物生物质具有5或更低的升糖指数(GI)。在植物生物质的这些实施方案中，植物生物质具有1或更低的GI。在植物生物质的某些实施方案中，植物生物质的GI为0。

在植物生物质的一些实施方案中，植物生物质是干燥生物质。在植物生物质的这些实施方案中，干燥的生物质是粉碎的和/或粉末状的生物质。

另一方面，本发明提供了上述植物的后代植物，其中后代植物中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达被调控。在另一个方面，本发明提供了来自此类后代植物的种子，其中在来自所述后代植物的所述种子中调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在另一个方面，本发明提供了用于产生具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的后代植物的方法，其通过将上文所述的植物与未被基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物杂交，以产生与对照植物相比具有调控的一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的后代植物。

在所述方法的一些实施方案中，与对照植物相比，后代植物包含增加水平的至少一种罗汉果苷。

在所述方法的一些实施方案中，所述方法包括在所述杂交步骤后从植物种植种子并从所述种子再生所述后代植物。

在一个方面，提供了表达构建体，其包含启动子和位于一对核酸酶识别位点之间的前导序列，且还在每一侧包含同源臂，其中所述启动子可操作地连接至编码与SEQ IDNO:1-20中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽的序列，诸如内源罗汉果苷合成途径基因。在具体的实施方案中，所述表达构建体包含位于一对工程化大范围核酸酶识别位点之间的CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列，且还在每一侧包含同源臂，其中所述启动子可操作地连接至编码与SEQ ID NO:1-20中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽的序列。在具体的实施方案中，所述启动子是同源启动子或异源启动子。在一些实施方案中，所述启动子是来自西瓜植物或葫芦科的其他植物的异源启动子。

附图简要说明

图1是罗汉果苷合成途径的示意图。

图2是含有与西瓜中的罗汉果苷基因同源物可操作地连接的木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子的表达构建体的示意图。

图3A-3B提供了修复模板的示意图，每个修复模板含有插入在一对ARCUS核酸酶切割位点之间的CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列，以及两侧150bp的同源臂。图3A是含有插入在一对ARCUS核酸酶切割位点U72 3-4和U72 5-6之间的CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列的修复模板的示意图。图3B是含有插入至ARCUS核酸酶对C87 1-2和C87 3-4之间的CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列的修复模板的示意图。

图4A-4B提供了显示插入CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列后，与未组合DNA修复模板或ARCUS酶的对照递送相比，罗汉果苷合成途径基因同源物表达增加的图。图4A提供了显示在插入CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列后，与未组合DNA修复模板或ARCUS酶的对照递送相比，UGT720基因的同源物的表达增加的图。图4B提供了显示插入CSVMV启动子和SynJ 5’前导序列后，与未组合DNA修复模板或ARCUS酶的对照递送相比，CYP87基因同源物表达增加的图。

发明详述

1.1参考文献和定义

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。在此引用的授权的美国专利、通过的申请、公开的外国申请和参考文献，包括GenBank数据库序列，在此引入作为参考，其程度与每一个明确地和单独地指出引入作为参考相同。

本发明可以不同的形式实施，且不应该被解释为限于这里阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开彻底和完整，并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。例如，关于一个实施方案说明的特征可结合到其他实施方案中，且关于特定实施方案说明的特征可从该实施方案中删除。此外，在不脱离本发明的情况下，根据本发明的公开内容，本文建议的实施方案的众多变化和添加对于本领域技术人员来说是显而易见的。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。

如本文所用，“一个”、“一种”或“该”可意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可指单个细胞或多个细胞。此外，术语“一个基因”可包括多个基因，包括一组数个基因。

如本文所用，除非另外具体指明，“或”一词用于“和/或”的包含意义，而不是“任一/或”的排他性含义。

术语“约”或“大约”通常意指在给定值或范围的5％内，或更优选在1％内。

术语“包含(comprise/comprising)”、“包括(include/including)”、“具有(having)”和它们的结合是指“包括但不限于”。

本发明的各种实施方案可以以范围的格式呈现。应当注意的是，无论何时列出参数的值或值的范围，所列举的值中间的值和范围也是本公开的一部分。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1-10的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-4、2-6、2-8、2-10、3-6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。这适用于无论范围的宽度如何。

当本文指示数值范围时，其意指包括在所指范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“第一所指数字和第二所指数字间的范围”和”从第一所指数字到第二所指数字的范围”在本文中可互换地使用，且意指包括第一和第二所指数字以及它们之间的所有分数和整数数字。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或易于从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所用，术语“基因”是指编码蛋白质、多肽或肽的功能性核酸单元。如本领域技术人员所理解的，该功能术语包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、cDNA序列，和更低的工程化基因片段。

如本文所用，术语“基因修饰的”是指其中或其祖先中的基因组DNA序列已通过重组技术有意修饰的细胞或生物体。本文所用的术语“基因修饰的”包括术语“重组的”或“转基因的”。

如本文可互换使用的，术语“罗汉果苷合成途径基因”或“罗汉果苷途径基因”是指编码参与罗汉果苷合成途径的酶(例如，催化罗汉果苷合成途径的一个或多个反应的酶，如图1中所述)或该基因的活性变体或同源物的任何基因。在一些实施方案中，罗汉果苷合成途径基因是编码葫芦二烯醇合酶(CDS)(SEQ ID NO:15)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因；编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)(SEQ ID NO:16)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因；编码环氧化物水解酶3(EPH3)(SEQ ID NO:17)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因；编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)(SEQ ID NO:18)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因；编码UDP糖基转移酶720(UGT720)(SEQ ID NO:19)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因；和/或编码UDP糖基转移酶94(UGT94)(SEQ ID NO:20)的基因或编码与其具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因。在一些实施方案中，罗汉果苷合成途径基因是编码CDS，CYP87D18、EPH3、SQE1、UGT720和/或UGT94的基因的同源物(例如，葫芦科家族植物，诸如西瓜(例如，查尔斯顿灰品种西瓜)植物或黄瓜植物中的同源物)。例如，罗汉果苷合成途径基因可以是编码CDS的基因的一种或多种同源物；编码CYP87D18的基因的一种或多种同源物；编码EPH3的基因的一种或多种同源物；编码SQE1的基因的一种或多种同源物；编码UGT720的基因的一种或多种同源物；和/或编码UGT94的基因的一种或多种同源物。在特定实施方案中，罗汉果苷合成途径基因是编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽序列的基因。

当参考特定的序列表时，这种参考应理解为还涵盖基本上对应于其互补序列的序列，因为包括由例如测序错误、克隆错误或导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其他改变引起的微小序列变化，只要这种变化的频率小于1/50个核苷酸，或者小于1/100个核苷酸，或者小于1/200个核苷酸，或者小于1/500个核苷酸，或者小于1/1000个核苷酸，或者小于1/5000个核苷酸，或者小于1/10000个核苷酸。

如本文所用，术语“多肽”是指线性有机聚合物，其含有在链中通过肽键键合在一起的大量氨基酸残基，形成蛋白质分子的一部分(或全部)。多肽的氨基酸序列是指包含多肽或其部分的氨基酸的线性连续排列。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。

术语“分离的”是指至少部分地从天然环境中分离，例如，从植物细胞。

如本文所用，术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。如本文所用，关于核苷酸序列或氨基酸序列的术语“外源的”或“异源的”旨在表示纯合成的，源自外源物种的，或如果来自相同物种，通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座中从其天然形式实质上修饰的序列。因此，异源核酸序列可不在植物中天然表达(例如，来自不同物种的核酸序列)，或者与相应的野生型植物相比可具有改变的表达。外源多核苷酸可以以稳定或瞬时的方式导入植物，以产生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。应注意，外源多核苷酸可包含与植物的内源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。

如本文所用，涉及基因或核苷酸序列或蛋白质的术语“内源”意指天然包含在细胞内或由细胞表达的基因或核苷酸序列或蛋白质。例如，为增加植物细胞中罗汉果苷的表达，可通过本公开的方法调控细胞中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因(即，细胞基因组中天然包含或表达的罗汉果苷合成途径基因)的表达。内源基因可包括在植物细胞中天然存在的基因，但其在细胞基因组中被修饰而没有插入或替换来自另一植物物种或修饰细胞基因组中的另一位置的异源基因。

“同源”或“同源序列”可指直系同源和旁系同源序列。旁系同源序列涉及物种基因组内的基因复制。由于祖先关系，直系同源序列涉及不同生物体中的同源基因。因此，直系同源物是源自给定两个物种的最后共同祖先中的单个祖先基因的进化对应物，因此极大可能具有相同功能。鉴定单子叶植物物种中的同源物(例如直系同源物)的一种方法是通过进行反向BLAST搜索。这可通过涉及针对任何序列数据库(诸如可在ncbi.nlm.nih.gov找到的公众可获得的NCBI数据库)对目的序列进行blast的第一次blast来完成。如果在水稻中寻找直系同源物，目的序列将针对例如来自日本水稻(Oryza sativa Nipponbare)的可在NCBI获得的28,469全长cDNA克隆进行blast。可过滤blast结果。然后，将过滤的结果或未过滤的结果的全长序列对源自目的序列的生物体的序列进行反向blast(第二blast)。然后，比较第一和第二blast的结果。当在第一blast中产生最高得分(最佳命中)的序列在第二blast中将查询序列(原始目的序列)鉴定为最佳命中时，即鉴定了直系同源物。使用相同的原理，发现了旁系同源物(相同生物体中基因的同源物)。在大序列族的情况下，可使用ClusteralW程序[ebi.ac.uk/Tools/clusteralw2/index.html]，随后使用邻接进化树(wikipedia.org/wiki/neighbor-joining)，该邻接进化树有助于可视化聚类。

在一些实施方案中，如本文所用的术语“同源物”是指基因的功能性同源物(例如罗汉果苷合成途径基因的功能性同源物)。功能性同源物是编码与参考基因编码的多肽具有序列相似性的多肽的基因，且该同源物编码的多肽执行参考基因编码的多肽的一种或多种生化或生理功能。因此，本文所述的罗汉果苷合成途径基因的功能同源物是编码多肽的基因，所述多肽与参考基因编码的罗汉果苷合成途径酶具有序列相似性，且能够催化与参考酶的罗汉果苷合成途径相同的步骤或部分步骤。通常，优选功能同源物和/或功能同源物编码的多肽与参考基因或参考基因编码的多肽具有至少一定程度的序列同一性。

同源性(例如，同源性百分比，序列同一性+序列相似性)可使用计算成对序列比对的任何同源性比较软件来确定。

如本文所用，“序列同一性”、“同一性”、“同一性百分比”、“相似性百分比”、“序列相似性”等是指基于序列比对的两个序列的相似性程度的量度，所述量度使比对的氨基酸残基或核苷酸之间的相似性最大化，且是序列比对中相同或相似残基或核苷酸的数目，总残基或核苷酸的数目以及存在缺口和长度的函数。多种算法和计算机程序可使用标准参数来确定序列相似性。如本文所用，使用用于氨基酸序列的BLASTp程序和用于核酸序列的BLASTn程序测量序列相似性，两者均可通过National Center for BiotechnologyInformation(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，且描述于例如Altschul et al.(1990),J.Mol.Biol.215:403-410；Gish and States(1993),Nature Genet.3:266-272；Madden etal.(1996),Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul et al.(1997),Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)；Zhang et al.(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14中。如本文所用，两个氨基酸序列的相似性百分比是基于用于BLASTp算法的以下参数的分数：字大小＝3；空位开放罚分＝-11；空位延伸罚分＝-1；且评分矩阵＝BLOSUM62。如本文所用，两个核酸序列的相似性百分比是基于用于BLASTn算法的以下参数的分数：字大小＝11；空位开放罚分＝-5；空位延伸罚分＝-2；匹配得分＝1；错配罚分＝-3。当序列同一性百分比用于蛋白质时，可认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能特性。当序列的保守取代不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调控的方法是本领域技术人员公知的。典型地，这包括将保守取代记为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，非保守取代得分为0时，保守取代得分为0-1。例如，根据Henikoff S和Henikoff J G.(Proc Natl Acad Sci 89:10915-9(1992))的算法计算保守取代的评分。

同一性(例如同源性百分比)可使用任何同源性比较软件确定，包括例如NationalCenter of Biotechnology Information(NCBI)的BlastN软件，诸如通过使用默认参数。

根据一些实施方案，同一性是整体同一性，即在本发明的整个氨基酸或核酸序列上而非在其部分上的同一性。

根据一些实施方案，术语“同源性”或“同源的”是指两个或更多个核酸序列的同一性；或两个或更多个氨基酸序列的同一性；或氨基酸序列与一个或多个核酸序列的同一性。

根据一些实施方案，同源性是整体同源性，例如在本发明的整个氨基酸或核酸序列上而非在其部分上的同源性。

两个或更多个序列之间的同源性或同一性程度可使用WO2014/102774中描述的各种已知序列比较工具来确定。

如本文所用，术语“重组DNA构建体”、“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换使用且是单链或双链多核苷酸。重组构建体包含核酸片段的人工组合，所述核酸片段包括但不限于自然界中未一起发现的调控序列和编码序列。例如，重组DNA构建体可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源并以不同于天然发现的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或与载体联合使用。

表达盒可允许特定多核苷酸序列在宿主细胞(例如植物细胞)中转录。表达盒可以是质粒、病毒基因组的一部分，或核酸片段。典型地，表达盒包括可操作地连接到启动子的待转录的多核苷酸。可存在于表达盒中的其他元件包括增强转录的元件(例如增强子)和终止转录的元件(例如终止子)，以及赋予由表达盒产生的重组蛋白某些结合亲和力或抗原性的元件。例如，本文所述的表达构建体可含有与罗汉果苷合成途径基因可操作地连接的启动子序列，其中所述启动子可指导(例如，调控，诸如增加)罗汉果苷合成途径基因在宿主细胞中的表达，诸如植物细胞(例如，葫芦科植物，诸如西瓜(例如，查尔斯通灰品种西瓜)植物或黄瓜植物)。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”是指与启动子/调控序列可操作连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，所述序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，所述序列还可包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是，例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能连接。例如，编码本文公开的蛋白质的核酸序列与调控序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许编码蛋白质的核酸序列表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当是指两个蛋白质编码区的连接时，可操作地连接是指编码区在同一读码框中。

如本文所用，关于参数，术语“调控”或“调控的”是指来自比较对照的参数的可检测的正向或负向变化，例如确立的参数的正常或参考水平，或确立的标准对照。例如，如本文所用，用于调控基因表达的方法是指本文所公开的方法，与基因的正常或参考表达水平(例如，在细胞经所述方法之前的细胞或尚未经所述方法的细胞中的基因的表达水平)相比，所述方法可引起基因的表达水平的可检测的正向或负向变化(例如，细胞，诸如植物细胞中的基因的表达水平的变化)。参数的调控(例如，基因表达的调控)可指参数的增加或降低(例如，基因表达的增加或降低)。例如，与基因的正常或参考表达水平(例如，在受上述方法约束的细胞之前或未受上述方法约束的细胞中基因的表达水平)相比，用于调控基因表达的方法可引起基因的表达水平(例如，细胞中的基因的表达水平，诸如植物细胞)的可检测的(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、25％、45％、45％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更高)的增加或正向变化。或者，与基因的正常或参比表达水平相比(例如，在经上述方法的细胞前的，或未经上述方法的细胞中，该基因的表达水平)，用于调控基因表达的方法可引起基因的表达水平(例如，细胞中的基因的表达水平，诸如植物细胞)的可检测的(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)的降低、减少或负向变化。

如本文关于参数所使用的，术语“增加的”或“增加”是指参数从可比较的对照中可检测的(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多)正向变化，例如参数的既定正常或参考水平，或既定标准对照。例如，与对照植物相比，植物中罗汉果苷产量的增加可表明植物中罗汉果苷产量的可检测(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多)的增加或正向变化。类似地，与相应的对照植物部分相比，植物部分(例如汁液、果肉等)中的罗汉果苷水平的增加可表明所述植物部分(例如汁液、果肉等)中的罗汉果苷水平的可检测的(例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多)增加或正向变化。

