KR101866578B1 - 표적화된 게놈 교체 - Google Patents

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윌리엄 엠 에인리
마이클 지 머레이
표도르 우르노프
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

예를 들어, 관심의 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 이상의 서열의 세포로 표적화된 통합 및/또는 표적화된 절제를 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다.

Description

표적화된 게놈 교체{TARGETED GENOMIC ALTERATION}
관련출원과의 상호참조
이 출원은 2010년 1월 22일 출원된 미국 가특허출원 제61/336,457호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
정부 지원된 연구 하에서 만들어진 발명에 대한 권리의 언급
적용 없음.
기술 분야
본 명세서는 유전자 조작, 특히 세포 게놈으로 하나 이상의 외인성 서열의 표적화된 통합 및/또는 표적화된 절제(excision) 분야에 속한다.
식품 생산을 위한 증가하는 세계적 요구의 도전을 충족시키기 위한 노력에서 생명공학은 필수적인 도구로 대두되었다. 농업 생산량을 개선시키기 위한 통상적인 접근, 예를 들어 향상된 수확량 또는 유전자 조작된 병해충 저항성(pest resistance)은 돌연변이유발 육종(breeding) 또는 작물 종의 게놈에 형질전환에 의한 신규 유전자의 도입에 의존한다. 두 가지 처리는 모두 본질적으로 비특이적이며 상대적으로 비효율적이다. 예를 들어, 통상적인 식물 형질전환 방법은 무작위 위치에서 게놈에 통합되는 외인성 DNA를 전달한다. 따라서, 바람직한 특질을 가지는 유전자 이식 주(transgenic line)를 확인하고 분리하기 위해서, 수천 개의 독특한 무작위-통합 사건을 발생시킨 다음, 후속해서 원하는 개체에 대해 스크리닝하는 것이 필요하다. 그 결과, 통상적인 식물 형질 유전자 조작은 노동 집약적이고, 시간 소모적이며, 예측 가능하지 않은 일이다. 더 나아가, 이들 통합의 무작위 특성은 의도하지 않은 게놈 파괴로 인한 다면발현(pleiotropic) 효과가 발생하였는지 여부를 예측하는 것을 어렵게 만든다. 그 결과, 유전자 조작된 유전자 또는 형질을 가지는 식물 주의 생성, 분리 및 특징화는 극도로 노동 및 비용 집약적인 처리이며, 성공 가능성은 낮다.
표적화된 유전자 변형은 식물계에서 통상적인 실행에 대한 물류 상의 도전 과제를 극복하므로, 그 자체로도 기본적인 식물 생물학 연구와 농업 생명공학 둘 다에서 오래 지속 되어 온 목표이긴 하지만, 달성하기 힘든 목표가 되었다. 그러나, 벼에서의 양성-음성 약물 선별을 통한 "유전자 표적화" 또는 사전 유전자 조작된 제한자리를 사용하는 경우를 제외하고는, 모델과 작물 둘 다의 모든 식물 종에서 표적화된 게놈 변형은 최근까지 극히 어려운 것으로 입증되었다. 문헌[Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93].
포유류 세포에서, 안정한 이종이식 및 표적화된 유전자 삽입은 유전자 치료와 세포 유전자 조작 둘 다에서 다수의 잠재적 용도를 가진다. 그러나, 현존하는 전략은 종종 게놈 DNA에 비효율적이고 비특이적인 삽입이다. 게놈 삽입의 자리를 제어하기 위한 무능은 게놈 내에서 위치효과(position effect)에 기인하는 집단을 통해 유전자 이식 발현의 매우 가변적인 수준을 야기할 수 있다. 추가적으로, 이식유전자의 안정한 유전자이식(transgenesis) 및 증폭의 현존하는 방법은 이식유전자의 물리적 상실, 시간에 따른 이식유전자 침묵, 유전자 통합에 의한 삽입 돌연변이 및 내인성 유전자 내부에 또는 인접한 자주적 프로모터, 염색체 이상의 창출 및 재배열된 유전자 산물의 발현(내인성 유전자, 삽입된 이식유전자 또는 둘 다를 포함), 및/또는 벡터 관련 독성의 창출 또는 벡터의 장기간 지속성을 위한 필요에 기인하여 영구적으로 발현된 벡터 유래 유전자로부터 생체 내 면역원성을 초래하여, 안정한 이식유전자 발현을 제공한다.
최근에, 게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 방법 및 조성물이 설명되었다. 이러한 표적화된 절단 사건을 사용하여, 예를 들어 표적화된 돌연변이유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하며, 사전 결정된 염색체 유전자 자리(locus)에서의 표적화된 재조합을 촉진할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 모든 목적을 위하여 전문이 참조로 포함된, 미국 특허 공개공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 및 제20060188987호 및 국제 공보 WO 2007/014275를 참조할 수 있다. 미국 특허 공개공보 제20080182332호에는 식물 게놈을 표적화된 변형을 위한 비정규 아연 핑거 뉴클레아제(non-canonical zinc finger nucleases: ZFN)의 용도가 설명되어 있으며, 미국 특허 공개 제20090205083호는 식물 EPSPS 유전자 자리의 ZFN-매개 표적화된 통합이 설명되어 있다. 추가로, 문헌[Moehle et al . (2007) Proc . Natl . Acad , Sci . USA 104(9): 3055-3060)]는 특정된 유전자 자리에서 표적화된 유전자 첨가를 위해 설계된 ZFN의사용을 설명한다.
그러나, 식물 및 그것의 자손에서 안정하고, 유전성인 유전자 변형을 확립하기 위한 표적화된 통합을 위하며, 유전자 치료 및 세포주 개발 목적을 위한 포유류 세포에 표적 통합을 위한 조성물 및 방법에 대한 필요가 남아있다.
본 명세서는 세포 게놈에 통합된 다중 삽입 자리에 통합된 하나 이상의 외인성 핵산 서열(즉, 단백질 또는 RNA 분자)을 발현시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 세포는 진핵세포, 예를 들어 식물, 효모 또는 포유류 세포일 수 있다.
외인성 핵산 서열의 통합은 세포 게놈에 하나 이상의 뉴클레아제, 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 위한 다중 표적 자리를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 게놈 통합에 의해 촉진된다. 폴리뉴클레오티드(또한 본 명세서에서 다양한 자리로서 언급됨)는 세포 게놈 내에서 특이적이고, 표적화된 이중 가닥 절단을 허용하는데, 이중 가닥 절단은 차례로 상동성 의존적 및 상동성 독립적 메커니즘을 통해 외인성 서열(들)의 통합을 초래한다.
따라서, 한 양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 같은 뉴클레아제에 대해 하나 이상의 표적 자리를 포함하는 다중 삽입 자리로 알려진 핵산 분자가 개시된다. 특정 구체예에서, 표적 자리는 다중 삽입 자리가 통합되는 내인성 게놈에 존재하지 않는다. 다중 삽입 자리는 뉴클레아제에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 표적 자리를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, (표적 자리와 짝지어진) 인접한 표적 자리와 결합하는 2개의 결합하는 DNA-결합 단백질의 절단-하프 도메인(half-domain)의 다이머화가 절단에 필요하다(예를 들어, 뉴클레아제의 쌍, 각 자리에 대해 하나의 결합이 절단에 필요하다). 본 명세서에서 설명되는 임의의 다중 삽입 자리에서, 표적 자리의 각 쌍의 하나의 표적 자리는 동일한 서열을 포함할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 도 1을 참조할 수 있다. 어떤 구체예에서, 적어도 한 쌍의 표적 자리는 동일하다. 다른 구체예에서, 적어도 한 쌍의 표적 자리는 상이한 표적(예를 들어 상이한 유전자 및/또는 상이한 유기체로부터의 유전자)으로부터 개개의 표적 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 짝지어진 표적 자리 중 적어도 하나는 서열 번호: 1-20으로 이루어진 군으로부터 선별된 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 다중 삽입 자리는 하나 이상의 서열, 예를 들어 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyl transferase: PAT) 암호화 서열, 또는 포유류 세포와 함께 사용을 위한 스크리닝 마커를 포함하는 식물 전사 단위(plant transcription unit: PTU)를 포함할 수 있다.
다중 삽입 자리는 세포(예를 들어 식물 또는 포유류 세포)의 게놈에 통합되어 뉴클레아제(예를 들어, ZFN)에 대한 게놈 표적을 제공한다. 어떤 구체예에서, 표적 자리는 아연 핑거 뉴클레아제 중 하나 이상의 쌍이 결합하고 호모다이머로 절단하도록 위치된다. 다른 구체예에서, 표적 자리는 아연 핑거 뉴클레아제 중 하나 이상의 쌍이 결합하고 헤테로다이머로 절단하도록 위치된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 하나 이상의 삽입 자리 및/또는 다중 삽입 자리에 통합된 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 식물 또는 종자가 본 명세서에 개시된다. 어떤 구체예에서, 다중 삽입 자리 및/또는 외인성 서열(들)은 옥수수(maize) 식물의 배우체에 통합된다.
특정 양태에서, 본 명세서에 설명된 바와 같은 하나 이상의 다중 삽입 자리를 포함하는 변형된 포유류 세포주, 변형된 일차 세포, 변형된 줄기세포 및/또는 유전자이식 동물 및/또는 다중 삽입 자리에 통합된 하나 이상의 외인성 서열이 본 명세서에 제공된다.
다른 양태에서, 본 명세서에서 세포(예를 들어 식물 또는 포유류 세포)의 게놈에 통합된 다중 삽입 자리에 외인성 서열을 통합하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은 (a) 뉴클레아제를 위한 하나 이상의 표적 자리를 포함하는 다중 삽입 자리 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈에 통합시키는 단계; (b) 다중 삽입 자리에서 제1 표적 자리와 결합하는 하나 이상의 뉴클레아제를 제공하고 및/또는 발현시키며, 그것의 표적 자리에 대한 뉴클레아제(들)의 결합이 세포 게놈을 절단하는 단계; 및 (c) 세포를 외인성 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써, 다중 삽입 자리 폴리뉴클레오티드 내에서 세포 게놈에 외인성 서열의 상동성 의존적 통합을 초래하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 세포(예를 들어, 식물 또는 포유류 세포)의 게놈에 다양한 외인성 서열을 통합하기 위한 방법이 본 명세서에서 제공되며, 본 방법은 (a) 뉴클레아제를 위한 하나 이상의 표적 자리를 포함하는 제1 다중 삽입 자리 폴리펩티드를 세포의 게놈에 통합시키되, 제1 다중 삽입 자리 폴리펩티드는 제1 및 제2 뉴클레아제에 대한 표적 자리 옆에 있는 적어도 하나의 제1 유전자를 포함하는 단계; 및 (b) 제3 및 제4 뉴클레아제에 대해 표적 자리 옆에 있는 적어도 하나의 제2 유전자를 포함하는 제2 다중 삽입 자리 폴리뉴클레오티드의 존재에서 세포 내 제1 또는 제2 뉴클레아제를 발현시킴으로써, 세포의 게놈에 제1 및 제2 유전자의 통합을 초래하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 방법은 암호화 서열 및/또는 뉴클레아제 자리를 포함하는 추가적인 외인성 서열을 통합하기 위한 삽입된 다중 삽입 자리에 존재하는 적절한 뉴클레아제의 발현 단계를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다. 뉴클레아제는 헤테로다이머 ZFN일 수 있으며, 보통 하나 이상의 뉴클레아제 사이에 하나의 모노머가 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입을 위한 외인성 DNA 서열은 ZFN 하프(half) 표적 자리를 포함할 수 있으며, 외인성 서열을 통합 시, 신규 ZFN 표적 자리는 공여자 DNA와 결합된 하프 표적 자리, 및 게놈 DNA와 결합된 하프 표적 자리를 포함하여 만들어진다. 이 신규 ZFN 표적 자리는 유사하게 신규 헤테로다이머 ZFN에 대한 표적 자리로 작용할 수 있다.
다른 양태에서, 세포(예를 들어 식물 또는 포유류 세포) 내 하나 이상의 외인성 핵산 서열의 생성물을 발현시키기 위한 방법이 본 명세서에서 제공되며, 본 방법은 외인성 서열이 통합된 핵산 분자 내 세포의 게놈에 통합되고, 외인성 서열은 발현되도록 본 명세서에 설명된 임의의 방법에 따라서 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 통합시키는 단계를 포함한다.
또한 세포의 게놈에 삽입된 하나 이상의 유전자의 결실 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서에 설명된 임의의 방법에 의해 다수의 외인성 서열을 통합시키는 단계 및 하나 이상의 외인성 서열이 게놈으로부터 결실되도록 세포 내에서 적절한 뉴클레아제를 발현시키는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 결실된 외인성 서열은 마커 유전자이다. 어떤 구체예에서, 외인성 서열의 결실 및 게놈 내에서 말단의 후속하는 재결합은 게놈 위치에서 기능 유전자 또는 서열을 만들며, 예를 들어 발현가능한 스크리닝 마커를 만든다.
또 다른 양태에서, 유전적으로 교체된 세포를 제공하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서에서 설명된 임의의 방법에 따라서 제1 세포에서 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 통합시키고 및/또는 절제하여, 제1 세포를 제1의 성적으로 성숙한 유기체로 발생시키고, 유기체를 대립 유전자 자리에서 게놈 교체를 포함하는 제2 유기체와 교배하여 제1 및 제2 유기체의 게놈 변형이 있는 제2 세포를 발생시키는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 유기체(들)는 식물이다. 다른 구체예에서, 유기체(들)는 유전자 이식 동물이다.
본 명세서에서 설명된 임의의 방법에서, 본 방법은 하나 이상의 내인성 유전자 자리에서 표적화된 통합 및/또는 표적화된 불활성화를 포함하는, 다른 방법의 게놈 변형과 조합하여 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질을 포함할 수 있되, 아연 핑거 결합 도메인은 유전자 조작되어 다중 삽입 자리에서 표적 자리에 결합하였다. 더 나아가, 임의의 이런 방법에서, 외인성 핵산 서열은 다중 삽입 자리 내 서열 및/또는 다중 삽입 자리가 통합된 영역 내 내인성 서열인 하나 이상의 서열을 포함한다.
본 명세서에서 설명된 임의의 방법에서, 하나 또는 그 이상의 다중 삽입 자리는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 삽입이 요망되는 내인성 유전자를 표적화하는 ZFN을 사용하여 뉴클레아제(예를 들어, ZFN)를 통해 표적화된 통합에 의해 게놈에 통합될 수 있다. 대안으로 하나 이상의 다중 삽입 자리는 표준 기술을 사용하여 세포의 게놈에 무작위로 통합될 수 있다.
외인성 핵산 서열은 하나 이상의 프로모터와 함께 또는 없이 하나 이상의 기능성 폴리펩티드(예를 들어 cDNA)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있고 및/또는 하나 이상의 RNA 서열을 생산할 수 있는데(예를 들어 하나 이상의 shRNA 발현 카세트를 통해), 이는 유기체에 원하는 특성을 부여한다. 식물에서 이러한 특성은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 제초제 저항성 또는 내성; 곤충 저항성 또는 내성; 질병 저항성 또는 내성(바이러스, 박테리아, 진균, 선충); 가뭄, 열, 냉각, 냉동, 과량의 수분, 염 스트레스에 대한 저항성 또는 내성으로 예시되는 스트레스 내성 및/또는 저항성; 산화적 스트레스; 증가된 수율; 식품 함량 및 구성; 물리적 외관; 웅성불임성(male sterility); 건조; 표준화; 풍부; 전분 양 및 품질; 오일 양 및 품질; 단백질 품질 및 양; 아미노산 조성물 등을 포함한다. 물론 제초제를 부여하는 것, 곤충, 질병(바이러스, 박테리아, 진균, 선충) 또는 가뭄 저항, 웅성 불임성, 건조, 표준화, 풍부; 전분 양 및 품질; 오일 양 및 품질; 수율을 증가시키는 것 또는 영양적 품질과 같은 임의의 설명 중 임의의 2 이상의 외인성 핵산이 요망되는 바와 같이 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 제조제 저항성 단백질(예를 들어 AAD(아릴옥시알카노에이트 다이옥시게나제 유전자) 및/또는 그것의 기능적 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 통합된 서열의 발현은 통합된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 대안으로, 통합된 서열은 프로모터가 없으며, 전사는 다중 삽입 자리 폴리뉴클레오티드의 삽입 영역 내에서 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 다른 구체예에서, 결합 자리의 절단 및 부정확한 보수는 관심의 유전자를 비활성화 또는 활성화시킬 수 있다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드이다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 분자이다.
포유류 세포에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 세포주 구성체에 대해, 예를 들어 항체와 같은 멀티머 폴리펩티드를 발현시키는 세포주의 구성체에 대해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포주는 연구 목적을 위해, 예를 들어 관심 경로의 구성원을 발현시키는 세포주의 구성체에 대해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 1차 세포 또는 줄기 세포는 세포 치료적 목적을 위해 관심의 멀티머 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제 활성을 측정하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 어떤 구체예에서, 본 방법은 (a) 적어도 하나의 아연 핑거 뉴클레아제 및 본 명세서에 설명되는 핵산 분자를 제공하되, 각각의 짝 지어진 표적 자리는 아연 핑거 뉴클레아제가 결합하는 2개의 아연 핑거 뉴클레아제 하프 표적 자리, 및 결합된 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 절단된 절단 자리를 포함하며, 절단 자리는 절반의 표적 자리 사이에 개입된 단계; (b) 아연 핑거 뉴클레아제가 적어도 절단 자리 내에서 짝 지어진 표적 자리를 절단하는 핵산과 아연 핑거 뉴클레아제를 결합하는 단계; (c) 최소한의 절단 자리를 시퀀싱하여 서열 데이터를 만드는 단계; 및 (d) 서열 데이터 내에서 절단 자리 내 염기쌍 결실의 수 및 길이를 아연 핑거 뉴클레아제가 없을 때의 절단 자리 내 염기쌍 결실의 수 및 길이와 비교함으로써, 짝 지어진 표적 자리에서 아연 핑거 뉴클레아제 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 하나 이상의 염기쌍의 결실은 아연 핑거 뉴클레아제(들)의 증가된 활성을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 짝지어진 표적 자리에서 아연 핑거 뉴클레아제 활성을 최적화하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 어떤 구체예에서, 본 방법은 (a) 적어도 하나의 핑거 뉴클레아제 및 본 명세서에서 설명되는 핵산 분자를 제공하되, 각각의 짝 지어진 표적 자리는 아연 핑거 뉴클레아제가 결합하는 2개의 아연 핑거 뉴클레아제 하프 표적 자리, 및 결합된 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 절단된 절단 자리를 포함하며, 절단 자리는 하프 표적 자리 사이에 개입된 단계; (b) 아연 핑거 뉴클레아제가 적어도 절단 자리 내에서 짝 지어진 표적 자리를 절단하도록 핵산과 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제를 결합하는 단계; (c) 절단 자리에서 아연 핑거 뉴클레아제 활성 수준을 결정하는 단계; (d) 절단 자리에서 염기쌍의 수를 다르게 하는 단계; (e) 단계 (b) 내지 (d)를 다수 회 반복하는 단계; 및 (f) 아연 핑거 뉴클레아제 활성의 가장 높은 수준을 제공하는 염기쌍의 수를 포함하는 핵산에 포함을 위한 절단 자리를 선별함으로써, 짝 지어진 표적 자리에서 아연 핑거 뉴클레아제 활성을 최적화하는 단계를 포함한다.
아연 핑거 뉴클레아제와 관련되는 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 제1 및 제2 절단 하프 도메인은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어 FokI 또는 StsI로부터 유래한다. 더 나아가, 본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 적어도 하나의 융합 단백질은 절단 하프 도메인의 이합체 계면의 아미노산 서열에서 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 절단 하프 도메인의 필수 헤테로다이머가 형성된다.
본 명세서에서 설명되는 임의의 방법에서, 식물 세포는 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물 세포를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 식물 세포는 작물 식물, 예를 들어 옥수수이다. 어떤 구체예에서, 세포는 포유류 세포, 예컨대 1차 세포, 세포주 또는 줄기세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 포유류 세포주는 관심의 폴리펩티드의 생성을 위해 사용될 수 있다.
