DE60123133T2

DE60123133T2 - Positionsabhängige erkennung des gnn nucleotidtripletts durch zinkfinger

Info

Publication number: DE60123133T2
Application number: DE60123133T
Authority: DE
Inventors: Qiang Foster City LIU; Andrew San Francisco JAMIESON; Edward El Cerrito REBAR
Original assignee: Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2021-11-21
Also published as: WO2002077227A3; AU2002239295B2; ATE339501T1; DE60123133D1; CA2429555A1; WO2002042459A3; AU2002239295C1; EP1364020B1; WO2002077227A2; WO2002042459A2; US6794136B1; AU3929502A; EP1364020A2; CA2429555C

Description

HINTERGRUND
Zinkfingerproteine (ZFPs) sind Proteine, die in einer sequenzspezifischen Art und Weise an DNA binden. Zinkfinger wurden zuerst in dem Transkriptionsfaktor TFIIIA aus der Oozyte des Afrikanischen Krallenfrosches, Xenopus laevis, identifiziert. Ein beispielhaftes Motiv, das eine Klasse dieser Proteine (C₂H₂-Klasse) kennzeichnet, ist -Cys-(X)_2-4-Cys-(X)₁₂-His-(X)_3-5-His (wobei X jede Aminosäure ist) (SEQ ID NO: 1). Eine einzelne Fingerdomäne ist etwa 30 Aminosäuren lang und zahlreiche strukturelle Studien haben gezeigt, dass sie eine alpha-Helix, enthaltend die zwei invarianten Histidinreste, und zwei invariante Cysteinreste in einem beta-Turn enthält, die durch Zink koordiniert werden. Bislang wurden über 10.000 Zinkfingersequenzen in mehreren Tausend bekannten oder potentiellen Transkriptionsfaktoren identifiziert. Zinkfingerdomänen sind nicht nur in die DNA-Erkennung verwickelt, sondern auch in die RNA-Bindung und die Protein-Protein-Bindung. Derzeitige Schätzungen gehen davon aus, dass diese Molekülklasse etwa 2% aller humanen Gene ausmacht.
Die Röntgenkristallstruktur von Zif268, einer Drei-Finger-Domäne aus einem murinen Transkriptionsfaktor, wurde im Komplex mit einer verwandten DNA-Sequenz gelöst und zeigt, dass jeder Finger durch eine periodische Rotation mit dem nächsten Finger überlagert werden kann. Die Struktur legt nahe, dass jeder Finger unabhängig über einen 3 Basenpaarintervall mit der DNA wechselwirkt, wobei die Seitenketten an den Positionen –1, 2, 3 und 6 auf jeder Erkennungshelix mit den entsprechenden DNA-Triplet-Subsites in Kontakt kommen. Der Aminoterminus von Zif268 befindet sich an dem 3'-Ende des DNA-Stranges, mit welchem er die meisten Kontakte ausbildet. Einige Zinkfinger können an eine vierte Base in einem Zielsegment binden. Wenn der Strang, mit dem ein Zinkfingerprotein die meisten Kontakte ausbildet, als Zielstrang bezeichnet wird, binden einige Zinkfingerproteine an ein Drei-Basen-Triplet in dem Zielstrang und an eine vierte Base auf dem Nichtzielstrang. Die vierte Base ist komplementär zu der Base, die sich unmittelbar 3' zu der Drei-Basen-Subsite befindet.
Die Struktur des Zif268-DNA-Komplexes legt auch nahe, dass die DNA-Sequenzspezifität eines Zinkfingerproteins durch die Einführung von Aminosäuresubstitutionen an den vier Helixpositionen (–1, 2, 3 und 6) jeder der Zinkfingererkennungshelices verändert werden kann. Phage-Display-Experimente unter Verwendung von kombinatorischen Zinkfingerbibliotheken, um diese Beobachtung zu untersuchen, wurden im Jahre 1994 in einer Reihe von Veröffentlichungen publiziert (Rebar et al., Science 263, 671–673 (1994); Jamieson et al., Biochemistry 33, 5689–5695 (1994); Choo et al., PNAS 91, 11163–11167 (1994)). Kombinatorische Bibliotheken wurden mit randomisierten Seitenketten, entweder in dem ersten oder dem mittleren Finger von Zif268, konstruiert und dann verwendet, um nach einer veränderten Zif268-Bindungsstelle, bei der die entsprechende DNA-Subsite durch ein verändertes DNA-Triplet ersetzt wurde, zu selektionieren. Ferner führte die wechselseitige Beziehung zwischen der Art der eingeführten Mutationen und der resultierenden Veränderung der Bindungsspezifität zu einer unvollständigen Reihe von Substitutionsregeln zum Design von ZFPs mit veränderter Bindungsspezifität.
Greisman & Pabo, Science 275, 657–661 (1997) behandeln eine ausführliche Darstellung eines Phage-Display-Verfahrens, bei dem jeder Finger von Zif268 randomisiert und für die Bindung an eine neue Triplet-Sequenz selektioniert wird. Diese Veröffentlichung berichtet von der Selektion von ZFPs für ein nukleäres Hormon-Response-Element, eine p53-Zielstelle und eine TATA-Box-Sequenz.
Eine Anzahl von Veröffentlichungen berichtet von Versuchen, ZPFs herzustellen, um bestimmte Zielstellen zu modulieren. Beispielsweise berichten Choo et al., Nature 372, 645 (1994) von einem Versuch, ein ZFP zu entwickeln, das die Expression eines bcr-abl-Onkogens reprimieren soll. Das Zielsegment, an das die ZFPs binden sollen, ist die Neun-Basen-Sequenz 5'-GCA GAA GCC-3', die so ausgewählt wurde, dass sie die durch eine spezifische onkogene Translokation, welche die bcr- und abl-codierenden Gene fusioniert, erzeugte Verbindungsstelle überlappt. Ziel ist es, dass ein für diese Zielstelle spezifisches ZFP an das Onkogen binden soll, ohne dass es an das abl- oder bcr-Gen bindet. Die Autoren verwenden Phage-Display, um eine Minibibliothek aus voneinander verschiedenen ZFPs für eine Bindung an dieses Zielsegment zu screenen. Von einem ZFP, das so isoliert wurde, wird dann berichtet, dass es die Expression eines stabil transfizierten bcr-abl-Konstrukts in einer Zelllinie reprimieren kann.
Pomerantz et al., Science 267, 93–96 (1995) berichten von einem Versuch, ein neues DNA-bindendes Protein zu entwickeln, indem zwei Finger von Zif268 mit einer Homeodomäne von Oct-1 fusioniert werden. Das Hybridprotein wird dann mit einem Transkriptionsaktivator zur Expression als chimäres Protein fusioniert. Es wird berichtet, dass das chimäre Protein an eine Zielstelle bindet, die ein Hybrid aus den Subsites der zwei Komponenten darstellt. Die Autoren haben dann einen Reportervektor konstruiert, der ein Luciferasegen in operativer Verknüpfung mit einem Promotor und einer Hybridstelle für das chimäre DNA-bindende Protein in unmittelbarer Nähe zu dem Promotor enthält. Die Autoren berichten, dass das chimäre DNA-bindende Protein die Expression des Luciferasegens aktivieren kann.
Liu et al., PNAS 94, 5525–5530 (1997) berichten von der Erzeugung eines zusammengesetzten Zinkfingerproteins durch Verwendung eines Peptidspacers, um zwei Zinkfingerproteinkomponenten, jeweils mit drei Fingern, miteinander zu verbinden. Das zusammengesetzte Protein wird dann weiter mit einer Transkriptionsaktivierungsdomäne verbunden. Es wird berichtet, dass das resultierende chimäre Protein an eine Zielstelle bindet, die aus den Zielsegmenten, die durch die zwei Zinkfingerproteinkomponenten gebunden werden, gebildet wird. Es wird des Weiteren berichtet, dass das chimäre Zinkfingerprotein die Transkription eines Reportergens aktivieren kann, wenn dessen Zielstelle in ein Reporterplasmid in der Nähe eines Promotors, der operativ mit dem Reporter verbunden ist, eingebracht wird.
Choo et al., WO 98/53058, WO 98/53059 und WO 98/53060 (1998) beschreiben die Selektion von Zinkfingerproteinen, um eine Zielstelle innerhalb des HIV-Tat-Gens zu binden. Choo et al. beschreiben auch die Selektion eines Zinkfingerproteins, um eine Zielstelle, umfassend eine gewöhnliche Mutationsstelle in dem Onkogen ras, zu binden. Die Zielstelle innerhalb von ras wird demzufolge durch die Position der Mutation eingeschränkt.
Die zuvor offenbarten Verfahren zum Design von sequenzspezifischen Zinkfingerproteinen basieren häufig auf der Modularität von einzelnen Zinkfingern, d.h. der Fähigkeit eines Zinkfingers, unabhängig von der Position des Fingers in einem Multi-Finger-Protein, dieselbe Zielsubsite zu erkennen. Obwohl in vielen Fällen ein Zinkfinger unabhängig von seiner Position innerhalb eines Multi-Finger-Proteins dieselbe Sequenzspezifität behält, kann die Sequenzspezifität eines Zinkfingers in einigen Fällen von dessen Position abhängen. Beispielsweise ist es für einen Finger möglich, eine bestimmte Triplet-Sequenz zu erkennen, wenn dieser als Finger 1 eines Drei-Finger-Proteins vorliegt, jedoch ist es möglich, dass ein Finger eine unterschiedliche Triplet-Sequenz erkennt, wenn dieser als Finger 2 eines Drei-Finger-Proteins vorliegt.
Versuche, Situationen anzugehen, bei denen sich ein Zinkfinger in einer nicht-modularen Art und Weise verhält (d.h. wenn seine Sequenzspezifität von seiner Position in einem Multi-Finger-Protein abhängt), haben bislang Strategien verwendet, die eine Randomisierung von Schlüsselbindungsresten in mehreren benachbarten Zinkfingern, gefolgt von einer Selektion anwenden. Siehe beispielsweise Isalan et al. (2001), Nature Biotechnol. 19: 656–660. Verfahren zum rationalen Design von Polypeptiden, enthaltend nicht-modulare Zinkfinger, wurden bislang jedoch nicht beschrieben.
Die nachveröffentlichten Dokumente WO 01/40798 und WO 01/59450 betreffen Zinkfingerproteine, die durch die vorliegende Erfindung nicht beansprucht werden.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Offenbarung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die die positionsabhängige Erkennung von GNN-Nukleotidtriplets durch Zinkfinger berücksichtigen.
Demzufolge wird hierin ein Zinkfingerprotein bereitgestellt, das an eine Zielstelle bindet, wobei das Zinkfingerprotein einen ersten (F1), einen zweiten (F2) und einen dritten (F3) Zinkfinger, angeordnet vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge F1, F2, F3, umfasst, wobei die Zielstelle in 3'-5'-Richtung eine erste (S1), eine zweite (S2) und eine dritte (S3) Zielsubsite umfasst, wobei jede Zielsubsite die Nukleotidsequenz GNN aufweist, wobei F1 die Aminosäuresequenz QRSNLVR (SEQ ID NO: 158) umfasst, wenn S1 GAA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801) umfasst, wenn S2 GAA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801) umfasst, wenn S3 GAA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130) umfasst, wenn S1 GAG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130) umfasst, wenn S2 GAG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDNLTR (SEQ ID NO: 231) umfasst, wenn S3 GAG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S1 GAC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S2 GAC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S3 GAC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSNLAR (SEQ ID NO: 1765) umfasst, wenn S1 GAT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGNLVR (SEQ ID NO: 1442) umfasst, wenn S2 GAT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSANLSR (SEQ ID NO: 377) umfasst, wenn S3 GAT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGHLAR (SEQ ID NO: 413) umfasst, wenn S1 GGA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287) umfasst, wenn S2 GGA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287) umfasst, wenn S3 GGA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDHLAR (SEQ ID NO: 127) umfasst, wenn S1 GGG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229) umfasst, wenn S2 GGG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229) umfasst, wenn S3 GGG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSHLTR (SEQ ID NO: 705) umfasst, wenn S1 GGC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSHLAR (SEQ ID NO: 1092) umfasst, wenn S2 GGC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSHLTR (SEQ ID NO: 835) umfasst, wenn S1 GGT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGHLSR (SEQ ID NO: 1201) umfasst, wenn S2 GGT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSGHLVR (SEQ ID NO: 1425) umfasst, wenn S3 GGT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) umfasst, wenn S1 GCA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) umfasst, wenn S2 GCA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) umfasst, wenn S3 GCA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188) umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDDLQR (SEQ ID NO: 1844) umfasst, wenn S2 GCG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188) umfasst, wenn S3 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz ERGTLAR (SEQ ID NO: 131) umfasst, wenn S1 GCC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417) umfasst, wenn S2 GCC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417) umfasst, wenn S3 GCC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450) umfasst, wenn S1 GCT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450) umfasst, wenn S2 GCT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSSDLQR (SEQ ID NO: 132) umfasst, wenn S3 GCT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGALTR (SEQ ID NO: 1398) umfasst, wenn S1 GTA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGALAR (SEQ ID NO: 3339) umfasst, wenn S2 GTA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153) umfasst, wenn S1 GTG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 237) umfasst, wenn S2 GTG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153) umfasst, wenn S3 GTG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S1 GTC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S2 GTC umfasst, und F3 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S3 GTC umfasst, mit der Maßgabe, dass das Zinkfingerprotein aus keinem der beiden folgenden Zinkfingerproteine besteht, wobei jedes der beiden Zinkfingerproteine die Finger (F1), (F2) und (F3) aufweist: ein Zinkfingerprotein, bei dem (F1) RSDNLAR umfasst, (F2) QSGNLAR umfasst und (F3) DRSDLTR umfasst, und ein Zinkfingerprotein, bei dem (F1) RSDHLAR umfasst, (F2) RSDNLAR umfasst und (F3) RSDHLSR umfasst.
Dieses Disclaimer schließt die in WO 01/40798, Seite 37, Zeile 4, und WO 01/59450, Seite 73, Zeilen 23 bis 24, offenbarten Zinkfingerproteine aus.
Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Entwickeln eines Zinkfingerproteins, umfassend einen ersten (F1), einen zweiten (F2) und einen dritten (F3) Zinkfinger, angeordnet vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge F1, F2, F3, das an eine Zielstelle, umfassend in 3'-5'-Richtung eine erste (S1), eine zweite (S2) und eine dritte (S3) Zielsubsite, bindet, wobei jede Zielsubsite die Nukleotidsequenz GNN aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) das Selektionieren des Zinkfingers F1, sodass dieser an die Zielsubsite S1 bindet, wobei F1 die Aminosäuresequenz QRSNLVR (SEQ ID NO: 158) umfasst, wenn S1 GAA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130) umfasst, wenn S1 GAG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S1 GAC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSNLAR (SEQ ID NO: 1765) umfasst, wenn S1 GAT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGHLAR (SEQ ID NO: 413) umfasst, wenn S1 GGA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDHLAR (SEQ ID NO: 127) umfasst, wenn S1 GGG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 705) umfasst, wenn S1 GGC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSHLTR (SEQ ID NO: 835) umfasst, wenn S1 GGT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) umfasst, wenn S1 GCA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188) umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLQR (SEQ ID NO: 1844) umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz ERGTLAR (SEQ ID NO: 131) umfasst, wenn S1 GCC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450) umfasst, wenn S1 GCT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGALTR (SEQ ID NO: 1398) umfasst, wenn S1 GTA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153) umfasst, wenn S1 GTG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S1 GTC umfasst, (b) das Selektionieren des Zinkfingers F2, sodass dieser an die Zielsubsite S2 bindet, wobei F2 die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801) umfasst, wenn S2 GAA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130) umfasst, wenn S2 GAG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S2 GAC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGNLVR (SEQ ID NO: 1442) umfasst, wenn S2 GAT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287) umfasst, wenn S2 GGA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229) umfasst, wenn S2 GGG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSHLAR (SEQ ID NO: 1902) umfasst, wenn S2 GGC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGHLSR (SEQ ID NO: 1201) umfasst, wenn S2 GGT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) umfasst, wenn S2 GCA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417) umfasst, wenn S2 GCC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450) umfasst, wenn S2 GCT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGALAR (SEQ ID NO: 3339) umfasst, wenn S2 GTA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDALSR (SEQ ID NO: 237) umfasst, wenn S2 GTG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S2 GTC umfasst, und (c) das Selektionieren des Zinkfingers F3, sodass dieser an die Zielsubsite S3 bindet, wobei F3 die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801) umfasst, wenn S3 GAA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDNLTR (SEQ ID NO: 231) umfasst, wenn S3 GAG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395) umfasst, wenn S3 GAC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSANLSR (SEQ ID NO: 377) umfasst, wenn S3 GAT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287) umfasst, wenn S3 GGA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229) umfasst, wenn S3 GGG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSGHLVR (SEQ ID NO: 1425) umfasst, wenn S3 GGT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) umfasst, wenn S3 GCA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188) umfasst, wenn S3 GCG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417) umfasst, wenn S3 GCC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSSDLQR (SEQ ID NO: 132) umfasst, wenn S3 GCT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153) umfasst, wenn S3 GTG umfasst, und F3 die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184) umfasst, wenn S3 GTC umfasst, wodurch ein Zinkfingerprotein entwickelt wird, das an eine Zielstelle bindet.
Bei einigen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Zinkfingerproteine und Verfahren umfasst S1 GAA und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QRSNLVR (SEQ ID NO: 158). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GAA und F2 umfasst die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GAA und F3 umfasst die Aminosäuresequenz QSGNLAR (SEQ ID NO: 801). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GAG und F1 umfasst die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GAG und F2 umfasst die Aminosäuresequenz RSDNLAR (SEQ ID NO: 130). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GAG und F3 umfasst die Aminosäuresequenz RSDNLTR (SEQ ID NO: 231). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GAC und F1 umfasst die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GAC und F2 umfasst die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GAC und F3 umfasst die Aminosäuresequenz DRSNLTR (SEQ ID NO: 395). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GAT und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSSNLAR (SEQ ID NO: 1765). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GAT und F2 umfasst die Aminosäuresequenz TSGNLVR (SEQ ID NO: 1442). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GAT und F3 umfasst die Aminosäuresequenz TSANLSR (SEQ ID NO: 377). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GGA und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSGHLAR (SEQ ID NO: 413). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GGA und F2 umfasst die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GGA und F3 umfasst die Aminosäuresequenz QSGHLQR (SEQ ID NO: 287). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GGG und F1 umfasst die Aminosäuresequenz RSDHLAR (SEQ ID NO: 127). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GGG und F2 umfasst die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GGG und F3 umfasst die Aminosäuresequenz RSDHLSR (SEQ ID NO: 229). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GGC und F1 umfasst die Aminosäuresequenz DRSHLTR (SEQ ID NO: 705). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GGC und F2 umfasst die Aminosäuresequenz DRSHLAR (SEQ ID NO: 1092). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GGT und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSSHLTR (SEQ ID NO: 835). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GGT und F2 umfasst die Aminosäuresequenz TSGHLSR (SEQ ID NO: 1201). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GGT und F3 umfasst die Aminosäuresequenz TSGHLVR (SEQ ID NO: 1425). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GCA und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSGSLTR (SEQ ID NO: 342). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GCA und F2 umfasst die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GCA und F3 umfasst die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GCG und F1 umfasst die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GCG und F2 umfasst die Aminosäuresequenz RSDDLQR (SEQ ID NO: 1844). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GCG und F3 umfasst die Aminosäuresequenz RSDDLTR (SEQ ID NO: 188). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GCC und F1 umfasst die Aminosäuresequenz ERGTLAR (SEQ ID NO: 131). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GCC und F2 umfasst die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GCC und F3 umfasst die Aminosäuresequenz DRSDLTR (SEQ ID NO: 417). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GCT und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GCT und F2 umfasst die Aminosäuresequenz QSSDLTR (SEQ ID NO: 1450). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GCT und F3 umfasst die Aminosäuresequenz QSSDLQR (SEQ ID NO: 132). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GTA und F1 umfasst die Aminosäuresequenz QSGALTR (SEQ ID NO: 1398). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GTA und F2 umfasst die Aminosäuresequenz QSGALAR (SEQ ID NO: 3339). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GTG und F1 umfasst die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GTG und F2 umfasst die Aminosäuresequenz RSDALSR (SEQ ID NO: 237). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GTG und F3 umfasst die Aminosäuresequenz RSDALTR (SEQ ID NO: 153). In anderen Ausführungsformen umfasst S1 GTC und F1 umfasst die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184). In anderen Ausführungsformen umfasst S2 GTC und F2 umfasst die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184). In anderen Ausführungsformen umfasst S3 GTC und F3 umfasst die Aminosäuresequenz DRSALAR (SEQ ID NO: 184).
Bereitgestellt werden auch Polypeptide, umfassend jedes hierin beschriebene Zinkfingerprotein. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polypeptid ferner wenigstens eine funktionelle Domäne. Bereitgestellt werden auch Polynukleotide, codierend jedes hierin beschriebene Polypeptid. Demzufolge werden auch Nukleinsäuren, codierend Zinkfinger, umfassend all die oben beschriebenen Zinkfinger, bereitgestellt.
Bereitgestellt werden auch Segmente eines Zinkfingers, umfassend eine Sequenz aus sieben benachbarten Aminosäuren, wie hierin gezeigt. Bereitgestellt werden auch Nukleinsäuren, codierend jedes dieser Segmente und Zinkfinger, umfassend dieselben.
Bereitgestellt werden auch Zinkfingerproteine, umfassend erste, zweite und dritte Zinkfinger. Die ersten, zweiten und dritten Zinkfinger umfassen erste, zweite und dritte Segmente aus sieben benachbarten Aminosäuren, wie hierin gezeigt. Bereitgestellt werden auch Nukleinsäuren, codierend solche Zinkfingerproteine.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der Stellenselektionsanalyse von zwei beispielhaften Zinkfingerproteinen (die 4 linken Spalten) und Messungen der Bindungsaffinität für jedes dieser Proteine an deren beabsichtigte Zielsequenzen und an davon verschiedene Zielsequenzen (die 3 rechten Spalten). Die Analyse von ZFP1 ist in dem oberen Teil der Figur gezeigt und die Analyse von ZFP2 ist in dem unteren Teil der Figur gezeigt. Für die Stellenselektionsanalyse sind die Aminosäuresequenzen der Reste –1 bis +6 der Erkennungshelix jeder der drei Zinkfingerkomponenten (F3 (ZFP1, SEQ ID NO: 130; ZFP2, SEQ ID NO: 420), F2 (ZFP1, SEQ ID NO: 1051, ZFP2, SEQ ID NO: 889) und F1 (ZFP1, SEQ ID NO: 395; ZPF2, SEQ ID NO: 685)) in der obersten Reihe gezeigt; die beabsichtigte Zielsequenz (unterteilt in fingerspezifische Zielsubsites) ist in der zweiten Reihe gezeigt und eine Zusammenfassung der gebundenen Sequenzen ist in der dritten Reihe gezeigt. Die Daten für F3 sind in der zweiten Spalte gezeigt, die Daten für F2 sind in der dritten Spalte gezeigt und die Daten für F1 sind in der vierten Spalte gezeigt.
Für die Bindungsaffinitätsanalysen sind die entwickelten Zielsequenzen für jedes ZFP ("verwandt") und zwei dazu in Beziehung stehende Sequenzen ("Mt") gezeigt (Spalte 6), zusammen mit der K_d für die Bindung des ZFP an jede dieser Sequenzen (Spalte 7).
2 zeigt Aminosäuresequenzen von Zinkfingererkennungsregionen (Aminosäuren –1 bis +6 der Erkennungshelix), die an jede der 16 GNN-Triplet-Subsites binden. Drei Aminosäuresequenzen sind für jede Trinukleotid-Subsite gezeigt; diese entsprechen den optimalen Aminosäuresequenzen für die Erkennung der Subsite durch jede der drei Positionen (Finger 1, F1 (SEQ ID NOS: 688, 2534, 676, 1769, 342, 1450, 131, 158, 1765, 395, 1407, 2644, 705, 1398, 1733 & 184); Finger 2, F2 (SEQ ID NOS: 688, 229, 1446, 3051, 220, 1450, 417, 801, 1442, 395, 1824, 1201, 972, 3339, 1151 & 184); oder Finger 3, F3 (SEQ ID NOS: 943, 229, 676, 1769, 220, 1365, 417, 801, 3525, 395, 1824, 1425, 972, 3592, 952 & 184)) in einem Drei-Finger-Zinkfingerprotein. Die Aminosäuresequenzen sind vom N-Terminus zum C-Terminus gezeigt; die Nukleotidsequenzen sind in 5'-3'-Richtung gezeigt.
Ebenfalls gezeigt sind Stellenselektionsergebnisse für jeden der 48 positionsabhängigen GNN-erkennenden Zinkfinger. Diese zeigen, wie häufig ein bestimmtes Nukleotid an einer gegebenen Position in einer Reihe von durch den Zinkfinger gebundenen Oligonukleotidsequenzen vorkommt. Von 15 Oligonukleotiden, die durch ein Zinkfingerprotein mit der Aminosäuresequenz QSGHLAR (SEQ ID NO: 413), die an der Position des Fingers 1 (F1) vorliegt, gebunden werden, enthielten beispielsweise 15 ein G in der am meisten 5'-gelegenen Position der Subsite, 15 ein G in der mittleren Position der Subsite, während 10 ein A, 3 ein G und 2 ein T an der am meisten 3'-gelegenen Position der Subsite enthielten. Demzufolge ist diese spezielle Aminosäuresequenz für die Bindung eines GGA-Triplets durch die F1-Position optimal.
Die 3A, 3B und 3C zeigen Stellenselektionsdaten, die die Positionsabhängigkeit von GCA-, GAT- und GGT-bindenden Zinkfingern andeuten. Die erste und vierte (falls anwendbar) Reihen jeder Figur zeigen die Positionen der Aminosäuresequenz eines entwickelten Zinkfingerproteins (F1-Spalte, SEQ ID NOS: 220, 1765, 1442, 835 & 1425; F2-Spalte, SEQ ID NOS: 220, 1765, 1442, 889, 1425; F3-Spalte, SEQ ID NOS: 220, 159, 377, 889 & 1425). Die Aminosäurereste –1 bis +6 jeder α-Helix sind von links nach rechts aufgelistet. Die zweite und fünfte (falls anwendbar) Reihe zeigt die Zielsequenz, die in drei Triplet-Subsites, eine für jeden in der ersten und vierten (falls anwendbar) Reihe gezeigten Finger des Proteins, unterteilt ist. Die dritte und sechste (falls anwendbar) Reihe zeigt die Verteilung der Nukleotide in den Oligonukleotiden, die durch Stellenselektion mit den in der ersten und vierten (falls anwendbar) Reihe gezeigten Proteine erhalten wurden. 3A zeigt die Daten für die für eine Bindung an GCA entwickelten Finger; 3B zeigt die Daten für die für eine Bindung an GAT entwickelten Finger; 3C zeigt die Daten für die für eine Bindung an GGT entwickelten Finger.
4A und 4B zeigen die Eigenschaften des entwickelten ZFP EP2C. 4A zeigt die Stellenselektionsdaten. Die erste Reihe zeigt die Aminosäuresequenzen (F3, SEQ ID NO: 1100; F2, SEQ ID NO: 237; F1, SEQ ID NO: 1450) der Reste –1 bis +6 der Erkennungshelices für jeden der drei Zinkfinger des EP2C-Proteins. Die zweite Reihe zeigt die Zielsequenz (5' nach 3'), wobei die Verteilung der Nukleotide in den durch die Stellenselektion erhaltenen Oligonukleotiden unterhalb der Zielsequenz angegeben ist.
