KR102091298B1 - 말산 탈수소효소의 표적화된 변형 - Google Patents

말산 탈수소효소의 표적화된 변형 Download PDF

Info

Publication number
KR102091298B1
KR102091298B1 KR1020147033395A KR20147033395A KR102091298B1 KR 102091298 B1 KR102091298 B1 KR 102091298B1 KR 1020147033395 A KR1020147033395 A KR 1020147033395A KR 20147033395 A KR20147033395 A KR 20147033395A KR 102091298 B1 KR102091298 B1 KR 102091298B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
sequence
mmdh
artificial sequence
zinc finger
Prior art date
Application number
KR1020147033395A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150013211A (ko
Inventor
비풀라 슈클라
만주 굽타
표도르 우르노프
드미트리 구스친
데 보쓰 미치엘 잔
폴 번독
락슈미 사스트리-덴트
Original Assignee
다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨, 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Publication of KR20150013211A publication Critical patent/KR20150013211A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102091298B1 publication Critical patent/KR102091298B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/825—Solanum lycopersicum [tomato]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

하나 이상의 내인성 식물 말산 탈수소효소 유전자의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 개시된다.

Description

말산 탈수소효소의 표적화된 변형{TARGETED MODIFICATION OF MALATE DEHYDROGENASE}
관련출원과의 상호참조
본 출원은 2012년 5월 2일 출원된 미국 가특허출원 제61/641,776호 및 2013년 3월 13일 출원된 미국 가특허출원 제61/780,512호의 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
정부 지원된 연구 하에서 만들어진 발명에 대한 권리의 언급
적용 없음.
기술 분야
본 명세서는 유전자 조작, 특히 내인성(endogenous) 식물 말산 탈수소효소(MDH) 유전자의 교체된 발현 및/또는 표적화된 변형 분야에 속한다.
식품 생산을 위한 증가하는 세계적 요구의 도전을 충족시키기 위한 노력에서 생명공학은 필수적인 도구로 대두되었다. 농업 생산량을 개선시키기 위한 통상적인 접근, 예컨대 향상된 수확량 또는 유전자 조작된 병해충 저항성(pest resistance)은 돌연변이유발 육종(breeding) 또는 작물 종의 게놈에 형질전환에 의한 신규 유전자의 도입에 의존한다. 두 가지 처리는 모두 본질적으로 비특이적이며 상대적으로 비효율적이다. 예컨대, 통상적인 식물 형질전환 방법은 무작위 위치에서 게놈에 통합되는 외인성 DNA를 전달한다. 따라서, 바람직한 특질을 가지는 유전자 이식 주(transgenic line)를 확인하고 분리하기 위해서, 수천 개의 독특한 무작위-통합 사건을 발생시킨 다음, 후속해서 원하는 사건에 대해 스크리닝하는 것이 필요하다. 그 결과, 통상적인 식물 형질 유전자 조작은 노동 집약적이고, 시간 소모적이며, 예측 가능하지 않은 일이다. 더 나아가, 이들 통합의 무작위 특성은 의도하지 않은 게놈 파괴로 인한 다면발현(pleiotropic) 효과가 발생하였는지 여부를 예측하는 것을 어렵게 만든다. 그 결과, 유전자 조작된 이식유전자 또는 형질을 가지는 식물 주의 생성, 분리 및 특징화는 극도로 노동 및 비용 집약적인 처리이며, 성공 가능성은 낮다.
표적화된 유전자 변형은 식물계에서 통상적인 실행에 대한 물류 상의 도전 과제를 극복하므로, 그 자체로도 기본적인 식물 생물학 연구와 농업 생명공학 둘 다에서 오래 지속 되어 온 목표이긴 하지만, 달성하기 힘든 목표가 되었다. 그러나, 벼에서의 양성-음성 약물 선별을 통한 "유전자 표적화" 또는 사전 유전자 조작된 제한자리를 사용하는 경우를 제외하고는, 모델과 작물 둘 다의 모든 식물 종에서 표적화된 게놈 변형은 최근까지 극히 어려운 것으로 입증되었다. 문헌[Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93].
최근에, 게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 방법 및 조성물이 설명되었다. 이러한 표적화된 절단 사건을 사용하여, 예컨대 표적화된 돌연변이유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 돌연변이(예컨대, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 유도하며, 사전 결정된 염색체 유전자 자리(locus)에서의 표적화된 재조합 및 통합을 촉진할 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 모든 목적을 위하여 전문이 참조로 포함된, 문헌[Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51]; 미국 특허 공개공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20090263900호; 제20090117617호; 제20100047805호; 제20110207221호; 제20110301073호; 제2011089775호 및 국제 공보 WO 2007/014275를 참조할 수 있다. 절단은 특이적 뉴클레아제 예컨대, 유전자 조작된 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nucleases: ZFN), 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription-activator like effector nucleases: TALEN), 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonucleases)의 사용을 통해, 또는 유전자 조작된 crRNA/tracr RNA('단일 가이드 RNA')를 가지는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생하여 특이적 절단을 안내할 수 있다. 미국 특허 공개공보 제20080182332호에는 식물 게놈의 표적화된 변형을 위한 비정규 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)의 용도가 설명되어 있으며, 미국 특허 공개 제20090205083호에는 식물 EPSPS 유전자 자리의 ZFN-매개 표적화된 변형이 설명되어 있으며, 미국 특허 제20100199389호에는 식물 Zp15 유전자 자리의 표적화된 변형이 설명되어 있으며, 미국 특허 제20110167521호에는 지방산 생합성에 관여하는 식물 유전자의 표적화된 변형이 설명되어 있다. 추가로, 문헌[Moehle et al . (2007) Proc . Natl . Acad , Sci . USA 104(9): 3055-3060]는 특정된 유전자 자리에서 표적화된 유전자 첨가를 위해 설계된 ZFN의 사용을 설명한다.
탄소 동화작용은 모든 생물의 대사 기능의 중심이다. ATP를 합성하고, 항상성, 성장 및 생식을 위해 그의 에너지를 활용하는 능력은 계를 넘어 보존되며, 대다수의 공지된 생물학적 과정에 영향을 미친다. 진핵생물에서 ATP 합성의 기본 성분은 시트르산 또는 크렙스(Krebs) 회로로도 알려진 트리카르복시산(TCA) 회로이며, 이는 유기산으로부터 산화된 산화환원 보조인자 NAD+ 및 FAD로 전자를 이동시켜, NADH, FADH2 및 이산화탄소를 형성한다. TCA 회로는 미토콘드리아 내에서 발생하며, 식물에서 그의 반응 동안 생산된 중간물은 무수한 생합성 경로를 위한 기질로서 제공되며, 아스파르트산, 글루탐산, 핵산, 포르피린 및 지방산의 생산을 위한 주된 투입이 TCA 회로에서 비롯된다. 추가로, TCA 회로 중간물은 광호흡 및 광합성의 에너지 과정에서 중요한 역할을 한다. 따라서, TCA 회로는 엽록체, 미토콘드리아 및 시토졸 산화환원 기능 사이에서 링크로서 작용하는 것으로 이해된다.
말산염은 TCA 회로의 중간물 중 하나이며, 피루빈산을 생성하는 말산 효소 및 말산 탈수소효소(MDH) 둘 다를 위한 기질로서 작용한다. MDH는 NADH를 통해 옥살로아세테이트(OAA)의 말산염으로의 가역적인 환원을 촉매하며, 말산염/아스파르트산염 셔틀에 관여한다. 대부분의 식물은 핵 유전자에 의해 암호화되는 미토콘드리아 및 시토졸 효소를 포함하는, MDH의 다중 이형을 포함한다. 식물 미토콘드리아 MDH(mMDH)는 3 유형의 반응에 참여한다: 말산염의 OAA로의 전환, OAA의 말산염으로의 환원, 및 OAA의 C4-경로 환원. 옥수수(C4 식물)에서, 5 개의 독립 염색체에 5 개의 별개의 MDH 유전자 자리가 있으며, 이중 2 개는 시토졸 이형을 암호화하며, 다른 3 개는 미토콘드리아 효소를 암호화한다. 전통적인 돌연변이 분석을 사용하여, MDH의 2 개의 시토졸 형태의 기능의 완전한 손실은 식물 성장 및 생식에 유해한 효과가 없음-시토졸 기능은 불필요한 것으로 보임을 증명하였다. 대조적으로, 3 개의 미토콘드리아 효소의 완전한 손실은 치명적이며-독자 생존이 가능하기 위해 식물은 하나 이상의 기능적 대립유전자를 필요로 한다(문헌[Goodman et al . (1981) Proc. Nat . Acad . Sci . USA 78:1783-1785]). 유사하게, 대두에서 미토콘드리아 MDH-1의 자발적인 제로 대립유전자(Mdh1-n)의 자연스러운 발생의 관찰은 미토콘드리아 Mdh2 유전자가 안정하게 유지되는 한 명백한 식물 표현형이 없었음을 나타낸다(문헌[Imsande et al . (2001) J. Heredity 92:333-338]).
식물 대사에서 그의 기본적인 역할에도 불구하고, TCA 회로에서 말산염의 기능은 여전히 완전하게 이해되지 않았다. MDH-돌연변이 식물은 보다 느린 성장 속도 및 교체된 광호흡 특성을 보인다. 문헌[Tomaz et al . (2010) Plant Physiol . 154(3):1143-1157]을 참고할 수 있다. 전체 식물 또는 열매에서 연구된 안티-센스 및 RNAi는 대조적인 결과를 나타내며, 이는 증가된 건조(신선하지 않음) 열매 중량을 가진 식물뿐만 아니라 야생형 대조군보다는 그들의 잎의 보다 더 높은 아스코르브산염 수준을 가지는 식물을 포함하나, 짧은 일광 조건(광호흡을 선호함)하에서 성장될 때, 식물은 왜소 표현형을 나타내며, 잎, 줄기 및 뿌리에서 감소된 바이오매스(biomass)를 가진다. 문헌[Nunes-Nesi et al. (2005) Plant Physiol. 137: 611-622); Nunes-Nesi et al . (2007) Physiol . Plant. 129:45-56); Nunes-Nesi (2008) J. Exp. Bot. 59:1675-1684; Finkmeier and Sweetlove (2009) F1000 Biology Reports I:47; doi:10.3410/B1-47]. 더 나아가, 감소된 mMDH 발현을 가진 mMDH 안티-센스 주는 상기 효소의 감소된 활성(야생형의 39 %)이 감소된 뿌리 영역 및 저해된 뿌리 성장을 초래함을 보인다. 문헌[Van der Merwe et al . (2009) Plant Physiol. 149:653-669); Van Der Merwe et al . (2010) Plant Physiol. 153:611-621)]. 더 나아가, mMDH 안티-센스 주는 열매 건조의 증가(보다 많은 H2O 손실) 및 진균 감염에 대한 증가된 민감성을 보인다. 문헌[Centeno et al . (2011) Plant Cell 23:162-184]. 미국 특허 공보 제20090123626호는 아스파라긴 수준을 감소시키기 위한 MDH RNAi의 사용을 설명하고 있으며, 이는 다시 식물 및 식물 생산물의 처리-관련 가열시 축적되는 아크릴아미드의 수준을 저하시킨다.
따라서, 식물 및 그의 자손에서 안정한 유전성 유전자 변형을 수립하기 위해 식물에서, 예컨대, MDH 유전자의 표적화된 유전자 변형에 의한 MDH 유전자의 발현 교체를 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 개시내용은 MDH 유전자(들)뿐만 아니라 MDH에 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 포함하는 세포(예컨대, 종자), 세포주, 유기체(예컨대, 식물) 등의 표적화된 변형을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. MDH 유전자는 예컨대, 미토콘드리아 MDH 유전자(mMDH)일 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 안티-센스 및 RNA-간섭 기술에 의한 MDH 효소 기능의 감소를 나타내는 연구는 예컨대, 열매 수확량에서 MDH 억제의 효과(들)와 대립되는 결과를 제공한다. 이러한 연구에 기반하여 TCA 회로 흐름의 억제가 광합성에 부정적인 영향을 가질 것이라고 예상된다. 따라서, 본 발명자들이 MDH 기능(활성)을 저하시키는, MDH의 표적화된 돌연변이를 포함하는 식물(및 식물 세포)이 MDH-변형된 세포를 포함하는 식물로부터 증가된 작물 수확량을 초래한다는 것을 나타낸 것은 놀랍고도 예상치 못한 것이다. 증가된 수확량은 예컨대, 열매 수확량의 증가량, 식물(또는 식물의 열매)의 증가된 바이오매스, 보다 높은 함량의 과육, 보다 큰 식물, 증가된 건조 중량, 증가된 고체 내용물, 수확시 보다 높은 총 중량, 작물 색상의 증대된 강도 및/또는 균일함, 교체된 화학(예컨대, 오일, 지방산, 탄수화물, 단백질) 특성 등을 포함할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, MDH의 발현이 감소되도록 내인성 MDH 유전자의 발현이 변형되고 식물이 증가된 작물 수확량을 보이는 식물 세포를 포함한 식물이 본 명세서에서 개시된다. 특정 실시태양에서, 내인성 MDH 유전자의 발현은 기능적 도메인 및 DNA-결합 단백질(예컨대, 아연 핑거 단백질, TAL 이펙터 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 교체된다. 특정 실시태양에서, 식물 세포는 MDH 유전자(예컨대, mMDH)의 표적화된 변형을 포함하며, 여기서 MDH 발현을 감소시키는 표적화된 변형은 뉴클레아제, 예컨대, 내인성 유전자를 절단하고 그의 발현을 감소시키는 기능적 도메인(예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제) 및 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질에 의해 유도된다. 예컨대, MDH 유전자의 NADH 결합 영역(예컨대, 유전자의 제1 및/또는 제2 NADH 결합 영역) 내의 하나 이상의 아미노산이 변형(예컨대, 결실, 치환 및/또는 삽입)될 수 있다. 특정 실시태양에서, 변형은 식물 세포 내 내인성 MDH 유전자의 제1 및/또는 제2 NADH 결합 영역의 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 야생형 MDH 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호:1(야생형 토마토 MDH 서열), 서열 번호:126(야생형 MDH 서열) 및/또는 서열 번호:125(야생형 대두 MDH 서열))에 나란하고(예컨대, 도 10) 이에 대해 번호 매긴, 위치 104-136 및/또는 171-220에서 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 것을 포함한다.
아연 핑거 단백질은 표 1A의 단일 열에서 나타나고/나거나 표 1B에 나타낸 바와 같이 표적 서열에 결합한 인지 나선 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레아제는 TAL 이펙터 도메인, 호밍 엔도뉴클레아제 및/또는 Crispr/Cas 단일 안내 RNA를 포함한다. MDH 발현의 표적화된 교체(예컨대, 표적화된 게놈 변형)는 MDH 활성을 증대시키거나 감소시킬 수 있으며, 예컨대, 유전자 생성물의 비정상적인 전사(예컨대, 프레임-시프트, 신규한 정지 코돈 또는 다른 돌연변이유발)를 초래하는 돌연변이유발을 만듦으로써 MDH 활성을 감소시킨다. 특정 실시태양에서, 뉴클레아제를 사용한 표적화된 변형은 또한 삽입-결실(indel)로도 알려진, 작은 삽입 및/또는 결실, 예컨대, 표 4에 나타낸 삽입-결실을 포함한다. 세포에서 변형은 하나 이상의 대립유전자(예컨대, 유사유전자에서 동형접합체, 이형접합체)일 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 임의의 식물 세포는 식물 또는 식물 부분(예컨대, 종자, 꽃, 열매), 예컨대, 임의의 종류의 토마토(예컨대, M82 또는 머니메이커(Moneymaker)), 콩, 옥수수, 감자, 알팔파 등에 속할 수 있다.
또 다른 측면에서, MDH 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 단백질(ZFP))이 본 명세서에서 설명된다. 아연 핑거 단백질은 하나 이상의 아연 핑거(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아연 핑거)를 포함할 수 있으며, 유전자 조작되어 임의의 MDH 유전자 내의 임의의 서열에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 임의의 아연 핑거 단백질은 MDH 발현의 변형이 성취되는 한, MDH의 암호화 서열 내의 또는 인접한 서열(예컨대, 프로모터 또는 다른 발현 요소) 내의 표적 자리에 결합할 수 있다. 특정 실시태양에서는, 아연 핑거 단백질은 mMDH 유전자의 표적 자리, 예컨대, 표 1B에 나타낸 표적 서열에 결합한다. 다른 실시태양에서, 성분 아연 핑거의 인지 나선 영역은 표 1A의 단일 열에 나타낸 바와 같이 핑거 1 내지 핑거 5(F1 내지 F5) 또는 핑거 1 내지 핑거 6(F1 내지 F6)으로 정리된다. 아연 핑거 단백질의 하나 이상의 성분 아연 핑거 결합 도메인은 정규(C2H2) 아연 핑거 또는 비정규(예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다(예컨대, N-말단 및/또는 C-말단 아연 핑거가 비정규 핑거일 수 있음).
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 본 명세서에서 개시되며, 융합 단백질 각각은 하나 이상의 MDH 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 단백질)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 MDH-결합 아연 핑거 단백질 및 기능적 도메인, 예컨대, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및/또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 실시태양에서, 융합 단백질은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. 절단 도메인 및 절단 하프 도메인은 예컨대, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 호밍 엔도 뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 한 실시태양에서, 절단 하프-도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제(예컨대, Fok I)에서 유래한다.
다른 측면에서, 임의의 DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 단백질) 및/또는 본 명세서에서 설명되는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시태양에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에서 설명되는 하나 이상의 ZFP를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ZFP 발현 벡터가 본 명세서에서 설명된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 ZFP는 ZFN이다.
ZFP 및 이러한 ZFP를 포함하는 융합 단백질은 유전자의 암호화 영역 내, 또는 유전자 내의 또는 이에 인접한 비-암호화 서열, 예컨대, 리더 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론, 또는 프로모터 서열 내, 또는 비전사 영역, 코딩 영역의 업스트림 또는 다운스트림 내에서 하나 이상의 MDH 유전자(예컨대, mMDH 유전자)를 결합할 수 있고/있거나 절단할 수 있다. 특정 실시태양에서, ZFP 또는 ZFN은 MDH 유전자의 조절 서열 또는 암호화 서열을 결합하고/하거나 절단한다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 단백질, 융합 단백질 및/또는 본 명세서에서 설명되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 설명된다. 식물 세포는 한 고유한 MDH 유전자 표적 또는 다중 유사 MDH 표적을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명되는 조성물은 식물 세포에서 하나 이상의 MDH 유전자를 표적화하는 하나 이상의 ZFP-함유 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. ZFP는 모든 유사유전자 또는 상동 유전자 및 식물 세포에서 선택된 특정 유사유전자 또는 상동 유전자 또는 일부 유사유전자 및 일부 상동 유전자의 조합 모두를 표적화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 식물 세포에서 하나 이상의 MDH 유전자(예컨대, 내인성 mMDH 유전자)의 발현을 교체하기 위한 방법이 본 명세서에서 제공되며, 상기 방법은 MDH의 발현이 교체되도록 세포 내의 단백질(예컨대, 아연 핑거 단백질)을 함유한 하나 이상의 DNA-결합 도메인을 발현하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제(단백질 및/또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 사용하여 MDH 발현을 방해하는 작은 삽입 및/또는 결실("삽입-결실")을 생성하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 예컨대, 이식유전자 또는 발현 증대 요소의 표적화된 삽입을 통해 MDH 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, MDH 발현을 교체하는 방법은 하나 이상의 아연 핑거 전사 인자(MDH-결합 아연 핑거 단백질 및 전사 조절 도메인인 기능적 도메인, 예컨대, 활성화 또는 억제 도메인을 포함하는 융합 단백질)을 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 교체된 MDH 발현/기능은 식물 세포 내에서 증가된 광합성을 초래한다. 특정 실시태양에서, 교체된 MDH 발현/기능은 식물 세포 내에서 시트르산 회로의 변형을 초래한다. 특정 실시태양에서, 교체된 MDH 발현/기능은 식물 세포에서 보다 높은 수준의 말산염을 유발한다. 다른 실시태양에서, MDH의 교체된 발현/기능은 세포에서 감소된 OAA 수준을 유발한다. 한 실시태양에서, 식물 세포에서 교체된 MDH 발현/기능은 증가된 수확량을 갖는 식물을 유발한다. 특정 실시태양에서, 수확량의 증가는 수득된 각 열매의 보다 많은 생체중(fresh weight) 및 돌연변이 식물의 제1 트러스(truss)로부터 수확된 모든 열매의 총 생체중을 유발한다.
또 다른 측면에서, MDH 유전자의 교체된 발현 및 변형을 검출 및/또는 측정하기 위한 핵산 및 항체, 및 이를 사용하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포에서 하나 이상의 MDH 유전자를 변형하는 방법이 본 명세서에서 설명된다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 뉴클레아제(예컨대, ZFN(들))가 발현되고 하나 이상의 MDH 유전자가 절단됨으로써 하나 이상의 MDH 유전자를 변형하도록 하는 조건 하에서, 하나 이상의 MDH 유전자의 표적 자리에 결합한 하나 이상의 뉴클레아제(예컨대, ZFN)을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 단백질 형태의 하나 이상의 뉴클레아제를 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, mMDH 유전자 내에 하나 이상의 표적 자리가 있다. 다른 실시태양에서, 하나 초과의 MDH 유전자가 절단된다. 더 나아가, 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 하나 이상의 유전자의 절단은 예컨대, MDH 활성이 교체(예컨대, 증대 또는 감소)되도록 절단된 영역에서 뉴클레오티드의 결실, 첨가 및/또는 치환을 초래할 수 있다.
또 다른 측면에서, 식물 세포 내 MDH 활성이 교체되도록 식물 세포의 게놈 내로 외인성 서열(이식유전자)을 도입하는 방법이 본 명세서에서 설명되며, 상기 방법은 (a) 세포를 외인성 서열(공여자 벡터)에 접촉하는 단계, 및 (b) 세포에서 본 명세서에서 설명되는 하나 이상의 뉴클레아제(예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제)를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (b)에서 염색체의 DNA의 절단이 상동 재조합에 의해 공여자 벡터의 게놈 내로의 도입을 촉진하도록, 하나 이상의 뉴클레아제가 염색체의 DNA를 절단한다. 특정 실시태양에서, 외인성 서열은 MDH 유전자 내로 도입된다. 다른 실시태양에서, 외인성 서열은 MDH 유전자 근처로 도입된다. MDH 활성은 증가되거나 감소될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 유형 IIs 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인 사이의 융합일 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레아제는 호밍 엔도뉴클레아제, 예컨대, 변형된 DNA-결합 도메인을 갖는 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 외인성 서열은 단백질 생성물을 암호화할 수 있다.
추가 측면에서, 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에 따라 수득된 식물 세포도 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에서 설명되는 식물 세포를 포함하는 식물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이 수득된 식물 세포를 포함하는 식물의 종자가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이 수득된 식물 세포를 포함하는 식물로부터 수득된 열매가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에서 설명되는 임의의 조성물(세포 또는 식물) 또는 방법에서, 식물 세포는 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 식물 세포는 농작물, 예컨대, 토마토(또는 다른 열매 작물), 감자, 옥수수, 콩, 알팔파 등이다.
도 1은 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum )(v. M82)의 미토콘드리아 MDH(mMDH) 유전자의 다양한 구조 요소를 개략적으로 묘사한다.
도 2, 패널 A 및 B는 토마토 미토콘드리아 말산 탈수소효소(mMDH) 유전자의 게놈 구성 및 서열을 묘사한다. 도 2a는 엑손 1, 3, 4, 및 6에서 ZFN에 대한 표적 자리(엑손 위의 짧은 좌우 지칭 화살표)를 나타낸다. 도 2a의 표지된 ZFN 결합 서열 번호는 표 1에 설명된 ZFN 번호에 상응하고, 표 1의 107830L는 도 2a에서 830L로 설명되며, 표 1의 107830R은 도 2a에서 830R로 설명되며, 표 1의 107832L은 도 2a에서 832L로 설명되며, 표 1의 107832R은 도 2a에서 832R로 설명되며, 표 1의 107833L은 도 2a에서 833L로 설명되며, 표 1의 107833R은 도 2a에서 833R로 설명되며, 표 1의 107835L은 도 2a에서 835L로 설명되며, 표 1의 107835R은 도 2a에서 835R로 설명된다. 도 2b(서열 번호:2)는 mMDH 유전자 자리의 서열을 나타내며, 엑손은 밑줄이 그어져 있고, ZFN 표적 자리는 굵게 표시하였다.
도 3은 pKG7479의 플라스미드 맵을 나타내는 개략도이다.
도 4은 pKG7480의 플라스미드 맵을 나타내는 개략도이다.
도 5은 pKG7481의 플라스미드 맵을 나타내는 개략도이다.
도 6은 pKG7482의 플라스미드 맵을 나타내는 개략도이다.
