CN117802125A

CN117802125A - 与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因及应用

Info

Publication number: CN117802125A
Application number: CN202311847754.6A
Authority: CN
Inventors: 谭健韬; 陈可; 刘琦; 刘传光; 孙康莉; 叶婵娟
Original assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-04-02

Abstract

本发明公开了与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因及应用，属于基因工程领域。本发明根据育种作物的密码子偏好性，优化AlaDC和TS的基因序列，利用连接肽连接两个基因片段后获得融合基因I，与育种作物胚乳强表达启动子融合，构建基因表达盒I；将AlaAT与育种作物胚乳强表达启动子融合，构建基因表达盒II；将基因表达盒I和基因表达盒II转入表达载体构建多基因重组载体；将多基因重组载体导入育种作物，获得种子胚乳能合成茶氨酸的转基因作物。本发明实现茶氨酸在作物(尤其是水稻)种子胚乳中的合成，其产品即可以直接用于食用，也可以作为生产茶氨酸的原料，对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。

Description

与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因及应用。

背景技术

茶氨酸(L-Theanine)，化学名N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一种茶叶的特征氨基酸，也是茶叶呈味物质之一，它与绿茶品质呈强正相关，相关系数达0.787～0.876。茶氨酸是茶叶中含量最高的氨基酸，约占绿茶氨基酸总量50％～60％，占茶叶干重的1％～2％。茶氨酸味鲜爽，具有缓解苦涩、增加茶汤香甜味的作用，且其结构与脑内活性物质谷氨酰胺相似，可以促进脑中枢神经递质多巴胺的释放，提高脑内多巴胺生理活性，使人感觉舒适、放松，从而调节人的情绪和精神状态。近年来的研究表明，茶氨酸还具有抗肿瘤、降血压、松弛神经紧张、促进神经生长、减肥及抗疲劳等医疗功效，因而被广泛应用于食品添加剂和保健品中，起改善食品风味和镇静安神的作用。

自然界中，除在茶梅、蘑菇、油茶等植物中能检测出微量茶氨酸存在外，尚未发现能产生茶氨酸的其它植物。在茶树中，糖酵解产生的丙酮酸在丙氨酸转氨酶AlaAT作用下生成丙氨酸，后者经脱羧(由丙氨酸脱羧酶AlaDC催化)生成乙胺。随后，谷氨酸和乙胺在茶氨酸合酶TS催化作用下生成茶氨酸(见图1)。目前，茶氨酸工业化生产主要有化学合成、酶法合成和从茶叶中提取等方法。然而，茶氨酸的化学合成存在安全性风险，酶法合成价格昂贵，从茶叶中提取则面临产率低、污染大等问题。因此，利用基因工程手段，以作物作为生物反应器大量生产茶氨酸，则可以解决上述问题。作物中富含茶氨酸的前体丙氨酸和谷氨酸，茶氨酸合成途径的功能酶也已经被克隆解析，因此以作物作为盘底生产茶氨酸是切实可行的。

水稻是一种重要的粮食作物和模式植物，稻米(胚乳)作为生物反应器已被广泛应用于生产活性代谢物，如富含β-类胡萝卜素的“黄金大米”、富含花青素的“紫晶米”和富含虾青素的“赤晶米”，被称为作物分子农场。利用基因工程方法在稻米胚乳中增加、强化合成特定功能性物质，具有高产量、低成本、简易的提取过程和安全性高等优点。目前还没有在水稻胚乳中生产茶氨酸的报道，因此，如何通过基因工程和合成生物学方法在胚乳中高效生产茶氨酸，是一个非常值得研究探索的科学问题。

发明内容

本发明的目的是提供与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因及应用，以解决上述现有技术存在的问题，将AlaDC、TS以及AlaAT基因导入作物中可以显著增加作物种子胚乳中茶氨酸的产量，为利用作物生产茶氨酸提供有效的生物途径和科学依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因，所述基因包括如下(1)或(2)任一种：

(1)AlaDC基因和TS基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示；

(2)AlaDC基因、TS基因和AlaAT基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-3所示。

本发明还提供由所述的基因编码的蛋白。

本发明还提供包含所述的基因的重组载体。

本发明还提供包含所述的重组载体的重组菌。

本发明还提供利用所述的基因构建种子胚乳能合成茶氨酸的转基因作物的方法，其包括如下(1)或(2)所示任一种方法：

(1)将外源AlaDC基因和TS基因导入作物，获取种子胚乳能合成茶氨酸的转基因作物；

(2)将外源AlaDC基因、TS基因和AlaAT基因导入作物，获取种子胚乳能合成茶氨酸的转基因作物。

优选的是，将外源基因导入植物的方法包括以下步骤：

将AlaDC基因和TS基因通过连接肽连接，获得融合基因I，将所述融合基因I与育种作物胚乳强表达启动子融合，构建基因表达盒I；

将AlaAT基因与所述育种作物胚乳强表达启动子融合，构建基因表达盒II；

将所述基因表达盒I和所述基因表达盒II转入表达载体，构建包含AlaDC基因、TS基因和AlaAT基因的多基因重组载体；

将所述多基因重组载体导入作物中，获取种子胚乳能合成茶氨酸的转基因植物。

优选的是，所述连接肽包含2A肽，所述2A肽的编码基因序列如SEQ ID NO：4所示；

所述育种作物胚乳强表达启动子包含Pens1或Pens2，所述Pens1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述Pens2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

优选的是，所述作物包括水稻、玉米或小麦。

本发明还提供所述的基因或所述的蛋白或所述的重组载体或所述的重组菌或所述的方法构建的转基因作物的种子胚乳在生产茶氨酸中的应用。更进一步地，所述的基因不限于SEQ ID NO：1-3所示序列，还可以是未经密码子优化之前的茶树的AlaDC基因(GenBank No.MN241445.1)、茶树的TS基因(GenBank No.JQ925872.1)以及水稻的AlaAT基因(GenBankNo.AB007405.1)，还可以是未经优化或者优化后的基因序列的片段。

