JP6329537B2 - 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物 - Google Patents

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関連出願への相互参照
本願は、２０１２年７月１１日に出願された米国仮出願第６１／６７０，４５１号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、赤血球の遺伝子操作の分野における開示であり、とりわけ、毒素への曝露の処置のための、生物学的薬剤の組織への治療的な送達のための開示を含む。

遺伝子治療は、ヒト医療における新時代にとって大きな潜在的可能性を有する。これらの方法は、標準的な医療実践ではこれまでのところ取組み可能でなかった状態のための処置を可能とするであろう。とりわけ有望な１つの領域は、導入遺伝子を細胞に付加して、その細胞に、その細胞内で以前は産生されていない産物を発現させる能力である。この技術の使用の例は、新規の治療用タンパク質をコードする遺伝子の挿入、細胞または個体において欠如するタンパク質をコードするコード配列の挿入、およびマイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの構造的核酸をコードする配列の挿入を含む。

導入遺伝子は、細胞自身のゲノムに組み込まれ、そこで維持されるように、様々な方途により、細胞に送達することができる。近年では、導入遺伝子を組み込むための戦略であって、選択されたゲノム遺伝子座へのターゲティングされた挿入のために、部位特異的ヌクレアーゼによる切断を使用する戦略が開発されている（例えば、共有の米国特許第７，８８８，１２１号を参照されたい）。導入遺伝子構築物が、相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）により、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に駆動される過程における末端捕捉により挿入されるように、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのヌクレアーゼ系などのヌクレアーゼ（操作されたガイドＲＮＡを活用する）であって、ターゲティングされた遺伝子に特異的なヌクレアーゼを活用することができる。

ターゲティングされる遺伝子座は、ヒト細胞内のＡＡＶＳ１遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞内のＲｏｓａ２６などの「セーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）」遺伝子座を含む（例えば、共有の米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号を参照されたい）。ヌクレアーゼ媒介型組込みは、遺伝子サイレンシングまたは近傍のがん遺伝子活性化の危険性を最小限とするための、導入遺伝子の正確なポジショニングを可能とするので、導入遺伝子のランダムな組込みに依拠する古典的な組込み法と比較して、導入遺伝子発現の改善、安全性および発現永続性の増大の見通しをもたらす。

導入遺伝子の標的細胞への送達が、この技術を十分に生かすために克服しなければならない１つの障害であるのに対し、乗り越えなければならない別の問題は、導入遺伝子を細胞に挿入し、発現させた後で、このようにしてコードされた遺伝子産物を、確実に、生物に必要な場所に到達させ、有効となるのに十分な局所濃度で産生させなければならないことである。タンパク質の欠如または異常な非機能的タンパク質の存在を特徴とする疾患では、導入遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の送達は、状態の改善、処置、および／または予防、例えば、遺伝子疾患（例えば、リソソーム蓄積症）を処置するための導入遺伝子の発現に極めて有用でありうる。

赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ（ＲＢＣ）またはｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、血液の主要な細胞成分である。実際、ＲＢＣは、ヒトにおける細胞のうちの４分の１を占める。ヒトでは、成熟ＲＢＣは、核および他の多くの細胞小器官を欠き、酸素を肺から取り出し、末梢組織に送達するそれらの仕事を容易とするように、ヘモグロビンで満たされている。ＲＢＣは、骨髄中で、ＣＤ３４＋造血幹細胞から発生し、半減期が約１００〜１２０日間である。ＲＢＣは、それらの表面上にタンパク質抗原（凝集原）を有し、これにより、被験体が不適合の血液型であるドナー血液を輸血される場合に問題となりうる血液型（Ａ、Ｂ、ＡＢ、またはＯ）が決まる。血液細胞抗原の第２に重要な種類は、約５０の異なる抗原を含むＲｈ（Ｒｈｅｓｕｓ）抗原である。Ｏ型Ｒｈ（−）の血液では、主要な血液型抗原のうちのいずれもが存在しないことから、Ｏ抗原をコードする遺伝子は、誰に供与するのにも使用しうるように、天然においてはるか以前に突然変異して、非機能性となっている。加えて、血液細胞抗原の別のセットは、ＫＥＬ遺伝子によりコードされるＫｅｌｌ抗原である。Ｋｅｌｌとは、高度に多型性のＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、一部の個体は、輸血の後で抗Ｋｅｌｌ抗体を発生させる。

業務災害、環境内に蓄積された毒素に由来する長期にわたる曝露、または化学戦争を介する毒素への曝露は、現在生じつつある懸念である。化学兵器の破壊効果は、起爆力に主に起因するわけではないため、ボツリヌス毒素、リシン、およびサキシトキシンなどの非生物毒素の使用を伴う化学戦争は、従来型兵器または核兵器の使用と異なる。２０世紀には、多様な神経作用物質、リン含有有機化学物質のクラスであって、シクロサリン、サリン、ソマン、タブン、ＶＸ、ＶＲ；殺虫剤およびノビコック剤など、神経が器官にメッセージを送る機構を破壊するクラスを含む、約７０の異なる化学物質が、化学兵器剤として使用または備蓄されている。毒性化学物質はまた、イソシアン酸メチルガスが放出された結果として、数十万人の人々が曝露され、数千人が死亡した、インドのボパールにおける事故などの業務災害に起因して、環境に放出される可能性もある。

これらの作用物質への曝露の結果としての神経破壊は、正常では神経伝達物質であるアセチルコリンの活性を弛緩させる酵素であるアセチルコリンエステラーゼの活性部位に対する共有結合的修飾により引き起こされる。神経作用物質への曝露は、多数の症状をもたらす結果として、最終的に窒息による死をもたらす。米軍は、第一次湾岸戦争において、国連により大量破壊兵器として分類される神経作用物質に曝露され、１９９５年の日本におけるテロリストによる攻撃では、神経作用物質であるサリンが放出された。神経作用物質の皮膚透過性に起因して、防護マスクに加えて、兵士または第一対応者にはあまり適さない装備である全身防護も要請される。処置の選択肢は存在するが、予防は手薄である。１つの戦略は、アセチルコリンエステラーゼの活性部位に可逆的に結合することが可能な低分子である、ピリドスチグミンの使用を伴うが、これは、理想的な解決法ではない。酵素と会合した後に、ピリドスチグミンは、活性部位に数時間にわたり滞留するに過ぎず、このため、予防的使用のためには８〜１２時間ごとに服用しなければならない。加えて、ピリドスチグミンは、血液脳関門を越えることができないので、末梢神経系において効果的であるに過ぎず、他の所望されない副作用ももたらす。アトロピン、オキシムなどの他の低分子化合物、およびジアゼパムなどの鎮痙剤との組合せが使用されているが、有効性は限定的である（Ｒｕｓｓｅｌｌら（２００３年）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ、５巻：１〜２７頁を参照されたい）。

ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ：ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）とは、ヒト血清中の自然発生のタンパク質であり、広範なスペクトルにわたる有機リン酸神経作用物質の標的である（Ｂｒｏｍｆｉｅｌｄら（１９９１年）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．、２５９巻（２号）：６３３〜８頁を参照されたい）。組換えＢＣＨＥが、神経作用物質の作用および効果を遮断するための犠牲的予防神経作用物質対策として開発中である（Ｌｅｎｚら（２００７年）、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．、２３３巻（１〜３号）：３１〜９頁を参照されたい）。ＢＣＨＥの触媒的類似体は、開発の早期段階にある。別の酵素である、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＰＯＮ１：ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ／ａｒｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ１）もまた、いくつかの神経作用物質を分解するように操作されている（Ｇｕｐｔａら（２０１１年）、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、７巻（２号）：１２０〜５頁、Ｅｐｕｂ、２０１１年１月９日を参照されたい）。他の有用な融合パートナーは、カルボキシルエステラーゼ（ＣａＥ）、抗体、およびウシ胎仔血清ＡＣｈＥ（ＦＢＳ−ＡＣｈＥ）、ウマ血清ブチリルコリンエステラーゼ（ＥｑＢＣｈＥ）を含むコリンエステラーゼ（ＣｈＥ：ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、およびＰｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａに由来するホスホトリエステラーゼでありうる。魅力的な防護選択肢ではあるが、半減期が短く、高価な注射用組換えタンパク質は、標準的な実践における組換えＢＣＨＥまたは操作ＰＯＮ１の有用性を制限しかねない。

近年では、環境毒素の潜在的危険の認識が増大している。重金属（例えば、鉛、カドミウム）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ダイオキシン、殺虫剤、フタル酸、アスベスト、およびハロゲン（塩素、フッ素）などの化合物を含む、われわれの環境内の毒素は、がん、高血圧症、心血管疾患、パーキンソン病、肺疾患、精神遅滞、および骨粗鬆症など、多くの疾患と潜在的に関連している（例えば、Ｖａｚｉｒｉ（２００８年）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９５巻（２号）：Ｈ４５４〜Ｈ４６５頁；Ｓａｍａｎｔａｒａｙら（２００８年）、ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．、７巻（３号）：３０５〜１２頁を参照されたい）。これらの毒素は、これらの疾患における誘発的役割を果たすか、または疾患誘発物質と相互作用して、疾患の進行を加速化することが多い。

米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０２９９５８０号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書

したがって、発現させた、導入遺伝子によりコードされる遺伝子産物を、例えば、環境毒素、産業毒素、および神経ガスなどの化学戦争毒素への曝露、ならびにリソソーム蓄積症などの遺伝子状態を処置するのに治療的に関与性のレベルで送達するのに使用しうるさらなる方法および組成物が依然として必要とされている。

本明細書では、赤血球の遺伝子改変のための方法および組成物であって、例えば、治療用生物学的薬剤（例えば、タンパク質）を、遺伝子状態（例えば、リソソーム蓄積症）を伴う生物、および／または毒素に曝露されているかもしくは毒素に曝露される生物における所望の部位に送達するための方法および組成物が開示される。本発明は、曝露された被験体（例えば、ヒト患者）を防護または処置するための、これらの改変ＲＢＣの集団を被験体に導入して、その必要とされる治療剤を供給することにより、高レベルの治療剤をもたらすような赤血球の改変に関する。治療用生物学的薬剤は、例えば、遺伝子疾患における突然変異体タンパク質の機能を置きかえ、かつ／または毒素の作用を遮断し、毒素を分解し、かつ／もしくは毒素を解毒するタンパク質（例えば、治療用タンパク質）をもたらす。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
タンパク質を発現させる組込み型導入遺伝子を含む単離された遺伝子改変赤血球（ＲＢＣ）またはＲＢＣ前駆細胞であって、前記タンパク質が、１種または複数種の毒素を分解もしくは解毒するか、またはリソソーム蓄積症において欠如するタンパク質を提供する、ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目２）
前記導入遺伝子が、グロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子に組み込まれている、項目１に記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目３）
前記グロビン遺伝子が、ベータグロビン遺伝子またはガンマグロビン遺伝子である、項目２に記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目４）
前記タンパク質を前記細胞中に保持する、項目１から３のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目５）
前記導入遺伝子が膜タンパク質の細胞外ドメインを含み、かつ前記タンパク質が、前記細胞の表面上に局在化している、項目１から３のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目６）
前記導入遺伝子が内因性配列と共に発現される、項目１から５のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目７）
前記内因性配列が、前記導入遺伝子タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分またはカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する、項目６に記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目８）
前記導入遺伝子が、前記ＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞のゲノムに、ヌクレアーゼにより前記ゲノムを切断した後で組み込まれる、項目１から７のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目９）
前記ヌクレアーゼが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ系を含む、項目８に記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目１０）
Ｏ型陰性である、項目１から９のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞。
（項目１１）
胎児性ヘモグロビンを発現させる、項目１から１０のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞。
（項目１２）
毒素の分解または毒素の作用の解毒を必要とする被験体において毒素を分解するかまたは毒素の作用を解毒する方法であって、項目１から１１のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆体を、それを必要とする前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１３）
ＲＢＣ前駆細胞を骨髄移植において投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
リソソーム蓄積症において欠損するタンパク質を提供する方法であって、項目１から１１のいずれかに記載のＲＢＣまたはＲＢＣ前駆細胞を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。

一態様では、本明細書では、ゲノム内の対象の領域内の標的部位（例えば、グロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子）に結合する亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ：ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、１または複数の操作された亜鉛フィンガー結合性ドメインを含むＺＦＰが記載される。一実施形態では、ＺＦＰは、対象の標的ゲノム領域を切断する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、１または複数の操作された亜鉛フィンガー結合性ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたはヌクレアーゼ切断ハーフドメインを含むＺＦＮである。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、多様な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）に由来する。ある種の実施形態では、亜鉛フィンガードメインは、グロビン遺伝子内またはセーフハーバー遺伝子内の標的部位を認識する。ある種の実施形態では、亜鉛フィンガードメインは、５つの亜鉛フィンガードメインを含み、グロビン遺伝子内の標的部位を認識する（例えば、表３に示される認識へリックス領域を伴う５本のフィンガーを有する亜鉛フィンガータンパク質）。