도 1은 본 명세서에서 설명하는 예시적인 다중 삽입 자리를 도시하는 개략도. 도 1은 7개의 ZFN 표적 자리로 구성되는 다중 삽입 자리를 보여준다. 표적 자리에 결합하는 ZFN 쌍은 기하학적 도면으로 도시된다. "블록 1"은 적절한 ZFN 쌍의 존재에서 다중 삽입 자리에 통합되지만, ZFN 표적 자리를 유지하는 외인성 서열이다(음영 표시되고 체크 무늬 표시된 삼각형). 도 1은 ZFN 표적 자리 대신에 적절한 ZFN 쌍의 존재에서 다중 삽입 자리에 "블록 1"의 통합을 보여준다.
도 2는 "블록 2"가 적절한 ZFN 쌍의 존재하에서 다중 삽입 자리에 통합된 외인성 서열인 도 1에서 나타낸 예시적인 다중 삽입 자리를 도시하는 개략도.
도 3은 ZFN에 의해 향상된 내부 대립유전자 재조합의 개략도. 동일한 게놈 위치에서 2개의 삽입물은, 서로로부터 대신되는 경우를 제외하고, ZFN에 의한 이중 가닥 절단 후 상동성 재조합 또는 가닥 교환을 겪을 수 있다. ZFN 쌍(ZFN 모노머는 둘 다 함께 발현됨)은 둘 다 대립유전자를 함께 포함하는 식물과 함께 ZFN 쌍을 발현시키는 식물을 교배시킴으로써 또는 단일 대립유전자를 함유하는 식물과 양쪽의 교배 자리로부터 2개의 ZFN 모노머를 도입함으로써 제공될 수 있다.
도 4는 헤테로다이머 "왼쪽" 및 "오른쪽" 표적 도메인의 사용을 도시하는 개략도. 상단의 선은 왼쪽 및 오른쪽의 표적 ZFN 도메인을 가지는 게놈을 도시(음영처리된 삼각형 및 체크 무늬 삼각형). 상이한 헤테로다이머 쌍 옆에 있는 유전자를 포함하는 외인성 분자의 존재에 적절한 ZFN 쌍이 첨가될 때, 유전자 및 옆에 있는 뉴클레아제 자리는 제시된 바와 같은 게놈에 삽입된다.
도 5는 게놈적으로 통합된 서열의 측면 중 하나에서 외인성 서열("유전자"로 도시)의 통합 및 절제를 도시하는 개략도. 첨가된 유전자는 적절한 자리에 유전자 카세트를 보내기 위한 상동성 영역 옆에 있다. 삽입을 위해 사용한 ZFN 표적 자리의 2개의 절반은 삽입된 DNA에서 2개의 새로운 조합을 만드는 것에 의해 재조합된다. 유전자 카세트의 절제는 옆에 있는 ZFN 표적 자리에서 절단을 위한 적절한 ZFN 쌍을 결합함으로써 수행된다. 절제는 원하는 DNA 서열의 결실을 방지하기 위해 상동성 암(arm)을 함유하는 주형을 필요로 할 수 있다. 각각의 "유전자"는 하나 이상의 서열, 예를 들어 하나 이상의 암호화 서열을 포함할 수 있다.
도 6은 ZFN 헤테로다이머를 사용하여 삽입된 마커 유전자의 절제 및 "재활용"을 도시하는 개략도(상이한 음영을 가지는 삼각형으로 도시).
도 7은 pDAB105900의 플라스미드 맵.
도 8은 pDAB105908의 플라스미드 맵.
도 9는 아연 핑거 뉴클레아제 호모다이머 발현 카세트의 다이아그램.
도 10은 아연 핑거 뉴클레아제 헤테로다이머 발현 카세트의 다이아그램.
도 11은 절단 후 비 상동성 말단 결합으로부터 초래되는 결실의 빈도에 의해 결정되는 옥수수 내 eZFN 절단 활성을 도시.
도 12는 절단 후 비 상동성 말단 결합으로부터 초래되는 결실의 빈도에 의해 결정된 담배 내 eZFN 절단 활성을 도시.
도 13은 동일한 유전자 자리에 2개의 유전자 이식 삽입물의 개략도. 상단의 선은 유전자 자리에서 상동성 재조합에 필요한 eZFN 결합 자리를 함유하는 다중 삽입 자리를 위한 무작위 서열 표지된 MIS(또한 본 명세서에서 랜딩 패드(landing pad)로 언급됨) 및 카나마이신 선별가능한 마커 유전자 및 GUS 스크리닝 가능한 마커 유전자를 포함하는 블록 1을 도시. 중간의 선은 하이그로마이신 저항 선별가능한 마커 유전자 및 황색 형광성 단백질 스크리닝 가능한 마커 유전자(HPT/YFP)를 포함하는 블록 2와 함께 상단 DNA에서와 같은 동일한 다중 삽입 자리(MIS)를 도시. 바닥의 선은 재조합 후 유전자 자리를 도시.
도 14는 ZFN에 의한 대립유전자 자리의 상동성 재조합 및 도 13에서 설명되는 동일한 유전자 자리에서 2개의 상이한 DNA 삽입의 생성을 도시. 블록 1을 포함하는 구성체(카나마이신 및 GUC 마커, GUS/NPT를 포함), 다중 삽입 자리(MIS 또는 랜딩 패드) 및 블록 2(카나마이신 및 황색 형광성 마커, HPT/YFP를 포함)는 애기장대(Arabidopsis)로 형질전환된다. 별개의 식물에서 다중 삽입 자리와 함께 각 블록을 단독으로 만들기 위해, 블록 2는 단지 블록 1 배치를 만드는 통합된 자리로부터 절제되고 또는 블록 1은 단지 블록 2 배치를 만드는 통합된 자리로부터 절제된다. 유전자 블록의 제거는 각 유전자 블록의 옆에 있는 eZFN 결합 자리에서 절단하는 ZFN을 발현시키는 식물과 함께 본래의 유전자 이식 사건을 함유하는 식물을 교배시킴으로써 수행된다. 회수된 단일 블록 식물은 교배되어 단일 식물 내에서 함께 2개의 배치를 초래하며, 식물은 2개의 블록 1과 블록 2 대립유전자 사이의 DNA 교환에 영향을 미치는 감수분열 특이적 프로모터를 발현시키는 식물과 교배된다.
도 15는 두 서열 사이의 중간 자리에서 ZFN 절단에 의한 동일 유전자 자리에 위치된 2개의 DNA 서열 사이의 재조합을 얻는 단계들을 도시하는 개략적 플로우차트. 도 16에서 설명된 구성체는 애기장대로 형질전환된다. 2개의 유전자 블록 중 하나(도 14에서 설명)는 결합 자리가 블록 옆에 있는 eZFN을 발현시키는 식물과 교배에 의해 제거되며, 블록 1 또는 블록 2 중 하나를 함유하는 식물을 초래한다.
도 16은 애기장대에 교환 유전자 자리의 도입을 위해 사용된 플라스미드의 개략도. 그것은 도 14에서 설명한 바와 같은 Blocks 1 및 2 및 다중 삽입 자리 서열을 함유한다. eZFN 결합 자리가 표시되며 Blocks 1 및 2(블록 1: eZFN1 및 8; 블록 2: eZFNs 3 및 6) 옆에 있고, 또는 다중 삽입 자리(eZFNs 4 및 7)에서 중심에 위치되어 상동성 재조합을 용이하게 한다.
본 명세서는 게놈, 예를 들어 옥수수와 같은 작물 식물 또는 포유류 세포에 표적화된 통합(targeted integration: TI)을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, ZFN)를 위한 다중 표적 자리를 함유하는 다중 삽입 자리는 게놈에 통합된다. 게놈에 다중 삽입 자리의 통합 후, 적절한 뉴클레아제는 외인성 서열이 삽입되는 것과 함께 세포에 도입된다.
어떤 구체예에서, 뉴클레아제(들)는 하나 이상의 ZFN을 포함한다. ZFN은 전형적으로 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인) 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하며, 단백질, 이들 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 암호화 폴리뉴클레오티드의 조합으로서 도입될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 전형적으로 절단 하프 도메인의 다이머화 후 다이머 단백질로 작용한다. "왼쪽" 및 "오른쪽" 인식 도메인에 대해 ZFN 모노머가 결합하는 절대(obligate) 헤테로다이머 ZFN은 결합하여 설명한 활성 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0131962호를 참조할 수 있다. 따라서, "왼쪽" 모노머가 임의의 "오른쪽" 모노머와 함께 활성 ZFN 뉴클레아제를 형성할 수 있는 적절한 표적 자리가 주어진다. 이것은 다양한 조합에서 사용될 수 있는 입증된 우측 및 좌측 도메인에 기반한 유용한 뉴클레아제 자리의 수를 상당히 증가시킨다. 예를 들어, 4개의 호모다이머 ZF 뉴클레아제의 결합 자리의 재조합으로 추가적인 12개 헤테로다이머 ZF 뉴클레아제를 얻는다. 더 중요하게는, 이는 유전자 이식 설계에 대한 체계적인 접근을 가능하게 하며, 모든 새로 도입된 서열은 방출된 유전자를 절제하거나 또는 그것의 옆에 있는 추가적인 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 독특한 ZFN 자리와 인접하게 된다. 추가적으로, 이 방법은 ZFN-의존적 이중가닥 파괴에 의해 구동되는 단일 유전자 자리에 집적(stacking) 전략을 단순화시킬 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 정규(C2H2) 아연 핑거 또는 비정규(예를 들어, C3H) 아연 핑거일 수 있다. 더 나아가, 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 아연 핑거)를 포함할 수 있고, 유전자 조작되어 다중 삽입 자리 내에서 임의의 서열에 결합할 수 있다. 세포 내에서 이러한 융합 단백질(또는 단백질들)의 존재는 그것의(그들의) 결합 자리(들)에 융합 단백질(들)의 결합 및 다중 삽입 자리 내에서 절단을 초래하는데, 이는 외인성 서열(들)의 통합을 야기한다.
일반
본 방법의 실행뿐만 아니라 본 명세서에서 개시한 조성물의 제조 및 사용은, 달리 표시되지 않는다면, 당업계의 기술 내에서 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터를 이용한 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서 통상적인 기술을 이용한다. 이들 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROtocoLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조할 수 있다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 호환적으로 사용되며, 선형 또는 고리형 입체 형태 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 말한다. 본 명세서의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이 면에서 제한되는 것으로 추론되지 않는다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 부분(예를 들어, 포스포로티오에이트 주쇄)에 있어서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄한다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 형성 특이성을 가지며, 즉 A의 유사체는 T와 염기 쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 이 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 대응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합하는"은 거대분자들 간의(예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적, 비-공유적 상호 작용을 말한다. 총괄적으로 이러한 상호 작용이 서열-특이적인 한은, 결합되는 상호 작용의 모든 성분들이 반드시 서열-특이적(예를 들어, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와 접촉됨)일 필요는 없다. 이러한 상호 작용은 일반적으로, 10-6M-1 또는 그 미만의 해리 상수(Kd)로 특징지어 진다. "친화도"는 결합 세기를 말하는데, 결합 친화도 증가는 보다 낮은 Kd와 관련이 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에는, 이것이 자신과 결합할 수 있고 및/또는 (동종-다이머, 동종-삼량체 등을 형성하기 위함) 상이한 단백질(들)의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 초과 유형의 결합 활성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 지닌다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 그의 구조가 아연 이온의 배위를 통하여 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종, 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
아연 핑거 결합 도메인은 사전결정된 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "유전자 조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 유전자 조작하기 위한 방법의 비제한적 예는 설계와 선별이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적 기준으로부터 초래된 본래 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터 정보를 저장하고 있는 데이터베이스 내의 정보를 처리하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘 및 치환 규칙을 적용하는 것을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 참조).
"선별된" 아연 핑거 단백질은 그의 생성이 주로 실험적 공정, 예컨대 파지 디스플레이(phage display), 상호 작용 트랩 또는 혼성 선별로부터 초래된 천연에서 발견되지 않는 단백질이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 제5,789,538호; 미국 제 5,925,523호; 미국 제6,007,988호; 미국 제6,013,453호; 미국 제6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조할 수 있다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 환상 또는 분지형일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는, 모든 길이의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 공여자 서열은 모든 길이, 예를 들어 길이가 2개 내지 10,000개 뉴클레오티드(또는 그 사이 또는 그 위의 임의의 정수 값), 바람직하게 길이가 약 100개 내지 1,000개 뉴클레오티드(또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 길이가 약 200개 내지 500개 뉴클레오티드일 수 있다.
"상동성이며, 동일하지 않은 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성은 공유하고 있지만, 그의 서열이 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 말한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 돌연변이체 유전자의 서열과 상동성이며, 동일하지 않다. 어떤 구체예에서, 두 서열 간의 상동성 정도는 정상적인 세포 메커니즘을 활용하여 그들 간의 상동 재조합을 허용하기에 충분하다. 상동성이며, 동일하지 않은 2개의 서열은 임의 길이일 수 있고, 그들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 적을 수 있거나(예를 들어, 표적화된 상동 재조합에 의해 게놈 점 돌연변이를 교정에 대해) 또는 10 또는 그 초과의 킬로염기만큼 클 수 있다(예를 들어, 염색체 내 사전결정된 이소성(ectopic) 자리에 유전자 삽입에 대해). 상동성이지만 동일하지 않은 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 반드시 동일한 길이일 필요는 없다. 예를 들어, 20 내지 10,000개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오티드(즉, 공여자 폴리뉴클레오티드)를 사용할 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 이로써 암호화된 아미노산 서열을 결정하며, 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 기술이 포함된다. 게놈 서열을 이러한 방식으로 결정하고 비교할 수도 있다. 일반적으로, 동일성은 2개 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응도를 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 동일성%을 결정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든지 아니면 아미노산 서열이든, 두 서열의 동일성%은 정렬된 두 서열 간의 정확한 매치 수를 더 짧은 서열 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 다이호프(Dayhoff)에 의해 개발된 스코어링 매트릭스, 문헌[Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, 미국 워싱턴 D.C.에 소재한 National Biomedical Research Foundation]을 사용함으로써 아미노산 서열에 적용할 수 있고, 문헌[Gribskov, Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정규화될 수 있다. 서열의 동일률을 결정하기 위한 상기 알고리즘의 예시적 이행은 "최적화(BestFit)" 활용 적용에서 제네틱스 컴퓨터 그룹(위스콘신주 매디슨시에 소재한 Genetics Computer Group)에 의해 공급된다. 서열 간의 동일성% 또는 유사성%을 계산하는데 적합한 프로그램은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있는데, 예를 들어 또 다른 정렬 프로그램은 BLAST이고, 이는 디폴트(default) 변수와 함께 사용된다. 예를 들어, 다음 디폴트 변수를 이용하여 BLASTN 및 BLASTP를 사용할 수 있다: 유전자 부호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 해독 + 스위스(Swiss) 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 인터넷에서 발견할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열을 기준으로 하여, 목적하는 서열 동일률 범위는 대략 80% 내지 100%, 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 전형적으로, 서열 간의 동일%는 적어도 70 내지 75%, 바람직하게는 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
대안으로, 폴리뉴클레오티드 간의 서열 유사도는 상동성 영역 간의 안정한 듀플렉스(duplexe) 형성을 허용하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 다음, 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해시키고, 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다. 두 핵산, 또는 두 폴리펩티드 서열은 이들 서열이 상기 방법을 이용하여 결정된 바와 같이 규정된 분자 길이 전반에 걸쳐 적어도 약 70 내지 75%, 바람직하게 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에 서로 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에 사용된, 실질적으로 상동성이란 또한, 지정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 특별한 시스템에 대해 규정된 바와 같이, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 혼성화 실험으로 확인할 수 있다. 적당한 혼성화 조건을 규정하는 것은 당해 분야의 기술 수준 내이다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
두 핵산 단편의 선별적 혼성화는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 핵산 분자 간의 서열 동일률은 이러한 분자 간의 혼성화 사건의 효율과 세기에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화를 억제하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 혼성화 분석(예를 들어, 서던(DNA) 블롯, 노던(Northern)(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.])을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어 낮은 수준의 엄격도부터 고도의 엄격도까지 다양한 조건을 이용하여 다양한 선별도를 사용하여 수행할 수 있다. 낮은 엄격도 조건을 이용하는 경우에는, 심지어 부분 서열 동일성 정도가 결여된 이차 프로브(예를 들어, 표적 분자와의 서열 동일률이 약 30% 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재를 평가할 수 있으므로, 비-특이적 결합 사건의 부재 하에서는, 이차 프로브가 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화에 의거한 검출 시스템을 활용하는 경우, 기준 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 프로브를 선별한 다음, 적당한 조건을 선별함으로써, 상기 프로브와 기준 서열은 선별적으로 혼성화하거나 또는 서로 결합하여 듀플렉스 분자를 형성한다. 중간 수준으로 엄격한 혼성화 조건 하에 기준 서열과 선별적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 전형적으로, 선별된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 대략 70% 이상인, 길이가 적어도 약 10 내지 14개의 뉴클레오티드인 표적 핵산 서열을 검출할 수 있게 해주는 조건 하에 혼성화된다. 엄격한 혼성화 조건은 전형적으로, 선별된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 90 내지 95% 초과인, 길이가 적어도 약 10 내지 14개 뉴클레오티드인 표적 핵산 서열의 검출을 검출할 수 있게 해준다. 프로브와 기준 서열이 특정 서열 동일성을 가지는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당해 분야에 공지된 바와 같이 결정할 수 있다(이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]을 참조할 수 있다).
혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 조건이 미스매치된 뉴클레오티드를 함유하는 하이브리드의 형성을 배제하는 정도를 말하는데, 엄격도가 보다 높다는 것은 미스매치된 하이브리드에 대한 관용도가 보다 낮다는 것과 상관이 있다. 혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 요인은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매, 예를 들어 포름아미드 및 다이메틸설폭사이드의 농도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 보다 고온, 보다 낮은 이온 강도 및 보다 낮은 용매 농도에 의해 증가된다.
혼성화에 대한 엄격도 조건과 관련하여, 수많은 동일한 조건을 이용하여, 예를 들어 다음 요인들을 다양하게 함으로써 특별한 엄격도를 확립시킬 수 있는 것으로 당해 분야에 잘 알려져 있다: 서열의 길이 및 성질, 각종 서열의 염기 조성, 염 및 기타 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중의 차단제(예를 들어, 덱스트란 설페이트, 및 폴리에틸렌 글라이콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 변수 뿐만 아니라 세척 조건을 다양하게 하는 것. 특정 혼성화 조건 세트를 선별하는 것은 당해 분야에서의 표준 방법에 따라서 선별한다(이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조할 수 있다).
"재조합"은 두 폴리뉴클레오티드 간의 유전자 정보 교환 과정을 말한다. 본 명세서의 목적을 위해, "상동 재조합(homologous recombination: HR)"은, 예를 들어 세포에서 이중 가닥 파괴를 복구하는 동안 일어나는 상기 교환의 특수 형태를 말한다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 요구하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 분자)의 주형 복구를 위해 "공여자" 분자를 사용하며, "비-교배 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 공지되어 있는데, 이는 이로써 유전자 정보가 공여자로부터 표적으로 전이되기 때문이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 전이는 파괴된 표적과 공여자 간에 형성되는 이종-듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 공여자를 사용하는 "합성-의존적 가닥 어닐링", 및/또는 관련 과정을 포함할 수 있다. 이러한 구체화된 HR로 인해 종종, 표적 분자의 서열이 교체되어 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열 전부 또는 일부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 포함된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유적 백본의 파괴를 말한다. 절단은, 이에 제한되지 않지만, 포스포다이에스터 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 둘 다 가능하며, 이중 가닥 절단은 2개의 별개의 단일 가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 특정 구체예에서, 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 융합 폴리펩티드가 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매적 활성을 지니는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 절단 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 함유될 수 있고 또는 절단 활성은 2개(또는 그 이상의) 폴리펩티드의 결합으로부터 발생할 수 있다.
"절단 하프-도메인"은 제2 폴리펩티드(동일 또는 상이함)와 함께, 절단 활성(바람직하게는, 이중 가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다.
"염색질"은 세포성 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포성 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 단백질(히스톤 및 비-히스톤 염색체성 단백질 포함)을 포함한다. 대다수의 진핵 세포성 염색질은 뉴클레오좀의 형태로 존재하는데, 여기서는 뉴클레오좀 코어가 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각을 2개 포함하는 옥타머(octamer)와 연합된 DNA의 대략 150개 염기 쌍을 포함하고; 링커 DNA(유기체에 따라서 가변적 길이를 지님)는 뉴클레오좀 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로, 링커 DNA와 결합된다. 본 명세서의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 원핵 및 진핵성의, 모든 유형의 세포성 핵단백질을 포괄하는 것을 의미한다. 세포성 염색질은 염색체성 염색질과 에피좀성 염색질을 둘 다 포함한다.