4B zeigt in vitro- und in vivo-Assays für die Bindungsspezifität von EP2C. Die ersten drei Reihen zeigen in vitro-Messungen der Bindungsaffinität von EP2C an seine beabsichtigte Zielsequenz und an mehrere dazu in Beziehung stehende Sequenzen. Die erste Spalte gibt den Namen jeder Sequenz an (2C0 ist die beabsichtigte Zielsequenz, vgl. mit 4A). Die zweite Spalte zeigt die Nukleotidsequenz der dazu verschiedenen Zielsequenzen, wobei die Unterschiede zu der beabsichtigten Zielsequenz (2C0) markiert sind. Die dritte Spalte zeigt die K_d (in nM) für die Bindung von EP2C an jede der Zielsequenzen. K_ds wurden durch Gelshiftassays unter Verwendung von zweifachen Verdünnungsreihen von EP2C bestimmt. Die rechte Seite der Figur (vierte Spalte und Balkendiagramm) zeigt die relativen Luciferase-Aktivitäten (normalisiert durch β-Galactosidase-Konzentrationen) in stabilen Zelllinien, bei denen eine Expression von EP2C induzierbar ist. Die Zellen wurden mit einem Vektor, der eine Luciferase-codierende Region unter der transkriptionellen Kontrolle der in der gleichen Reihe der Figur gezeigten Zielsequenz enthält, und einem Kontrollvektor, der für β-Galactosidase codiert, cotransfiziert. Luciferase- und β-Galactosidase-Konzentrationen wurden nach der Induktion der EP2C-Expression gemessen. Die Proben wurden dreifach untersucht und die Standardabweichungen sind in dem Balkendiagramm gezeigt. pGL3 ist ein Luciferase-codierender Vektor, dem die EP2C-Zielsequenzen fehlen. 3B ist eine andere Negativkontrolle, bei der die Luciferase-Expression unter der transkriptionellen Kontrolle von Sequenzen (3B) ist, die mit den EP2C-Zielsequenzen nicht in Bezug stehen.
DEFINITIONEN
Ein DNA-bindendes Zinkfingerprotein ist ein Protein oder Segment innerhalb eines größeren Proteins, das DNA als Ergebnis der Stabilisierung der Proteinstruktur durch Koordination eines Zinkions auf eine sequenzspezifische Art und Weise bindet. Die Bezeichnung DNA-bindendes Zinkfingerprotein wird häufig als Zinkfingerprotein oder ZFP abgekürzt.
Zinkfingerproteine können so konstruiert werden, dass sie eine ausgewählte Zielsequenz in einer Nukleinsäure erkennen. Jedes im Stand der Technik bekannte oder hierin offenbarte Verfahren kann verwendet werden, um ein konstruiertes Zinkfingerprotein oder eine Nukleinsäure, codierend ein konstruiertes Zinkfingerprotein, zu erzeugen. Diese umfassen den rationalen Design, Selektionsverfahren (z.B. Phage-Display), die zufällige Mutagenese, kombinatorische Bibliotheken, den Computerdesign, die Affinitätsselektion, die Verwendung von Datenbanken, welche Zinkfingeraminosäuresequenzen mit Zielsubsitenukleotidsequenzen abgleichen, das Klonieren von cDNA und/oder genomischen Bibliotheken und der synthetische Bau, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein konstruiertes Zinkfingerprotein kann eine neue Kombination von natürlich vorkommenden Zinkfingersequenzen umfassen. Verfahren zur Konstruktion von Zinkfingerproteinen sind in WO 00/41566 und WO 00/42219 als auch in WO 98/53057, WO 98/53058, WO 98/53059 und WO 98/53060 offenbart. Verfahren zur Identifizierung von bevorzugten Zielsequenzen und zur Konstruktion von Zinkfingerproteinen, welche solche bevorzugte Zielsequenzen binden, sind in WO 00/42219 beschrieben.
Ein entwickeltes Zinkfingerprotein ist ein Protein, das in der Natur nicht vorkommt und dessen Design/Verknüpfung prinzipiell nach rationellen Kriterien erfolgt. Rationelle Kriterien für den Design umfassen die Anwendung von Substitutionsregeln und Computeralgorithmen zur Prozessierung von Information einer Datenbank, welche Informationen über existierende ZFP-Designs und Bindungsdaten enthält.
Ein ausgewähltes/selektioniertes Zinkfingerprotein ist ein Protein, das in der Natur nicht vorkommt, und dessen Herstellung in erster Linie auf einem empirischen Prozess, wie Phage-Display, basiert.
Die Bezeichnung natürlich vorkommend wird verwendet, um ein Objekt zu beschreiben, das in der Natur vorkommt und sich dadurch unterscheidet, dass es nicht künstlich durch die Menschheit erzeugt wurde. Eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (umfassend Viren) vorkommt, der aus einer natürlichen Quelle isoliert werden kann und der nicht durch den Menschen vorsätzlich in einem Labor modifiziert wurde, ist beispielsweise natürlich vorkommend. Im Allgemeinen betrifft die Bezeichnung natürlich vorkommend ein Objekt, wie es in einem nicht-pathologischen (nicht-krankhaften) Individuum vorkommt, so wie es für die Spezies üblich ist.
Eine Nukleinsäure liegt in operativer Verknüpfung vor, wenn sie in einer funktionellen Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz vorliegt. Ein Promotor oder Enhancer ist beispielsweise operativ mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn dieser die Transkription der codierenden Sequenz erhöht. Operativ verknüpft bedeutet, dass die miteinander verbundenen DNA-Sequenzen üblicherweise benachbart und, wenn es notwendig ist zwei Protein-codierende Regionen zu verbinden, benachbart und im Leserahmen vorliegen. Da Enhancer im Allgemeinen arbeiten, wenn sie durch bis zu mehrere Kilobasen oder mehr und von dem Promotor getrennt vorliegen und Intronsequenzen eine variable Länge aufweisen können, können einige Polynukleotidelemente jedoch operativ verknüpft, aber nicht benachbart sein.
Eine spezifische Bindungsaffinität zwischen beispielsweise einem ZFP und einer spezifischen Zielstelle bedeutet eine Bindungsaffinität von wenigstens 1 × 10⁶ M^–1.
Die Bezeichnungen "Modulation der Expression", "Inhibierung der Expression" und "Aktivierung der Expression" eines Gens bezeichnet die Fähigkeit eines Zinkfingerproteins, die Transkription eines Gens zu aktivieren oder inhibieren. Eine Aktivierung umfasst eine Verhinderung einer nachfolgenden Transkriptionsinhibierung (d.h. eine Verhinderung der Repression der Genexpression) und eine Inhibierung umfasst eine Verhinderung einer nachfolgenden Transkriptionsaktivierung (d.h. eine Verhinderung einer Genaktivierung). Eine Modulation kann durch Bestimmung jedes möglichen Parameters gemessen werden, der indirekt oder direkt durch die Expression des Zielgens beeinflusst wird. Solche Parameter umfassen z.B. Veränderungen von RNA- oder Proteinkonzentrationen, Veränderungen der Proteinaktivität, Veränderungen der Produktkonzentrationen, Veränderungen der Expression von stromabwärts gelegenen Genen, Veränderungen der Reportergentranskription (Luciferase, CAT, beta-Galactosidase, GFP (siehe z.B. Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15: 961–964 (1997)), Veränderungen bei der Signaltransduktion, der Phosphorylierung und Dephosphorylierung, von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen, der Konzentrationen von sekundären Botenstoffen (z.B. cGMP, cAMP, IP3 und Ca²⁺), des Zellwachstums, der Neovaskularisierung, in vitro, in vivo und ex vivo. Solche funktionellen Effekte können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, wie z.B. durch Messung der RNA- oder Proteinkonzentrationen, Messung der RNA-Stabilität, Identifizierung einer stromabwärts gelegenen Expression oder Reportergenexpression, z.B. durch Chemilumineszenz, Fluoreszenz, colorimetrische Reaktionen, Antikörperbindung, induzierbare Marken, Ligandenbindungsassays, Veränderungen der intrazellulären sekundären Botenstoffe, wie cGMP und Inositoltriphosphat (IP3), Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentrationen, Cytokinfreisetzung und dgl.
Eine "regulatorische Domäne" bezeichnet ein Protein oder eine Proteinuntersequenz, das/die eine Transkriptonsmodulationsaktivität aufweist. Üblicherweise ist eine regulatorische Domäne kovalent oder nicht kovalent mit einem ZFP verbunden, um die Transkription zu modellieren. Alternativ dazu kann ein ZFP auch alleine ohne eine regulatorische Domäne oder mit mehreren regulatorischen Domänen wirken, um die Transkription zu modellieren.
Eine D-fähige Subsite innerhalb einer Zielstelle weist das Motiv 5'-NNGK-3' (SEQ ID NO: 4084) auf. Eine Zielstelle, die eines oder mehrere solcher Motive enthält, wird manchmal als eine D-fähige Zielstelle bezeichnet. Ein Zinkfinger, der dazu entwickelt wurde, an eine D-fähige Subsite zu binden, wird manchmal als ein D-fähiger Finger bezeichnet. Ähnlich wird ein Zinkfingerprotein, das wenigstens einen für die Bindung einer Zielstelle, umfassend wenigstens eine D-fähige Subsite, entwickelten oder selektionierten Finger enthält, manchmal als ein D-fähiges Zinkfingerprotein bezeichnet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
I. Allgemeines
Die Tabellen 1–5 zählen eine Sammlung von nicht natürlich vorkommenden Zinkfingerproteinsequenzen und den dazugehörigen Zielstellen auf. Die erste Spalte jeder Tabelle gibt ein internes Zeichen an. Die zweite Spalte listet eine durch ein Drei-Finger-Zinkfingerprotein gebundene Zielstelle aus 9 oder 10 Basen auf, wobei die Zielstellen in 5'-3'-Orientierung angegeben sind. Die dritte Spalte listet die SEQ ID NOS für die in Spalte 2 aufgezählten Zielstellensequenzen auf. Die vierte, fünfte und sechste Spalte listet die Aminosäurereste des ersten, zweiten und dritten Fingers eines Zinkfingerproteins auf, das die in der zweiten Spalte aufgelistete Zielsequenz erkennt. Für jeden Zinkfinger sind sieben Aminosäuren, welche die Positionen –1 bis +6 des Fingers besetzen, aufgelistet. Die Nummerierungsregeln für Zinkfingerproteine sind unten definiert. Die Spalten 5, 7 und 9 stellen die SEQ ID NOS für die in den Spalten 4, 6 und 8 aufgelisteten Aminosäuresequenzen bereit. Die letzte Spalte jeder Tabelle zählt die Bindungsaffinität (d.h. die K_d in nM) des Zinkfingerproteins für seine Zielstelle auf. Bindungsaffinitäten werden wie unten beschrieben bestimmt.
Jeder Finger bindet ein Basentriplet innerhalb einer entsprechenden Zielsequenz. Der erste Finger bindet das erste Triplet, beginnend von dem 3'-Ende einer Zielstelle, der zweite Finger bindet das zweite Triplet und der dritte Finger bindet das dritte (d.h. am meisten 5'-gelegene) Triplet der Zielsequenz. Beispielsweise bindet der RSDSLTS-Finger (SEQ ID NO: 646) von SBS# 201 (Tabelle 2) 5'-TTG-3', der RSTLTR-Finger (SEQ ID NO: 851) 5'-GCC-3' und der QRADLRR-Finger (SEQ ID NO: 1056) 5'-GCA-3'.
Tabelle 6 zählt eine Sammlung von Konsensussequenzen für Zinkfinger und die durch solche Sequenzen gebundenen Zielstellen auf. Der herkömmliche Einbuchstabencode für Aminosäuren wird verwendet, um Aminosäuren, welche die Konsensuspositionen besetzen, zu bezeichnen. Das Symbol "X" bezeichnet eine Nicht-Konsensusposition, die prinzipiell durch jede Aminosäure besetzt sein kann. Bei den meisten Zinkfingern vom C₂H₂-Typ ist die Bindungsspezifität hauptsächlich auf die Reste –1, +2, +3 und +6 zurückzuführen. Demzufolge umfasst eine Konsensussequenz, welche die Bindungsspezifität bestimmt, üblicherweise wenigstens diese Reste. Konsensussequenzen sind für das Design von Zinkfingern, damit diese an eine gegebene Zielsequenz binden, geeignet. Reste, welche andere Positionen besetzen, können unter Bezugnahme auf die in den Tabellen 1–5 gezeigten Sequenzen oder auf andere bekannte Zinkfingersequenzen ausgewählt werden. Alternativ dazu können diese Proteine mit einer Vielzahl von möglichen Aminosäuren randomisiert und gegen eine oder mehrere Zielsequenzen, um die Bindungsspezifität zu verfeinern oder zu verbessern, gescreent werden. Im Allgemeinen kann die gleiche Konsensussequenz ohne Rücksicht auf die relative Position des Fingers in einem Multi-Finger-Zinkfingerprotein für das Design eines Zinkfingers herangezogen werden. Beispielsweise kann die Sequenz RXDNXXR (SEQ ID NO: 4060) verwendet werden, um einen N-terminalen, zentralen oder C-terminalen Finger eines Drei-Finger-Proteins zu entwickeln. Einige Konsensussequenzen sind jedoch für das Design eines Zinkfingers, der eine bestimmte Position in einem Multi-Finger-Protein besetzt, am besten geeignet. Beispielsweise ist die Konsensussequenz RXDHXXQ (SEQ ID NO: 4055) am besten für das Design eines C-terminalen Fingers eines Drei-Finger-Proteins geeignet.
II. Eigenschaften von Zinkfingerproteinen
Zinkfingerproteine werden aus Zinkfingerkomponenten gebildet. Zinkfingerproteine können beispielsweise einen bis siebenunddreißig Finger aufweisen, wobei sie üblicherweise 2, 3, 4, 5 oder 6 Finger besitzen. Ein Zinkfingerprotein erkennt und bindet eine Zielstelle (manchmal als Zielsegment bezeichnet), die eine relativ kleine Untersequenz innerhalb eines Zielgens darstellt. Jede Fingerkomponente eines Zinkfingerproteins kann innerhalb der Zielstelle an eine Subsite binden. Die Subsite umfasst ein Triplet aus drei benachbarten Basen, alle auf demselben Strang (manchmal als Zielstrang bezeichnet). Die Subsite kann manchmal eine vierte Base auf dem entgegengesetzten Strang umfassen, die komplementär zu der Base unmittelbar 3' zu den drei benachbarten Basen auf dem Zielstrang ist. Bei vielen Zinkfingerproteinen bindet ein Zinkfinger im Wesentlichen unabhängig von anderen Fingern in demselben Zinkfingerprotein an seine Triplet-Subsite. Demzufolge entspricht die Bindungsspezifität eines Zinkfingerproteins mit mehreren Fingern üblicherweise etwa der Summe der Spezifitäten der Fingerkomponenten. Wenn ein Zinkfingerprotein aus ersten, zweiten und dritten Fingern gebildet wird, die unabhängig an die Triplets XXX, YYY und ZZZ binden, ist die Bindungsspezifität des Zinkfingerproteins beispielsweise 3'-XXX YYY ZZZ-5'.