本发明还提供一种利用作物种子胚乳生产茶氨酸的方法，包括：利用所述的方法构建转基因作物；获取所述转基因作物的种子胚乳，从所述种子胚乳中分离提取茶氨酸。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用改造的pCambia1300e构建了一个T-DNA区中含有在种子胚乳中合成茶氨酸所需的两个关键酶重组基因(rAlaDC和rTS，通过2A肽编码序列连接为rAlaDC-2A-rTS)以及促进基因AlaAT，并且rAlaDC-2A-rTS基因和AlaAT基因分别用水稻胚乳特异启动子控制的多基因载体(双元载体)。通过农杆菌介导的方法，把聚合三个目的基因的多基因载体转入水稻获得转基因水稻株系。这三个目的基因在胚乳中特异表达，在胚乳中特异合成积累茶氨酸效率较高(达94.54μg/g)的转基因水稻，其水稻种子可直接食用或作为原材料进行提取加工。

本发明首次实现茶氨酸在作物(尤其是水稻)胚乳中的合成，其产品即可以直接食用，也可以作为生产茶氨酸的原料，本发明对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。另外，本发明可以实现在作物种子胚乳合成积累有用活性物质或营养物质(茶氨酸)，因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了技术方法，具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为转基因作物种子胚乳中合成茶氨酸的途径，黑色细实线箭头代表水稻胚乳中存在的反应；黑色虚线箭头代表水稻胚乳中不存在的反应；黑色粗实线箭头代表导入外源转基因表达的酶催化的反应；

图2为含一至三个茶氨酸合成通路关键基因(rAlaDC、rTS和AlaAT)的多基因载体p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA的结构示意图；T-DNA区的HPT为抗潮霉素基因；

图3为对导入p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA的水稻转化体基因组DNA的三个外源基因(ORF)的PCR检测；NGZ(WT)为野生型对照基因组DNA；p1300-D#1、#2、#3，p1300-DT#1、#2、#3，p1300-DTA#1、#2、#3分别为携带三种表达载体的水稻基因组DNA；

图4为以RT-PCR对p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA水稻转化体的授粉后20天发育种子的三个外源基因的表达检测；NGZ(WT)为野生型对照；以水稻Actin1作为内参基因；

图5为合成茶氨酸或其中间代谢物的p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA转基因水稻糙米的外观；野生型为受体品种南桂占；标尺为1厘米；

图6为LC-MS检测p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA转基因水稻种子胚乳中的代谢物；

图7为p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA转基因水稻种子胚乳中的茶氨酸含量；ND表示未检测到。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1一种在水稻胚乳中生产茶氨酸的转基因育种方法

本实施例在AlaDC和TS基因基础上叠加AlaAT基因可以显著性增加胚乳中茶氨酸的产量，具体建立了一种在水稻胚乳中生产茶氨酸的转基因育种方法，包括以下步骤：

1、三个关键基因表达盒的构建

1.1两个必需基因(rAlaDC和rTS)编码区的合成

以茶树的AlaDC基因(GenBank No.MN241445.1)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon Optimization Tool程序优化密码子，合成获得SEQ ID NO:1所示DNA序列的rAlaAT，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以茶树的TS基因(GenBankNo.JQ925872.1)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon OptimizationTool程序优化密码子，合成获得SEQ ID NO:2所示DNA序列rTS，克隆到质粒载体，测序确定其序列。

rAlaAT(SEQ ID NO:1)：

ATGGAGGGGACGGTGAGCGTGCTGAGCAACGTGAGCAAGGTGGAGCTGCTGAGCAAGTGCTTCGACCTGATCACCATCCCGGTGGAGCCGCTGCCGCCGGTTGTGGCTTCCAACGGGGTGGCGGGGGGGGAAACCAAAAAGATGAAAGAAAAAGACATCGTGCTCGGCAAAAACGTGCACACCACCTCCTTGACCATCACGGAGCCAGACGTCGATGACGATTCCACCAGCGATATGGAGGCGTTCATGGCCGGGGTGCTGGTGAGGTACAGGAAGACCCTCATCGAAAAAACCAAGTACCACCTCGGCTACCCGTTCAACCTCGACCTCGACTACGGCCCGCTCGCCGAGCTGCAGCACTTCGCCATCAACAACCTCGGCGACCCGTTCATCGAGTCCAACTACGGCGTGCACTCCCGCCAGTTCGAGGTGGGCGTGCTCGACTGGTTCGCCCGCCTCTGGGAGATCGAGCAGAAGGAGTACTGGGGCTACATCACCAACGGCGGCACCGAGGGCAACCTCCACGGCATCCTCGTGGGCCGCGAGGTGTTCCCGGACGGCATCTTCTACACCTCCCGCGAGTCCCACTACTCCATCTTCAAGGCCGCCCGCATGTACCGCATGGAGTGCGTGAAGGTGGGCACCCTCATCAACGGCGAGATCGACTGCGCCGACTTCAAGGCCAAGCTCCTCTCCAACAAGGACAAGCCGGCCATCATCAACCTCAACATCGGCACCACCGTGAAGGGCGCCGTGGACGACATCGACCTCGTGATCCAGACCCTCGAAGAGTGCGGCTTCTCCCACGACCGCTTCTACATCCACTGCGACGGCGCCCTCTTCGGCTTCATGATGCCGTTCCTCAACCGCGGCCCGAAGATCACCTTCAAGAAGCCGATCGGCTCCGTGTCCGTGTCCGGCCACAAGTTCATGGGCTGCCCGACCCCGTGCGGCGTGCAGATCACCCGCCTCGAACACATCAACGCCCTCTCCCGCAACGTGGAGTACCTCGCCTCCCGCGACGCCACCATCACCGGCTCCCGCAACGGCCACTCCCCGATCATCCTCTGGTACGCCCTCAACCGCAAGGGCTTCAAGGGCTTCCAGAAGGAGGTGCAGAAGTGCCTCCGCAACGCCCACTACCTCAAGGACCGCCTCCGCGAGGCCGGCATCTCCGCCATGCTCAACGAGCTGTCCTCCACCGTGGTGTTCGAGCGCCCGCTCGACGAGGAGTTCGTGCGCCGCTGGCAGCTCGCCTGCGAGGGCAACATGGCCCACGTGATCGTGATGCCGAACGTGACCATCGAGAAGCTCGACGAGTTCCTCAACGAGCTGGTGCAGAAGCGCGCCAACTGGTACAACGACGGCAAGGCCGGCCCGCCGTGCCTCGCCCCGGACATCGGCTCCGAGAACTGCGACTGCGACCTCCACAAGTGA.