도 7은 원형질체에서 ZFN 활성에 의한 토마토 mMDH 유전자로 유도된 작은 삽입 또는 결실("삽입-결실")의 서열 분석을 묘사한다. ZFN은 토마토 원형질체에서 일시적으로 발현되며, 삽입-결실은 HRM 분석을 사용하여 검출하였다. 각 ZFN의 mMDH 표적 자리는 밑줄 그은 결합 자리로 나타난다. 결실(-로 나타냄) 또는 삽입(굵게 표시)을 포함하는 증폭된 생성물이 각 표적 서열 아래에 나타난다.
도 8, 패널 A 및 B는 F2 식물의 mMDH 활성을 나타내는 그래프이다. 도 8a는 주 107832_9-6(-3 bps 삽입-결실)에서 유래된 F2 식물의 mMDH 활성의 관찰을 나타내는 그래프이다. "126 9-6 WT"는 삽입-결실 돌연변이가 결여된 F2 식물의 생화학적 검사 결과를 확인하며, "115 9-6 M"은 삽입-결실 돌연변이에 대해 동형 접합성인 F2 식물을 확인하며, "132 9-6 H"는 삽입-결실 돌연변이에 대해 이형 접합성인 F2 식물을 확인하다. 도 8b는 주 107832_10-2(-2 bps 삽입-결실)에서 유래된 F2 식물의 mMDH 활성의 관찰을 나타내는 그래프이다. WT48은 삽입-결실 돌연변이가 결여된 F2 식물을 확인하며, "M60"은 삽입-결실 돌연변이에 대해 동형 접합성인 F2 식물을 확인하며, "H32"는 삽입-결실 돌연변이에 대해 이형 접합성인 F2 식물을 확인한다.
도 9는 주 107832 9-6의 토마토 열매 수확량을 묘사하는 그래프이다. 평균 토마토 중량(g)은 mMDH 유전자 자리의 -3 bps 돌연변이와 구별되는 F2 식물의 3 부류에 대해 Y 축 상에 나타난다. "WT"은 삽입-결실이 결여된 F2 식물을 확인하며, "Het"는 삽입-결실에 대해 이형 접합성인 F2 식물을 확인하며, "Homo"는 삽입-결실에 대해 동형 접합성인 F2 식물을 확인한다.
도 10은 대두(서열 번호:125), 콘(서열 번호:126), 및 토마토(서열 번호:1) mMDH 효소의 서열 배열이다.
도 11은 토마토 게놈에서 발생하는 mMDH 돌연변이의 서열 배열이다.
도 12는 mMDH 효소에 의해 촉매되는 생화학 반응을 나타내는 개략도이다.
도 13은 NADH 산화에 대한 분광학적 모니터링으로 측정된 야생형 및 두 개의 돌연변이 토마토 mMDH의 특이적 활성을 묘사하는 표이다. "mMDH del 3" 돌연변이는 야생형 효소의 활성의 약 23 %를 유지하며, "mMDH del3 NADH BS1" 돌연변이의 활성은 야생형 효소의 활성의 약 1.5 %로 상당히 약화된다.
본 명세서는 식물 세포 또는 식물에서 하나 이상의 말산 탈수소효소(MDH) 유전자의 교체된 발현, 예컨대, MDH 유전자, 예컨대 식물 세포(예컨대, 옥수수, 토마토, 콩 등) 내 미토콘드리아 말산 탈수소효소(mMDH) 유전자의 표적화된 게놈 변형을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, MDH의 발현은 DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 단백질) 및 기능적 도메인(예컨대, 전자 조절 도메인 및/또는 뉴클레아제)를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 교체된다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 뉴클레아제(예컨대, ZFN)를 사용하여 MDH 유전자를 절단하여 MDH 유전자 자리에서 변형(예컨대, 돌연변이)을 생성함으로써 표적화된 변형이 성취된다. DNA-결합 도메인, 예컨대, 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 류신 지퍼 DNA-결합 도메인, TAL DNA-결합 도메인, 아연 핑거 단백질(ZFP), Crispr/Cas 시스템 또는 상술된 것의 키메라 조합을 포함하는 융합 단백질의 사용을 통해 절단이 표적화된다. 특정 실시태양에서, 변형은 내인성 MDH 유전자의 제1 및/또는 제2 NADH 결합 영역 내 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 서열 번호:1(야생형 토마토 MDH 서열), 서열 번호:125(야생형 콘 MDH 서열) 및/또는 서열 번호:126(야생형 대두 MDH 서열)에 나란하고 이에 대해 번호 매겨진 위치 104-136 및/또는 171-220에서의 하나 이상의 아미노산이 교체되도록, MDH 유전자의 돌연변이(치환, 결실 및/또는 삽입)를 포함한다.
특정 실시태양에서, 뉴클레아제(들)는 하나 이상의 ZFN을 포함한다. ZFN은 전형적으로 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인) 및 내인성 MDH 유전자의 표적 자리에 결합된 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. ZFN은 단백질로서, 이들 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서 및/또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 암호화 폴리뉴클레오티드의 조합으로서 도입될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 전형적으로 절단 하프 도메인의 다이머화 후 다이머 단백질로 작용하며, 호모다이머 및/또는 헤테로다이머를 형성할 수 있다. "좌측" 및 "우측" 인식 도메인에 대해 ZFN 모노머가 결합하는 절대(obligate) 헤테로다이머 ZFN은 결합하여 설명한 활성 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 공개 제2008/0131962호를 참조할 수 있다. 따라서, 적절한 표적 자리가 주어졌을 때, "좌측" 모노머가 임의의 "우측" 모노머와 함께 활성 ZFN 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 이것은 다양한 조합으로 사용될 수 있는 입증된 우측 및 좌측 도메인에 기반한 유용한 뉴클레아제 자리의 수를 상당히 증가시킨다. 예컨대, 4개의 호모다이머 ZF 뉴클레아제의 결합 자리의 재조합으로 추가적인 12개 헤테로다이머 ZF 뉴클레아제를 얻는다. 더 중요하게는, 이는 유전자 이식 설계에 대한 체계적인 접근을 가능하게 하며, 모든 새로 도입된 외인성 서열(이식 유전자)은 방출된 유전자를 절제하거나 또는 그것의 옆에 있는 추가적인 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 독특한 ZFN 자리와 인접하게 된다. 추가적으로, 이 방법은 ZFN-의존적 이중가닥 파괴에 의해 구동되는 단일 유전자 자리에의 집적(stacking) 전략을 단순화시킬 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 정규(C2H2) 아연 핑거 또는 비정규(예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다. 더 나아가, 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아연 핑거)를 포함할 수 있고, 유전자 조작되어 임의의 MDH 유전자 내에서 임의의 서열에 결합할 수 있다. MDH 유전자에 결합시 사용을 위한 예시적인 MDH-결합 아연 핑거 단백질의 인지 나선 영역은 표 1A에 나타나며, MDH 유전자 내에서 예시적인 표적 자리는 표 1B에 나타난다. 세포 내에서 이러한 융합 단백질(또는 단백질들 및/또는 이들 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 존재는 그것의(그들의) 결합 자리(들)에 융합 단백질(들)의 결합 및 MDH 유전자(들) 내에서 절단을 초래한다.
개괄
본 방법의 실행뿐만 아니라 본 명세서에서 개시한 조성물의 제조 및 사용은, 달리 표시되지 않는다면, 당업계의 기술 내에서 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터를 이용한 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서 통상적인 기술을 이용한다. 이들 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROtocoLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조할 수 있다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 호환적으로 사용되며, 선형 또는 고리형 입체 형태 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 말한다. 본 명세서의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이 면에서 제한되는 것으로 추론되지 않는다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 잔기(예컨대, 포스포로티오에이트 백본)에 있어서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 형성 특이성을 가지며, 즉 A의 유사체는 T와 염기 쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 이 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 대응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합하는"은 거대분자들 간의(예컨대, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적, 비-공유적 상호 작용을 말한다. 총괄적으로 이러한 상호 작용이 서열-특이적인 한은, 결합되는 상호 작용의 모든 성분들이 반드시 서열-특이적(예컨대, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와 접촉됨)일 필요는 없다. 이러한 상호 작용은 일반적으로, 10-6M-1 또는 그 미만의 해리 상수(Kd)로 특징지어진다. "친화도"는 결합 세기를 말하는데, 결합 친화도 증가는 보다 낮은 Kd와 관련이 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예컨대 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에는, 이것이 자신과 결합할 수 있고 (동종-다이머, 동종-트라이머 등을 형성하기 위함) 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 초과 유형의 결합 활성을 지닐 수 있다. 예컨대, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 지닌다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 그의 구조가 아연 이온의 배위를 통하여 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종, 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
아연 핑거 결합 도메인은 사전결정된 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "유전자 조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 유전자 조작하기 위한 방법의 비제한적 예는 설계와 선별이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적 기준으로부터 초래된 본래 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터 정보를 저장하고 있는 데이터베이스 내의 정보를 처리하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘 및 치환 규칙을 적용하는 것을 포함한다(예컨대, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 참조).
"선별된" 아연 핑거 단백질은 그의 생성이 주로 실험적 공정, 예컨대 파지 디스플레이(phage display), 상호 작용 트랩 또는 혼성 선별로부터 초래된 천연에서 발견되지 않는 단백질이다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 제5,789,538호; 미국 제 5,925,523호; 미국 제6,007,988호; 미국 제6,013,453호; 미국 제6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조할 수 있다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 환상 또는 분지형일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는, 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예컨대 길이가 2개 내지 10,000개 뉴클레오티드(또는 그 사이 또는 그 위의 임의의 정수 값), 바람직하게 길이가 약 100개 내지 1,000개 뉴클레오티드(또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 길이가 약 200개 내지 500개 뉴클레오티드일 수 있다.
"상동성이며, 동일하지 않은 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성은 공유하고 있지만, 그의 서열이 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 말한다. 예컨대, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 돌연변이체 유전자의 서열과 상동성이며, 동일하지 않다. 특정 실시태양에서, 두 서열 간의 상동성 정도는 정상적인 세포 메커니즘을 활용하여 그들 간의 상동 재조합을 허용하기에 충분하다. 상동성이며, 동일하지 않은 2개의 서열은 임의 길이일 수 있고, 그들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 적을 수 있거나(예컨대, 표적화된 상동 재조합에 의해 게놈 점 돌연변이의 교정에 대해) 또는 10 이상의 킬로염기만큼 클 수 있다(예컨대, 염색체 내 사전결정된 이소성(ectopic) 자리에 유전자 삽입에 대해). 상동성이지만 동일하지 않은 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 반드시 동일한 길이일 필요는 없다. 예컨대, 20 내지 10,000개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오티드(즉, 공여자 폴리뉴클레오티드)를 사용할 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 이로써 암호화된 아미노산 서열을 결정하며, 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 이러한 방식으로 결정하고 비교할 수도 있다. 일반적으로, 동일성은 2개 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응도를 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 동일성%을 결정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든지 아니면 아미노산 서열이든, 두 서열의 동일성%은 정렬된 두 서열 간의 정확한 매치 수를 더 짧은 서열 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 다이호프(Dayhoff)에 의해 개발된 스코어링 매트릭스, 문헌[Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, 미국 워싱턴 D.C.에 소재한 National Biomedical Research Foundation]을 사용함으로써 아미노산 서열에 적용할 수 있고, 문헌[Gribskov, Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정규화될 수 있다. 서열의 동일성%를 결정하기 위한 상기 알고리즘의 예시적 이행은 "최적화(BestFit)" 활용 적용에서 제네틱스 컴퓨터 그룹(위스콘신주 매디슨시에 소재한 Genetics Computer Group)에 의해 공급된다. 서열 간의 동일성% 또는 유사성%을 계산하는데 적합한 프로그램은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있는데, 예컨대 또 다른 정렬 프로그램은 BLAST이고, 이는 디폴트(default) 변수와 함께 사용된다. 예컨대, 다음 디폴트 변수를 이용하여 BLASTN 및 BLASTP를 사용할 수 있다: 유전자 부호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 해독 + 스위스(Swiss) 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 인터넷에서 발견할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열을 기준으로 하여, 목적하는 서열 동일성% 범위는 대략 80% 내지 100%, 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 전형적으로, 서열 간의 동일성%는 적어도 70 내지 75%, 바람직하게는 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
다르게는, 폴리뉴클레오티드 간의 서열 유사도는 상동성 영역 간의 안정한 듀플렉스(duplexe) 형성을 허용하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 다음, 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해시키고, 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다. 두 핵산, 또는 두 폴리펩티드 서열은 이들 서열이 상기 방법을 이용하여 결정된 바와 같이 규정된 분자 길이 전반에 걸쳐 적어도 약 70 내지 75%, 바람직하게 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에 서로 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에 사용된, 실질적으로 상동성이란 또한, 지정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 특별한 시스템에 대해 규정된 바와 같이, 예컨대 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 혼성화 실험으로 확인할 수 있다. 적당한 혼성화 조건을 규정하는 것은 당업자에게 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
두 핵산 단편의 선별적 혼성화는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 핵산 분자 간의 서열 동일률은 이러한 분자 간의 혼성화 사건의 효율과 세기에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화를 억제하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 혼성화 분석(예컨대, 서던(DNA) 블롯, 노던(Northern)(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등, 예컨대, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.])을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석은, 예컨대 낮은 수준의 엄격도부터 고도의 엄격도까지 다양한 조건을 이용하여 다양한 선별도를 사용하여 수행할 수 있다. 낮은 엄격도 조건을 이용하는 경우에는, 심지어 부분 서열 동일성 정도가 결여된 이차 프로브(예컨대, 표적 분자와의 서열 동일률이 약 30% 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재를 평가할 수 있으므로, 비-특이적 결합 사건의 부재 하에서는, 이차 프로브가 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화에 의거한 검출 시스템을 활용하는 경우, 기준 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 프로브를 선별한 다음, 적당한 조건을 선별함으로써, 상기 프로브와 기준 서열은 선별적으로 혼성화하거나 또는 서로 결합하여 듀플렉스 분자를 형성한다. 중간 수준으로 엄격한 혼성화 조건 하에 기준 서열과 선별적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 전형적으로, 선별된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 대략 70% 이상인, 길이가 적어도 약 10 내지 14개의 뉴클레오티드인 표적 핵산 서열을 검출할 수 있게 해주는 조건 하에 혼성화된다. 엄격한 혼성화 조건은 전형적으로, 선별된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 90 내지 95% 초과인, 길이가 적어도 약 10 내지 14개 뉴클레오티드인 표적 핵산 서열의 검출을 검출할 수 있게 해준다. 프로브와 기준 서열이 특정 서열 동일성을 가지는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당해 분야에 공지된 바와 같이 결정할 수 있다(이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]을 참조할 수 있다).
혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 조건이 미스매치된 뉴클레오티드를 함유하는 하이브리드의 형성을 배제하는 정도를 말하는데, 엄격도가 보다 높다는 것은 미스매치된 하이브리드에 대한 관용도가 보다 낮다는 것과 상관이 있다. 혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 요인은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매, 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 보다 고온, 보다 낮은 이온 강도 및 보다 낮은 용매 농도에 의해 증가된다.
혼성화에 대한 엄격도 조건과 관련하여, 수많은 동일한 조건을 이용하여, 예컨대 다음 요인들을 다양하게 함으로써 특별한 엄격도를 확립시킬 수 있는 것으로 당해 분야에 잘 알려져 있다: 프로브 서열의 길이 및 성질, 각종 서열의 염기 조성, 염 및 기타 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중의 차단제(예컨대, 덱스트란 술페이트, 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 변수 뿐만 아니라 세척 조건을 다양하게 하는 것. 특정 혼성화 조건 세트를 선별하는 것은 당해 분야에서의 표준 방법에 따라서 선별한다(이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조할 수 있다).
"재조합"은 두 폴리뉴클레오티드 간의 유전자 정보 교환 과정을 말한다. 본 명세서의 목적을 위해, "상동 재조합(homologous recombination: HR)"은, 예컨대 세포에서 이중 가닥 파괴를 복구하는 동안 일어나는 상기 교환의 특수 형태를 말한다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 요구하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 분자)의 주형 복구를 위해 "공여자" 분자를 사용하며, "비-교배 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 공지되어 있는데, 이는 이로써 유전자 정보가 공여자로부터 표적으로 전이되기 때문이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 전이는 파괴된 표적과 공여자 간에 형성되는 이종-듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 공여자를 사용하는 "합성-의존적 가닥 어닐링", 및/또는 관련 과정을 포함할 수 있다. 이러한 특수 HR로 인해 종종, 표적 분자의 서열이 교체되어 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열 전부 또는 일부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 포함된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유적 백본의 파괴를 말한다. 절단은, 이에 제한되지 않지만, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 둘 다 가능하며, 이중 가닥 절단은 2개의 별개의 단일 가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 특정 실시태양에서, 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 융합 폴리펩티드가 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매적 활성을 지니는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 절단 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 함유될 수 있고 또는 절단 활성은 2개(또는 그 이상의) 폴리펩티드의 결합으로부터 발생할 수 있다.
"절단 하프-도메인"은 제2 폴리펩티드(동일 또는 상이함)와 함께, 절단 활성(바람직하게는, 이중 가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다.
"유전자 조작된 절단 하프 도메인"은 또 다른 절단 하프 도메인(예컨대, 또 다른 유전자 조작된 절단 하프 도메인)을 갖는 절대 헤테로다이머를 형성하기 위해 변형된 절단 하프 도메인이다. 이에 대해서는, 전체 내용이 참조로서 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공보 제2005/0064474호, 제20070218528호, 제2008/0131962호를 참조할 수 있다.
"염색질"은 세포성 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포성 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 단백질(히스톤 및 비-히스톤 염색체성 단백질 포함)을 포함한다. 대다수의 진핵 세포성 염색질은 뉴클레오좀의 형태로 존재하는데, 여기서는 뉴클레오좀 코어가 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각을 2개 포함하는 옥타머(octamer)와 연합된 DNA의 대략 150개 염기 쌍을 포함하고; 링커 DNA(유기체에 따라서 가변적 길이를 지님)는 뉴클레오좀 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로, 링커 DNA와 결합된다. 본 명세서의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 원핵 및 진핵성의, 모든 유형의 세포성 핵단백질을 포괄하는 것을 의미한다. 세포성 염색질은 염색체성 염색질과 에피좀성 염색질을 둘 다 포함한다.
"염색체"는 세포 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포 게놈은 종종, 세포 게놈을 포함하는 모든 염색체의 컬렉션인 그의 핵형(karyotype)에 의해 특징 규명된다. 세포 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피좀"은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체, 또는 세포의 염색체성 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 기타 구조이다. 에피좀의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스성 게놈을 포함한다.
"접근 가능한 영역"은 핵산에 존재하는 표적 자리가, 이러한 표적 자리를 인식하는 외인성 분자에 의해 연결될 수 있는 세포성 염색질 내의 자리이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 접근 가능한 영역은 뉴클레오좀성 구조 내로 패키지화되지 않는 것으로 여겨진다. 접근 가능한 영역의 별개 구조는 종종, 화학적 및 효소적 프로브, 예컨대 뉴클레아제에 대한 그것의 민감도에 의해 검출될 수 있다.
"표적 자리" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합될 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열인데, 단 충분한 결합 조건이 존재한다. 예컨대, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 자리이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만, 한 가지 이상의 유전적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에 정상적으로 존재"하는 것은 세포의 특정 발생 단계 및 환경적 조건을 기준으로 하여 결정한다. 따라서, 예컨대 꽃의 발생의 초기 단계 동안에만 세포에 존재하는 분자는 완전히 발생된 꽃의 세포를 기준으로 하여 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 유도된 분자는 비-열-쇼크된 세포를 기준으로 하여 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예컨대 모든 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 암호화 서열, 기능 장애성 내인성 분자의 기능성 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 장애성 버전을 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 분자는 숙주 세포 내의 내인성 유전자의 오솔로그(ortholog)인 또 다른 종으로부터의 암호화 서열을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 특히, 소분자, 예컨대 조합 화학 공정에 의해 생성되는 바와 같은 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 모든 변형된 유도체, 또는 상기 분자를 하나 이상 포함하는 모든 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산뿐만 아니라 삼중체-형성 핵산을 포함한다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호 참조할 수 있다. 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 레컴비나제, 리가제, 토포아이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 식물 세포 내로, 예컨대, 식물 세포 내의 MDH 유전자 내로 도입된 외인성 서열인 "이식 유전자" 또는 "관심 유전자"를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예컨대 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예컨대, 외인성 핵산은 감염성 바이러스성 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피좀, 또는 정상적으로는 세포에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 원형질체 형질전환, 탄화 규소(예컨대, 위스커스™(WHISKERS™)), 아그로박테리움(Agrobacterium )-매개된 형질전환, 지질-매개된 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격(예컨대, "유전자 총"을 사용), 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경적 조건 하에 특정 발생기에 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예컨대, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리온의 게놈, 엽록체 또는 기타 세포 소기관, 또는 자연적으로 발생하는 에피좀성 핵산을 포함할 수 있다. 부가적인 내인성 분자는 단백질, 예컨대 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "외인성 핵산의 생성물"은 폴리뉴클레오티드 생성물과 폴리펩티드 생성물을 둘 다 포함하는데, 예컨대 전사 생성물(RNA와 같은 폴리뉴클레오티드) 및 번역 생성물(폴리펩티드)이 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결되는 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 단백질의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 융합 단백질(예컨대, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합물) 및 융합 핵산(예컨대, 상기 설명한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 제2 유형의 융합 분자의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 삼중체-형성 핵산과 폴리펩티드 간의 융합, 및 마이너 그루브 결합제와 핵산 간의 융합을 포함한다.
세포에서의 융합 단백질의 발현은 이러한 융합 단백질의 세포에의 전달로부터 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 세포에의 전달로부터 초래될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 전사되고, 전사체는 해독되어 융합 단백질을 생성시킨다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 연결이 세포에서의 단백질 발현에 관여할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에 제시되어 있다.
본 명세서의 목적을 위한 "유전자"는 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역(하기 참조)뿐만 아니라 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하든지 아니든지 간에 유전자 생성물의 생성을 조절하는 DNA 영역이 포함된다. 따라서, 유전자는, 필수적으로 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결인자, 해독 조절성 서열, 예컨대 리보솜 결합 자리 및 내부 리보솜 도입 자리, 인핸서, 침묵인자, 절연물, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 자리 및 유전자 자리 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 말한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물(예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 기타 모든 유형의 RNA) 또는 mRNA의 해독에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한, 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화 및 에디팅과 같은 처리에 의해 변형되는 RNA, 및, 예컨대 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성 상의 변화를 말한다. 발현의 조절은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
"식물" 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 외떡잎 식물(단자엽 식물) 또는 쌍떡잎 식물(쌍자엽 식물)의 세포를 포함한다. 외떡잎 식물의 비제한적 예는 곡류 식물, 예컨대, 옥수수, 벼, 보리, 귀리, 밀, 당밀, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나 및 코코넛이 포함된다. 쌍떡잎 식물의 비 제한적 예는 담배, 토마토, 해바라기, 면, 사탕무, 감자, 상추, 멜론, 콩, 카놀라(평지씨), 및 알팔파를 포함한다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분 및/또는 임의의 식물 발생 단계로부터 유래될 수 있다.
"관심의 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 유전자 또는 유전자 내의 또는 이에 인접한 비암호화 서열인데, 이것이 외인성 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은, 예컨대 염색체, 에피좀, 세포 소기관 게놈(예컨대, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스성 게놈 내에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비암호화 영역, 예컨대 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있는 비전사된 영역 내에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작을 수 있거나, 또는 길이가 2,000개 이하의 뉴클레오티드 쌍 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "작동적으로 연결된")은 2가지 이상 성분(예컨대, 서열 요소)의 병렬에 관하여 상호 호환적으로 사용되는데, 이들 성분은 양 성분이 정상적으로 기능하고 적어도 한 가지 성분이 다른 성분 중의 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시로써, 전사 조절성 서열, 예컨대 프로모터는, 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 상기 전사 조절 서열이 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우에, 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로, 암호화 서열과 cis로 작동가능하게 연결되지만, 이에 바로 인접해야할 필요는 없다. 예컨대, 인핸서는 연속적이지 않은 경우일지라도 암호화 서열과 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드에 관해서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각 성분이 이렇게 연결되지 않은 경우에 수행하는 것과 마찬가지로 다른 성분과의 연결에서도 동일한 기능을 수행한다는 사실을 말할 수 있다. 예컨대, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인과 융합되는 융합 폴리펩티드에 관해서는, 이러한 융합 폴리펩티드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분은 그의 표적 자리 및/또는 그의 결합 자리와 결합할 수 있으면서, 절단 도메인은 표적 자리 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 그의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 유지하고 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은, 대응하는 천연 분자보다 더 많은 수, 더 적은 수, 또는 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환물을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예컨대, 암호화 기능, 또 다른 핵산과 혼성화할 수 있는 능력)을 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예컨대, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예컨대 필터-결합, 전기영동 이동도-이동, 또는 면역침전 분석에 의해 결정할 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다(문헌[Ausubel et al., 상기] 참조). 또 다른 단백질과 상호 작용할 수 있는 단백질의 능력은, 예컨대 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석 또는 상보성(유전적 및 생화학적 둘 다)에 의해 결정할 수 있다(예컨대, 문헌[Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350을 참조).