Die relative Anordnung der Finger in einem Zinkfingerprotein vom N-Terminus zum C-Terminus bestimmt die relative Anordnung der Triplets in der 3'-5'-Richtung in dem Ziel. Wenn ein Zinkfingerprotein beispielsweise vom N-Terminus zum C-Terminus erste, zweite und dritte Finger umfasst, die unabhängig an die Triplets 5'-GAC-3', 5'-GTA-3' und 5'-GGC-3' binden, dann bindet das Zinkfingerprotein an das Zielsegment 3'-CAGATGCGG-5'. Wenn das Zinkfingerprotein die Finger in einer anderen Reihenfolge, wie beispielsweise zweiter Finger, erster Finger, dritter Finger, umfasst, dann bindet das Zinkfingerprotein an ein Zielsegment, umfassend eine unterschiedliche Permutation aus Triplets, in diesem Beispiel 3'-ATGCAGCGG-5' (siehe Berg & Shi, Science 271, 1081–1086 (1996)). Die Bewertung der Bindungseigenschaften eines Zinkfingerproteins als die Summe seiner Fingerkomponenten kann in einigen Fällen durch zusammenhangsabhängige Wechselwirkungen mehrerer Finger, die in demselben Protein binden, beeinflusst werden.
Zwei oder mehrere Zinkfingerproteine können miteinander verbunden werden, damit sie eine Zielspezifität aufweisen, die der Summe der Spezifitäten der Zinkfingerproteinkomponenten entspricht (siehe z.B. Kim & Pabo, PNAS 95, 2812–2817 (1998)). Ein erstes Zinkfingerprotein mit ersten, zweiten und dritten Fingerkomponenten, die in der Reihenfolge an XXX, YYY und ZZZ binden, kann beispielsweise mit einem zweiten Zinkfingerprotein mit ersten, zweiten und dritten Fingerkomponenten mit den Bindungsspezifitäten AAA, BBB und CCC verbunden werden. Die Bindungsspezifität der kombinierten ersten und zweiten Proteine ist demzufolge 3'-XXXYYYZZZ_AAABBBCCC-5', wobei die Unterstreichung eine kurze dazwischenliegende Region (üblicherweise 0–5 Basen jedes Typs) bezeichnet. In dieser Situation kann die Zielstelle so betrachtet werden, als ob sie zwei Zielsegmente, die durch ein dazwischenliegendes Segment voneinander getrennt sind, umfasst.
Die Verbindung kann durch Verwendung jedes der folgenden Peptidlinker erfolgen: TGEKP (SEQ ID NO: 2) (Liu et al., 1997, supra), (G₄S)_n (SEQ ID NO: 3) (Kim et al., PNAS 93, 1156–1160 (1996), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 4), LRQRDGERP (SEQ ID NO: 5), LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 6), LRQKD(G₃S)₂ERP (SEQ ID NO: 7). Alternativ dazu können flexible Linker auch durch rationellen Design unter Verwendung von Computerprogrammen, die zum Modelling von DNA-Bindungsstellen und Peptiden fähig sind, oder durch Phage-Display-Verfahren hergestellt werden. Gemäß einer weiteren Abwandlung kann eine nicht-kovalente Verbindung auch durch Fusionieren von zwei Zinkfingerproteinen mit Domänen, welche eine Heterodimerbildung der zwei Zinkfingerproteine unterstützen, erreicht werden. Ein Zinkfingerprotein kann beispielsweise mit fos und das andere mit jun fusioniert werden (siehe Barbas et al., WO 95/119431).
Die Verbindung von zwei Zinkfingerproteinen ist zur Erzeugung einer einzigartigen Bindungsspezifität innerhalb eines Säugetiergenoms vorteilhaft. Ein typisches diploides Säugetiergenom besteht aus 3 × 10⁹ bp. Unter der Annahme, dass die vier Nukleotide A, C, G und T statistisch verteilt sind, kommt eine gegebene 9 bp lange Sequenz ~23.000 mal vor. Demzufolge hätte ein ZFP, das ein 9 bp langes Ziel mit absoluter Spezifität erkennt, die Möglichkeit, an ~23.000 Stellen innerhalb des Genoms zu binden. Eine 18 bp lange Sequenz kommt einmal in 3,4 × 10¹⁰ bp oder etwa einmal in einer zufälligen DNA-Sequenz, dessen Komplexität zehn mal der eines Säugetiergenoms entspricht, vor.
Eine Fingerkomponente eines Zinkfingerproteins enthält üblicherweise etwa 30 Aminosäuren und weist das folgende Motiv (N-C) auf:
Die zwei invarianten Histidinreste und die zwei invarianten Cysteinreste in einem einzelnen beta-Turn sind durch Zink koordiniert (siehe z.B. Berg & Shi, Science 271, 1081–1085 (1996)). Das obige Motiv folgt einer Nummerierungsregel, die auf dem Fachgebiet betreffend Zinkfinger und deren Bindungsspezifität üblich ist. Der Aminosäure, die sich links (auf der N-terminalen Seite) des ersten invarianten His-Restes befindet, wird die Nummer +6 zugeteilt und den anderen weiter links liegenden Aminosäuren werden der Reihe nach abnehmende Zahlen zugeteilt. Die alpha-Helix beginnt bei Rest 1 und verläuft bis zu dem Rest, der dem zweiten konservierten Histidin folgt. Die vollständige Helix weist daher eine variable Länge zwischen 10 und 13 Resten auf.
Das Verfahren des Designs oder der Selektion eines nicht natürlich vorkommenden oder abweichenden ZPF beginnt üblicherweise bei einem natürlichen ZFP als Quelle für die Gerüstreste. Das Verfahren zum Design oder zur Selektion dient dazu, nicht konservierte Positionen (d.h. die Positionen –1 bis +6) zu definieren, um eine gewünschte Bindungsspezifität zu erreichen. Ein geeignetes ZFP ist das DNA-bindende Protein des Transkriptionsfaktors Zif268 aus Maus. Die DNA-bindende Domäne dieses Proteins weist die Aminosäuresequenz auf:
YACPVESCDRRFSRSDELTRHIRIHTGQKP (F1) (SEQ ID NO: 9)
FQCRICMRNFSRSDHLTTHIRTHTGEKP (F2) (SEQ ID NO: 10)
FACDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK (F3) (SEQ ID NO: 11)
und bindet an das Ziel 5'-GCG TGG GCG-3' (SEQ ID NO: 12).
Ein anderes geeignetes natürliches Zinkfingerprotein als Quelle für Gerüstreste ist Sp-1. Die für den Bau von Zinkfingerproteinen verwendete Sp-1-Sequenz umfasst die Aminosäuren 531 bis 624 des Sp-1-Transkriptionsfaktors. Diese Sequenz ist 94 Aminosäuren lang. Die Aminosäuresequenz von Sp-1 ist wie folgt:
PGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMCTWSYCGKRFTRSDELQR HKRTHTGEKKFACPECPKRFMRSDHLSKHIKTHQNKKG (SEQ ID NO: 13).
Sp-1 bindet an die Zielstelle 5'-GGG GCG GGG-3' (SEQ ID NO: 14).
Eine andere Form von Sp-1, eine Sp-1-Konsensussequenz, weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
meklrngsgdPGKKKQHACPECGKSFSKSSHLRAHQRTHTGERPYKCPECGKSFSRSD ELQRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDHLSKHQRTHQNKKG (SEQ ID NO: 15)
(die klein geschriebenen Buchstaben entsprechen einer Leadersequenz von Shi & Berg, Chemistry and Biology 1, 83–89 (1995)). Die optimale Bindungssequenz für die Sp-1-Konsensussequenz ist 5'-GGGGCGGGG-3' (SEQ ID NO: 16). Andere geeignete ZFPs werden unten beschrieben.
Es existiert eine Anzahl von Substitutionsregeln, die beim rationalen Design von einigen Zinkfingerproteinen helfen (siehe Desjarlais & Berg, PNAS 90, 2256–2260 (1993); Choo & Klug, PNAS 91, 11163–11167 (1994); Desjarlais & Berg, PNAS 89, 7345–7349 (1992); Jamieson et al., supra; Choo et al., WO 98/53057, WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060). Viele dieser Regeln werden durch gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)-Experimente an der Drei-Finger-Domäne des ubiquitären Transkriptionsfaktors Sp-1 gestützt (Desjarlais und Berg, 1992; 1993). Eine dieser Regeln ist, dass ein 5'-G in einem DNA-Triplet durch ein Zinkfingerprotein gebunden werden kann, das Arginin an Position 6 der Erkennungshelix enthält. Eine andere Substitutionsregel ist, dass ein G in der Mitte einer Subsite erkannt werden kann, wenn ein Histidinrest an Position 3 eines Zinkfingers eingebracht wird. Eine weitere Substitutionsregel ist, dass Asparagin eingebracht werden kann, um A in der Mitte eines Triplets zu erkennen, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin oder Threonin können eingebracht werden, um ein C in der Mitte eines Triplets zu erkennen, und Aminosäuren mit kleinen Seitenketten, wie Alanin, können eingebracht werden, um ein T in der Mitte eines Triplets zu erkennen. Eine weitere Substitutionsregel ist, dass die 3'-Base der Triplet-Subsite erkannt werden kann, wenn die folgenden Aminosäuren an Position –1 der Erkennungshelix eingebracht werden: Arginin, um G zu erkennen, Glutamin, um A zu erkennen, Glutaminsäure (oder Asparaginsäure), um C zu erkennen, und Threonin, um T zu erkennen. Obwohl diese Substitutionsregeln zum Design von Zinkfingerproteinen verwendet werden können, berücksichtigen sie nicht alle möglichen Zielstellen. Ferner ist die den Regeln zugrundeliegende Annahme, nämlich dass eine bestimmte Aminosäure in einem Zinkfinger für die Bindung an eine bestimmte Base in einer Subsite verantwortlich ist, nur angenähert. Zusammenhangsabhängige Wechselwirkungen zwischen benachbarten Aminosäuren in einem Finger oder die Bindung von mehreren Aminosäuren an eine einzelne Base oder umgekehrt können zu einer Abänderung der Bindungsspezifitäten, die durch die existierenden Substitutionsregeln vorhergesagt werden, führen.
Die Technik des Phage-Display stellt ein empirisches Mittel zur Erzeugung von Zinkfingerproteinen mit einer gewünschten Zielspezifität bereit (siehe z.B. Rebar, US 5,789,538 ; Choo et al., WO 96/06166; Barbas et al., WO 95/19431 und WO 98/543111; Jamieson et al., supra). Das Verfahren kann in Verbindung mit oder als Alternative zu dem rationalen Design verwendet werden. Das Verfahren umfasst die Erzeugung verschiedener Bibliotheken von mutierten Zinkfingerproteinen, gefolgt von der Isolierung der Proteine mit gewünschten DNA-Bindungseigenschaften unter Verwendung von Affinitätsselektionsverfahren. Um dieses Verfahren zu verwenden, geht der Experimentator üblicherweise wie folgt vor. Zunächst wird ein Gen für ein Zinkfingerprotein mutiert, um Veränderungen in Regionen, die für die Bindungsspezifität und/oder -affinität wichtig sind, einzuführen. Bei einer typischen Anwendung wird dies durch Randomisierung eines ersten Fingers an den Positionen –1, +2, +3 und +6 und manchmal an zusätzlichen Positionen, wie +1, +5, +8 und +10, erreicht. Dann wird das mutierte Gen in einen Phagen oder einen Phagemidvektor in der Form einer Fusion mit dem Gen III eines filamentösen Phagen, das für das Hüllprotein pIII codiert, kloniert. Das Zinkfingergen wird zwischen den Segmenten des Gens III, welche das Membranexportsignalpeptid und den Rest von pIII codieren, insertiert, sodass das Zinkfingerprotein in Form einer aminoterminalen Fusion mit pIII oder als reifes, prozessiertes Protein exprimiert wird. Werden Phagemidvektoren verwendet, kann das mutierte Zinkfingergen auch mit einer trunkierten Version des Gen III, welche mindestens die C-terminale Region, die für den Zusammenbau von pIII in dem Phagenpartikel benötigt wird, codiert, fusioniert werden. Die resultierende Vektorbibliothek wird in E. coli transformiert und dazu verwendet, einen filamentösen Phagen zu erzeugen, der abweichende Zinkfingerproteine auf seiner Oberfläche als Fusion mit dem Hüllprotein pIII exprimiert. Wenn ein Phagemidvektor verwendet wird, dann erfordert dieser Schritt die Superinfektion mit Helferphagen. Die Phagenbibliothek wird dann mit der DNA-Zielstelle inkubiert und Affinitätsselektionsverfahren werden verwendet, um den Phagen aus der Masse der Phagen zu isolieren, der das Ziel bindet. Üblicherweise liegt das DNA-Ziel immobilisiert auf einem festen Träger vor, der dann unter Bedingungen gewaschen wird, die ausreichend sind, um alle Phagen, jedoch nicht den Phagen mit der stärksten Bindung, zu entfernen. Nach dem Waschen wird jeder auf dem Träger verbliebene Phage durch Elution unter Bedingungen, die die Zinkfinger-DNA-Bindung zerstören, gewonnen. Der gewonnene Phage wird dazu verwendet, frische E. coli zu infizieren, die dann amplifiziert und dazu verwendet werden, eine neue Charge von Phagenpartikeln zu erzeugen. Die Selektion und die Amplifikation werden dann so viele Male wie notwendig wiederholt, um den Phagenpool mit Phagen mit einer festen Bindung anzureichern, sodass diese unter Verwendung von Sequenzier- und/oder Screeningverfahren identifiziert werden können. Obwohl das Verfahren für pIII-Fusionen veranschaulicht ist, können analoge Prinzipien verwendet werden, um ZFP-Varianten als pVIII-Fusionen zu screenen.