別の態様では、本明細書では、ゲノム内の対象の領域内の標的部位（例えば、グロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子）に結合するＴＡＬＥタンパク質（転写活性化因子様）であって、１または複数の操作されたＴＡＬＥ結合性ドメインを含むＴＡＬＥタンパク質が記載される。一実施形態では、ＴＡＬＥは、対象の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であって、１または複数の操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたはヌクレアーゼ切断ハーフドメインを含むＴＡＬＥＮである。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、多様な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）に由来する。ある種の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインは、グロビン遺伝子内またはセーフハーバー遺伝子内の標的部位を認識する。

別の態様では、本明細書では、ゲノム内の対象の領域内の標的部位（例えば、高度に発現する遺伝子、疾患に関連する遺伝子、またはセーフハーバー遺伝子）に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単鎖ガイドＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が記載される。ある種の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、高度に発現する遺伝子内、疾患に関連する遺伝子内、またはセーフハーバー遺伝子内の標的部位を認識する。ある種の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、グロビン遺伝子内、アルブミン遺伝子内、ＣＣＲ５遺伝子内、ＣＸＣＲ４遺伝子内、ＡＡＶＳ１遺伝子内、Ｒｏｓａ遺伝子内、またはＨＰＲＴ遺伝子内の標的を認識する。

本明細書で記載されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなど、遺伝子内のコード領域内もしくは非コード領域内または遺伝子に隣接するコード領域内もしくは非コード領域内の対象の領域に結合し、かつ／または対象の領域を切断する場合もあり、コード領域の上流または下流の非転写領域内の対象の領域に結合し、かつ／または対象の領域を切断する場合もある。ある種の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、グロビン遺伝子に結合し、かつ／またはグロビン遺伝子を切断する。他の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、セーフハーバー遺伝子、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としてもまた公知の）遺伝子、アルブミン遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子に結合し、かつ／またはこれを切断する。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１１０３０１０７３号、同第２０１３０１７７９８３号、および同第２０１３０１７７９６０号；ならびに米国仮出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。加えて、選択の一助とするため、ＨＰＲＴ遺伝子座を使用することもできる（米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号を参照されたい）。別の態様では、本明細書では、本明細書で記載される亜鉛フィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のうちの１または複数を含む組成物が記載される。

別の態様では、本明細書では、本明細書で記載される１または複数のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドが記載される。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡでありうる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾することができる（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら（２０１１年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照されたい）。

別の態様では、本明細書では、本明細書で記載される１または複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドであって、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の発現ベクターが記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形態では、発現ベクターは、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質をコードするｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて産生させるために使用する。

別の態様では、本明細書では、赤血球（ＲＢＣ）またはＲＢＣ前駆細胞（幹細胞）などの遺伝子改変宿主細胞、例えば、１または複数の導入遺伝子を含む宿主細胞が記載される。ある種の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子状態、例えば、リソソーム蓄積症（表２を参照されたい）を伴う被験体において欠如するかまたは十分に機能しないタンパク質をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、カルボキシルエステラーゼ（ＣａＥ）、抗体、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）、ウシ胎仔血清ＡＣｈＥ（ＦＢＳ−ＡＣｈＥ）、ウマ血清ブチリルコリンエステラーゼ（ＥｑＢＣｈＥ）などのコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、アリールエステラーゼ（例えば、血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＰＯＮ１））、および／またはＰｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａに由来するホスホトリエステラーゼをコードすることにより、毒素（例えば、神経作用物質）を分解し、毒素を解毒し、かつ／または毒素の作用を遮断する１または複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど、機能的ポリヌクレオチドをコードする。ある種の実施形態では、ヌクレアーゼ、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ（および／またはＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチド）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、導入遺伝子を、ＲＢＣ前駆体のゲノムに組み込む。宿主細胞は、１または複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮの発現ベクターまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で安定的に形質転換することもでき、１または複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮの発現ベクターまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を一過性にトランスフェクトすることもでき、これらの組合せを施すこともできる。別の実施形態では、宿主細胞を、本発明のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡで処置する。次いで、ある種の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ヌクレアーゼで改変されたＲＢＣ前駆体を増殖させ、成熟ＲＢＣに分化するように誘導する。次いで、例えば、状態（例えば、神経作用物質などの毒素への曝露）を処置および／または予防するために、結果として得られるＲＢＣを、被験体に投与することができる。他の態様では、骨髄移植においてＲＢＣ前駆体（幹細胞）を施し、ＲＢＣをｉｎ ｖｉｖｏにおいて分化および成熟させる。ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子座に対する特異性により操作することもでき、赤血球内で高度に発現する遺伝子への特異性を有する場合もある。非限定的な例だけを目的として述べると、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１部位、ＣＣＲ５遺伝子、またはＨＰＲＴ遺伝子でありうる。非限定的な例だけを目的として述べると、赤血球内で高度に発現する遺伝子は、ベータグロビンである。