rTS基因编码区序列(SEQ ID NO：2)

ATGGAGAAGTTCGCGGAGCTGAGGGAGGTGGTGGAGGGGGTGGAGGTGGTGGACGCGCACGCACACAACCTGGTGGCCTTGGACAGCACCTTGCCGTTCTTGCAGTGTTTCAGTGAGGCGTACGGCGACGCCCTGCTTTTGGCGCCGCACGCTTTGAATTTTAAGAGGGGCATTCGCGATATCGCCGAGTTGTACGGTTCCGAGCTGTCCCTTGACGGTATCCAGAAGTACCGCAAAGGCAATGGACTCCAATCCATCTCCTCCATCTGTTTTAAGGCCGCCCGAATTGCCGCCATCTTGATTGACGACGGCATCGAGTTTGATAAGATGCACGACATCGAGTGGCACCGCAACTTTGCCCCGGTCGTGGGCCGCATCCTCCGCATTGAGCACCTCGCCGAGAAGATCCTCGACGAGGGCCGCCCGGATGGCAGTACCTGGACCTTGGACTCTTTCACAGAGACCTTCATCGGTAAACTCAAATCCGTGGCCAACAAAATAGTGGGGCTCAAGTCCATTGCCGCCTACTGCAGCGGGCTCGAAATTAACACCAACGTGACCAGGAAAGAGGCGCAAGCCGGCCTGGTGGAGGTGCTCAACGCCGGAAGTCCGGTGCGCATCACGAACAAGAACTTCATCGATTACCTCTTCGTTCAAAGCCTCGAAGTGGCCATTCAGTACGACCTGCCGATGCAGATACACACCGGCTTCGGCGACAAGGACCTCGACCTCCGCCTCTCCAACCCCCTCCACCTCCGCACCCTTCTTGAGGACAAGCGCTTTTCCAAGTGCCGCCTCGTGCTCCTTCACGCCTCCTACCCATTCTCCAAGGAGGCCTCCTACCTCGCCTCCATCTACTCCCAAGTCTACCTCGACTTCGGCCTCGCCGTTCCGAAGCTCTCCGTCCACGGTATGATCTCCTCCGTCAAGGAGTTGCTCGAACTCGCCCCGATCAAGAAGGTTATGTTCTCCACCGATGGCTATGCCTTCCCGGAGACCTTCTACCTCGGCGCCAAACGCGCCCGCGAGGTGGTTTTCTCCGTGCTCTGTGATGCCTGCATCGATGGCGACCTCTCCATTCCGGAGGCCATAGAGGCGGCCAAAGACATCTTTTCCGAGAACGCCAAGAAGTTCTACAAGATTAATCTGTATCTCAAGCCGTTTGACAGCAAGATCAACGAAGTGTGCAAAGTCGTGAAGATGGAGACCGACACCGTGCAGTCCGACGTGGCCTTCGTGAGGATCATCTGGGTGGACGTGTCCGGCCAGCACCGCTGCCGTGCTGTGCCAAGGAAGAGATTCCACGACGTGGTGGTGAAGAACGGCCTCGGCCTCACCGTGGCCTGTATGGCCATGAGCAGCGCCACTGATTGTCCGGCCGACGAGACCAACCTCACCGGCGTGGGCGAAATAAGGCTCATCCCAGATTTGAGTACAAAATGCATCATCCCGTGGGCCAAGCAGGAGGAGATGGTGTTGGGGGACATGCACCTCAAGCCGGGGGAAGCCTGGGAGTACTGCCCGAGGGAGGCGCTCCGCAGGGTGTCAAAGATCCTCAATGACGAGTTCAACCTGGTGATGTACGCGGGCTTTGAGAGCGAATTTTACCTCCTCAAGTCCGCCCTGAGGGAGGGCAAGGAAGAGTGGTTTAGCTTCGACATGACCCCATATTGCAGCGCCTCCGCCTTCGACGCGGCCTCTCCAGTGCTTCACGAGGTGGTGGCCGCCCTCCAGTCCCTCAACATAGCCGTGGAACAGCTGCACTCCGAGGCTGGCAAGGGCCAGTTCGAGCTGGCCCTCGGATACACCCTCTGCTCCAACGCTGCCGACAACCTTATCTTTACACGCGAGGTCGTGCGCTCCGTGGCGAGGAAACACGGCCTCCTGGCGACATTCATGCCGAAGTATGCTCTCGACGACGTGGGCTCCGGCTCCCACGTCCATCTTTCCCTTTGGGAGAACGGCAAGAACGTGTTCATGGCGAGTGGAGGACACTCCAAACACGGAATGTCCAAAGTCGGCGAGGAATTTATGGCCGGCGTGCTTAACCACCTCCCGTCCATCCTCGCTTTCACCGCACCGATCCCAAATTCCTACGACAGGATTGTGCCGAACATGTGGAGCGGCGCCTACCAGTGCTGGGGCAAGGAAAACAGAGAAGCCCCACTCCGCACCGCCTGCCCCCCAGGAGTTCCAAACGGCGTCGTGTCCAACTTTGAGATCAAGGCCTTCGACGGCTGCGCGAACCCGCACCTCGGCCTTGCTGCGATCATCGCCGCCGGCATCGACGGCCTGCGCAGACATCTGTCCCTCCCGGAGCCGATTGACACCAACCCGCACTCCCTTGGCACCGAAATCAAGCGCCTTCCAGAATCCCTCTCCGAGTCCGTGGAGGCCCTCGACAAAGATGGCATTTTCAAAGACCTCATCGGCGAGAAACTCCTCGTGGCCATACGCGGCATCCGCAAAGCCGAGATCGCCTTCTACAGCGAGAACAAGGACGCCTATAAGCAGCTCATACACAGGTACTGA.