DNA -결합 도메인
임의의 DNA-결합 도메인이 본 명세서에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 특정 실시태양에서, DNA-결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 이에 대해서는, 문헌[Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65]; 미국 특허 제6,453,242호를 참조할 수 있다. 본 명세서에 기재된 아연 핑거 결합 도메인은 일반적으로 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 그 초과의 아연 핑거를 포함한다.
전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 길이가 약 30개 아미노산이다. 구조적 연구 결과, 각 아연 핑거 도메인(모티프)은 2개의 베타 시트(2개의 불변 시스테인 잔기를 함유하는 베타 회전으로 유지됨) 및 알파 나선(2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유함)을 함유하는데, 이들이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의해 아연 원자의 배위를 통하여 특정 입체 형태로 유지되는 것으로 입증되었다.
아연 핑거는 정규 C2H2 아연 핑거(즉, 아연 이온이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기에 의해 배위되는 것) 및 비-정규 아연 핑거, 예컨대 C3H 아연 핑거(아연 이온이 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 의해 배위되는 것) 및 C4 아연 핑거(아연 이온이 4개의 시스테인 잔기에 의해 배위되는 것) 둘 다를 포함한다. 또한 WO 02/057293; 및 식물에서 사용하기 위한 비-정규 ZFP에 관한 미국 특허 공개공보 제20080182332호를 참조할 수 있다.
유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질과 비교해서 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자 조작 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 합리적 설계 및 각종 유형의 선별을 포함한다. 합리적 설계는, 예컨대 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오티드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하는데, 여기서 각 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열과 결합하는 아연 핑거 중 하나 이상의 아미노산 서열과 결합한다.
파지 디스플레이 및 2-혼성 시스템을 포함하는 예시적인 선별 방법이 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예컨대 WO 02/077227에서 설명되었다.
개개의 아연 핑거는 3-뉴클레오티드(즉, 삼중항) 서열(또는 하나의 뉴클레오티드가, 인접한 아연 핑거의 4-뉴클레오티드 결합 자리와 중첩될 수 있는 4-뉴클레오티드 서열)과 결합하기 때문에, 아연 핑거 결합 도메인이 결합되도록 유전자 조작한 서열(예컨대, 표적 서열)의 길이는 유전자 조작한 아연 핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거의 수를 결정할 것이다. 예컨대, 핑거 모티프가 중복 서브사이트와 결합하지 않는 ZFP의 경우에, 예컨대 6-뉴클레오티드 표적 서열이 2-핑거 결합 도메인에 의해 결합되고; 9-뉴클레오티드 표적 서열은 3-핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 본 명세서에서 주목된 바와 같이, 표적 자리 내에서 개개의 아연 핑거에 대한 결합 자리(즉, 서브사이트)는 연속적일 필요는 없지만, 다중-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거 간의 아미노산 서열(즉, 핑거간 링커)의 길이 및 성질에 따라서 1개 또는 수 개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인에서, 인접한 아연 핑거는 대략 5개 아미노산의 아미노산 링커 서열(소위 "정규" 핑거간 링커)에 의해 분리될 수 있거나, 또는 또 다르게는, 하나 이상의 비-정규 링커에 의해 격리될 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조할 수 있다. 3개 초과의 핑거를 포함하는 유전자 조작한 아연 핑거 결합 도메인의 경우, 몇몇 경우는 특정 아연 핑거 사이에 보다 긴("비-정규") 핑거간 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 상기 결합 도메인에 의해 결합 친화도 및/또는 결합 특이도가 증가될 수 있기 때문이다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480를 참조할 수 있다. 따라서, 다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인은 또한, 비-정규 핑거간 링커의 존재 및 위치에 관해서 명확히 규명할 수 있다. 예컨대, 3개의 핑거(2개의 정규 핑거간 링커에 의해 연결됨), 긴 링커 및 3개의 부가 핑거(2개의 정규 핑거간 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 6-핑거 아연 핑거 결합 도메인은 2×3 입체 배치로 표시된다. 유사하게, 2개의 핑거(그 사이에 정규 링커를 수반함), 긴 링커 및 2개의 부가 핑거(정규 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 결합 도메인은 2×2 입체 배치를 의미한다. 3개의 2-핑거 단위(각각의 경우에, 2개의 핑거는 표준 링커에 의해 연결되고, 각 2-핑거 단위는 긴 링커에 의해 인접한 2개 핑거 단위에 연결됨)를 포함하는 단백질은 3×2 입체 배치로서 언급된다.
다중-핑거 결합 도메인 내의 2개의 인접한 아연 핑거 간에 긴 또는 비-정규 핑거간 링커의 존재는 종종 2개의 핑거가 표적 서열 내에서 바로 연속적지 않은 서브사이트와 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표적 자리 내의 서브사이트 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 갭이 존재할 수 있는데, 즉 표적 자리는 아연 핑거에 의해 접촉되지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예컨대, 2x2 아연 핑거 결합 도메인은 하나의 뉴클레오티드에 의해 격리된 2개의 6-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는데, 즉 이는 13-뉴클레오티드 표적 자리와 결합한다. 이에 대해서는, 문헌[Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441] 및 WO 01/53480을 참조할 수 있다.
앞서 논의한 바와 같은, 표적 서브사이트는 단일 아연 핑거에 의해 결합된 3- 또는 4-뉴클레오티드 서열이다. 특정 목적을 위해, 2-핑거 단위는 "결합 모듈"로 표시된다. 결합 모듈은, 예컨대 특정 6-뉴클레오티드 표적 서열과 결합하는 다중-핑거 단백질(일반적으로, 3 핑거)에 관련해서 2개의 인접한 핑거에 대해 선별함으로써 얻을 수 있다. 다르게는, 모듈은 개개의 아연 핑거의 조립체에 의해 구성될 수 있다. 또한 이에 대해서는, WO 98/53057 및 WO 01/53480을 참조할 수 있다.
다르게는, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, ISceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 이에 대해서는, 예컨대 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180]; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조할 수 있다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 결합 자리와 결합하도록 유전자 조작할 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 공보 제20070117128호를 참조할 수 있다.
다른 대안으로서, DNA-결합 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper) 단백질로부터 유래될 수 있다. 류신 지퍼는 유전자 발현과 관련된 중요한 전사 인자인 다수의 진핵 조절 단백질에서 단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 단백질 부류이다. 류신 지퍼는 동물, 식물, 효모 등을 포함한 여러 가지 계 전반에 걸쳐 이들 전사 인자에 공유된 공통의 구조적 모티프를 말한다. 류신 지퍼는 류신 잔기가 α-나선을 통하여 균일하게 간격을 두고 두 폴리펩티드의 류신 잔기가 나선의 동일한 면 상에서 종결되도록 하는 방식으로 특이적 DNA 서열과 결합하는 두 폴리펩티드(동종-다이머 또는 이종-다이머)에 의해 형성된다. 류신 지퍼의 DNA 결합 특이성을 본 명세서에 설명된 DNA-결합 도메인에서 이용할 수 있다.
일부 실시태양에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원체 산토모나스(Xanthomonas)로부터 유래된 TAL 이펙터로부터 유전자 조작된 도메인이다(문헌[Miller et al . (2011) Nature Biotechnology 29(2):143-8; Boch et al, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881) 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.1178817); 및 미국 특허 공보 제20110239315호, 제20110145940호 및 제20110301073호)]을 참조할 수 있으며, 이의 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 포함됨).
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR 연관) 뉴클레아제 시스템은 게놈 유전자 조작에 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기반하여 최근에 유전자 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이는 다수의 박테리아 및 고세균(Archea)의 적응 면역 반응의 일부에 기반한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아를 침입할 때, 침입자의 DNA의 단편이 '면역' 반응에 의해 CRISPR RNA(crRNA)로 전환된다. 이러한 crRNA는 부분적 상호보완 영역을 통해 연관되며, tracrRNA로 불리는 RNA의 또 다른 유형은 Cas9 뉴클레아제를 "프로토스페이서"라고 불리는 표적 DNA의 crRNA에 동형 접합성인 영역으로 안내한다. Cas9는 DNA를 절단하여 crRNA 전사 내에 포함된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 구체화되는 위치에서 DSB에 평활 말단을 생성한다. Cas9는 자리 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 요구한다. crRNA 및 tracrRNA가 한 분자 내로 조합될 수 있고("단일 가이드 RNA"), 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가부는 유전자 조작되어 Cas9 뉴클레아제를 임의의 바람직한 서열을 표적화하도록 가이드할 수 있도록, 이러한 시스템이 현재 유전자 조작되어 왔다(문헌[Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 유전자 조작되어 게놈 내 바람직한 표적에서 이중-가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있고, DSB의 수선은 오류 유발 수선의 증가를 유발하는 수선 억제자의 사용에 의해 영향받을 수 있다.
절단 도메인
상기 언급된 바와 같이, DNA-결합 도메인은 절단(뉴클레아제) 도메인과 결합될 수 있다. 예컨대, 호밍 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 기능을 유지시키면서 그의 DNA-결합 특이성을 변형시킬 수 있다. 또한, 아연 핑거 단백질을 절단 도메인과 융합시켜 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성시킬 수도 있다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는, 이에 제한되지 않지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조할 수 있다. DNA를 절단시키는 부가의 효소가 공지되어 있다(예컨대, S1 뉴클레아제; 녹두(mung bean) 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조할 수 있다). 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 비제한적 예는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 또한, 이에 대해서는, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조할 수 있다. 이들 효소(또는 그의 기능적 단편) 중의 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 하프-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하고, (인식 자리에서) DNA와 서열-특이적으로 결합할 수 있으며, 결합 자리 또는 그 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다. 특정 제한 효소(예컨대, 유형 IIS)는 인식 자리로부터 제거된 자리에서 DNA를 절단시키고, 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예컨대, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 9개 뉴클레오티드에서 및 다른 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 및 문헌[Li et al. (1992) Proc . Natl . Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad . Sci . USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인), 및 유전자 조작할 수 있거나 유전자 조작하지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 다이머로서 활성이다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 10,570-10,575] 참조할 수 있다). 따라서, 본 명세서의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부가 절단 하프-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-FokI 융합물을 이용하여 세포 서열의 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 표적화 대체의 경우에, 각각 FokI 절단 하프-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여, 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 다르게는, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 하프-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자를 사용할 수도 있다. 아연 핑거-FokI 융합물을 이용하여 표적화된 서열 교체 및 표적화 절단시키기 위한 변수가 본 명세서의 다른 부분에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 유지하고 있거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 멀티머화(예컨대, 다이머화)될 수 있는 능력을 보유하고 있는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 국제 공개공보 WO 2007/014275에 기재되어 있다.
절단 특이성을 증강시키기 위해서는, 절단 도메인을 변형시킬 수도 있다. 특정 실시태양에서는, 절단 하프-도메인의 변이체를 이용하는데, 이들 변이체는 절단 하프-도메인의 동종-다이머화를 최소화하거나 방지한다. 이러한 변형된 절단 하프-도메인의 비제한적 예는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2007/014275에 상세히 기재되어 있다. 또한, 실시예를 참조할 수 있다. 특정 실시태양에서, 동종-다이머화를 최소화하거나 방지하는 유전자 조작한 절단 하프-도메인(또한 다이머화 도메인 돌연변이체로서 언급됨)을 포함하는 절단 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 공개공보 제20050064474호, 제20060188987호, 제20070305346호 및 제20080131962호에 기재되어 있다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 FokI 절단 하프-도메인의 다이머화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다.
절대 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 부가적인 유전자 조작된 절단 하프-도메인을 본 명세서에 기재된 ZFN에 사용할 수도 있다. 절대 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 예시적인 유전자 조작된 절단 하프-도메인은 FokI의 위치 490 및 538에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제1 절단 하프-도메인, 위치 486 및 499에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제2 절단 하프-도메인의 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시태양에서, 490의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 대체하고; 538의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체하고; 486의 돌연변이는 Gln(Q)를 Glu(E)로 대체하고; 위치 499의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체한다. 구체적으로, 한 절단 하프-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이 유발함으로써 "E490K:I538K"로 지칭된 유전자 조작한 절단 하프-도메인을 생산하고, 또 다른 절단 하프-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)을 돌연변이 유발함으로써 "Q486E:I499L"로 지칭된 유전자 조작한 절단 하프-도메인을 생산하여 본 명세서에서 설명된 유전자 조작한 절단 하프-도메인을 제조하였다. 본 명세서에서 설명된 유전자 조작한 절단 하프-도메인은 이상 절단이 최소화되거나 억제된 절대 헤테로다이머 돌연변이체이다. 예컨대, 모든 목적을 위해 그의 전체 내용이 참조로서 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공보 제2008/0131962호를 참조할 수 있다. 특정 실시태양에서, 유전자 조작된 절단 하프-도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대해 번호 매김)에서의 돌연변이, 예컨대, 위치 486의 야생형 Gln(Q) 잔기가 Glu(E) 잔기로 대체되고, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Leu(L) 잔기로 대체되고, 위치 496의 야생형 Asn(N) 잔기가 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기(각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 언급됨)로 대체된 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자 조작된 절단 하프-도메인은 위치 490, 538 및 537(야생형 FokI에 대해 번호 매김)의 돌연변이, 예컨대, 위치 490의 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로 대체되고, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Lys(K) 잔기로 대체되고, 위치 537의 야생형 His(H) 잔기가 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 언급됨)로 대체된 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자 조작된 절단 하프-도메인은 위치 490 및 537(야생형 FokI에 대해 번호 매김)의 돌연변이, 예컨대, 위치 490의 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로 대체되고, 위치 537의 야생형 His(H) 잔기가 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 언급됨)로 대체된 돌연변이를 포함한다. (미국 특허 공보 제20110201055호 참조). 다른 실시태양에서, 유전자 조작된 절단 하프 도메인은 "샤키(Sharkey)" 및/또는 "샤키" 돌연변이를 포함한다(문헌[Guo et al, (2010) J. Mol . Biol. 400(1):96-107] 참조).
임의의 적합한 방법을 사용하여, 예컨대, 미국 특허 공보 제20050064474호, 제20080131962호 및 제20110201055호에 설명된 야생형 절단 하프-도메인(FokI)의 위치-지정 돌연변이유발에 의해 본 명세서에서 설명된 유전자 조작된 절단 하프-도메인을 제조할 수 있다.
다르게는, 뉴클레아제는 소위 "스플리트(split)-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 자리에서 생체 내 조립될 수 있다(예컨대, 미국 특허 공보 제20090068164호 참조). 이러한 스플리트 효소의 성분은 별개의 발현 구축물로 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이 예컨대, 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리된 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예컨대, WO 2009/042163호 및 20090068164호에 설명된 효모계 염색체 시스템에서의 사용에 앞서 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구축물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 이에 대해서는, 미국 특허 공보 제20030232410호, 제20050208489호, 제20050026157호, 제20050064474호, 제20060188987호, 제20060063231호 및 국제 공보 WO 07/014275를 참조할 수 있다. 뉴클레아제의 발현은 구성성 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예컨대 라피노오스 및/또는 갈락토오스의 존재하에서 활성화되고(탈-억제) 글루코오스의 존재하에서 억제된 갈락토키나아제 프로모터의 제어하에서 일 수 있다.
융합 단백질
융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 설계하고 구성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 도메인) 및 조절성 또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 설계하고 구성하는 방법은 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 및 미국 특허 공개공보 2007/0134796호, 제2005/0064474호, 제20080182332호, 제20090205083호, 제20100199389호; 제20110167521호, 제20110239315호, 제20110145940호 및 제20110301073호(그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 특정 실시태양에서는, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터는 세포 내로 도입할 수 있다(벡터, 및 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 방법에 관한 하기 추가의 개시 참조).
본 명세서에 설명된 방법의 특정 실시태양에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 제한 효소로부터의 절단 하프-도메인 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 이러한 2개의 융합 단백질이 세포에서 발현된다. 세포 내에서 2개의 융합 단백질의 발현은 세포에 2개 단백질의 전달; 하나의 단백질과 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 하나의 핵산의 세포에 전달; 각각 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 2개의 핵산의 세포에 전달; 또는 양 단백질을 암호화하는 단일 핵산의 세포에 전달에 의해 초래될 수 있다. 추가적인 실시태양에서, 융합 단백질은 2개의 절단 하프 도메인 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이 경우, 단일 융합 단백질이 세포에서 발현되며, 이론에 의해 구속되지 않고, 이는 절단 하프 도메인의 분자 내 다이머 형성에 따른 결과로서 DNA를 절단시키는 것으로 믿어진다.
특정 실시태양에서, 융합 단백질(예컨대, ZFP-FokI 융합물)의 성분들은, 아연 핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이는 FokI 효소로부터 유래된 바와 같은 자연적으로 발생하는 다이머화 절단 도메인 내에서의 절단 도메인의 상대적 배향을 반영하고 있는데, DNA-결합 도메인은 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인은 카복시 말단 가장 근처에 있다. 이들 실시태양에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 다이머화하는 것은 융합 단백질을 맞은편의 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 5' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
추가 실시태양에서, 융합 단백질(예컨대, ZFP-FokI 융합물)의 성분들은, 절단 하프-도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 아연 핑거 도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 실시태양에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 다이머화하는 것은 융합 단백질을 대향하는 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 3' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
또 다른 추가적 실시태양에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있는 절단 하프-도메인, 및 카복시-말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 아연 핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있으며 절단 하프-도메인이 카복시 말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 실시태양에서, 양 융합 단백질은 동일한 DNA 가닥과 결합하는데, 카복시 말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위는 아미노 말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 대해 위치한다.
개시된 융합 단백질의 특정 실시태양에서, 아연 핑거 도메인과 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 간의 아미노산 서열은 "ZC 링커"를 의미한다. 이러한 ZC 링커는 상기 논의된 핑거간 링커와 구별되어야 한다(예컨대, 절단을 최적화시키는 ZC 링커를 수득하는 것에 관한 상세 내역은 미국 특허 공보 제20050064474호 및 제20030232410호, 및 국제 특허 공개공보 WO05/084190을 참조할 수 있다).
한 실시태양에서, 본 명세서는 표 1A에 제시된 인식 나선 아미노산 서열 중의 하나 이상을 가지는 아연 핑거 단백질(예컨대, 표 1A의 단일 열에 나타낸 인식 나선을 갖는 성분 아연 핑거 도메인으로 구성된 아연 핑거 단백질)을 포함하는 뉴클레아제(예컨대, ZFN)를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 표 1A에 제시된 하나 이상의 인식 나선을 가지는 ZFP, 예컨대 표 1A의 단일 열에 나타나고 지시된 인식 나선 영역을 갖는 ZFP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZFP 발현 벡터가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 표 1B에 나타낸 표적 자리에 결합한 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP) 또는 표 1B에 나타낸 표적 자리에 결합한 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 제공된다.
표적 자리
개시된 방법 및 조성물은 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP) 및 조절 도메인 또는 절단(예컨대, 뉴클레아제) 도메인(또는 절단 하프 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, DNA-결합 도메인(예컨대, 아연 핑거 도메인)은 하나 이상의 식물 MDH 유전자의 세포 염색질 내 서열에 결합함으로써, 전사 조절 도메인 또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)의 활성을 서열 부근으로 보내고, 따라서 표적 서열의 부근에서 전사를 조절하거나 절단을 유도한다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, DNA-결합 도메인, 예컨대 아연 핑거 도메인은 유전자 조작되어 거의 임의의 바람직한 서열에 결합할 수 있다. 따라서, 유전자 조절, 절단 또는 재조합이 요망되는 서열을 포함하는 관심 영역을 확인한 이후, 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인이 유전자 조작되어 관심 영역에서 하나 이상의 서열에 결합할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 명세서에 설명된 ZFP는 표 1B에 나타낸 표적 자리에 결합한다.
DNA-결합 도메인(예컨대, 표적 자리)에 의한 결합을 위한 임의의 MDH 유전자의 세포 염색질 내 관심 게놈 영역의 표적 자리의 선별은 예컨대, 미국 특허 제6,453,242호 및/또는 미국 특허 공보 제20110239315호, 제20110145940호, 및 제20110301073호에 개시된 방법에 따라 성취될 수 있으며, 이는 또한 선별된 서열에 결합하기 위한 ZFP를 설계하는 방법을 개시한다. 뉴클레오티드 서열의 간단한 외관 검사를 또한 표적 자리의 선별에 사용할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 표적 자리 선별을 위한 임의의 수단이 청구되는 방법에서 사용될 수 있다.
표적 자리는 일반적으로 복수 개의 인접한 표적 서브사이트로 구성된다. 표적 서브사이트는 개별적인 아연 핑거에 결합된 서열(흔히 인접한 사중항을 갖는 한 뉴클레오티드에 의해 중첩할 수 있는 뉴클레오티드 사중항 또는 뉴클레오티드 삼중항)을 말한다. 예컨대, WO　02/077227호를 참조할 수 있다. 아연 핑거 단백질이 대부분 접촉하는 가닥이 표적 가닥 "제1 인식 가닥" 또는 "제1 접촉 가닥"으로 지칭되는 경우, 일부 아연 핑거 단백질은 표적 가닥에서 세 개의 염기 삼중항 및 비-표적 가닥상의 제4 염기에 결합한다. 아연 핑거 단백질의 경우, 표적 자리는 일반적으로 9개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 따라서 3개 이상의 아연 핑거를 포함하는 아연 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예컨대, 4-핑거 결합 도메인의 12-뉴클레오티드 표적 자리로의 결합, 5-핑거 결합 도메인의 15-뉴클레오티드 표적 자리로의 결합 또는 6-핑거 결합 도메인의 18-뉴클레오티드 표적 자리로의 결합이 또한 가능하다. 보다 큰 결합 도메인(예컨대, 7-, 8-, 9- 핑거 및 그 이상)의 보다 긴 표적 자리로의 결합이 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다.
표적 자리가 세 뉴클레오티드의 배수일 필요는 없다. 예컨대, 교차-가닥 상호작용이 발생하는 경우에(예컨대, 미국 특허 제6,453,242호 및 WO　02/077227호 참조), 다중-핑거 결합 도메인의 개별적 아연 핑거의 하나 이상이 중첩하는 사중항 서브사이트에 결합할 수 있다. 그 결과, 세-핑거 단백질은 10-뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있으며, 제10 뉴클레오티드는 말단 핑거에 의해 결합된 사중항의 일부이며, 네-핑거 단백질은 13-뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있으며, 제13 뉴클레오티드는 말단 핑거 등에 의해 결합된 사중항의 일부이다.
다중-핑거 결합 도메인 내 개별적인 아연 핑거들 사이의 아미노산 링커 서열의 길이 및 성질이 또한 표적 서열에의 결합에 영향을 미친다. 예컨대, 다중-핑거 결합 도메인에서 인접한 아연 핑거들 사이의 소위 "비-정규 링커", "긴 링커", "구조화된 링커"의 존재는 이러한 핑거를 바로 인접하지 않은 서브사이트에 결합하도록 한다. 이러한 링커의 비-제한적 예는 예컨대, 미국 특허 제6,479,626호 및 WO　01/53480호에 설명된다. 따라서, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 표적 자리에서 하나 이상의 서브사이트는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 그러나 한 예를 제공하기 위해서, 네-핑거 결합 도메인이 서열에서 두 개의 인접한 3-뉴클레오티드 서브사이트, 매개 뉴클레오티드, 및 두 개의 인접한 삼중항 서브사이트를 포함하는 13-뉴클레오티드 표적 자리에 결합할 수 있다. 상이한 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 표적 자리에 결합하기 위해 인공 뉴클레아제를 연결하는 방법 및 조성물에 대해서는 미국 특허 공보 제20090305419호를 또한 참조할 수 있다. 서열(예컨대, 표적 자리) 사이의 거리는 두 서열들 사이를 매개하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 수를 말하며, 이는 서로 가장 가까운 서열의 모서리로부터 측정된다.
특정 실시태양에서, 예컨대, ZFP 및 전사 조절 도메인(예컨대, 활성화 또는 억제 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 구축함으로써 전사 인자 기능을 갖는 ZFP가 설계된다. 유전자 발현을 조절하기 위해 DNA-결합 도메인에 융합될 수 있는 적합한 전사 조절 도메인의 비-제한적 예는 예컨대, 미국 특허 제6,534,261호, 제6,824,978호, 제6,933,113호 및 제8,399,218호, 및 미국 특허 공보 제20080182332호에 설명된다. 전사 인자 기능의 경우, 프로모터와 충분한 근접성 및 간단한 결합이 일반적으로 요구되는 전부이다. 프로모터에 대한 정확한 위치, 배향 및 한계 내의 거리는 크게 중요하지 않다. 이러한 특징은 인공 전사 인자를 구축하는 표적 자리를 선택하는데 상당한 유연성을 제공한다. 따라서, ZFP에 의해 인지되는 표적 자리는 선택적으로 조절 도메인에 연결된, ZFP에 의해 유전자 발현이 활성화 또는 억제되는 표적 유전자 내 임의의 적합한 자리일 수 있다. 바람직한 표적 자리는 전사 시작 자리의 다운스트림 또는 업스트림에 인접한 영역을 포함한다. 또한, 인핸서 영역에 위치된 표적 자리, 억제자 자리, RNA 폴리머라제 중지 자리, 및 특이적 조절 자리(예컨대, SP-1 자리, 저산소증 반응 요소, 핵 수용체 인지 요소, p53 결합 자리)는 cDNA 암호화 영역 내 또는 발현된 서열 태그(EST) 암호화 영역 내에 위치한다.