別の態様では、本明細書では、細胞内のベータグロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子を切断するための方法であって、細胞に、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を発現させ、１または複数のグロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子を切断するような条件下で、１または複数のグロビン遺伝子内の標的部位に結合する１または複数のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む方法が記載される。ある種の実施形態では、亜鉛フィンガードメインは、５つの亜鉛フィンガードメインを含み、グロビン遺伝子内の標的部位（例えば、表３に示される認識へリックス領域を伴う５本のフィンガーを有する亜鉛フィンガータンパク質）を認識する。いくつかの実施形態では、本発明のヌクレアーゼを含むポリヌクレオチドは、発現ベクターを含み、他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、任意の標的遺伝子内のゲノム配列を、例えば、本明細書で記載されるＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ（および／または前記ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードするベクター）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ならびにＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるターゲティングされた切断の後で遺伝子に挿入される「ドナー」配列を使用して置きかえる。ドナー配列は、ＺＦＮベクター内またはＴＡＬＥＮベクター内に存在させることもでき、別個のベクター（例えば、ＡｄベクターまたはＬＶベクター）内に存在させることもでき、代替的に、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することもできる。ドナーヌクレオチド配列の標的遺伝子座（例えば、グロビン遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子など）へのこのような挿入は、標的遺伝子座の（例えば、グロビンの）遺伝子制御エレメントの制御下における導入遺伝子の発現を結果としてもたらす。いくつかの態様では、対象の導入遺伝子の、例えば、グロビン遺伝子への挿入は、無傷の外因性タンパク質配列の発現を結果としてもたらし、グロビンでコードされたいかなるアミノ酸も欠く。他の態様では、発現させた外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子およびさらなる（例えば、グロビン）遺伝子配列（例えば、内因性標的遺伝子座に由来する遺伝子配列、または、代替的に、導入遺伝子上のグロビンコード配列に由来する遺伝子配列）によりコードされるアミノ酸を含む。いくつかの場合には、グロビン遺伝子は、ベータグロビンである。他の場合には、グロビン遺伝子は、ガンマグロビン遺伝子である。ある場合には、グロビン配列が、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在するのに対し、他の場合には、グロビン配列は、外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在するであろう。他の場合には、グロビン配列は、外因性タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分のいずれにも存在するであろう。グロビン配列は、全長野生型グロビン配列または突然変異体グロビン配列を含む場合もあり、代替的に、部分的なグロビンアミノ酸配列を含む場合もある。いくつかの実施形態では、グロビン−導入遺伝子融合体を、細胞内の内因性遺伝子座に配置するのに対し、他の実施形態では、グロビン−導入遺伝子コード配列を、ゲノム内のセーフハーバーに挿入する。いくつかの態様では、セーフハーバーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、Ｒｏｓａ遺伝子座、ＨＰＲＴ遺伝子座、アルブミン遺伝子座、またはＣＣＲ５遺伝子座から選択される（共有の米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９６０号、および同第２０１３０１７７９６０号を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質産物を成熟赤血球内に保持するように、導入遺伝子を発現させる。他の実施形態では、発現させたときに、導入遺伝子融合体が、治療用タンパク質の表面への局在化を結果としてもたらすように、導入遺伝子を、膜タンパク質の細胞外ドメインに融合させる。いくつかの態様では、細胞外ドメインは、表１に列挙されたタンパク質から選択される。さらに他の実施形態では、治療用タンパク質産物が、いくつかの地点において改変細胞から放出される、例えば、改変ＲＢＣ前駆細胞から発生する成熟赤血球から放出されるように、導入遺伝子を発現させる。

本発明はまた、例えば、遺伝子状態を伴う被験体および／または毒素（例えば、神経作用物質）に曝露される可能性が高い被験体を処置および／または予防するための単一の産物、ならびに毒素（例えば、神経作用物質）への曝露の犠牲者を処置するための単一の産物の開発を可能とする同種産物として、全ての被験体（例えば、ヒト患者）に広く使用されうる治療用タンパク質のＲＢＣ担体を作製するための方法および組成物も提供する。

別の態様では、本発明は、その産物がＲＢＣ前駆体内の遺伝子の発現を阻害しうる調節的遺伝子をノックアウトするか、またはこのようなタンパク質のＤＮＡ上の標的部位を破壊するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、ノックアウトのために選択される遺伝子またはそれらの標的配列は、胎児性ヘモグロビンの発現の阻害に関与する遺伝子またはそれらの標的配列である。このような前駆体から分化したＲＢＣであれば、胎児性ヘモグロビンを含有し、低酸素状況下の被験体において使用しうるであろう。

別の実施形態では、導入遺伝子は、非コードＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡをコードする。ＲＢＣが成熟する前に導入遺伝子が発現すれば、対象の非コードＲＮＡを含有するＲＢＣが結果としてもたらされるであろう。

別の実施形態では、本発明は、これらの前駆体に由来する成熟ＲＢＣが、導入遺伝子によりコードされる高レベルの産物を含有するように、導入遺伝子が挿入されたＲＢＣ前駆細胞（すなわち、造血幹細胞：ＣＤ３４＋細胞）に関する。いくつかの実施形態では、前駆体は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。非限定的な例だけを目的として述べると、ｉＰＳＣに由来する赤血球内で高度に発現する遺伝子は、ベータグロビンおよびガンマグロビンである。

いくつかの実施形態では、本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用して、例えば、トランスジェニック動物系を作り出すことができる。いくつかの態様では、トランスジェニック動物を、導入遺伝子によりヒト遺伝子がコードされるモデル開発において使用することができる。いくつかの場合には、トランスジェニック動物は、挿入された導入遺伝子をコードする内因性遺伝子座においてノックアウトされることから、ヒトタンパク質を単離して研究しうるｉｎ ｖｉｖｏ系の開発を可能としうる。このようなトランスジェニックモデルは、対象のヒトタンパク質と相互作用する場合もあり、これを修飾する場合もある、低分子もしくは生体高分子または他の実体を同定するためのスクリーニング目的で使用することができる。いくつかの態様では、導入遺伝子を、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞など）または本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより得られる動物の胚の選択された遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー）に組み込み、次いで、生きた動物が出生するように胚を移植する。次いで、子孫のうちの少なくとも一部が、組込み型導入遺伝子を含むように、動物を性成熟期まで育成し、子孫をもうけさせる。

なおさらなる態様では、本明細書では、核酸配列を、染色体、例えば、胚の染色体の内因性遺伝子座（例えば、グロビン遺伝子）に部位特異的に組み込むための方法が提示される。ある種の実施形態では、方法は、（ａ）胚に、（ｉ）組み込まれる核酸配列を挟む上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、および（ｉｉ）標的遺伝子座（例えば、グロビン遺伝子座）内の組込み部位を認識する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を注射するステップと、（ｂ）胚を培養して、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、および／またはＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼの発現を可能とするステップであって、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により組込み部位に導入された二本鎖の切断が、ＤＮＡベクターによる相同組換えを介して、核酸配列を染色体に組み込むように修復されるステップとを含む。

本明細書で記載される方法のうちのいずれかでは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび／またはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含みうる。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。

また、本発明のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含むキットも提供される。キットは、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または、必要な場合、適切な発現ベクター内に含有されるＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＣａｓをコードする遺伝子および適切なＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡ）、ドナー分子、適切な宿主細胞または宿主細胞系、本発明の方法を実施するための指示書などを含みうる。