如本文所用，“对照植物”或“对照植物部分”或“对照细胞”是指未经本文所述方法和组合物的植物或植物部分或细胞，例如未经本文所述的用于调控一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达的方法和组合物的植物或植物部分或细胞。在一些实施方案中，对照植物或对照植物部分或对照细胞是指不具有调控表达的基因(例如罗汉果苷合成途径基因)的植物或植物部分或细胞。特别地，如本文所用，“对照植物”或“对照植物部分”或“对照细胞”可指未经修饰(例如，通过本文所述的方法和组合物)以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的植物或植物部分或细胞。例如，对照植物或对照植物部分或对照细胞可指不具有含调控表达的罗汉果苷合成途径基因(例如，内源罗汉果苷合成途径基因)或不具有与本公开的测试(例如，基因修饰的或转基因的)植物或植物部分或细胞相同的调控表达的罗汉果苷合成途径基因的植物或植物部分或细胞。

如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物(植物可由其再生)、植物愈伤组织、植物丛和在植物或植物部分(诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果肉、汁液、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等中)完整的植物细胞。谷粒是指由商业种植者生产的成熟种子，其目的不同于种植或繁殖该物种。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。还提供了保留本文公开的序列的加工的植物产品(例如，提取物)或副产物，包括例如糖、甜味剂、加工的植物生物质等。如本文所用，术语“果肉”是指植物的肉质部分，诸如果实的肉质部分，茎的肉质部分等。在本公开的一些实施方案中，果肉是指本文所述的植物(例如，葫芦科植物，诸如西瓜(例如，查尔斯顿灰品种西瓜植物)或黄瓜植物)的果实的可食用的肉质部分。

如本文所用，术语“甜味剂”是指当添加到食品和饮料中，或单独品尝时提供甜味的天然或人造物质。在本公开的一些实施方案中，甜味剂是一种提取物，诸如来自本文描述的植物(例如，葫芦科植物，诸如西瓜植物或黄瓜植物)的结晶提取物，该提取物当添加到食物和饮料中，或单独品尝时提供甜味。本文所述的甜味剂可含有一种或多种罗汉果苷。例如，在具体的实施方案中，甜味剂包含罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧化罗汉果苷IIE、11-氧化罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧化罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧化罗汉果苷V、11-氧化罗汉果苷V、罗汉果苷VI和/或罗汉果苷VII中的至少一种。另外地或可选地，本文描述的甜味剂可以是从本文描述的植物或其后代植物中提取的一种或多种罗汉果苷，所述植物被修饰以具有调控的一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达。在具体实施方案中，从基因修饰的植物或其后代中提取的罗汉果苷可进行加工以纯化罗汉果苷，和/或结晶罗汉果苷。以这种方式，可制备本文所述的包含由基因修饰的植物或其后代产生的一种或多种罗汉果苷的结晶甜味剂。

如本文所用，“基因编辑”或“基因组编辑”或“修饰”或“基因修饰”或或“基因修饰的”或“工程化的”或“工程化”或“基因工程化”是指相对于参考序列(例如，野生型或天然序列)，重组序列中的氨基酸残基的任何插入、缺失或取代，或可指细胞基因组中或细胞基因组外部(例如，质粒)的核酸分子的单链切割、双链切割或结合。“修饰(Modification)”或“修饰(modifying)”可指对过程或对靶标功能(诸如启动子、转录因子基因等)的任何可检测的正向或反向作用。靶标的修饰(例如，启动子的修饰)可指靶标的活化或抑制(例如，启动子的活化或抑制)。例如，启动子的修饰可表明启动子的功能(例如，启动子在细胞基因组中的功能，诸如植物细胞)相对于正常或参考水平(例如，启动子在细胞经上述方法前的基因组中的功能，或未经上述方法的细胞中的功能)具有可检测到的(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、50％、75％、300％、25％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多)活化或正向作用。或者，启动子的修饰可指示与正常或参考水平(例如，在细胞经所述方法之前细胞或未经所述方法的细胞的基因组中的启动子的功能)相比，对启动子的功能或活性(例如，细胞的基因组中的启动子的功能，诸如植物细胞)的可检测的(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)的抑制或反向作用。因此，“基因修饰的植物”或“基因修饰的植物部分”或“基因修饰的细胞”或“基因修饰的植物基因组”是指已经上文所述的一种或多种修饰的植物或植物部分或细胞或基因组。例如，基因修饰的植物或基因修饰的植物部分或基因修饰的细胞可指植物或植物部分或细胞，其中所述植物或植物部分或细胞的基因组已被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

如本文所用，关于测试产品(例如，测试食品，诸如来自本文所述植物的甜味剂、果肉或汁液)，术语“升糖指数”或“GI”是指消费该产品后两小时血糖水平的相对升高。可将0-100的GI值分配给测试产品(例如，测试食品，诸如来自本文所述植物的甜味剂、果肉或汁液)，其中纯葡萄糖任意给定100的值。测试产品(例如，测试食品，来自如本文所述的植物的甜味剂、果肉或汁液)的GI值可通过在禁食12小时并用一定量的可用碳水化合物(通常为50g)摄取产品后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。测试产品的AUC除以标准品(葡萄糖或白面包，给出两种不同的定义)的AUC并乘以100。平均GI值由在10名人类受试者中收集的数据计算。标准和测试产品必须含有等量的可用碳水化合物。结果给出了每个测试产品的相对等级。如果GI为55或更低，则认为测试产品(例如，测试食品，诸如来自本文所述植物的甜味剂、果肉或汁液)具有低GI；如果为70或更高，则为高GI；以及，如果其为56-69，则为中间范围GI。

如本文所用，关于测试产品(例如，测试食品，诸如来自本文所述植物的甜味剂、果肉或汁液)，术语“甜度指数”是指相对于蔗糖，测试产品中的甜度的量度。可通过比较测试产品的阈值与蔗糖的阈值来测量测试产品(例如，测试食品，诸如来自本文所述植物的甜味剂、果肉或汁液)相对于蔗糖的甜度指数。测试产品或蔗糖的阈值可通过测试产品或蔗糖在水中的浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测(例如，品尝)到该产品或蔗糖在水中的存在。任何感官分析方法可用于评价罗汉果苷的相对甜度，包括但不限于2选一强制选择(2-AFC)和三角试验。

如本文所用，术语“大范围核酸酶”是指以大于12个碱基对的识别序列结合双链DNA的内切核酸酶。在一些实施方案中，本公开的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是源自I-CreI(SEQ ID NO:22)的内切核酸酶，且可指相对于天然I-CreI在例如DNA结合特异性，DNA切割活性，DNA结合亲和力或二聚特性方面已被修饰的I-CreI的工程化变体。用于产生I-CreI的此类修饰变体的方法是本领域已知的(例如，WO2007/047859，通过引用将其全文并入)。本文所用的大范围核酸酶作为异源二聚体与双链DNA结合。大范围核酸酶也可以是“单链大范围核酸酶”，其中使用肽接头将一对DNA结合结构域连接到单个多肽中。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。当在如本文所述的靶向细胞中表达时，本公开的大范围核酸酶是基本上无毒的，这样使得当使用本文描述的方法测量时，细胞可被转染且维持在37℃而没有观察到对细胞活力的有害影响或大范围核酸酶切割活性的显著降低。

如本文所用，术语“单链大范围核酸酶”是指包含通过接头连接的一对核酸酶亚基的多肽。单链大范围核酸酶具有以下结构：N端亚基-接头-C端亚基。两个大范围核酸酶亚基通常在氨基酸序列上是不相同的，且将结合不相同的DNA序列。因此，单链大范围核酸酶典型地切割假-回文或非回文识别序列。单链大范围核酸酶可被称为“单链异二聚体”或“单链异二聚体大范围核酸酶”，尽管事实上其非二聚体。为清楚起见，除非另有说明，术语“大范围核酸酶”可指二聚体或单链大范围核酸酶。

如本文所用，术语“核酸酶”和“内切核酸酶”可互换使用，是指天然存在的或工程化的酶，其切割多核苷酸链内的磷酸二酯键。

如本文所用，术语“紧凑(compact)TALEN”是指包含DNA结合结构域的核酸内切酶，所述DNA结合结构域具有一个或多个TAL结构域重复，所述重复以任何方向与I-TevI归巢核酸内切酶的任何部分或美国申请号20130117869(其全文以引用方式并入本文)中表2中所列的核酸内切酶的任一融合，所述核酸内切酶包括但不限于MmeI、EndA、End1、I-BasI、I-TevII、I-TevIII、I-TwoI、MspI、MvaI、NucA和NucM。紧凑TALEN不需要用于DNA加工活性的二聚化，减轻了对具有插入DNA间隔子的双靶点的需要。在一些实施方案中，所述紧凑TALEN包含16-22个TAL结构域重复。

如本文所用，术语“CRISPR核酸酶”或“CRISPR系统核酸酶”是指CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复)相关的(Cas)内切核酸酶或其变体，诸如Cas9，其与向导(guide)RNA结合，通过与多核苷酸中的识别位点杂交而引导相关内切核酸酶的核酸切割。在某些实施方案中，所述CRISPR核酸酶是2类CRISPR酶。在这些实施方案的一些中，CRISPR核酸酶是2类，II型酶，诸如Cas9。在其他实施方案中，CRISPR核酸酶是2类，V型酶，诸如Cpf1或Cas12a。向导RNA包含同向重复序列和与靶识别位点互补的向导序列(在内源CRISPR系统的上下文中通常称为间隔子)。在某些实施方案中，CRISPR系统还包含与向导RNA上存在的直接重复序列(有时称为tracr-mate序列)互补(完全或部分)的tracrRNA(反式活化CRISPR RNA)。在特定实施方案中，CRISPR核酸酶可相对于相应的野生型酶进行突变，使得该酶缺乏切割靶标多核苷酸的一条链的能力，作为切口酶起作用，仅切割靶标DNA的一条链。作为切口酶起作用的CRISPR酶的非限制性实例包括在RuvcI催化结构域内具有D10A突变或具有H840A、N854A或N863A突变的Cas9酶。给定预定的DNA基因座，可使用本领域已知的许多程序(Kornel Labun；Tessa G.Montague；James A.Gagnon；Summer B.Thyme；Eivind Valen.(2016).CHOPCHOP v2:a web tool for the next generation of CRISPR genomeengineering.Nucleic Acids Research；doi:10.1093/nar/gkw398；Tessa G.Montague；Jose M.Cruz；James A.Gagnon；George M.Church；Eivind Valen.(2014).CHOPCHOP:aCRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.Nucleic Acids Res.42.W401-W407)。

如本文所用，术语“megaTAL”是指单链核酸内切酶，其包含具有工程化的、序列特异性归巢核酸内切酶的转录活化物样效应子(TALE)DNA结合结构域。

如本文所用，术语“TALEN”是指包含DNA结合结构域的核酸内切酶，所述DNA结合结构域包含与来自核酸内切酶或核酸外切酶的核酸酶结构域或其活性部分融合的多个TAL结构域重复，所述核酸内切酶或核酸外切酶包括但不限于限制性核酸内切酶、归巢核酸内切酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、微球菌核酸酶和酵母HO核酸内切酶。参见例如，Christian et al.(2010)Genetics 186:757-761，其全文通过引用并入本文。可用于TALEN设计的核酸酶结构域包括来自II型限制性内切核酸酶的结构域，包括但不限于FokI、FoM、StsI、HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI，和AlwI。另外的II型限制性内切核酸酶描述于国际公布号WO2007/014275中，其全文以引用方式并入。在一些实施方案中，TALEN的核酸酶结构域是FokI核酸酶结构域或其活性部分。TAL结构域重复可源自用于黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体感染过程的TALE(转录活化物样效应子)蛋白家族。TAL结构域重复是具有不同的第12和13位氨基酸的33-34个氨基酸序列。这两个位置，称为重复可变二肽(RVD)，是高度可变的，并显示与特定核苷酸识别的强相关性。DNA靶序列中的每个碱基对与RVD产生的具有的特异性的单个TAL重复序列接触。在一些实施方案中，TALEN包含16-22个TAL结构域重复。通过TALEN的DNA切割需要两个DNA识别区(即“半位点”)，位于非特异性中心区(即“间隔子”)的侧翼。关于TALEN的术语“间隔子”是指分隔由构成TALEN的每个单体识别和结合的两个核酸序列的核酸序列。TAL结构域重复序列可以是来自天然存在的TALE蛋白的天然序列，或者可通过合理的或实验的方法重新设计以产生与预定DNA序列结合的蛋白(参见，例如Boch et al.(2009)Science326(5959):1509-1512and MoscouandBogdanove(2009)Science 326(5959):1501，其每一个通过引用整体并入本文)。还参见美国公开号20110145940和国际公开号WO2010/079430的用于工程化TALEN以识别和结合特定序列的方法，以及RVD及其相应靶核苷酸的实例。在一些实施方案中，每种核酸酶(例如FokI)单体可与识别和结合不同DNA序列的TAL效应子序列融合，且只有当两个识别位点紧密接近时，无活性单体才会聚在一起产生功能酶。应理解，术语“TALEN”可指单个TALEN蛋白，或可选地，一对TALEN蛋白(即，左TALEN蛋白和右TALEN蛋白)，其与邻近TALEN间隔子序列的上游和下游半位点结合，并协同以在间隔子序列内产生切割位点。给定预定的DNA基因座或间隔子序列，可使用本领域已知的许多程序鉴定上游和下游半位点(Kornel Labun；Tessa G.Montague；James A.Gagnon；Summer B.Thyme；Eivind Valen.(2016).CHOPCHOPv2:a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.NucleicAcids Research；doi:10.1093/nar/gkw398；Tessa G.Montague；Jose M.Cruz；JamesA.Gagnon；George M.Church；Eivind Valen.(2014).CHOPCHOP:a CRISPR/Cas9 and TALENweb tool for genome editing.Nucleic Acids Res.42.W401-W407)。还应当理解，TALEN识别序列可被定义为单个TALEN蛋白的DNA结合序列(即，半位点)，或可选地，包含上游半位点、间隔子序列和下游半位点的DNA序列。

如本文所用，术语“锌指核酸酶”或“ZFN”是指包含与来自核酸内切酶或核酸外切酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域的嵌合蛋白，所述核酸内切酶或核酸外切酶包括但不限于限制性核酸内切酶、归巢核酸内切酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、微球菌核酸酶和酵母HO核酸内切酶。可用于锌指核酸酶设计的核酸酶结构域包括来自II型限制性内切核酸酶的结构域，包括但不限于FokI、FoM和StsI限制性内切酶。另外的II型限制性内切核酸酶描述于国际公布号WO2007/014275中，其全文以引用方式并入。锌指结构域的结构通过锌离子的配位而稳定。包含一个或多个锌指结构域的DNA结合蛋白以序列特异性方式结合DNA。锌指结构域可是天然序列，或者可通过合理的或实验的方式重新设计，以产生与长度约18个碱基对的预定DNA序列结合的蛋白质，其包含由2-10个碱基对分开的9个碱基对半位点对。参见，例如，美国专利号5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,200,759和国际公布号WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878，WO01/60970、WO01/88197和WO02/099084，其各自通过引用整体并入本文。通过将该工程化蛋白结构域与核酸酶结构域(诸如FokI核酸酶)融合，可以以基因组水平特异性靶向DNA断裂。用于锌指核酸酶设计和构建的靶位点，锌指蛋白的选择，和方法是本领域技术人员已知的，且详细描述于美国公开号20030232410、20050208489、2005064474、20050026157、20060188987和国际公开号WO07/014275中，其各自全文以引用方式并入本文。在锌指的情况下，DNA结合结构域典型地识别包含由2-10个碱基对“间隔子序列”分开的9个碱基对“半位点”对的18bp识别序列，且通过核酸酶的切割产生可变长度的平端或5’突出端(通常为4个碱基对)。应理解，术语“锌指核酸酶”可指单个锌指蛋白，或可选地，一对锌指蛋白(即，左ZFN蛋白和右ZFN蛋白)，其结合至与锌指核酸酶间隔子序列相邻的上游和下游半位点，并协同以在间隔子序列内产生切割位点。给定预定的DNA基因座或间隔子序列，上游和下游半位点可以使用本领域已知的许多程序进行识别(Mandell JG,Barbas CF 3rd.Zinc Finger Tools:customDNA-binding domains for transcription factors and nucleases.Nucleic AcidsRes.2006Jul 1；34(Web Server issue):W516-23)。还应当理解，锌指核酸酶识别序列可被定义为单个锌指核酸酶蛋白的DNA结合序列(即，半位点)，或可选地，包含上游半位点、间隔子序列和下游半位点的DNA序列。