다른 실시태양에서, 뉴클레아제 예컨대 ZFN 및/또는 TALEN이 설계된다. 세포에서 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인(또는 두 융합 단백질의, 각각은 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 뉴클레아제의 발현은 표적 서열의 주변에서 절단한다. 특정 실시 태양에서, 절단은 두 개의 아연 핑거 도메인/절단 하프-도메인 융합 분자의 별개의 표적 자리에의 결합에 의존한다. 두 개의 표적 자리는 반대 DNA 가닥 상에 있을 수 있거나, 또는 다르게는 두 표적 자리 모두는 동일한 DNA 가닥 상에 있을 수 있다.
유전자 발현의 조절
DNA-결합 단백질 예컨대 ZFP가 유전자 발현을 조절하는지를 확인하는데 다양한 분석이 사용될 수 있다. 특정 단백질의 활성은 예컨대, 면역분석(예컨대, ELISA 및 항체로 면역조직화학 분석), 하이브리드 형성 분석(예컨대, RNase 보호, 노던, 계 내 하이브리드 형성, 올리고뉴클레오티드 어레이 연구), 비색 분석, 증폭 분석, 효소 활성 분석, 표현형 분석 등을 사용하여, 예컨대 단백질 또는 mRNA 수준, 생산물 수준, 효소 활성, 리포터 유전자의 전사 활성화 또는 억제를 측정함으로써 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내 분석을 사용하여 분석될 수 있다.
DNA-결합 단백질은 전형적으로 ELISA 분석을 사용한 다음 효소 발현 시스템을 사용하여 시험관 내 활성에 대해 우선 시험한다. 예컨대, ZFP는 흔히 리포터 유전자를 갖는 일시적인 발현 시스템을 사용하여 우선 시험한 다음, 표적 내인성 유전자의 조절을 세포 내 및 전체 식물에서, 생체 내 및 생체 외(ex vivo ) 둘 모두 시험한다. DNA-결합 단백질은 세포에서 재조합형으로 발현되거나, 식물에 이식된 세포에서 재조합형으로 발현되거나, 또는 유전자 이식 식물에서 재조합형으로 발현될 수 있을 뿐만 아니라 아래에 설명되는 전달 비히클을 사용하여 식물 또는 세포에 단백질로서 투여될 수 있다. 이러한 세포는 고정되거나, 용액에 있거나, 식물 내로 주입되거나, 또는 유전자 이식 또는 비-유전자 이식 식물에서 자연적으로 발생할 수 있다.
유전자 발현의 조절은 본 명세서에서 설명되는 시험관 내 또는 생체 내 분석 중 하나를 사용하여 시험한다. 샘플 또는 분석은 DNA-결합 단백질(예컨대, ZFP)로 처리되며 조절 정도를 조사하기 위해 시험 화합물이 없는 대조용 샘플과 비교된다. 내인성 유전자 발현을 조절하는 경우, DNA-결합 단백질은 전형적으로 200 nM 이하, 보다 바람직하게는 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 50 nM, 가장 바람직하게는 25 nM 이하의 Kd를 가진다.
결합 단백질의 효과는 상기 설명된 임의의 변수를 조사함으로써 측정될 수 있다. 임의의 적합한 유전자 발현, 표현형 또는 생리학적 변화를 사용하여 DNA-결합 단백질(예컨대, ZFP)의 영향을 분석할 수 있다. 온전한 세포 또는 식물을 사용하여 기능적 결과를 확인할 때, 다양한 영향 예컨대, 식물 성장, 공지된 및 비특성화 유전자 마커 둘 다로의 전사적 변화(예컨대, 노던 블롯 또는 올리고뉴클레오티드 어레이 연구), 세포 대사의 변화 예컨대, 세포 성장 또는 pH 변화 및 세포 내 제2 메신저 예컨대 cGMP의 변화를 또한 측정할 수 있다.
내인성 유전자 발현의 조절을 위한 바람직한 분석은 시험관 내에서 수행될 수 있다. 한 바람직한 시험관 내 분석 형식에서, 배양 세포 내 내인성 유전자 발현의 ZFP 조절은 ELISA 분석을 사용하여 단백질 생산을 조사함으로써 측정된다. 시험 샘플을 빈 벡터 또는 또 다른 유전자로 표적화된 비연관 ZFP로 처리된 대조용 세포와 비교한다.
또 다른 실시태양에서, 내인성 유전자 발현의 조절은 표적 유전자 mRNA 발현의 수준을 측정함으로써 시험관 내에서 측정된다. 유전자 발현의 수준은 증폭을 사용하여, 예컨대 PCR(예컨대, 실시간 PCR), LCR, 또는 하이브리드 형성 분석, 예컨대 노던 하이브리드 형성, RNase 보호, 점 블롯을 사용하여 측정된다. 한 실시태양에서 RNase 보호가 사용된다. 단백질 또는 mRNA의 수준은 본 명세서에서 설명된 직접적 또는 간접적으로 표지된 검출 시약, 예컨대 형광 또는 방사성 표지된 핵산, 방사성 또는 효소로 표지된 항체 등을 사용하여 검출된다.
다르게는, 리포터 유전자 시스템은 리포터 유전자, 예컨대 루시페라제, 녹색 형광 단백질, CAT, 또는 β-gal과 작동가능하게 연결된 표적 유전자 프로모터를 사용하여 고안될 수 있다. 리포터 구축물은 전형적으로 배양 세포 내로 코-트랜스펙션(co-transfection)된다. 선택한 DNA-결합 단백질(예컨대, ZFP)과의 처리 이후, 리포터 유전자 전사, 해독 또는 활성의 양은 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 측정된다.
유전자 이식 및 비-유전자 이식 식물이 또한 생체 내 내인성 유전자 발현의 조절을 조사하기 위한 바람직한 실시태양으로 사용된다. 유전자 이식 식물은 선택한 DNA-결합 단백질(예컨대, ZFP)을 안정하게 발현할 수 있다. 다르게는, 선택된 ZFP를 일시적으로 발현하거나 ZFP가 전달 비히클 중에서 투여되는 식물이 사용될 수 있다. 내인성 유전자 발현의 조절은 본 명세서에서 설명된 분석 중 임의의 하나를 사용하여 시험한다.
표적화된 절단 방법
개시된 방법 및 조성물이 세포 염색질의 관심 영역(예컨대, MDH 유전자 내 또는 이에 인접한 게놈에서 바람직하거나 사전결정된 위치)에서 DNA를 절단하는데 사용될 수 있다. 이러한 표적화된 DNA 절단의 경우, DNA-결합 도메인, 예컨대 아연 핑거 결합 도메인이 유전자조작되어 사전결정된 절단 위치에서 또는 그 근처에서 표적 자리에 결합하며, 유전자조작된 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인을 포함한 융합 단백질이 세포 내 폴리뉴클레오티드로부터 도입 및/또는 발현된다. 융합 단백질의 아연 핑거 부분이 표적 자리에 결합할 때, DNA가 절단 도메인에 의해 표적 자리 근처에서 절단된다.
다르게는, 각각 아연 핑거 결합 도메인과 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 기능적 절단 도메인이 재구성되고 DNA가 표적 자리의 부근에서 절단되는 방법으로 병치되는 표적 자리에 결합한다. 한 실시태양에서, 절단은 두 아연 핑거 결합 도메인의 표적 자리들 사이에서 발생한다. 하나 또는 두 아연 핑거 결합 도메인이 유전자조작될 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 사용한 표적화된 절단의 경우, 결합 자리는 절단 자리를 포괄할 수 있거나, 또는 결합 자리는 모서리 근처가 절단 자리로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 내지 50 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 절단 자리에 대해, 결합 자리의 정확한 위치는 특정 절단 도메인 및 ZC 링커의 길이에 의존할 것이다. 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 폴리펩티드가 사용되는 방법의 경우, 결합 자리는 일반적으로 절단 자리를 스트래들(straddle)한다. 따라서, 제1 결합 자리의 근처 모서리는 절단 자리의 한 측상의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 내지 50 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)일 수 있으며, 제2 결합 자리의 근처 모서리는 절단 자리의 다른 측상의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 내지 50 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 생체 내 및 시험관 내 절단 자리 매핑(mapping) 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 명세서에 설명된 방법은 절단 도메인에 융합된 유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 결합 도메인은 유전자 조작되어 절단이 바람직한 곳 또는 그 근처에서, 표적 서열에 결합한다. 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 식물 세포 내로 도입된다. 세포 내로 도입되거나 또는 세포 내에서 발현되면, 융합 단백질은 표적 서열에 결합하며 표적 서열에서 또는 그 근처에서 절단한다. 절단의 정확한 자리는 절단 도메인의 특성 및/또는 결합 및 절단 도메인 사이의 링커 서열의 존재 및/또는 특성에 의존한다. 각각 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질이 사용되는 경우, 결합 자리의 근처 모서리 사이의 거리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 내지 50 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 절단의 최적 수준은 또한 두 개의 융합 단백질의 결합 자리 사이의 거리(예컨대, 문헌[Smith et al . (2000) Nucleic Acids Res . 28:3361-3369; Bibikova et al . (2001) Mol . Cell . Biol . 21:289-297] 참조) 및 각 융합 단백질에서 ZC 링커의 길이(또한 미국 특허 제7,888,121호, 미국 특허 공보 제20050064474호 및 국제 특허 공보 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809 참조) 둘 다에 의존할 수 있다.
특정 실시태양에서, 절단 도메인은 두 개의 절단 하프-도메인을 포함하며, 이 둘 모두는 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부로, 제1 절단 하프-도메인 및 제2 절단 하프-도메인이다. 절단 하프-도메인은 그들이 DNA를 절단 기능을 하는 한, 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
절단 하프-도메인은 또한 별개의 분자에 제공될 수 있다. 예컨대, 두 개의 융합 폴리펩티드는 세포 내로 도입될 수 있으며, 각각의 폴리펩티드는 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함한다. 절단 하프-도메인은 그들이 DNA를 절단 기능을 하는 한, 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 나아가, 융합 폴리펩티드의 결합시, 두 개의 절단 하프-도메인이 절단 도메인의 재구성을 허용하는(예컨대, 하프-도메인의 다이머화에 의해) 서로에 대해 공간적인 배향으로 존재함으로써, 서로에 대해 하프-도메인이 배치되어 기능적 절단 도메인을 형성하며, 관심 영역의 세포 염색질의 절단을 초래하는 방법으로 전형적으로 배치된 표적 서열에 결합 도메인이 결합한다. 일반적으로, 재구성된 절단 도메인에 의한 절단은 두 표적 서열 사이에 위치한 자리에서 발생한다. 하나 또는 두 단백질은 유전자조작되어 그의 표적 자리에 결합할 수 있다.
두 융합 단백질은 동일 또는 반대 극성으로 관심 영역에 결합할 수 있으며, 그들의 결합 자리(즉, 표적 자리)는 임의의 수의 뉴클레오티드, 예컨대 0 내지 200 개 또는 그사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시태양에서, 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질을 위한 결합 자리는 다른 결합 자리에 가장 가까운 각 결합 자리의 모서리에서 측정했을 때, 5 내지 18 개의 뉴클레오티드 떨어져, 예컨대, 5-8 개의 뉴클레오티드 떨어져, 또는 15-18 개의 뉴클레오티드 떨어져, 또는 6 개의 뉴클레오티드 떨어져, 또는 16 개의 뉴클레오티드 떨어져, 위치될 수 있으며, 절단은 결합 자리들 사이에서 발생한다.
DNA가 절단되는 자리는 일반적으로 두 개의 융합 단백질의 결합 자리들 사이에 놓여있다. DNA의 이중-가닥 파괴는 흔히 두 개의 단일-가닥 파괴, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 오프셋(offset)된 "닉(nick)"(예컨대, 4 개의 뉴클레오티드에 의해 오프셋된 단일-가닥 파괴로부터 유래된 본래 FokⅠ에 의한 이중-가닥 DNA의 절단)에서 유래된다. 따라서, 절단은 반드시 각 DNA 가닥 상의 정확하게 대향되는 위치에서 발생하는 것은 아니다. 또한, 융합 단백질의 구조 및 표적 자리 사이의 거리는 절단이 단일 뉴클레오티드 쌍에 인접하게 발생하는지, 또는 절단이 몇몇 자리에서 발생하는지에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 표적화된 재조합 및 표적화된 돌연변이 유발(아래쪽 참고)을 포함하는 다수의 적용의 경우, 뉴클레오티드 범위 내의 절단은 일반적으로 충분하며, 특정 염기쌍 간의 절단이 요구되지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 설명되는 융합 단백질(들)은 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로 도입될 수 있다. 예컨대, 각각 상술한 폴리펩티드 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하는 두 개의 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입될 수 있으며, 폴리펩티드가 발현되고 각각이 그의 표적 서열에 결합할 때, 절단은 표적 서열에서 또는 그 근처에서 발생한다. 다르게는, 융합 폴리펩티드 둘 다를 암호화하는 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입된다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 DNA 및/또는 RNA의 임의의 변형된 형태 또는 유사체일 수 있다.
절단 특이성을 증대하기 위해서, 본 명세서에서 설명되는 방법에 부가적인 조성물이 또한 사용될 수 있다. 예컨대, 단일 절단 하프-도메인은 제한된 이중-가닥 절단 활성을 보일 수 있다. 각각 세-핑거 아연 핑거 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질이 세포 내로 도입되는 방법에서, 어느 하나의 단백질은 대략 9-뉴클레오티드 표적 자리를 명시한다. 18 개의 뉴클레오티드의 총 표적 서열은 포유류 및 식물 게놈에 고유한 것 같더라도, 임의의 주어진 9-뉴클레오티드 표적 자리가 인간 게놈의 평균 대략 23,000 배 발생한다. 따라서, 단일 하프-도메인의 자리-특이적 결합으로 인한, 비-특이적 절단이 발생할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명되는 방법은 두 개의 융합 단백질과 함께 세포 내에서 발현되는 FokI(또는 이를 암호화하는 핵산) 등의 절단 하프-도메인의 우성-음성 돌연변이체의 사용을 고려한다. 우성-음성 돌연변이체는 다이머화할 수 있으나, 절단할 수 없고, 또한 이들이 다이머화되는 하프-도메인의 절단 활성을 차단한다. 융합 단백질에 몰초과량의 우성-음성 돌연변이체를 제공함으로써, 두 융합 단백질 모두가 결합된 영역만이 다이머화를 위한 기능적 절단 하프-도메인의 충분히 높은 국소 농도를 가질 것이며, 절단이 발생한다. 두 개의 융합 단백질 중 오직 하나만 결합되는 자리에서, 이의 절단 하프-도메인은 우성 음성 돌연변이 하프-도메인을 갖는 다이머를 형성하며, 바람직하지 않은, 비-특이적 절단이 발생하지 않는다.
발현 벡터
본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질(예컨대, ZFN)을 암호화하는 핵산을, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 형질전환시키기 위한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 벡터는 원핵성 벡터(예컨대 플라스미드, 또는 셔틀(shuttle) 벡터, 곤충 벡터) 또는 진핵성 벡터일 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 또한, 세포에 투여하기 위해, 발현 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다.
융합 단백질(예컨대, ZFN)을 발현하기 위해, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 서열을 전형적으로, 전사를 지시하기 위한 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적합한 원핵성 및 진핵성 프로모터가 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예컨대 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al ., supra. Bacterial expression systems for expressing the proteins are available in, e.g., E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983))]에 기재되어 있다. 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵성 발현 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 이용가능하다.
융합 단백질-암호화 핵산의 발현을 지시하는데 사용된 프로모터는 특정 용도에 의존한다. 예컨대, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성성 프로모터가 융합 단백질의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
대조적으로, 식물 유전자의 조절을 위해 융합 단백질을 생체 내 투여할 때(하기 "식물 세포로의 핵산 전달" 섹션 참조), 융합 단백질의 특정 용도에 따라서 구성성 조절된(예컨대, 발육 동안, 조직 또는 세포 유형에 의해 또는 환경에 의해)또는 유도성 프로모터를 사용한다. 식물 프로모터의 비제한적 예는 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3(ubi-3)(Callis, et al., 1990, J. Biol . Chem . 265-12486-12493)로부터 유래된 프로모터 서열; 아그로박테리움 투미파시엔스(A. tumifaciens) 만노핀 합성효소(Δmas)(Petolino et al., 미국 특허 제6,730,824호 참조)로부터 유래된 프로모터 서열; 및/또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스(CsVMV)(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 또한, 실시예를 참조할 수 있다.
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 전형적으로, 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 핵산의 발현에 필요한 모든 부가적 요소를 함유하는 발현 카세트 또는 전사 단위를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예컨대 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터(리보좀 결합 자리 포함), 및 예컨대, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 또는 해독 종결에 요구되는 신호를 함유한다. 상기 카세트의 부가 요소는, 예컨대 인핸서, 이종 스플라이싱 신호, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(문헌[Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127])로부터의 2A 서열 및/또는 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하기 위해 사용되어 온 특정 발현 벡터는 융합 단백질의 의도한 용도, 예컨대 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선별된다(하기 언급되는 발현 벡터 참조). 표준 박테리아성 및 동물 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 미국 특허 공개공보 제20050064474A1호 및 국제 특허 공개공보 WO 05/084190, WO 05/014791 및 WO 03/080809에 상세히 기재되어 있다.
표준 트랜스펙션 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 박테리아성, 식물, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생성시킨 다음, 표준 기술을 이용하여 이를 정제할 수 있다(예컨대, 문헌[Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)]을 참조). 진핵성 및 원핵성 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라서 수행한다(예컨대, 문헌[Morrison, J. Bact . 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983)]을 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포 내로 도입하기 위한 널리 공지된 임의의 과정을 사용할 수 있다. 이들 과정은 인산칼슘 트랜스펙션, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법(예컨대, 소노포레이션(sonoporation)), 리포솜, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 아크로박테리움-매개 형질전환, 탄화규소(예컨대, 위스커스™) 매개 형질전환, 에피좀성 및 통합성 둘 다를 사용하는 방법, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하는 것으로 널리 공지된 기타 모든 방법을 포함한다(예컨대, 문헌[Sambrook et al., 상기] 참조). 선별 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는 특정 유전자 조작 과정을 사용하는 것만이 필요하다.
식물 세포에 대한 핵산 전달
상기 주목한 바와 같이, DNA 구축물은 다양한 통상적인 기술에 의해 원하는 식물 숙주 내로(예컨대, 원하는 식물의 게놈 내로) 도입될 수 있다. 이러한 기술에 관한 검토를 위해, 예컨대 문헌 [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N. Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조할 수 있다. 또한, 이의 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공보 제20090205083호; 제20100199389호; 제20110167521호 및 제20110189775호를 참조할 수 있다.
예컨대, DNA 구축물은 식물 세포 원형질체의 미세주사 및 전기천공과 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 구축물은 바이오리스틱스(biolistic) 방법, 예컨대 DNA 입자 충격을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다(예컨대, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 다르게는, DNA 구축물은 나노입자 형질전환을 통하여 식물 세포 내로 도입할 수 있다(예컨대, 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 공보 제20090104700호를 참조할 수 있다). 다르게는, DNA 구축물은 적합한 T-DNA 경계/인접 영역과 조합되며, 이를 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환 기술(이원 벡터의 사용 및 개발 및 암유전자의 완화(disarming) 포함)은 과학 문헌에 널리 보고되었다(예컨대, 문헌[Horsch et al. (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조).
또한, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 리조븀 종 NGR234, 시노리조보윰 멜리로티, 메소리조븀 로티, 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다. 예컨대, 문헌[Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조할 수 있다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독성 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터를 이용하여 박테리아에 의해 감염되거나(Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 공동-배양 과정(Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)에 의해 감염되는 경우에, 해당 구축물 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템을 사용하여 쌍떡잎 식물을 유전자 조작한다(Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641 참조). 아그로박테리움 형질전환 시스템을 또한 사용하여, DNA를 외떡잎 식물 및 식물 세포로 전달시킬 수 있을 뿐만 아니라 형질전환시킬 수 있다. 예컨대 미국 특허 제5,591,616호; 문헌 Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol . Biol . 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol . 95:426-434]을 참조할 수 있다.
대안의 유전자 전달 및 형질전환 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)- 또는 전기천공-매개된 흡수를 통한 원형질체 형질전환(문헌[Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722; Potrykus et al. (1985) Molec . Gen . Genet . 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공(문헌 [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505] 참조)을 포함한다. 식물 세포를 형질전환시키기 위한 부가적인 방법은 미세주사, 탄화규소(위스커스™) 매개된 DNA 흡수(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), 및 미세발사체 충격(Klein et al . (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618)이 포함된다.
개시된 방법 및 조성물은 MDH 유전자에 외인성 서열을 삽입하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 이식유전자의 발현이 그의 통합 자리에 결정적으로 의존하기 때문에 유용하다. 따라서, 예컨대 제초제 내성, 해충 저항성, 영양분, 항생제 또는 치료용 분자를 암호화하는 유전자는 표적화 재조합에 의해, 그들의 발현에 바람직한 식물 게놈 영역 내로 삽입할 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생성된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고, 따라서 목적하는 표현형을 지닌 완전 식물을 생성시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 전형적으로 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입시킨 살생제 및/또는 제초제 마커에 따라서, 조직 배양 성장 배지에서 특정의 식물 호르몬을 조작하는 것에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌[Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants , Plant Protoplasts , pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에서 설명된다. 재생은 또한, 식물 캘러스(callus), 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 얻을 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로, 문헌[Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에서 설명된다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여 거의 모든 식물에 대해 목적하는 형질을 부여할 수 있다. 본 명세서의 핵산 구축물 및 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여, 본 명세서에 기재된 목적하는 생리학적 및 농경학적 특징을 위해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 유전공학 처리시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 조작을 위한 표적 식물 및 식물 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 외떡잎 및 쌍떡잎 식물, 예컨대 낟알 작물(예컨대, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 열매 작물(예컨대, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물(예컨대, 알팔파), 근채류 작물(예컨대, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물(예컨대, 상추, 시금치)을 포함한 작물; 화훼(예컨대, 페투니아, 장미, 국화), 침엽수(conifers) 및 소나무(예컨대, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물 환경복원에 사용된 식물(예컨대, 중금속 축적 식물); 오일 작물(예컨대, 해바라기, 평지씨) 및 실험용으로 사용된 식물(예컨대, 아라비도프시스(Arabidopsis)을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캡시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리게론(Erigeron), 글라이신(Glycine), 고시퓸(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카 (Lactuca), 롤륨(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하여 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.
식물 세포 내로 도입되는 핵산의 도입은 근본적으로 임의의 식물에 바람직한 형질을 부여하는데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 식물 세포에서 교체된 MDH 발현/기능은 증가된 열매 수확량, 식물(또는 식물의 열매)의 증가된 바이오매스, 과육의 보다 높은 함량, 집중된 열매 세트, 보다 큰 식물, 증가된 신선 중량, 증가된 건조 중량, 증가된 고체 내용물, 수확시 보다 높은 총 중량, 작물 색의 증대된 강도 및/또는 균일함, 교체된 화학(예컨대, 오일, 지방산, 탄수화물, 단백질) 특성 등을 갖는 식물을 초래한다.