"염색체"는 세포 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포 게놈은 종종, 세포 게놈을 포함하는 모든 염색체의 컬렉션인 그의 핵형(karyotype)에 의해 특징 규명된다. 세포 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피좀"은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체, 또는 세포의 염색체성 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 기타 구조이다. 에피좀의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스성 게놈을 포함한다.
"접근 가능한 영역"은 핵산에 존재하는 표적 자리가, 이러한 표적 자리를 인식하는 외인성 분자에 의해 연결될 수 있는 세포성 염색질 내의 자리이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 접근 가능한 영역은 뉴클레오좀성 구조 내로 패키지화되지 않는 것으로 여겨진다. 접근 가능한 영역의 별개 구조는 종종, 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어 뉴클레아제에 대한 그것의 민감도에 의해 검출될 수 있다.
"표적 자리" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합될 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열인데, 단 충분한 결합 조건이 존재한다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 자리이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만, 한 가지 이상의 유전적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에 정상적으로 존재"하는 것은 세포의 특정 발생 단계 및 환경적 조건을 기준으로 하여 결정한다. 따라서, 예를 들어 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포를 기준으로 하여 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 유도된 분자는 비-열-쇼크된 세포를 기준으로 하여 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어 모든 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 암호화 서열, 기능 장애성 내인성 분자의 기능성 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 장애성 버전을 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 분자는 숙주 세포 내의 내인성 유전자의 오솔로그(ortholog)인 또 다른 종으로부터의 암호화 서열을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 특히, 소분자, 예컨대 조합 화학 공정에 의해 생성되는 바와 같은 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 모든 변형된 유도체, 또는 상기 분자를 하나 이상 포함하는 모든 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산뿐만 아니라 삼중체-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호 참조. 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 레컴비나제, 리가제, 토포아이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스성 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피좀, 또는 정상적으로는 세포에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 지질-매개된 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공-침전, 나노입자 형질전환, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경적 조건 하에 특정 발생기에 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리온의 게놈, 엽록체 또는 기타 세포 소기관, 또는 자연적으로 발생하는 에피좀성 핵산을 포함할 수 있다. 부가적인 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "외인성 핵산의 생성물"은 폴리뉴클레오티드 생성물과 폴리펩티드 생성물을 둘 다 포함하는데, 예를 들어 전사 생성물(RNA와 같은 폴리뉴클레오티드) 및 번역 생성물(폴리펩티드)이 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결되는 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 단백질의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합물) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 설명한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 제2 유형의 융합 분자의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 삼중체-형성 핵산과 폴리펩티드 간의 융합, 및 마이너 그루브 결합제와 핵산 간의 융합을 포함한다.
세포에서의 융합 단백질의 발현은 이러한 융합 단백질의 세포에 전달로부터 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 세포에 전달로부터 초래될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 전사되고, 전사체는 번역되어 융합 단백질을 생성시킨다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 연결이 세포에서의 단백질 발현에 관여할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에 제시되어 있다.
본 명세서의 목적을 위한 "유전자"는 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역(하기 참조)뿐만 아니라 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하든지 아니든지 간에 유전자 생성물의 생성을 조절하는 DNA 영역이 포함된다. 따라서, 유전자는, 필수적으로 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결인자, 해독 조절성 서열, 예컨대 리보솜 결합 자리 및 내부 리보솜 도입 자리, 증강인자, 침묵인자, 절연물, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 자리 및 유전자 자리 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 말한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 기타 모든 유형의 RNA) 또는 mRNA의 해독에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한, 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화 및 에디팅과 같은 처리에 의해 변형되는 RNA, 및, 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글라이코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성 상의 변화를 말한다. 발현의 조절은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
"식물" 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물의 세포를 포함한다. 외떡잎 식물의 비제한적 예는 곡류 식물, 예컨대, 옥수수, 벼, 보리, 귀리, 밀, 당밀, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나 및 코코넛이 포함된다. 쌍떡잎 식물의 비 제한적 예는 담배, 토마토, 해바라기, 면, 사탕무, 감자, 상추, 멜론, 대두, 카놀라(평지씨), 및 알팔파를 포함한다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분 및/또는 임의의 식물 발생 단계로부터 유래될 수 있다.
"관심의 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들어 유전자 또는 유전자 내의 또는 이에 인접한 비암호화 서열인데, 이것이 외인성 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은, 예를 들어 염색체, 에피좀, 세포 소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스성 게놈 내에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비암호화 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있는 비전사된 영역 내에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작을 수 있거나, 또는 길이가 2,000개 이하의 뉴클레오티드 쌍 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "작동적으로 연결된")은 2가지 이상 성분(예를 들어, 서열 요소)의 병렬에 관하여 상호 호환적으로 사용되는데, 이들 성분은 양 성분이 정상적으로 기능하고 적어도 한 가지 성분이 다른 성분 중의 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시로써, 전사 조절성 서열, 예컨대 프로모터는, 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 상기 전사 조절 서열이 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우에, 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로, 암호화 서열과 cis로 작동가능하게 연결되지만, 이에 바로 인접해야할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 연속적이지 않은 경우일지라도 암호화 서열과 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드에 관해서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각 성분이 이렇게 연결되지 않은 경우에 수행하는 것과 마찬가지로 다른 성분과의 연쇄에서도 동일한 기능을 수행한다는 사실을 말할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인과 융합되는 융합 폴리펩티드에 관해서는, 이러한 융합 폴리펩티드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분은 그의 표적 자리 및/또는 그의 결합 자리와 결합할 수 있으면서, 절단 도메인은 표적 자리 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 그의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 유지하고 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은, 대응하는 천연 분자보다 더 많은 수, 더 적은 수, 또는 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환물을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 또 다른 핵산과 혼성화할 수 있는 능력)을 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동도-이동, 또는 면역침전 분석에 의해 결정할 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다(문헌[Ausubel et al., 상기] 참조). 또 다른 단백질과 상호 작용할 수 있는 단백질의 능력은, 예를 들어 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석 또는 상보성(유전적 및 생화학적 둘 다)에 의해 결정할 수 있다(이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350을 참조할 수 있다).
다중 삽입 자리
다중 삽입 자리, 즉 다수의 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 결합 자리를 포함하며, 적절한 ZFN 쌍의 결합 시 다수의 삽입 자리가 ZFN 쌍의 표적 자리 사이에서 절단되는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시된다.
다중 삽입 자리 상에 포함된 표적 자리는 바람직하게는 그것이 통합된 세포의 게놈에서 발견되지 않는다. 그러한, 게놈 내 원치 않는 절단의 발생은 감소되거나 제거된다. 임의의 표적 자기의 수는 다중 삽입 자리 폴리뉴틀레오티드에, 예를 들어 1-50개(또는 그 사이의 임의의 수), 바람직하게는 2 내지 30개(또는 그 사이의 임의의 수), 및 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 20개(또는 그 사이의 임의의 수)로 포함될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제에 대해, 표적 자리는 전형적으로 쌍으로 존재하며, 아연 핑거 뉴클레아제는 호모- 또는 헤테로다이머를 형성하여 적절한 자리에서 절단한다.
더 나아가, 도 1에서 제시된 바와 같이, 표적 자리 각 쌍 중 하나의 표적 자리(음영표시된 삼각형 도 1)는 전체 다중 삽입 자리를 가로지르는 동일물일 수 있다. 대안으로, 헤테로다이머 쌍은 자리 간에 상이할 수 있다.
다중 삽입 자리는 단지 호모다이머에 의해 결합된 표적 자리, 단지 헤테로다이머에 의해 결합된 표적 자리, 또는 호모- 및 헤테로-다이머에 의해 결합된 표적 자리의 조합을 포함할 수 있다. 호모다이머에 의해 결합된 표적 자리는 다음의 이유 중 한 가지 이상에 대해 일부 경우에 바람직할 수 있다: 하나의 ZFN의 전달은 2개보다 더 효율적일 수 있으며, 호모다이머화는 ZFN의 동일하지 않은 발현에 기인하여 동일하지 않은 화학양론의 문제를 감소시키고; 표적을 벗어난 자리에서 절단으로부터의 독성은 감소될 수 있고; 호모다이머는 CCHC(비정규) 아연 핑거 도메인을 사용할 때 방해될 가능성이 있는 절반이며; 및/또는 독특한 표적가능 자리의 총 수는 확장될 수 있다. 대안으로, 헤테로다이머는 그것들이 상이한 표적 자리의 혼합 및 매칭을 허용하고, 따라서 ZFN 쌍에 대한 표적가능한 자리에서 잠재적 증가를 허용하기 때문에 다른 경우에 바람직할 수 있다. 또한, 헤테로다이머는 실시자의 필요에 따라 공여자의 순차적 첨가를 허용할 수 있다. 헤테로다이머 조합은 또한 신규 ZFN 쌍의 사용을 통해 공여자의 임의의 원하는 섹션의 특이적 결실을 허용할 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제에 대해 다중의 3개 뉴클레오티드가 되는 표적 자리가 필요하지 않음은 명백할 것이다. 예를 들어, 교배 가닥(cross-strand) 상호작용이 일어난 경우에(예를 들어 미국 특허 제6,453,242호 및 WO 02/077227를 참조), 다중 핑거 결합 도메인의 하나 이상의 개개의 아연 핑거는 중복 사중체 서브 사이트(subsite)와 결합할 수 있다. 결과로서, 3-핑거 단백질은 10-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있되, 제10 뉴클레오티드는 말단 핑거에 의해 결합된 사중체의 부분이며, 4-핑거 단백질은 13-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있되, 제13 뉴클레오티드는 말단 핑거에 의해 결합된 사중체의 부분이다.
다중 핑거 결합 도메인 내 개개의 아연 핑거 간 아미노산 링커 서열의 길이 및 특성은 또한 표적 서열에 대한 결합에 영향을 미친다. 예를 들어 다중-핑거 결합 도메인 중의 인접한 아연 핑거들 간에 소위 "비정규 링커", "긴 링커" 또는 "구조화된 링커"의 존재는 이 핑거가 바로 인접하지 않은 서브 사이트와 결합할 수 있게 한다. 이러한 링커의 비제한적 예는, 예를 들어 미국 특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480에 기재되어 있다. 따라서, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 표적 자리 내의 하나 이상의 소-자리는 서로 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 떨어져 있을 수 있다. 단지 한 가지 예를 제공하기 위해, 4-핑거 결합 도메인은, 서열상 2개의 연속되는 3-뉴클레오티드 소-자리, 개재 뉴클레오티드 및 2개의 연속되는 삼중체 소-자리를 포함하는 13-뉴클레오티드 표적 자리와 결합할 수 있다.
서열(예를 들어, 표적 자리) 사이의 거리는 서로 가장 근접한 서열 가장자리로부터 측정된 바와 같이, 두 서열 간에 개입된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 수를 말한다.
절단이 별개의 표적 자리에 대해 2개 아연 핑거 도메인/절단 하프-도메인 융합 분자의 결합에 좌우되는 어떤 구체예에서는, 2개의 표적 자리가 맞은편의 DNA 가닥 상에 있을 수 있다. 다른 구체예에서는, 양 표적 자리가 동일한 DNA 가닥 상에 있다.
다중 삽입 자리는 식물 게놈 내에서 어디에서나 통합될 수 있다. 어떤 구체예에서, 다중 삽입 자리는 미국 출원 제12/653,735호에서 외인성 서열의 표적화된 통합을 위한 바람직한 자리로 설명되는 바와 같이 옥수수 게놈 내 Zp15에 통합된다.
DNA -결합 도메인
임의의 DNA-결합 도메인이 본 명세서에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서, DNA-결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌[Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65]; 미국 특허 제6,453,242호 참조. 본 명세서에 기재된 아연 핑거 결합 도메인은 일반적으로 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 그 초과의 아연 핑거를 포함한다.
전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 길이가 약 30개 아미노산이다. 구조적 연구 결과, 각 아연 핑거 도메인(모티프)은 2개의 베타 시트(2개의 불변 시스테인 잔기를 함유하는 베타 회전으로 유지됨) 및 알파 나선(2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유함)을 함유하는데, 이들이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의해 아연 원자의 배위를 통하여 특정 입체 형태로 유지되는 것으로 입증되었다.
아연 핑거는 표준 C2H2 아연 핑거(즉, 아연 이온이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기에 의해 배위되는 것) 및 비-표준 아연 핑거, 예를 들어 C3H 아연 핑거(아연 이온이 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 의해 배위되는 것) 및 C4 아연 핑거(아연 이온이 4개의 시스테인 잔기에 의해 배위되는 것) 둘 다를 포함한다. 또한 WO 02/057293; 및 식물에서 사용하기 위한 비-정규 ZFP에 관한 미국 특허 공개공보 제20080182332호를 참조할 수 있다.
유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질과 비교해서 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자 조작 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 합리적 설계 및 각종 유형의 선별을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중체(또는 사중체) 뉴클레오티드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하는데, 여기서 각 삼중체 또는 사중체 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중체 또는 사중체 서열과 결합하는 아연 핑거 중 하나 이상의 아미노산 서열과 결합한다.
파지 디스플레이 및 2-혼성 시스템을 포함하는 예시적인 선별 방법이 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동-소유의 WO 02/077227에서 설명되었다.
개개의 아연 핑거는 3-뉴클레오티드(즉, 삼중체) 서열(또는 하나의 뉴클레오티드가, 인접한 아연 핑거의 4-뉴클레오티드 결합 자리와 중첩될 수 있는 4-뉴클레오티드 서열)과 결합하기 때문에, 아연 핑거 결합 도메인이 결합되도록 유전자 조작한 서열(예를 들어, 표적 서열)의 길이는 유전자 조작한 아연 핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거의 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중복 소-자리와 결합하지 않는 ZFP의 경우에, 예를 들어 6-뉴클레오티드 표적 서열이 2-핑거 결합 도메인에 의해 결합되고; 9-뉴클레오티드 표적 서열은 3-핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 본 명세서에서 주목된 바와 같이, 표적 자리 내에서 개개의 아연 핑거에 대한 결합 자리(즉, 서브사이트)는 연속적일 필요는 없지만, 다중-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거 간의 아미노산 서열(즉, 핑거간 링커)의 길이 및 성질에 따라서 1개 또는 수 개의 뉴클레오티드로 분리될 수 있다.
다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인에서, 인접한 아연 핑거는 대략 5개 아미노산의 아미노산 링커 서열(소위 "정규" 핑거 사이의 링커)에 의해 격리될 수 있거나, 또는 또 다르게는, 하나 이상의 비-표준 링커에 의해 격리될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조할 수 있다. 3개 이상의 핑거를 포함하는 유전자 조작한 아연 핑거 결합 도메인의 경우, 몇몇 경우는 특정 아연 핑거 사이에 보다 긴("비-정규") 핑거 사이에 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 상기 결합 도메인에 의해 결합 친화도 및/또는 결합 특이도가 증가될 수 있기 때문이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480를 참조할 수 있다. 따라서, 다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인은 또한, 비-표준 핑거간 링커의 존재 및 위치에 관해서 명확히 규명할 수 있다. 예를 들어, 3개의 핑거(2개의 표준 핑거간 링커에 의해 연결됨), 긴 링커 및 3개의 부가 핑거(2개의 표준 핑거 사이의 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 6-핑거 아연 핑거 결합 도메인은 2×3 입체 배치를 의미한다. 유사하게, 2개의 핑거(그 사이에 표준 링커를 수반함), 긴 링커 및 2개의 부가 핑거(표준 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 결합 도메인은 2×2 입체 배치를 의미한다. 3개의 2-핑거 단위(각각의 경우에, 2개의 핑거는 표준 링커에 의해 연결되고, 각 2-핑거 단위는 장 링커에 의해 인접한 2개 핑거 단위에 연결됨)를 포함하는 단백질은 3×2 입체 배치로서 언급된다.
다중-핑거 결합 도메인 내의 2개의 인접한 아연 핑거 간에 장 또는 비-정규 핑거 사이에 링커의 존재는 종종 2개의 핑거가 표적 서열 내에서 바로 연속적이지 않은 서브사이트와 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표적 자리 내의 서브사이트 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드의 갭이 존재할 수 있는데, 즉 표적 자리는 아연 핑거에 의해 접촉되지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2x2 아연 핑거 결합 도메인은 하나의 뉴클레오티드에 의해 격리된 2개의 6-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는데, 즉 이는 13-뉴클레오티드 표적 자리와 결합한다. 이에 대해서는, 문헌[Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441] 및 WO 01/53480을 참조할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같은, 표적 서브사이트는 단일 아연 핑거에 의해 결합된 3- 또는 4-뉴클레오티드 서열이다. 특정 목적을 위해, 2-핑거 단위는 "결합 모듈"을 의미한다. 결합 모듈은, 예를 들어 특정 6-뉴클레오티드 표적 서열과 결합하는 다중-핑거 단백질(일반적으로, 3 핑거)에 관련해서 2개의 인접한 핑거에 대해 선별함으로써 얻을 수 있다. 대안으로, 모듈은 개개의 아연 핑거의 조립체에 의해 구성될 수 있다. 또한 이에 대해서는, WO 98/53057 및 WO 01/53480을 참조할 수 있다.
대안으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, ISceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180]; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조할 수 있다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 결합 자리와 결합하도록 유전자 조작할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 공보 제20070117128호를 참조할 수 있다.
다른 대안으로서, DNA-결합 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper) 단백질로부터 유래될 수 있다. 류신 지퍼는 유전자 발현과 관련된 중요한 전사 인자인 다수의 진핵 조절 단백질에서 단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 단백질 부류이다. 류신 지퍼는 동물, 식물, 효모 등을 포함한 여러 가지 계 전반에 걸쳐 이들 전사 인자에 공유된 공통의 구조적 모티프를 말한다. 류신 지퍼는 류신 잔기가 α-나선을 통하여 균일하게 간격을 두고 두 폴리펩티드의 류신 잔기가 나선의 동일한 면 상에서 종결되도록 하는 방식으로 특이적 DNA 서열과 결합하는 두 폴리펩티드(동종-다이머 또는 이종-다이머)에 의해 형성된다. 류신 지퍼의 DNA 결합 특이성을 본 명세서에 설명된 DNA-결합 도메인에서 이용할 수 있다.
일부 구체예에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원체 산토모나스(Xanthomonas)로부터 유래된 TAL 이펙터로부터 유전자 조작한 도메인이다(이에 관하여, 문헌[Boch et al. (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881) 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.1178817)]을 참조).
절단 도메인
상기 언급된 바와 같이, DNA-결합 도메인은 절단(뉴클레아제) 도메인과 결합될 수 있다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 기능을 유지시키면서 그의 DNA-결합 특이성을 변형시킬 수 있다. 또한, 아연 핑거 단백질을 절단 도메인과 융합시켜 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성시킬 수도 있다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 어떠한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는, 이에 제한되지 않지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조할 수 있다. DNA를 절단시키는 부가의 효소가 공지되어 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두(mung bean) 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 비제한적 예는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 또한, 이에 대해서는, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조할 수 있다. 이들 효소(또는 그의 기능적 단편) 중의 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 하프-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하고, (인식 자리에서) DNA와 서열-특이적으로 결합할 수 있으며, 결합 자리 또는 그 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 유형 IIS)는 인식 자리로부터 제거된 자리에서 DNA를 절단시키고, 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 9개 뉴클레오티드에서 및 다른 가닥 상의 그의 인식 자리로부터 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 및 문헌[Li et al. (1992) Proc . Natl . Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad . Sci . USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인), 및 유전자 조작할 수 있거나 유전자 조작하지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 다이머로서 활성이다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 10,570-10,575] 참조). 따라서, 본 명세서의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부가 절단 하프-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-FokI 융합물을 이용하여 세포 서열의 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 표적화 대체의 경우에, 각각 FokI 절단 하프-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여, 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 하프-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자를 사용할 수도 있다. 아연 핑거-FokI 융합물을 이용하여 표적화된 서열 교체 및 표적화 절단시키기 위한 변수가 본 명세서 어딘가에 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 유지하고 있거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 멀티머화(예를 들어, 다이머화)될 수 있는 능력을 보유하고 있는 단백질의 모든 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 공동 소유의 국제 공개공보 WO 2007/014275에 기재되어 있다.