In einigen Ausführungsformen wird die durch ein bestimmtes Zinkfingerprotein gebundene Sequenz durch die Durchführung von Bindungsreaktionen (siehe z.B. Bedingungen für die Bestimmung von K_d, infra) zwischen dem Protein und einem Pool von randomisierten doppelsträngigen Oligonukleotidsequenzen bestimmt. Die Bindungsreaktion wird durch einen elektrophoretischen Mobilitätsshiftassay (EMSA) analysiert, bei dem Protein-DNA-Komplexe verzögert in einem Gel wandern und dadurch von den ungebundenen Nukleinsäuren abgetrennt werden können. Oligonukleotide, welche den Finger gebunden haben, werden von dem Gel befreit und beispielsweise durch eine Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Die Selektion (d.h. Bindungsreaktion und EMSA-Analyse) wird dann so oft wie nötig mit den selektionierten Oligonukleotidsequenzen wiederholt. Auf diese Art und Weise wird die Bindungsspezifität eines Zinkfingerproteins mit einer bestimmten Aminosäuresequenz bestimmt.
Zinkfingerproteine werden oft als Fusionsproteine mit einer heterologen Domäne exprimiert. Herkömmliche Domänen zur Addition an das ZFP umfassen beispielsweise Transkriptionsfaktordomänen (Aktivatoren, Repressoren, Coaktivatoren, Corepressoren), Silencer, Onkogene (z.B. Mitglieder der myc-, jun-, fos-, myb-, max-, mad-, rel-, ets-, bcl-, myb-, mos-Familien, etc.), DNA-Reparaturenzyme und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren, DNA-Rearrangementenzyme und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren, Chromatin-assoziierte Proteine und deren Modifikatoren (z.B. Kinasen, Acetylasen und Deacetylasen), und DNA-modifizierende Enzyme (z.B. Methyltransferasen, Topoisomerasen, Helikasen, Ligasen, Kinasen, Phosphatasen, Polymerasen, Endonukleasen) und deren assoziierte Faktoren und Modifikatoren. Eine bevorzugte Domäne zur Fusion mit einem ZFP, wenn das ZFP dazu verwendet wird, die Expression eines Zielgens zu reprimieren, ist eine KRAB-Repressionsdomäne aus dem humanen KOX-1-Protein (Thiesen et al., New Biologist 2, 363–374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509–4513 (1994), Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22: 2908–2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514–4518 (1994)). Bevorzugte Domänen, um eine Aktivierung zu erreichen, umfassen die HSV VP16-Aktivierungsdomäne (siehe z.B. Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952–5962 (1997)), Kernhormonrezeptoren (siehe z.B. Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10: 373–383 (1998)), die p65-Untereinheit des Kernfaktors kappa B (Bitko & Barik, J. Virol. 72: 5610–5618 (1998) und Doyle & Hunt, Neuroreport 8: 2937–2942 (1997); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5: 3–28 (1998)) oder artifizielle chimäre funktionelle Domänen, wie VP64 (Seifpal et al., EMBO J. 11, 4961–4968 (1992)).
Ein wichtiger Faktor bei der Verabreichung von Polypeptidverbindungen, wie den ZFPs, ist, sicherzustellen, dass das Polypeptid die Fähigkeit aufweist, die Plasmamembran einer Zelle oder die Membran eines intrazellulären Kompartiments, wie den Kern, zu durchdringen. Zelluläre Membranen bestehen aus Lipid-Protein-Doppelschichten, die für kleine, nicht-ionische lipophile Verbindungen frei permeabel sind und für polare Verbindungen, Makromoleküle und Therapeutika oder Diagnostika undurchlässig sind. Proteine und andere Verbindungen, wie Liposomen, wurden jedoch beschrieben, die die Fähigkeit besitzen, Polypeptide, wie ZFPs, durch eine Zellmembran zu schleusen.
Beispielsweise haben "Membrantranslokationspolypeptide" amphiphile oder hydrophobe Aminosäureuntersequenzen, die die Fähigkeit besitzen, als Membrantranslokationsträger zu wirken. In einer Ausführungsform haben Homeodomänenproteine die Fähigkeit, durch die Zellmembranen zu translokieren. Das kürzeste translokierbare Peptid eines Homeodomänenproteins, Antennapedia, ist die dritte Helix des Proteins von Aminosäureposition 43 bis 58 (siehe z.B. Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6: 629–634 (1996)). Andere Untersequenzen, die h (hydrophobe)-Domäne von Signalpeptiden zeigt ähnliche Zellmembrantranslokationseigenschaften (siehe z.B. Lin et al., J. Biol. Chem. 270: 14255–14258 (1995)).
Beispiele von Peptidsequenzen, die mit einem ZFP verbunden werden können, um die Aufnahme des ZFP in Zellen zu erleichtern, umfassen ein 11 Aminosäuren langes Peptid des tat-Proteins von HIV, eine 20 Reste lange Peptidsequenz, die den Aminosäuren 84–103 des p16-Proteins entspricht (siehe Fahraeus et al., Current Biology 6: 84 (1996)), die dritte Helix der 60 Aminosäuren langen Homeodomäne von Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)), die h-Region eines Signalpeptids, wie die h-Region des Kaposi-Fibroblastenwachstumsfaktors (K-FGF) (Lin et al., supra), oder die VP22-Translokationsdomäne von HSV (Elliot & O'Hare, Cell 88: 223–233 (1997)), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Andere geeignete chemische Anteile, die zu einer erhöhten zellulären Aufnahme führen, können auch chemisch mit den ZFPs verknüpft werden.
Toxinmoleküle besitzen auch die Fähigkeit, Polypeptide durch Zellmembranen zu transportieren. Häufig sind solche Moleküle aus wenigstens zwei Teilen (als "binäre Toxine" bezeichnet) aufgebaut: einer Translokations- oder Bindungsdomäne oder einem Translokations- oder Bindungspolypeptid und einer getrennten Toxindomäne oder einem getrennten Toxinpolypeptid. Üblicherweise bindet die Translokationsdomäne oder das Translokationspolypeptid an einen zellulären Rezeptor und dann wird das Toxin in die Zelle transportiert. Zahlreiche bakterielle Toxine, umfassend Clostridium perfringens Lota-Toxin, Diphtherie-Toxin (DT), Pseudomonas Exotoxin A (PE), Pertussis-Toxin (PT), Bacillus anthracis Toxin und Pertussis-Adenylatcyclase (CYA), wurden in Versuchen verwendet, um Peptide als interne oder aminoterminale Fusionen in das Zellcytosol zu überführen (Arora et al., J. Biol. Chem. 269: 3334–3341 (1993), Perelle et al., Infect. Immun. 61: 5147–5156 (1993); Stenmark et al., J. Cell Biol. 113: 1025–1032 (1991); Donnelly et al., PNAS 90: 3530–3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63: 3851–3857 (1995); Klimpel et al., PNAS U.S.A. 89: 10277–10281 (1992); und Novak et al., J. Biol. Chem. 267: 17186–17193 (1992)).
Solche Untersequenzen können verwendet werden, um ZFPs durch eine Zellmembran zu translokieren. ZFPs können herkömmlich mit solchen Sequenzen fusioniert oder derivatisiert werden. Üblicherweise wird die Translokationssequenz als Teil eines Fusionsproteins bereitgestellt. Gegebenenfalls kann ein Linker verwendet werden, um das ZFP und die Translokationssequenz miteinander zu verbinden. Jeder geeignete Linker kann verwendet werden, wie z.B. ein Peptidlinker.
III. Positionsabhängigkeit der Subsiteerkennung durch Zinkfinger
Eine Anzahl von hierin offenbarten Polypeptiden wurde unter Verwendung von den in der elterlichen Anmeldung Nr. 09/716,637, die als US Patent Nr. 6,794,136, erteilt am 21. September 2004, veröffentlicht wurde, offenbarten Verfahren charakterisiert, insbesondere in Bezug auf die Wirkung ihrer Position innerhalb eines Multi-Finger-Proteins auf dessen Sequenzspezifität. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stellen eine Reihe von Zinkfingersequenzen bereit, die im Hinblick auf eine Erkennung von bestimmten Triplet-Zielsubsites, deren am meisten 5'-gelegenes Nukleotid ein G ist (d.h. GNN-Triplet-Subsites), optimiert wurden. Demzufolge werden spezielle Zinkfingersequenzen bereitgestellt, die von jeder Position eines Drei-Finger-Zinkfingerproteins jede der GNN-Triplet-Subsites erkennen. Siehe 2. Der Fachmann wird verstehen, dass die hierin offenbarten, für die Erkennung von GNN-Zielsubsites optimierten, positionsspezifischen Zinkfingersequenzen nicht nur auf eine Verwendung in Drei-Finger-Proteinen beschränkt sind. Beispielsweise sind sie auch in Sechs-Finger-Proteinen, die durch eine Verknüpfung von zwei Drei-Finger-Proteinen hergestellt werden können, geeignet.
Eine Anzahl von Zinkfingeraminosäuresequenzen, von denen berichtet wird, dass sie an Zielsubsites binden, bei denen der am meisten 5'-gelegene Nukleotidrest G ist (d.h. GNN-Subsites), wurden kürzlich offenbart. Segal et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2758–2763; Drier et al. (2000), J. Mol. Biol. 303: 389–502; U.S. Patent Nr. 6,140,081. Diese GNN-bindenden Zinkfinger wurden durch Selektion von Sequenzen für Finger 2 aus Phage-Display-Bibliotheken von Drei-Finger-Proteinen, bei denen bestimmte Aminosäurereste des Fingers 2 randomisiert wurden, erhalten. Aufgrund der Art und Weise, auf welche sie selektioniert wurden, ist nicht klar, ob diese Sequenzen dieselbe Zielsubsitespezifität aufweisen würden, wenn sie an den Positionen F1 und/oder F3 vorliegen würden.
Die Verwendung der hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen erlaubt nun die Identifizierung von spezifischen Zinkfingersequenzen, welche jede der 16 GNN-Triplet-Subsites binden und stellt zum ersten Mal Zinkfingersequenzen bereit, die für eine Erkennung dieser Triplet-Subsites in einer positionsabhängigen Art und Weise optimiert wurden. Überdies zeigen in vivo-Studien mit diesen optimierten Designs, dass die Funktionalität eines ZFP mit dessen Bindungsaffinität für seine Zielsequenz in Verbindung steht. Siehe Beispiel 6, infra.
Als Ergebnis der hierin offenbarten Entdeckung, dass die Sequenzerkennung durch Zinkfinger positionsabhängig ist, geht hervor, dass die existierenden Designregeln nicht für jede Situation, bei der es erforderlich ist, ein sequenzspezifisches ZFP zu erzeugen, anwendbar sind. Die hierin offenbarten Ergebnisse zeigen, dass viele Zinkfinger, die basierend auf Designregeln konstruiert wurden, die durch diese Designregeln vorhergesagte Sequenzspezifität nur an gewissen Fingerpositionen aufweisen. Die hierin offenbarten positionsspezifischen Zinkfinger funktionieren voraussichtlich effizienter in vivo und in kultivierten Zellen mit weniger unspezifischen Effekten. Hochspezifische ZFPs, die unter Verwendung von positionsspezifischen Zinkfingern hergestellt wurden, sind ein geeignetes Mittel zum Studium der Genfunktion und werden eine breite Anwendung in so vielen Bereichen, wie als humane Therapeutika und bei dem Plant Engineering, finden.
IV. Erzeugung von Zinkfingerproteinen
ZFP-Polypeptide und Nukleinsäuren, welche diese codieren, können unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik hergestellt werden. Grundlegende Literaturstellen, die allgemeine Verfahren offenbaren, umfassen Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2nd Ed. (1989)); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. (1994)). Zudem können Nukleinsäuren mit weniger als etwa 100 Basen von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen bezogen werden, wie The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (http://www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA). Ähnlich können Peptide von einer Vielzahl von Quellen bezogen werden, wie PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (http://www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd (U.K.), Bio.Synthesis, Inc.
Oligonukleotide können chemisch durch das Festphasenphosphoramidittriester-Verfahren, das zuerst durch Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859–1862 (1981) beschrieben wurde, unter Verwendung einer automatisierten Syntheseapparatur, wie sie in Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 (1984) beschrieben ist, synthetisiert werden. Die Reinigung der Oligonukleotide wird entweder durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese oder durch Reverse-Phase-HPLC durchgeführt. Die Sequenz der klonierten Gene und der synthetischen Oligonukleotide kann nach der Klonierung unter Verwendung von z.B. des Kettenterminationsverfahrens zur Sequenzierung von doppelsträngigen Templaten von Wallace et al., Gene 16: 21–26 (1981) überprüft werden.
Zwei alternative Verfahren werden üblicherweise verwendet, um die codierenden Sequenzen zu erzeugen, die benötigt werden, um neu entwickelte DNA-bindende Proteine zu exprimieren. Ein Protokoll basiert auf einer PCR-basierten Zusammenbauprozedur, die sechs überlappende Oligonukleotide verwendet (1). Drei Oligonukleotide (Oligos 1, 3 und 5 in 1) entsprechen den "universellen" Sequenzen, welche Bereiche der DNA-bindenden Domäne zwischen den Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide bleiben üblicherweise für alle Zinkfingerkonstrukte konstant. Die anderen drei "spezifischen" Oligonukleotide (Oligos 2, 4 und 6 in 1) werden so entwickelt, dass sie für die Erkennungshelices codieren. Diese Oligonukleotide enthalten vorwiegend an den Positionen –1, 2, 3 und 6 der Erkennungshelices Substitutionen, wodurch sie spezifisch für jede der unterschiedlichen DNA-Bindungsdomänen werden.
Die PCR-Synthese wird in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wird ein doppelsträngiges DNA-Templat durch Vereinigen der sechs Oligonukleotide (drei universelle, drei spezifische Oligonukleotide) in einer Vier-Zyklen-PCR-Reaktion mit einer geringeren Temperatur im Annealingschritt, wodurch die Oligonukleotide annealen, um ein DNA-"Gerüst" zu erzeugen, erzeugt. Die Lücken in dem Gerüst werden durch eine hochgenaue thermostabile Polymerase aufgefüllt, wobei auch eine Kombination aus Taq- und Pfu-Polymerasen ausreicht. In der zweiten Konstruktionsphase wird das Zinkfingertemplat mit Hilfe von externen Primern, die entwickelt wurden, um Restriktionsstellen für eine Klonierung in einen Shuttlevektor oder direkt in einen Expressionsvektor an jedem Ende einzuführen, amplifiziert.