如本文所用，术语“识别半位点”，“识别序列半位点”或简称为“半位点”是指双链DNA分子中被同型二聚体或异二聚体大范围核酸酶的单体或单链大范围核酸酶的一个亚基或单链大范围核酸酶的一个亚基或TALEN或锌指核酸酶的单体识别和结合的核酸序列。

如本文所用，术语“识别序列”或“识别位点”或“切割位点”或“切割序列”是指被核酸酶结合和切割的DNA序列。在大范围核酸酶的情况下，识别序列包含一对反向的9个碱基对“半位点”，其被4个碱基对分开。在单链大范围核酸酶的情况下，蛋白质的N端结构域接触第一半位点，蛋白质的C端结构域接触第二半位点。大范围核酸酶切割产生四个碱基对3’突出端。“突出端”或“粘性末端”是短的单链DNA片段，其可通过对双链DNA序列进行核酸内切酶切割而产生。在来源于I-CreI的大范围核酸酶和单链大范围核酸酶的情况下，突出端包含22个碱基对识别序列的10-13碱基。在紧凑TALEN的情况下，识别序列包含被I-TevI结构域识别的第一CNNNGN序列，随后是长度为4-16个碱基对的非特异性间隔子，接着是被TAL效应子结构域识别的长度为16-22bp的第二序列(该序列典型地具有5’T碱基)。通过紧凑TALEN切割产生两个碱基对3’突出端。在CRISPR核酸酶的情况下，识别序列是向导RNA结合以直接切割的序列，典型地为16-24个碱基对。切割未必需要向导序列和识别序列之间的完全互补性来实现。通过CRISPR核酸酶的切割可产生平端(诸如2类，II型CRISPR核酸酶)或突出端(诸如2类，V型CRISPR核酸酶)，取决于CRISPR核酸酶。在使用CpfI或Cas12a CRISPR核酸酶的那些实施方案中，由包含其的CRISPR复合物进行的切割将产生5’突出端，且在某些实施方案中产生5-核苷酸5’突出端。每种CRISPR核酸酶还需要识别靠近与向导RNA互补的识别序列的PAM(原间隔子相邻基序)序列。PAM的精确序列，长度要求以及与靶序列的距离根据CRISPR核酸酶而不同，但是PAM典型地是与靶标/识别序列相邻的2-5个碱基对序列。用于特定CRISPR核酸酶的PAM序列是本领域已知的(参见，例如，美国专利号8,697,359和美国公开号20160208243，其各自通过引用以其全文并入)，且用于新的或工程化的CRISPR核酸酶的PAM序列可使用本领域已知的方法来鉴定，诸如PAM损耗测定(参见，例如，Karvelis etal.(2017)Methods 121-122:3-8，其以全文引用的方式并入本文中)。在锌指的情况下，DNA结合结构域典型地识别包含由2-10个碱基对分开的一对9个碱基对“半位点”的18bp识别序列，且核酸酶的切割产生可变长度的平端或5’突出端(通常为4个碱基对)。

如本文所用，术语“靶标位点”或“靶标序列”是指包含核酸酶识别序列的细胞染色体DNA的区域。

应当理解，为清楚起见，在单独实施方案的上下文中所述的本公开的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本公开的各种特征也可单独地提供，或在任何合适的亚组合中提供，或在任何其他描述的实施方案中合适地提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有那些元件的情况下不起作用。

2.1本发明的原理

如果可产生足够量的化合物，则在葫芦科植物罗汉果(Siraitia grosvenorii)(Luo Han Guo或monk fruit)的果实中天然发现的罗汉果苷可以是精制糖的低热量替代品。然而，在植物中，由于这些植物在其天然生境外生长的困难，由罗汉果生产罗汉果苷是不可扩植的。因此，需要在广泛适应的植物系统中生产罗汉果苷。

本文描述了用于在植物中产生罗汉果苷的方法，所述植物可用可靠的农艺实践，稳定的生产力历史和一致的下游处理和加工实践来栽培。因此，本文所述的方法解决了产业中对于罗汉果苷的可规模化，天然和经济的生产系统的未满足的需要。本文还描述了经基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的植物，与对照植物相比，其产生一种或多种罗汉果苷的水平增加。此外，本文提供了植物部分(例如，汁液、果肉、种子、果实、花、花蜜、胚、花粉、胚珠、叶、茎、枝、树皮、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等)，植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)，植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)，植物生物质(例如，干燥的生物质，诸如粉碎的和/或粉末状的生物质)，来自此类基因修饰的植物的提取物(例如，甜味剂)，以及产生此类基因修饰的植物或此类植物的后代的方法。在一些实施方案中，来自此类植物的提取物(例如，甜味剂)，植物部分(例如，汁液、果肉、种子、果实、花、胚、花粉、胚珠、叶、枝、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等)，植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)，植物生物质(例如，干燥的生物质，诸如粉碎的和/或粉末状的生物质)，和/或植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)具有增加水平的罗汉果苷。在某些情况下，本文所述的植物是葫芦科植物，诸如易于用可靠的农艺实践栽培的葫芦科植物。因此，本文所述的组合物和方法利用了罗汉果和另一种易于栽培的葫芦科植物之间的基因相似性，以在后者中重新活化天然罗汉果苷合成途径，从而确保罗汉果苷的天然的、可扩展的且经济的生产系统。本文所述的组合物和方法通过调控至少一种内源罗汉果苷合成途径基因的表达来增加罗汉果苷的产量。

在一些实施方案中，本文所述的罗汉果苷是罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧化罗汉果苷IIE、11-氧化罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧化罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧化罗汉果苷V、11-氧化罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII中的一种或多种。在具体实施方案中，本文所述的罗汉果苷是罗汉果苷、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷IIE、罗汉果苷V、罗汉果苷VI和/或罗汉果苷VII。在某些实施方案中，本文所述的罗汉果苷是罗汉果苷V。

2.2葫芦科植物

在一些实施方案中，本文描述了用于在葫芦科植物中产生罗汉果苷的方法。葫芦科，也称为葫芦科(cucurbit family)或葫芦科(gourd family)，是生长在热带和温带地区的植物科，其中具有可食用果实的葫芦科植物是最早栽培的植物之一。葫芦科在用作人类食物的物种的数量和百分比方面在植物家族中排名最高。根据美国农业部的植物数据库，葫芦科包含34个属和127个公认的分类群。葫芦科中的属包括以下：芹菜属(GenusApodanthera Arn.-apodanthera)；冬瓜属(Benincasa Savi-benincasa)；Brandegea属(Brandegea Cogn.-starvine)；泻根属(Bryonia L.-bryony)；泻瓜属(Cayaponia SilvaManso-melonleaf)；西瓜属(Citrullus Schrad.-watermelon)；红瓜属(Coccinia Wight&Arn.–coccinia)；睫苞瓜属(Ctenolepis Benth.&Hook.f.-ctenolepis)；白子瓜属(Cucumeropsis Naudin-cucumeropsis)；黄瓜属(Cucumis L.-melon)；葫芦属-葫芦(Cucurbita L.-gourd)；小雀瓜属(Cyclanthera Schrad.-cyclanthera)；道耶瓜属(Doyerea Gros.-doyeria)；喷瓜属(Ecballium A.Rich.-squirting cucumber)；刺囊属(Echinocystis Torr.&A.Gray-echinocystis)；香脂瓜属(Echinopepon Naud.-balsamapple)；化毒藤属(Fevillea L.-fevillea)；油渣果属(Hodgsonia Hook.f.&Thomson-hodgsonia)；笑布袋属(Ibervillea Greene-globeberry)；葫芦属(Lagenaria Ser.-lagenaria)；丝瓜属(Luffa Mill.-luffa)；苦蓬壶属(Marah Kellogg-manroot)；马交儿属(Melothria L.-melothria)；苦瓜属(Momordica L.-momordica)；小蝶瓜属(PsiguriaNeck.ex Arn.-pygmymelon)；佛手瓜属(Sechium P.Br.-sechium)；麝香瓜属(SicanaNaud.-sicana)；刺黄瓜属(Sicyos L.-bur cucumber)；箭叶瓜属(Sicyosperma A.Gray-sicyosperma)；牡蛎瓜属(Telfairia Hook.-telfairia)；赤瓟属(Thladiantha Bunge-thladiantha)；栝楼属(Trichosanthes L.-trichosanthes)；Tumamoca属(Tumamoca Rose-tumamoca)；和马瓟儿属(Zehneria Endl)。

在某些实施方案中，本公开所述的葫芦科植物是西瓜植物(例如，西瓜(Citrulluslanatus))或黄瓜植物(例如，黄瓜(Cucumis sativus))。例如，本文公开的方法可用于在西瓜或黄瓜中产生罗汉果苷。在具体实施方案中，本公开所述的葫芦科植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。例如，本文公开的方法可用于在查尔斯顿灰品种西瓜植物中生产罗汉果苷。

在一些实施方案中，本文所述的方法可通过基因修饰细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达来增加植物(例如葫芦科植物)和植物部分中产生的罗汉果苷的水平。在某些实施方案中，与对照植物或植物部分相比，本公开的方法可增加植物(例如葫芦科植物)和植物部分中产生的罗汉果苷的水平约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。另外地或可选地，与对照植物或植物部分相比，本公开的方法可将植物和植物部分中产生的罗汉果苷的水平增加至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在特定的实施方案中，本文所述的方法可增加细胞中产生的罗汉果苷的水平，所述细胞诸如植物的细胞(例如葫芦科植物的细胞)或植物部分。在具体实施方案中，本文所述的方法可通过调控罗汉果苷合成途径(例如，通过调控植物基因组中一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达)的一种或多种基因(例如，内源基因)的表达来增加植物或植物部分(诸如植物或植物部分的细胞)中至少一种罗汉果苷的水平。

在一些实施方案中，本文所述的植物，植物部分(例如种子、果实、汁液、果肉等)，植物提取物(例如甜味剂)，植物浓缩物，植物粉末和/或植物生物质中的一种或多种罗汉果苷的量或水平可通过本领域已知的一种或多种标准方法来确定。在某些实施方案中，本文所述的植物，植物部分，植物提取物，植物浓缩物，植物粉末和/或植物生物质中的一种或多种罗汉果苷的量或水平可通过核磁共振波谱法确定，其也被称为NMR波谱法或磁共振波谱法(MRS)。在另外的或替代的实施方案中，本文所述的植物，植物部分，植物提取物，植物浓缩物，植物粉末和/或植物生物质中的一种或多种罗汉果苷的量或水平可通过紫外(UV)吸收光谱或荧光光谱来确定。参见，例如，Itkin et al.(Proc Natl Acad Sci 113:E7619-E7628(2016))。

本文还描述了植物(例如，葫芦科植物)或植物部分，其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，使得至少一种罗汉果苷的水平增加。在一些实施方案中，与对照植物或植物部分相比，本公开的植物和植物部分(例如葫芦科植物，诸如西瓜或黄瓜植物)中产生的罗汉果苷的水平可增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。另外地或可选地，与对照植物或植物部分相比，在本公开的植物或植物部分中产生的罗汉果苷的水平可增加至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在某些实施方案中，具有增加水平的至少一种罗汉果苷的植物具有一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的调控(例如，增加或降低)。例如，具有增加水平的至少一种罗汉果苷的植物可具有增加的一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。特别地，本文描述了植物和植物部分，其中植物细胞或植物部分或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，使得植物具有增加水平的至少一种罗汉果苷。

本文还描述了产生上文所述植物的方法，诸如具有增加水平的至少一种罗汉果苷的植物。在某些实施方案中，所述方法涉及基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达(例如，调控植物基因组中一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达)，以及从那些植物细胞或植物部分种植植物。在特定的实施方案中，所述方法包括基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达，并从这些植物细胞或植物部分种植植物，从而产生具有增加水平的罗汉果苷的植物。

在一些实施方案中，本文公开的植物或植物部分的基因组被基因修饰以调控(例如，增加或降低)罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与对照植物或对照植物部分(例如，未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物或植物部分)相比，植物或植物部分的基因组经基因修饰以调控本文公开的植物或植物部分中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在特定的实施方案中，与来自对照植物的植物部分相比，本文公开的植物的植物部分中，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。

内源罗汉果苷合成途径基因的表达可通过本领域用于测量基因表达的任何手段来测量。在一些实施方案中，可通过测量mRNA、蛋白质或任何其他基因表达产物的总量来测量表达。例如，基因表达可通过核酸分析方法(诸如PCR或RT-PCR)测量，或可通过蛋白质检测方法(诸如Western blot)分析测量。

本公开还描述了来自上文公开的植物(例如葫芦科植物，诸如植物或黄瓜)的提取物(例如甜味剂、抗氧化剂、生物碱等)，诸如植物，其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。在一些实施方案中，来自植物的提取物是甜味剂。例如，本公开可描述来自上文公开的植物的甜味剂，诸如具有调控的一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在一些实施方案中，相对于来自对照植物的提取物的甜度指数，本文公开的植物的甜味剂具有高甜度指数。本文公开的植物的甜味剂的甜度指数可相对于蔗糖来测量。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较甜味剂的阈值与蔗糖的阈值来测量。甜味剂或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该甜味剂或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度甜味剂的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的甜味剂(例如，本文公开的植物的甜味剂)或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中甜味剂或蔗糖的存在。甜味剂(例如，本文公开的植物的甜味剂)或蔗糖的浓度可被认为是甜味剂或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后，可将甜味剂(例如，本文公开的植物的甜味剂)的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定甜味剂相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，本文公开的植物的甜味剂具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。例如，与蔗糖相比，本文公开的植物的甜味剂可具有约50-1000X或更高，或约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X或更高(例如，约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高)的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的提取物相比，来自经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的甜味剂的甜度可增加至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。例如，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的提取物相比，来自经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物或植物部分的基因组的植物的甜味剂可具有约20-1000％，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更高，或约20％、25％、30％、35％、50％、400％、800％、825％、850％、850％、875％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、950％、975％、1000％或更高的甜度增加。

另外地或可选地，本文公开的植物的甜味剂可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的升糖指数(GI)，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的甜味剂的GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的甜味剂的GI是通过摄入该甜味剂两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的甜味剂的GI可基于12小时禁食和摄取甜味剂与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。甜味剂的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得甜味剂的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

本公开还描述了来自上文公开的植物的植物部分(例如叶、茎、根、树皮、花、果实、种子、果肉、汁液、花蜜、胚、花粉、胚珠、枝、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根尖、花药等)，包括其中植物细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。本文涵盖的植物部分可是增殖植物部分，包括但不限于种子，或非增殖植物部分，包括汁液、果肉、果实、花、花蜜、叶、茎、枝、树皮、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖等。

在一些实施方案中，本文公开的植物的植物部分(例如，通过本文公开的方法基因修饰细胞或植物部分的基因组以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)具有增加量的至少一种罗汉果苷。在某些实施方案中，与对照植物的植物部分中罗汉果苷的水平相比，本文公开的植物的植物部分的至少一种罗汉果苷水平的增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多的罗汉果苷。

在一些实施方案中，本文公开的植物部分具有高甜度指数。在某些情况下，本文公开的植物部分的甜度指数是相对于蔗糖测量的。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较植物部分的阈值与蔗糖的阈值来测量。植物部分或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该植物部分或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度植物部分的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的植物部分或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中植物部分或蔗糖的存在。植物部分或蔗糖的浓度可被认为是植物部分或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后可将植物部分的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定植物部分相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，本文公开的植物的植物部分具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，本文公开的植物的植物部分(例如汁液、果肉、种子、果实、花、花蜜、胚、花粉、胚珠、叶、茎、枝、树皮、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等)可具有约50-1000X、约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X、或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物部分相比，来自细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物部分可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物部分相比，其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物部分(例如，汁液、果肉、种子、果实、花、花蜜、胚、花粉、胚珠、叶、茎、枝、树皮、果仁、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等)可具有约20-1000％或更多(例如，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多))的甜度增加。