당업자는 외인성 서열이 식물 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은 서열이 도입된 식물 세포의 세포 기구를 활용할 수 있다. 식물 세포 내로 일시적으로 도입된 ZFN을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 표적 서열의 게놈 DNA를 분석하여 임의의 삽입-결실, 반전, 또는 삽입을 확인하고 알아냄으로써 분석될 수 있다. 이러한 유형의 재배열은 게놈 DNA 서열 내의 표적 자리의 절단 및 이후의 DNA 복구에서 유래한다. 또한, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 당업자에게 공지된 마커 유전자 발현의 시험을 가능하게 한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 마커 유전자의 일시적인 발현은 다양한 식물, 조직 및 DNA 전달 시스템을 사용하여 보고된다. 일시적인 분석 시스템은 임의의 관심 식물 종을 사용한 임의의 일시적인 식물 분석에서 조직의 전기천공 또는 입자 충돌을 통한 유전자 전달 지시를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 일시적인 시스템은 다양한 조직 소스의 원형질체의 전기천공 또는 관심 특정 조직의 입자 충돌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서는 자리 특이적 엔도뉴클레아제(예컨대, ZFN)를 평가하고 MDH 표적 유전자 내의 돌연변이를 도입하는 임의의 일시적인 발현 시스템의 사용을 포괄한다. 적절한 전달 시스템을 통한 일시적인 시험에 구상되는 식물 조직의 예는 잎 기반 조직, 캘러스(callus), 자엽, 뿌리, 내배유, 배, 꽃 조직, 화분, 표피 조직을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당업자는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 유전자 이식 식물에 안정적으로 포함될 수 있음을 인식할 것이다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 작동 가능하다는 것을 확인한 후에, 이를 유성 교배에 의해 기타 식물 내로 도입할 수 있다. 교배하고자 하는 종에 따라서, 임의의 다수의 표준 육종 기술이 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘루스, 조직 또는 식물은 형질전환성 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 형질에 대해, 유전자 조작한 식물 물질을 선별 또는 스크리닝함으로써 확인하고 분리할 수 있다. 예컨대, 선별은 유전자 조작한 식물 물질을, 형질전환 유전자 구축물이 내성을 부여한 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한, 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 모든 가시적 마커 유전자(예: β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 C1 유전자)의 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이러한 선별 및 스크리닝 방법론은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 안정하게 삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체, 또는 자리-특이적 엔도뉴클레아제(예컨대, ZFN)의 일시적인 발현에서 유래된 표적 유전자 교체된 게놈 DNA를 포함하는 식물 세포를 확인할 수 있다. 이들 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1) 재조합 DNA 삽입물의 구조를 검출하고 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사체를 검출하고 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 이러한 유전자 생성물이 유전자 구축물에 의해 암호화되는 경우, 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 분석; 4) 유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소 결합 면역분석(ELISA)을 포함한다. 부가의 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색을 또한 사용하여, 특이적 식물 기관 및 조직 내에서의 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 이들 분석 모두를 수행하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법을 이용하는 유전자 조작의 효과는, 예컨대 관심 있는 조직으로부터 분리된 RNA(예컨대 mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나 mRNA의 양이 증가하였다면, 대응하는 이식유전자가 발현되는 것으로 추정될 수 있다. 유전자 및/또는 암호화된 폴리펩티드 활성을 측정하는 기타 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라서, 상이한 유형의 효소적 분석을 이용할 수 있다. 또한, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 널리 공지된 기타 항체 의거 분석, 예컨대 전기영동적 검출 분석(염색 또는 웨스턴 블롯팅을 이용함)에 의해 측정할 수 있다. 한 가지 비제한적 예로서, ELISA 분석을 이용하여 AAD-1 및 PAT 단백질을 검출하는 방법은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 공보 제20090093366호에서 설명된다. 이식유전자는 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발생 단계에서 선별적으로 발현될 수 있거나, 또는 이식유전자는 실질적으로 그의 전체 라이프 사이클에 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 양식이 또한 적용 가능하다.
본 명세서는 또한 상기 설명한 유전자 이식 식물의 종자를 포함하되, 종자는 이식유전자 또는 유전자 구축물을 가진다. 본 명세서는 추가로, 이식유전자 또는 유전자 구축물을 가지는, 상기 언급된 유전자 이식 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 포함한다.
융합 단백질(예컨대, ZFN) 및 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 유전자 조절, 표적화 절단 및/또는 재조합을 위해 식물에게 직접 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물은 다수의 유사 MDH 표적 유전자를 함유한다. 따라서, 하나 이상의 상이한 융합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 식물 중의 하나 이상의 유사한 유전자를 표적화하기 위해 식물에 투여될 수 있다.
유효량의 투여는 처리하고자 하는 식물 세포와 궁극적으로 접촉하여 융합 단백질을 도입하기 위해 통상 사용되고 있는 임의의 경로에 의한다. ZFP는 바람직하게는 허용가능한 담체와 함께 임의의 적합한 방식으로 투여된다. 이러한 조절 인자를 투여하는데 적합한 방법은 당업자에게 이용 가능하고 널리 알려져 있으며, 한 가지 초과의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수도 있지만, 특정 경로는 종종, 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 유효한 반응을 제공할 수 있다.
담체가 사용할 수 있으며, 투여되는 특정 조성물에 의해서뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용 가능한 광범위한 적합한 담체 제형이 존재한다.
실시예
실시예 1: 토마토(솔라눔 리코퍼시쿰 )의 미토콘드리아 말산 탈수소효소( mMDH ) 표적 유전자의 특성화
말산 탈수소효소(MDH) 유전자는 일반적으로 유기체 내의 다수의 유사한 복제로서 나타난다. 유기체 내의 유사한 유사 말산 탈수소효소 유전자 서열의 존재에도 불구하고, 단일 미토콘드리아 말산 탈수소효소(mMDH) 유전자 서열이 확인되었고, 솔라눔 리코퍼시쿰으로부터 분리되었다. 처음에, 폴리뉴클레오티드 서열 데이터베이스에 포함된 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는, 문헌에 설명된, 공지된 말산 탈수소효소 유전자 서열 부분을 비교함으로써, 미토콘드리아 말산 탈수소효소(mMDH) 유전자 서열을 몇몇 폴리뉴클레오티드 서열 데이터베이스에서 확인하였다. 서열 정렬의 무수한 비교 이후, 두 개의 상이한 말산 탈수소효소 유전자 서열의 완전한 서열, mMDH 서열(이하 설명됨) 및 글리코솜 MDH(gMDH) 서열(기탁 번호: AY725476)을 확인하였다. 서열 데이터베이스 스크리닝 결과는 솔게노믹스(Solgenomics)(또한, 문헌[Bombarely et al . (2011) Nuc Acids Res. (Database issue):D1149-55] 참조)에서 온라인으로 이용가능한 토마토 게놈 서열 데이터베이스로부터 기탁 번호: Solyc07g062650 (서열 번호:1)로서 mMDH 유전자자리를 확인하였다.
인 실리코(in silico)로 확인된 mMDH 유전자 서열을 사용하여 두 개의 별개 토마토 유전자형, M82 및 머니메이커로부터 mMDH 유전자 서열을 확인하였다. 확인된 인 실리코 mMDH 유전자 서열에 기반하여 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction (PCR)) 프라이머를 설계하였다. 대략 6kb의 PCR 절편을 각 토마토 유전자형에서 분리하고 클로닝하고 시퀀싱하였다. 놀랍게도, 전형적으로 미미한 차이가 예상되기 때문에, 토마토 유전자형의 시퀀싱된 mMDH는 본래 확인되고 인 실리코로 분리된 mMDH 유전자 자리와 차이를 보이지 않았다.
분리된 신규한 mMDH 유전자 서열은 추가 아연 핑거 시약 설계에 사용되었다.
실시예 2: 미토콘드리아 말산 탈수소효소( mMDH ) 유전자와 결합하도록 설계된 아연 핑거 단백질의 생산
이전에 설명된 바와 같이, S. 리코페르시쿰 v. M82 mMDH 유전자 암호화 영역(도 1 참조)의 다양한 기능적 도메인을 암호화하는 DNA 서열에 대한 아연 핑거 단백질이 설계되었다. 이에 대해서는 예컨대, 문헌[Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651]을 참조할 수 있다. 예시적인 표적 서열 및 인식 나선이 표 1A(인식 나선 영역 설계) 및 표 1B(표적 자리)에 나타난다. 표 1B에서, ZFP 인식 나선에 의해 접촉되는 표적 자리의 뉴클레오티드는 대문자로 지칭되며, 비-접촉 뉴클레오티드는 소문자로 지칭된다.
[표 1A] 토마토 mMDH -결합 아연 핑거 디자인
Figure 112014115149583-pct00001
[표 1B] 아연 핑거 단백질의 표적 서열
Figure 112014115149583-pct00002
* 서열 번호:2의 상보적 또는 반전 배향의 결합 서열을 지칭.
mMDH 아연 핑거 설계가 CCHC 구조를 갖는 하나 이상의 핑거를 가지는 단백질을 암호화하는 벡터에 포함되었다. 이에 대해서는, 미국 특허 공보 제2008/0182332호를 참조할 수 있다. 특히, 각 단백질의 마지막 핑거는 인식 나선을 위해 CCHC 주쇄를 가졌다. 비-정규 아연 핑거-암호화 서열을 4 아미노산 ZC 링커 및 제아 메이즈(Zea mays)로부터 유래된 불투명-2 핵 위치 신호를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI(문헌[Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)의 뉴클레아제 도메인에 융합되어 mMDH 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성하였다. 바이시스트로닉 발현 구축물의 융합 단백질의 발현은 문헌[Shukla et al . (2009) Nature 459:437-441]에 설명된 2A 리보솜 스터터링(stuttering) 신호를 활용하며, 비교적 강하고, 구성적이며, 이소성(ectopic)인 프로모터 예컨대, CsVMV 프로모터 또는 솔라눔 리코퍼시쿰 AA6(AA6) 프로모터에서 유래된 프로모터에 의해 구동되었다.
활성 뉴클레아제를 확인하도록 이전에 나타낸 출아 효모 기반 시스템을 사용하여 절단 활성에 대해 최적의 아연 핑거를 입증하였다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 공보 제20090111119호; 문헌[Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708]; 문헌[Geurts et al. (2009) Science 325:433]을 참조할 수 있다. 생체 내 사용을 위해 다양한 기능적 도메인에 대한 아연 핑거를 선택하였다. 추정상의 mMDH 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 자리에 결합하기 위해 설계되고, 생산되고, 시험된 무수한 ZFN 중에서, 높은 수준으로 생체 내 활성을 갖는 네 개의 ZFN이 확인되었고, 추가 실험을 위해 선택되었다. 표 1A를 참조할 수 있다. 이러한 네 개의 ZFN은 식물 내(in planta) 네 개의 독특한 mMDH 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 자리와 효율적으로 결합하고 절단할 수 있는 것을 특징으로 하였다.
도 2a 및 2b(서열 번호:2)는 네 개의 ZFN 쌍의 표적 자리/ZFN 폴리뉴클레오티드 결합에 관한 mMDH 유전자자리의 게놈 구성을 나타낸다. 제1 ZFN 쌍(107830L/ 107830R; 도 2a에서 각각 "830L" 및 "830R"로 지칭)은 엑손 1 내에 결합하며, 제2 ZFN 쌍(107832L/107832R; 도 2a에서 각각 "832L" 및 "832R"로 지칭)은 엑손 3 내에 결합하며, 제3 ZFN(107833L/107833R; 도 2a에서 각각 "833L" 및 "833R"로 지칭)은 엑손 4 내에 결합하며, 제4 ZFN 쌍(107835L/107835R; 도 2a에서 각각 "835L" 및 "835R"로 지칭)은 엑손 6 내에 결합한다.
실시예 3: 토마토에서의 발현을 위한 아연 핑거 뉴클레아제 구축물
효모 분석을 사용하여 확인되었고, 실시예 2에서 설명된, 네 개의 예시적 아연 핑거 뉴클레아제의 ZFN 발현 구축물을 함유한 플라스미드 벡터가 당업계에 일반적으로 알려진 기법 및 기술을 사용하여 설계되고 완성되었다. 각각의 아연 핑거-암호화 서열은 불투명-2 핵 위치 신호(문헌[Maddaloni et al . (1989) Nuc . Acids Res. 17(18):7532])를 암호화하는 서열에 융합되었고, 이는 아연 핑거 뉴클레아제의 업스트림에 배치되었다.
다음으로, 불투명-2 핵 위치 신호 :: 아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열이 상보적 불투명-2 핵 위치 신호 :: 아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열과 짝을 이루었다. 이와 같이, 각각의 구축물은 토세아 아시그나 바이러스(문헌[Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127])의 2A 서열에 의해 분리된 두 개의 불투명-2 핵 위치 신호 :: 아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열로 구성된 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. ZFN 암호화 서열의 발현은 매우 발현한 구성요소 AA6 프로모터(미국 특허 공보 제2009/0328248호)에 의해 구동되었고, 노스 3' 폴리A 비해독 영역(문헌[Bevan et al . (1983) Nucl . Acid Res. 11:369-385])에 인접하였다.
그 결과의 네 개의 플라스미드 구축물, pKG7479 (ZFN 107830L/R 구축물 함유), pKG7480(ZFN 107832L/R 구축물 함유), pKG7481(ZFN 107833L/R 구축물 함유) 및 pKG7482(ZFN 107835L/R 구축물 함유)가 제한 효소 소화를 통해 및 DNA 시퀀싱을 통해 확인되었다. 도 3 내지 6을 참조할 수 있다.
실시예 4: 대규모 플라스미드 분리
대규모 플라스미드 DNA 분리 프로토콜을 활용하여 다음의 프로토콜을 사용한 원형질체 트랜스펙션을 위한 대량의 DNA를 생산하였다. 우선, 실시예 3에 상술된 아연 핑거 뉴클레아제 구축물 중 하나를 함유한 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 탑10(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 균주를 밤새 37 ℃에서 100 μg/mL의 카르베니실린을 함유한 250 mL의 LB 배지를 접종하였다. 이어서 배양물을 15분 동안 6,000 rpm에서 원심분리하고, 그 결과의 펠릿을 20 mL의 살균 GTE 완충제(리터당: 10 g 글루코오스, 25 mL의 pH 8.0의 1 M 트리스, 및 20 mL의 pH 8.0의 0.5 MEDTA) 및 20 mg의 라이소자임(미주리주 세인트 루이스 소재의 두체파(Duchefa))에 재현탁하였다. 다음으로, 30 mL의 NaOH-SDS 완충제(200mM NaOH, 1% SDS (w/v))을 첨가하고, 와류 없이 완전하게 혼합하고 3 분 동안 얼음에서 배양하였다. 마지막으로, 22.5 mL의 아세트산 칼륨 완충제(294.5 g/l)를 첨가하고 샘플을 얼음에서 10 분 동안 배양하였다. 그 결과의 슬러리를 원심분리(5 ℃에서 25 분 동안 6,000 rpm)하였고, 살균 여과지를 통해 이를 통과시킨 후, 상청액을 수집하였다.
다음으로, 60 mL의 이소프로판올(1 부피)을 여과물 상청액에 첨가하였고 10 분 동안 상온에서 배양하였다. 이어서 혼합물을 원심분리(상온에서 30 분 동안 6,000 rpm)하고, 상청액을 버리고 펠릿을 70 % 에탄올에 세척하였다. 2차 원심분리(상온에서 5분 동안 6,000 rpm) 이후, 상청액을 제거하고 펠릿을 4 mL의 TE(10 mM 트리스, 1 mM pH 8.0 EDTA)에 용해하고, 4 μl의 RNase 용액을 첨가하고 용액을 상온에서 20 분 동안 배양하였다. 이어서 샘플을 12 mL 튜브로 이송하고, 400 μl의 3M pH 5.2 NaOAc 및 4 mL 페놀을 첨가하고, 와류한 다음, 원심분리(상온에서 10 분 동안 4,000 rpm)하였다. 원심분리된 샘플의 상부를 새로운 튜브에 수집하였고, 4 mL의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 추가하고, 와류하고 원심분리(상온에서 10 분 동안 4,000 rpm)하였다. 다시, 원심분리된 샘플의 상부를 수집하고, 8 mL의 무수 에탄올을 첨가하고 -20 ℃에서 30 분 동안 배양하였다.
추가 차수의 원심분리(5 ℃에서 30 분 동안 4,000 rpm) 이후, 펠릿을 70 % 에탄올로 헹구고 원심분리(상온에서 5 분 동안 4,000 rpm)한 다음 플로우 캐비넷에서 공기 건조하였다. 펠릿을 물로 정제한 4 ml의 밀리-큐™(MILLI-Q™)에 용해하고 1.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 분취하였다. 다음으로, 0.5 mL의 PEG 용액(40 % 폴리에틸렌 글리콜 6,000(w/v), MgCl2:6H2O, 필터(0.2 ㎛))을 첨가하였고, 상온에서 30 분 배양 후 튜브를 원심분리(10분 동안 14,000 rpm)하였다. 펠릿은 70 % 에탄올로 세척한 다음, 원심분리(5분 동안 14,000 rpm)하였고, 이러한 단계를 두 번 반복하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 0.5 mL의 밀리-큐™ 물의 최종 부피에 용해하였다. 나노 드랍™(NANO DROP™) 장치(델라웨어주, 윌밍턴 소재의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 확인하였다.
실시예 5: 토마토 원형질체 분리 및 트랜스펙션
토마토 잎 원형질체의 분리 및 재생은 이전에 설명되어 왔고(문헌[Shahin (1985) Theor . Appl . Genet. 69:235-240]; 문헌[Tan et al . (1987) Theor . Appl . Genet. 75:105-108]; 문헌[Tan et al . (1987) Plant Cell Rep. 6:172-175]), 이러한 프로토콜을 위해 활용될 수 있는 예시적인 용액 및 배지가 이러한 출판물에 알려져있다. 간단히, 솔라눔 리코퍼시쿰 종자를 0.1 % 차아염소산-나트륨으로 살균하고, 2,000 lux, 25 ℃ 및 50-70 % 상대습도에서 16/8 시간의 광주기를 갖는 살균 MS20 배지에서 시험관 내 성장하였다. 다음으로, 1 g의 갓 수확한 잎을 5 mL의 CPW9M 액체 배지의 접시에 배치하였다. 메스 칼날(scalpel blade)을 사용하여 수확한 잎을 주된 줄기에 수직으로 절단하였다. 잎의 단면은 폭이 ~1 mm이었다.
잎 단면을 25 mL 효소 용액(CPW9M 함유 2 % 셀룰로오스 ONOZUKA RS™, 0.4 % 마체로자임 오노주카(ONOZUKA) R10™, 2,4-D(2 mg/mL), NAA(2 mg/mL), BAP(2 mg/mL) pH 5.8)을 함유한 새 플레이트로 이송시키고, 소화를 어둠 속에서 25 ℃로 밤새 진행하였다. 이어서 그들을 1 시간 동안 오비탈 쉐이커(40-50 rpm)에 배치하여 원형질체를 제거하였다. 그들을 50 ㎛ 체를 통과시켜 원형질체를 세포 파편에서 분리하였고 체를 CPW9M으로 두 번 세척하였다. 다음으로, 원형질체를 85 배 중력(x g)으로 원심분리하였고, 상청액을 버리고 펠릿을 CPW9M 용액 부피의 절반으로 취하였다.
마지막으로, 원형질체를 3 ml의 CPW9M 용액으로 취한 다음, 3 ml의 CPW18S을 조심스럽게 첨가하여 층으로 된 계면을 생성하였고, 두 용액 사이의 혼합은 없었다. 원형질체를 10 분 동안 85 배의 중력으로 회전시켰고, 상간층(interphase layer)에서 생존 원형질체 부유물을 파스퇴르 피펫을 사용하여 수집하였다. 원형질체 부피는 더 많은 CPW9M 배지를 첨가함으로써 10 mL로 증가하였고, 회수된 원형질체의 수는 혈구계(haemocytometer)를 사용하여 측정하였다. 원형질체 현탁액을 5 ℃에서 10 분 동안 85 배 중력으로 원심분리하였다. 상청액을 버리고 원형질체 필렛을 CPW9M 세척 배지에서 106.mL-1의 최종 농도로 재현탁하였다.
ZFN 구축물로 분리된 원형질체의 트랜스펙션을 이어서 수행하였다. 10 mL 튜브에서, 250 μL의 원형질체 현탁액, 및 플라스미드 DNA(20 μg 또는 30 μg의 농도에서 사용), 및 250 μL의 PEG 용액(40% PEG4000, 0.1M Ca(NO3)2, 0.4M 만니톨)을 부드럽게, 그러나 완전히 혼합하였다. 상온에서 20 분의 배양 이후, 5 mL의 차가운 0.275 M Ca(NO3)2을 적가하였다. 원형질체 현탁액을 4 ℃에서 85 배 중력으로 10 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 이후, 상청액을 버리고 원형질체를 4 mL의 액체 K8p 배지에 재현탁하였다. 원형질체를 어둠 속 28 ℃에서 48 시간 동안 배양한 다음, 게놈 DNA 분리를 위한 원심분리를 통해 수확하였다.
상술한 프로토콜을 사용하여 토마토 원형질체를 트랜스펙션함으로써 토마토 세포 원형질체의 ZFN의 활성을 시험하였다. 토마토 원형질체를 대량으로 분리하고 플라스미드 DNA를 PEG 매개 트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 원형질체의 세포 내로 도입하였다. 전형적으로, 리포터 구축물, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 함유한 리포터 구축물을 사용할 때, 최대 80 %의 트랜스펙션률이 관찰된다. 토마토 세포 내에 도입된 대량의 플라스미드 복제가 플라스미드에 의해 암호화된 대량의 단백질을 생산한다. 그 결과로, GFP 단백질을 발현한 토마토 세포는 트랜스펙션 이후 최대 48 시간까지 발견할 수 있다. 그러나, 48 시간 내에 세포 내의 플라스미드 DNA가 제거되기 때문에 도입된 구축물의 발현은 일시적이다.
실시예 6: 토마토 원형질체의 ZFN 활성
토마토 원형질체의 ZFN 구축물의 발현 및 토마토 게놈 DNA의 mMDH 유전자 자리를 절단하는 ZFN의 활성을 측정하기 위해, 다음과 같은 풋프린트 분석이 완료되었다. 토마토 원형질체를 분리하고 네 개의 예시적인 ZFN 구축물(pKG7479(ZFN 107830L/R 구축물 함유); pKG7480(ZFN 107832L/R 구축물 함유); pKG7481(ZFN 107833L/R 구축물 함유); 또는 pKG7482(ZFN 107835L/R 구축물 함유)) 중 하나를 수행하는 플라스미드 DNA에 트랜스펙션하였다. 세포 내부에 도입된 이후, ZFN이 발현되었고, ZFN 효소가 특이적 mMDH 표적 자리에서 DNA 이중 가닥 파괴(DSB)를 유도하였다. 비상동 말단 접합(NHEJ) 경로에 수반되는 단백질로 DNA DSB를 복구하였고, 이러한 복구 과정은 때때로 오류 유발이며, DSB 도입 자리에서 작은 삽입 또는 결실("삽입-결실")을 초래한다. ZFN 처리 이후, mMDH 표적 자리를 PCR 증폭하였고 그 결과의 삽입-결실을 검출하고 고해상도 용융(HRM) 곡선 분석 및/또는 시퀀싱을 사용하여 정량화하였다.
토마토 M82 품종의 원형질체(~250,000)를 분리하였고, 다양한 농도(20 또는 30 μg)의 pKG7479, pKG7480, pKG7481 및 pKG7482 플라스미드로 트랜스펙션하였고, 48 시간 이후 세포를 수집하였다. 음성 대조군으로서, AA6 ::GFP 구축물을 함유한 플라스미드를 사용하여 토마토 원형질체 트랜스펙션을 수행하였다. 이어서 게놈 DNA를 DNEASY 미니키트(MINI KIT)™(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 각 샘플에서 분리하였고, DNA 농도를 측정하였다. 각각의 트랜스펙션된 원형질체 샘플로부터 제작자의 지시를 따라 헤르쿨라제 II 퓨젼 키트™(HERCULASE II FUSION KIT™)(캘리포니아주 산타클라라 소재의 아길렌트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 사용하여 도입된 ZFN 구축물에 상응하는 연관 표적 자리를 증폭시켰다. 표적 자리 전부는 제작자의 지시를 따라 헤르쿨라제 II 퓨젼 키트™를 사용하여 GFP 대조 구축물로 트랜스펙션된 음성 대조군 샘플로부터 증폭되었다. PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머는 표 2A(PCR 분석) 및 2B(HRM 분석)에 설명되어 있다.
[표 2A] PCR 분석을 위한 표적 자리 특이적 프라이머
Figure 112014115149583-pct00003
[표 2B] HRM 분석을 위해 사용되는 프라이머
Figure 112014115149583-pct00004
PCR 증폭된 생산물을 PCR 퓨리피케이션 키트™(PURIFICATION KIT™)(퀴아젠)을 사용하여 정제하였고, 50 ng의 정제된 DNA를 사용하여 제작자의 지시에 따라 제로 블런트 클로닝 키트™(ZERO BLUNT CLONING KIT™)(인비트로겐(Invitrogen))로 클로닝하였다. 다음으로, 2 μl의 결찰 혼합물을 에스케리치아 콜리 원-샷 탑10(ONE-SHOT TOP10) 수용성 세포(인비트로겐)로 이송시켰고, 100 μg/mL의 카나마이신으로 보충된 LB 배지에서 군체를 선택하였다. 헤르쿨라제 II 퓨전 키트™ PCR 반응(50 μl 최종 부피)를 표 2에 설명된 HRM 프라이머를 사용하여 제작자의 설명에 따라 수행하였다. 각각의 세트 또는 PCR 프라이머는 약 200 bps의 파편을 증폭하였다. 그 결과의 PCR 생산물을 HRM 분석에 사용하였다.