절단 특이성을 증강시키기 위해서는, 절단 도메인을 변형시킬 수도 있다. 특정 구체예에서는, 절단 하프-도메인의 변이체를 이용하는데, 이들 변이체는 절단 하프-도메인의 동종-다이머화를 최소화하거나 방지한다. 이러한 변형된 절단 하프-도메인의 비제한적 예는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2007/014275에 상세히 기재되어 있다. 또한, 실시예를 참조할 수 있다. 특정 구체예에서, 동종-다이머화를 최소화하거나 방지하는 유전자 조작한 절단 하프-도메인(또한 다이머화 도메인 돌연변이체로서 언급됨)을 포함하는 절단 도메인은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 공개공보 제20050064474호 및 제20060188987호에 기재되어 있다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 FokI 절단 하프-도메인의 다이머화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제20050064474호 및 제20060188987호; 국제 특허 공개공보 WO 07/139898; 문헌[Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(7):778-785]을 참조할 수 있다; 문헌[Doyon et al. (2011) Nature Methods 8(1):74-79]을 참조할 수 있다.
절대 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 부가적인 유전자 조작된 절단 하프-도메인을 본 명세서에 기재된 ZFN에 사용할 수도 있다. 한 구체예에서, 제1 절단 하프-도메인은 FokI의 위치 490 및 538에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고, 제2 절단 하프-도메인은 위치 486 및 499에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다.
특정 구체예에서, 절단 도메인은 2개의 절단 하프-도메인을 포함하는데, 이들 둘 다는 결합 도메인, 제1 절단 하프-도메인 및 제2 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부이다. 절단 하프-도메인은 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 단 이들은 DNA를 절단시키는 기능을 해야 한다.
일반적으로, 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함하는 경우는 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 요구된다. 대안으로, 2개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질을 사용할 수 있다. 2개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각 절단 하프-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 이러한 2개의 융합 단백질에 대한 표적 자리는, 2개의 융합 단백질이 그들의 각각의 표적 자리와 결합하여 서로에 대한 공간적 배향으로 절단 하프-도메인을 위치시켜 절단 하프-도메인이, 예를 들어 다이머화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있도록 서로에 대해 배치시키는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 자리의 근처 단부들은 5 내지 8개 뉴클레오티드 또는 15 내지 18개 뉴클레오티드 정도 떨어져 있다. 그러나, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 어떠한 정수도 두 표적 자리 사이에 삽입될 수 있다(예를 들어, 2개 내지 50개 뉴클레오티드 또는 그 초과). 일반적으로, 절단 점은 표적 자리 사이에 있다.
융합 단백질
융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 설계하고 구성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, DNA-결합 도메인(예를 들어, 아연 핑거 도메인) 및 조절성 또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 설계하고 구성하는 방법은 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 및 미국 특허 공개공보 2007/0134796호 및 제2005/0064474호(그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 특정 구체예에서는, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터는 세포 내로 도입할 수 있다(벡터, 및 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 방법에 관한 하기 추가의 개시 참조).
본 명세서에 설명된 방법의 특정 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 제한 효소로부터의 절단 하프-도메인 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 이러한 2개의 융합 단백질이 세포에서 발현된다. 세포 내에서 2개의 융합 단백질의 발현은 세포에 2개 단백질의 전달; 하나의 단백질과 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 하나의 핵산의 세포에 전달; 각각 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 2개의 핵산의 세포에 전달; 또는 양 단백질을 암호화하는 단일 핵산의 세포에 전달에 의해 초래될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 융합 단백질은 2개의 절단 하프 도메인 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이 경우, 단일 융합 단백질이 세포에서 발현되며, 이론에 의해 구속되지 않고, 이는 절단 하프 도메인의 분자 내 다이머 형성에 따른 결과로서 DNA를 절단시키는 것으로 믿어진다.
어떤 구체예에서, 융합 단백질(예를 들어, ZFP-FokI 융합물)의 성분들은, 아연 핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이는 FokI 효소로부터 유래된 바와 같은 자연적으로 발생하는 다이머화 절단 도메인 내에서의 절단 도메인의 상대적 배향을 반영하고 있는데, DNA-결합 도메인은 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인은 카복시 말단 가장 근처에 있다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 다이머화하는 것은 융합 단백질을 맞은편의 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 5' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
추가 구체예에서, 융합 단백질(예를 들어, ZFP-FokI 융합물)의 성분들은, 절단 하프-도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 아연 핑거 도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 다이머화하는 것은 융합 단백질을 대향하는 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 3' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
또 다른 추가적 구체예에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있는 절단 하프-도메인, 및 카복시-말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 아연 핑거 도메인 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있으며 절단 하프-도메인이 카복시 말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 구체예에서, 양 융합 단백질은 동일한 DNA 가닥과 결합하는데, 카복시 말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위는 아미노 말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 대해 위치한다.
개시된 융합 단백질의 특정 구체예에서, 아연 핑거 도메인과 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 간의 아미노산 서열은 "ZC 링커"를 의미한다. 이러한 ZC 링커는 상기 논의된 핑거간 링커와 구별되어야 한다(예를 들어, 절단을 최적화시키는 ZC 링커를 수득하는 것에 관한 상세 내역은 미국 특허 공개공보 제20050064474A1호 및 제20030232410호, 및 국제 특허 공개공보 WO05/084190을 참조할 수 있다).
한 구체예에서, 본 명세서는 표 1에 제시된 인식 나선 아미노산 서열 중의 하나 이상을 가지는 아연 핑거 단백질을 포함하는 ZFN을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 표 1에 제시된 하나 이상의 인식 나선을 가지는 ZFP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZFP 발현 벡터가 제공된다.
표적화된 통합
다중 삽입 자리가 통합된 임의의 세포 게놈에서 DNA를 절단하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 개시되며, 이는 다중 삽입 자리에 외인성 서열의 안정하고 표적화된 통합 및/또는 적절한 ZFN 쌍의 존재에서 외인성 서열의 절제를 용이하게 할 수 있다. 이에 대해서는, 도 1 및 도 2를 참조할 수 있다.
또한 외인성 서열의 부분으로서 ZFN 삽입 자리가 일련의 세포 게놈에 도입되는 방법이 본 명세서에서 설명된다. 도 4 및 도 5를 참조한다. 예를 들어, 헤테로다이머 뉴클레아제 자리의 상이한 조합 옆에 있는 외인성 서열은 게놈에 삽입된다. 후속하여 적절한 옆에 있는 ZFN 자리 중 하나에서 절단하는 ZFN 쌍은 다른 외인성 서열의 존재에서 세포에 도입되는데, 이는 다시 헤테로다이머 뉴클레아제 자리의 상이한 조합을 포함한다. 이 처리는 원한다면 외인성 서열을 삽입하기 위해 반복될 수 있다. 추가로, 적절한 ZFN 쌍의 존재에서, 하나 이상의 외인성 서열은 게놈으로부터 절제될 수 있다.
도 6은 외인성 서열이 마커 유전자 및 관심의 유전자를 포함하는 다른 구체예를 보여준다. 마커 유전자와 관심의 유전자는 둘 다 상이한 ZFN 결합 자리 옆에 있고(상이한 음영을 가지는 삼각형으로 도시), 따라서 마커 유전자는, 예를 들어 추가 유전자를 삽입할 때 적절하다면 결실될 수 있다. 식물과 같은 유기체에서 효과적인 선별가능한 마커의 제한된 수가 있는 경우, 이는 겨우 하나뿐인 선별가능한 마커 유전자의 사용을 허용하며, 관심의 집적 유전자에 대한 가능성을 크게 촉진한다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 상동성 관련 DNA 쌍의 효율에 의존하여, "분할(split)" 선별가능한 마커가 사용될 수 있다. 분할-선별가능한 마커를 사용하는 공여자 DNA 서열의 정확한 통합은 발현가능한 선별가능한 마커 유전자를 만든다. 선별가능한 마커는 통합된 DNA 서열로부터 절제될 수 있고, 따라서 재활용될 수 있다. 다른 구체예에서, 제거를 위한 외인성 서열은 분할 마커 유전자의 부분적 서열에 의해 게놈 내에서 인접해 있다. 절제 시, 마커 유전자는 재구성되며, 기능적 마커 유전자의 창출을 초래한다. 선별가능한 마커 절제의 사용은 2개 또는 가능하다면 단지 1개로 필요한 선별가능한 마커의 수를 제한한다.
본 명세서에서 설명되는 통합된 다중 삽입 자리에 표적화된 통합을 위하여, 하나 이상의 DNA-결합 도메인(예를 들어, ZFP)는 유전자 조작되어 사전 결정된 절단 자리에서 또는 근처에서 표적 자리와 결합하고, 유전자 조작된 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질은 세포 내에서 발현된다. 표적 자리에 대한 융합 단백질의 DNA-결합(예를 들어 아연 핑거) 부분의 결합 시, DNA는 절단 도메인에 의해 표적 자리 근처에서 바람직하게는 이중 가닥 파괴를 통해 절단된다.
다중 삽입 자리에서 이중 가닥 파괴의 존재는 상동성 재조합을 통해 외인성 서열의 통합을 촉진한다. 어떤 구체예에서, 다중 삽입 자리에 삽입된 외인성 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 다중 삽입 자리 폴리뉴클레오티드를 가지는 하나 이상의 상동성 영역 및/또는 주변의 게놈을 포함하여 상동성 재조합을 용이하게 할 것이다. 대략 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,000개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 공여자와 게놈 서열 사이의 서열 상동성(또는 10 내지 2,000개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 임의의 정수 값)은 그 사이의 상동성 재조합을 지지할 것이다. 어떤 구체예에서, 상동성 암은 길이가 1,000개 미만의 염기쌍이다. 다른 구체예에서, 상동성 암은 길이가 750개 미만의 염기쌍이다. 또한 이에 대해서는, 본 명세서에 참조로 포함된 미국 가특허 출원 제61/124,047호를 참조할 수 있다. 공여자 분자(외인성 서열)는 세포 염색질에 대해 몇몇 불연속적 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에서 정상적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여자 핵산 분자 중에서 제공될 수 있고, 관심 영역에서 유전자 서열과 상동성인 영역 옆에 있을 수 있다.
임의의 관심 서열(외인성 서열)은 본 명세서에서 설명되는 다중 삽입 자리에 도입되거나 또는 다중 삽입 자리로부터 절제될 수 있다. 예시적인 외인성 서열은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 임의의 폴리펩티드 암호화 서열(예를 들어, cDNA), 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 서열(예를 들어 간섭 RNA 서열, shRNA 발현 카세트, 에피토프 태그, 마커 유전자, 절단 효소 인식 자리 및 다양한 유형의 발현 구성체)을 포함한다. 이러한 서열은 표준 분자 생물학 기술(클로닝, 합성 등)을 사용하여 용이하게 획득될 수 있고, 및/또는 상업적으로 이용가능하다. 외인성 서열은 융합 단백질(들)의 발현 전, 동시에 또는 이후에 세포에 도입될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 이는 선형 또는 고리 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단을 당업자에게 공지된 방법에 의해 보호할 수 있다(예를 들어, 외부핵산 분해적 분해로부터 보호). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기를 선형 분자의 3' 말단에 부가하고 및/또는 자기-상보성 올리고뉴클레오티드를 한 말단 또는 양 말단에 연결시킨다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889] 참조. 외인성 폴리뉴클레오티드가 분해되지 못하게 하는 부가의 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 말단 아미노 기(들)를 부가하는 방법, 및 변형된 뉴클레오티드간 연쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기를 사용하는 방법을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 부가 서열, 예를 들어 복제 원점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자를 가지는 벡터 분자의 부분으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 게다가, 공여자 폴리뉴클레오티드는 네이키드(naked) 핵산으로서, 나노입자, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 작용물질(agent)와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 바이러스(예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조븀 종(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조보윰 멜리로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti), 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus), 감자 바이러스 X, 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥(cassava vein) 모자이크 바이러스)에 의해 식물 세포에 전달될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조할 수 있다.
상술한 바와 같이, 2개의 융합 단백질(호모다이머 또는 헤테로다이머)에 대한 다중 삽입 자리 상의 결합 자리는, 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하며, 다른 결합 자리에 인접한 각 결합 자리의 에지로부터 측정되는 바와 같이 5 내지 8 또는 15 내지 18개의 뉴클레오티드로 떨어져서 위치될 수 있고, 절단은 결합 자리 사이에 생긴다. 결합 자리 사이의 단일 자리 또는 다중 자리에서 절단이 생기는지 여부는 중요하지 않은데, 절단된 게놈 서열이 공여자 서열에 의해 대체되기 때문이다. 따라서, 표적화된 재조합에 의한 단일 뉴클레오티드 쌍 서열의 효율적인 교체를 위해, 결합 자리 사이 영역의 중간점은 뉴클레오티드 쌍의 10,000개 뉴클레오티드 내, 바람직하게는 1,000개 뉴클레오티드, 또는 500개 뉴클레오티드 또는 200개 뉴클레오티드, 또는 100개 뉴클레오티드, 또는 50개 뉴클레오티드, 또는 20개 뉴클레오티드, 또는 10개 뉴클레오티드, 또는 5개 뉴클레오티드, 또는 2개 뉴클레오티드 또는 1개 뉴클레오티드 내 또는 관심의 뉴클레오티드에 있다.
이에 제한되는 것은 아니지만, 부가적인 ZFP-기능적 도메인 융합의 사용으로 상동 재조합에 관여한 유전자, 예를 들어 RAD54 우위성(epistasis) 군(예를 들어, AtRad54, AtRad51), 및 그의 생성물이 전술된 유전자 생성물과 상호 작용하는 유전자의 발현을 활성화시키는 것을 포함하여, 표적화된 재조합 수준을 향상시킬 수 있는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 예를 들어, 문헌[Klutstein M, et al. Genetics. 2008 Apr;178(4):2389-97]을 참조.
유사하게 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 조합으로 ZFP-기능적 도메인 융합물을 사용하여 비-상동성 말단 연결에 관여한 유전자(예를 들어, Ku70/80, XRCC4, 폴리(ADP 리보스) 중합효소, DNA 리가제 4)의 발현을 억제할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Riha et al. (2002) EMBO 21:2819-2826; Freisner et al. (2003) Plant J. 34:427-440; Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142]을 참조할 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인과 기능적 도메인 간의 융합을 이용하여 유전자 발현을 활성화시키고 억제시키는 방법은, 예를 들어 공동 소유의 미국 특허 제6,534,261호; 제6,824,978호 및 제6,933,113호에 개시되어 있다. 부가의 억제 방법은 억제시켜야 하는 유전자의 서열에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 저분자 간섭 RNA(siRNA 또는 RNAi) 또는 shRNA를 사용하는 방법을 포함한다.
아연 핑거/뉴클레아제 융합 분자 및 공여자 DNA 분자를 포함하는 세포에서, 표적화 재조합 효율을 추가로 증가시키는 것은 상동성-구동된 복구 과정이 최대로 활성인 경우에 세포 주기의 G2 기에 있는 세포를 차단시킴으로써 달성한다. 이러한 저지는 수많은 방식으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 세포를, 예를 들어 G2 기에 있는 세포를 저지하도록 세포-주기 진행에 영향을 미치는 약물, 화합물 및/또는 소분자로 처리할 수 있다. 이러한 유형의 예시적인 분자는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미소관 중합에 영향을 미치는 화합물(예를 들어, 빈블라스틴(vinblastine), 노코다졸(nocodazole), 탁솔(Taxol)), DNA와 상호 작용하는 화합물(예를 들어, cis-백금 (II) 디아민 디클로라이드, 시스플라틴, 독소루비신(doxorubicin)] 및/또는 DNA 합성에 영향을 미치는 화합물(예를 들어, 티미딘, 히드록시우레아, L-미모신, 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실)을 포함한다. 재조합 효율을 부가로 증가시키는 것은 게놈성 DNA가 세포성 재조합 기구에 보다 접근 가능하도록 하기 위해 염색질 구조를 교체시키는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예를 들어, 나트륨 부티레이트, 트리코스타틴 A)를 사용함으로써 달성된다.
세포-주기 저지를 위한 츄가적인 방법은, 예를 들어 해당 단백질을 암호화하는 cDNA를 세포 내로 도입하거나 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 활성화시키는 유전자 조작한 ZFP를 세포 내로 도입함으로써, CDK 세포-주기 키나제의 활성을 억제시키는 단백질을 과발현시키는 것을 포함한다. 세포-주기 저지는 또한, 예를 들어 RNAi 방법(예를 들어, 미국 특허 제6,506,559호)을 사용하여 사이클린 및 CDK의 활성을 억제하거나 또는 세포-주기 진행에 관여한 하나 이상의 유전자, 예를 들어 사이클린 및/또는 CDK 유전자의 발현을 억제하는 유전자 조작한 ZFP를 세포 내로 도입함으로써 달성된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 유전자 발현의 조절을 위해 유전자 조작한 아연 핑거 단백질을 합성하는 방법에 관한, 공동 소유의 미국 특허 제6,534,261호를 참조할 수 있다.
대안으로, 특정 경우에, 표적화 절단은 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재 하에 수행되고(바람직하게, S 또는 G2 기에서 수행됨), 재조합은 상동성 염색체 사이에서 일어난다.
발현 벡터
본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질(예를 들어, ZFN)을 암호화하는 핵산을, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 형질전환시키기 위한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 벡터는 원핵성 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀(shuttle) 벡터, 곤충 벡터 또는 진핵성 벡터일 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 또한, 식물 세포에 투여하기 위해, 발현 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다.
융합 단백질(예를 들어, ZFN)을 발현하기 위해, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 서열을 전형적으로, 전사를 지시하기 위한 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적합한 박테리아성 및 진핵성 프로모터가 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al ., supra. Bacterial expression systems for expressing the ZFP are available in, e.g., E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983))]에 기재되어 있다. 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵성 발현 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 이용가능하다.
융합 단백질-암호화 핵산의 발현에 관하여 사용된 프로모터는 특정 용도에 의존한다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성성 프로모터가 융합 단백질의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
대조적으로, 식물 유전자의 조절을 위해 융합 단백질을 생체 내 투여할 때(하기 "식물 세포로의 핵산 전달" 섹션 참조), 융합 단백질의 특정 용도에 따라서 구성성 또는 유도성 프로모터를 사용한다. 식물 프로 모터의 비제한적 예는 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3(ubi-3)(Callis, et al., 1990, J. Biol . Chem. 265-12486-12493)로부터 유래된 프로모터 서열; 아그로박테리움 투미파시엔스(A. tumifaciens) 만노핀 합성효소(Δmas)(Petolino et al., 미국 특허 제6,730,824호 참조)로부터 유래된 프로모터 서열; 및/또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스(CsVMV)(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 또한, 실시예를 참조할 수 있다.
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 전형적으로, 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 핵산의 발현에 필요한 모든 부가적 요소를 함유하는 발현 카세트 또는 전사 단위를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터, 및 예를 들어, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 해독 종결에 요구되는 신호를 함유한다. 상기 카세트의 부가 요소는, 예를 들어 증강인자, 이종 스플라이싱 신호 및/또는 핵 국재화 신호(NLS)를 포함할 수 있다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하기 위해 사용되어 온 특정 발현 벡터는 융합 단백질의 의도한 용도, 예를 들어 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선별된다(하기 언급되는 발현 벡터 참조). 표준 박테리아성 및 동물 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 공개공보 제20050064474A1호 및 국제 특허 공개공보 WO 05/084190, WO 05/014791 및 WO 03/080809에 상세히 기재되어 있다.
표준 트랜스펙션 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 박테리아성, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생성시킨 다음, 표준 기술을 이용하여 이를 정제할 수 있다(예를 들어, 문헌[Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)]을 참조). 진핵성 및 원핵성 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라서 수행한다(예를 들어, 문헌[Morrison, J. Bact . 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983)]을 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포 내로 도입하기 위한 널리 공지된 모든 과정을 사용할 수 있다. 이들 과정은 인산칼슘 트랜스펙션, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법(예를 들어, 소노포레이션(sonoporation)), 리포솜, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 에피좀성 및 통합성 둘 다의 바이러스성 벡터를 사용하는 방법, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하는 것으로 널리 공지된 기타 모든 방법을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기] 참조). 선별 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는 특정 유전자 조작 과정을 사용하는 것만이 필요하다.
식물 세포에 대한 핵산 전달
상기 주목한 바와 같이, DNA 구성체는 다양한 통상적인 기술에 의해 원하는 식물 숙주 내로(예를 들어, 원하는 식물의 게놈 내로) 도입될 수 있다. 이러한 기술에 관한 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N. Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조할 수 있다.