1.2上游关键功能基因AlaAT的克隆

以水稻的AlaAT基因(GenBank No.AB007405.1)为模板，以水稻叶片cDNA为模板，设计引物扩增AlaAT基因CDS，获得SEQ ID NO:3所示DNA序列的AlaAT，克隆到质粒载体，测序确定其序列。所用引物如下：

引物F-AlaAT ORF：5'-ATGGCTGCTCCCAGCGTCGC-3'；

引物R-AlaAT ORF：5'-TCAGTCGCGGTACGCTGCCAT-3'；

扩增AlaAT基因约1.5kb的编码框。

扩增体系：2x Phanta Max Buffer，15μL；10mM dNTP Mix，0.6μL；Phanta Max，0.4U；10μM F和R引物对，0.9μL(终浓度0.3μM)；ddH₂O补足到30μL。

所用扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min/kb，共30个循环；最后72℃再延伸3min。

AlaAT基因编码区序列(SEQ ID NO：3)：

ATGGCTGCTCCCAGCGTCGCCGTCGACAACCTCAACCCCAAGGTTTTGAATTGTGAGTATGCAGTGCGTGGAGAGATTGTGATCCATGCTCAGCGCCTGCAGCAACAGCTACAGACTCAACCAGGGTCTCTTCCTTTTGATGAGATCCTATACTGCAACATTGGGAATCCCCAGTCTCTTGGTCAGAAGCCAGTTACATTCTTCAGGGAGGTTATTGCTCTTTGTGATCATCCATGCTTGTTGGAAAAGGAGGAAACCAAATCATTGTTCAGTGCTGATGCCATTTCTCGAGCAACAACAATTCTTGCCTCGATTCCTGGAAGAGCAACTGGAGCATACAGCCACAGCCAGGGCATCAAAGGGCTGCGTGATGCAATTGCTGCTGGAATTGCATCACGTGACGGATACCCTGCAAATGCAGACGACATTTTCCTTACTGACGGAGCAAGCCCTGGAGTTCACATGATGATGCAGTTACTGATAAGGAACGAGAAAGATGGCATTCTCTGCCCAATTCCTCAATATCCTTTGTACTCAGCCTCCATTGCTCTTCATGGTGGAGCTCTTGTCCCGTATTATCTTAATGAATCAACAGGCTGGGGTTTGGAGATCTCTGACCTTAAGAAGCAACTCGAAGATTCTCGGTTGAAAGGCATTGATGTTAGGGCTTTGGTAGTTATCAATCCAGGAAATCCAACTGGGCAGGTTCTTGCTGAGGAAAACCAACGGGACATAGTGAAGTTCTGCAAAAATGAGGGACTTGTTCTTCTGGCTGATGAGGTGTACCAAGAGAACATCTATGTTGACAACAAGAAATTTAACTCTTTCAAGAAGATAGCGAGATCCATGGGATACAACGAGGATGATCTCCCTTTAGTATCATTTCAATCTGTTTCTAAGGGATATTATGGTGAATGTGGCAAAAGAGGAGGCTACATGGAGATTACTGGCTTCAGTGCTCCAGTTAGAGAGCAGATCTACAAAGTGGCGTCAGTGAACTTATGTTCCAATATCACTGGCCAGATCCTTGCCAGCCTCGTCATGAATCCACCAAAGGCTGGAGATGCATCATATGCTTCATACAAGGCAGAGAAAGATGGAATCCTCCAATCATTAGCTCGCCGTGCAAAGGCATTGGAGAATGCTTTCAACAGTCTTGAGGGAATTACATGCAACAAAACTGAAGGAGCAATGTACCTCTTCCCTCAGCTTAGTCTGCCACAAAAGGCAATTGACGCTGCTAAAGCTGCTAACAAAGCACCTGATGCTTTCTATGCCCTTCGTCTCCTCGAGGCAACCGGAATTGTTGTTGTCCCTGGATCTGGATTTGGCCAAGTTCCTGGCACATGGCACATCAGATGCACAATCCTGCCACAGGAGGAGAAGATCCCCGCGATCATCTCCCGCTTCAAGGCATTCCATGAGGGCTTCATGGCAGCGTACCGCGACTGA.