당업계에 인식된 과정을 사용하여 HRM 분석을 수행하였다. 간단히, 미처리된(ZFN 아님) 게놈 DNA상에 동일한 프라이머를 사용하여 생산된 야생형 PCR 생산물과 PCR 생산물을 1:1 비로 혼합하였다. SYBR®-녹색 염료를 추가하고 PCR 생산물의 용융 곡선 프로파일을 로슈 라이트 사이클러™(ROCHE LIGHT CYCLER™)(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 다이어그노스틱스(Roche Diagnostics))로 측정하였다. 야생형 미처리된 PCR 생산물과 상당히 상이한 용융 곡선을 갖는 PCR 생산물을 확인하였고 저장하였다. 이어서 M13F 및 M13R 프라이머를 사용한 PCR 반응이 HRM 과정을 사용하여 확인한 박테리아 클론 상에서 직접 완료되었고, 그 결과의 PCR 생산물을 정제하고 시퀀싱하였다. 이러한 분석의 결과는 표 3 및 도 7에 나타난다.
[표 3] HRM 의 요약 및 서열 분석
Figure 112014115149583-pct00005
나타낸 바와 같이, 삽입-결실의 형성이 모든 ZFN 표적 자리에서 검출되며, 네 개의 ZFN 전부가 토마토 원형질체에서 활성임을 입증한다. 주어진 ZFN 구축물의 효능 평가는 삽입-결실을 포함한 처리에 의해 생산된 PCR 생산물의 수를 계산함으로써 행해질 수 있다. ZFN 107830 및 107832가 가장 높은 수의 삽입-결실 PCR 생산물을 제공하였다(각각 4.1 % 및 5.5 %). 반면에, ZFN 107833 및 107835의 경우, 삽입-결실 PCR 생산물의 수는 상당히 더 낮았다(각각 2 % 및 0.7 %). GFP 플라스미드로 처리된 대조군 토마토 원형질체에서 유래된 PCR 생성물에서는 어떠한 삽입-결실도 검출되지 않았다.
실시예 7: mMDH 유전자자리에서 돌연변이를 함유한 식물의 분리
토마토 원형질체를 토마토 품종 M82 및 머니메이커에서 분리하고, 이전에 설명한 대로 pKG7479, pKG7480, pKG7481 및 pKG7482로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션으로부터 토마토 식물의 재생을 위해, 원형질체를 2 mL의 알기네이트 용액(만니톨 90 g/L, CaCl2.2H2O 140 mg/L, 알기네이트-Na 20 g/L(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 재현탁하였고, 뒤집어 완전히 혼합하였다. 이러한 재현탁액으로부터, 1 mL의 세포를 Ca-한천 평판(72.5 g/L 만니톨, 7.35 g/L CaCl2.2H2O, 8g/L 한천)에 균일하게 층층이 쌓고, 중합하였다. 이어서 알기네이트 디스크를 4 mL의 K8p 배양 배지를 포함한 4 cm 페트리 접시로 이동시키고 7일 동안 어둠에서 28 ℃로 성장시켰다. 할당된 배양 시간 이후, 알기네이트 디스크를 얇은 스트립으로 자르고 어둠 속 28 ℃에서 3주 동안 GM-ZG 배지를 함유한 플레이트에 배치하여 캘러스 성장을 촉진하였다. 이러한 배양 시기 이후, 이어서 스트립에서 개별적인 캘리(calli)를 고르고 새로운 GM-ZG 배지에 배열하고 빛에서 25 ℃로 성장시켰다. 3주 이후, 캘리를 새로운 GM-ZG 배지로 이동시킨다. 이러한 단계를 캘리가 약 2 cm 크기가 될 때까지 두 번 반복하였다.
다음으로, 캘리를 배지로 이동시켜 순 형성(MS20-ZI; MS20 + 2 mg/L 제아틴 + 0.1 mg/L IAA)을 촉진하며, 순이 형성될 때까지 이동을 반복하였다. 이어서 DNA 분리를 위해 각 순에서 잎 하나를 제거하고 표 2에 설명된 프라이머와 이전에 설명된 PCR 반응을 사용하여 연관 mMDH 표적 자리를 증폭시켰다. 이어서 PCR 생산물을 정제하고 시퀀싱하여 mMDH 유전자자리에 돌연변이를 포함한 순을 확인하였다. 이러한 순을 발근배지(MS20 + 0.5 mg / l IBA) 그리고 최종적으로 온실로 이동시켰다.
이러한 실험 동안 토마토 식물의 게놈에서 생산된 돌연변이의 요약이 표 4에 나타난다. ZFN 결합 자리는 밑줄 그어져있고, 삭제된 뉴클레오티드(-)를 표시한다. 별표로 표시된 식물 식별 번호는 mMDH의 복제 둘 다에서 동일한 돌연변이를 가지며, 설명된 돌연변이체에 동형접합성인 것으로 확인된 식물을 지칭한다.
[표 4] mMDH 의 ZFN -유도된 돌연변이의 요약
Figure 112014115149583-pct00006
Figure 112014115149583-pct00007
생식력 있는 돌연변이체 식물 계통을 모 식물과 교배하여 F1 종자를 수집하였다. 모 돌연변이체 식물에 존재한 삽입-결실 돌연변이를 검출하기 위해 F1 묘목을 스크리닝하였고 이러한 식물을 성숙기로 성장시키고 자가 수정하여 F2 종자를 생산하였다. F2 종자에서 성장한 토마토 식물을 사용하여 토마토 수확량에 미치는 돌연변이의 효과를 확인할 수 있다.
실시예 8: mMDH 유전자자리에서 돌연변이의 분자적 및 생화학적 확인
각 돌연변이체 식물 계통의 F2 종자를 싹트게 하고 12 개의 묘목은 돌연변이 자리를 증폭시키고 PCR 생산물을 시퀀싱하여 묘목이 야생형 서열을 가지는지 또는 삽입-결실 돌연변이에 이형접합성 또는 동형접합성인지를 확인한 유전자형이다. 이어서 각 유형(총 6)의 두 묘목을 성숙기로 성장시키고 열매를 맺게 하였다. 각각의 식물로부터 조직 샘플을 수집하였고, mMDH 단백질 수준 및 mMDH 활성에 미치는 다양한 돌연변이의 효과를 측정하였다. 웨스턴 블로팅을 사용하여 반정량적으로 mMDH 단백질 수준을 측정하였고, 토마토 식물 열매 수확량을 확인함으로써 mMDH 활성을 측정하였다.
mMDH 단백질 수준을 확인하기 위해, 토끼의 mMDH 항원 결정 부위(epitope)(RSEVAGFAGEEQLGQA, 서열 번호:62)에 접종하여 생산되고, E. 콜리에서 과발현된 재조합형 mMDH 단백질을 사용하여 시험된, 다중클론성 안티-mMDH 항체를 식물 유래 단백질의 검출에 사용하였다. 유전자이식 및 대조 식물로부터 수득한 잎 샘플에서 mMDH이 검출되었다. 10 분 동안 90 ℃에서 DTT를 함유한 누페이지®(NUPAGE®) LDS 샘플 완충제(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)에 배양되고, MES 러닝 완충제(인비트로겐)을 갖는 아크릴아미드 프리캐스트 겔에서 전기영동적으로 분리된 mMDH 단백질 표준으로 유전자이식 및 대조 식물로부터의 식물 추출물을 분석하였다. 이어서 단백질이 인비트로겐 제작자의 프로토콜을 사용하여 니트로셀룰로오스막 위에 전기전달되었다. 수퍼블록® 블로킹 믹스(Superblock®Blocking Mix)(인비트로겐)로 차단하고 0.1 % PBST로 세척한 후, 안티-mMDH 항혈청 이후의 염소 항-토끼 포스파타아제로 mMDH 단백질을 검출하였다. 검출된 단백질을 동일한 부피로 혼합된 수퍼시그날 웨스트 피코 루미놀 인핸서™(SuperSignal West Pico Luminol Enhancer™) 및 스테이블 퍼옥시드 솔루션™(Stable Peroxide Solution™)(일리노이주 록퍼드 소재의 피어스(Pierce))을 사용하여 화학발광을 통해 가시화하였다.
존재를 검출하고 mMDH 단백질의 분자량을 측정하기 위해 F2 돌연변이체 식물 계통에서 웨스턴 블롯 분석을 완료하였다. 전체 길이 mMDH 단백질은 삽입-결실 돌연변이가 부족한 F2 대조 식물, 및 삽입-결실 돌연변이에 이형접합성인 F2 식물에서 검출될 수 있다. 그러나, mMDH 오픈 리딩 프레임을 방해하는 삽입-결실 돌연변이에 동형접합성인 F2 식물에서는 mMDH 단백질에 대한 어떤 신호도 검출되지 않았다. 동형접합성 삽입-결실을 함유한 F2 식물은 절단형(truncated) mMDH 단백질 서열을 생산하였다. 조기 종결 코돈을 도입하거나 또는 mMDH 단백질을 단축함으로써 mMDH 단백질 서열을 절단하였다. 절단형 mMDH 단백질은 저분자량의 밴드로서 웨스턴 블롯에 존재할 것이 예상되었다. 그러나, 어떠한 작은 밴드도 검출되지 않았다. 이러한 결과는 절단형 단백질이 세포에서 분해되었음을 시사한다. 보존된 NAD 결합 도메인 내에 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 결실 또는 교체(즉, mMDH 단백질이 절단되지 않음)를 초래하는 동형접합성 삽입-결실 돌연변이를 함유한, F2 돌연변이체 식물, 107832_8-3 및 107832_9-6이 웨스턴 블롯 분석을 통해 나타나는 바와 같이 전체 길이 mMDH 단백질을 생산하였다.
F2 식물에서 mMDH 활성을 측정하기 위한 생물화학적 분석을 완료하였다. mMDH 단백질은 말산염 및 NAD+의 옥살로아세테이트 및 NADH로의 전환 또는 그 반대를 촉매한다. 전환된 NADH는 O.D. 340 nm에서 최대 흡광도를 보이는 반면, 이러한 파장에서 NAD+는 무시가능한 흡광도를 가진다. 그러므로, 샘플의 mMDH 활성은 옥살로아세테이트의 존재하에서 NADH의 NAD+로의 전환률을 따라 측정될 수 있다. 개별 F2 식물의 어린 잎에서 약 2 cm 직경의 다섯 개의 잎 펀치를 취하였고, 4 ℃에서 추출물 완충제(10mM 디티오트레이톨, 20 mM MgCl2 및 2mM EDTA을 함유한 50 mM 이미다졸-HCl 완충제)로 찧었다(crush in). 잎 추출물을 10,000 g에서 20 분 동안 냉장된 원심분리기에서 원심분리하고; 상청액을 디켄팅하고 효소 제제가 분석에서 활용될 때까지 얼음에 배치하였다. 분석을 위해 1.5 ml의 분석 완충제(50 mM 트리스-HCl pH8.0, 1 mM EDTA)을 피펫을 사용해 튜브로 옮기고, 100 μl의 효소 추출물을 첨가하고 37 ℃의 수조에서 5 분 동안 배양하였다. 혼합제(cocktail)를 석영 큐벳에 따르고 50 μl의 NADH를 첨가하고(트리스-HCl 내 6 mM NADH, pH 8.0) 340 nm으로 설정된 분광광도계에 배치하였다. 초기 판독값 및 다음의 흡광도 감소는 15 초 내지 최대 3 분 간격으로 기록되었고, 이러한 판독값은 대조군으로 제공된다. 다음으로, 50 μl의 옥살로아세테이트를 첨가하고(0.3 M 옥살로아세테이트를 증류수에서 새로 제조함) 3 분 동안 흡광도를 기록하였다. 프레임 및 무의미한(null) 삽입-결실 돌연변이 둘 다에 대해 분리한 F2 계통에서 mMDH 활성은 도 8에 나타난다.
삽입-결실 돌연변이(-3bps)에 대해 분리된 계통 107832_9-6에서 유래된 F2 식물은 웨스턴 블롯에서 전체 길이 mMDH 단백질을 생산하였다. 생화학적 분석에서, mMDH 활성은 시험된 모든 식물에서와 유사하였다. 생화학적 분석의 결과는 시험된 모든 식물과 동일한 추세를 따랐다. 시험된 식물은 단일 아미노산을 결핍한 mMDH 단백질을 생산하고, 삽입-결실 돌연변이를 함유한 무의미한, 이형접합성, 동형접학성 식물을 포함한다. 따라서, 아미노산의 손실은 생화학적 분석에서 mMDH 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 그럼에도 불구하고, 생화학적 분석이 mMDH 활성의 적당한 감소를 검출하기에 충분히 민감하지 않을 수 있으므로, 생화학적 효능은 여전히 다소 타협될 것이다. 계통 107832_10-2에서 유래되고 삽입-결실 돌연변이(-2bps)에 대해 분리된 F2 식물을 또한 생화학적 분석을 사용하여 시험하였다. 이러한 삽입-결실 돌연변이에 대해 무의미한 및 이형접합성인 식물은 유사한 수준의 mMDH 활성을 초래하였다. 삽입-결실 돌연변이에 동형접합성인 식물은 상당히 감소된 mMDH 활성을 나타냈다. mMDH 단백질에 대한 웨스턴 블롯은 이러한 식물에서 검출되지 않았다.
실시예 9: 토마토 열매 수확량의 mMDH 유전자자리에서의 돌연변이의 효과
토마토 열매 수확량에서 이전에 설명된 돌연변이의 효과를 확인하기 위해, 제1 토마토 트러스의 모든 열매를 수확하고 토마토의 수 및 각 토마토의 생중량을 문헌[Centeno et al. (2011) Plant Cell 23:162-184]에 설명된 방법을 사용하여 확인하였다.
삽입-결실 돌연변이 107832_9-6 (-3 bps)에서 유래된 F2 식물에서, 수득된 각 토마토의 평균 생중량 및 돌연변이 식물(이형접합 또는 동형접합)의 제1 트러스에서 수확된 모든 토마토의 총 생중량을 측정하였다. 동형접합성 107832_9-6 토마토 식물에서 수득된 토마토의 생중량이 대조군 식물에서 수득된 토마토(돌연변이 함유하지 않음)의 생중량보다 더 많았다(도 9 참조). 107832_9-6 토마토 식물의 mMDH 유전자자리에서 생산된 돌연변이는 열매 수확량을 증가시키는 감소된 단백질 활성을 초래한다. 대조적으로, mMDH 오픈 리딩 프레임의 방해를 유발하는 임의의 삽입-결실 돌연변이에 이형접합성인 토마토 식물은 감소된 성장 및 보다 낮은 총 열매 수확량을 나타낸다. 따라서, 삽입-결실 돌연변이에 동형접합성인 식물에서 관찰된 mMDH 활성의 감소는 총 토마토 열매 수확량의 증가를 초래한다.
실시예 10: 효소 비율 및 활성에 미치는 mMDH 유전자자리에서 돌연변이의 효과
이전에 설명된 ZFN 절단에서 유래된 토마토 게놈의 mMDH 효소에 대한 돌연변이는 토마토(서열 번호:1), 대두(서열 번호:125), 및 콘(서열 번호:126)으로부터 본래의 mMDH 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열에 도입된다.
이러한 효소의 본래 버전의 정렬은 도 10에 나타나며, 높은 수준의 서열 유사성과 전환된 단백질 모티프를 공유하는 상이한 식물 종으로부터 mMDH 효소를 도시한다. ZFN 절단으로부터 토마토 mMDH 효소를 초래하는 돌연변이가 도 11에 도시되며, 이러한 펩티드 서열은 표 4에 나타낸 절단된 DNA 서열에 대응된다.
mMDH 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 도처에 포함된 신규한 돌연변이가 본 명세서의 실시태양으로 추가로 포함된다. 제1 및 제2 NADH 결합 자리 둘 다는 대다수의 도입된 돌연변이를 포함한다. 야생형(본래) 서열에 대해 번호를 매긴, 하나 이상의 아미노산의 예시적인 돌연변이(예컨대, 결실 및/또는 삽입)는 하나 이상의 서열 번호:1(V, V, I, I, P, A, G,V, P, R, K, P, G, M, T, R, D, D, L, F, N, I, N, A, G, I, V, K, S, L, C,T, A)에 나타낸 토마토 MDH 서열에 대해 번호 붙이고 정렬된 아미노산 잔기 104-136 및/또는 서열 번호:1 (D, E, K, K, L, F, G, V, T, M, L, D, V, V, R, A, K, T, F, Y, A, G, K, A, K, V, N, V, A, E, V, N, L, P, V, V, G, G, H, A, G, I, T, I, L, P, L, F, S, Q)에 나타난 토마토 MDH 서열에 대해 번호 붙인 아미노산 잔기 171-220에서의 돌연변이; 서열 번호:1에 정렬되고 서열 번호:126에 나타낸 콘 MDH 서열에 대해 번호 매긴, 아미노산 잔기 171-220(D, E, K, K, L, F, G, V, T, T, L, D, V, V, R, A, K, T, F, Y, A, G, K, A, N, L, P, V, T, D, V, N, V, P, V, V, G, G, H, A, G, I, T, I, L, P, L, F, S, Q) 및/또는 아미노산 잔기 104-136(V, V, I, I, P, A, G, V, P, R, K, P, G, M, T, R, D, D, L, F, N, I, N, A, G, I, V, K N, L, S, T, A)에서의 하나 이상의 돌연변이; 및 서열 번호:1에 정렬되고 서열 번호:125에 나타낸 대두 MDH 서열에 대해 번호 매긴 하나 이상의 아미노산 잔기 104-136 (V, V, I, I, P, A, G, V, P, R, K, P, G, M, T, R, D, D, L, F, N, I, N, A, G, I, V, E, T, L, C,T, A) 및/또는 아미노산 잔기 171-220 (D, E, K, R, L, F, G, V, T, T, L, D, V, V, R, A, K, T, F, Y, A, G, K, A, N, V, P, V, A, G, V, N, V, P, V, V, G, G, H, A, G, I, T, I, L, P, L, F, S, Q)에서의 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
MDH에서 이러한 돌연변이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음에 나타난다(서열 번호:132-137 및 서열 번호:124):
Figure 112014115149583-pct00008
Figure 112014115149583-pct00009
Figure 112014115149583-pct00010
Figure 112014115149583-pct00011
Figure 112014115149583-pct00012
Figure 112014115149583-pct00013
Figure 112014115149583-pct00014
돌연변이체 mMDH 오픈 리딩 프레임을 함유하는 플라스미드의 구축물
6x His tag와 융합된 토마토 mMDH ORF를 함유한 플라스미드 pKG7495를 HindIII 및 XhoI 제한 효소로 소화하고, 퀴아젠 겔 아이솔레이션 키트™(QIAGEN GEL ISOLATION KIT™)(캘리포니아주 칼스배드 소재의 퀴아젠)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 5.8 kbps 벡터 밴드를 분리하였다. 토마토 mMDH 서열의 일부를 HindIII / XhoI 자리에 인접하게 합성하였다(진아트(GeneArt)). 이러한 서열은 제2 NADH 결합 도메인에서 3 bp 서열(뉴클레오티드 543 내지 545 결실됨; 서열 번호:136)을 결실하며, 이러한 유전자 위치에서 ZFN 절단에 의해 토마토 식물에 생산된 돌연변이에 상응한다. 제2 토마토 mMDH 돌연변이를 제1 NADH 결합 도메인에서 3 bps(뉴클레오티드 353 내지 355; 서열 번호:124)을 결실한 HindIII/XhoI 단편 상에 합성하였다. 모든 단편을 pKG7495 벡터에 결찰하고, 시퀀싱으로 클론을 확인하였다. 이러한 구축물은 E.콜리의 이형접합성 생산 시스템에서 과발현된 NADH 결합 도메인 둘 다의 인-프레임 결실을 갖는 일련의 토마토 돌연변이체 mMDH 클론을 초래한다.
미토콘드리아 말산 탈수소효소( mMDH )의 과발현 및 정제
야생형 및 돌연변이 mMDH 구축물을 E. 콜리 발현 벡터에 클로닝하였다. 벡터 DNA는 원샷®BL21(DE3) 화학적 수용성 세포(인비트로겐)로 트랜스펙션되었다. 표적 유전자를 클로닝하여, 과발현될 때, 그 결과의 효소가 N-말단 헥사히스틴 태그를 함유한다. 군체를 100 μg/mL 카르베네실린을 함유한 LB 플레이트에 37 ℃로 밤새 성장시켰다. 단일 군체를 사용하여 동일한 배지의 50 mL의 LB 종자 배양물을 배양하였다. 배양물을 37 ℃에서 밤새 성장시켰고, 이후에 100 100 μg/mL 카르베네실린을 함유한 1.2 L의 LB를 접종하는데 사용하였다. 야생형 mMDH 효소의 경우, 배양물이 0.6의 OD600에서 1 mM IPTG에 유도되였다. 15분 동안 8,000 rpm에서의 원심분리를 통해 세포가 수확되는 4 시간 동안 37 ℃에서 유도가 진행되었다. 모든 변형물은 10 분 동안 얼음 욕조에 배치한 다음 저온(19 ℃)에서 18 시간 동안 200 μM의 IPTG에 유도되었다.
세포 펠릿을 15-20 mL 완충제 A(50 mM 트리스-HCl pH 8.2, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 및 5 % 글리세롤)에 재현탁하였다. 가용성 프로테아제 억제제(로슈 컴플리트 미니 테블렛) 및 리소자임(1 mg/mL)을 추가하였다. 용액을 20 분 동안 4 ℃에서 교반하였고, 얼음 위에서 4 ×1 분 파열로 초음파 처리하였다. 완충제 A에서 평형인 1 mL 히스 트랩(His Trap) FF 컬럼이 조 용해물(crude lysate)에 적용되는 시간으로 원심분리(45 분 동안 16,500 rpm)하여 세포 파괴물을 제거하였다. 20 컬럼 부피가 넘는 0-100% 완충제 B(50 mM 트리스-HCl pH 8.2, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 및 5 % 글리세롤)의 선형 구배를 사용하여 단백질 표적을 녹여서 분리하였다. mMDH를 함유하는 일부는 SDS-PAGE 분석 및 활성 분석으로 확인하였다. 양성 부획물들을 함께 모으고, 10 kDa 분자량 컷오프 막을 구비한 아미콘 울트라필트레이션(Amicon Ultrafiltration) 장치로 농축하였다. 농축된 분획물을 PD10 겔 여과를 사용하여 이미다졸이 부족한 완충제 A로 교환하였다. 단백질 농도는 익스파시 바이오인포메틱스 리소스 포탈 프로트파람(Expasy Bioinformatics Resource Portal ProtParam) 도구를 사용하여 계산된 이론적 몰 흡광 계수로 확인하였다. 탈염된 효소를 액체 질소에 플래시 냉동하고 추가 사용시까지 -80 ℃에 저장하였다. SDS-PAGE 분석은 정제된 단백질의 분자량이 ~37 kDa의 그들의 계산된 중량에 상응한다는 것을 입증하였다.
야생형 및 돌연변이 mMDH 의 비 활성
35 ℃의 마이크로플레이트 판독기에서 효소 검사를 수행하였고, 200 μL의 최종 부피에 100 mM 트리스-HCl pH 8.2, 400 μM NADH, 0.0075-0.045 μM mMDH 또는 mMDH이 함유되었다. 3 mM의 최종 농도로의 옥살로아세테이트의 첨가에 의한 개시 이전에 반응물을 1 분 동안 35 ℃에서 배양하였다. 초기 속도는 NADH 산화(340 nm)에 대해 분광학적으로 모니터링하여 확인하였다. 속도는 몰 흡광 계수 6220 M-1 cm-1를 사용하여 mOD/분에서 μM 분-1으로 전환되었다. 효소 검사의 결과는 도 13 및 표 5에 묘사된다.
나타낸 바와 같이, 야생형 및 두 개의 돌연변이 토마토 mMDH 효소의 비 활성을 NADH 산화의 분광학적으로 모니터링으로 측정하였다. 서열 번호:124(표 5 및 도 13에서 "mMDH del3 NADH BS1"로 표지됨)에 암호화된 제1 NADH 결합 서열의 돌연변이는 상당히 줄었고 약 1.5 %의 야생형 효소의 활성을 생산한다. 비교해보면, 서열 번호:136 (표 5 및 도 13에서 "mMDH del 3"로 표지됨)에 암호화된 제2 NADH 결합 서열의 돌연변이는 약 23 %의 야생형 효소의 활성을 보유한다. mMDH 효소에서 NADH 결합 자리 내에 도입된 돌연변이는 감소된 효소 활성을 초래하며, 그 결과 mMDH 효소 내에 이러한 돌연변이를 함유한 토마토 식물은 보다 큰 양의 생중량을 갖는 열매를 생산한다.
[표 5] " mMDH del3 " 및 " mMDH del3 NADH BS1 "로 설명된 돌연변이된 mMDH 효소에서 완료된 효소 동역학적 분석. 돌연변이는 야생형 mMDH " WT mMDH "와 비교하 여 더 낮은 효소 활성을 갖는 효소를 초래한다.