예를 들어, DNA 구성체는 식물 세포 원형질체의 미세주사 및 전기천공과 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 구성체는 바이오리스틱스(biolistics) 방법, 예컨대 DNA 입자 충격을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 대안으로, DNA 구성체는 나노입자 형질전환을 통하여 식물 세포 내로 도입할 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 출원 제12/245,685호를 참조할 수 있다). 대안으로, DNA 구성체는 적합한 T-DNA 경계/인접 영역과 조합되며, 이를 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환 기술(이원 벡터의 사용 및 완화(disarming) 포함)은 과학 문헌에 널리 보고되었다(예를 들어, 문헌[Horsch et al. (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조).
또한, 유전자 전이는 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 리조븀 종 NGR234, 시노리조보윰 멜리로티, 메소리조븀 로티, 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조할 수 있다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독성 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터를 이용하여 박테리아에 의해 감염되거나(Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 공동-배양 과정(Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)에 의해 감염되는 경우에, 해당 구성체 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템을 사용하여 쌍떡잎 식물을 유전자 조작한다(Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641 참조). 아그로박테리움 형질전환 시스템을 또한 사용하여, DNA를 외떡잎 식물 및 식물 세포로 전이시킬 수 있을 뿐만 아니라 형질전환시킬 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제5,591,616호; 문헌 Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol . Biol . 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol . 95:426-434]을 참조할 수 있다.
대안의 유전자 전달 및 형질전환 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)- 또는 전기천공-매개된 흡수를 통한 원형질체 형질전환(문헌[Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722; Potrykus et al. (1985) Molec . Gen . Genet . 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공(문헌 [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505] 참조)을 포함한다. 식물 세포를 형질전환시키기 위한 부가적인 방법은 미세주사, 탄화규소 매개된 DNA 흡수(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), 및 미세발사체 충격(Klein et al . (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618)이 포함된다.
개시된 방법 및 조성물은 식물 세포의 게놈에 삽입된 다중 삽입 자리에 외인성 서열을 삽입하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 이식유전자의 발현이 그의 통합 자리에 결정적으로 의존하기 때문에 유용하다. 따라서, 예를 들어 제초제 내성, 해충 저항성, 영양분, 항생제 또는 치료용 분자를 암호화하는 유전자는 표적화 재조합에 의해, 그들의 발현에 바람직한 식물 게놈 영역 내로 삽입할 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생성된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고, 따라서 목적하는 표현형을 지닌 완전 식물을 생성시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 전형적으로 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입시킨 살생제 및/또는 제초제 마커에 따라서, 조직 배양 성장 배지에서 특정의 식물 호르몬을 조작하는 것에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌[Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants , Plant Protoplasts , pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에서 설명된다. 재생은 또한, 식물 캘러스(callus), 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 얻을 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로, 문헌[Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에서 설명된다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여 거의 모든 식물에 대해 목적하는 형질을 부여할 수 있다. 본 명세서의 핵산 구성체 및 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여, 본 명세서에 기재된 목적하는 생리학적 및 농경학적 특징을 위해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 공학 처리시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 조작을 위한 표적 식물 및 식물 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 외떡잎 및 쌍떡잎 식물, 예컨대 낟알 작물(예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물(예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물(예를 들어, 알팔파), 근채류 작물(예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물(예를 들어, 상추, 시금치)을 포함한 작물; 화훼(예를 들어, 페투니아, 장미, 국화), 침엽수(conifers) 및 소나무(예를 들어, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물 환경복원에 사용된 식물(예를 들어, 중금속 축적 식물); 오일 작물(예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험용으로 사용된 식물(예를 들어, 아라비도프시스(Arabidopsis)을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캡시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리게론(Erigeron), 글라이신(Glycine), 고시퓸(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카 (Lactuca), 롤륨(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하여 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.
당업자는 외인성 서열을 유전자 이식 식물에 안정적으로 포함시키고 이것이 작동 가능하다는 것을 확인한 후에, 이를 유성 교배에 의해 기타 식물 내로 도입할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 교배하고자 하는 종에 따라서, 임의의 다수의 표준 육종 기술이 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘루스, 조직 또는 식물은 형질전환성 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 형질을 알아보기 위해, 유전자 조작한 식물 물질을 선별 또는 스크리닝함으로써 확인하고 분리할 수 있다. 예를 들어, 선별은 유전자 조작한 식물 물질을, 형질전환 유전자 구성체가 내성을 부여한 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한, 재조합 핵산 구성체 상에 존재할 수 있는 모든 가시적 마커 유전자(예: β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 C1 유전자)의 활성을 알아보기 위해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이러한 선별 및 스크리닝 방법론은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 삽입된 유전자 구성체를 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이들 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1) 재조합 DNA 삽입물의 구조를 검출하고 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구성체의 RNA 전사체를 검출하고 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 이러한 유전자 생성물이 유전자 구성체에 의해 암호화되는 경우, 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 분석; 4) 유전자 구성체 생성물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소 결합 면역분석(ELISA)을 포함한다. 부가의 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색을 또한 사용하여, 특이적 식물 기관 및 조직 내에서의 재조합 구성체의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 이들 분석 모두를 수행하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법을 이용하는 유전자 조작의 효과는, 예를 들어 관심 있는 조직으로부터 분리된 RNA(예를 들어 mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나 mRNA의 양이 증가하였다면, 대응하는 이식유전자가 발현되는 것으로 추정될 수 있다. 유전자 및/또는 암호화된 폴리펩티드 활성을 측정하는 기타 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라서, 상이한 유형의 효소적 분석을 이용할 수 있다. 또한, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 널리 공지된 기타 항체 의거 분석, 예를 들어 전기영동적 검출 분석(염색 또는 웨스턴 블롯팅을 이용함)에 의해 측정할 수 있다. 한 가지 비제한적 예로서, ELISA 분석을 이용하여 AAD-1 및 PAT 단백질을 검출하는 방법은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 출원 제11/587,893호에서 설명된다. 이식유전자는 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발생 단계에서 선별적으로 발현될 수 있거나, 또는 이식유전자는 실질적으로 그의 전체 라이프 사이클에 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 양식이 또한 적용 가능하다.
본 명세서는 또한 상기 설명한 유전자 이식 식물의 종자를 포함하되, 종자는 이식유전자 또는 유전자 구성체를 가진다. 본 명세서는 추가로, 이식유전자 또는 유전자 구성체를 가지는, 상기 언급된 유전자 이식 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 포함한다.
융합 단백질(예를 들어, ZFN) 및 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 유전자 조절, 표적화 절단 및/또는 재조합을 위해 식물에게 직접 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물은 다수의 유사 표적 유전자를 함유한다. 식물이 다수의 유사 유전자를 함유할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 하나 이상의 상이한 융합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 식물 중의 하나 이상의 Zp15 유전자(예를 들어, Zp15, PCT 특허 공개 WO2010077319를 참조)를 표적화하기 위해 식물에 투여될 수 있다.
유효량의 투여는 처리하고자 하는 식물 세포와 궁극적으로 접촉하여 융합 단백질을 이러한 식물 세포 내로 도입하기 위해 통상 사용되고 있는 임의의 경로에 의한다. ZFP는 바람직하게는 허용가능한 담체와 함께 임의의 적합한 방식을 투여된다. 이러한 조절 인자를 투여하는데 적합한 방법은 당업자에게 이용 가능하고 널리 알려져 있으며, 한 가지 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수도 있지만, 특정 경로는 종종, 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 유효한 반응을 제공할 수 있다.
담체가 사용할 수 있으며, 투여되는 특정 조성물에 의해서뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용 가능한 광범위한 적합한 담체 제형이 존재한다.
포유류 세포에 대한 전달
본 명세서에서 설명되는 ZFN은, 예를 들어 ZFN mRNA의 주입에 의하는 것을 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 표적 포유류 세포에 전달될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Hammerschmidt et al. (1999) Methods Cell Biol. 59:87-115]을 참조할 수 있다.
아연-핑거를 포함하는 단백질의 전달 방법은, 예를 들어 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에서 설명되며, 이것의 모든 개시는 그것 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서에서 설명되는 ZFN은 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 임의의 벡터 시스템은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터 등을 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 이에 대해서는, 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제 7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참조할 수 있다. 더 나아가, 임의의 이들 벡터가 서열을 암호화하는 하나 이상의 ZFN을 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 따라서, ZFN의 하나 이상의 쌍이 세포에 도입될 때, ZFN은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터를 운반한다. 다중 벡터가 사용될 때, 각 벡터는 하나 또는 다수의 ZFN을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 포유류 세포에 유전자 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 시험관 내에서 포유류 세포에 ZFP를 암호화하는 핵산을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, ZFP를 암호화하는 핵산은 생체 내 또는 생체 밖 사용을 위해 투여된다.
비바이러스 벡터 전달 시스템은 전기천공, 리포펙션(lipofection), 미세주사, 바이오리스틱스, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다양이온 또는 지질:핵산 컨주게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용물질-향상 흡수를 포함한다. 예를 들어 소니트론 2000 시스템(Sonitron 2000 system)(Rich-Mar)을 사용하는 소노포레이션이 또한 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하는데, 이는 세포에 전달 후 에피좀 또는 통합된 게놈 중 하나를 가진다. 부가적인 예시적 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(독일 쾰른시에 소재), Maxcyte, Inc.(메릴랜드주 록스빌시에 소재), BTX Molecular Delivery Systems(매사추세츠주 홀리스톤에 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc,(예를 들어 미국 제6008336호 참조)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 리포펙틴은, 예를 들어 미국 제5,049,386호, 미국 제4,946,787호; 및 미국 제4,897,355호에서 설명되며, 리포펙틴 시약은 시판된다(예를 들어, TRANSFECTAM(상표명) 및 LIPOFECTIN(상표명)). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체 인식 리포펙틴에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 그것들을 포함한다. 전달은 세포(생체 밖 투여) 또는 표적 조직(생체 내 투여)에 대한 것일 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호] 참조).
상기 주목한 바와 같이, 개시된 방법 및 조성물은 포유류 세포의 임의의 유형에서 사용될 수 있다. 단백질(예를 들어, ZFP), 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 본 명세서에서 설명되는 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 적합한 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함한다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 발생된 세포주의 비제한적 예는 COS, CHO(예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포뿐만 아니라 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera fugiperda: Sf)와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyce), 피키아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyce)를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적합한 1차 세포는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 및 다른 혈액 세포 서브셋, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 적합한 세포는 또한, 예로서 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell), 조혈모세포, 신경줄기세포 및 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)와 같은 줄기 세포를 포함한다.
실시예
실시예 1: 플라스미드 설계
실시예 1.1: eZFN 결합 자리
8개의 유전자 조작된 아연 핑거 뉴클레아제(eZFN) 결합 자리(CL:AR - 서열 번호:1, RL:PR - 서열 번호:2, AL:PR - 서열 번호:3, PL:AR - 서열 번호:4, CL:RR - 서열 번호:5, RL:CR - 서열 번호:6, CL:PR - 서열 번호:7, RL:AR - 서열 번호:8)를 각각의 eZFN 결합 자리에 대해 독특한 PCR 프라이머 자리 옆에 있는 단일 DNA 단편(다중-eZFN 결합 자리)에 결합시켰다. 추가로, 다른 eZFN 결합 자리는 다음을 포함하는 효모 내에서 높은 수준으로 절단하도록 설계하였고, 제시하였다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0111119호): PL:RR - 서열 번호:9, AL:RR - 서열 번호:10, AL:CR - 서열 번호:11, PL:CR - 서열 번호:12 및 호모다이머 eZFN’s RR:RR - 서열 번호:13, RL:RL - 서열 번호:14, PR:PR - 서열 번호:15, PL:PL - 서열 번호:16, CL:CL - 서열 번호:17, CR:CR - 서열 번호:18, AR:AR - 서열 번호:19, 및 AL:AL - 서열 번호:20. "CL" 및 "CR"은 각각 CCR5 수용체 지정 8266 및 8196에 대해 설계된 "왼편" 및 "오른편" 아연 핑거 설계를 말하는데, 이는 미국 특허 공개 제2008/0159996호에서 제시하는 서열을 가지며 거기서 제시한 표적 자리와 결합한다. "AL" 및 "AR"은 각각 AAVS1 유전자 자리 지정된 15556 및 15590에 대한 "왼편" 및 "오른편" 아연 핑거 설계를 말하며, 미국 특허 공개 제2008/0299580호에서 제시한 표적 자리와 결합한다."PL" 및 "PR" 설계뿐만 아니라 "RL" 및 "RR" 설계에 대한 인지 나선 서열 및 표적을 이하의 표 1 및 표 2에서 열거한다. PL 및 PR은 둘 다 인간 PRMT1 유전자에 특이적인 ZFN에 대한 "왼편" 및 "오른편" 아연 핑거를 말하는 한편, "RL" 및 "RR"은 마우스 Rosa26 유전자 자리에 특이적인 ZFN에 대한 "왼편" 및 "오른편" 아연 핑거 설계를 말한다.
이 표적 자리 중 어떤 것도 생물정보학 분석에 의해 측정되는 옥수수 게놈에 존재하지 않았다. eZFN에 의해 염색체로 위치된 DNA 단편의 2중 가닥 절단으로부터 초래되는 NHEJ의 평가를 위해 PCR 프라이머 자리를 포함시켰다.
Figure 112012066990186-pct00001
Figure 112012066990186-pct00002
부착 자리를 합성 DNA 단편에 포함시켰고, 단편을 TOPO 클로닝(캘리포니아 칼즈배드시에 소재한 Invitrogen)을 사용하여 플라스미드에 클로닝하였다. Gateway LR CLONASE(상표명)(Invitrogen) 반응을 사용하여 이 단편을 pDAB101834 및 pDAB101849에 전달하였다. 이 벡터는 각각 담배 및 옥수수에 적합한 선별가능한 마커를 함유한다. pDAB101834는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터(Cassava Vein Mosaic Virus promoter: CsVMV 프로모터 및 카사바 잎맥 모자이크로부터 유래된 5' 불포화 영역 ; Verdaguer et al., (1996) Plant Molecular Biology, 31(6) 1129-1139), 포스피노드리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(PAT; Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1), 25-37) 및 AtuORF1 3’ UTR(아그로박테리움 투메파시엔스 pTi15955의 오픈 리딩 프레임 1(ORF1)의 전사 종결자 및 폴리아데닐화 자리를 포함하는 3' 미번역 영역(UTR); Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology, 2(6), 335-50)을 포함한다. 옥수수 pDAB101849 벡터는 벼 액틴 1 유전자 프로모터(OsAct1; 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 및 벼(Oryza sativa) 액틴 1(Act1) 유전자로부터 유래된 인트론; McElroy et al., (1990) Plant Cell 2(2):163-71) 및 전사 종결자 및 옥수수 전분(Zea mays) 유전자의 전사 종결자 및 폴리아데닐화 자리를 포함하는 3' 미번역 영역(UTR); GenBank accession L35913)를 포함하는 선별가능한 마커 카세트를 포함한다.
결과 담배 벡터, pDAB105900(도 7)을 전기천공법을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스에 전달하였다. 제한 효소 확인 후, 아그로박테리움을 사용할 때까지 글라이세롤 저장액으로 저장하였다. 옥수수 벡터, pDAB105908(도 8)를 벌크화하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라서 Qiagen QIAfilter Plasmid Giga 키트(캘리포니아주 발렌시아시에 소재한 Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
실시예 1.2: eZFN 을 발현시키기 위한 벡터
정규(C2H2) 또는 비정규(C3H) 백본 중 하나에서 적절한 인지 나선을 발현시키는 ZFN 벡터를 본질적으로 미국 특허 공개 제2008/0182332호 및 제2008/0159996호에서 설명한 바와 같이 제조하였다.
ZFN의 기능을 효모 ZFN 스크리닝 시스템에 삽입한 실시예 1.1에서 설명한 eZFN 다중 삽입 자리 상에서 시험하였다(미국 특허 공개 제2009/0111119호를 참조). 시험한 모든 ZFN 쌍은 효모 시스템에서 활성이었다.
8개의 eZFN을 식물 세포 내 발현에 필요한 조절 서열을 함유하는 벡터에 클로닝한다. 구성체에 대해 사용한 클로닝 전략은 미국 특허 제2009/0111188A1호 및 제20100199389호에서 본질적으로 설명된 바와 같다. 도 9 및 도 10은 발생된 eZFN 발현 카세트의 개략도를 보여준다.
실시예 2: 옥수수에서 eZFN 의 평가
실시예 2.1: WHISKERS (상표명)-매개 DNA 전달
옥수수의 배 형성 Hi-II 세포 배양물을 만들었고, 통합이 입증된 살아있는 식물 세포의 공급원으로 사용하였다. 당업자는 다양한 식물 종으로부터 유래된 세포 배양물, 또는 통합이 입증된 살아있는 식물 세포의 공급원으로서 다양한 식물종으로부터 유래된 분화된 식물 조직의 이용을 생각할 수 있다.
이 실시예에서, PAT 식물 선별가능한 마커 카세트 및 다중-eZFN 결합 자리 삽입 서열을 함유하는 플라스미드를 (pDAB105908) 유전자 이식 사건을 만들기 위해 사용하였다. 유전자 이식 분리물을 eZFN과 함께 형질전환하여 이중가닥 절단을 평가하였다.
특히, 이전에 동결보존한 세포로부터의 12㎖ 압축세포용적(packed cell volume, PCV) + 28㎖의 조건화 배지를 500㎖ 삼각플라스크 중에서 80㎖의 GN6 액체 배지(N6 배지(Chu et al. (1975) Scientia Sin 18:659-668), 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, pH 5.8)로 서브클로닝하였고, 125 rpm 28℃에서 진탕기 상에 두었다. 총 36㎖ PCV가 3개의 플라스크 전체에 분포되도록 이 단계를 동일한 세포주를 사용하여 2회 반복하였다. 24시간 후, GN6 액체 배지를 제거하였고, 72㎖ GN6 S/M 삼투압 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 45.5 g/ℓ 소르비톨, 45.5 g/ℓ 만니톨, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, pH 6.0)로 대체하였다. 플라스크를 중간으로 교반하면서(125 rpm) 30-35분 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 동안, 405㎎의 멸균 탄화규소 위스커에 8.1㎖의 GN6 S/M 액체 배지를 첨가함으로써 50 ㎎/㎖의 탄화규소 위스커(사우스 캐롤라이나주 그리어시에 소재한 Advanced Composite Materials, LLC)를 제조하였다.
GN6 S/M 삼투압 배지에서 인큐베이션 후, 각 플라스크의 내용물을 250㎖ 원심분리 보틀에 모았다. 플라스크 내 모든 세포를 바닥에 가라앉힌 후, 대략 14㎖의 GN6 S/M 액체의 과량인 수용용적을 회수하였고, 장래 사용을 위해 멸균 1ℓ 플라스크에서 수집하였다. 사전에 적신 위스커의 현탁액을 60초 동안 최대 교반 속도로 혼합한 다음, 원심분리 보틀에 첨가하였다.
이 실시예에서, pDAB105908 플라스미드 DNA로부터 170㎍의 정제한 단편을 각 보틀에 첨가하였다. 일단 DNA를 첨가하면, 보틀을 변형된 Red Devil 5400 상업적 페이트 믹서(미국 미네소타주 플리머스시에 소재한 Red Devil Equipment Co.)에 즉시 두었고, 10초 동안 교반하였다. 교반 후, 세포, 배지, 위스커 및 DNA의 칵테일을 125㎖ 신선한 GN6 액체 배지와 함께 1ℓ 플라스크의 내용물에 첨가하여 삼투성을 감소시켰다. 2시간 동안 125 rpm으로 설정한 진탕기로부터 세포를 회수하였다. 덮개 진공배관에 연결된 유리 세포 수집기 단위를 사용하여 6㎖의 분산 현탁액을 Whatman #4 필터 페이퍼(5.5㎝) 상에서 여과하여, 보틀 당 60 필터를 얻었다. 필터를 GN6 고체 배지의 60×20㎜에 두었고(2.5 g/ℓ 겔라이트 겔화제(Gelrite gelling agent)를 제외하고 GN6 액체 배지와 동일), 1주일 동안 어두운 조건 하에 28℃에서 배양하였다.