本文公开的植物的植物部分可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的升糖指数(GI)，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，本文公开的植物的植物部分GI为0。在某些实施方案中，本文所述的植物的植物部分的GI是通过摄入该植物部分两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的植物部分的GI可基于12小时禁食和摄取植物部分与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。植物部分的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得植物部分的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，植物部分是种子(例如，来自植物果实的种子)。例如，本公开可描述来自上文公开的植物的种子，诸如其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在一些实施方案中，本文公开的植物种子具有调控的罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与对照植物中种子相比，本文公开的植物种子中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达被调控约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。在特定的实施方案中，与对照植物中种子相比，本文公开的植物种子中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

在一些实施方案中，植物部分是汁液(例如，来自植物果实的汁液，来自植物叶片的汁液等)。例如，本公开可描述来自上文公开的植物的汁液，包括其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在一些实施方案中，来自本文公开的植物的汁液具有增加量的至少一种罗汉果苷。在某些实施方案中，与对照植物的汁液中罗汉果苷的水平相比，来自本文公开的植物的汁液中至少一种罗汉果苷的水平增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多罗汉果苷。在一些实施方案中，来自本文公开的植物的汁液具有高甜度指数。在某些情况下，相对于蔗糖，测量本文公开的植物的汁液的甜度指数。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过将果汁的阈值与本文别处公开的蔗糖的阈值进行比较来测量。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，来自本文公开的植物(例如，其中植物细胞或植物部分的基因组被通过本文公开的方法基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的汁液具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，来自本文公开的植物的汁液可具有约50-1000X，约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X，或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的汁液相比，来自其中细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的汁液(例如，来自植物果实的汁液，来自植物叶片的汁液等)，可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的汁液相比，其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的汁液可具有约20-1000％或更多，或约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多，或约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。

另外地或可选地，来自本文公开的植物的植物汁液可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的GI，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的植物汁液的GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的植物汁液的GI是通过摄入该植物汁液两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的植物汁液的GI可基于12小时禁食和摄取植物汁液与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。汁液的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得植物汁液的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，植物部分是果肉(例如，来自植物果实的果肉，来自植物茎的果肉等)。例如，本公开可描述来自上文公开的植物的果肉，诸如其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在一些实施方案中，来自本文公开的植物的果肉具有增加量的至少一种罗汉果苷。在某些实施方案中，与对照植物的果肉中罗汉果苷的水平相比，来自本文公开的植物的果肉的至少一种罗汉果苷水平增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多的罗汉果苷。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的果肉具有高甜度指数。在某些情况下，来自本文公开的植物的果肉的甜度指数是相对于蔗糖测量的。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较果肉的阈值与蔗糖的阈值来测量。果肉或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该果肉或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度果肉的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的果肉或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中果肉或蔗糖的存在。果肉或蔗糖的浓度可被认为是果肉或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后，可将果肉的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定果肉相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，来自本文公开的植物的果肉(例如，来自植物的果实的果肉，来自植物的茎的果肉等)具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，本文公开的植物的果肉可具有约50-1000X，约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X，或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的果肉相比，来自其中细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的果肉可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的果肉相比，来自其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的果肉(例如，植物果实的果肉，植物茎的果肉等)可具有约20-1000％，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。

另外地或可选地，本文公开的植物的果肉可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的GI，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的果肉的GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的果肉的GI是通过摄入该果肉两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的果肉的GI可基于12小时禁食和摄取果肉与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。果肉的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得果肉的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的果肉具有调控的罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与对照植物的果肉相比，在本文公开的植物的果肉中，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因表达被调控约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在特定的实施方案中，与来自对照植物(例如，没有修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的果肉相比，本文公开的植物的果肉中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。

本公开还描述了上文公开的植物的生物质，诸如其中植物细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在某些实施方案中，本文所述的植物生物质可以是干燥的生物质(例如，通过包括但不限于冷冻干燥、干燥和/或喷雾干燥的方法干燥的生物质)。在特定的实施方案中，可将干燥的生物质粉碎和/或粉末化以形成粉碎的和/或粉末状的生物质。在一些实施方案中，来自本文公开的植物的生物质(例如，干燥的生物质，诸如粉碎的和/或粉末状的植物生物质)具有增加的量的至少一种罗汉果苷。在某些实施方案中，与对照植物(没有修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的生物质中罗汉果苷的水平相比，来自本文公开的植物的生物质的至少一种罗汉果苷水平增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90％-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的罗汉果苷。

在一些实施方案中，如通过本文别处公开的方法测量的，来自本文公开的植物的生物质具有高甜度指数。在某些情况下，来自本文公开的植物的生物质的甜度指数是相对于蔗糖测量的。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较生物质的阈值与蔗糖的阈值来测量。生物质或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该生物质或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度生物质的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的生物质或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中生物质或蔗糖的存在。生物质或蔗糖的浓度可被认为是生物质或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后，可将生物质的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定生物质相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，来自本文公开的植物的生物质具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，本文公开的植物的生物质可具有约50-1000X，约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X，或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的生物质相比，来自其中细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的生物质可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的生物质相比，来自其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的生物质(例如，干燥的生物质，诸如植物的粉碎的和/或粉末状的生物质)可具有约20-1000％或更多(例如，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或更多(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多))的甜度增加。

另外地或可选地，来自本文公开的植物的生物质可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的升糖指数(GI)，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的生物质的GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的生物质的GI是通过摄入该生物质两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的生物质的GI可基于12小时禁食和摄取生物质与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。生物质的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得生物质的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的生物质具有调控的罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与对照植物的生物质相比，本文公开的植物的生物质中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达被调控约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。在特定的实施方案中，与对照植物的生物质相比，本文公开的植物的生物质中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

本公开还描述了来自上文公开的植物(例如葫芦科植物，诸如西瓜植物或黄瓜植物)的浓缩物，诸如其中植物细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物。在一些实施方案中，本文公开的植物浓缩物可以是通过使整株植物经本领域已知的一种或多种机械方法获得的整株植物的浓缩物，所述机械方法包括但不限于压缩、干燥筛分、粉碎(例如，干燥后粉碎)、研磨(例如，干燥后研磨)和/或共混(例如，干燥后共混)。另外地或可选地，本文公开的植物浓缩物可以是通过将一个或多个植物部分经本领域已知的一种或多种机械方法获得的植物部分浓缩物，所述机械方法包括但不限于压缩、干法过筛、压碎、研磨和/或共混。在某些实施方案中，来自植物的植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)是一种或多种罗汉果苷。在其他实施方案中，来自植物的植物浓缩物包含一种或多种罗汉果苷。在一些实施方案中，来自本文公开的植物的植物浓缩物具有增加量的至少一种罗汉果苷。在某些实施方案中，与对照植物的植物浓缩物中罗汉果苷的水平相比，来自本文公开植物的植物至少一种罗汉果苷水平增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多的罗汉果苷。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)具有高甜度指数。在某些情况下，本文公开的植物的生物质的甜度指数是相对于蔗糖测量的。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较植物浓缩物的阈值与蔗糖的阈值来测量。植物浓缩物或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该植物浓缩物或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度植物浓缩物的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的植物浓缩物或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中植物浓缩物或蔗糖的存在。植物浓缩物或蔗糖的浓度可被认为是植物浓缩物或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后，可将植物浓缩物的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定植物浓缩物相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，来自本文公开的植物(例如，其中细胞或植物部分的基因组通过本文公开的方法基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，来自本文公开的植物的植物浓缩物可具有约50-1000X，约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X，或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物浓缩物相比，来自细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物浓缩物可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物浓缩物相比，来自其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物浓缩物可具有约20-1000％或更多(例如，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或更多(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多))的甜度增加。

另外地或可选地，来自本文公开的植物的植物浓缩物可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的GI，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的植物浓缩物GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的植物浓缩物的GI是通过摄入该植物浓缩物两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的植物浓缩物的GI可基于12小时禁食和摄取植物浓缩物与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。浓缩物的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得植物浓缩物的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)具有调控(例如，增加或降低)的罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与对照植物的植物浓缩物相比，来自本文公开的植物的植物浓缩物中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达被调控约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。在特定的实施方案中，与对照植物(例如，没有修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的植物浓缩物相比，本文公开的植物的植物浓缩物中罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

本公开还描述了来自上文公开的植物的粉末，诸如其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达的植物。在一些实施方案中，本文公开的植物粉末可以是配制的粉末。特别地，本文公开的配制的植物粉末可以是通过干燥(例如，通过包括但不限于冷冻干燥、干燥和/或喷雾干燥的方法干燥)、压碎、研磨和/或共混植物部分(例如，上文所述的一种或多种植物部分)获得的配制的植物部分粉末。在某些实施方案中，来自植物的植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)是一种或多种罗汉果苷。在其他实施方案中，来自植物的植物粉末包含一种或多种罗汉果苷。在特定的实施方案中，来自本文公开的植物的植物粉末具有增加量的至少一种罗汉果苷。例如，与对照植物的植物粉末中罗汉果苷的水平相比，本文公开的植物的植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)的至少一种罗汉果苷水平可增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的罗汉果苷。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的植物粉末具有高甜度指数。在某些情况下，来自本文公开的植物的植物粉末的甜度指数是相对于蔗糖测量的。特别地，相对于蔗糖的甜度指数可通过比较植物粉末的阈值与蔗糖的阈值来测量。植物粉末或蔗糖的阈值可通过测试其浓度来确定，在该浓度下，一组经训练的品尝者小组中有一半人可检测到该植物粉末或蔗糖在水中的存在。例如，研究人员可向小组的每个参与者提供已加入不同程度植物粉末的水样品。首先，可给予品尝者清水，然后给予具有增加浓度的植物粉末或蔗糖的水样品，直到品尝者检测(例如，品尝)出水样品中植物粉末或蔗糖的存在。植物粉末或蔗糖的浓度可被认为是植物粉末或蔗糖的阈值，在该浓度下，品尝者小组的一半可检测水样品的变化(例如，水样品味道的变化)。然后，可将植物粉末的阈值与蔗糖的阈值进行比较以确定植物粉末相对于蔗糖的甜度指数。

在一些实施方案中，与蔗糖相比，来自本文公开的植物(例如，其中植物细胞或植物部分的基因组通过本文公开的方法基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)的植物粉末具有至少50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X的甜度指数。例如，与蔗糖相比，来自本文公开的植物的植物粉末可具有约50-1000X，约50-300X、200-450X、350-600X、500-750X、750-1000X，或约50X、100X、150X、200X、250X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X或更高的甜度指数。

或者，与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物粉末相比，来自其中细胞或植物部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物粉末可具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的甜度增加。例如，其中与来自未经修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的对照植物的植物粉末相比，来自其中植物细胞或部分的基因组经基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物的植物粉末可具有约20-1000％或更多(例如，约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或更多(例如，约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多))的甜度增加。

来自本文公开的植物(例如，其中植物细胞或植物部分的基因组被基因修饰以通过本文公开的方法调控内源罗汉果苷合成途径基因的表达的植物)的植物粉末可具有约10或更低(例如，约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更低)的GI，诸如约5或更低(例如，约5、4、3、2、1或更低)的GI。特别地，来自本文公开的植物的植物粉末GI为0。在某些实施方案中，来自本文所述的植物的植物粉末的GI是通过摄入该植物粉末两小时后血糖水平的相对上升来测量的。例如，来自本文所述植物的植物粉末的GI可基于12小时禁食和摄取植物粉末与一定量的可用碳水化合物(例如，约50g)后2小时血糖反应曲线(AUC)下的增量面积来测量。植物粉末的AUC可除以标准品(例如葡萄糖或白面包)的AUC并乘以100以获得植物粉末的GI值。平均GI值可从在10名人类受试者收集的数据计算。

在一些实施方案中，来自本文公开的植物的植物粉末具有调控的罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达。在某些实施方案中，与来自对照植物的植物粉末相比，在来自本文公开的植物的植物粉末中，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达被调控约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在特定的实施方案中，与来自对照植物的植物粉末相比，在来自本文公开的植物的植物粉末中，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

2.3.调控内源罗汉果苷合成途径基因的表达

本文描述了用于基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因表达以增加细胞或植物部分中至少一种罗汉果苷的水平的方法。在本公开的一些实施方案中，与对照植物(例如，没有修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物)相比，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达被调控(例如，增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多。在特定的实施方案中，与对照植物相比，罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达增加约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

罗汉果苷源自三萜类化合物的葫芦烷骨架，数百种可能的环状三萜类化合物骨架之一(Xu et al.,Phytochemistry 65:261-291(2004)；Thimmappa et al.,Annu RevPlant Biol 65:225-257(2014))，其在整个葫芦科家族中普遍存在。强烈苦味的葫芦素是相同骨架的衍生物，但与强烈甜味的罗汉果苷的区别主要在于葫芦烷骨架上的氧化修饰。鉴于罗汉果苷在C3、C11、C24和C25的四种区域特异性氧化，形成四羟基化的葫芦烷，罗汉果醇，罗汉果苷在葫芦烷三萜中是独特的(Itkin et al.,Proc Natl Acad Sci 113:E7619-E7628(2016))。

罗汉果苷合成途径可分为上游和下游途径(IShi et al.,Molecules 24:4076(2019))。6个酶家族在上游途径中起关键作用；乙酰辅酶A经由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、角鲨烯合酶(SQS)、角鲨烯环氧酶(SQE)、葫芦二烯醇合酶(CDS)、环氧化物水解酶(EPH)和细胞色素P450(CYP450)的催化转化为罗汉果醇(Tang et al.,BMC Genom 12:343(2011))。角鲨烯是2,3-氧化角鲨烯的前体，2,3-氧化角鲨烯可在CDS催化下转化成为葫芦二烯醇(cucurbitadienol)。葫芦二烯醇作为关键的三萜系化合物骨架，可转化为一系列的罗汉果苷。环阿屯醇是几乎所有植物甾族化合物的合成起点，其与罗汉果中的葫芦二烯醇生物合成竞争底物2,3-氧化角鲨烯。在罗汉果苷生物合成途径的下游部分，通过UDP-糖基转移酶(UGT)将罗汉果苷转化为不同等级的罗汉果苷。总之，24个结构基因被认为参与罗汉果苷合成途径(Xia et al.,Gigascience 7:1-9(2018)；美国专利申请公开号US 2017/0283844A1)。图1提供了罗汉果苷合成途径的概要示意图。

(A)罗汉果苷合成途径基因

在本公开的一些实施方案中，所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自：编码葫芦二烯醇合酶(CDS；也称为(S)-2,3-环氧角鲨烯变位酶(环化，形成葫芦二烯醇)；系统名称：(S)-2,3-环氧-2,3-二氢角鲨烯变位酶(环化，形成葫芦二烯醇))的基因(SEQ IDNO:15)或编码与其具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因；编码细胞色素P450酶87D18的基因(CYP87D18；也称为葫芦二烯醇11-羟化酶)(SEQ ID NO:16)或编码与其具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因；编码环氧化物水解酶3(EPH3；也称为ABHD9、EH3或EPHX3)的基因)(SEQ ID NO:17)或编码与其具有至少75％(例如、至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因；编码角鲨烯环氧酶1的基因(SQE1；也称为角鲨烯单加氧酶)(SEQ ID NO:18)或编码与其具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因；编码UDP糖基转移酶720的基因(UGT720)(SEQ ID NO:19)或编码与其具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因；和/或编码UDP糖基转移酶94的基因(UGT94)(SEQ ID NO:20)或编码与其具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽序列的基因。在具体的实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因是内源罗汉果苷合成途径基因。

所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因可以是编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE1、UGT720和/或UGT94基因的同源物。例如，一种或多种内源性罗汉果苷合成途径基因可选自：编码CDS基因的一种或多种同源物；编码CYP87D18基因的一种或多种同源物；编码EPH3基因的一种或多种同源物；编码SQE1基因的一种或多种同源物；编码UGT720基因的一种或多种同源物；和/或编码UGT94基因的一种或多种同源物。在特定实施方案中，所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因。

在本公开的一些实施方案中，编码CDS(SEQ ID NO:15)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

CYP87D18在罗汉果苷合成途径中作为多功能葫芦二烯醇氧化酶(Zhang et al,Plant cell physiol 57:1000-1007(2016))。在一些实施方案中，编码CYP87D18(SEQ IDNO:16)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。例如，CYP87D18的变体可在单个氨基酸位置上区别与SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在具体的实施方案中，CYP87D18的变体或同源物是SEQ IDNO:21中所示的CYP102801。