Figure 112014115149583-pct00015
mMDH 효소 내에 부가적인 돌연변이의 포함
미토콘드리아 말산 탈수소효소( mMDH )의 과발현 및 이형접합성 발현을 위한 벡터의 구축
토마토, 대두 및 콘의 본래 및 돌연변이 mMDH 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이 벡터 내로 도입되며 이형접합성 발현을 위해 미생물 유기체 내로 형질전환된다. 돌연변이 mMDH 오픈 리딩 프레임을 함유한 플라스미드의 구축물은 6x His tag 및 분리에 사용되는 기타 서열에 융합될 수 있다. mMDH 폴리뉴클레오티드 서열의 단편이 합성된다. 단편은 제한 효소 자리에 인접하며 mMDH 오픈 리딩 프레임을 함유한 플라스미드로 용이하게 클로닝될 수 있다. 단편은 제1 및 제2 NADH 결합 도메인 도처에서 약 3 bps, 4 bps, 5 bps, 6 bps, 7 bps, 8 bps, 또는 9 bps의 돌연변이를 포함하도록 설계된다. mMDH 오픈 리딩 프레임의 제2 NADH 결합 도메인 내로 도입되는 이들 다양한 돌연변이 외에, 토마토 식물에서 생산된 돌연변이가 토마토, 대두 및 콘의 mMDH 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 내로 도입된다. 그 결과, NADH 결합 도메인 둘 다에서 인-프레임 결실을 포함하는 일련의 돌연변이된 mMDH 암호화 서열이 토마토, 대두 및 콘에서 분리된 효소의 경우 생산된다.
미토콘드리아 말산 탈수소효소( mMDH )의 과발현 및 정제
토마토, 대두 및 콘의 암호화 서열 내에 도입된 다양한 돌연변이를 함유한 플라스미드가 화학적으로 수용성인 에스체리키아 콜리 세포로 형질전환된다. 형질전환된 박테리아 군체가 성장한다. 단일 군체를 사용하여 종자 배양물을 배양한다. 배양물이 성장하며 이후에 배양물 배지로 사용된다. 배양이 유도되고 배양물의 성장을 분광광도계를 사용하여 모니터링한다. 세포를 수확할 때까지 일정 기간의 시간 동안 유도를 진행한다.
배양물을 원심분리하고 그 결과의 세포 펠릿을 세포 용해 완충제(lysis buffer)에 재현탁한다. 재현탁된 세포 용액을 초음파처리하거나 당업자에게 공지된 다른 방법으로 세포 용해한다. 세포 파괴물을 원심분리로 제거한다. 단백질을 녹여서 분리한다. mMDH를 함유한 분획물을 SDS-PAGE 분석 및 활성 검사로 확인한다. 양성 분획물을 함께 모으고 농축한다. 농축된 부분을 탈염한다. 단백질 농도는 익스파시 바이오인포메틱스 리소스 포탈 프로트파람 도구를 사용하여 계산된 예상되는 몰 흡광 계수를 사용하여 확인한다. 탈염된 효소는 액체 질소로 플래시냉동될 수 있으며 추가 사용시까지 또는 검사 즉시 -80 ℃에 저장된다.
야생형 및 돌연변이 mMDH 활성의 평가
완충제, NADH 및 정제된 mMDH 효소(필요하다면 추가 시약도 포함됨)를 포함하는 최종 혼합체에서 효소 검사를 수행한다. 옥살로아세테이트(0-50 mM)의 첨가로 반응을 개시한다. 초기 효소 비율은 340 nm에서의 감소(NADH 산화)를 분광학적으로 모니터링하여 확인한다. mMDH 효소 내로 도입된 다양한 돌연변이에 대한 비율은 몰 흡광 계수 6220 M-1 cm-1을 사용하여 μM 분-1으로 전환함으로써 확인한다. 돌연변이의 포함에서 효소로의 교체는 mMDH 효소의 변형된 기질 특이성을 초래한다. mMDH 효소는 도 12에 나타낸 생화학 반응을 촉매하며, 여기서 mMDH 효소는 NAD+의 NADH로의 환원을 사용하여 말산염의 옥살로아세테이트로의 산화를 가역적으로 촉매한다. 시험된 다양한 mMDH 효소 중에서, 가장 유리한 전체 동역학적 변수(k cat /Km 값)를 생성하는 돌연변이가 확인된다. 이러한 돌연변이는 감소된 활성을 갖는 mMDH 효소를 초래하며, 그 결과 이러한 mMDH 효소에 대한 돌연변이를 함유한 식물이 보다 큰 생중량을 갖는 종자 및 열매를 생산한다.
본 명세서에 언급되는 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
이해의 명확성의 목적을 위해 일부 상술에서 예시 및 예로서 개시가 제공되지만, 본 명세서의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 앞서 언급한 설명 및 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC <120> TARGETED MODIFICATION OF MALATE DEHYDROGENASE <130> 8326-4008.40 <140> PCT/US2013/039309 <141> 2013-05-02 <150> 61/780,512 <151> 2013-03-13 <150> 61/641,776 <151> 2012-05-02 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 346 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <220> <221> MOD_RES <222> (256)..(256) <223> Any amino acid <400> 1 Met Arg Thr Ser Met Leu Lys Ser Ile Val Arg Arg Ser Ser Thr Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ser Tyr Val Ser Arg Arg Gly Phe Ala Ser Gly Ser Ala Pro 20 25 30 Glu Arg Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Pro 35 40 45 Leu Ser Leu Leu Met Lys Leu Asn Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Leu 50 55 60 Tyr Asp Ile Ala Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Asp Val Ser His Ile 65 70 75 80 Asn Thr Arg Ser Glu Val Ala Gly Phe Ala Gly Glu Glu Gln Leu Gly 85 90 95 Gln Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Ile Ile Pro Ala Gly Val Pro 100 105 110 Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Ala Gly 115 120 125 Ile Val Lys Ser Leu Cys Thr Ala Ile Ala Lys Tyr Cys Pro Asn Ala 130 135 140 Leu Val Asn Met Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Thr Val Pro Ile Ala 145 150 155 160 Ala Glu Val Phe Lys Lys Ala Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Lys Leu Phe 165 170 175 Gly Val Thr Met Leu Asp Val Val Arg Ala Lys Thr Phe Tyr Ala Gly 180 185 190 Lys Ala Lys Val Asn Val Ala Glu Val Asn Leu Pro Val Val Gly Gly 195 200 205 His Ala Gly Ile Thr Ile Leu Pro Leu Phe Ser Gln Ala Thr Pro Lys 210 215 220 Ala Asn Leu Ser Tyr Glu Glu Ile Val Ala Leu Thr Lys Arg Thr Gln 225 230 235 240 Asp Gly Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Ser Xaa 245 250 255 Thr Leu Ser Ile Ala Tyr Ala Gly Ala Ile Phe Ala Asp Ala Cys Leu 260 265 270 Lys Gly Leu Asn Gly Val Pro Asp Val Val Glu Cys Ala Phe Val Gln 275 280 285 Ser Asn Val Thr Glu Leu Pro Phe Phe Ala Ser Lys Val Arg Leu Gly 290 295 300 Lys Asn Gly Val Glu Glu Val Leu Gly Leu Gly Pro Leu Asn Asp Tyr 305 310 315 320 Glu Lys Gln Gly Leu Glu Ala Leu Lys Pro Glu Leu Leu Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Gly Ile Lys Phe Ala Lys Glu Asn 340 345 <210> 2 <211> 3126 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 2 attttctccg ccgtagcttt taccttttcc tcatttcttt tgtatattcc gaaatgagga 60 cctccatgtt gaaatccatc gtccgccgga gctccactgc cggagcatcc tatgtatctc 120 gccgtggatt cgcatcggga tccgcgccgg agaggaaagt tgcagttttg ggggcagccg 180 gagggattgg acagccttta tctcttctaa tgaagcttaa ccctttagta tccagccttt 240 cactctacga tatcgccggt actcccggtg ttgccgccga tgttagtcac atcaacacca 300 gatctgaggt tgttttctac tctctctctc ccttacgttt tctacttgga attctctgtt 360 tttgttcatt ttgtatgagt attggcgaag attactaatg aggatttgta ttaactaaat 420 tggaactaag acgtatctgg taggttgatt gattctgtta acatgctttt ttgatttcct 480 gaatctcgag ctccgatccg atttacgtta gtcgatttca ctagtgagtt tgagtttgtt 540 gcttgcttca ttccactatt tagtctattt ttcgagtgtg tatcacataa gtacatatag 600 attcgtgaat gagttactaa agtacaaggt tttgtgctga aaactaggtg tttgtcagca 660 atgaagagtt caacaccaga tcattttact ctttgcatca gttgcctgtt ttaatttcaa 720 gatgatttga ttacaatgtt gttttaggcg tccactgtca agtagttaac gatttgaagc 780 ccatctacct tttgtgtcct aaacccctct aaatagtgtt tgtgccagtt tatggttttc 840 tttcctgcaa ttctgatctg taaatatatt tgtggacttt gcaggttgcc ggttttgcag 900 gagaagagca gctagggcag gcactggaag gagctgatgt tgttatcatt cctgctggtg 960 tgccccgaaa gcctggtatg acccgagatg atctgttcaa cattaatgcg ggtattgtta 1020 aatctctatg cacggccatt gctaagtact gccccaatgt gagtatgctt gtgtaattat 1080 ctctgtatat gggggttata tataggagat tctagaaaaa gtttctgatt aattttctca 1140 tttgctgctt gttctgataa cttaaaggct ctggtcaata tgataagcaa cccagtgaat 1200 tccactgtcc ctattgctgc tgaggtgttt aagaaagctg gaacttatga tgaaaagaag 1260 ctctttggag ttaccatgct tgatgtggtt agggccaaga cattttatgc tggaaaagct 1320 aaagtaaatg ttgctggtgc gcgtcttctt gtctaattct ttatttgaat tgattttgtt 1380 tcgctttaca tgaaactgta aattcataca atactatctg tctactttac ttactttttg 1440 cttcgttttt cagaggtcaa tctcccagta gttggtggtc atgctggcat aactatcctc 1500 ccattatttt ctcaagtaat ttttcttttc ttgtcccttg ttataaagct ttttcttttt 1560 ttagtatcta ttattatctt ctttatgttg taagtgtttg attgaacatt ttttagtatg 1620 tattatctaa attgttattg gtgatttcca tattgtggca tattgagtct tgtttttatc 1680 actaaatttt ggatacaggc cactccaaag gcaaatctat cagatgagga aattgttgca 1740 ctcacaaagc gaacccaaga tggtgggaca gaagttgtag aggccaaggc tggaaagggt 1800 tcagccaccc tctcaatggc gtacgtttcc acttcaatgt ttttcttgat ttattttttt 1860 ttcctgaagg attttcactt tgattgcaag attttgttta cgaataagtt atggtgctgc 1920 ccaatgtcac ggtcaaatat ttaggaatgt agagaaacaa acaaaaaaag aaactttttt 1980 gacatatact gccccaaacc acttcattta ctggcctttc ctgtttgcat actcggttct 2040 aagcagttag ttttacttgt gcagctatgc tggggctatt tttgccgatg cttgcttgaa 2100 ggggttgaat ggagttcccg atgttgttga atgtgctttt gtgcagtcca atgtcaccga 2160 gcttcccttc ttcgcatcca aggtaataag ccttttcttt tcctacaaag acactggacg 2220 tcatgtatac ttttttcttt gaactgtctg attcatttgg tcattgccct cttatcatgt 2280 gggtatgaaa aggtcaaaac aaattatata gttcaagttt aggtttgttt aagcatgtct 2340 gaagctgtgt ctattctgga tgtgttgagg gatagttttg acatcatgag tcatcgattg 2400 atcttgatta agcatgtctc atgtggaatg gttggtagct tttcaacagt gcaagtcgaa 2460 tgtgtcaaga actaagttga catcctaggt tattatttgt tgttagtcac acacgcatct 2520 gaacgtaaat agctcgttaa ctttgaatca tgggctaaat ttgtacttcc tcttatcaac 2580 tgacttgtgg gtaattcact gtataaggtc actattttca ttttgcttac ttatacatgt 2640 cattcaattt gatcgctttg caggtaagac ttgggaaaaa tggagtggag gaagtcctag 2700 ggttgggtcc acttaacgac tacgagaagc aaggacttga ggctcttaag ccagagctgc 2760 tctcctccat tgaaaaggga atcaagtttg ccaaagaaaa ctaaaaaaac aaaattatgg 2820 tctagttttc tatagtgaca gttttggatc tttttgggtc aattgttttt gtatcctttg 2880 caagtttctt gcagccggag gcttagattt agctcttttg atattatacc caacatttct 2940 acaaaataat gtatggcaaa ctgggggcct atcccatttg ccttagtgtg gaggtgttat 3000 tctcacatga atcgttttcc aattatggtt agtagcagac aattgatgca aaatgaagaa 3060 atgttcatga ccaattactg catcgttttg caattcatta accattttct gtcgttatac 3120 ttttga 3126 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 3 agcatcctat gtatctcgcc gtggattcgc atcgggatcc g 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 4 cggatcccga tgcgaatcca cggcgagata cataggatgc t 41 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 5 ctctttggag ttaccatgct tgatgtggtt agggccaag 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 6 cttggcccta accacatcaa gcatggtaac tccaaagag 39 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 7 ttcagaggtc aatctcccag tagttggtgg tcatgctggc ataac 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 8 gttatgccag catgaccacc aactactggg agattgacct ctgaa 45 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 9 gtcaccgagc ttcccttctt cgcatccaag gtaataagcc 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 10 ggcttattac cttggatgcg aagaagggaa gctcggtgac 40 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Glu 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Thr Asn Ser Asn Arg Lys Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Thr Asn Ser Asn Arg Ile Thr 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Arg Arg Glu Asp Leu Ile Thr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Thr Ser Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Arg Ser Asp Tyr Leu Ser Lys 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Ser Ser Val Arg Thr Thr 1 5 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Arg Ser His Leu Ser Asp 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Val 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Asp Asn Ser Thr Arg Ile Lys 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Arg 1 5 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gln Arg Gly Asn Arg Asn Thr 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Asp Ser Ser Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Leu Arg His His Leu Thr Arg 1 5 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Leu Arg Gln Asn Leu Ile Met 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Glu 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Arg Ser Ser Thr Arg Lys Thr 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Asp Arg Ser Ala Leu Ser Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Arg Ser Asp Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Asn Arg Tyr Asp Leu His Lys 1 5 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Leu Arg Phe Ala Arg Asp Ala 1 5 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Arg Ser Asp His Leu Thr Gln 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gln Ala Gly Asn Leu Lys Lys 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Leu Lys Gln His Leu Thr Arg 1 5 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Arg Ser Asp His Leu Ser Gln 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gln Asn Ala His Arg Ile Thr 1 5 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 accacaactc ctaatttatt ttctccg 27 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 aaggctggat actaaagggt 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 taagtactgc cccaatgtga g 21 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ttgggttcgc tttgtgagt 19 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Arg Ser Glu Val Ala Gly Phe Ala Gly Glu Glu Gln Leu Gly Gln Ala 1 5 10 15 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 atactgcccc aaaccact 18 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 actatccctc aacacatcca gaa 23 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 cgtagctttt accttttcct c 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 ataaaggctg tccaatccc 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 caatatgata agcaacccag 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ttagacaaga agacgcgca 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 gcgtcttctt gtctaattc 19 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 cttgagaaaa taatgggagg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 cggttctaag cagttagttt 20 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 tgacgtccag tgtctttgt 19 <210> 73 <211> 41 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 73 agcatcctat gtatctcgcc gtggattcgc atcgggatcc g 41 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 agcatcctat gtatctcgga ttcgcatcgg gatccg 36 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 agcatcctat gtatctcgcg attcgcatcg ggatccg 37 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 agcatcctat gtatctcgcc gattcgcatc gggatccg 38 <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 agcatcctat gtatctcgcc ggattcgcat cgggatccg 39 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 agcatcctat gtatctcgcc gcatcgggat ccg 33 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 agcatcctat gtatctcgat tcgcatcggg atccg 35 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 80 ctctttggag ttaccatgct tgatgtggtt agggccaag 39 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ctctttggag ttaccatgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 ctctttggag ttaccaggtt agggccaag 29 <210> 83 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 ctctttggag ttaccatttg atgtggttag ggccaag 37 <210> 85 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ctctttggag ttacgatgtg gttagggcca ag 32 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ctctttggag ttaccagatg tggttagggc caag 34 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 ctctttggag ttaccattgc ttgatgtggt tagggccaa 39 <210> 88 <211> 45 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 88 ttcagaggtc aatctcccag tagttggtgg tcatgctggc ataac 45 <210> 89 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 ttcagaggtc aatctcccag tggtggtcat gctggcataa c 41 <210> 90 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ttcagaggtc aatcttggtg gtcatgctgg cataac 36 <210> 91 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ttcagaggtc aatctcccag tttggtggtc atgctggcat aac 43 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 ttcagaggtc aatctcccat ggtggtcatg ctggcataac 40 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ttcagaggtc aatctcccag tagtcatgct ggcataac 38 <210> 94 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ttcagaggtc aatctcccag tggtcatgct ggcataac 38 <210> 95 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 ttcagaggtc aatctcccag tagtttggtg gtcatgctgg cataa 45 <210> 96 <211> 38 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 96 caccgagctt cccttcttcg catccaaggt aataagcc 38 <210> 97 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gtcaccgagc ttcccttctt tccaaggtaa taagcc 36 <210> 98 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gtcaccgagc ttcccttctt ccaaggtaat aagcc 35 <210> 99 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 agcatcctat gtatctggat tcgcatcggg atccg 35 <210> 100 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 agcatcctat gtatctcgcc ggattcgcat cgggatccg 39 <210> 101 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 agcatcctat gtatctgtgg attcgcatcg ggatccg 37 <210> 102 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 agcatcctat gtatggattc gcatcgggat ccg 33 <210> 103 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 ctctttggag ttaccatgct cttgatgtgg ttagggccaa g 41 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 ctctttggag ttgatgtggt tagggccaag 30 <210> 105 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 ctctttggag ttaccatgtg gttagggcca ag 32 <210> 106 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 ctctttggag ttaccatgct gtggttaggg ccaag 35 <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 111 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 ctctttggag ttaccatgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 112 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 ctctttggag ttaccatgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 113 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 ctctttggag ttaccttgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 114 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ctctttggag ttaccatgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 115 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 ctctttggag ttaccatctt gatgtggtta gggccaag 38 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ctctttggag ttaccatgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 117 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 ctctttggag ttaccatgcg atgtggttag ggccaag 37 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 ctctttggag ttaccatgct gtggttaggg ccaag 35 <210> 119 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 ctctttggag ttaccttgat gtggttaggg ccaag 35 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 121 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 ctctttggag ttaccattga tgtggttagg gccaag 36 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 caccgagctt ccctt 15 <210> 123 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 caccgagctt cccttcccaa ggtaataagc c 31 <210> 124 <211> 1041 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> modified_base <222> (766)..(766) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 124 atgtcaagga cctccatgtt gaaatccatc gtccgccgga gctccactgc cggagcatcc 60 tatgtatctc gccgtggatt cgcatcggga tccgcgccgg agaggaaagt tgcagttttg 120 ggggcagccg gagggattgg acagccttta tctcttctaa tgaagcttaa ccctttagta 180 tccagccttt cactctacga tatcgccggt actcccggtg ttgccgccga tgttagtcac 240 atcaacacca gatctgaggt tgccggtttt gcaggagaag agcagctagg gcaggcactg 300 gaaggagctg atgttgttat cattcctgct ggtgtgcccc gaaagcctgg tacccgagat 360 gatctgttca acattaatgc gggtattgtt aaatctctat gcacggccat tgctaagtac 420 tgccccaatg ctctggtcaa tatgataagc aacccagtga actccactgt ccctattgct 480 gctgaggtgt ttaagaaagc tggaacttat gatgaaaaga agctctttgg agttaccatg 540 cttgatgtgg ttagggccaa gacattttat gctggaaaag ctaaagtaaa tgttgctgag 600 gtcaatctcc cagtagttgg tggtcatgct ggcataacta tcctcccatt attttctcaa 660 gccactccaa aggcaaatct atcatatgag gaaattgttg cactcacaaa gcgaacccaa 720 gatggtggga cagaagttgt agaagccaaa gctggaaagg gttcanccac cctctcaata 780 gcctatgctg gggctatttt tgccgatgct tgcttgaagg ggttgaatgg agttcccgat 840 gttgttgaat gtgcttttgt gcagtccaat gtcaccgagc ttcccttctt cgcatccaag 900 gtaagacttg ggaaaaatgg agtggaggaa gtcctagggt tgggtccact taacgactac 960 gagaagcaag gacttgaggc tcttaagcca gagctgctct cctccattga aaagggaatc 1020 aagtttgcca aagaaaacta a 1041 <210> 125 <211> 378 <212> PRT <213> Glycine max <400> 125 Met Lys Pro Ser Met Leu Arg Ser Leu His Ser Ala Ala Thr Arg Gly 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Ser Arg Arg Gly Tyr Ala Ser Glu Pro Val Pro Glu 20 25 30 Arg Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu 35 40 45 Ser Leu Leu Met Lys Leu Asn Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr 50 55 60 Asp Ile Ala Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Asp Val Ser His Ile Asn 65 70 75 80 Thr Gly Ser Glu Val Val Gly Tyr Gln Gly Asp Glu Glu Leu Gly Lys 85 90 95 Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Ile Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg 100 105 110 Lys Pro Gly Met Thr Arg Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Ala Gly Ile 115 120 125 Val Glu Thr Leu Cys Thr Ala Ile Ala Lys Tyr Cys Pro His Ala Leu 130 135 140 Val Asn Met Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Thr Val Pro Ile Ala Ala 145 150 155 160 Glu Val Phe Lys Lys Ala Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Arg Leu Phe Gly 165 170 175 Val Thr Thr Leu Asp Val Val Arg Ala Lys Thr Phe Tyr Ala Gly Lys 180 185 190 Ala Asn Val Pro Val Ala Gly Val Asn Val Pro Val Val Gly Gly His 195 200 205 Ala Gly Ile Thr Ile Leu Pro Leu Phe Ser Gln Ala Thr Pro Lys Ala 210 215 220 Asn Leu Asp Asp Asp Val Ile Lys Ala Leu Thr Lys Arg Thr Gln Asp 225 230 235 240 Gly Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Ser Ala Thr 245 250 255 Leu Ser Met Ala Tyr Ala Gly Ala Leu Phe Ala Asp Ala Cys Leu Lys 260 265 270 Gly Leu Asn Gly Val Pro Asp Val Val Glu Cys Ser Phe Val Gln Ser 275 280 285 Thr Val Thr Glu Leu Pro Tyr Phe Ala Ser Lys Val Arg Leu Gly Lys 290 295 300 Asn Gly Val Glu Glu Val Leu Gly Leu Gly Pro Leu Ser Asp Phe Glu 305 310 315 320 Gln Gln Gly Leu Glu Ser Leu Lys Pro Glu Leu Lys Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Gly Ile Lys Phe Ala Asn Gln Leu Asn Met Leu Ser His Thr Cys 340 345 350 Leu Val Gly Cys Cys Tyr Ser Phe Lys Asn Gln Ile Lys Phe Cys Asn 355 360 365 Leu Arg Thr Ile Val Val Leu Leu Pro Ala 370 375 <210> 126 <211> 419 <212> PRT <213> Zea mays <400> 126 Met Arg Pro Ser Leu Met Arg Ser Thr Ser Gln Leu Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Tyr Ser Ser Ala Ser Gly Gln Pro Glu Arg Lys Val Ala Ile Leu 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu Ser Leu Leu Met Lys Leu 35 40 45 Asn Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Asp Ile Ala Gly Thr Pro 50 55 60 Gly Val Ala Ala Asp Val Ser His Ile Asn Ser Pro Ala Leu Val Lys 65 70 75 80 Gly Phe Met Gly Asp Glu Gln Leu Gly Glu Ala Leu Glu Gly Ser Asp 85 90 95 Val Val Ile Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg 100 105 110 Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Ala Gly Ile Val Lys Asn Leu Ser Thr 115 120 125 Ala Ile Ala Lys Tyr Cys Pro Asn Ala Leu Val Asn Met Ile Ser Asn 130 135 140 Pro Val Asn Ser Thr Val Pro Ile Ala Ala Glu Val Phe Lys Lys Ala 145 150 155 160 Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Lys Leu Phe Gly Val Thr Thr Leu Asp Val 165 170 175 Val Arg