これらの態様および他の態様は、開示全体に照らせば、当業者にたやすく明らかであろう。

本明細書では、治療用生物学的薬剤を生物における所望の部位に送達するための方法および組成物が開示される。本発明は、高レベルの治療剤をもたらすような赤血球の改変に関する。これらの改変ＲＢＣの集団を患者に導入すれば、その必要とされるタンパク質が供給されるであろう。導入遺伝子は、それを必要とする患者において治療的に有益な、所望のタンパク質または非コードＲＮＡをコードしうる。さらに、改変ＲＢＣは、Ｏ型前駆細胞に由来する場合もあり、Ａ血液型抗原、Ｂ血液型抗原、Ｒｈ血液型抗原、および／またはＫｅｌｌ血液型抗原を欠くことからほぼユニバーサルなドナー細胞となるように遺伝子操作された前駆細胞に由来する場合もある。このようなユニバーサルドナー細胞は、いかなる時点においてもすぐに使用できるように作製しうる集団をもたらすように増殖させることができる。本発明は、導入遺伝子から産生される治療用生物学的薬剤を必要とするヒト、例えば、毒素に曝露される可能性があるか、毒素に曝露されるか、または毒素に曝露されているヒトを処置するのに有用である。

したがって、本発明の方法および組成物を使用して、赤血球内の遺伝子座から高度に発現する治療的に有益なタンパク質を、導入遺伝子から発現させることができる。例えば、導入遺伝子は、遺伝子状態（例えば、リソソーム蓄積症）を伴う被験体において欠如するかもしくは十分に機能的ではないタンパク質、および／または毒素への曝露後において、体内の毒性作用物質もしくは有害作用物質に結合し、かつ／もしくはこれらを不活化することが可能なタンパク質をコードしうる。

加えて、導入遺伝子は、それを必要とする被験体における終局的移植で使用するための、患者に由来する細胞、例えば、患者に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または他の種類の幹細胞（胚性幹細胞または造血幹細胞）に導入することができる。

一般
別段に指し示されない限りにおいて、本明細書で開示される方法の実施のほか、本明細書で開示される組成物の調製および使用では、当技術分野の技術範囲内にある、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および関連分野における従来の技法を援用する。これらの技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；および３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年；および定期的改訂版；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ； Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、直鎖状コンフォメーションまたは環状コンフォメーションにあり、一本鎖形態または二本鎖形態にあるデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的なものとしてはみなさないものとする。用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体のほか、塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドも包摂しうる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対であろう。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに互換的に使用される。これらの用語はまた、１または複数のアミノ酸が、対応する自然発生アミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、高分子の間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）、配列特異的な非共有結合的相互作用を指す。相互作用全体が配列特異的である限りにおいて、結合性相互作用の全ての成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）必要はない。このような相互作用は一般に、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「アフィニティー」とは、結合の強度を指すことから、結合アフィニティーの増大は、Ｋ_ｄの低下と相関する。

「結合性タンパク質」とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子に結合する場合（ＤＮＡ結合性タンパク質）もあり、ＲＮＡ分子に結合する場合（ＲＮＡ結合性タンパク質）もあり、かつ／またはタンパク質分子に結合する場合（タンパク質結合性タンパク質）もある。タンパク質結合性タンパク質の場合、タンパク質結合性タンパク質は、タンパク質自体に結合する場合（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）もあり、かつ／または１もしくは複数の異なるタンパク質のうちの１もしくは複数の分子に結合する場合もある。結合性タンパク質は、複数種類の結合活性を有しうる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または結合性ドメイン）とは、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化する結合性ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数の亜鉛フィンガーを介して、配列特異的な様式でＤＮＡに結合する大型タンパク質内のタンパク質またはドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性タンパク質という用語は、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略記されることが多い。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン」または「ＴＡＬＥ」とは、１単位当たり１または複数のＴＡＬＥリピートドメインを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥのそのコグネイトの標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「リピート単位」（また、「リピート」とも称する）は典型的に、３３〜３５アミノ酸の長さであり、自然発生のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列との少なくともある程度の配列相同性を呈示する。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

亜鉛フィンガー結合性ドメインおよびＴＡＬＥ結合性ドメインは、例えば、自然発生の亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域を操作すること（１または複数のアミノ酸を変化させる）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合性タンパク質（亜鉛フィンガーまたはＴＡＬＥ）とは、非自然発生のタンパク質である。ＤＮＡ結合性タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、デザインおよび選択である。デザインされたＤＮＡ結合性タンパク質は、自然発生しないタンパク質であって、そのデザイン／組成が、主に合理的基準から生じるタンパク質である。デザインのための合理的基準は、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥのデザインおよび結合データについての情報を保存するデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。

「選択された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥとは、天然では見出されないタンパク質であって、その産生が主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験的工程から生じるタンパク質である。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８、ＵＳ５，９２５，５２３、ＵＳ６，００７，９８８、ＵＳ６，０１３，４５３、ＵＳ６，２００，７５９、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、および米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝子情報の交換の過程を指す。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、このような交換の特化形態であって、例えば、相同性指向修復機構を介する、細胞内の二本鎖切断の修復において生じる形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を要請し、「ドナー」分子を使用して、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た標的分子）の修復の鋳型とし、ドナーから標的への遺伝子情報の移動をもたらすため、「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに述べると、このような移動は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡに対するミスマッチの補正、および／またはドナーを使用して標的の一部となる遺伝子情報を再合成する「合成依存型鎖アニーリング」、および／または関連過程を伴いうる。このような特化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変化を結果としてもたらすことが多い。

本開示の方法では、本明細書で記載される、１または複数のターゲティングされたヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内の所定の部位において二本鎖切断を創出し、切断の領域内のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易とすることが示されている。ドナー配列を、物理的に組み込む場合もあり、代替的に、ドナーポリヌクレオチドを、相同組換えを介する切断を修復するための鋳型として使用する結果として、ヌクレオチド配列の全部または一部を、ドナー内の配列として細胞クロマチンに導入する場合もある。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を変化させることができ、ある種の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「〜を置きかえる」または「置きかえ」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置きかえ（すなわち、配列の情報的な意味における置きかえ）を表すと理解することができ、必ずしも１つのポリヌクレオチドの、別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的な置きかえを要請するわけではない。

本明細書で記載される方法のうちのいずれかでは、亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対を、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用することができる。

細胞クロマチン内の対象の領域内の配列のターゲティングされた組換えおよび／または置きかえおよび／または改変のための方法についてのある種の実施形態では、染色体の配列を、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を伴う相同組換えにより変化させる。切断の領域と相同な配列が存在する場合は、このような相同組換えが、細胞クロマチン内の二本鎖切断の存在により刺激される。