Ein alternatives Verfahren zur Klonierung der neu entwickelten DNA-bindenden Proteine basiert auf dem Annealen von komplementären Oligonukleotiden, welche die spezifischen Regionen des gewünschten ZFP codieren. Dieses besondere Verfahren erfordert, dass die Oligonukleotide vor dem finalen Ligationsschritt phosphoryliert werden. Dies wird üblicherweise vor dem Durchführen der Annealingreaktionen durchgeführt. Kurz gesagt werden die "universellen" Oligonukleotide, welche die konstanten Regionen des Proteins codieren (Oligos 1, 2 und 3 von oben), mit den entsprechenden komplementären Oligonukleotiden annealed. Zudem werden die "spezifischen" Oligonukleotide, welche die Fingererkennungshelices codieren, mit ihren entsprechenden komplementären Oligonukleotiden annealed. Diese komplementären Oligos werden so entwickelt, dass sie die Region, die zuvor in dem oben beschriebenen Protokoll durch die Polymerase aufgefüllt wird, auffüllen. Die komplementären Oligos zu dem herkömmlichen Oligo 1 und Finger 3 werden so entwickelt, dass sie überhängende Sequenzen erzeugen, die spezifisch für die Restriktionsschnittstellen sind, die in dem nächsten Schritt bei der Klonierung in den Vektor der Wahl verwendet werden. Das zweite Zusammenbauprotokoll unterscheidet sich von dem ersten Protokoll in folgender Hinsicht: Das "Gerüst", das für das neu entwickelte ZFP codiert, besteht vollständig aus synthetischer DNA, wodurch der Polymeraseauffüllschritt eliminiert wird. Zudem bedarf es keiner Amplifikation des in den Vektor zu klonierenden Fragmentes. Zuletzt ermöglicht das Design von zurückbleibenden sequenzspezifischen Überhängen die Notwendigkeit für einen Restriktionsenzymverdau des zu insertierenden Fragments. Alternativ dazu können Veränderungen in den ZFP-Erkennungshelices unter Verwendung von herkömmlichen gerichteten Mutageneseverfahren (site-directed mutagenesis) erzeugt werden.
Beide Zusammenbauverfahren erfordern, dass das resultierende Fragment, welches das neu entwickelte ZFP codiert, in einen Vektor ligiert wird. Schließlich wird die ZFP-codierende Sequenz in einen Expressionsvektor kloniert. Expressiensvektoren, die üblicherweise verwendet werden, umfassen einen modifizierten bakteriellen pMAL-c2-Expressionsvektor (New England BioLabs) oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, pcDNA (Promega), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die endgültigen Konstrukte werden durch Sequenzanalyse überprüft.
Jedes dem Fachmann bekannte geeignete Proteinreinigungsverfahren kann verwendet werden, um ZFPs aufzureinigen (siehe Ausubel, supra; Sambrook, supra). Zudem kann jeder geeignete Wirt für die Expression verwendet werden, wie z.B. bakterielle Zellen, Insektenzellen, Hefezellen, Säugetierzellen und dgl.
Die Expression eines an ein Maltose-bindendes Protein fusionierten Zinkfingerproteins (MBP-ZFP) in dem bakteriellen Stamm JM109 ermöglicht eine schnelle Aufreinigung durch eine Amylosesäule (NEB). Hohe Expressionsgrade des chimären Zinkfingerproteins können durch Induktion mit IPTG erzeugt werden, da das MBP-ZFP-Fusionsprotein in dem pMal-c2-Expressionsplasmid unter der Kontrolle des Tac-Promotors steht (NEB). Bakterien, welche das MBP-ZFP-Fusionsplasmid enthalten, werden in 2 × YT-Medium, das 10 μM ZnCl₂, 0,02% Glucose und 50 μg/ml Ampicillin enthält, inokuliert und bei 37°C geschüttelt. Bei einem mittleren exponentiellen Wachstum wird IPTG bis zu einer Konzentration von 0,3 mM zugegeben und die Kulturen werden geschüttelt. Nach 3 Stunden werden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet, durch Ultraschall oder den Durchtritt durch eine French-Press-Zelle oder die Verwendung von Lysozym aufgeschlossen und das unlösliche Material wird durch Zentrifugation entfernt. Die MBP-ZFP-Proteine werden auf einem Amylose-gebundenen Harz gebunden, ausführlich mit Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 5 mM DTT und 50 μM ZnCl₂ enthält, gewaschen, dann mit Maltose in im Wesentlichen demselben Puffer (die Aufreinigung basiert auf einem Standardprotokoll von NEB) eluiert. Die aufgereinigten Proteine werden quantifiziert und für eine biochemische Analyse gelagert.
Die Dissoziationskonstanten der aufgereinigten Proteine, z.B. K_d, werden üblicherweise durch einen elektrophoretischen Mobilitätsshiftassay (EMSA) (Buratowski & Chodosh, in Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 12.2.1–12.2.7 (Ausubel, Ed. (1996)) bestimmt. Die Affinität wird durch Titration des aufgereinigten Proteins gegen eine feste Menge eines markierten, doppelsträngigen Oligonukleotidziels bestimmt. Das Ziel umfasst üblicherweise die natürliche Bindungsstellensequenz, flankiert von den in der natürlichen Sequenz vorkommenden 3 bp und zusätzlichen konstanten flankierenden Sequenzen. Die natürliche Bindungsstelle ist üblicherweise für ein Drei-Finger-Protein 9 bp lang und für ein Sechs-Finger-ZFP 2 × 9 bp + dazwischenliegende Basen lang. Die annealten Oligonukleotidziele besitzen einen 1 Basen langen 5'-Überhang, der ein effizientes Markieren der Ziele mit T4-Phagen-Polynukleotidkinase ermöglicht. Für den Assay wird das Ziel in einer Konzentration von 1 nM oder weniger zugegeben (die genaue Konzentration wird wenigstens 10-fach geringer als die erwartete Dissoziationskonstante gehalten), die aufgereinigten ZFPs werden bei verschiedenen Konzentrationen zugegeben, und die Reaktion wird für wenigstens 45 Minuten äquillibriert. Zudem enthält die Reaktionsmischung auch 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 5 mM DTT, 10% Glycerin, 0,02% BSA. (NB: In früheren Assays wurde auch Poly-d(IC) bei einer Konzentration von 10–100 μg/μl zugegeben.)
Die äquilibrierten Reaktionen werden auf ein 10% Polyacrylamidgel gegeben, das zuvor für 45 min mit Tris/Glycerin-Puffer betrieben wurde, dann werden gebundene und nicht-gebundene markierte Ziele durch Elektrophorese bei 150 V aufgelöst. (Alternativ dazu können 10–20% Gradienten-Tris-HCl-Gele, die eine 4% Polyacrylamidschicht enthalten, verwendet werden.) Die getrockneten Gele werden durch Autoradiographie oder Phosphorimaging sichtbar gemacht und die apparente K_d wird durch Berechnung der Proteinkonzentration, welche eine halbmaximale Bindung ergibt, bestimmt.
Die Assays können auch die Bestimmung von aktiven Fraktionen in den Proteinpräparationen umfassen. Aktive Fraktionen werden durch stöchiometrische Gelshifts bestimmt, wenn Proteine gegen eine hohe Konzentration einer Ziel-DNA titriert werden. Titrationen werden mit 100%, 50% und 25% des Ziels (üblicherweise im mikromolaren Konzentrationsbereich) durchgeführt.
V. Anwendungen von entwickelten Zinkfingerproteinen
ZFPs, die an ein bestimmtes Zielgen binden, und Nukleinsäuren, die diese codieren, können für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Diese Anwendungen umfassen therapeutische Verfahren, bei denen ein ZFP oder eine ein ZFP codierende Nukleinsäure einem Patienten verabreicht und dazu verwendet wird, die Expression eines Zielgens in dem Patienten zu modulieren. Siehe z.B. WO 00/41566. Die Modulation kann durch eine Repression erfolgen, z.B. wenn das Zielgen in einem pathologischen infektiösen Mikroorganismus oder in einem endogenen Gen des Patienten, wie einem Onkogen oder einem viralen Rezeptor, die zu einem Krankheitszustand beitragen, vorliegt. Alternativ dazu kann die Modulation durch eine Aktivierung erfolgen, wenn die Aktivierung der Expression oder eine erhöhte Expression eines endogenen zellulären Gens einen Krankheitszustand verbessert. Für solche Anwendungen werden ZFPs oder mehr bevorzugte Nukleinsäuren, die für diese ZFPs codieren, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden teilweise durch die Art der speziellen zu verabreichenden Zusammensetzung als auch das für die Verabreichung der Zusammensetzung verwendete spezielle Verfahren bestimmt (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985)). Die ZFPs können alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Bestandteilen als Aerosolformulierungen hergestellt werden (z.B. können sie "zerstäubt" werden), um durch eine Inhalation verabreicht zu werden. Aerosolformulierungen können mit unter Druck gesetzten, verträglichen Treibmitteln, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dgl., zusammengebracht werden. Formulierungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, wie beispielsweise auf eine intravenöse, intramuskuläre, intradermale und subkutane Art und Weise, umfassen wässrige und nicht-wässrige isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des Rezipienten machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Aufschlussmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen. Die Zusammensetzungen können beispielsweise durch eine intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen der Verbindungen können in Form von verschlossenen Behältern, die eine einzelne oder Mehrfachdosis enthalten, dargeboten werden, wie Ampullen und Vials. Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granali und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Die einem Patienten zu verabreichende Dosis sollte ausreichend sein, um in einem Patienten eine vorteilhafte therapeutische Antwort über eine bestimmte Zeitdauer zu erzielen. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit und den K_d des verwendeten ZFP, die Zielzelle und den Zustand des Patienten als auch das Körpergewicht oder den Oberflächenanteil des zu behandelnden Patienten bestimmt. Die Größe der Dosis wird auch durch das Vorhandensein, die Art und das Ausmaß möglicher negativer Nebeneffekte, die die Verabreichung einer bestimmten Verbindung oder eines bestimmten Vektors in einem bestimmten Patienten begleiten, bestimmt.
In anderen Anwendungen werden ZFPs in diagnostischen Verfahren zum sequenzspezifischen Nachweis von Zielnukleinsäuren in einer Probe verwendet. Beispielsweise können ZFPs verwendet werden, um abweichende Allele, die mit einer Erkrankung oder einem Phenotyp in einer Patientenprobe verbunden sind, nachzuweisen. Beispielsweise können ZFPs verwendet werden, um die Gegenwart einer bestimmten mRNA-Spezies oder einer bestimmten cDNA in einer komplexen Mischung aus mRNAs oder cDNAs nachzuweisen. Ferner können ZFPs beispielsweise verwendet werden, um die Kopienzahl eines Gens in einer Probe zu bestimmen. Beispielsweise ist der Nachweis des Verlusts einer Kopie eines p53-Gens in einer klinischen Probe ein Indikator für die Anfälligkeit gegenüber Krebs. In einem weiteren Beispiel können ZFPs verwendet werden, um die Gegenwart von pathologischen Mikroorganismen in klinischen Proben nachzuweisen. Dies wird durch Verwendung von einem oder mehreren ZFPs, die für die nachzuweisenden Gene des Mikroorganismus spezifisch sind, erreicht. Ein geeignetes Format zur Durchführung von diagnostischen Assays verwendet ZFPs, die mit einer Domäne verbunden sind, welche eine Immobilisierung der ZFPs auf einer ELISA-Platte ermöglicht. Das immobilisierte ZFP wird mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie eine Zielnukleinsäure enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen eine Bindung auftritt. Üblicherweise werden die Nukleinsäuren in der Probe markiert (z.B. im Laufe einer PCR-Amplifikation). Alternativ dazu können nicht-markierte Proben unter Verwendung einer zweiten markierten Probe nachgewiesen werden. Nach dem Waschen werden gebundene markierte Nukleinsäuren nachgewiesen.
ZFPs können auch für Assays verwendet werden, um den Phenotyp und die Funktion der Genexpression zu bestimmen. Momentane Verfahren zur Bestimmung der Genfunktion basieren vorwiegend entweder auf der Überexpression oder der Entfernung (dem vollständigen Knock-Out) des Gens von Interesse aus seinem natürlich biologischen Umfeld und dem Beobachten der Effekte. Die beobachteten phenotypischen Effekte deuten die Rolle des Gens in dem biologischen System an.
Ein Vorteil der ZFP-vermittelten Regulation eines Gens verglichen mit einer herkömmlichen Knock-Out-Analyse besteht darin, dass die Expression des ZFP unter die Kontrolle von kleinen Molekülen gestellt werden kann. Durch Kontrolle der Expressionsgrade der ZFPs kann man wiederum die Expressionsgrade eines durch das ZFP regulierten Gens kontrollieren, um zu bestimmen, welcher Grad der Repression oder Stimulation der Expression erforderlich ist, um einen gegebenen phenotypischen oder biochemischen Effekt zu erzielen. Dieser Ansatz ist von besonderem Wert für die Entwicklung von Medikamenten. Indem das ZFP unter die Kontrolle von kleinen Molekülen gestellt wird, können Probleme, wie eine embryonale Sterblichkeit und eine Entwicklungskompensation, durch ein Anschalten des ZFP-Repressors zu einem späteren Zeitpunkt in der Mausentwicklung und Beobachten der Effekte in erwachsenen Mäusen vermieden werden. Transgene Mäuse mit Zielgenen, die durch ein ZFP reguliert werden, können durch Integration der Nukleinsäure, die für das ZFP codiert, an jeder in trans-Stelle in dem Zielgen erzeugt werden. Demzufolge ist eine homologe Rekombination zur Integration der Nukleinsäure nicht erforderlich. Ferner wird nur eine chromosomale Kopie benötigt, da das ZFP transdominant ist und daher können funktionelle Knock-Out-Tiere ohne Rückkreuzung erzeugt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Anfängliches Design von Zinkfingerproteinen und Bestimmung der Bindungsaffinität
Die anfänglichen ZFP-Designs basierten auf den bestehenden Designregeln, Übereinstimmungsregimen und ZFP-Verzeichnissen, umfassend die hierin offenbarten (siehe Tabellen 1–5) und WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060. Siehe auch WO 00/42219. Die Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung der Aminosäuren 532–624 des humanen Transkriptionsfaktors Sp-1 als Grundgerüst entwickelt. Polypeptide, welche für die entwickelten ZFPs codierten, wurden mithilfe eines Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierten Verfahrens, das sechs überlappende Oligonukleotide verwendet, erzeugt. PCR-Produkte wurden direkt in den Tac-Promotor-Vektor pMal-c2 (New Englang Biolabs, Beverly, MA) unter Verwendung der KpnI- und BamHI-Restriktionsstellen kloniert. Die codierten MBP-ZFP-Fusionspolypeptide wurden gemäß den Verfahren des Herstellers (New England Biolabs, Beverly, MA) aufgereinigt. Die Bindungsaffinitäten wurden durch Gelmobilitätsshiftanalysen bestimmt. All diese Verfahren sind detailliert in WO 00/41566 und WO 00/42219 als auch in Zhang et al. (2000), J. Biol. Chem. 275: 33850–33860 und Liu et al. (2001), J. Biol. Chem. 276: 11323–11334 beschrieben.