编码EPH3(SEQ ID NO:17)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码SQE1(SEQ ID NO:18)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码UGT720(SEQ ID NO:19)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如，增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码UGT94(SEQ ID NO:20)的基因或编码与其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列具有至少75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

编码与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％序列同一性的多肽序列的基因的表达可被调控(例如增加或降低)约1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％，或调控约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％，或更多。

(B)用于调控罗汉果苷合成途径基因的方法

本文还公开了用于基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控(例如，增加或降低)一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达以增加细胞或植物部分中的罗汉果苷水平的方法。在本公开的一些实施方案中，植物细胞或植物部分的基因组通过一种或多种以下方法基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

(i)启动子序列的修饰

在本公开的一些实施方案中，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达涵盖相应基因的启动子序列的修饰(例如，活化或失活)。例如，为调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，植物细胞或植物部分的基因组可通过活化相应基因的启动子序列进行基因修饰。在特定的实施方案中，罗汉果苷合成途径基因的启动子序列没有活性或表现出降低的活性。通过增加启动子序列的活性，可调控可操作地连接到启动子的基因的表达以增加罗汉果苷的水平。

在某些实施方案中，通过插入一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、53、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个)核苷酸来修饰所述基因(例如，内源基因)的启动子序列。例如，通过插入一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、39、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个)核苷酸可增强、改善或增加所述基因(例如，内源基因)的启动子序列的活性。另外地或可选地，通过缺失一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个)核苷酸可修饰所述基因(例如内源基因)的启动子序列。例如，通过缺失一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、53、59、60、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个)核苷酸可增强、改善，或增加所述基因(例如内源基因)的启动子序列的活性。

在某些实施方案中，内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列通过用一个或多个取代物对启动子序列的替换而被修饰。特别地，所述取代可以是顺式基因取代物。例如，基因的启动子序列可通过用一个或多个顺式基因取代物替换启动子序列来修饰。或者，取代物可是转基因取代物。例如，内源基因的启动子序列可通过用一个或多个转基因取代物替换启动子序列来修饰。

在某些实施方案中，通过启动子序列的校正来修饰内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。启动子序列可通过一个或多个多态性或突变的缺失、修饰和/或校正来校正，否则这些多态性或突变将限制启动子序列的活性。特别地，内源基因的启动子序列可通过以下方式修饰：(i)检测限制启动子序列活性的一个或多个多态性或突变；和(ii)通过多态性或突变的缺失、修饰和/或校正校正启动子序列。

在某些实施方案中，内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列通过一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、53、59、60、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个)上游核苷酸序列的插入、缺失，和/或修饰来修饰所述内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。特别地，所述内源基因的启动子序列的活性可通过一个或多个上游核苷酸序列的插入、缺失和/或修饰来增强、改善和/或增加。

在某些实施方案中，通过添加、插入和/或工程化顺式作用因子来修饰内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。例如，可通过添加、插入和/或工程化与启动子序列相互作用并修饰启动子序列的顺式作用因子来增强、改善和/或增加内源基因的启动子序列的活性。

在一些实施方案中，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控(例如，增加或降低)一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达涵盖一种或多种转录因子基因表达的调控(例如，增加或降低)。例如，为增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，可通过一种或多种转录因子基因表达的调控(例如，增加或降低)来基因修饰植物细胞或植物部分的基因组。在某些实施方案中，调控一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。在所述方法的具体实施方案中，一种或多种转录因子基因表达的调控增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在一些实施方案中，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的调控涵盖转录因子结合位点或增强子元件的插入、修饰和/或工程化。在某些实施方案中，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的调控涵盖新的转录因子结合位点或增强子元件的插入。或者，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的调控可涵盖现有的转录因子结合位点或增强子元件的修饰和/或工程化。

(ii)负调控序列的修饰

在本公开的一些实施方案中，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控(例如，增加或降低)一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达涵盖所述基因的一种或多种负调控序列的修饰(例如，插入或缺失，诸如部分或全部的插入或缺失)。例如，为增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，植物细胞或植物部分的基因组可通过修饰基因的一种或多种负调控序列进行基因修饰。在某些实施方案中，基因的负调控序列位于顺式位置。或者，基因的负调控序列可位于反式位置。在特定的实施方案中，负调控序列包括上游开放阅读框(uORF)。例如，为调控罗汉果苷合成途径基因的表达，可缺失内源罗汉果苷合成途径基因上游区域或罗汉果苷合成途径基因内源启动子上游区域。在一些实施方案中，待修饰或缺失的内源罗汉果苷合成途径基因或启动子上游区域长度为至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个核苷酸，或长度为至少1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750或750-1000个核苷酸。此外，待修饰或缺失的内源罗汉果苷合成途径基因或启动子上游区域可以是基因或启动子上游的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个核苷酸，或基因或启动子上游的约1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750或750-1000个核苷酸。

(iii)功能性启动子的插入

在一些情况下，基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达涵盖将一种或多种功能性启动子插入至所述细胞或植物部分的基因组中，其中在插入后，所述功能性启动子与相应的内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。例如，为调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，植物细胞或植物部分的基因组可通过将一种或多种功能性启动子插入到细胞或植物部分的基因组中进行基因修饰，其中在插入后，功能性启动子与相应基因可操作地连接。在某些实施方案中，一种或多种功能性启动子是同源启动子。例如，为调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，植物细胞或植物部分的基因组可通过将一种或多种同源或顺式基因启动子插入细胞或植物部分的基因组中进行基因修饰，其中在插入后，同源或顺式基因启动子与一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。在其他实施方案中，一种或多种功能性启动子是异源启动子。例如，为调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，植物细胞或植物部分的基因组可通过将一种或多种异源启动子插入至细胞或植物部分的基因组中进行基因修饰，其中在插入后，异源启动子与一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。

(C)表达构建体

本文还描述了可用于调控本文公开的植物中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的表达构建体。在一些实施方案中，表达构建体含有与一个或多个罗汉果苷合成途径基因可操作连接的顺式作用调控元件。在某些实施方案中，顺式作用调控元件指导和/或调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。例如，表达构建体可含有与一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作连接的顺式作用调控元件，其中顺式作用调控元件可调控细胞中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。在具体实施方案中，顺式作用调控元件是启动子。在特定的实施方案中，表达构建体可含有与一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接的启动子序列，其中所述启动子序列可调控细胞中一种或多种罗汉果苷合成途径基因(例如，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因)的表达以增加细胞中罗汉果苷的水平。在某些情况下，表达构建体可含有与一种或多种罗汉果苷合成途径基因(例如，一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因)可操作地连接的木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子，其中所述启动子序列可调控(例如，增加或降低)细胞中一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达以增加细胞中罗汉果苷的水平。

本文公开的表达构建体可含有可操作地连接至编码与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21中任一个所示的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因(例如内源基因)的启动子序列。例如，本文公开的表达构建体可含有与编码与SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21中任一个所示的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽序列的基因(例如内源基因)可操作地连接的CSVMV启动子。

在一些实施方案中，本文公开的表达构建体可含有启动子序列、前导序列和/或一个或多个核酸酶识别位点。在某些实施方案中，本文公开的表达构建体可以是修复模板，诸如含有插入至一对核酸酶识别位点(例如，一对工程化大范围核酸酶切割位点)之间的启动子(例如，病毒启动子，诸如CsVMV启动子)和前导序列(例如，SynJ 5’前导序列)的修复模板。

在一些实施方案中，本文所述的表达构建体可含有另外的调控信号，包括但不限于转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调控元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见，例如，美国专利号5,039,523和4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook etal.(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ed.Maniatis et al.(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),hereinafter"Sambrook 11"；Davis et al.,eds.(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring HarborLaboratory Press),Cold Spring Harbor,N.Y.，和本文引用的参考文献。

在制备表达盒时，可操纵各种DNA片段，从而以合适的方向，并且如果合适的话，在合适的阅读框中提供DNA序列。为此，可使用衔接子或接头连接DNA片段，或可使用其他操作以提供方便的限制性位点，去除多余的DNA，去除限制性位点等。为此目的，可使用体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和变换。

许多启动子可用于本公开的实施中。可基于期望的结果选择启动子。核酸可与组成型、诱导型、组织优选的或其他启动子组合用于在目的生物体中表达。参见例如WO99/43838和美国专利号8,575,425；7,790,846；8,147,856；8,586832；7,772,369；7,534,939；6,072,050；5,659,026；5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142以及6,177,611中所述的启动子；其通过引用并入本文。

对于在植物中的表达，组成型启动子还包括CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素蛋白(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensenet al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)。

在具体实施方案中，罗汉果苷合成途径基因的内源启动子可用于本文公开的方法和组合物中。罗汉果苷合成途径的任何内源启动子可移动以调控与该启动子异源的罗汉果苷合成途径的任何内源基因的表达。例如，CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94基因的启动子可用于调控除启动子天然基因之外的CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94基因的表达。在一些实施方案中，用于调控另一内源罗汉果苷合成途径基因的表达的内源罗汉果苷合成途径基因的天然启动子可被修饰以调控该启动子的活性。在一些实施方案中，一种葫芦科植物的罗汉果苷合成途径基因的天然启动子可与另一种葫芦科植物的内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。例如，任何葫芦科植物的罗汉果苷合成途径基因的天然启动子可与西瓜或黄瓜的内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接，以调控西瓜或黄瓜中内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

在特定的实施方案中，葫芦科植物基因组的任何内源启动子可用于调控内源罗汉果苷合成途径基因的表达。例如，西瓜基因组的任何启动子可用于调控西瓜基因组中内源罗汉果苷合成途径基因的表达。同样，黄瓜基因组的任何启动子可用于调控黄瓜基因组中内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

用于本发明的组织优选启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505中提出的那些。

叶优选的启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon etal.(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Gotor et al.(1993)Plant J.3:509-18；Orozco et al.(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138；以及Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590中提出的那些。

根优选的启动子是已知的，并且包括Hire et al.(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10):1051-1061(根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露糖苷合成酶(MAS)基因)；和Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1):11-22(胞质性谷氨酰胺合成酶(GS))；Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7):633-641；Leach和Aoyagi(1991)Plant Science(Limerick)79(1):69-76(rolC和rolD)；Teeri et al.(1989)EMBO J.8(2):343-350；Kuster et al.(1995)PlantMol.Biol.29(4):759-772(VfENOD-GRP3基因启动子)；和Capana et al.(1994)PlantMol.Biol.25(4):681-691(rolB启动子)中的那些。还参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。

“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育过程中有活性的启动子，诸如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发过程中有活性的启动子)。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10:108。种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO00/11177和美国专利号6,225,529)。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)是代表性的胚胎特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。还参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子。

2.4.含有罗汉果苷的组合物

本文所述的方法和组合物还涵盖含有罗汉果苷(例如，罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI，和/或罗汉果苷VII)的组合物。例如，本公开的多肽、多核苷酸、细胞和方法可用于产生至少一种罗汉果苷或含有至少一种罗汉果苷的组合物。在某些实施方案中，本文描述的组合物包含本公开的提取物(例如，甜味剂)，植物部分(例如，汁液、果肉、种子、果实、花、胚、花粉、胚珠、叶、枝条、籽粒、穗、穗轴、果壳、茎、根、根尖、花药等)，植物浓缩物(例如，整株植物浓缩物或植物部分浓缩物)，植物生物质(例如，干燥的生物质，诸如粉碎的和/或粉末状的生物质)，和/或植物粉末(例如，配制的粉末，诸如配制的植物部分粉末)，其中所述提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质，和/或植物粉末具有增加水平的一种或多种罗汉果苷。

在某些实施方案中，本文所述的组合物中至少一种罗汉果苷的浓度为至少0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm、5.5ppm、6ppm、6.5ppm、7ppm、7.5ppm、8ppm、8.5ppm、9ppm、9.5ppm、10ppm、10.5ppm、11ppm、11.5ppm、12ppm、12.5ppm、13ppm、13.5ppm、14ppm、14.5ppm、15ppm、15.5ppm、16ppm、16.5ppm、17ppm、17.5ppm、18ppm、18.5ppm、19ppm、19.5ppm、20ppm、25ppm、30ppm、35ppm、40ppm、50ppm、55ppm、60ppm、65ppm、70ppm、75ppm、80ppm、85ppm、90ppm、95ppm、100ppm、105ppm、110ppm、115ppm、120ppm、125ppm、130ppm、135ppm、140ppm、145ppm、150ppm、155ppm、160ppm、165ppm、170ppm、175ppm、180ppm、185ppm、190ppm、195ppm、200ppm、205ppm、210ppm、215ppm、220ppm、225ppm、230ppm、235ppm、240ppm、245ppm、250ppm、255ppm、260ppm、265ppm、270ppm、275ppm、280ppm、285ppm、290ppm、295ppm、300、305ppm、310ppm、315ppm、320ppm、325ppm、330ppm、335ppm、340ppm、345ppm、350ppm、355ppm、360ppm、365ppm、370ppm、375ppm、380ppm、385ppm、390ppm、395ppm、400ppm、405ppm、410ppm、415ppm、420ppm、425ppm、430ppm、435ppm、440ppm、445ppm、450ppm、455ppm、460ppm、465ppm、470ppm、475ppm、480ppm、485ppm、490ppm、495ppm、500ppm、525ppm、550ppm、600ppm、625ppm、650ppm、700ppm、725ppm、750ppm、800ppm、825ppm、850ppm、900ppm、925ppm、950ppm、1000ppm或更多。

在某些实施方案中，本文所述的组合物中的罗汉果苷的浓度为至少10％(wt/wt)、15％(wt/wt)、20％(wt/wt)、25％(wt/wt)、30％(wt/wt)、35％(w/w)、40％(wt/wt)、45％(wt/wt)、50％(wt/wt)、55％(wt/wt)、60％(wt/wt)、65％(wt/wt)、70％(w/w)、75％(wt/wt)、80％(wt/wt)、85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、95％(w/w)、97％(wt/wt)、99％(wt/wt)或更高。

在一些实施方案中，本文所述的组合物，诸如含有本公开的提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质和/或植物粉末的组合物(其具有增加水平的一种或多种罗汉果苷)是可消费品。在一些实施方案中，诸如含有本公开的提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质和/或植物粉末的组合物(其具有增加水平的一种或多种罗汉果苷)用作一种或多种消费品中的成分。本文公开的组合物，诸如含有本公开的提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质和/或植物粉末的组合物(其具有增加水平的一种或多种罗汉果苷)可用作一种或多种消费品中的添加剂。消费品可包括所有食品，包括但不限于谷物产品、米产品、木薯产品、西米产品、面包产品、饼干产品、糕点产品、面包产品、糖果产品、甜点产品、树胶、口香糖、巧克力、冰糖、蜂蜜产品、糖浆产品、酵母产品、烘焙粉、盐和香料产品、咸味产品、芥末产品、醋产品、沙司(调味品)、烟草产品、雪茄、香烟、加工食品、熟水果和蔬菜产品、肉和肉制品、果冻、果酱、水果沙司、蛋制品、奶和乳制品、酸奶、奶酪产品、黄油和黄油替代品、奶替代品、大豆制品、食用油和脂肪产品、药物、饮料、碳酸饮料、酒精饮料、啤酒、软饮料、矿泉水和充气水和其他非酒精饮料、水果饮料、果汁、咖啡、人造咖啡、茶、可可，包括需要重制的形式、食品提取物、植物提取物、肉提取物、调味品、甜味剂、营养制品、明胶、药物和非药物树胶、片剂、锭剂、滴剂、乳剂、酏剂、糖浆和用于制作饮料的其他制剂，及其组合。本文所述的组合物可用于各种消费品，包括但不限于水基消费品、固体干消费品、乳制品、乳制品衍生产品和乳制品替代产品。在一些实施方案中，组合物是食品。

水基消费品包括但不限于饮料、水、水饮料、增强/微增甜的水饮料、矿泉水、碳酸饮料、非碳酸饮料、碳酸水、蒸馏水、软饮料、无酒精饮料、酒精饮料、啤酒、葡萄酒、白酒、果汁饮料、果汁、水果果汁、蔬菜汁、肉汤饮料、咖啡、茶、红茶、绿茶、乌龙茶、凉茶、可可(水基)、茶基饮料、咖啡基饮料、可可基饮料、糖浆、冷冻水果、冷冻果汁、水基冰、水果冰、果汁冻、调料、色拉调料、沙司、汤和饮料植物材料(整体或研磨的)，或用于重制的速溶粉末(咖啡豆、研磨咖啡、速溶咖啡、可可豆、可可粉、速溶可可、茶叶、速溶茶粉)。