本明細書で記載される方法のうちのいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、対象の領域内のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含有する場合があり、これにより、対象の領域内に非同一配列を挿入する相同組換えが刺激される。したがって、ある種の実施形態では、対象の領域内の配列と相同なドナー配列の部分は、置きかえられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を呈示する。他の実施形態では、例えば、ドナー配列とゲノム配列との間で、１００連続塩基対にわたり、１つのヌクレオチドだけが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％を超える。ある種の場合には、新たな配列が対象の領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、対象の領域内に存在しない配列を含有しうる。これらの場合には、非相同配列は一般に、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列であって、対象の領域内の配列と相同であるかまたは同一な配列により挟まれる。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によりゲノムに挿入される。

本明細書で記載される方法のうちのいずれかを、対象の遺伝子の発現を破壊する、ターゲティングされたドナー配列の組込みによる、細胞内の１または複数の標的配列の部分的または完全な不活化のために使用することができる。また、部分的または完全に不活化された遺伝子を伴う細胞系も提供される。

さらに、本明細書で記載される、ターゲティングされた組込みの方法はまた、１または複数の外因性配列を組み込むのにも使用することができる。外因性核酸配列は、例えば、１もしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列のほか、１または複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）も含みうる。加えて、外因性核酸配列は、１または複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）ももたらしうる。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合的骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的加水分解または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法により誘発することができる。一本鎖切断および二本鎖切断のいずれもが可能であり、二本鎖切断は、２つの個別の一本鎖切断イベントの結果として生じうる。ＤＮＡの切断は、平滑末端または粘着末端の生成を結果としてもたらしうる。ある種の実施形態では、融合ポリペプチドを、ターゲティングされた二本鎖ＤＮＡの切断に使用する。

「切断ハーフドメイン」とは、第２のポリペプチド（同一のポリペプチドまたは異なるポリペプチド）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１の切断ハーフドメインおよび第２の切断ハーフドメイン」、「＋切断ハーフドメインおよび−切断ハーフドメイン」、ならびに「右側切断ハーフドメインおよび左側切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すのに互換的に使用される。

「操作された切断ハーフドメイン」とは、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と共に偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。また、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、および同第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。

「配列」という用語は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり；直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、分枝状の場合もあり；一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチドの間の長さでありうる。

「クロマチン」とは、細胞ゲノムを含むヌクレオタンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよびヒストン以外の染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームコアが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のうちの２つずつを含むオクタマーと関連する約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じた可変的な長さの）が、ヌクレオソームコアの間に張り渡される、ヌクレオソームの形態で存在する。ヒストンＨ１の分子は一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的では、「クロマチン」という用語は、原核細胞および真核細胞の両方の、全ての種類の細胞ヌクレオタンパク質を包摂することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」とは、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合体である、その核型により特徴づけられることが多い。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含みうる。

「エピソーム」とは、複製型核酸、ヌクレオタンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムを含む。

「標的部位」または「標的配列」とは、結合に十分な条件が存在する場合に、結合性分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。

「外因性」分子とは、正常では細胞内に存在しないが、１または複数の遺伝子法、生化学法、または他の方法により細胞に導入されうる分子である。「正常な細胞内の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境的状態に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生時だけに存在する分子は、成体の筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全性内因性分子の機能性変化形または正常機能性内因性分子の機能不全性変化形を含みうる。

外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学工程により作り出される低分子などの低分子の場合もあり、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１もしくは複数を含む任意の複合体などの高分子の場合もある。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み；一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり；直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、環状の場合もあり；任意の長さでありうる。核酸は、二重鎖を形成することが可能な核酸のほか、三重鎖形成核酸も含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号、および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、およびヘリカーゼを含むがこれらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または外因性核酸でありうる。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または正常では細胞内に存在しない染色体を含みうる。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介型導入（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型導入、およびウイルスベクター媒介型導入を含むがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子でありうるが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する場合もある。例えば、ヒト核酸配列を、元来はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入することができる。

これに対し、「内因性」分子とは、正常では、特定の環境的状態下で、特定の発生段階において、特定の細胞内に存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞小器官、または自然発生のエピソーム核酸を含みうる。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含みうる。

「融合」分子とは、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学的種類の分子の場合もあり、異なる化学的種類の分子の場合もある。第１の種類の融合分子の例は、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合体）および融合核酸（例えば、上述で記載した融合タンパク質をコードする核酸）を含むがこれらに限定されない。第２の種類の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合体、および副溝結合剤と核酸との間の融合体を含むがこれらに限定されない。

細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から生じる場合もあり、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達であって、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を作り出す送達により生じる場合もある。また、トランススプライシング、ポリペプチドの切断、およびポリペプチドのライゲーションも、細胞内のタンパク質の発現に関与しうる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の別の箇所で提示される。

本開示の目的では、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照されたい）のほか、そのような調節的配列が、コード配列および／または転写配列に隣接する場合であれ、そうでない場合であれ、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域も含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合性部位および内部リボソーム導入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス接合部位、および遺伝子座制御領域を含むが必ずしもこれらに限定されるわけではない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、または他の任意の種類のＲＮＡ）の場合もあり、ｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質の場合もある。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、およびエディティングなどの過程により修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。

遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションは、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含みうるがこれらに限定されない。ゲノムエディティング（例えば、切断、改変、不活化、ランダム突然変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子不活化とは、遺伝子発現の、本明細書で記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較した任意の低減を指す。したがって、遺伝子の不活化は、部分的な場合もあり、完全な場合もある。

「対象の領域」とは、例えば、遺伝子または遺伝子内の非コード配列もしくは遺伝子に隣接する非コード配列など、細胞クロマチンの任意の領域であって、外因性分子に結合することが望ましい領域である。結合は、ＤＮＡのターゲティングされた切断および／またはターゲティングされた組換えを目的としうる。対象の領域は、例えば、染色体内、エピソーム内、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム）内、または感染ウイルスゲノム内に存在しうる。対象の領域は、遺伝子のコード領域内にある場合もあり、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなど、転写される非コード領域内にある場合もあり、コード領域の上流または下流における非転写領域内にある場合もある。対象の領域は、単一ヌクレオチド対という小領域の場合もあり、最大で２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対の場合もある。