Beispiel 2: Optimierung der Bindungsspezifität durch Stellenselektion
Die entwickelten ZFPs wurden auf ihre Bindungsspezifität unter Verwendung von Stellenselektionsverfahren, welche in der elterlichen Anmeldung USSN 09/716,637, veröffentlicht als U.S. Patent Nr. 6,794,136, erteilt am 21. September 2004, offenbart sind, untersucht. Kurz gesagt wurden die entwickelten Proteine mit einer Population aus markierten, doppelsträngigen Oligonukleotiden, umfassend eine Bibliothek aller möglicher 9- oder 10-Nukleotid-Zielsequenzen, inkubiert. Fünf Nanomol der markierten Oligonukleotide wurden mit Protein bei einer Proteinkonzentration, die 4-fach oberhalb des K_ds für die Zielsequenz lag, inkubiert. Die Mischung wurde einer Gelelektrophorese unterzogen und die gebundenen Oligonukleotide wurden durch einen Mobilitätsshift identifiziert und von dem Gel extrahiert. Die aufgereinigten gebundenen Oligonukleotide wurden amplifiziert und die Amplifikationsprodukte wurden für eine nachfolgende Selektionsrunde verwendet. Bei jeder Selektionsrunde wurde die Proteinkonzentration um das 2-fache verringert. Nach 3–5 Selektionsrunden wurden die Amplifikationsprodukte in den TOPO TA Klonierungsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und die Nukleotidsequenzen von etwa 20 Klonen wurden bestimmt. Die Identitäten der durch ein entwickeltes Protein gebundenen Zielstellen wurden anhand der Sequenzen bestimmt und als Sammlung von Subsite-bindenden Sequenzen exprimiert.
Beispiel 3: Vergleich der Stellenselektionsergebnisse mit der Bindungsaffinität
Um die Korrelation zwischen den Stellenselektionsergebnissen und der Bindungsaffinität eines ZFP gegenüber verschiedenen verwandten Zielen zu untersuchen, wurden Stellenselektionsexperimente mit zwei Drei-Finger-ZFPs, als ZFP1 und ZFP2 bezeichnet, durchgeführt und die Stellenselektionsergebnisse wurden mit den K_d-Messungen, die aus dem quantitativen Gelmobilitätsshiftassay unter Verwendung der gleichen ZFPs und Zielstellen erhalten wurden, verglichen. Jedes ZFP wurde anhand von Designregeln konstruiert, sodass es an eine bestimmte Neun-Nukleotid-Zielsequenz, umfassend 3 Drei-Nukleotid-Subsites, wie in 1 gezeigt, bindet. Die Stellenselektionsergebnisse und Affinitätsmessungen sind in 1 gezeigt. Die Stellenselektionsergebnisse zeigen, dass die Finger 1 und 3 der ZFP1- und ZFP2-Proteine vorzugsweise ihre vorhergesagten Zielsequenzen auswählen. Jedoch wählt der zweite Finger jedes ZFP vorzugsweise andere Subsites aus, als diejenigen Subsites, für deren Bindung er entwickelt wurde (z.B. F2 von ZFP1 wurde für eine Bindung an TCG entwickelt, er wählt aber vorzugsweise GTG aus; F2 von ZFP2 wurde für eine Bindung an GGT entwickelt, er wählt jedoch vorzugsweise GGA aus).
Um die Stellenselektionsergebnisse zu bestätigen, wurden die Bindungsaffinitäten für ZFP1 und ZFP2 bestimmt (siehe Beispiel 1, supra), beide für ihre ursprünglichen Zielsequenzen und für die neuen Zielsequenzen, welche die Stellenselektionsergebnisse widerspiegeln. Beispielsweise enthält die Mt-1-Sequenz zwei Basenaustausche (verglichen mit der ursprünglichen Zielsequenz für ZFP1), die zu einer Veränderung der Sequenz der Finger 2-Subsite nach GTG führt, was der bevorzugten Finger 2-Subsitesequenz, die durch Stellenselektion erhalten wurde, entspricht. In Übereinstimmung mit den Stellenselektionsergebnissen ist die Bindung von ZFP1 an die Mt-1-Sequenz etwa 4-fach stärker als die Bindung an die ursprüngliche Zielsequenz (K_d von 12,5 nM verglichen mit einer K_d von 50 nM, siehe 1).
Für ZFP2 wurde die Spezifität von Finger 2 für die 3'-Base der Zielsubsite untersucht, da, obwohl dieser Finger für eine Bindung an GGT entwickelt wurde, die Stellenselektion andeutet, dass dieser vorzugsweise an GGA bindet. Überdies haben die Stellenselektionsergebnisse vorhergesagt, dass Finger 2 von ZFP2 mit etwa der gleichen Affinität an GGT und GGC binden würde. Demzufolge wurden Zielsequenzen, die GGA (Mt-3) und GGC (Mt-4) an der Finger 2-Subsite enthielten, konstruiert und die Bindungsaffinitäten von ZFP2 an diese Zielsequenzen und an seine ursprüngliche Zielsequenz (die GGT an der Finger 2-Subsite enthält) wurden verglichen. In völliger Übereinstimmung mit den Stellenselektionsergebnissen zeigte ZFP2 die stärkste Bindungsaffinität für die Zielsequenz, welche GGA an der Finger 2-Subsite enthielt (K_d von 0,5 nM, 1), und die Affinität für die GGT oder GGC an die die Finger 2-Subsite enthaltenden Zielsequenzen war etwa gleich (K_d von 1 nM für beide Ziele, 1). Demzufolge kann das Stellenselektionsverfahren neben der Verwendung zur iterativen Optimierung der Bindungsspezifität auch als hilfreicher Indikator für die Bindungsaffinität verwendet werden.
Beispiel 4: Verwendung der Stellenselektion, um positionsabhängige GNN-bindende Zinkfinger zu identifizieren
Eine große Anzahl von entwickelten ZFPs wurde durch Stellenselektion ausgewertet, um Zinkfinger zu identifizieren, die an GNN-Zielsubsites binden. Im Verlauf dieser Studien wurde es offensichtlich, dass die Bindungsspezifität einer bestimmten Zinkfingersequenz in einigen Fällen von der Position des Zinkfingers in dem Protein und daher von dem Ort der Zielsubsite innerhalb der Zielsequenz abhängt. Will man ein Drei-Finger-Zinkfingerprotein entwickeln, das an eine die Triplet-Subsite GAT enthaltende Zielsequenz bindet, so ist es beispielsweise notwendig, zu wissen, ob diese Subsites als erste, zweite oder dritte Subsite in der Zielsequenz vorliegt (d.h. ob die GAT-Subsite durch den ersten, zweiten oder dritten Finger des Proteins gebunden wird). Demzufolge wurden über 110 Drei-Finger-Zinkfingerproteine, die potenzielle GNN-erkennende Zinkfinger an verschiedenen Orten enthielten, durch Stellenselektionsexperimente ausgewertet. Im Allgemeinen wurden mehrere Zinkfingersequenzen entwickelt, um jedes GNN-Triplet zu erkennen, und jedes Design wurde in jeder der F1-, F2- und F3-Positionen durch 4 bis 6 Selektionsrunden untersucht.
Die Ergebnisse dieser Analysen, die in 2 gezeigt sind, stellen optimale positionsabhängige Zinkfingersequenzen (die gezeigten Sequenzen repräsentieren die Aminosäurereste –1 bis +6 des Erkennungshelixbereichs des Fingers) für eine Erkennung der 16 GNN-Zielsubsites als auch Stellenselektionsergebnisse für diese GNN-spezifischen Zinkfinger bereit. Optimale Aminosäuresequenzen für die Erkennung jeder GNN-Subsite aus jeder der drei Positionen (Finger 1, Finger 2 oder Finger 3) werden dadurch bereitgestellt.
Desings für GNG-bindende Finger
Die Aminosäuresequenz RSDXLXR (SEQ ID NO: 4085) (Position –1 bis +6 der Erkennungshelix) zeigte sich als optimal für die Bindung an die vier GNG-Triplets, wobei Asn⁺³ spezifisch für ein A als das mittlere Nukleotid ist, His⁺³ spezifisch für ein G als das mittlere Nukleotid ist, Ala⁺³ spezifisch für ein T als das mittlere Nukleotid ist und Asp⁺³ spezifisch für ein Cytosin als das mittlere Nukleotid ist. An der Position +5 wurden Ala, Thr, Ser und Gln untersucht und alle zeigten ähnliche Spezifitätsprofile durch Stellenselektion. Interessanterweise und im Gegensatz zu vorherigen Berichten (Swirnoff et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2275–2287) deuteten die Stellenselektionsergebnisse an, dass drei natürlich vorkommende GCG-bindende Finger von Zif268 und Sp-1, welche die Aminosäuresequenzen RSDELTR (SEQ ID NO: 123), RSDELQR (SEQ ID NO: 302) und RSDERKR (SEQ ID NO: 1100) enthielten, nicht GCG-spezifisch waren. Vielmehr wählte jeder dieser Finger etwa die gleiche Anzahl von GCG- und GTG-Sequenzen aus. Eine Analyse der Bindungsaffinität der Gelshiftexperimente bestätigte, dass Finger 3 von Zif268, der die Sequenz RSDERKR (SEQ ID NO: 1100) aufweist, GCG und GTG mit etwa der gleichen Affinität bindet.
Positionsabhängigkeit von GCA-, GAT-, GGT-, GAA- und GCC-bindenden Fingern
Basierend auf bestehenden Designregeln wurde die Aminosäuresequenz QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) (–1 bis +6) auf ihre Fähigkeit, das GCA-Triplet durch drei Positionen (F1, F2 und F3) innerhalb eines Drei-Finger-ZFP zu binden, hin untersucht. 3A zeigt, dass die QSGDLTR (SEQ ID NO: 220)-Sequenz vorzugsweise an die GCA-Triplet-Subsite von der F2- und F3-Position, jedoch nicht von der F1-Position, aus bindet. Tatsächlich führte die Gegenwart von QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) an der F1-Position von drei unterschiedlichen Drei-Finger-ZFPs vorwiegend zur Auswahl von GCT. Demzufolge wurde ein Versuch durchgeführt, um diese Sequenz neu zu entwickeln, um Spezifitäten für GCA von der F1-Position aus zu erhalten. Da die Sequenz Q^–1G⁺²S⁺³R⁺³ (SEQ ID NO: 4065) zuvor aus einer randomisierten F1-Bibliothek unter Verwendung von GCA als Ziel selektioniert wurde (Rebar et al. (1994), Science 263: 671–673), wurde ein D (Asp) nach S (Ser) Austausch an dem Rest +3 dieses Fingers durchgeführt. Die resultierende Sequenz QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) wurde für ihre Bindungsaffinität durch Stellenselektion untersucht und es hat sich gezeigt, dass diese vorzugsweise bei drei unterschiedlichen ZFPs GCA von der F1-Position aus bindet (siehe 2).
Der QSGSLTR (SEQ ID NO: 342)-Zinkfinger, der für eine Erkennung der GCA-Subsite von der F1-Position her optimiert wurde, wurde für seine Selektivität, wenn diese an der F2-Position vorkommt, untersucht. Demzufolge wurden zwei ZFPs, ein ZFP, das QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) an Finger 2 enthielt, und ein ZFP, das QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) an Finger 2 enthielt (beide mit identischen F1-Sequenzen und identischen F3-Sequenzen), durch Stellenselektion untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) vorzugsweise viel mehr an GTA als an GCA bindet, wenn QSGSLTR an der F2-Position verwendet wird. Für eine optimale Bindung einer GCA-Triplet-Subsite von der F1-Position aus ist demzufolge die Aminosäuresequenz QSGSLTR (SEQ ID NO: 342) erforderlich, während für eine optimale Bindung derselben Subsitesequenz von F2 oder F3 aus, QSGDLTR (SEQ ID NO: 220) verwendet werden sollte. Demzufolge können unterschiedliche Zinkfingeraminosäuresequenzen erforderlich sein, um eine bestimmte Triplet-Subsitesequenz abhängig von der Position der Subsite innerhalb der Zielsequenz und daher von der Position des Fingers in dem Protein zu spezifizieren.
Positionseffekte wurden auch für Zinkfinger beobachtet, die GAT- und GGT-Subsites erkannten. Die Zinkfingeraminosäuresequenz QSSNLAR (SEQ ID NO: 1765) (–1 bis +6) soll, basiert auf Designregeln, GAT binden. Diese Sequenz wählte GAT jedoch nur von der F1-Position aus und nicht von den F2- und F3-Positionen, von denen aus die Sequenz GAA vorzugsweise gebunden wurde (3B). Ähnlich sollte die Aminosäuresequenz QSSALTR (SEQ ID NO: 835) nach den Designregeln GGT binden, wählte GGT jedoch nur von der F1-Position, jedoch nicht von den F2- und F3-Positionen, aus, von denen aus vorzugsweise GGA gebunden wurde (3C). Umgekehrt wurde zuvor basierend auf der Selektion aus einer randomisierten Bibliothek für Finger 2 von Zif268 offenbart, dass die Aminosäuresequenz TSGHLVR (SEQ ID NO: 1425) das Triplet GGT erkennt. U.S. Patent Nr. 6,140,081. TSGHLVR (SEQ ID NO: 1425) war jedoch nicht spezifisch für die GGT-Subsite, wenn TSGHLVR an der Position F1 vorlag (3C). Diese Ergebnisse deuten an, dass die Bindungsspezifität vieler Finger positionsabhängig ist und machen insbesondere klar, dass die Sequenzspezifität eines aus einer F2-Bibliothek selektionierten Zinkfingers positionell begrenzt sein kann.