실시예 2.2: 추정적 유전자 이식 사건의 확인 및 분리
DNA 전달 1주일 후, 필터 페이퍼를 선별제를 함유하는 GN6(1H) 선별 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2, 4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 2.5 g/ℓ 겔라이트(Gelrite), pH 5.8)의 60x20㎜ 플레이트에 옮겼다. 이 선별 플레이트를 어둠 속에서 1주일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 어둠 속에서 선별의 1주일 후, 37-38℃에서 보유된 3.0㎖의 GN6 아가로스 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2, 4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 7 g/ℓ SeaPlaque 아가로스, pH 5.8, 121℃에서 단지 10분 동안 오토클레이브)를 함유하는 튜브에 각 플레이트로부터의 세포의 절반을 스크레이핑함으로써 조직을 신선한 배지에 포매(embed)시켰다.
아가로스/조직 혼합물을 스패출러로 부수었고, 후속하여 3㎖의 아가로스/조직 혼합물을 GN6(1H) 배지를 함유하는 100×15㎜ 페트리 접시의 표면에 균일하게 부었다. 이 과정을 각 플레이트의 양 절반에 대해 반복하였다. 일단 모든 조직이 포매되면, 플레이트를 NESCOFILM(등록상표) 또는 PARAFILM M(등록상표)로 개개로 밀봉하였고, 10주까지 어두운 조건 하에 28℃에서 배양하였다.
이 선별 조건하에 성장시킨 추정적으로 형질전환된 분리물을 포매된 플레이트로부터 제거하였고, 60×20㎜ 플레이트 내 신선한 선별 배지에 옮겼다. 대략 2주 후 지연된 성장이 명확하다면, 사건은 도포된 제초제(선별제)에 저항성인 것으로 여겨지며, 세포의 알리쿼트는 후속하여 유전자형 분석을 위해 채집하였다.
실시예 2.3: 게놈 DNA 추출
게놈 DNA(gDNA)를 실시예 2.2에서 설명한 바와 같은 분리한 옥수수 세포로부터 추출하였고, PCR 게놈형 실험을 위한 주형으로 이용하였다. DNeasy 96 식물 키트(캘리포니아주 발렌시아시에 소재한 QIAGEN Inc.)에서 상술된 제조업자의 프로토콜에 따라서 상기 설명한 바와 같이 분리한 Hi-II 캘러스의 대략 100-300㎕ 압축세포용적(PCV)으로부터 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA를 100㎕의 키트 공급 용리 완충제 중에서 용리하여 20-200 ng/㎕의 최종 농도를 얻었고, 후속하여 이하에 약술하는 PCR-기반 지노타이핑(genotyping) 방법을 통해 분석하였다.
실시예 2.4: 복제 수의 분자 분석
pDAB105908 이식유전자의 단일 복제 통합을 함유한 것을 확인하기 위해서 캘러스에 저항성인 제초제 샘플 스크리닝을 TAQMAN(등록상표)로 수행하였다. 유전자 발현 카세트에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 상술한 분석을 수행하였다. 추가 분석을 위해 단일 복제 사건을 확인하였다.
Third Wave Technologies(위스콘신주 메디슨시에 소재)에 의해 Hi-II 캘러스 내 PAT 유전자 분석에 대해 Custom TAQMAN(등록상표) 분석을 진행하였다. 게놈 DNA 샘플을 95℃에서 인큐베이션에 의해 96-웰 플레이트 포맷으로 우선 변성시킨 다음, 주위 온도로 냉각시켰다. 다음에, 마스터 믹스(master mix)(완충제에 더하여 PAT에 대해 프로브 믹스 및 내부 기준 유전자를 함유)를 각 웰에 첨가하였고, 샘플을 광유를 가하였다. 플레이트를 밀봉하였고 BioRad TETRAD(등록상표) 서모사이클러(thermocycler) 중에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 주위 온도로 냉각시킨 후, 형광 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 모든 플레이트는 1복제, 2복제 및 4복제 표준뿐만 아니라 야생형 대조군 샘플 및 샘플을 함유하지 않는 블랭크 웰을 함유하였다. 판독을 수집하였고, 각 채널에 대한 폴드오버 0(즉, 배경)과 비교하였고, 샘플 원 신호(raw signal)를 주형이 없는 원 신호로 나눔으로써 결정하였다.
이 데이터로부터 표준 곡선을 구성하였고, 선형 회귀 분석에 의해 최고 적합성을 결정하였다. 이 적합성으로부터 확인한 변수를 사용하여, 다음으로 명백한 PAT 복제 수를 각 샘플에 대해 측정하였다.
실시예 2.5: PCR 지노타이핑에 대한 프라이머 설계
이 실시예에서, PCR 지노타이핑은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 게놈 내에 포매된 도너 DNA를 함유하는 것으로 예측된 분리 옥수수 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 다음으로 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하는 것으로 이해된다. PCR 지노타이핑 방법은 잘 설명되어 있고(예를 들어, 문헌[Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-253]), 세포 배양물을 포함하는 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
당업자는(이에 제한되는 것은 아니지만) 식물 게놈 내 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내 다중 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내 비특이적 서열의 증폭, 또는 이들의 조합을 포함하는 PCR-지노타이핑에 대한 전략을 생각할 수 있다. 증폭 후에는 이 실시예에서 설명되는 바와 같은 클로닝 및 시퀀싱 또는 증폭 생성물의 직접 서열 분석이 있을 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 생성된 증폭 생성물의 대안의 분석 방법을 생각할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 한 구체예에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR 증폭에 사용된다.
본 명세서에 제공되는 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표준 탈염 조건 하에, 예를 들어 Integrated DNA Technologies, Inc.(아이오와주 코랄빌시에 소재)에 의해 합성하고, 100 μM의 농도로 물에 의해 희석하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 DNA 삽입의 옆에 있는 영역으로 어닐링하도록 설계하였다. 비유전자이식 식물로부터 분리한 DNA의 존재에서 플라스미드 DNA의 희석을 사용하여 프라이머를 설계하였다. pDAB105908 이식유전자를 프라이머를 사용하는 추정적 사건의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 결과 단편을 플라스미드 벡터로 클로닝하였고, 시퀀싱하여 다중-eZFN 결합 자리 서열이 형질전환 동안 식물 게놈에 완전히 통합된다는 것을 확인하였다.
실시예 2.6: 표적 DNA 에 의한 유전자 이식 사건의 선별
저 복제(1-2) 사건을 무결함 다중-eZFN 결합 자리 및 PAT 유전자에 대한 PCR에 의해 스크리닝하였다. 복제 수를 PAT 유전자 프로브에 의한 표준 방법을 사용하여 서던 분석에 의해 확인하였다. 일시적으로 발현된 eZFN이 있는 이후의 평가를 위해 단일 복제물을 품고 있는 선별된 유전자 이식 사건으로부터의 캘러스, 무결함 삽입물을 유지하였다.
실시예 3: 식물 세포에 eZFN DNA 전달
eZFN-매개 2중 가닥 절단을 가능하게 하기 위하여, eZFN-암호화 DNA의 전달 후 식물 세포 내 기능적 eZFN 단백질이 필요하다는 것이 이해된다. 당업자는 기능적 ZFN 단백질의 발현은, 제한되는 것은 아니지만, ZFN-암호화 구성의 유전자 이식, 또는 ZFN-암호화 구성의 일시적 발현을 포함하는, 몇몇 방법에 의해 달성될 수 있다는 것을 생각할 수 있다.
본 명세서에서 인용되는 실시예에서, 방법은 식물 세포에 eZFN-암호화 DNA의 전달을 위해 설명된다. 당업자는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아그로박테리움 매개 형질전환, 바이오리스틱스 기반 DNA 전달 또는 WHISKERS(상표명)-매개 DNA 전달을 포함하는 식물 세포에 적절한 임의의 다양한 DNA 전달 방법을 사용할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 한 구체예에서, 바이오리스틱스 매개 DNA 전달 실험을 다양한 eZFN-암호화 DNA 구성을 사용하여 수행하였다.
실시예 3.1: 바이오리스틱 -매개 DNA 전달
상기 설명한 바와 같은, 옥수수의 배 발생 Hi-II 세포 배양물을 생성하였고, eZFN 기능에 대한 살아있는 식물의 공급원으로 사용하였다. 당업자는 표적화된 통합이 입증된 살아있는 식물 세포의 공급원으로서 다양한 식물 종으로부터 유래된 세포 배양물, 또는 다양한 식물 종으로부터 유래된 분화된 식물 조직의 이용을 생각할 수 있다.
내부 대조군(IPK-1)과 함께 다중-eZFN 결합 자리 상에서 특이적 표적 서열에 결합하는 8개의 eZFN 중 하나를 발현시키는 플라스미드를 5-10 유전자 이식 분리물로부터 캘러스의 풀(pool)에 충격을 가하였다.
유전자이식 Hi-II 옥수수 캘러스 사건을 GN6(1H) 배지 상에서 매주 2차 배양하였다. 배양 후 7일에, 대량 400㎎의 세포를 2.5 g/ℓ 겔라이트로 고형화한 GN6 S/M 배지를 함유하는 100x15㎜ 페트리 접시의 중각에 걸쳐 직경 2.5 ㎝ 원으로 얇게 펼쳤다. 세포를 4시간 동안 어둠 하에 배양하였다. 바이오리스틱 입자를 DNA로 코팅하기 위해서, 3㎎의 0.6 마이크론 직경 금 입자를 100% 에탄올로 1회, 멸균 증류수로 2회 세척하였고, 실리콘 처리한 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내 50㎕ 중에서 재현탁하였다. 총 5㎍의 플라스미드 DNA, 20㎕ 스페르미딘(0.1 M) 및 50㎕ 염화칼슘(2.5M)을 금 현탁액에 개별적으로 첨가하였고, 교반하면서 부드럽게 혼합하였다. 혼합물을 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 10초 동안 벤치탑 마이크로원심분리기에서 10,000 rpm으로 펠렛화하였으며, 60㎕ 차가운 100% 에탄올 중에서 재현탁하였고, 8-9㎕를 각 거대 담체에 분포시켰다.
Biolistic PDS-1000/HE(상표명) 시스템(캘리포니아주 허큘러스시에 소재한 Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 충격(Bombardment)을 수행하였다. 세포를 함유하는 플레이트를 1100 psi 및 27인치의 Hg 진공 조건 하에서 중간 선반에 두었고, 조작 매뉴얼에 따라서 충격을 가하였다. 충격 후 24시간에, 조직을 GN6 고체 배지에 대해 작은 클럼프로 옮겼다.
실시예 4: Solexa 시퀀싱 및 분석
실시예 4.1: 샘플 제조
eZFN 및 대조군 IPK1-ZFN(Shukla et al. (1990) Nature 459, 437-441)으로 충격 후 72시간에, 조직을 2㎖ 마이크로 튜브(microfuge tube)에서 수집하였고, 적어도 48시간 동안 동결건조시켰다. QIAGEN(등록상표)gDNA 추출 키트를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라서 게놈 DNA를 동결건조 조직으로부터 추출하였다. 최종적으로, DNA를 200㎕ 물에서 재현탁시켰고, Nanodrop spectrophotometer(델라웨어주 윌밍턴시에 소재한 Thermo Scientific)를 사용하여 농도를 결정하였다. DNA의 통합을 0.8% 아가로스 E-겔(캘리포니아주 칼즈배드시에 소재한 Invitrogen) 상의 모든 샘플을 실행함으로써 측정하였다. 모든 샘플을 PCR 증폭에 대해 정규화하여(25 ng/㎕) Solexa 시퀀싱에 대한 앰플리콘을 만들었다.
표적화(ZFN-처리군) 및 대조군 샘플로부터 eZFN 절단 자리뿐만 아니라 IPK1-ZFN 표적 자리 각각을 포함하는 영역의 증폭을 위한 PCR 프라이머를 IDT(캘리포니아주 산호세시에 소재한 Integrated DNA Technologies)로부터 구입하였다. 이 프라이머에 대한 최적 증폭 조건을 0.2 μM 적절한 프라이머를 사용하는 구배 PCR, Accuprime Pfx Supermix(1.1X, 캘리포니아주 칼즈베드시에 소재한 Invitrogen) 및 23.5㎕ 반응에서 100 ng의 주형 게놈 DNA에 의해 확인하였다. 고리화 변수는 95°(5 분)에서 초기 변성 후 35주기의 변성(95℃, 15 초), 어닐링[55-72℃, 30 초], 연장(68℃, 1 분) 및 최종 연장(72℃, 7 분)을 포함한다. 증폭 생성물을 3.5% TAE 아가로스 겔에서 분석하였다. 최적의 어닐링 온도를 확인한 후, 분취 PCR 반응을 수행하여 PCR 프라이머의 각 세트의 입증을 수행하였고 Solexa 앰플리콘을 발생시켰다. 옥수수 및 담배 중의 eZFN 표적 영역의 증폭을 위해 사용한 올리고뉴클레오티드를 이하의 표 3에서 나타낸다. 프라이머(서열 번호: 27 GCAGTGCATGTTATGAGC(전방 프라이머) 및 서열 번호: 28 CAGGACATAAATGAACTGAATC(역 프라이머))를 사용하여 IPK1 표적 영역을 증폭시켰다.
Figure 112012066990186-pct00003
분취 PCR에 대해, 8-개개의 작은 스케일 PCR 반응을 상기 설명한 조건을 사용하여 각 주형에 대해 완료하였고, 생성물을 함께 모으고, Qiagen MinElute(상표명) 겔 정제 키트를 사용하여 3.5% 아가로스 겔 상에서 겔을 정제하였다. 겔 정제한 앰플리콘의 농도를 Nanodrop 분광광도계를 사용하여 결정하였고, 표적화된 eZFN로부터의 대략 100 ng 앰플리콘 및 대응하는 야생형 대조군뿐만 아니라 표적화된 정규화 IPK-1 및 야생형 대조군을 모으는 것에 의해 Solexa 샘플을 제조하였다. eZFN+IPK-1 표적화된 샘플, IPK-1 표적화된 샘플 및 야생형 대조군으로부터 앰플리콘을 포함하는 4개의 최종 Solexa 샘플을 만들었고 시퀀싱하였다. 앰플리콘을 PCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)로 클로닝하였고, 시퀀싱을 위해 제출하여 Solexa 시퀀싱 전 프라이머를 입증하였다.
실시예 4.2: Solexa 시퀀싱 및 분석
Solexa 시퀀싱은 수천개의 서열 생산을 초래하였다. DAS Next Generation Sequence(NGS) 분석 스크립트를 사용하여 서열을 분석하였다. 저 품질 서열(5미만의 품질 스코어 컷오프를 가지는 서열)을 여과하였다. 다음으로 서열을 기준 서열과 나란히 하였고, ZFN-매개 절단 및 NHEJ 매개 보수에 의해 야기된 ZFN 절단 자리에서 삽입/결실(Indel)에 대해 스코어링 하였으며, 이는 종종 ZFN 활성을 나타내는 삽입/결실을 야기한다. 배경 활성을 차감한 후 ZFN 단백질에 대한 결합 자리 사이의 "갭" 서열 내 하나의 bp 보다 더 큰 결실 수에 의해 에디팅 활성을 결정하였다. 연구에서 각 eZFN에 대한 활성을 야생형 대조군과 비교하여 계산하였고, IPK-1 ZFN 활성에 대해 정규화하였다. 각 eZFN에 대해 정규화된 활성을 비교하여 연구에서 사용한 eZFN을 랭크하였다. 또한 활성을 eZFN 절단 자리에서 서열 배열 수준(Solexa 생산량과 비교에 대해)에서 삽입/결실의 존재에 의해 평가하였다
도 11에서 나타내는 바와 같이, 8개의 eZFN 중 7개는 옥수수에서 에디팅 활성을 나타낸다.
실시예 5: 담배에서 eZFN 의 평가
실시예 5.1: 다중- eZFN 결합 자리 서열의 안정한 통합
본 명세서에서 상기 설명한 다중 eZFN 결합 자리 서열의 통합된 복제를 가지는 유전자 이식 식물 사건을 만들기 위하여, 쁘띠 하바나(Petit Havana) 담배 식물(예를 들어, 이전에 통합한 ZFN-IL1 결합 자리를 함유하는 사건 1585-10)로부터 절단하고, MS 배지(Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) 및 PhytaTrays(Sigma, St. Louis, MO) 내 30 g/ℓ 수크로스 상에서 무균으로 성장시킨 잎 원판(disk)(1 cm2)을 OD600 ~1.2로 성장시킨 플라스미드 pDAB105900를 품고 있는 아그로박테리움 LBA4404의 배양물을 밤새 플롯팅하였고, 멸균 필터 페이퍼 상의 건조물을 닦아낸 다음, 60×20 mm 접시(접시 당 5 원판)에서 1 ㎎/ℓ 인돌아세트산 및 1 ㎎/ℓ 벤즈아미노 퓨린의 첨가와 함께 동일한 배지에 두었다. 72시간의 공동 배양 후, 잎 원판을 250 ㎎/ℓ 세포탁심 및 5 ㎎/ℓ BASTA(등록상표)와 함께 동일 배지로 옮겼다. 3-4주 후, PhytaTray에서 추가 2-3주 동안 250 ㎎/ℓ 세포탁심 및 10 ㎎/ℓ BASTA(등록상표)가 있는 MS 배지에 소식물체(plantlet)를 옮긴 후, 식물을 채집하였고, 분자 분석을 하였다.
실시예 5.2: 다중- eZFN 결합 자리 서열 유전자 이식 사건의 복제 수 및 PTU 분석
DNA 분리. 유전자 이식 담배 식물 조직을 BASTA(등록상표)-저항성 소식물체로부터 채집하였고, 96-웰 수집 플레이트에서 적어도 2일 동안 동결건조시켰다. 다음으로 제조업자의 설명서에 따라서 DNEASY(상표명) 96 웰 추출 키트(캘리포니아주 발렌시아시에 소재한 Qiagen)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 조직 파쇄를 위해 모델 2-96A Kleco 조직 미분쇄기(캘리포니아주 비세일리아시에 소재한 Garcia Manufacturing)를 사용하였다.
DNA 정량화. 결과 게놈 DNA를 QUANT-IT(등록상표) Pico Green DNA 분석 키트(캘리포니아주 칼즈베드시에 소재한 Molecular Probes, Invitrogen)를 사용하여 정량화하였다. 20 ng/㎕ 내지 1.25 ng/㎕(단계 희석)의 범위에 있는 5개의 사전 정량화한 DNA 표준을 표준 곡선 생성을 위해 사용하였다. 미지 샘플을 선형 범위의 분석 내에 있도록 1:10 또는 1:20 희석으로 우선 희석하였다. 5㎕의 희석 샘플 및 표준을 100㎕의 희석 Pico Green 기질(1:200)과 혼합하였고, 어둠 속에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로 Synergy2 플레이트 판독기(버몬트주 위누스키시에 소재한 Biotek)를 사용하여 형광을 기록하였다. 게놈 DNA 농도를 배경 형광 보정 후 계산한 표준 곡선으로부터 측정하였다. TE 또는 물을 사용한 다음, Biorobot3000 자동 액체 핸들러(Qiagen)를 사용하여 DNA를 10 ng/㎕의 통상의 농도로 희석하였다.
복제 수 추정. TAQMAN(등록상표) 분석과 유사한 DNA 가수분해 프로브 분석을 사용하여 추정적 유전자 이식 사건을 통합 복잡화에 대해 분석하였다. 다중 자리 구성체의 복제 수를 서열 특이적 프라이머 및 PAT 유전자이식 및 내인성 담배 기준 유전자 둘 다에 대한 프로브, PAL를 사용하여 추정하였다. 유전자 둘 다에 대한 분석을 LIGHTCYCLER(등록상표) 프로브 설계 소프트웨어(Probe Design Software) 2.0을 사용하여 설계하였다. 유전자 둘 다에 대한 실시간 PCR을 LIGHTCYCLER(등록상표)480 시스템(인디애나주 인디아나폴리스시에 소재한 Roche Applied ScienceN)을 사용하여 평가하였다. 증폭을 위해, LIGHTCYCLER(등록상표)480 Probes Master 혼합물을 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브(이하의 표 4)를 함유하는 10㎕ 부피 멀티플렉스 반응 중에서 1X 최종 농도로 제조하였다. 2단계 증폭 반응을 형광성 획득과 함께 38초 동안 58℃에서 연장으로 수행한다. 모든 샘플을 3회 실행하였고, 평균한 Ct 값을 각 샘플의 분석을 위해 사용하였다. 실시간 PCR 데이터의 분석을 상대적 양자 모듈을 사용하는 LIGHTCYCLER(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 이는 ΔΔCt 방법을 기반으로 하였다. 이를 위해, 단일 복제 캘리브레이트로부터의 gDNA 샘플을 포함시켜 결과를 정규화하였다. 단일 복제 캘리브레이트 사건을 서던 분석에 의해 확인하였고, PAT 유전자의 단일 삽입을 가진다는 것을 확인하였다.