「真核」細胞は、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含むがこれらに限定されない。

「赤血球」（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）とは、造血幹細胞に由来する最終分化細胞である。ＲＢＣは、ヌクレアーゼおよび大半の細胞性細胞小器官を欠く。ＲＢＣは、酸素を肺から末梢組織に運ぶヘモグロビンを含有する。実際、個々のＲＢＣのうちの３３％はヘモグロビンである。それらはまた、代謝時に細胞により産生されるＣＯ２も、息を吐く時に放出するために組織から肺に運び戻す。ＲＢＣは、血中の低酸素状態に応答して骨髄中で産生されるが、これは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の放出により媒介される。ＥＰＯは、前赤芽球の数を増大させ、ＲＢＣの完全な成熟に要請される時間を短縮する。約１２０日間後、ＲＢＣは、核または他の任意の再生能を含有しないので、肝臓内、脾臓内、およびリンパ節内のマクロファージの食作用活性により（約９０％）、または血漿中の溶血により（約１０％）、循環から除去される。マクロファージによる貪食の後で、ＲＢＣの化学成分は、リソソーム酵素の作用に起因して、マクロファージの液胞内で分解される。

「分泌性組織」とは、動物における組織であって、生成物を、個々の細胞から、典型的には上皮に由来するいくつかの種類の管腔内に分泌する組織である。消化管に局在化した分泌性組織の例は、胃、膵臓、および膀胱の内膜となる細胞を含む。他の分泌性組織は、肝臓、眼と関連する組織、ならびに唾液腺、乳腺、前立腺、脳下垂体、および内分泌系の他のメンバーなどの粘膜を含む。加えて、分泌性組織は、分泌が可能な組織型のうちの個別の細胞を含む。

「作動的連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）の並置であって、構成要素を、構成要素が正常に機能し、かつ、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して果たされる機能を媒介しうる可能性を許容するように配置する並置に関して互換的に使用される。例示を目的として述べると、プロモーターなどの転写調節配列は、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、転写調節配列により、コード配列の転写レベルが制御される場合に、コード配列に作動的に連結されている。転写調節配列は一般に、シス側でコード配列と作動的に連結されるが、コード配列にじかに隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に作動的に連結された転写調節配列であるが、それらは連接しない。

融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、他の構成要素と連結されると、構成要素の各々が、そのように連結されなかった場合と同じ機能を果たすという事実を指す場合がある。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインを、活性化ドメインに融合させた融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、活性化ドメインとは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメイン部分またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合性部位に結合することが可能である一方で、活性化ドメインは、遺伝子発現を上方調節することが可能な場合に、作動的に連結されている。ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインを、切断ドメインに融合させる融合ポリペプチドでは、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、切断ドメインとは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメイン部分またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合性部位に結合することが可能である一方で、切断ドメインは、標的部位の近傍においてＤＮＡを切断することが可能な場合に、作動的に連結されている。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」とは、その配列が全長タンパク質、全長ポリペプチド、または全長核酸と同一でないが、全長タンパク質、全長ポリペプチド、または全長核酸と同じ機能をやはり保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を保有する場合もあり、かつ／または１もしくは複数のアミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換を含有する場合もある。当技術分野では、核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定するための方法が周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合性機能は、例えば、フィルター結合性アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイにより決定することができる。ＤＮＡの切断は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝子的および生化学的両方の相補性により決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号；およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」とは、対象の遺伝子の発現を方向付けることが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能な任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体のほか、組込みベクターも含む。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、タンパク質産物をもたらす任意の配列であって、好ましくは日常的アッセイで容易に測定されるが、必ずしもそうではない配列を指す。適切なレポーター遺伝子は、抗生剤耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに細胞成長および／または遺伝子増幅の増強を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列を含むがこれらに限定されない。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーを含む。「発現タグ」は、対象の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望される遺伝子配列に作動可能に連結されうるレポーターをコードする配列を含む。

「被験体」および「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長動物のほか、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物および／または愛玩動物などの哺乳動物を指す。したがって、本明細書で使用される「被験体」または「患者」という用語は、本発明の改変ＲＢＣ（または幹細胞）を投与しうる任意の哺乳動物患者または哺乳動物被験体を意味する。本発明の被験体は、例えば、神経毒素を含む１または複数の化学毒素に曝露されている被験体を含む。

ヌクレアーゼ
本明細書では、組成物、特に、導入遺伝子をＲＢＣに挿入するために遺伝子をターゲティングするのに有用なヌクレアーゼについて記載する。ある種の実施形態では、ヌクレアーゼは、自然発生である。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、非自然発生である、すなわち、ＤＮＡ結合性ドメイン内および／または切断ドメイン内で操作されている。例えば、自然発生のヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインは、選択された標的部位（例えば、コグネイトの結合性部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように変化させることができる。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合性ドメインおよび切断ドメイン（例えば、異種切断ドメインを伴う亜鉛フィンガーヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン；ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン）または操作された単鎖ガイドＲＮＡを活用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。

Ａ．ＤＮＡ結合性ドメイン
ある種の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。自然発生のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに群分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。それらの認識配列は公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻：１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５〜３５３頁；およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。

ある種の実施形態では、ヌクレアーゼは、操作された（非自然発生の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩなど、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻：１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５〜３５３頁；およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）、Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインは、ヌクレアーゼ全体の文脈で（すなわち、ヌクレアーゼが、コグネイトの切断ドメインを含むように）変化させることもでき、異種切断ドメインに融合させることもできる。

他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、自然発生のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合性ドメイン、または操作された（非自然発生の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合性ドメインを含む。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の病原性は、２５を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存的ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）がある（Ｋａｙら（２００７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬＥは、各リピートが、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４アミノ酸を含有する、タンデムリピートの集中ドメインを含有する。加えて、それらは、核局在化配列および酸性の転写活性化ドメインも含有する（総論としては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓら（２００６年）、Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍのＲ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ １ ｓｔｒａｉｎ ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ ４ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０００では、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称する２つの遺伝子が、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）、Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が９８．９％互いと同一であり、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失だけ異なる。しかし、いずれの遺伝子産物の、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のＡｖｒＢｓ３ファミリーのタンパク質との配列同一性も、４０％未満である。

したがって、いくつかの実施形態では、標的遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー）内の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインは、植物病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属（Ｂｏｃｈら（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９〜１５１２頁；ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０１頁を参照されたい）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁；米国特許第８，４２０，７８２号、および同第８，４４０，４３１号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい）に由来するＴＡＬエフェクターと類似するＴＡＬエフェクターに由来する操作ドメインである。

ある種の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質（例えば、グロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子内の標的部位に結合する亜鉛フィンガータンパク質）を含む。好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質は、選り抜きの標的部位に結合するように操作されるという点で非自然発生である。例えば、全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。