在某些实施方案中，本文所述的组合物(例如，含有罗汉果苷的组合物)可用于水基消费品，诸如饮料。特别地，饮料可选自下组：水性饮料、增强/微增甜的水饮料、矿泉水、碳酸饮料、非碳酸饮料、碳酸水、蒸馏水、软饮料、无酒精饮料、酒精饮料、啤酒、葡萄酒、白酒、果汁饮料、果汁、水果果汁、蔬菜汁、肉汤饮料、咖啡、茶、红茶、绿茶、乌龙茶、凉茶、可可、茶基饮料、咖啡基饮料、可可基饮料、糖浆、乳制品、冷冻水果、冷冻果汁、水基冰、水果冰、果汁冻、调料、色拉调料、沙司、汤和饮料植物材料，或用于重制的速溶粉末。

在某些实施方案中，本文所述的组合物可用于固体干消费品。固体干消费品包括但不限于谷物、烘焙食品、饼干、面包、早餐谷物、谷物棒、能量棒/营养棒、格兰诺拉麦片、蛋糕、饼干、薄饼、甜甜圈、松饼、糕点、糖果、口香糖、巧克力、软糖、硬糖、棉花糖、压制片、快餐食品和植物材料(完整的或磨碎的)，以及如上所述用于重制的速溶粉末。

对于在水基消费品或固体干消费品中的用途，罗汉果苷的有用浓度可为约0.2-300ppm，诸如约0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm、5.5ppm、6ppm、6.5ppm、7ppm、7.5ppm、8ppm、8.5ppm、9ppm、9.5ppm、10ppm、10.5ppm、11ppm、11.5ppm、12ppm、12.5ppm、13ppm、13.5ppm、14ppm、14.5ppm、15ppm、15.5ppm、16ppm、16.5ppm、17ppm、17.5ppm、18ppm、18.5ppm、19ppm、19.5ppm、20ppm、25ppm、30ppm、35ppm、40ppm、45ppm、50ppm、55ppm、60ppm、65ppm、70ppm、75ppm、80ppm、85ppm、90ppm、95ppm、100ppm、105ppm、110ppm、115ppm、120ppm、125ppm、130ppm、135ppm、140ppm、145ppm、150ppm、155ppm、160ppm、165ppm、170ppm、175ppm、180ppm、185ppm、190ppm、195ppm、200ppm、205ppm、210ppm、215ppm、220ppm、225ppm、230ppm、235ppm、240ppm、245ppm、250ppm、255ppm、260ppm、265ppm、280ppm、285ppm、290ppm、295ppm或300ppm。

某些消费品中，可能需要较高的甜味剂浓度以达到类似的甜度强度；例如，本公开的组合物用于在乳制品，乳制品衍生产品和乳制品替代产品中。乳制品衍生产品含有奶或奶蛋白。乳制品替代产品含有来自植物来源(例如大豆、稻米、杏仁和其他富含蛋白质的植物材料)的蛋白质(代替来自哺乳动物乳制品的乳蛋白)。乳制品，乳制品衍生产品和乳制品替代产品包括但不限于奶、流质奶、发酵奶产品、发酵和非发酵乳基饮料、用乳酸菌培养的发酵乳产品、酸奶、酸奶基饮料、思慕雪(smoothie)、拉西(lassi)、奶昔、酸奶、酸奶饮料、黄油乳、开菲尔(kefir)、奶基饮料、乳/果汁混合物、发酵奶饮料、冰淇淋、甜点、酸奶油、酱汁、色拉调料、松软干酪、冷冻酸奶、豆奶、杏仁奶、米奶、大豆饮料、米奶饮料等。奶包括但不限于全脂奶、脱脂奶、炼乳、淡奶油、低脂奶、脱脂奶和奶固体(其可是脂肪或非脂肪的)。

用于乳制品、乳制品衍生产品和乳制品替代产品的罗汉果苷的有用浓度可是约0.3-500ppm或更高，且可是至多550ppm、600ppm、650ppm、700ppm、750ppm或更高，诸如约0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm、5.5ppm、6ppm、6.5ppm、7ppm、7.5ppm、8ppm、8.5ppm、9ppm、9.5ppm、10ppm、10.5ppm、11ppm、11.5ppm、12ppm、12.5ppm、13ppm、13.5ppm、14ppm、14.5ppm、15ppm、15.5ppm、16ppm、16.5ppm、17ppm、17.5ppm、18ppm、18.5ppm、19ppm、19.5ppm、20ppm、25ppm、30ppm、35ppm、40ppm、45ppm、50ppm、55ppm、65ppm、70ppm、75ppm、80ppm、85ppm、90ppm、95ppm、100ppm、105ppm、110ppm、115ppm、120ppm、125ppm、130ppm、135ppm、140ppm、145ppm、150ppm、155ppm、160ppm、165ppm、170ppm、175ppm、180ppm、185ppm、190ppm、195ppm、200ppm、205ppm、210ppm、215ppm、220ppm、225ppm、230ppm、235ppm、240ppm、245ppm、250ppm、255ppm、260ppm、265ppm、270ppm、275ppm、280ppm、285ppm、290ppm、295ppm、300ppm、305ppm、310ppm、315ppm、320ppm、325ppm、330ppm、335ppm、340ppm、345ppm、350ppm、355ppm、360ppm、365ppm、370ppm、375ppm、380ppm、385ppm、390ppm、395ppm、400ppm、405ppm、410ppm、415ppm、420ppm、425ppm、430ppm、435ppm、440ppm、445ppm、450ppm、455ppm、460ppm、465ppm、470ppm、475ppm、480ppm、485ppm、495ppm、500ppm、525ppm、550ppm、600ppm、625ppm、650ppm、700ppm、725ppm、750ppm或更高。

在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，含有本公开的提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质和/或植物粉末的组合物，其具有增加水平的一种或多种罗汉果苷)中的罗汉果苷的浓度足以使得风味增强。在一些实施方案中，其中期望增强的甜度，组合物中罗汉果苷的浓度足以使得风味增强，且可用作甜味剂。在某些实施方案中，本文公开的组合物，诸如含有本公开的提取物、植物部分、植物浓缩物、植物生物质和/或植物粉末的组合物，其具有增加水平的一种或多种罗汉果苷，是甜味剂。此类组合物可含有至少0.2ppm，诸如至少0.2-100ppm、0.2-200ppm、0.2-300ppm、0.2-400ppm、0.2-500ppm，或至少约0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm、5.5ppm、6ppm、6.5ppm、7ppm、7.5ppm、8ppm、8.5ppm、9ppm、9.5ppm、10ppm、10.5ppm、11ppm、11.5ppm、12ppm、12.5ppm、13ppm、13.5ppm、14ppm、14.5ppm、15ppm、15.5ppm、16ppm、16.5ppm、17ppm、17.5ppm、18ppm、18.5ppm、19ppm、19.5ppm、20ppm、25ppm、30ppm、35ppm、40ppm、45ppm、50ppm、55ppm、60ppm、65ppm、70ppm、75ppm、80ppm、85ppm、90ppm、95ppm、100ppm、105ppm、110ppm、115ppm、120ppm、125ppm、130ppm、135ppm、140ppm、145ppm、150ppm、155ppm、160ppm、165ppm、170ppm、175ppm、180ppm、185ppm、190ppm、195ppm、200ppm、205ppm、210ppm、215ppm、220ppm、225ppm、230ppm、235ppm、240ppm、245ppm、250ppm、255ppm、260ppm、265ppm、270ppm、275ppm、280ppm、285ppm、290ppm、295ppm、300ppm、310ppm、315ppm、320ppm、325ppm、330ppm、335ppm、340ppm、345ppm、350ppm、355ppm、360ppm、365ppm、370ppm、375ppm、380ppm、385ppm、390ppm、395ppm、400ppm、405ppm、410ppm、415ppm、420ppm、425ppm、430ppm、435ppm、440ppm、445ppm、450ppm、455ppm、460ppm、465ppm、470ppm、475ppm、480ppm、485ppm、490ppm、495ppm、500ppm或更高的罗汉果苷浓度。

在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含风味成分，其选自下组：蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、Acek、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、悬钩子苷、莱鲍迪苷A、甜菊苷、甜叶菊和/或三叶苷。

本文公开的包含至少一种罗汉果苷的组合物，可包含一种或多种另外的风味成分，例如另外的甜味剂，所述罗汉果苷产生自具有罗汉果苷合成途径的至少一种内源基因调控表达的植物。可用于本公开的组合物的合适的风味剂成分的非限制性列表包括蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、Acek、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚苷二氢查耳酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、悬钩子苷、莱鲍迪苷A、甜菊苷、甜叶菊和三叶苷。

消费品中常用的甜味剂包括：

安赛蜜K-人造甜味剂(E950)；龙舌兰糖浆-改性糖；阿力甜-人造甜味剂(E956)；阿斯巴甜-人造甜味剂(E951)；阿斯巴甜-安赛蜜盐-人造甜味剂(E962)；大麦麦芽糖浆-改性糖；桦树糖浆-糖提取物；黑带糖蜜-糖提取物；Brazzein-天然甜味剂；糙米糖浆-改性糖；甘蔗汁-糖提取物；焦糖-改性糖；椰子棕榈糖-糖提取物；玉米糖(HFCS)-改性糖；玉米甜味剂(HFCS)-改性糖；玉米糖浆(HFCS)-改性糖；姜黄素-天然甜味剂；甜蜜素-人造甜味剂(E952)；葡萄糖-糖；赤藓糖醇-糖醇(E968)；果糖葡萄糖浆(HFCS)-改性糖；果糖-糖；半乳糖-糖；葡萄糖醇(Sorbitol)-糖醇(E420)；葡萄糖-糖；葡萄糖果糖糖浆(HFCS)-改性糖；甘油(Glycerin)-糖醇(E422)；甘草酸-天然甜味剂(E958)；金色糖浆-改性糖；高果糖玉米糖浆(HFCS)-改性糖；HFCS-42-改性糖；HFCS-55-改性糖；HFCS-90-改性糖；蜂蜜-天然糖；HSH-糖醇；氢化淀粉水解物(HSH)-糖醇；异葡萄糖(HFCS)-改性糖；菊粉-糖纤维；转化糖-改性糖；异麦芽酮糖醇-糖醇(E953)；乳糖醇-糖醇(E966)；乳糖-糖；左旋糖(果糖)-糖；罗汉果-天然甜味剂；麦芽糖醇-糖醇(E965)；麦芽糖糊精-糖；麦芽糖-糖；甘露醇-糖醇(E421)；枫叶糖浆-糖提取物；神秘果素(Miraculin)-天然甜味剂；糖蜜-糖提取物；莫内林(Monellin)-天然甜味剂；罗汉果-天然甜味剂；新橙皮苷DC-人造甜味剂(E959)；纽甜-人造甜味剂(E961)；低聚果糖-糖纤维；棕榈糖-糖提取物；戊二醛-天然甜味剂；雷帕霉素-糖提取物；精制糖浆-改性糖；糖精-人造甜味剂(E954)；蔗糖(Sucrose)-糖；山梨糖醇-糖醇(E420)；高粱糖浆-糖提取物；甜菊糖-天然甜味剂；甜菊苷-天然甜味剂(E960)；三氯蔗糖-人造甜味剂(E955)；蔗糖-糖；塔格糖-改性糖；奇异果甜蛋白-天然甜味剂(E957)；海藻糖-糖；木糖醇-糖醇(E967)；雪莲果糖浆-天然甜味剂。

在一些实施方案中，本文所述的包含至少一种罗汉果苷的组合物是治疗剂，所述罗汉果苷产生自具有罗汉果苷合成途径的至少一种内源基因的调控表达的植物。在一些实施方案中，组合物用作一种或多种治疗剂中的成分或添加剂。在某些实施方案中，治疗剂具有健康促进功能和/或疾病预防功能。在特定的实施方案中，治疗剂是功能性食品，诸如具有一种或多种其他功能(例如健康促进功能和/或疾病预防功能)的食品。另外地或可选地，治疗剂可是具有健康促进功能和/或疾病预防功能的丸剂、片剂、粉剂、凝胶、乳剂、液体、树胶、锭剂、滴剂、酏剂和/或糖浆。在一些实施方案中，本文所述的包含至少一种罗汉果苷的组合物是诱导有益微生物(诸如细菌和真菌)的生长或活性的益生元(例如，在人类受试者的胃肠道中，其中益生元可改变肠道微生物群中微生物的组成)，其中罗汉果苷产自具有罗汉果苷途径的至少一种基因的调控表达的植物。

2.5.植物的转化

本文还公开了用核酸转化本公开的植物(诸如植物(例如葫芦科植物，诸如西瓜(例如查尔斯顿灰品种西瓜)植物或黄瓜植物)的细胞)的方法，以调控至少一种内源罗汉果苷合成途径基因的表达并增加细胞中至少一种罗汉果苷的水平。

可用本公开的一些实施方案的核酸构建体(例如，表达盒)稳定或瞬时地转化植物细胞。在稳定转化中，本公开的一些实施方案的核酸分子整合至植物基因组中，且因此其代表稳定和遗传的性状。在瞬时转化中，核酸分子由转化的细胞表达，但不整合至基因组中，因而代表瞬时性状。

存在多种将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物的方法(Potrykus et al.,Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:205-225(1991)；Shimamoto et al.,Nature 338:274-276(1989))。

将外源DNA稳定整合至植物基因组DNA中的主要方法包括两种主要方法：

(i)农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移：Klee et al.,Annu Rev PlantPhysiol 38:467-486(1987)；Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25；Gatenby,inPlant Biotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。

(ii)直接摄取DNA：Paszkowski et al.,in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68；包括将DNA直接摄入原生质体的方法，Toriyama,K.et al.(1988)Bio/Technology 6:1072-1074.DNAuptake induced by brief electric shock of plant cells:Zhang et al.Plant CellRep.(1988)7:379-384.Fromm et al.Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或组织中，Klein et al.Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe etal.Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过微量移液管系统的使用：Neuhaus et al.,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhausand Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217；玻璃纤维或碳化硅晶须转化细胞培养物，胚或愈伤组织，美国专利号5,464,765或通过DNA与萌发花粉直接孵育，DeWet etal.in Experimental Manipulation of Ovule Tissue,eds.Chapman,G.P.and Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman,London,(1985)p.197-209；以及Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。

农杆菌系统包括使用含有整合至植物基因组DNA中的确定DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法根据植物种类和农杆菌递送系统而不同。广泛使用的方法是叶盘方法，其可用任何组织外植体进行，所述组织外植体为全植物分化的开始提供良好来源。Horschet al.in Plant Molecular Biology Manual A5,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht(1988)p.1-9。补充方法使用与真空渗透结合的农杆菌递送系统。农杆菌系统在产生转基因双子叶植物中特别可行。

有多种将DNA直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小的微量移液管将DNA直接机械注射到细胞中。在微粒轰击中，DNA被吸附在微粒(诸如硫酸镁晶体或钨颗粒)上，微粒被物理加速进入细胞或植物组织。

接着使稳定的转化植物繁殖。植物繁殖的最常见方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生具有缺陷，即由于杂合性，在作物中缺乏一致性，因为种子是根据由孟德尔法则控制的遗传变异由植物产生的。基本上，每种种子是遗传上不同的，且每种将以其自身的特定性状生长。因此，优选产生转化的植物，使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选通过微繁殖再生转化植物，所述微繁殖提供转化植物的快速、一致的繁殖。

微繁殖是从已从所选亲本植物或栽培种切下的单片组织培育新一代植物的过程。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量繁殖。所产生的新一代植物在遗传上与原始植物相同，且具有原始植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料，并在保存原始转基因或转化植物的特征中提供所选栽培品种的快速繁殖。克隆植物的优点是植物繁殖的速度和产生的植物的质量和一致性。