1.3 2A肽编码序列F2A的合成及rAlaDC-2A-rTS融合基因的获得

根据F2A蛋白序列(GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPG)，按照单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon Optimization Tool程序优化密码子，合成获得SEQ ID NO:4所示DNA序列的F2A；通过引物扩增出rAlaDC、rTS和F2A片段，利用Gibson组装的原理(Gibson,2011,Enzymatic assembly of overlapping DNAfragments.Methods Enzymol,498:349-361.)进行连接，获得rAlaDC-2A-rTS融合基因。所用引物和扩增条件如下：

引物F-AlaDC ORF：5'-ATGGAGGGGACGGTGAGCGT-3'；

引物R-AlaDC-2AORF：

5'-TCCCCCGCCAGCTTCAGCAAGTCAAAGTTCAATGTCTGCTTCACAGATCCCTTGTGGAGGTCGCAGT-3'；

扩增AlaDC基因和部分F2A序列，约1.5kb。

引物F-2A-TS ORF：

5'-TGAAGCTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAACCCGGGGCCTGGCTCTATGGAGAAG TTCGCGGAGCT-3'；

引物R-TS ORF：5'-TCAGTACCTGTGTATGAGCTGC-3'；

扩增TS基因和部分F2A序列，约2.6kb。

扩增体系和扩增程序同上述1.2中的扩增体系和扩增程序。

F2A的编码序列(SEQ ID NO:4)：

GGATCTGTGAAGCAGACATTGAACTTTGACTTGCTGAAGCTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAACCCGGGGCCTGGCTCT.

2、水稻胚乳特异合成茶氨酸及其上游代谢物的多基因载体p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA的组装

多基因载体为经改造的pCambia1300e载体，包含多克隆位点Asc I-Swa I-Sac I-Mlu I-Pac I-Sbf I，可用于多基因表达盒组装；包含HPT表达盒，可用于作物遗传转化筛选。

2.1含rAlaDC的表达载体p1300-D构建

利用限制性内切酶Asc I酶切pCambia1300e，获得载体骨架片段a；以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBank No.BAC83236.1)约1.5kb的启动子Pens1(SEQ ID NO:5)，作为片段b；扩增rAlaDC基因，作为片段c；从质粒pSAT3(GenBankNo.DQ005465)扩增manopine synthase终止子Tmas(SEQ ID NO:7)作为片段d。每个片段两侧，分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法(Zhu et al.,2014,Robust multi-type plasmid modifications based on isothermalin vitro recombination.Gene,548:39-42.)，获得含rAlaDC基因表达盒的载体p1300-D(见图2)。所用引物如下：

引物F-Pens1：

5'-CAATCGCACTGGAAACATCAAGGTCTACAGGGTTCCTTGCGTGAAG-3'；

引物R-Pens1：

5'-TCAGCACGCTCACCGTCCCCTCCATAGCTATTTGAGGATGTTATTGGAAACT-3'；

扩增Pens1启动子约1.5kb的序列，即片段b。

引物F-Pens1-rAlaDC：

5'-TTCCAATAACATCCTCAAATAGCTATGGAGGGGACGGTGAGCGT-3'；

引物R-rAlaDC-Tmas：

5'-CCAAGATTTCGAGATCAGGTACGCGTTCACTTGTGGAGGTCGCAGTCGCAGT-3'；

扩增rAlaDC基因约1.4kb的编码框，即片段c。

引物F-Tmas：

5'-CTGCGACCTCCACAAGTGAACGCGTACCTGATCTCGAAATCTTGG-3'；

引物R-Tmas：

5'-GCCTGCAGGTTAATTAAGGCGCGCCGATCTGATAATTTATTTGAA-3'；

扩增Tmas终止子约0.3kb的序列，即片段d。

上述扩增体系均为：2x Phanta Max Buffer，15μL；10mM dNTP Mix，0.6μL；PhantaMax，0.4U；10μM F和R引物对，各0.9μL(终浓度0.3μM)；ddH₂O补足到30μL。

启动子Pens1序列(SEQ ID NO：5)：

TACAGGGTTCCTTGCGTGAAGAAGGGTGGCCTGCGGTTCACCATTAACGGTCACGACTACTTCCAGCTAGTACTGGTGACCAACGTCGCGGCGGCAGGGTCAATCAAGTCCATGGAGGTTATGGGTTCCAACACAGCGGATTGGATGCCGATGGCACGTAACTGGGGCGCCCAATGGCACTCACTGGCCTACCTCACCGGTCAAGGTCTATCCTTTAGGGTCACCAACACAGATGACCAAACGCTCGTCTTCACCAACGTCGTGCCACCAGGATGGAAGTTTGGCCAGACATTTGCAAGCAAGCTGCAGTTCAAGTGAGAGGAGAAGCCTGAATTGATACCGGAGCGTTTCTTTTGGGAGTAACATCTCTGGTTGCCTAGCAAACATATGATTGTATATAAGTTTCGTTGTGCGTTTATTCTTTCGGTGTGTAAAATAACATACATGCTTTCCTGATATTTTCTTGTATATATGTACACACACACGACAAATCCTTCCATTTCTATTATTATTGAACAATTTAATTGCGAGGGCGAGTACTTGTCTGTTTACCTTTTTTTTTTCAGATGGCATTTTATAGTTTAACCTTTCATGGACCGGCAGTAGTTCTAACCATGAATGAAAAGAAATCATAGTCCACACCACGCAGGGACATTGTGGTCATTTTAGACAAGACGATTTGATTAATGTCTTGTATGATATGGTCGACAGTGAGGACTAACAAACATATGGCATATTTTATTACCGGCGAGTTAAATAAATTTATGTCACAGTAATAAACTGCCTAATAAATGCACGCCAGAAAATATAATGATAAAAAAAAGAAAAGATACATAAGTCCATTGCTTCTACTTTTTTAAAAATTAAATCCAACATTTTCTATTTTTTGGTATAAACTTGGAAGTACTAGTTGGATATGCAAAATCATCTAACCTCCATATATTTCATCAATTTGTTTACTTTACATATGGGAGAGGATAGTATGTCAAAGAAAATGACAACAAGCTTACAAGTTTCTTATTTTAAAAGTTCCGCTAACTTATCAAGCATAGTGTGCCACGCAAAACTGACAACAAACCAACAAATTTAAGGAGCGCCTAACTTATCATCTATGACATACCGCACAAAATGATAACATACTAGAGAAACTTTATTGCACAAAAGGAAATTTATCCATAAGGCAAAGGAACATCTTAAGGCTTTGGATATACATTTACCAACAAGCATTGTTTGTATTACCCCTAAAGCGCAAGACATGTCATCCATGAGTCATAGTGTGTATATCTCAACATTGCAAAGCTACCTTTTTTCTATTATACTTTTCGCATTATAGGCTAGATATTATCTATACATGTCAACAAACTCTATCCCTACGTCATATCTGAAGATTCTTTTCTTCACTATATAAGTTGGCTTCCCTGTCATTGAACTCACATCAACCAGCCCAAGTTTCCAATAACATCCTCAAATAGCTCAACCAGCCCAAGTTTCCAATAACATCCTCAAATAGCT.