Figure 112012066990186-pct00004
PCR . 낮은 복제(1-2)사건을 후속하여 PAT 유전자에 대한 무결함 식물 전사 단위(PTU) 및 무결함 다중-eZFN 결합 자리에 대해 PCR에 의해 스크리닝하였다.
실시예 6: 다중- eZFN 결합 자리 서열에서 eZFN 절단의 시험
통합된 다중-eZFN 결합 자리 서열에서 표적화된 절단을 촉진하기 위한 eZFN의 능력을 시험하기 위해, 유전자 이식 담배 잎 원판의 아그로박테리움 공동 배양을 통해 eZFN-구성체의 일과적 발현(transient expression)을 기반으로 한 일과성 분석을 사용하였다. 다중-eZFN 결합 자리 서열 함유 구성체의 단일, 전장 복제(뿐만 아니라 ZFN-IL1 구성체의 단일, 전장 복제)를 함유하는 일과성 사건으로부터 절단한 잎 원판(1 cm2)을 OD600 ~1.2에서 성장시킨 아그로박테리움 배양물상에서 밤새 플로팅하였고, 멸균 필터 페이퍼 상에서 건조물을 닦아낸 다음 1 ㎎/ℓ 인돌아세트산 및 1 ㎎/ℓ 벤지아미노 퓨린의 첨가와 함께 동일 배지에 두었다. 시험한 각 eZFN에 대해, 3개의 처리군을 사용하였다: 처리군 당 20개의 잎 원판이 있는 pDAB1601(음성 대조군 - 단지 PAT), pDAB4346 단지(양성 대조군 - 단지 ZFN-IL1) 및 pDAB4346 + pDABeZFN-X(ZFN-IL1 + 시험한 eZFN).
실시예 6.1: 서열 분석
Qiagen DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA를 아그로박테리움처리한, 유전자 이식 담배 잎 원판으로부터 분리하였다. 모든 처리를 2회하였고, 모든 샘플로부터의 게놈 DNA를 100㎕의 물 중에서 재현탁하였고, 농축물을 Nanodrop에 의해 결정하였다. 개개의 처리군에 대해 각 복제물로부터 동일 양의 게놈 DNA를 함께 모았고, Solexa 앰플리콘 생성을 위한 출발 주형으로서 사용하였다.
표적화된(eZFN-처리된) 및 대조군 샘플로부터 다중-eZFN 결합 자리 서열 및 절단 자리를 포함하는 영역의 증폭을 위한 PCR 프라이머는 Integrated DNA Technologies(아이오와주 코랄빌시에 소재)로부터 얻었고, HPLC 정제하였다. 0.2 μM의 적절한 프라이머, Accuprime Pfx Supermix(1.1x, 캘리포니아주 칼즈베드시에 소재한 Invitrogen) 및 100 ng의 주형 게놈 DNA를 23.5㎕ 반응으로 사용하는 구배 PCR에 의해 최적의 증폭 조건을 확인하였다. 고리화 변수를 95°(5분)에서 초기 변성 후 35주기의 변성(95℃, 15초), 어닐링[55-72℃, 30초], 연장(68℃, 1분) 및 최종 연장(72℃, 7분)하였다. 증폭 생성물을 3.5% TAE 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 최적 어닐링 온도(56.1℃)를 확인한 후, 분취 PCR 반응을 수행하여 PCR 프라이머의 각 설정 및 Solexa 앰플리콘의 발생에 대해 입증하였다.
분취 PCR에 대해, 8-개개의 소규모 PCR 반응을 상기 설명한 조건을 사용하여 각 주형에 대해 행하였고, 생성물을 함께 모으고, Qiagen MinElute 겔 정제 키트를 사용하여 3.5% 아가로스 겔 상에서 겔 정제하였다. 겔 정제한 앰플리콘의 농도를 Nanodrop 분광광도계를 사용하여 결정하였고, 대략 200 ng의 각 앰플리콘을 함께 모아서 최종 Solexa 시퀀싱 샘플(800 ng 총 샘플)을 제조하였다. 앰플리콘을 또한 PCR-Blunt II-TOPO로 클로닝하였고, 보통의 시퀀싱을 위해 제출하여 Solexa 시퀀싱 전 프라이머를 입증하였다. Solexa 분석(Shendure et al. (2008) Nat. Biotechnology, 26: 1135-1145)을 수행하였고, 서열을 분석하였다.
실시예 6.2: Solexa 시퀀싱 및 분석
Solexa 시퀀싱을 수행하여 수천 개의 서열 생산을 초래하였다. DAS NGS 분석 스크립트를 사용하여 서열을 분석하였다. 낮은 품질의 서열(5미만의 품질 스코어 컷오프를 가지는 서열)을 여과하였다. 다음으로 서열을 기준 서열(다중-eZFN 결합 자리를 함유하는 pDAB105900)과 함께 배열하였고, 절단 자리에서 삽입/결실(Indel)을 위해 저장하였다. 각 eZFN 및 미처리 대조군에 대한 에디팅 활성(%NHEJ)을 계산하였고(삽입/결실이 있는 고품질 서열의 수/고품질 서열의 총 수×100), 이하의 도 12에서 나타낸다. 2개의 유전자 이식 담배 사건에서 8-eZFN의 활성(105900/#33 및 105900/#45)을 증명하였다(도 12). 8개의 8-eZFN 중 3개는 시험한 2개의 유전자 이식 담배 사건에서 활성이었다. 또한 eZFN 처리 샘플 내 eZFN 절단 자리에서 삽입/결실의 존재에 의해 서열 배열 수준(기준 대 solexa 산출량)에서 활성을 평가하였다.
ZFN 모노머("오른쪽" 및 "왼쪽") 하프의 모든 조합은 효모 분석에서 활성이었다. 옥수수 및 담배 실험을 위해 설명한 데이터는 일부 또는 대부분의 조합이 식물에서 활성이라는 것을 증명하며, 이는 연구로부터 선별된 4개의 본래 ZFN으로부터 2개의 ZFN 모노머의 치환의 유효 숫자를 사용하는 것의 가능성을 지지한다.
실시예 7: 대립유전자 내 재조합
대립유전자 내 재조합은 이식유전자의 2개의 독립적 블록의 발생 및 최적화를 허용하는데, 이는 다음으로 재조합에 의해 하나의 유전자 자리에서 함께 집적될 수 있다. 2개의 블록 사이의 재조합 수준을 향상시키기 위해, 2중 가닥 절단은 유전자 변환 또는 염색분체 교환에 의한 DNA 교환을 개시한다.
식물 내에서 이 개념을 증명하기 위하여, 도 13에서 예시한 유전자 이식 삽입물을 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 만든다. 구성체는 선별가능한 마커(네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPTII)) 또는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT) 및 점수화가능한 마커(β-글루쿠로니다제(GUS) 또는 황색 형광 단백질(YFP))를 함유하는 유전자 블록을 포함한다. 이 유전자 블록들은 동일한 게놈 위치에 있지만, 서로 대략 2 kb 떨어져 있다. 2개 블록사이의 재조합은 교배에 의해 단일 식물에 각각 2개의 블록을 운반하는 염색체를 조합함으로써 수행된 다음, 2개 블록 사이의 위치 중앙에서 절단하는 ZFN을 발현시키는 식물에 대한 자손을 재교배함으로써 수행된다(도 13에서 MIS 위쪽의 검정색 바). 감수분열 특이적/바람직한 프로모터를 사용하여 ZFN을 발현시켰다. 사용한 랜딩 패드 서열은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제61/297,641호에서 설명되는 것을 포함한다.
동일한 게놈 위치에서 독립적 블록을 만들기 위해, 연속적 배열로 블록을 둘 다 포함하여 구성체를 만들었다(도 14). 독립적 블록을 단독으로 운반하는 식물을 만들기 위해, 각 블록을 설계한 ZFN을 사용하는 별개의 교배로 절제하여 대응하는 ZFN 결합 자리(적색 및 파란색 바)에서 각 블록의 측면 중 하나에서 DNA를 절제한다. 도 15는 적절한 주(ZFN을 발현시키는 애기장대)의 교배 후, 블록이 절단되고 단일 블록 삽입물을 만드는 것을 도시한다. 이 주는 선별가능한 마커로서 PAT 유전자를 운반한다. 예상된 표현형(HygR+, KanR-, PAT+, YFP+ 또는 KanR+, HygR-, PAT+, GUS+)을 가지는 식물의 회수를 표현현 스크리닝을 통해(HygR, KanR 및 PAT 유전자에 저항성인 제초제 또는 GUS 및 YFP의 점수화 가능한 마커 유전자 발현) 또는 PCR 및 서던과 같은 분자 분석에 의해 확인하였다. 2개의 상이한 블록 중 하나를 운반하는 식물을 교배시켜 HygR+, KanR+, PAT-, GUS+, YFP+ 자손을 발생시켰다.
결과 식물의 분자 특징화 후, 확인한 삽입물을 가지는 식물을 감수분열 특이적 프로모터를 사용하여 2개의 블록 사이에 위치시킨 결합 자리의 ZFN을 발현시키는 주와 교배시켜 DNA의 교환을 달성한다. 이는 하나의 DNA 위치에서 함께 2개의 블록의 집적을 초래한다. 최종 집적 유전자 식물은 단일, 분리 유전자 자리로서 HygR+, KanR+, GUS+, YFP+ 배치를 수행한다. 대안으로, 블록 중 하나를 함유하는 식물을 감수분열 프로모터/ZFN 구성체, 얻은 2개의 삽입물에 동형접합적 식물을 포함하는 2개의 모노머 중 하나와 교배시킨 다음, 함께 교배시켰다.
실시예 7.1: DNA 구성체
ZFN 구성체의 구성을 위해 사용한 클로닝 전략은 미국 특허 공개 제2009/0111188A1호 및 제 2010/0199389호에서 본질적으로 설명한 것과 같다. 도 9는 예시적인 eZFN 발현 카세트를 도시한다. ZFN 암호화 서열을 ZmUbi1 프로모터를 사용하여 발현시켰다(프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 및 Zea로부터 유래된 인트론은 유비퀴틴 1(Ubi-1) 유전자일 수 있다; 문헌[Christensen et al. (1992) Plant Molec. Biol. 18(4), 675-89]). 이를 후속하여 PAR 유전자의 발현을 구동하는 벼 액틴1 프로모터를 함유하는 바이너리 GATEWAY(상표명) 목적 벡터로 클로닝하였다. 각각 블록 1 절제자(Excisor)(eZFN1,8) 또는 블록 2 절제자(eZFN3,6) 구성체로 지정한 결과 플라스미드 pDAB105951(ZFN1; CL:AR), 105954(ZFN8; RL:AR), 105952(ZFN3; AL:PR), 105953(ZFN6; CL:RR)를 아그로박테리움 균주 DA2552recA로 전달하였다.
스펙티노마이신(spec)(100 ㎍/㎖) 및 에리트로마이신(ery)(150 ㎍/㎖)을 함유하는 10㎖의 YEP에 글라이세롤 저장액으로부터의 DA2552 균주를 접종하는 것에 의해 출발 배양물을 제조함으로써 전기천공법을 위한 컴피턴트로 아그로박테리움 DA2552 균주를 만들었다. 10㎖ 배양물을 28℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 5밀리리터의 출발 배양물을 사용하여 적절하게 라벨을 붙인 1.5 ℓ 삼각 플라스크 중에서 적절한 항생물질과 함께 500㎖의 YEP를 접종하였다. 배양물을 28℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션 후, 배양물을 축축한 빙욕에 두어서 냉각시키고, 약하게 교반하였다. 모든 추가 단계를 위하여 4℃에서 세포를 유지하였다. 사전 냉각시킨 로터 내에서 라벨을 붙인 멸균 원심분리 보틀 중에서 세포를 4000×g에서 10분 동안 원심분리함으로써 펠렛화하였다. 상청액을 부었고, 버린 다음, 5 내지 10㎖의 빙냉 멸균 재증류수를 첨가하였고, 클럼프가 남지 않을 때까지 세포를 부드럽게 아래 위로 피펫팅하였다. 현탁액 부피를 빙냉 멸균 재증류수로 대략 500㎖로 조절하였다. 세포를 사전 냉각시킨 로터 중에서 4℃로 4000×g에서 10분 동안 원심분리함으로써 펠렛화하였다. 상청액을 버리고, 5 내지 10㎖의 빙냉 멸균 재증류수를 첨가한 다음; 멸균 와이드 보어(wide-bore) 피펫을 사용하여 클럼프가 남지 않을 때까지 세포를 부드럽게 아래 위로 피펫팅하였다. 현탁액 부피를 빙냉 멸균 재증류수로 대략 250㎖로 조절하였고 세포를 사전 냉각시킨 로터 중에서 4℃로 10분 동안 4000×g에서 다시 원심분리함으로써 펠렛화하였다. 상청액을 버리고, 5 내지 10㎖의 빙냉 멸균 재증류수를 첨가한 다음, 펠렛을 약하게 재현탁하였고, 최종 부피를 빙냉 멸균 재증류수에 의해 50㎖로 조절하였다. 세포를 사전 냉각시킨 로터 중에서 4℃로 10분 동안 4000×g에서 원심분리함으로써 펠렛화하였다. 세포를 10%(v/v) 빙냉, 멸균 글라이세롤의 5㎖의 최종 부피 중에서 재현탁하였다. 세포를 멸균 0.5㎖ 마이크로관 중에서 50㎕ 알리쿼트로 제공하였고, 액체 질소 중에서 냉동시켰다.
아그로박테리움 전기천공을 위해 20 마이크로리터의 컴피턴트 DA2552 세포를 제조업자의 사전 설정 및 프로토콜에 따라서 GENE PULSER(등록상표) XCELL(등록상표) 전기천공 시스템(캘리포니아주 허큘러스시에 소재한 BioRad Hercules)을 사용하여 50 ng의 플라스미드 DNA로 전기천공하였다. 세포를 SOC 중의 28℃에서 2시간 동안 회수한 다음 YEP spec/ery 한천 플레이트 상에 플레이팅하였고, 48시간 동안 28℃에서 성장시켰다.
실시예 7.2: 교환 유전자 자리 구성체
벡터 1: AtAct2 프로모터(AtAct2 프로모터 v2(프로모터, 애기장대 액틴 유전자(ACT2)로부터의 5' 미번역 영역 및 인트론; 문헌[An et al. (1996) Plant J. 10, 107-121)])/GUS(Jefferson, (1987) EMBO J. 6, 3901-3907)/AtuORF23 3' UTR(아그로박테리움 투메파시엔스 pTi15955의 오픈 리딩 프레임 23(ORF23)의 전사 종결자 및 폴리아데닐화 자리를 포함하는 3' 미번역 영역(UTR); 문헌[Barker et al., (1983) Plant Molec. Biol. 2(6):335-50)]: AtAct2 프로모터/NPTII(Bevan et al. (1983) Nature 304, 184-187)/eZFN 1 및 8 옆에 있는 AtuORF23 3’ UTR, 벡터 2: 서열의 중앙에서 eZFN 4 및 7을 가지는 합성 2 kb 영역, 및 벡터 3: CsVMV 프로모터/HPT(Kaster et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 (19), 6895-6911 (1983))/AtuORF23 3’ UTR::AtUbi10 프로모터(프로모터, 5' 미번역 영역 및 애기장대 폴리유비퀴틴 10(UBQ10) 유전자로부터의 인트론; 문헌[Norris et al. (1993) Plant Molecular Biology 21(5):895-906)]/PhiYFP(Shagin et al., (2004) Molecular Biol. Evol. 21:841-850)/eZFN 3 및 6 옆에 있는 AtuORF23 3’ UTR을 포함하는 GATEWAY(상표명) 엔트리 벡터로부터 교환 유전자 자리 DNA 구성체를 제조하였다.
아그로박테리움 바이너리 벡터 백본에 1 kb 무작위 합성 DNA 서열을 삽입함으로써 목적 벡터를 제조하였으며, 제한 자리는 그것들 사이에 포함되어 GATEWAY(상표명) ccdB 음성 선별가능한 마커 카세트로 클로닝되었다. LR 클로나제 반응에 의해 목적 벡터에 엔트리 벡터를 클로닝하였다. 결과 벡터, pDAB100646(도 16)를 상기 설명한 아그로박테리움에 전달하였다.
실시예 7.3: 애기장대 형질전환
문헌[Clough & Bent (1998 Plant J., 16, 735-743)]에서 설명된 방법에 따라서 애기장대로 모든 형질전환을 수행하였다.
절제자 주
"절제자" 주 구성체는 글루포시네이트에 저항성을 전달하는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(PAT) 유전자를 소유한다. T1 식물을 심고 7, 10 및 13일 후 DeVilbiss 압축 공기 분사 팁을 사용하여 10 ㎖/트레이(703 L/ha) 분사 부피에서 284 ㎎/ℓ 용액의 Liberty 제조제(리터 당 200 그램의 활성 성분(g ai/L) 글루포시네이트, 미주리주 캔자스시티시에 소재한 Bayer Crop Sciences)로 분사하였다. 최종 분사 후 4-7일에 생존자(활발하게 성장하는 식물)을 확인하였고, 포팅 배지(Metro Mix 360)로 제조한 3-인치 포트에 개별적으로 옮겨 심었다.
절제자 사건에서 eZFN의 발현을 역 트랜스크립타제 PCR(RT PCR)에 의해 결정하였고, 복제 수를 PAT 유전자의 본 명세서에서 설명한 바와 같은 qPCR에 의해 결정하였으며 서던 분석에 의해 확인하였다. 높은 수준으로 ZFN을 발현시키는 3개의 낮은 복제 사건을 교환 유전자 자리 사건과 교배시켰다.
교환 유전자 자리 주
하이그로마이신 또는 카나마이산을 함유하는 배지 내 선별을 포함하여 문헌[Clough & Bent (1998 Plant J., 16, 735-743)]에 의해 설명되는 방법에 따라서 애기장대에서 교환 유전자 자리 주를 발생시켰다.
실시예 7.4: 애기장대 교배 및 자손 회수
교환 유전자 자리 사건과 블록 1 및 블록 2 절제자 주의 2가지 설정의 교배를 표준 방법을 사용하여 행한다. 교배물로부터의 종자를 하이그로마이신(블록 1 결실) 또는 카나마이신(블록 2 결실)에서 성장시켰고, 식물 저항성을 GUS 발현(블록 1 결실) 또는 YFP 발현(블록 2 결실)에 대해 분석하였다. GUS 활성을 조직화학적 분석(Jefferson et al. (1987) Plant Mol . Biol . Rep 5, 387-405) 및 형광 현미경을 사용하는 YFP로 결정한다. 원하는 표현형이 있는 식물(블록 1 양성: GUS+,NPT+,HPT-,YFP-; 블록 2 양성: GUS-,NPT-,HPT+,YFP+)을 PCR 및 서던에 의해 분석여 원하는 유전자 배치를 확인한다. 선별한 식물로부터의 잎을 비알라포스(bialaphos) 용액으로 페인팅하여 PAT+를 평가한다.
블록 1 및 블록 2 유전자 카세트를 함유하는 식물을 교배시키고, 자손을 하이그로마이신/카나마이신 플레이트 상에서 선별한다. HygR/KanR 식물을 PCR 및 표현형 스크리닝에 의해 모든 유전자의 존재를 위해 분석한다. 원하는 표현형이 있는 F1 식물을 성장시키고, 감수분열 프로모터/ZFN 식물과 교배하여 블록 1과 블록 2 사이의 재조합을 달성한다. 결과 자손을 하이그로마이신/카나마이신 플레이트 상에서 성장시킨다. 살아남은 식물에 대해, 선별을 GUS 및 YFP에 대해 스크리닝한다. 재조합의 확인 및 특징화를 PCR, 서던, 시퀀싱 및 분리 분석을 사용하여 행한다.
실시예 8: eZFN 자리에서 유전자 집적
다음의 방법을 사용하여 도 1, 2, 4, 5 및 6에서 제시하는 전략을 수행할 수 있다.
구성체 설계
헤테로다이머 eZFN 자리의 다양한 조합을 식물 형질전환에 적합한 플라스미드 벡터 내 연쇄동일순서(concatemer)로서 조립할 수 있다. 도 1, 도 2, 및 도 4는 벡터에 포함시키며, 식물의 염색체로 형질전환시킬 수 있는 헤테로다이머의 다양한 버전을 도시한다.