Ala Lys Thr Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Asn Leu Pro Val Thr 180 185 190 Asp Val Asn Val Pro Val Val Gly Gly His Ala Gly Ile Thr Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Phe Ser Gln Ala Thr Pro Ala Thr Asn Ala Leu Ser Asp Glu 210 215 220 Asp Ile Lys Ala Leu Thr Lys Arg Thr Gln Asp Gly Gly Thr Glu Val 225 230 235 240 Val Glu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Ser Ala Thr Leu Ser Met Ala Tyr 245 250 255 Ala Gly Ala Val Phe Ala Asp Ala Cys Leu Lys Gly Leu Asn Gly Val 260 265 270 Pro Asp Ile Val Glu Cys Ser Phe Val Gln Ser Thr Val Thr Glu Leu 275 280 285 Pro Phe Phe Ala Ser Lys Val Arg Leu Gly Lys Asn Gly Val Glu Glu 290 295 300 Val Leu Gly Leu Gly Glu Leu Ser Asp Phe Glu Lys Glu Gly Leu Glu 305 310 315 320 Lys Leu Lys Ser Glu Leu Lys Ser Ser Ile Glu Lys Gly Ile Lys Phe 325 330 335 Ala Asn Asp Asn Ile Arg Pro Phe Cys Arg Leu Gln Gln Leu Lys Pro 340 345 350 Leu Val Ala Ile Glu Thr Phe Ser Cys Gly Ile Phe Phe His Ser Thr 355 360 365 Leu Phe Cys Pro Phe Leu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Lys Lys Pro 370 375 380 Asp Gly Gln Ser Leu Gln Glu Gly Phe Ile Pro Ala Gly Arg His Ile 385 390 395 400 Thr Tyr Val Lys Phe Cys Thr Glu Pro Val Val Tyr Glu Leu Ser Ala 405 410 415 Ala Phe Tyr <210> 127 <211> 13 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 127 Leu Phe Gly Val Thr Met Leu Asp Val Val Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 128 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Leu Phe Gly Val Thr Ile Asp Val Val Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Leu Phe Gly Val Asp Val Val Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Leu Phe Gly Val Thr Ile Val Val Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Leu Phe Gly Val Thr Ile Asp Val Val Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 132 <211> 1021 <212> DNA <213> Zea mays <400> 132 atgaaggccg tcgctgatga gatccacctc ccagctcctc cgccgccgga gctactcctc 60 cgcatccggg cagcccgagc ggaaggtggc catcctcggg gcggcggggg gcatcgggca 120 gccgctgtcg ctgctcatga agcttaaccc actcgtctcc tccctctcgc tctacgatat 180 cgccggcacc ccaggtgtcg cggccgacgt ctcccacatc aactcccccg ccctggtgaa 240 gggtttcatg ggtgatgagc agcttgggga agcgctagag ggctcggacg tggtgatcat 300 accggccggc gtcccgagga agcccggcat gaccagggac gacctattca atatcaacgc 360 tggcatcgtt aagaacctca gcaccgccat cgccaagtac tgccccaatg cccttgtcaa 420 catgatcagc aaccctgtga actcaactgt accgattgct gctgaggttt tcaagaaggc 480 tgggacatat gatgagaaga agttgtttgg cgtgaccact gatgttgttc gtgctaagac 540 tttctatgct gggaaggcta atttaccagt taccgatgtg aatgtccctg ttgttggtgg 600 tcatgcgggt atcactatcc tgccgttgtt ctcacaggcc acccctgcaa ccaacgcatt 660 gtctgatgaa gacatcaagg ctctcaccaa gaggacacag gatggtggaa ctgaagttgt 720 cgaggcaaag gctgggaagg gctctgcaac cttgtccatg gcgtatgctg gtgctgtttt 780 tgcagatgca tgcttgaagg gtctcaatgg agttccggat attgttgagt gctcttttgt 840 tcaatcaact gtaacagagc ttccattctt tgcatctaag gtaaggcttg ggaagaatgg 900 agttgaggaa gtgcttggat taggtgagct gtcggacttt gagaaagaag ggttggagaa 960 gctcaagagc gagctcaagt cttcgattga gaagggtatc aagtttgcaa atgataacta 1020 g 1021 <210> 133 <211> 1015 <212> DNA <213> Zea mays <400> 133 atgaaggccg tcgctgatga gatccacctc ccagctcctc cgccgccgga gctactcctc 60 cgcatccggg cagcccgagc ggaaggtggc catcctcggg gcggcggggg gcatcgggca 120 gccgctgtcg ctgctcatga agcttaaccc actcgtctcc tccctctcgc tctacgatat 180 cgccggcacc ccaggtgtcg cggccgacgt ctcccacatc aactcccccg ccctggtgaa 240 gggtttcatg ggtgatgagc agcttgggga agcgctagag ggctcggacg tggtgatcat 300 accggccggc gtcccgagga agcccggcat gaccagggac gacctattca atatcaacgc 360 tggcatcgtt aagaacctca gcaccgccat cgccaagtac tgccccaatg cccttgtcaa 420 catgatcagc aaccctgtga actcaactgt accgattgct gctgaggttt tcaagaaggc 480 tgggacatat gatgagaaga agttgtttgg cgtgaccatt gttcgtgcta agactttcta 540 tgctgggaag gctaatttac cagttaccga tgtgaatgtc cctgttgttg gtggtcatgc 600 gggtatcact atcctgccgt tgttctcaca ggccacccct gcaaccaacg cattgtctga 660 tgaagacatc aaggctctca ccaagaggac acaggatggt ggaactgaag ttgtcgaggc 720 aaaggctggg aagggctctg caaccttgtc catggcgtat gctggtgctg tttttgcaga 780 tgcatgcttg aagggtctca atggagttcc ggatattgtt gagtgctctt ttgttcaatc 840 aactgtaaca gagcttccat tctttgcatc taaggtaagg cttgggaaga atggagttga 900 ggaagtgctt ggattaggtg agctgtcgga ctttgagaaa gaagggttgg agaagctcaa 960 gagcgagctc aagtcttcga ttgagaaggg tatcaagttt gcaaatgata actag 1015 <210> 134 <211> 1032 <212> DNA <213> Glycine max <400> 134 atgaagccat cgatgctcag atctcttcac tctgccgcca cccgcggcgc ctcccacctc 60 tcccgccgtg gctacgcctc cgagccggtg ccggagcgca aggtggccgt tctaggtgcc 120 gccggcggga tcgggcaacc cctctccctt ctcatgaagc tcaaccccct cgtttccagc 180 ctctccctct acgatatcgc cggaactccc ggtgtcgccg ccgatgtcag ccacatcaac 240 accggatctg aggtagtggg gtaccaaggt gacgaagagc tcggaaaagc tttggagggt 300 gcagatgttg ttataattcc tgctggtgtg cccagaaagc ctggaatgac tcgtgatgat 360 ctttttaaca tcaatgctgg cattgttgag acactgtgta ctgctattgc taagtactgc 420 cctcatgccc ttgttaacat gataagcaat cctgtgaact ccactgttcc tattgctgct 480 gaagttttca agaaggcagg aacgtatgat gagaagagat tgtttggtgt taccactgat 540 gttgttaggg caaaaacttt ctatgctggg aaagccaatg ttccagttgc tggtgttaat 600 gtacctgttg tgggtggcca tgcaggcatt actattctgc cattattttc tcaagccaca 660 ccaaaagcca atcttgatga tgatgtcatt aaggctctta caaagaggac acaagatgga 720 ggaacagaag ttgtagaagc taaggctgga aagggttctg caactttgtc aatggcctat 780 gctggtgccc tatttgctga tgcttgcctt aagggcctca atggagtccc agatgttgtg 840 gagtgctcat tcgtgcaatc cactgttact gaacttccct actttgcttc caaggtgagg 900 cttgggaaga atggagtgga ggaagttctg ggcttaggac ctctctcaga ttttgagcaa 960 caaggcctcg aaagccttaa gcctgaactc aaatcatcaa ttgagaaggg aatcaaattt 1020 gccaaccagt aa 1032 <210> 135 <211> 1026 <212> DNA <213> Glycine max <400> 135 atgaagccat cgatgctcag atctcttcac tctgccgcca cccgcggcgc ctcccacctc 60 tcccgccgtg gctacgcctc cgagccggtg ccggagcgca aggtggccgt tctaggtgcc 120 gccggcggga tcgggcaacc cctctccctt ctcatgaagc tcaaccccct cgtttccagc 180 ctctccctct acgatatcgc cggaactccc ggtgtcgccg ccgatgtcag ccacatcaac 240 accggatctg aggtagtggg gtaccaaggt gacgaagagc tcggaaaagc tttggagggt 300 gcagatgttg ttataattcc tgctggtgtg cccagaaagc ctggaatgac tcgtgatgat 360 ctttttaaca tcaatgctgg cattgttgag acactgtgta ctgctattgc taagtactgc 420 cctcatgccc ttgttaacat gataagcaat cctgtgaact ccactgttcc tattgctgct 480 gaagttttca agaaggcagg aacgtatgat gagaagagat tgtttggtgt taccattgtt 540 agggcaaaaa ctttctatgc tgggaaagcc aatgttccag ttgctggtgt taatgtacct 600 gttgtgggtg gccatgcagg cattactatt ctgccattat tttctcaagc cacaccaaaa 660 gccaatcttg atgatgatgt cattaaggct cttacaaaga ggacacaaga tggaggaaca 720 gaagttgtag aagctaaggc tggaaagggt tctgcaactt tgtcaatggc ctatgctggt 780 gccctatttg ctgatgcttg ccttaagggc ctcaatggag tcccagatgt tgtggagtgc 840 tcattcgtgc aatccactgt tactgaactt ccctactttg cttccaaggt gaggcttggg 900 aagaatggag tggaggaagt tctgggctta ggacctctct cagattttga gcaacaaggc 960 ctcgaaagcc ttaagcctga actcaaatca tcaattgaga agggaatcaa atttgccaac 1020 cagtaa 1026 <210> 136 <211> 1041 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 136 atgtcaagga cctccatgtt gaaatccatc gtccgccgga gctccactgc cggagcatcc 60 tatgtatctc gccgtggatt cgcatcggga tccgcgccgg agaggaaagt tgcagttttg 120 ggggcagccg gagggattgg acagccttta tctcttctaa tgaagcttaa ccctttagta 180 tccagccttt cactctacga tatcgccggt actcccggtg ttgccgccga tgttagtcac 240 atcaacacca gatctgaggt tgccggtttt gcaggagaag agcagctagg gcaggcactg 300 gaaggagctg atgttgttat cattcctgct ggtgtgcccc gaaagcctgg tatgacccga 360 gatgatctgt tcaacattaa tgcgggtatt gttaaatctc tatgcacggc cattgctaag 420 tactgcccca atgctctggt caatatgata agcaacccag tgaattccac tgtccctatt 480 gctgctgagg tgtttaagaa agctggaact tatgatgaaa agaagctctt tggagttacc 540 attgatgtgg ttagggccaa gacattttat gctggaaaag ctaaagtaaa tgttgctgag 600 gtcaatctcc cagtagttgg tggtcatgct ggcataacta tcctcccatt attttctcaa 660 gccactccaa aggcaaatct atcatatgag gaaattgttg cactcacaaa gcgaacccaa 720 gatggtggga cagaagttgt agaagccaaa gctggaaagg gttcagccac cctctcaata 780 gcctatgctg gggctatttt tgccgatgct tgcttgaagg ggttgaatgg agttcccgat 840 gttgttgaat gtgcttttgt gcagtccaat gtcaccgagc ttcccttctt cgcatccaag 900 gtaagacttg ggaaaaatgg agtggaggaa gtcctagggt tgggtccact taacgactac 960 gagaagcaag gacttgaggc tcttaagcca gagctgctct cctccattga aaagggaatc 1020 aagtttgcca aagaaaacta a 1041 <210> 137 <211> 1035 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 137 atgtcaagga cctccatgtt gaaatccatc gtccgccgga gctccactgc cggagcatcc 60 tatgtatctc gccgtggatt cgcatcggga tccgcgccgg agaggaaagt tgcagttttg 120 ggggcagccg gagggattgg acagccttta tctcttctaa tgaagcttaa ccctttagta 180 tccagccttt cactctacga tatcgccggt actcccggtg ttgccgccga tgttagtcac 240 atcaacacca gatctgaggt tgccggtttt gcaggagaag agcagctagg gcaggcactg 300 gaaggagctg atgttgttat cattcctgct ggtgtgcccc gaaagcctgg tatgacccga 360 gatgatctgt tcaacattaa tgcgggtatt gttaaatctc tatgcacggc cattgctaag 420 tactgcccca atgctctggt caatatgata agcaacccag tgaattccac tgtccctatt 480 gctgctgagg tgtttaagaa agctggaact tatgatgaaa agaagctctt tggagttacc 540 atggttaggg ccaagacatt ttatgctgga aaagctaaag taaatgttgc tgaggtcaat 600 ctcccagtag ttggtggtca tgctggcata actatcctcc cattattttc tcaagccact 660 ccaaaggcaa atctatcata tgaggaaatt gttgcactca caaagcgaac ccaagatggt 720 gggacagaag ttgtagaagc caaagctgga aagggttcag ccaccctctc aatagcctat 780 gctggggcta tttttgccga tgcttgcttg aaggggttga atggagttcc cgatgttgtt 840 gaatgtgctt ttgtgcagtc caatgtcacc gagcttccct tcttcgcatc caaggtaaga 900 cttgggaaaa atggagtgga ggaagtccta gggttgggtc cacttaacga ctacgagaag 960 caaggacttg aggctcttaa gccagagctg ctctcctcca ttgaaaaggg aatcaagttt 1020 gccaaagaaa actaa 1035 <210> 138 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 138 His His His His His His 1 5

Claims (20)

  1. 발현된 미토콘드리아 말산 탈수소효소(mMDH) 단백질의 활성이 비변형 토마토 식물 세포에 비하여 감소되도록, 서열 번호:3 내지 10 중 어느 하나 내의 표적 서열에 결합하고 서열 번호:3 및 4 내의 또는 그 사이의, 서열 번호:5 및 6 내의 또는 그 사이의, 서열 번호:7 및 8 내의 또는 그 사이의, 또는 서열 번호:9 및 10 내의 또는 그 사이의 mMDH 유전자를 절단하는 뉴클레아제에 의하여 내인성 mMDH 유전자의 서열이 변형되고, 전체 토마토 식물의 부분이 아닌, 토마토 식물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형이 mMDH 유전자의 NADH 결합 도메인에서의 돌연변이를 포함하는 것인 토마토 식물 세포.
  3. 제1항에 있어서, mMDH 유전자에 대한 상기 변형이 식물에서 서열 번호:1의 아미노산 잔기 104-136, 171-220, 또는 양자 모두에 상응하는 아미노산 잔기를 코딩하는 mMDH 서열 내에 있는 것인 토마토 식물 세포.
  4. 제1항에 있어서, mMDH의 두 대립유전자가 변형된 것인 토마토 식물 세포.
  5. 제1항에 있어서, 종자의 부분인 토마토 식물 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 DNA-결합 도메인 및 기능적 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 사용하여 만들어진 것인 토마토 식물 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 아연 핑거 뉴클레아제인 토마토 식물 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아연 핑거 뉴클레아제가 비-정규(non-canonical) 아연 핑거 도메인을 포함하는 것인 토마토 식물 세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 아연 핑거 뉴클레아제가 핑거 1 내지 핑거 5 또는 핑거 1 내지 핑거 6으로 지시된 5 또는 6 개의 아연 핑거 도메인을 포함하고, 각각의 아연 핑거 도메인이 인식 나선 영역을 포함하고, 상기 아연 핑거 뉴클레아제가 하기 표의 단일 열에 나타내고 지시된 인식 나선 영역을 포함하는 것인 토마토 식물 세포:
    Figure 112019095552022-pct00031
    .
  10. 제6항에 있어서, 상기 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에서 키메라 단백질이 발현될 수 있도록 식물 세포 내로 도입되는 것인 토마토 식물 세포.
  11. mMDH 유전자가 식물 세포 내에서 변형되도록 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제를 토마토 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 토마토 식물 세포를 포함하는 토마토 식물의 생산 방법으로서, 여기서 각각의 아연 핑거 뉴클레아제는 식물 세포 내에서 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함하고, mMDH 단백질 활성이 야생형 활성과 비교하여 감소되도록 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제가 다이머화하고 mMDH를 절단하는 것인 토마토 식물의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 외인성 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 것을 더 포함하며, 외인성 서열이 mMDH 유전자 내에 통합되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 변형이 NADH 결합 도메인에서 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 감소된 mMDH 단백질 활성이 증가된 광합성, 식물 세포 내 시트르산 회로에의 변형, 식물 세포 내 증가된 수준의 말산염, 세포 내 감소된 옥살로아세테이트(OAA) 수준, 또는 증가된 열매 수확량을 초래하는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
KR1020147033395A 2012-05-02 2013-05-02 말산 탈수소효소의 표적화된 변형 KR102091298B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261641776P 2012-05-02 2012-05-02
US61/641,776 2012-05-02
US201361780512P 2013-03-13 2013-03-13
US61/780,512 2013-03-13
PCT/US2013/039309 WO2013166315A1 (en) 2012-05-02 2013-05-02 Targeted modification of malate dehydrogenase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150013211A KR20150013211A (ko) 2015-02-04
KR102091298B1 true KR102091298B1 (ko) 2020-03-19

Family

ID=49514894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147033395A KR102091298B1 (ko) 2012-05-02 2013-05-02 말산 탈수소효소의 표적화된 변형

Country Status (17)

Country Link
US (3) US9523098B2 (ko)
EP (1) EP2844754B1 (ko)
JP (1) JP6352250B2 (ko)
KR (1) KR102091298B1 (ko)
CN (1) CN104428414B (ko)
AU (1) AU2013256240B2 (ko)
BR (1) BR112014027227B1 (ko)
CA (1) CA2872124C (ko)
HK (1) HK1208052A1 (ko)
IL (1) IL235364B (ko)
MX (2) MX344903B (ko)
NZ (1) NZ701060A (ko)
PH (1) PH12014502445B1 (ko)
RU (1) RU2658437C2 (ko)
UA (1) UA115875C2 (ko)
WO (1) WO2013166315A1 (ko)
ZA (1) ZA201407764B (ko)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
MX344903B (es) * 2012-05-02 2017-01-11 Dow Agrosciences Llc Modificación dirigida de deshidrogenasa de malato.
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
PL3138910T3 (pl) 2012-12-06 2018-01-31 Sigma Aldrich Co Llc Oparta na CRISPR modyfikacja i regulacja genomu
JP2016519652A (ja) 2013-03-14 2016-07-07 カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法
WO2014144592A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The General Hospital Corporation Using truncated guide rnas (tru-grnas) to increase specificity for rna-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
BR112017000621B1 (pt) * 2014-07-11 2024-03-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc Método para melhorar um traço agronômico de uma planta de milho ou de soja
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016116032A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences A method for precise modification of plant via transient gene expression
BR112017015988B1 (pt) * 2015-01-27 2024-02-27 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Métodos para a modificação sítio dirigida para um fragmento alvo de um gene alvo em uma planta inteira e para a obtenção de uma planta mutante livre de transgene
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
KR20200078685A (ko) 2015-08-14 2020-07-01 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 디벨롭멘털 바이오롤지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017070633A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3039928A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
WO2019194825A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-10 Plant Sensory System, LLC Non-transgenic plants with mutated glutamate decarboxlases for agronomic benefits
CN108795956B (zh) * 2018-05-04 2021-04-23 华南农业大学 GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2021076782A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 Donald Danforth Plant Science Center Methods and compositions for improving agronomic characteristics of c4 plants
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물
CN114645026B (zh) * 2020-12-17 2023-10-13 中国农业大学 苹果酸脱氢酶mdh及其编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100043096A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Jang Ryol Liu The Method for Enhancement of Photosynthesis and Biomass of Plant by Plastid Transformation of Malate Dehydrogenase
JP2010512745A (ja) * 2006-12-14 2010-04-30 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO1995019431A1 (en) 1994-01-18 1995-07-20 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AR014491A1 (es) 1998-01-29 2001-02-28 Dow Agrosciences Llc Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum.
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
DE69942334D1 (de) 1998-03-02 2010-06-17 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
DE60023936T2 (de) * 1999-12-06 2006-05-24 Sangamo Biosciences Inc., Richmond Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
WO2001053480A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Sangamo Biosciences, Inc. Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US20030044787A1 (en) 2000-05-16 2003-03-06 Joung J. Keith Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7070682B2 (en) 2001-01-16 2006-07-04 Cheng Lee Microfluidic apparatus for performing gel protein extractions and methods for using the apparatus
AU2002241946B2 (en) 2001-01-22 2007-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Modified zinc finger binding proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
EP1421177A4 (en) 2001-08-20 2006-06-07 Scripps Research Inst ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN
CA2474486C (en) * 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US20060058190A1 (en) * 2002-12-20 2006-03-16 Thomas Ehrhardt Malate dehydrogenase as a target for herbicides
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US20070134796A1 (en) 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005014791A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7253273B2 (en) * 2004-04-08 2007-08-07 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
EP2298901B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes
US20080131962A1 (en) 2006-05-25 2008-06-05 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
KR20070060115A (ko) 2004-09-16 2007-06-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법
MX2007013757A (es) 2005-05-05 2008-01-24 Univ Arizona Reagrupacion permitida de secuencia (seer)-met odo de novedad para visualizar secuencias de adn especificas.
EP2650365B1 (en) 2005-10-18 2016-09-14 Precision Biosciences Rationally designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity
RU2008129105A (ru) 2005-12-16 2010-01-27 Киджин Н.В. (Nl) Конститутивные промоторы растений
RU2010101604A (ru) * 2007-07-20 2011-08-27 БАСФ ПЛАНТ САЙЕНС ГмбХ (DE) Растения, имеющие усиленные признаки, связанные с урожайностью, и способ их получения
EP2987861A1 (en) 2007-07-20 2016-02-24 BASF Plant Science GmbH Plants having increased yield-related traits and a method for making the same
CA2700231C (en) 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
SI2205749T1 (sl) * 2007-09-27 2016-09-30 Dow Agrosciences, Llc Konstruirani proteini s cinkovim prstom, usmerjeni v 5-enolpiruvil-šikimat-3-fosfat-sintazne gene
US20090123626A1 (en) 2007-09-28 2009-05-14 J.R. Simplot Company Reduced acrylamide plants and foods
RU2495935C2 (ru) 2007-10-05 2013-10-20 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Способы переноса молекулярных веществ в клетки растений
EP2205752B1 (en) 2007-10-25 2016-08-10 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
DE102007056956B4 (de) 2007-11-27 2009-10-29 Moosbauer, Peter, Dipl.-Ing.(FH) Schaltung zur Regelung der Stromversorgung eines Verbrauchers und Verfahren zum Betrieb einer Schaltung
EP2281050B1 (en) 2008-04-14 2014-04-02 Sangamo BioSciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
EP2297318B1 (en) 2008-05-28 2018-05-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
CN102159722B (zh) 2008-08-22 2014-09-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物
AU2009333863B2 (en) 2008-12-17 2015-02-05 Corteva Agriscience Llc Targeted integration into the Zp15 locus
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US10340778B2 (en) 2009-10-19 2019-07-02 Qm Power, Inc. Parallel magnetic circuit motor
US8592645B2 (en) 2009-10-22 2013-11-26 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
AU2011207769B2 (en) 2010-01-22 2015-05-28 Corteva Agriscience Llc Targeted genomic alteration
JP6137596B2 (ja) 2010-02-08 2017-05-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 遺伝子操作された切断ハーフドメイン
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
MX344903B (es) * 2012-05-02 2017-01-11 Dow Agrosciences Llc Modificación dirigida de deshidrogenasa de malato.
NZ719494A (en) * 2013-11-04 2017-09-29 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100043096A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Jang Ryol Liu The Method for Enhancement of Photosynthesis and Biomass of Plant by Plastid Transformation of Malate Dehydrogenase
JP2010512745A (ja) * 2006-12-14 2010-04-30 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150013211A (ko) 2015-02-04
RU2014148160A (ru) 2016-06-27
HK1208052A1 (en) 2016-02-19
US20130326725A1 (en) 2013-12-05
BR112014027227B1 (pt) 2022-04-19
EP2844754A4 (en) 2015-12-30
JP6352250B2 (ja) 2018-07-04
US11085092B2 (en) 2021-08-10
MX2014013296A (es) 2015-06-05
US10358684B2 (en) 2019-07-23
UA115875C2 (uk) 2018-01-10
BR112014027227A2 (pt) 2017-07-18
CA2872124A1 (en) 2013-11-07
US20190327928A1 (en) 2019-10-31
JP2015516159A (ja) 2015-06-11
AU2013256240A1 (en) 2014-11-06
RU2658437C2 (ru) 2018-06-21
IL235364A0 (en) 2014-12-31
PH12014502445A1 (en) 2015-01-12
PH12014502445B1 (en) 2015-01-12
US20170088825A1 (en) 2017-03-30
MX344903B (es) 2017-01-11
NZ701060A (en) 2016-10-28
IL235364B (en) 2021-03-25
MX369788B (es) 2019-11-21
WO2013166315A1 (en) 2013-11-07
AU2013256240B2 (en) 2018-09-20
EP2844754A1 (en) 2015-03-11
CN104428414B (zh) 2022-01-21
ZA201407764B (en) 2016-05-25
EP2844754B1 (en) 2018-10-24
US9523098B2 (en) 2016-12-20
CA2872124C (en) 2022-05-03
CN104428414A (zh) 2015-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11085092B2 (en) Targeted modification of malate dehydrogenase
JP6886433B2 (ja) 植物のゲノム内に外因性配列を組み込むための方法および組成物
JP6442442B2 (ja) ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換え
KR101866578B1 (ko) 표적화된 게놈 교체
JP6127297B2 (ja) Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み
AU2017216446A1 (en) Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right