微繁殖是需要在阶段之间改变培养基或生长条件的多阶段方法。因此，微繁殖方法包括四个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养增殖；阶段三，分化和植物形成；以及阶段四，温室栽培和硬化。在第一阶段，初始组织培养期间，组织培养物被建立且经认证无污染物。在第二阶段，繁殖初始组织培养物，直到产生足够数量的组织样品以满足生产目标。在第三阶段，将在第二阶段生长的组织样品分开并生长成单个小植株。在第四阶段，将转化的小植株转移到温室中用于硬化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，使得其可在自然环境中生长。

虽然稳定转化目前是优选的，本公开的一些实施方案也预期叶细胞、分生组织细胞或整个植物的瞬时转化。

瞬时转化可通过上述任何直接DNA转化方法或通过使用修饰的植物病毒的病毒感染来实现。

已显示可用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒转化植物描述于美国专利4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；以及Gluzman,Y.et al.,Communications in MolecularBiology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,pp.172-189(1988)中。在WO87/06261中描述了用于在众多宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒。

用于在植物中导入和表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及Dawson,W.O.et al.,Virology(1989)172:285-292；Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6:307-311；French et al.Science(1986)231:1294-1297；和Takamatsu etal.FEBS Letters(1990)269:73-76说明。

当病毒是DNA病毒时，可对病毒本身进行合适的修饰。或者，可首先将病毒克隆到细菌质粒中，以便用外源DNA构建所需的病毒载体。然后，可从质粒上切下病毒。如果病毒是DNA病毒，细菌复制起点可附着至病毒DNA上，然后由细菌复制。该DNA的转录和翻译会产生将包裹病毒DNA的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后，用质粒制备所有的构建体。然后，通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以产生包裹病毒RNA的外壳蛋白来产生RNA病毒。

用于在植物中导入和表达非病毒外源核酸序列(诸如包含在本发明一些实施方案的构建体中的)的植物RNA病毒的构建，由上述参考文献以及美国专利号5,316,931说明。

在一个实施方案中，提供了植物病毒核酸，其中已从病毒核酸中缺失了天然外壳蛋白编码序列，插入了非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒核酸，并确保重组植物病毒核酸对宿主的系统性感染。或者，外壳蛋白基因可通过在其中插入非天然核酸序列而失活，从而产生蛋白质。重组植物病毒核酸可含有一种或多种另外的非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻基因或核酸序列，且不能彼此重组，或与天然亚基因组启动子重组。如果包括多于一个核酸序列，非天然(外源)核酸序列可邻近天然植物病毒亚基因组启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组启动子插入。非天然核酸序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下转录或表达以产生所需产物。

在另一个实施方案中，提供了如第一个实施方案中所述的重组植物病毒核酸，除了将天然外壳蛋白编码序列在邻近非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一非天然外壳蛋白编码序列置于附近。

在不同的实施方案中，提供了重组植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白基因邻近其亚基因组启动子且一个或多个非天然亚基因组启动子已被插入到病毒核酸中。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻基因，且不能彼此重组，或与天然亚基因组启动子重组。可将非天然核酸序列插入至邻近非天然亚基因组植物病毒启动子，使得该序列在亚基因组启动子控制下在宿主植物中转录或表达以产生所需产物。

在另一个实施方案中，提供了诸如第三个实施方案中的重组植物病毒核酸，除了天然外壳蛋白编码序列被非天然外壳蛋白编码序列替代。

病毒载体被重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白包裹以产生重组植物病毒。重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染合适的宿主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中复制，在宿主中系统传播，和将外源基因(分离的核酸)在宿主中转录或表达以产生所需蛋白质。

除了上述之外，本发明一些实施方案的核酸分子也可被导入叶绿体基因组，从而使叶绿体能够表达。

将外源核酸序列导入叶绿体基因组的技术是已知的。该技术包括以下步骤。首先，对植物细胞进行化学处理以将每个细胞的叶绿体数目减少到约1。然后，通过粒子轰击将外源核酸导入细胞，目的是将至少一种外源核酸分子导入叶绿体。选择外源核酸，使其通过易于受叶绿体固有的酶影响的同源重组整合至叶绿体基因组中。为此，除了目的基因外，外源核酸还包括至少一种来源于叶绿体基因组的核酸片段。另外，外源核酸包括可选择标记，其通过连续的选择程序起作用以确定在这样的选择之后叶绿体基因组的所有或基本上所有拷贝将包括外源核酸。关于该技术的进一步细节可见于美国专利4,945,050；和5,693,507，其通过引用并入本文。因此，多肽可由叶绿体的蛋白质表达系统产生并整合至叶绿体的内膜中。根据本发明的一些实施方案，提供了异源表达的本发明的分离的多核苷酸的宿主细胞，如上所述。宿主细胞可以是任何合适的宿主细胞，包括可在发酵、植物和其他真核细胞中培养或生长的细菌、酵母和其他微生物。例如，宿主细胞是用异源核酸转化的细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，所述异源核酸例如含有本文所述的核酸分子的噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体，或用含有本文所述核酸分子的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)或(S.pombe))。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在一个具体的实施方案中，酵母细胞是缺乏内源性甾醇生物合成的酵母细胞，诸如GIL77，或缺乏内源性角鲨烯环氧酶ergl基因的酵母细胞系，诸如Rasbery J M等所述(Jour.Biol.Chem.2007.282:17002-17013)。

在一些实施方案中，宿主细胞产生罗汉果醇、罗汉果苷或罗汉果苷前体，或罗汉果苷。例如，宿主细胞可产生一种或多种罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

所述方法也可使用重组和非重组宿主的混合物。如果使用一种以上的宿主，则可共培养这些宿主，或者可分别培养它们。如果分别培养宿主，则可回收，任选纯化和部分纯化中间产物，并使用中间产物作为底物培养给重组宿主。

本文所述的重组宿主可用于生产罗汉果苷的方法中。例如，如果重组宿主是微生物，则该方法可包括在培养基中，在表达本发明方法催化步骤的一种或多种酶(例如合酶、水解酶、CYP450和/或UGT)的条件下培养重组微生物。重组微生物可在补料分批或连续过程中生长。

典型地，重组微生物在发酵罐中在限定的温度下生长一段所需的时间。可从表达一种或多种酶的重组宿主制备细胞裂解物，并用于接触底物，从而可产生罗汉果苷。例如，可从表达一种或多种UGT的重组宿主制备细胞裂解物，并将其用于接触罗汉果醇或罗汉果苷，从而可生产罗汉果苷。

在一些实施方案中，可使用全细胞产生罗汉果苷，所述全细胞是含有前体分子(例如罗汉果苷)的进料原料。原料可在细胞生长期间或细胞生长之后进料。全细胞可悬浮或固定。全细胞可在发酵液中或在反应缓冲液中。在一些实施方案中，可能需要渗透剂来将底物有效转移到细胞中。

产物、底物和中间体的水平可根据公开的方法通过从培养基中提取样品用于分析来确定。可使用本领域已知的各种技术从培养物或培养基中回收罗汉果苷。

在一些实施方案中，提供宿主细胞的细胞裂解物。该细胞裂解物可包含本文公开的罗汉果苷途径的酶以及该途径的罗汉果醇、罗汉果苷和罗汉果苷前体和罗汉果苷产物。因此，细胞裂解物可用于回收罗汉果苷途径的产物(例如罗汉果醇、罗汉果苷M4、M5和M6)或回收重组表达的酶多肽。提取活性酶多肽的方法是本领域熟知的。

本公开的细胞裂解物还可单独或与其他合适的底物或酶组合用于罗汉果醇、罗汉果苷或罗汉果苷前体和罗汉果苷的无细胞合成。

在一些实施方案中，含有启动子序列的DNA构建体可用于转化目的植物或其他目的生物体。在某些实施方案中，本文所述的任何表达盒可用于基因修饰植物的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

转化方法包括将核苷酸构建体导入植物。“导入”是指将核苷酸构建体导入植物或其他宿主细胞，使得构建体进入植物细胞或宿主细胞的内部。本公开的方法不需要用于将核苷酸构建体导入植物或宿主细胞的特定方法，只是核苷酸构建体获得进入植物或宿主生物体的至少一种细胞的内部。将核苷酸构建体导入植物和其他宿主细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法，瞬时转化方法和病毒介导方法。

所述方法产生转化的生物体，诸如植物，包括整个植物，以及植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

如本文所用，术语“转基因”或“转化的”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已通过本公开的方法修饰以具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的植物或细胞或组织。相反，对照、非转基因或未修饰的植物或细胞或组织是指没有此类修饰(例如，没有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的修饰)的植物或细胞或组织。应认识到，其他外源或内源核酸序列或DNA片段也可导入植物细胞中。农杆菌介导的转化和生物基因枪介导的转化仍然是两种主要采用的方法。然而，转化可通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微喷射、生物基因枪或粒子轰击、电穿孔、二氧化硅/碳纤维、超声介导、PEG介导、磷酸钙共沉淀、聚阳离子DMSO技术、DEAE葡聚糖方法、农杆菌和病毒介导(花椰菜花叶病毒组、双生病毒、RNA植物病毒)、脂质体介导的等方法来进行。

转化方案以及用于将多肽或多核苷酸序列导入植物的方案可根据用于转化的靶向植物或植物细胞(即单子叶植物或双子叶植物)的类型而不同。用于转化的方法是本领域已知的且包括在美国专利号8,575,425；7,692,068；8,802,934；7,541,517中阐述的那些，其每一个在此引入作为参考。也可参见Rakoczy-Trojanowska,M.(2002)Cell Mol BiolLett.7:849-858；Jones et al.(2005)Plant Methods 1:5；Rivera et al.(2012)Physicsof Life Reviews 9:308-345；Bartlett et al.(2008)Plant Methods 4:1-12；Bates,G.W.(1999)Methods in Molecular Biology 111:359-366；Binns和Thomashow(1988)Annual Reviews in Microbiology 42:575-606；Christou,P.(1992)The Plant Journal2:275-281；Christou,P.(1995)Euphytica 85:13-27；Tzfira et al.(2004)TRENDS inGenetics 20:375-383；Yao et al.(2006)Journal of Experimental Botany 57:3737-3746；Zupan和Zambryski(1995)Plant Physiology 107:1041-1047；Jones et al.(2005)Plant Methods 1:5。

转化可使得核酸稳定或瞬时导入细胞中。“稳定转化”是指导入宿主细胞的核苷酸构建体整合至宿主细胞的基因组中并能够被其后代遗传。“瞬时转化”是指将多核苷酸导入宿主细胞而不整合至宿主细胞的基因组中。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab et al.(1990)Proc.Nail.Acad.Sci.USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于含有选择标记的DNA的基因枪递送和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，质体转化可通过沉默质体携带的转基因的反式活化来完成，所述转基因通过核编码的和质体导向的RNA聚合酶的组织优选表达来实现。在McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305中已报道了这种系统。

已转化的细胞可根据常规方法生长成植物。参见，例如，McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后，可种植这些植物，且用相同的转化品系或不同的品系授粉，且鉴定所需表型特征的组成型表达的所得杂交种。可种植两代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定地维持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已经实现。以这种方式，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定导入至其基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。

在具体的实施方案中，本文提供的序列可靶向宿主细胞或植物细胞基因组内的特定位点。将序列靶向基因组中的特定位点的方法可包括使用工程化核酸酶。

本领域已知可使用位点特异性核酸酶在活细胞的基因组中产生DNA断裂，且这种DNA断裂可通过与转基因DNA序列的同源重组导致基因组的永久修饰。使用核酸酶诱导靶基因座中的双链断裂可刺激同源重组，特别是在转基因DNA序列两侧与基因组靶同源的序列。以这种方式，可将外源核酸插入靶基因座。例如，可将外源核酸插入葫芦科植物的基因组以调控至少一种罗汉果苷合成途径基因的表达。

本领域已知可使用位点特异性核酸酶在活细胞的基因组中产生DNA断裂，且这种DNA断裂可通过诱变NHEJ修复或通过与转基因DNA序列的同源重组使得基因组永久修饰。NHEJ可在切割位点产生诱变，使得等位基因失活。NHEJ相关诱变可通过产生早期终止密码子，产生异常非功能性蛋白质的移码突变，或可触发机制(诸如无义介导的mRNA衰变)而使等位基因失活。使用核酸酶通过NHEJ诱导诱变可用于靶向野生型等位基因中存在的特定突变或序列。此外，已知使用核酸酶诱导靶基因座中的双链断裂可刺激同源重组，特别是转基因DNA序列两侧与基因组靶标同源的序列。以这种方式，可将外源核酸序列插入靶基因座。此类外源核酸可编码任何目的序列或多肽，诸如可调控内源罗汉果苷合成途径基因的表达以增加植物中罗汉果苷水平的序列。

因此，在不同的实施方案中，多种不同类型的核酸酶可用于实施本发明。在一个实施方案中，可使用工程化的重组大范围核酸酶实施本发明。在另一个实施方案中，本发明可使用CRISPR系统核酸酶(例如CRISPR/Cas9或RNA引导的核酸酶，诸如Cpf1、MAD7等)或CRISPR系统切口酶来实施。用于制备识别和结合预定DNA位点的CRISPR和CRISPR切口酶系统的方法是本领域已知的，例如Ran,et al.(2013)Nat Protoc.8:2281-308。在另一个实施方案中，本发明可使用TALEN或紧凑TALEN来实施。制备与预定DNA位点结合的TALE结构域的方法是本领域已知的，例如Reyon et al.(2012)Nat Biotechnol.30:460-5。在另一个实施方案中，可使用锌指核酸酶(ZFN)实施本发明。在另一个实施方案中，可使用megaTAL来实施本发明。

在一些实施方案中，用于实施本发明的核酸酶是大范围核酸酶。在特定的实施方案中，用于实施本发明的核酸酶是单链大范围核酸酶。单链大范围核酸酶包含通过接头肽连接的N端亚基和C端亚基。两个结构域中的每一个识别并结合识别序列的一半(即，识别半位点)，且DNA切割位点位于靠近两个亚基的界面的识别序列的中间。DNA链断裂被四个碱基对抵消，使得DNA被大范围核酸酶切割产生一对四个碱基对，3’单链突出端。

在一些实施方案中，用于编辑植物基因组的系统包括但不限于针对目的植物基因组序列设计的工程化大范围核酸酶(例如归巢核酸内切酶)(D’Halluin et al.2013PlantBiotechnol J)；CRISPR-Cas9，本领域已知的替代的CRISPR编辑系统(例如，RNA引导的核酸酶，诸如Cpf1、MAD7等)，TALEN和其他技术可用于基因组的精确编辑(例如，Feng,etal.Cell Research 23:1229-1232,2013,Podevin,et al.Trends Biotechnology,onlinepublication,2013,Wei et al.,J Gen Genomics,2013,Zhang et al(2013)WO2013/026740)；Cre-lox位点特异性重组(Dale et al.(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik,etal.(2007)Transgenic Plant J 1:1-9；FLP-FRT重组(Li et al.(2009)Plant Physiol151:1087-1095)；Bxb1介导的整合(Yau et al.Plant J(2011)701:147-166)；锌指核酸酶介导的整合(Wright et al.(2005)Plant J 44:693-705)；Cai et al.(2009)Plant MolBiol 69:699-709)；以及同源重组(Lieberman-Lazarovich and Levy(2011)Methods MolBiol 701:51-65)；Puchta(2002)Plant Mol Biol 48:173-182)。

2.6.植物的育种

本文还公开了用于培育具有基因修饰的本公开的植物(诸如植物(例如葫芦科植物，诸如西瓜(例如查尔斯通灰品种西瓜)植物或黄瓜植物))的方法，以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达。具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的植物可从本公开的植物细胞或植物部分再生，其中所述植物细胞或植物部分的基因组通过本文公开的方法基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。使用常规育种技术或自花授粉，可从具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的植物产生一种或多种种子。此类种子和由此产生的从此类种子生长的后代植物可含有调控的(例如，增加的或减少的)罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的表达，且因此可是转基因的。