WHISKERS (상표명) 형질전환
옥수수의 배 발생 Hi-II 세포 배양물을 미국 특허 제7,179,902호에서 설명한 바와 같이 생성하고, 표적화된 통합이 예시된 살아있는 식물 세포의 공급원으로 사용한다. 식물 선별가능한 마커 카세트에 연결된 헤테로다이머 eZFN 자리를 함유하는 DNA 단편을 사용하여 유전자 이식 사건을 만든다. 유전자 이식 사건을 분리하고, 특징화한다.
사전에 동결보존한 세포주로부터 12㎖의 압축세포용적(PCV) + 28㎖의 조건화 배지를 500㎖ 삼각 플라스크 중에서 80㎖의 GN6 액체 배지(N6 배지(Chu et al., (1975) Sci Sin. 18:659-668), 2.0 ㎎/ℓ 2, 4-D, 30 g/ℓ 수크로스, pH 5.8)로 2차 배양하고, 125 rpm로 28℃에서 진탕기 상에 둔다. 이 단계를 동일 세포주를 사용하여 2회 반복하고, 총 36㎖ PCV를 3개의 플라스크에 걸쳐 분포시킨다.
24시간 후, GN6 액체 배지를 제거하고, 72㎖ GN6 S/M 삼투 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 45.5 g/ℓ 소르비톨, 45.5 g/ℓ 만니톨, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, pH 6.0)로 대체한다. 플라스크를 보통의 교반(125 rpm)과 함께 30-35분 동안 28℃에서 어둠 중에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 동안, 탄화규소 위스커의 50 ㎎/㎖(w/v) 현탁액(사우스 캐롤라이나주 그리어시에 소재한 Advanced Composite Materials, LLC)을 405㎎의 멸균, 탄화규소 위스커에 8.1㎖의 GN6 S/M 액체 배지를 첨가함으로써 제조한다. GN6 S/M 삼투 배지 중에서 인큐베이션 후, 각 플라스크의 내용물을 250㎖ 원심분리 보틀에 붓는다. 플라스크 내 모든 세포를 바닥에 가라앉힌 후, 대략 14㎖의 GN6 S/M 액체의 과량의 내용물 부피를 회수하고, 장래 사용을 위해 멸균 1ℓ 플라스크 중에서 수집한다. 위스커의 사전에 적신 현탁액을 60초 동안 최대 속도의 교반으로 혼합한 다음, 원심분리 보틀에 첨가한다.
85㎍의 정제 DNA 단편의 알리쿼트를 각 보틀에 첨가한다. 일단 DNA가 첨가되면, 보틀을 변형 Red Devil 5400 상업적 페이트 믹서(미네소타주 플리머스시에 소재한 Red Devil Equipment Co.) 중에 즉시 두고, 10초 동안 교반한다. 교반 후, 세포, 배지, 위스커 및 DNA의 칵테일을 125㎖ 신선한 GN6 액체 배지와 함께 1ℓ 플라스크의 내용물에 첨가하여 삼투성을 감소시킨다. 세포를 2시간 동안 125 rpm의 진탕기 설정에서 회수한다. 덮개 진공배관에 연결된 유리 세포 수집기 단위를 사용하여 6㎖의 분산 현탁액을 Whatman #4 필터 페이퍼(5.5 ㎝) 상에서 여과하여, 보틀 당 60 필터를 얻었다. 필터를 GN6 고체 배지의 60×20㎜에 두었고(2.5 g/ℓ Gelrit 겔화제를 제외하고 GN6 액체 배지와 동일), 1주일 동안 어두운 조건 하에 28℃에서 배양하였다.
추정적 유전자 이식 사건의 확인 및 분리
DNA 전달 1주일 후, 필터 페이퍼를 선별제를 함유하는 GN6(1H) 선별 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2, 4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 2.5 g/ℓ 겔라이트, pH 5.8)의 60x20㎜ 플레이트에 옮겼다. 이 선별 플레이트를 어둠 속에서 1주일 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 어둠 속에서 선별의 1주일 후, 37-38℃에서 보유된 3.0㎖의 GN6 아가로스 배지(N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2, 4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 7 g/ℓ SeaPlaque 아가로스, pH 5.8, 121℃에서 단지 10분 동안 오토클레이브)를 함유하는 튜브에 각 플레이트로부터의 세포의 절반을 스크레이핑함으로써 조직을 신선한 배지에 포매시켰다.
아가로스/조직 혼합물을 스패출러로 부수었고, 후속하여 3㎖의 아가로스/조직 혼합물을 GN6(1H) 배지를 함유하는 100×15㎜ 페트리 접시의 표면에 균일하게 부었다. 이 과정을 각 플레이트의 양 절반에 대해 반복하였다. 일단 모든 조직이 포매되면, 플레이트를 NESCOFILM(등록상표) 또는 PARAFILM M(등록상표)로 개개로 밀봉하였고, 10주까지 어두운 조건 하에 28℃에서 배양하였다.
이 선별 조건하에 성장시킨 추정적으로 형질전환된 분리물을 포매된 플레이트로부터 제거하였고, 60×20㎜ 플레이트 내 신선한 선별 배지에 옮겼다. 대략 2주 후 지연된 성장이 명확하다면, 사건은 도포된 제초제(선별제)에 저항성인 것으로 여겨지며, 세포의 알리쿼트는 후속하여 유전자형 분석을 위해 채집하였다.
사건의 분자 특징화
게놈 DNA(gDNA)를 실시예 2.2에서 설명한 바와 같은 분리한 옥수수 세포로부터 추출하였고, PCR 지노타이핑 실험을 위한 주형으로 이용하였다. DNeasy 96 식물 키트(캘리포니아주 발렌시아시에 소재한 QIAGEN Inc.)에서 상술된 제조업자의 프로토콜에 따라서 상기 설명한 바와 같이 분리한 Hi-II 캘러스의 대략 100-300㎕ 압축세포용적(PCV)으로부터 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA를 100㎕의 키트 공급 용리 완충제 중에서 용리하여 20-200 ng/㎕의 최종 농도를 얻었고, 후속하여 PCR-기반 지노타이핑 방법을 통해 분석하였다.
복제 수의 분자 분석
INVADER(등록상표) 또는 가수분해 프로브 분석을 수행하여 제조제 저항성 캘러스 샘플을 스크리닝하고 T-가닥 DNA의 단일 복제 통합을 함유하는 것을 확인한다. 유전자 발현 카세트에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 상술한 분석을 수행한다. 추가 분석을 위해 단일 복제 사건을 확인한다.
Third Wave Technologies(위스콘신주 매디슨시에 소재)에 의해 Hi-II 캘러스 내 선별가능한 마커 유전자에 대해 관습적 INVADER(등록상표) 분석을 진행한다. 게놈 샘플을 INVADER(등록상표) 분석 키트를 사용하여 증폭시키고, 판독을 수집한다. 이 판독으로부터, 각 채널에 대한 폴드오버(fold-over) 0(즉, 배경)을 각 샘플 원 신호(raw signal)를 주형이 없는 원 신호로 나눔으로써 결정하였다. 이 데이터로부터, 표준 곡선을 구성하고, 선형 회귀 분석에 의해 최고의 적합성을 결정한다. 이 적합성으로부터 확인한 변수를 사용하여, 다음으로 명백한 선별가능한 마커 복제 수를 각 샘플에 대해 추정한다.
표적 DNA 에 의한 유전자 이식 사건의 선별
선별가능한 마커 유전자 카세트 및 무결함 eZFN 자리를 함유하는 무결함 식물 전사 단위(PTU)에 대해 낮은 복제(이식유전자의 1-2 복제) 사건을 상기 설명한 PCR에 의해 스크리닝한다. 선별가능한 마커 유전자에 의한 표준 방법을 사용하여 서던 분석에 의해 복제 수를 확인한다. 단일 복제, 무결함 삽입물을 함유하는 선별된 유전자 이식 사건으로부터의 캘러스를 유지한다.
eZFN 을 함유하는 식물 세포에 바이오리스틱 -매개 DNA 전달
상기 설명한 바와 같은, 옥수수의 배 발생 Hi-II 세포 배양물을 생성하고, 표적화된 통합이 증명된 살아있는 식물 세포의 공급원으로 사용한다. 옥수수의 배 형성 현탁액을 상기 설명한 실험 전 대략 24시간에 GN6 액체 배지에 2차 배양한다. 과량의 액체 배지를 제거하고, 2.5 g/ℓ 겔라이트와 함께 고형화한 GN6 S/M 배지를 함유하는 100×15㎜ 페트리 접시의 중심에 걸쳐 대략 0.4㎖ PCV의 세포를 직경 2.5㎝ 원으로 얇게 펼친다.
세포를 4시간 동안 어둠 조건 하에 배양한다. 공여자 DNA 단편(도 1의 블록 1, 도 2의 블록 2, 또는 도 4의 유전자 1)을 함유하는 DNA로 바이오리스틱 입자를 코팅하기 위하여, 3㎎의 1.0 마이크론 직경 금 입자를 100% 에탄올로 1회, 멸균 증류수로 2회 세척하였고, 규소화된 에펜도르프 튜브 내의 50㎕ 물 중에서 재현탁하였다. 총 5㎍의 플라스미드 DNA(eZFN 및 공여자 DNA 단편을 암호화하는 핵산 분자의 단일 벡터 또는 별개의 벡터를 함유), 20㎕ 스페르미딘(0.1M) 및 50㎕ 염화칼슘(2.5M)을 금 현탁액에 개별적으로 첨가하였고, 교반하면서 혼합하였다. 혼합물을 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 10초 동안 벤치 탑 마이크로원심분리기 중의 10,000 rpm에서 펠렛화하며, 60㎕의 차가운 100% 에탄올 중에서 재현탁하고, 8-9㎕를 각 거대담체에 분포시킨다.
Biolistic PDS-1000/HE(상표명) 시스템(캘리포니아주 허큘러스시에 소재한 Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 충격을 수행한다. 세포를 함유하는 플레이트를 1,100 psi 및 27인치의 Hg 진공 조건 하에 중간 선반에 두고, 작업 메뉴얼에 따라서 충격을 가한다. 충격 후 6시간에, 조직을 GN6(1H) 배지에 대해 작은 클럼프 중에서 전달하고, 어둠 조건하에 28℃에서 2-3주 동안 배양한다. 공여자 DNA의 통합으로부터 초래되는 추정적 유전자 이식 분리물이 나타나기 시작할 때까지 2-4주 마다 전달을 계속한다. 표적 서열을 함유하는 분리물을 생성하기 위해 상기 설명한 방법을 사용하여 바이알라포스 저항성 콜로니를 일반적으로 PCR 및 서던 블롯팅에 의해 분석한다.
PCR 지노타이핑을 통한 표적화된 통합 사건을 위한 스크리닝
PCR 반응을 수행하여 공여자 DNA의 무결함 복제의 존재를 조사한다. 추가적인 반응은 표적과 공여자 사이의 5'-경계 및 공여자와 표적 사이의 3'-경계에 초점을 둔다. 증폭된 단편을 겔-절제시키고, 표준 프로토콜에 따라서 정제한다. 정제한 단편을 후속하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 TOPO TA CLONING(등록상표) 키트(pCR2.1 벡터를 지님) 및 ONE SHOT(등록상표) TOP10 화학적으로 컴피턴트 대장균(E. coli) 세포(캘리포니아주 칼즈베드시에 소재한 Invitrogen Life Technologies)을 사용하여 pCR2.1 플라스미드에 클로닝한다.
개개의 콜로니를 선별하고 증폭시킨 PCR 단편을 함유하는 것을 확인한다. 플라스미드 클론의 이중 가닥 시퀀싱 반응을 수행하여 PCR 증폭 게놈 서열이 통합 공여자를 함유한다는 것을 확인한다. 공여자 단편을 함유한다는 것을 확인한 사건은 특정 유전자 표적에서 도너 DNA의 이중 가닥 파괴 및 표적화된 통합의 상동성 구동 보수의 표적을 나타낸다.
eZFN 자리를 사용하는 유전자 집적의 특이적 적용
도 1은 식물의 염색체에 안정하게 형질전환된 7개의 eZFN 표적 자리로 구성된 다중 삽입 자리의 변형을 보여준다. 표적 자리에 결합하는 eZFN 쌍을 기하학적 도면으로 도시한다. "블록 1"은 설계된 eZFN에 의해 형질전환하여 특정 eZFN 자리를 절단할 때 적절한 eZFN의 다중 삽입 자리에 통합될 수 있는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이다. eZFN 및 "블록 1" 공여자 DNA 서열의 공동 형질전환을 앞서 상기에 설명한 바이오리스틱 형질전환 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 식물 세포에 형질전환된 eZFN이 이 다른 자리를 절단하지 않기 때문에 다양한 다른 eZFN 자리의 정확도는 유지된다. "블록 1"은 "블록 1"으 서열을 함유하는 식물 세포를 초래하는 상동성 재조합을 통해 식물 염색체에 통합된다. 결과 식물 세포는 성숙 식물로 성장될 수 있고, 서던 블롯팅, Taqman 분석 또는 Invader 분석과 같은 당업계에 알려진 분석적 분자 생물학 방법을 사용하여 "블록 1"의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다.
도 2는 도 1의 다른 변형을 도시하되, 상이한 eZFN 결합 자리는 폴리뉴클레오티드 공여자 서열 "블록 2"로 표적화된다. DNA 단편의 얻어진 통합은 염색체 내에서 "블록 2"를 함유하는 안정한 식물을 생성한다.
도 4는 eZFN "왼쪽" 및 "오른쪽" 도메인의 사용을 도시한다. 상단의 선은 왼쪽 및 오른쪽 eZFN 도메인으로 형질전환된 식물의 게놈을 도시한다(음영 표시된 삼각형 및 체크무늬 삼각형). 적절한 eZFN이 새롭고 상이한 헤테로다이머 eZFN 자리 옆에 있는 "유전자 1"을 포함하는 외인성 분자의 존재에 첨가될 때, "유전자 1" 및 옆에 있는 eZFN 자리는 게놈에 삽입된다. "유전자 1" 및 옆에 있는 eZFN 자리를 함유하는 얻어진 자손을 확인하며, 이 식물들은 후속하여 모 식물 내 제공되지 않는 새로운 헤테로다이머 eZFN 자리(즉, 음영표시된 삼각형 및 체크 무늬 삼각형을 함유하는 eZFN 자리)를 사용하여 재표적화될 수 있다.
도 5 및 도 6은 eZFN 자리가 염색체 위치에 새로운 이식유전자를 집적시키기 위해 사용되는 방법을 도시한다. 게다가, 이 전략은 다른 유전자 발현 카세트의 절제를 허용한다. 일부 예에서, 유전자 발현 카세트는 완전하게 제거될 수 있으며(도 5), 다른 시나리오에서, 유전자 발현 카세트는 식물의 특이적 발생에서 제거될 수 있고, 종국적으로 이 식물의 자손을 재도입함으로써, 유전자 발현 카세트의 재순환을 허용한다. 결실된 마커(도 6) 서열을 상기 설명한 프로토콜을 사용하여 표적화하는 상동성 재조합 매개 유전자를 통해 재도입할 수 있다. 헤테로다이머 eZFN 자리로 유전자 표적화는 상기 설명한 프로토콜을 사용하여 완료한다. 이 실시예에서, eZFN 결합 자리를 사용하여 식물에서 형질변환 식물로부터 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 임의의 이식유전자의 결실을 가능하게 한다. 이에 대해서는, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 가특허출원 제61/297628호를 참조할 수 있다.
본 명세서에 언급되는 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그것의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 포함된다.
이해의 명확성의 목적을 위해 일부 상술에서 예시 및 예로서 개시가 제공되지만, 본 명세서의 정신 또는 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 앞서 언급한 설명 밀 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
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Claims (16)

  1. 내인성 게놈 및 상기 내인성 게놈에 통합된 외인성 핵산 분자를 포함하는 분리된 세포 또는 세포주로서, 상기 외인성 핵산 분자는 다중 삽입 자리를 포함하고, 상기 다중 삽입 자리는 아연 핑거 뉴클레아제의 하나 이상의 쌍을 위한 3개 이상의 상이한 짝지어진 표적 자리를 포함하고, 상기 짝지어진 표적 자리는 상기 아연 핑거 뉴클레아제의 하나 이상의 쌍이 헤테로다이머로서 결합하고 절단하도록 위치하고, 상기 짝지어진 표적 자리는 상기 세포 또는 세포주의 상기 내인성 게놈에 존재하지 않고, 상기 세포 또는 세포주는 상기 짝지어진 표적 자리에 결합하는 아연 핑거 뉴클레아제의 쌍에 의해 절단시, 상기 다중 삽입 자리에 통합되는 공여자 서열을 더욱 포함하는, 세포 또는 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 짝지어진 표적 자리로부터 하나의 표적 자리는 동일한 서열을 포함하는 것인 세포 또는 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공여자 서열은 하나 이상의 암호화 서열을 포함하는 것인 세포 또는 세포주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포 또는 비-인간 포유류 세포 또는 비-인간 포유류 세포주와 같은 진핵 세포인 것인 세포 또는 세포주.
  5. 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 아연 핑거 뉴클레아제의 하나 이상의 쌍을 제1항에 기재된 세포에 제공하되, 상기 아연 핑거 뉴클레아제는 통합된 핵산 분자 내 표적 자리에 결합하며, 상기 뉴클레아제의 그것의 표적 자리에 대한 결합은 상기 세포의 게놈을 절단하는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 상기 공여자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키되, 상기 공여자 서열은 통합된 핵산 내에서 상기 세포의 게놈에 통합되는 단계를 포함하는, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 추가적인 공여자 서열의 존재하에, 통합된 핵산 분자 내 추가적인 표적 자리를 절단하는 추가적인 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하며 단계 (a) 및 (b)를 반복함으로써, 세포 게놈에 추가적인 공여자 서열을 삽입하는 단계를 더 포함하는, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 공여자 서열 중 하나 이상은 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 하나 이상의 표적 자리를 포함하는 것인, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 공여자 서열에 존재하는 하나 이상의 표적 자리는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 결합되고, 상기 공여자 서열의 통합 시, 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제가 결합하는 제1 및 제2 표적 자리를 포함하는 표적 자리가 만들어지는 것인, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 공여자 서열 중 하나 이상은 암호화 서열을 포함하며, 상기 세포는 상기 암호화 서열의 생성물을 발현하는 것인, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  10. 비-인간 세포의 게놈에 삽입된 하나 이상의 서열을 결실시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 제5항에 기재된 방법에 따라서 하나 이상의 공여자 서열을 통합시키는 단계; 및
    (b) 상기 공여자 서열 중 하나 이상을 상기 게놈으로부터 결실시키도록 세포에서 뉴클레아제를 발현시키는 단계를 포함하는, 비-인간 세포의 게놈에 삽입된 하나 이상의 서열을 결실시키는 방법.
  11. 게놈 변경된 비-인간 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 제5항에 기재된 방법에 따라서 적어도 제1 세포에서 하나 이상의 공여자 서열을 통합시키는 단계;
    (b) 상기 제1 세포를 성적으로 성숙한 제1 유기체로 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 제1 유기체를 게놈 변경을 포함하는 제2 유기체와 교배하여, 상기 제1 유기체의 게놈 변경 중 적어도 하나를 갖는 제2 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 게놈 변경된 비-인간 세포를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 세포 게놈 변경은 상기 제2 세포 내 단일 게놈 위치에서 다수의 이종성 유전자를 포함하는 것인, 게놈 변경된 비-인간 세포를 제공하는 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 세포는 상기 통합된 핵산 분자를 포함하는 영역 밖에서 해당 세포의 게놈의 변형을 더 포함하는 것인, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포인 것인, 세포의 게놈에 하나 이상의 공여자 서열을 통합하기 위한 방법.
  15. 게놈 변경된 비-인간 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 제10항에 기재된 방법에 따라서 적어도 제1 세포에서 하나 이상의 공여자 서열을 결실시키는 단계;
    (b) 상기 제1 세포를 성적으로 성숙한 제1 유기체로 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 제1 유기체를 게놈 변경을 포함하는 제2 유기체와 교배하여, 상기 제1 유기체의 게놈 변경 중 적어도 하나를 갖는 제2 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 게놈 변경된 비-인간 세포를 제공하는 방법.
  16. 삭제
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