Die in 2 gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Erkennung wenigstens der GAA- und GCC-Triplets durch Zinkfinger positionsabhängig ist.
Diese Positionsabhängigkeiten stehen im Kontrast zu früher veröffentlichten Arbeiten, welche vorschlagen, dass Zinkfinger sich in Bezug auf die Sequenzspezifität ihrer Bindung an DNA als unabhängige Module verhalten. Desjarlais et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2256–2260.
Beispiel 5: Charakterisierung von EP2C
Das entwickelte Zinkfingerprotein EP2C bindet die Zielsequenz GCGGTGGCT mit einer Dissoziationskonstante (K_d) von 2 nM. Stellenselektionsergebnisse deuten darauf hin, dass die Finger 1 und 2 hochspezifisch für ihre Zielsubsites sind, während Finger 3 GCG (die gewünschte Zielsubsite) und GTG mit etwa der gleichen Häufigkeit wählt (4A). Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurden die Bindungsaffinitäten von EP2C an seine verwandte Zielsequenz und an abweichende Zielsequenzen durch Standardgelshiftanalysen gemessen (siehe Beispiel 1, supra). Als Standards wurden zum Vergleich die Bindungsaffinitäten von Sp-1 und Zif268 an ihre jeweiligen Ziele unter denselben Bedingungen gemessen und sind 40 nM für Sp-1 (Zielsequenz GGGGCGGGG) und 2 nM für Zif268 (Zielsequenz GCGTGGGCG). Die Messungen der Bindungsaffinitäten bestätigten, dass F3 von EP2C GTG und GCG gleich gut bindet (K_ds von 2 nM), hingegen GAG mit einer 2-fach geringeren Affinität bindet (4B). Finger 2 war sehr spezifisch für das GTG-Triplet und band 15-fach weniger stark an ein GGG-Triplet (vergleiche 2C0 und 2C3 in 4B). Finger 1 war auch sehr spezifisch für das GCT-Triplet. Finger 1 band ein GAT-Triplet (2C4) mit 4-fach geringerer Affinität und ein GCG-Triplet (2C5) mit 2-fach geringerer Affinität. Diese Beispiele zeigen wieder mal den hohen Grad der Korrelation zwischen den Seitenselektionsergebnissen und den Bindungsaffinitäten.
Beispiel 6: Beurteilung der entwickelten ZFPs durch in vivo-Funktionsassays
Um zu bestimmen, ob eine Korrelation zwischen der Bindungsaffinität eines entwickelten ZFP und seiner Zielsequenz und dessen Funktionalität in vivo besteht, wurden zellbasierte Reportergenassays verwendet, um die funktionellen Eigenschaften des entwickelten ZFP EP2C zu analysieren (siehe Beispiel 5, supra). Für diese Assays wurde ein Plasmid, das für das ZFP EP2C, fusioniert mit einer VP16-Transkriptionsaktivierungsdomäne, codiert, verwendet, um eine stabile Zelllinie (T-Rex-293^TM, Invitrogen, Carlsbad, CA) zu erzeugen, bei der die Expression von EP2C-VP16, wie in Zhang et al., supra, beschrieben, induzierbar ist. Um Reporterkonstrukte zu erzeugen, wurden drei Tandemkopien der EP2C-Zielstelle oder deren Varianten (siehe 4B, Spalte 2) zwischen den MluI- und BgIII-Stellen des Luciferase-codierenden pGL3-Vektors (Promega, Madison, WI) oberhalb des SV40-Promotors insertiert. Die Strukturen aller Reporterkonstrukte wurden durch DNA-Sequenzierungen bestätigt.
Luciferasereporterassays wurden durch Cotransfektion eines Luciferasereporterkonstrukts (200 ng) und pCMV-βgal (100 ng, als interne Kontrolle verwendet) in die EP2C-Zellen, die in 6-Well-Platten ausgebracht wurden, durchgeführt. Die Expression des EP2C-VP16-Transkriptionsaktivators wurde 24 Stunden nach der Transfektion der Reporterkonstrukte mit Doxycyclin (0,05 μg/ml) induziert. Die Zelllysate wurden 40 Stunden nach der Transfektion geerntet, Luciferase- und β-Galactosidaseaktivitäten wurden durch das Dual-Light-Reporter-Assaysystem (Tropix, Bedford, MA) bestimmt und die Luciferaseaktivitäten wurden auf die cotransfizierten β-Galactosidaseaktivitäten normalisiert. Die auf der rechten Seite von 4B gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die normalisierte Luciferaseaktivität für jedes Reporterkonstrukt sehr gut mit der in vitro-Bindungsaffinität von EP2C an die in dem Konstrukt vorliegende Zielsequenz korreliert. Beispielsweise stimulierten die Zielsequenzen, an die EP2C mit der höchsten Affinität band (2C0 und 2C2, K_d von 2 nM jeweils), die höchsten Luciferaseaktivitätsgrade, wenn sie verwendet wurden, um die Luciferaseexpression in dem Reporterkonstrukt anzutreiben (4B). Die Zielsequenzen 2C1 und 2C5, an die EP2C mit einer 2-fach geringeren Affinität band (K_d von 4 nM jeweils), stimulierten in etwa die Hälfte der Luciferaseaktivität der 2C0- und 2C2-Ziele. Die 2C3- und 2C4-Sequenzen, für die EP2C die geringsten in vitro-Bindungsaffinitäten zeigt, führten auch zu den niedrigsten in vivo-Aktivitätsgraden, wenn diese verwendet wurden, um die Luciferaseexpression voranzutreiben. Das Ziel 3B, eine Sequenz, an die EP2C nicht bindet, führte zu einem Hintergrundluciferaseaktivitätseffekt, ähnlich zu denjenigen, die mit einem Luciferase-codierenden Vektor, dem die EP2C-Zielsequenzen fehlten (pGL3), erzielt wurden. Demzufolge existieren gute Korrelationen zwischen der Bindungsaffinität (bestimmt durch K_d-Messung), der Bindungsspezifität (bestimmt durch Stellenselektion) und der in vivo-Funktionalität der entwickelten Zinkfingerproteine.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zinkfingerprotein, das an eine Zielstelle bindet, wobei das Zinkfingerprotein einen ersten (F1), einen zweiten (F2) und einen dritten (F3) Zinkfinger, angeordenet vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge F1, F2, F3, umfasst, wobei die Zielstelle in 3'-5'-Richtung eine erste (S1), eine zweite (S2) und eine dritte (S3) Zielsubsite umfasst, wobei jede Zielsubsite die Nukleotidsequenz GNN aufweist, wobei die Sequenzerkennung jeder dieser Zinkfinger von seiner Position in dem Zinkfingerprotein abhängt und wobei F1 die Aminosäuresequenz QRSNLVR umfasst, wenn S1 GAA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S2 GAA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S3 GAA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S1 GAG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S2 GAG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDNLTR umfasst, wenn S3 GAG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S1 GAC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S2 GAC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S3 GAC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSNLAR umfasst, wenn S1 GAT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGNLVR umfasst, wenn S2 GAT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSANLSR umfasst, wenn S3 GAT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGHLAR umfasst, wenn S1 GGA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S2 GGA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S3 GGA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDHLAR umfasst, wenn S1 GGG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S2 GGG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S3 GGG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSHLTR umfasst, wenn S1 GGC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSHLAR umfasst, wenn S2 GGC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSHLTR umfasst, wenn S1 GGT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGHLSR umfasst, wenn S2 GGT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSGHLVR umfasst, wenn S3 GGT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGSLTR umfasst, wenn S1 GCA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S2 GCA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S3 GCA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDDLQR umfasst, wenn S2 GCG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S3 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz ERGTLAR umfasst, wenn S1 GCC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S2 GCC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S3 GCC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S1 GCT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S2 GCT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSSDLQR umfasst, wenn S3 GCT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGALTR umfasst, wenn S1 GTA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGALAR umfasst, wenn S2 GTA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S1 GTG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDALSR umfasst, wenn S2 GTG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S3 GTG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S1 GTC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S2 GTC umfasst, und F3 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S3 GTC umfasst, mit der Maßgabe, dass das Zinkfingerprotein aus keinem der beiden folgenden Zinkfingerproteine besteht, wobei jedes der beiden Zinkfingerproteine die Finger (F1), (F2) und (F3) aufweist: ein Zinkfingerprotein, bei dem (F1) RSDNLAR umfasst, (F2) QSGNLAR umfasst und (F3) DRSNLTR umfasst, und ein Zinkfingerprotein, bei dem (F1) RSDHLAR umfasst, (F2) RSDNLAR umfasst und (F3) RSDHLSR umfasst.
Polypeptid, umfassend ein Zinkfingerprotein nach Anspruch 1 und wenigstens eine funktionelle Domäne.
Polynukleotid, codierend für ein Zinkfingerprotein nach Anspruch 1 oder ein Polypeptid nach Anspruch 2.
Verwendung eines Zinkfingerproteins, das an eine Zielstelle bindet, oder eines Polypeptids, umfassend das Zinkfingerprotein und wenigstens eine funktionelle Domäne, zur positionsabhängigen Erkennung von GNN-Triplets durch Zinkfinger, wobei das Zinkfingerprotein einen ersten (F1), einen zweiten (F2) und einen dritten (F3) Zinkfinger, angeordenet vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge F1, F2, F3, umfasst, wobei die Zielstelle in 3'-5'-Richtung eine erste (S1), eine zweite (S2) und eine dritte (S3) Zielsubsite umfasst, wobei jede Zielsubsite die Nukleotidsequenz GNN aufweist, wobei die Sequenzerkennung jeder dieser Zinkfinger von seiner Position in dem Zinkfingerprotein abhängt und wobei F1 die Aminosäuresequenz QRSNLVR umfasst, wenn S1 GAA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S2 GAA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S3 GAA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S1 GAG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S2 GAG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDNLTR umfasst, wenn S3 GAG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S1 GAC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S2 GAC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S3 GAC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSNLAR umfasst, wenn S1 GAT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGNLVR umfasst, wenn S2 GAT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSANLSR umfasst, wenn S3 GAT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGHLAR umfasst, wenn S1 GGA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S2 GGA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S3 GGA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDHLAR umfasst, wenn S1 GGG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S2 GGG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S3 GGG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSHLTR umfasst, wenn S1 GGC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSHLAR umfasst, wenn S2 GGC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSHLTR umfasst, wenn S1 GGT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGHLSR umfasst, wenn S2 GGT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSGHLVR umfasst, wenn S3 GGT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGSLTR umfasst, wenn S1 GCA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S2 GCA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S3 GCA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDDLQR umfasst, wenn S2 GCG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S3 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz ERGTLAR umfasst, wenn S1 GCC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S2 GCC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S3 GCC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S1 GCT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S2 GCT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSSDLQR umfasst, wenn S3 GCT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGALTR umfasst, wenn S1 GTA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGALAR umfasst, wenn S2 GTA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S1 GTG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDALSR umfasst, wenn S2 GTG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S3 GTG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S1 GTC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S2 GTC umfasst, und F3 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S3 GTC umfasst.
Komplex zwischen einem Zinkfingerprotein, das an eine Zielstelle bindet, oder einem Polypeptid, umfassend das Zinkfingerprotein und wenigstens eine funktionelle Domäne, und seiner Zielstelle, wobei das Zinkfingerprotein einen ersten (F1), einen zweiten (F2) und einen dritten (F3) Zinkfinger, angeordenet vom N-Terminus zum C-Terminus in der Reihenfolge F1, F2, F3, umfasst, wobei die Zielstelle in 3'-5'-Richtung eine erste (S1), eine zweite (S2) und eine dritte (S3) Zielsubsite umfasst, wobei jede Zielsubsite die Nukleotidsequenz GNN aufweist, wobei die Sequenzerkennung jeder dieser Zinkfinger von seiner Position in dem Zinkfingerprotein abhängt und wobei F1 die Aminosäuresequenz QRSNLVR umfasst, wenn S1 GAA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S2 GAA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGNLAR umfasst, wenn S3 GAA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S1 GAG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDNLAR umfasst, wenn S2 GAG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDNLTR umfasst, wenn S3 GAG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S1 GAC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S2 GAC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSNLTR umfasst, wenn S3 GAC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSNLAR umfasst, wenn S1 GAT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGNLVR umfasst, wenn S2 GAT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSANLSR umfasst, wenn S3 GAT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGHLAR umfasst, wenn S1 GGA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S2 GGA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGHLQR umfasst, wenn S3 GGA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDHLAR umfasst, wenn S1 GGG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S2 GGG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDHLSR umfasst, wenn S3 GGG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSHLTR umfasst, wenn S1 GGC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSHLAR umfasst, wenn S2 GGC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSHLTR umfasst, wenn S1 GGT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz TSGHLSR umfasst, wenn S2 GGT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz TSGHLVR umfasst, wenn S3 GGT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGSLTR umfasst, wenn S1 GCA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S2 GCA umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSGDLTR umfasst, wenn S3 GCA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S1 GCG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDDLQR umfasst, wenn S2 GCG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDDLTR umfasst, wenn S3 GCG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz ERGTLAR umfasst, wenn S1 GCC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S2 GCC umfasst, F3 die Aminosäuresequenz DRSDLTR umfasst, wenn S3 GCC umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S1 GCT umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSSDLTR umfasst, wenn S2 GCT umfasst, F3 die Aminosäuresequenz QSSDLQR umfasst, wenn S3 GCT umfasst, F1 die Aminosäuresequenz QSGALTR umfasst, wenn S1 GTA umfasst, F2 die Aminosäuresequenz QSGALAR umfasst, wenn S2 GTA umfasst, F1 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S1 GTG umfasst, F2 die Aminosäuresequenz RSDALSR umfasst, wenn S2 GTG umfasst, F3 die Aminosäuresequenz RSDALTR umfasst, wenn S3 GTG umfasst, F1 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S1 GTC umfasst, F2 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S2 GTC umfasst, und F3 die Aminosäuresequenz DRSALAR umfasst, wenn S3 GTC umfasst, mit der Maßgabe, dass das Zinkfingerprotein nicht aus einem Zinkfingerprotein besteht, bei dem (F1) RSDHLAR umfasst, (F2) RSDNLAR umfasst und (F3) RSDHLSR umfasst.