具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的植物可自花授粉以提供本公开的纯合植物的一个或多个种子(对于产生罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的调控表达的基因组中的修饰是纯合的)或与未修饰的植物或不同修饰的植物杂交以提供本公开的杂合植物的种子(对于产生罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因的调控表达的基因组中的修饰是杂合的)。此类纯合和杂合植物在本文中都称为“后代植物”。后代植物是具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的植物，其为在基因组中具有调控的(例如，增加的或降低的)罗汉果苷合成途径的一种或多种内源基因表达的修饰的原始植物的后裔。可收获使用本发明的此类植物产生的种子并用于种植几代经修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物，，例如本发明的后代植物，其包含具有调控的表达的罗汉果苷合成途径的内源基因并任选地表达农学目的基因(例如，除草剂抗性基因)。通常用于不同作物的育种方法的描述可在几本参考书之一中找到，参见，例如Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,Calif.,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(ed),Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses,2nd Edition,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of Variety Development,Theory and Technique,(Vol.1)andCrop Species Soybean(Vol.2),Iowa State Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明或本文公开的实施方案的范围的情况下，本文描述的本发明的方法的其他合适的修改和改编是显而易见的，且可使用合适的等价物进行。现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，包括这些实施例仅用于说明的目的，而不旨在限制本发明。

具体实施方式

以下实施例仅是说明性的，且不旨在以任何方式限制本文提供的公开内容的范围。

实施例1.通过病毒启动子活化西瓜中罗汉果苷基因同源物

以下实施例描述了病毒启动子介导的西瓜中罗汉果苷合成途径基因同源物的活化。

为活化西瓜中罗汉果苷合成途径基因的同源物，使用含有与罗汉果苷基因同源物可操作性连接的木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子的表达构建体。图2提供了表达构建体的示意图。

首先，鉴定了西瓜中与罗汉果中的罗汉果苷生物合成基因进化保守的一组基因。UGT72(ClCG04G007540；SEQ ID NO:7)和CYP87D18(ClCG01G014540；SEQ ID NO:3)是这些基因中的两个。这两个基因在西瓜的叶和果实组织中都具有非常低的表达水平。

为证明可使用基因组编辑活化这些基因，使工程化的大范围核酸酶对(称为ARCUS核酸酶(第1对：U72 3-4和U72 5-6；第2对：使C87 1-2和C87 3-4))分别靶向UGT72和CYP87D18基因的启动子区。对于每个启动子，设计特异性修复模板以将CsVMV启动子与SynJ5’前导序列一起插入于ARCUS核酸酶识别位点对之间。作为双链DNA递送的这些修复模板由540bp的CsVMV和SynJ 5’序列以及两侧150bp的同源臂组成。同源臂具有与ARCUS核酸酶识别位点侧翼的西瓜基因组区域匹配的序列，如图3A-3B所示。

在第一种情况下，合成编码U72 3-4和U72 5-6ARCUS核酸酶的mRNA，并与携带UGT72基因同源臂的修复模板DNA混合(图3A)。然后，将混合物递送至从幼苗分离的西瓜原生质体并孵育72小时。作为对照，仅用编码U72 3-4和U72 5-6ARCUS核酸酶的mRNA单独递送，而不使用DNA修复模板。在单独的对照中，GFP mRNA与DNA修复模板共同递送。复制每个基因递送以确保一致性。72小时后，收集未转染的原生质体、仅用ARCUS核酸酶递送的原生质体，以及用ARCUS核酸酶和修复模板共同递送的原生质体，用于总RNA提取。设计Q-RT-PCR引物以特异性扩增编码区中的UGT72区域。使用Q-RT-PCR研究来自所有样品的UGT72的表达。结果如图4A所示。

如图4A所述，与未转染样品相比，CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列的插入显著增加了基因表达。在两个对照递送中没有观察到增加的基因表达，其中DNA修复模板或ARCUS酶未组合。

在第二种情况下，合成编码C87 1-2和C87 3-4ARCUS核酸酶的mRNA，并与携带CYP87基因同源臂的修复模板DNA混合(图3B)。然后，将混合物递送至从幼苗分离的西瓜原生质体并孵育72小时。作为对照，仅用编码C87 1-2和C87 3-4ARCUS核酸酶的mRNA进行单独递送，而不使用DNA修复模板。在单独的对照中，GFP mRNA与DNA修复模板共同递送。复制每个基因递送以确保一致性。72小时后，收集未转染的原生质体、仅用ARCUS核酸酶递送的原生质体，以及用ARCUS核酸酶和修复模板递送的原生质体，用于总RNA提取。设计Q-RT-PCR引物以特异性扩增编码区中的CYP87区域。使用Q-RT-PCR研究来自所有样品的CYP87的表达。结果如图4B所示。

如图4B所述，与未转染样品相比，CsVMV启动子和SynJ 5’前导序列的插入显著增加了基因表达。在两个对照递送中没有观察到增加的基因表达，其中DNA修复模板或ARCUS酶未组合。

因此，病毒启动子可有效活化西瓜中罗汉果苷合成途径基因的同源物。

本文公开的所有序列的总结由以下序列汇总表(表1)中提供。

表1.序列汇总表

在本申请中引用的所有参考文献、专利、未决专利申请和出版物的内容在此明确地全文引入作为参考。

本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在被以下权利要求所涵盖。

Claims

1.用于通过细胞增加一种或多种罗汉果苷产量的方法，所述方法包括基因修饰所述细胞的基因组，以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码葫芦二烯醇合酶(CDS)的内源基因、编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)的内源基因、编码环氧化物水解酶3(EPH3)的内源基因、编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)的内源基因、编码UDP糖基转移酶720(UGT720)的内源基因、编码UDP糖基转移酶94(UGT94)的内源基因，或其一种或多种同源物。

3.权利要求1或2的方法，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽序列的内源基因。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法包括调控葫芦科植物基因组中一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

5.权利要求4的方法，其中所述葫芦科植物是西瓜植物或黄瓜植物。

6.权利要求5的方法，其中所述西瓜植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中调控所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括所述基因的启动子序列的修饰。

8.权利要求7的方法，其中所述启动子序列的修饰包括：

(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或

(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。

9.权利要求1-6中任一项的方法，其中调控一种或多种转录因子基因的表达以调控所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

10.权利要求9的方法，其中所述调控一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。

11.权利要求9或10的方法，其中所述调控一种或多种转录因子基因的表达增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的负调控序列。

13.权利要求12的方法，其中所述负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中基因修饰所述细胞的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括将一种或多种功能性启动子插入所述细胞的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。

15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种功能性启动子是同源启动子。

16.权利要求14的方法，其中所述一种或多种功能性启动子是异源启动子。

17.权利要求14的方法，其中所述启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。

18.权利要求17的方法，其中所述CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

20.权利要求19的方法，其中所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中：

(i)当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加至少20％、25％、

30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的一种或多种罗汉果苷；和/或

(ii)当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多的一种或多种罗汉果苷。

22.权利要求21的方法，其中：

(i)当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加至少20％、25％、

30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％或更多的罗汉果苷V；和/或

(ii)当与对照细胞相比时，所述细胞产生增加约20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-200％、200-300％、300-400％、400-500％、500-600％、600-700％、700-800％、800-900％、900-1000％或更多的罗汉果苷V。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中基因修饰所述细胞的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括增加所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

24.用于产生包含增加水平的一种或多种罗汉果苷的植物的方法，所述方法包括基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达，以及从所述植物细胞或植物部分种植植物，其中与对照植物相比，所述植物包含增加水平的一种或多种罗汉果苷。

25.权利要求24的方法，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码葫芦二烯醇合酶(CDS)的内源基因、编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)的内源基因、编码环氧化物水解酶3(EPH3)的内源基因、编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)的内源基因、编码UDP糖基转移酶720(UGT720)的内源基因、编码UDP糖基转移酶94(UGT94)的内源基因，或其一种或多种同源物。

26.权利要求24或25的方法，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽序列的内源基因。

27.权利要求24-26中任一项的方法，其中基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括所述基因的启动子序列的修饰。

28.权利要求27的方法，其中所述启动子序列的修饰包括：

(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或

(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。

29.权利要求27的方法，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的调控包括调控一种或多种转录因子基因的表达。

30.权利要求29的方法，其中调控所述一种或多种转录因子基因的表达活化一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。

31.权利要求29或30的方法，其中一种或多种转录因子基因表达的调控增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

32.权利要求24-31中任一项的方法，其中调控一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达包括修饰所述基因的负调控序列。

33.权利要求32的方法，其中所述负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。

34.权利要求24-33中任一项的方法，其中基因修饰植物细胞或植物部分的基因组以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括将一种或多种功能性启动子插入所述植物细胞或植物部分的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。

35.权利要求34的方法，其中所述一种或多种功能性启动子是同源启动子。

36.权利要求34的方法，其中所述一种或多种功能性启动子是异源启动子。

37.权利要求34的方法，其中所述启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。

38.权利要求37的方法，其中所述CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

39.权利要求24-38中任一项的方法，其中一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

40.权利要求39的方法，其中所述一种或多种罗汉果苷为罗汉果苷V。

41.权利要求24-40中任一项的方法，其中调控一种或多种罗汉果苷合成途径基因的表达包括增加一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

42.权利要求24-41中任一项的方法，其中所述植物是葫芦科植物。

43.权利要求42的方法，其中所述植物是西瓜植物或黄瓜植物。

44.权利要求43的方法，其中所述植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

45.植物或植物部分，其与对照植物相比，包含增加水平的至少一种罗汉果苷，其中所述植物的基因组包含基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

46.权利要求45的植物或植物部分，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因选自编码葫芦二烯醇合酶(CDS)的内源基因、编码细胞色素P450酶87D18(CYP87D18)的内源基因、编码环氧化物水解酶3(EPH3)的内源基因、编码角鲨烯环氧酶1(SQE1)的内源基因、编码UDP糖基转移酶720(UGT720)的内源基因、编码UDP糖基转移酶94(UGT94)的内源基因，或其一种或多种同源物。

47.权利要求45或46的植物或植物部分，其中所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因选自编码与SEQ ID NO:1-14和21中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽序列的内源基因。

48.权利要求45-47中任一项的植物或植物部分，其中调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰包括所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因启动子序列的基因修饰。

49.权利要求48的植物或植物部分，其中启动子序列的基因修饰包括：

(i)一个或多个核苷酸序列的插入；和/或

(ii)一个或多个核苷酸序列的缺失。

50.权利要求45的植物或植物部分，其中调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括调控一种或多种转录因子基因的表达。

51.权利要求50的植物或植物部分，其中调控一种或多种转录因子基因的表达活化所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的启动子序列。

52.权利要求50或51的植物或植物部分，其中调控所述一种或多种转录因子基因的表达增加所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

53.权利要求45-52中任一项的植物或植物部分，其中所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的调控包括修饰所述基因的负调控序列。

54.权利要求53的植物或植物部分，其中所述负调控序列包含上游开放阅读框(uORF)。

55.权利要求45-54中任一项的植物或植物部分，其中所述基因修饰以调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达包括将一种或多种功能性启动子插入植物细胞或植物部分的基因组中，其中在所述插入后，所述一种或多种功能性启动子与所述一种或多种罗汉果苷合成途径基因可操作地连接。

56.权利要求55的植物或植物部分，其中所述一种或多种功能性启动子是同源启动子。

57.权利要求55的植物或植物部分，其中所述一种或多种功能性启动子是异源启动子。

58.权利要求55的植物或植物部分，其中所述启动子是木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子。

59.权利要求58的植物或植物部分，其中所述CSVMV启动子与编码CDS、CYP87D18、EPH3、SQE、UGT720或UGT94的基因可操作地连接。

60.权利要求45-59中任一项的植物或植物部分，其中所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

61.权利要求60的植物或植物部分，其中所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。

62.权利要求45-61中任一项的植物或植物部分，其中与对照植物或植物部分相比，所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达增加。

63.权利要求45-62中任一项的植物或植物部分，其中所述植物是葫芦科植物。

64.权利要求63的植物或植物部分，其中所述植物是西瓜植物或黄瓜植物。

65.权利要求64的植物或植物部分，其中所述植物是查尔斯顿灰品种西瓜植物。

66.提取物，其来自权利要求45-65中任一项的植物或植物部分。

67.权利要求66的提取物，其中所述提取物包含一种或多种罗汉果苷。

68.权利要求67的提取物，其中所述提取物包含罗汉果苷V。

69.权利要求66-68中任一项的提取物，其中所述提取物是甜味剂。

70.权利要求66-69中任一项的提取物，其中所述提取物与蔗糖相比具有200-450X的甜度指数。

71.权利要求66-70中任一项所述的提取物，其中所述提取物具有5或更低的升糖指数(GI)。

72.权利要求45-65中任一项的植物部分，其中所述植物部分与蔗糖相比具有200-450X的甜度指数。

73.权利要求45-65或72中任一项的植物部分，其中所述植物部分具有5或更低的升糖指数(GI)。

74.权利要求45-65、72或73中任一项的植物部分，其中所述植物部分是果肉。

75.权利要求45-65、72或73中任一项的植物部分，其中所述植物部分是汁液。

76.权利要求45-65中任一项的植物种子，其中所述种子包含调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰。

77.权利要求45-65中任一项的植物或植物部分的植物浓缩物。

78.权利要求77的植物浓缩物，其中与由对照植物产生的植物浓缩物相比，所述植物浓缩物包含增加量的一种或多种罗汉果苷。

79.权利要求78的植物浓缩物，其中所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

80.权利要求79的植物浓缩物，其中所述一种或多种罗汉果苷为罗汉果苷V。

81.权利要求77-80中任一项的植物浓缩物，其中所述植物浓缩物与蔗糖相比具有200-450X的甜度指数。

82.权利要求77-81中任一项的植物浓缩物，其中所述植物浓缩物具有5或更低的升糖指数(GI)。

83.权利要求45-65中任一项的植物或植物部分的植物粉末。

84.权利要求83的植物粉末，其中所述植物粉末与由对照植物产生的植物粉末相比包含增加量的一种或多种罗汉果苷。

85.权利要求84的植物粉末，其中所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

86.权利要求85的植物粉末，其中所述一种或多种罗汉果苷为罗汉果苷V。

87.权利要求83-86中任一项的植物粉末，其中所述植物粉末与蔗糖相比具有200-450X的甜度指数。

88.权利要求83-87中任一项的植物粉末，其中所述植物粉末具有5或更低的升糖指数(GI)。

89.权利要求83-88中任一项的植物粉末，其中所述植物粉末是配制的植物粉末。

90.权利要求45-65中任一项的植物的植物生物质。

91.权利要求90的植物生物质，其中所述植物生物质与来自对照植物的植物生物质相比包含增加量的一种或多种罗汉果苷。

92.权利要求91的植物生物质，其中所述一种或多种罗汉果苷选自罗汉果醇、罗汉果苷I-A1、罗汉果苷I-E1、罗汉果苷IIA、罗汉果苷IIB、罗汉果苷IIE、7-氧罗汉果苷IIE、11-氧罗汉果苷A1、罗汉果苷III、罗汉果苷III A1、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IIIx、11-脱氧罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷IV-A、11-氧罗汉果苷IV-A、赛门苷I、罗汉果苷V、7-氧罗汉果苷V、11-氧罗汉果苷V、罗汉果苷VI和罗汉果苷VII。

93.权利要求92的植物生物质，其中所述一种或多种罗汉果苷是罗汉果苷V。

94.权利要求90-93中任一项的植物生物质，其中所述植物生物质与蔗糖相比具有200-450X的甜度指数。

95.权利要求90-94中任一项的植物生物质，其中所述植物生物质具有5或更低的升糖指数(GI)。

96.权利要求90-95中任一项的植物生物质，其中所述植物生物质是干燥生物质。

97.权利要求96的植物生物质，其中所述配制的干燥生物质是粉碎的和/或粉末状的生物质。

98.权利要求45-65中任一项的植物的后代植物，其中在所述后代植物中调控所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

99.来自权利要求98的后代植物的种子，其中在来自所述后代植物的所述种子中调控所述一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因的表达。

100.用于产生具有调控一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的基因修饰的后代植物的方法，所述方法包括将权利要求45-65中任一项的植物与未被基因修饰以调控内源罗汉果苷合成途径基因表达的植物杂交，以产生与对照植物相比具有调控的一种或多种内源罗汉果苷合成途径基因表达的后代植物。

101.权利要求100的方法，其中当与对照植物相比时，所述后代植物包含增加水平的至少一种罗汉果苷。

102.权利要求100或101的方法，其包含在所述杂交步骤后从植物种植种子并从所述种子再生所述后代植物。