终止子Tmas(SEQ ID NO：7)：

ACCTGATCTCGAAATCTTGGACTCCCATGTTGGCAAAGGCAACCAAACAAACAATGAATGATCCGCTCCTGCATATGGGGCGGTTTGAGTATTTCAACTGCCATTTGGGCTGAATTGAAGACATGCTCCTGTCAGAAATTCCGTGATCTTACTCAATATTCAGTAATCTCGGCCAATATCCTAAATGTGCGTGGCTTTATCTGTCTTTGTATTGTTTCATCAATTCATGTAACGTTTGCTTTTCTTATGAATTTTCAAATAAATTATCAGATC.

2.2含rAlaDC和rTS的表达载体p1300-DT构建

利用限制性内切酶Asc I酶切pCambia1300e，获得载体骨架片段a；以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBank No.BAC83236.1)约1.5kb的启动子Pens1(SEQ ID NO:5)，作为片段b；扩增rAlaDC-2A-rTS融合基因，作为片段c；从质粒pSAT3扩增manopine synthase终止子Tmas作为片段d。每个片段两侧，分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含rAlaDC和rTS基因表达盒的载体p1300-DT(见图2)。所用引物如下：

引物F-Pens1：

5'-CAATCGCACTGGAAACATCAAGGTCTACAGGGTTCCTTGCGTGAAG-3'；

引物R-Pens1：

5'-TCAGCACGCTCACCGTCCCCTCCATAGCTATTTGAGGATGTTATTGGAAACT-3'；

扩增Pens1启动子约1.5kb的序列，即片段b。

引物F-Pens1-rAlaDC：

5'-TTCCAATAACATCCTCAAATAGCTATGGAGGGGACGGTGAGCGT-3'；

引物R-TS-Tmas：

5'-GGAGTCCAAGATTTCGAGATCAGGTTCAGTACCTGTGTATGAGCT-3'；

扩增rAlaDC-2A-rTS融合基因约4.1kb的编码框，即片段c。

引物F-Tmas-1：

5'-TAAGCAGCTCATACACAGGTACTGAACCTGATCTCGAAATCTTGG-3'；

引物R-Tmas：

5'-GCCTGCAGGTTAATTAAGGCGCGCCGATCTGATAATTTATTTGAA-3'；

扩增Tmas终止子约0.3kb的序列，即片段d。

扩增体系和扩增程序同上述2.1的扩增体系和扩增程序。

2.3含rAlaDC、rTS和AlaAT的表达载体p1300-DTA构建

利用限制性内切酶Mlu I酶切p1300-DT，获得载体骨架片段a；以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBank No.BAC19997.1)约2.4kb的启动子Pens2(SEQ ID NO:6)，作为片段b；扩增AlaAT基因，作为片段c；从质粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(GenBank No.KR029109.1)扩增nopaline synthase终止子Tnos(SEQ ID NO:8)作为片段d。每个片段两侧，分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含rAlaDC、rTS和AlaAT基因表达盒的载体p1300-DTA(见图2)。所用引物如下：

引物F-Pens2：

5'-GAATTTTCAAATAAATTATCAGATCACAGATTCTTGCTACCAACAAC-3'；

引物R-Pens2：

5'-CGACGGCGACGCTGGGAGCAGCCATAGCTATTTGTACTTGCTTATGGAAAC-3'；

扩增Pens2启动子约2.4kb的序列，即片段b。

引物F-Pens2-AlaAT：

5'-TTTCCATAAGCAAGTACAAATAGCTATGGCTGCTCCCAGCGTCGC-3'；

引物R-AlaAT-Tnos：

5'-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACGGCGCGCCTCAGTCGCGGTACGCTGCCAT-3'；

扩增AlaAT基因约1.5kb的编码框，即片段c。

引物F-Tnos：

5'-GCAGCGTACCGCGACTGAGGCGCGCCGTTCAAACATTTGGCAATA-3'；

引物R-Tnos：

5'-GTATCCTGGCCTGCAGGTTAATTAACCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3'；

扩增Tnos终止子约0.3kb的序列，即片段d。

扩增体系和扩增程序同上述2.1的扩增体系和扩增程序。

启动子Pens2序列(SEQ ID NO：6)：

ACAGATTCTTGCTACCAACAACTTCACAAAGTAGTAGTCAACCAAAACTATGCTAAGGAATCACCTCACTTCCGCCCATGACCGTGAGCACGACTGTTCAAACAGTTTGTTAATCTCTACAAAGAAGGTACACTTTACCTACACAACGCCACTAACCTGAGTTACCCAGCCCATGCAAAATAGCCACGTCTTGTGACTTAAGGGATTTCGCGACAAGGCATTTCGAAAGCCCACACAAGGACACCTTATGAAAACTGGAGGGGTCCCACAGACCAACAACAAGTTAGGTCCCAAACCATGTTGTGCCAGGAAAAATCCAAGGGGTCCTCCCCAACACCACCCCGACAAATCCACTTGTCCATTGGCATCAAGATTTGCCTGACCTAGCTAATTACTCAGCCAGGCATGTCACAATTCACCCATGTGGTCACACATGTTAGGTTGGAGAAATTCTAAAGGAAAGGAATCGGTCCATATGAGCAAGACCGAGAAACCATACCACCAGTACTTCTACCGAAATACGAGTTTAGTAAACTCATTTGTTTTCAAGGCACCCGACCCAGGTGTGTCGGGTTTTCCAGGGATTTTGTAAACCCAAGTTTTACCCATAGTTGATCATTCAAATTTTGAGGAGGGTCATTGGTATCCGTACCTGAGGGCACGAATACTGAGACCTAGCATTGTAGTCGACCAAGGAGGTTAATGCAGCAATTGTAGGTGGGGCCTGTTGGTTATATTGCAAACTGCGGCCAACATTTCATGTGTAATTTAGAGATGTGCATTTTGAGAAATGAAATACTTAGTTTCAAATTATGGGCTCAAATAATGAAAGGTGACCTACCTTGCTTGATATCTTGAGCTTCTTCCTCGTATTCCGCGCACTAGGAGATCTTCTGGCTCCGAAGCTACACGTGGAACGAGATAACTCAACAAAACGACCAAGGAAAAGCTCGTATTAGTGAGTACTAAGTGTGCCACTGAATAGATCTCGATTTTTGAGGAATTTTAGAAGTTGAACAGAGTCAATCGAACAGACAGTTGAAGAGATATGGATTTTCTAAGATTAATTGATTCTCTGTATAAAGAAAAAAAGTATTATTGAATTAAATGGAAAAAGAAAAAGGAAAAAGGGGATGGCTTCTGCTTTTTGGGCTGAAGGCGGCGTGTGGCCAGCGTGCTGCGTGCGGACAGCGAGCGAACACACGACGGAGCAGCTACGACGAACGGGGGACCGAGTGGACCGGACGAGGATGTGGCCTAGGACGAGTGCACAAGGCTAGTGGACTCGGTCCCCGCGCGGTATCCCGAGTGGTCCACTGTCTGCAAACACGATTCACATAGAGCGGGCAGACGCGGGAGCCGTCCTAGGTGCACCGGAAGCAAATCCGTCGCCTGGGTGGATTTGAGTGACACGGCCCACGTGTAGCCTCACAGCTCTCCGTGGTCAGATGTGTAAAATTATCATAATATGTGTTTTTCAAATAGTTAAATAATATATATAGGCAAGTTATATGGGTCAATAAGCAGTAAAAAGGCTTATGACATGGTAAAATTACTTACACCAATATGCCTTACTGTCTGATATATTTTACATGACAACAAAGTTACAAGTACGTCATTTAAAAATACAAGTTACTTATCAATTGTAGTGTATCAAGTAAATGACAACAAACCTACAAATTTGCTATTTTGAAGGAACACTTAAAAAAATCAATAGGCAAGTTATATAGTCAATAAACTGCAAGAAGGCTTATGACATGGAAAAATTACATACACCAATATGCTTTATTGTCCGGTATATTTTACAAGACAACAAAGTTATAAGTATGTCATTTAAAAATACAAGTTACTTATCAATTGTCAAGTAAATGAAAACAAACCTACAAATTTGTTATTTTGAAGGAACACCTAAATTATCAAATATAGCTTGCTACGCAAAATGACAACATGCTTACAAGTTATTATCATCTTAAAGTTAGACTCATCTTCTCAAGCATAAGAGCTTTATGGTGCAAAAACAAATATAATGACAAGGCAAAGATACATACATATTAAGAGTATGGACAGACATTTCTTTAACAAACTCCATTTGTATTACTCCAAAAGCACCAGAAGTTTGTCATGGCTGAGTCATGAAATGTATAGTTCAATCTTGCAAAGTTGCCTTTCCTTTTGTACTGTGTTTTAACACTACAAGCCATATATTGTCTGTACGTGCAACAAACTATATCACCATGTATCCCAAGATGCTTTTTTATTGCTATATAAACTAGCTTGGTCTGTCTTTGAACTCACATCAATTAGCTTAAGTTTCCATAAGCAAGTACAAATAGCT.

Tnos终止子(SEQ ID NO：8)：

CGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG.

3、多基因载体p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA的水稻转化与检测

3.1水稻的遗传转化

把多基因载体p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA质粒分别转入农杆菌EHA105，用于转化水稻胚愈伤组织。将水稻未成熟种子或成熟种子，在25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。用适量的农杆菌悬浮于加有100μmol/L乙酰丁香酮的侵染液培养基中，28℃震荡培养(200rpm，0.5h)，用分光光度计调OD₅₅₀值为0.3～0.4，即可用于愈伤组织的浸染。挑选颜色新鲜呈淡黄色、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织，和农杆菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后转到共培养培养基，暗培养3天后，转移到含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，每2周继一次代，继代2次。抗性筛选后，把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基上，分化出转化苗，获得转化植株。

上述涉及的培养基组分及用量如下：

侵染液培养基：10×MS_macro母液100mL，1000×B5_micro母液1mL，100×B5_vit母液10mL，2,4-D 2mg，水解酪蛋白500mg，肌醇2g，蔗糖30g，乙酰丁香酮100μmol，pH调节为5.5，ddH₂O补足到1L。

共培养培养基：10×MS_macro母液100mL，1000×B5_micro母液1mL，100×B5_vit母液10mL，2,4-D 2mg，水解酪蛋白500mg，肌醇2g，蔗糖30g，乙酰丁香酮100μmol，琼脂8g,pH调节为5.5，ddH₂O补足到1L。

筛选培养基：10×N6_macro母液100mL，1000×B5_micro母液1mL，100×B5_vit母液10mL，2,4-D 2mg，水解酪蛋白300mg，L-脯氨酸500mg，L-谷氨酰胺500mg，蔗糖30g，琼脂8g，pH调节为5.8，ddH₂O补足到1L；高温灭菌后冷却，加入1000×头孢曲松钠(cef)，1000×羧苄青霉素(carb)，1000×潮霉素(Hm)抗生素各1mL。

分化培养基：10×N6_macro母液100mL，1000×MS_micro母液1mL，100×B5_vit母液10mL，BA 3mg，NAA 1mg，山梨醇18.2g，蔗糖20g，琼脂8g，pH调节为5.8，ddH₂O补足到1L。

3.2转化植株基因组PCR检测

用SDS法抽提T₀代植株叶片基因组DNA作为模板，用PCR扩增方法，分别检测外源rAlaDC、rTS和AlaAT转基因。所用引物如下：

引物F-rAlaDC：5'-ATGGAGGGGACGGTGAGCGT-3'；

引物R-rAlaDC：5'-CTTGTGGAGGTCGCAGTCGC-3'；

扩增rAlaDC基因约1.4kb的编码框。

引物F-rTS：5'-ATGGAGAAGTTCGCGGAGCT-3'；

引物R-rTS：5'-TCAGTACCTGTGTATGAGCTGC-3'；

扩增rTS基因约2.5kb的编码框。

引物F-AlaAT：5'-ATGGCTGCTCCCAGCGTCGC-3'；

引物R-AlaAT：5'-GTTAATTAACCTGCAGGATT-3'；

扩增AlaAT基因约1.5kb的编码框。

所用扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃再延伸3min。

结果显示，野生型(WT)对照均不能扩出外源基因，转基因植株均能扩出上述三个基因(见图3)。

转基因植株T₁种子的RT-PCR检测：把转基因植株的T₁代授粉后20天的种子，在液氮条件下研磨成粉末，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用TransScript cDNA合成试剂盒反转录得到cDNA，用如下引物和扩增条件进行rAlaDC、rTS和AlaAT基因的RT-PCR检测，以水稻内源Actin 1基因作为内参。所用引物如下：

引物F-RT-rAlaDC：5'-GGCAACATGGCCCACGTGAT-3'；

引物R-RT-rAlaDC：5'-TTGTACCAGTTGGCGCGCTT-3'；

用作rAlaDC基因的表达检测。

引物F-RT-rTS：5'-TCCAGAATCCCTCTCCGAGT-3'；

引物R-RT-rTS：5'-GCGATCTCGGCTTTGCGGAT-3'；

用作rTS基因的表达检测。

引物F-RT-AlaAT：5'-CTCGAGGCAACCGGAATTGT-3'；

引物R-RT-AlaAT：5'-GATCGCGGGGATCTTCTCCT-3'；

用作AlaAT基因的表达检测。

所用扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，共40个循环。

结果显示，对照野生型种子不能检测到外源rAlaDC和rTS基因的表达，能检测到内源AlaAT基因表达；而转基因种子能检测到rAlaDC、rTS和AlaAT基因的表达，且AlaAT基因的表达量显著高于野生型(见图4)。

实施例2转基因水稻胚乳中茶氨酸及其中间代谢物的质谱鉴定及含量检测

1、转基因水稻种子外观的观察

与野生型种子相比，导入p1300-D、p1300-DT和p1300-DTA的转基因水稻种子糙米(去除谷壳)并无显著性差异(见图5)，表明转基因并不会影响水稻种子的外观品质。

2、转基因水稻种子茶氨酸的提取与液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定

取0.1g水稻种子在冰上研磨成粉末，加入4mL含0.001M HCl的20％乙醇溶液；低温水浴超声波震荡30min，4℃12000g离心5min，取上清液，沉淀加入4mL提取液重新提取1次；合并两次上清，定容至10mL；充分混匀，吸取1mL液体，过0.22μm水相滤膜，再注入到2mL棕色取样瓶，进样量20μL，用Information-HILICZ(2.7um,3.0*100)色谱柱进行分析。流动相为A：75％乙腈；B：0.1mol/L醋酸钠。色谱条件为柱温35℃，流速为0.3mL/min。以多种氨基酸和乙胺标准品绘制标准曲线。

结果显示，载体p1300-DTA的转基因株系能检测到茶氨酸的上游底物乙胺(45m/z)和茶氨酸(175m/z)的离子特征峰(见图6)，表明在转基因水稻种子中成功合成了茶氨酸。进一步通过HPLC对转基因种子中的乙胺和游离氨基酸含量进行定量检测。结果显示，WT和p1300-D转基因种子不含茶氨酸，p1300-DT转基因种子含有微量茶氨酸(0.81μg/g)，而p1300-DTA转基因种子则含有大量茶氨酸(94.54μg/g)，以及乙胺(8.98μg/g)(见图7)，表明在转入rAlaDC和rTS基因的基础上增加AlaAT基因的表达能显著促进茶氨酸的合成。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.与作物种子胚乳合成茶氨酸相关的基因，其特征在于，所述基因包括如下(1)或(2)任一种：

(1)AlaDC基因和TS基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示；

2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白。

3.包含权利要求1所述的基因的重组载体。

4.包含权利要求3所述的重组载体的重组菌。

5.利用权利要求1所述的基因构建种子胚乳能合成茶氨酸的转基因作物的方法，其特征在于，包括如下(1)或(2)所示任一种方法：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将外源基因导入植物的方法包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述连接肽包含2A肽，所述2A肽的编码基因序列如SEQ ID NO：4所示；

所述育种作物胚乳强表达启动子包含Pens1或Pens2，所述Pens1的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，所述Pens2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述作物包括水稻、玉米或小麦。

9.如权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌或权利要求5-8任一项所述的方法构建的转基因作物的种子胚乳在生产茶氨酸中的应用。

10.一种利用作物种子胚乳生产茶氨酸的方法，其特征在于，包括：利用权利要求5-8任一项所述的方法构建转基因作物；获取所述转基因作物的种子胚乳，从所述种子胚乳中分离提取茶氨酸。