操作された亜鉛フィンガー結合性ドメインまたはＴＡＬＥドメインは、自然発生の亜鉛フィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有しうる。操作法は、合理的デザインおよび多様な種類の選択を含むがこれらに限定されない。合理的デザインは、例えば、三連（または四連）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースであって、各三連または四連のヌクレオチド配列が、特定の三連または四連の配列に結合する亜鉛フィンガーの１または複数のアミノ酸配列と関連するデータベースの使用を含む。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号のほか、ＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７において開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合性ドメインへの結合特異性の増強については、例えば、共有のＷＯ０２／０７７２２７においても記載されている。

加えて、これらの参考文献および他の参考文献において開示されている通り、ＤＮＡドメイン（例えば、マルチフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥドメイン）は、例えば、５アミノ酸以上の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を使用して、一体に連結することができる。また、６アミノ酸以上の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書で記載されるＤＮＡ結合性タンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガーの間の適切なリンカーの任意の組合せを含みうる。加えて、亜鉛フィンガー結合性ドメインへの結合特異性の増強については、例えば、共有のＷＯ０２／０７７２２７においても記載されている。

標的部位、ＤＮＡ結合性ドメイン、ならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）をデザインおよび構築するための方法の選択は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号において詳細に記載されている。

加えて、これらの参考文献および他の参考文献において開示されている通り、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、マルチフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上の長さのリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を使用して、一体に連結することができる。また、６アミノ酸以上の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書で記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガーの間の適切なリンカーの任意の組合せを含みうる。

Ｂ．切断ドメイン
任意の適切な切断ドメインをＤＮＡ結合性ドメインに作動的に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインを、ヌクレアーゼドメインに融合させて、ＺＦＮ（その操作（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合性ドメインを介して、その意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介して、ＺＦＰ結合性部位の近傍でＤＮＡを切断させることが可能な機能的実体）を創出している。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。より近年において、ＺＦＮは、様々な生物におけるゲノム修飾に使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号；および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインも、ヌクレアーゼドメインに融合させて、ＴＡＬＥＮを創出している。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

上記で言及した通り、切断ドメインは、ＤＮＡ結合性ドメインに対して異種でありうる、例えば、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼに由来する切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合性ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメインおよび異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメインである。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来しうる例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。例えば、２００２年〜２００３年版カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素も公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；また、Ｌｉｎｎら（編）、Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照されたい）。これらの酵素（またはこれらの機能的断片）のうちの１または複数を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

同様に、切断ハーフドメインは、上記で示した通り、切断活性のために二量体化を要請する、任意のヌクレアーゼまたはその部分にも由来しうる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合は、２つの融合タンパク質が切断に要請される。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質も使用することができる。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはこれらの機能的断片）に由来する場合もあり、各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはこれらの機能的断片）に由来する場合もある。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質の、それらのそれぞれの標的部位への結合により、切断ハーフドメインが、互いに対する空間的配向性であって、例えば、二量体化することにより機能的切断ドメインを形成することを可能とする配向性に置かれるように、互いに対して配置することが好ましい。したがって、ある種の実施形態では、標的部位の近傍のエッジを、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ隔てる。しかし、２つの標的部位の間に、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対（例えば、２〜５０ヌクレオチド対以上）を介在させることができる。一般に、切断部位は、標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種において存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位において）、結合部位においてまたは結合部位の近傍においてＤＮＡを切断することが可能である。ある種の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを、認識部位から除去される部位において切断し、隔離可能な結合性ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素であるＦｏｋ Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号のほか、Ｌｉら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作される場合もあり、操作されない場合もある、１または複数の亜鉛フィンガー結合性ドメインを含む。

その切断ドメインが結合性ドメインから隔離可能な、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁）。したがって、本開示の目的では、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、亜鉛フィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合体を使用する細胞内配列のターゲティングされた二本鎖切断および／またはターゲティングされた置きかえのためには、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性の切断ドメインを再構成することができる。代替的にまた、ＤＮＡ結合性ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子も、使用することができる。

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化して（例えば、二量体化して）、機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質の任意の部分でありうる。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７０１３４７９６号において記載されている。さらなる制限酵素はまた、隔離可能な結合性ドメインおよび切断ドメインも含有し、本開示では、これらも想定される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。

ある種の実施形態では、切断ドメインは、例えば、それらの全ての開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００８０１３１９６２号において記載されている通り、ホモ二量体化を最小化または防止する、１または複数の操作された切断ハーフドメイン（また、二量体化ドメインの突然変異体とも称する）を含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位におけるアミノ酸残基は全て、Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。

偏性ヘテロ二量体を形成する、例示的なＦｏｋ Ｉの操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインが、Ｆｏｋ Ｉのアミノ酸残基４９０位および５３８位における突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において突然変異を含む対を含む。

したがって、一実施形態では、４９０における突然変異によりＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置きかえ、５３８における突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置きかえ、４８６における突然変異によりＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置きかえ、４９９位における突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置きかえる。具体的には、本明細書で記載される、操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称する、操作された切断ハーフドメインを作製し、かつ、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称する、操作された切断ハーフドメインを作製することにより調製した。本明細書で記載される、操作された切断ハーフドメインは、異常な切断を最小化または消失させた、偏性ヘテロ二量体の突然変異体である。例えば、その開示が全ての目的で参照によりその全体において組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。

ある種の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに照らして番号付けした）における突然変異、例えば、４８６位における野生型のＧｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置きかえる突然変異、４９９位における野生型のＩｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置きかえる突然変異、および４９６位における野生型のＡｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）残基またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれまた、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称する）で置きかえる突然変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに照らして番号付けした）、例えば、４９０位における野生型のＧｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置きかえる突然変異、５３８位における野生型のＩｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置きかえる突然変異、および５３７位における野生型のＨｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれまた、「ＫＫＫ」、および「ＫＫＲ」ドメインとも称する）で置きかえる突然変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに照らして番号付けした）における突然変異、例えば、４９０位における野生型のＧｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置きかえる突然変異、および５３７位における野生型のＨｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれまた、「ＫＩＫ」、および「ＫＩＲ」ドメインとも称する）で置きかえる突然変異を含む（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい）。本明細書で記載される、操作された切断ハーフドメインは、任意の適切な方法を使用して、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号において記載されている、野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位指向突然変異誘発により調製することができる。

代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏの核酸標的部位においてアセンブルすることができる。このようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現させることもでき、個別の成分を、例えば、自己切断型２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により隔てた１つのオープンリーディングフレーム内で連結することもできる。構成要素は、個々の亜鉛フィンガー結合性ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合性ドメインでありうる。

ヌクレアーゼは、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３および米国特許出願公開第２００９００６８１６４号において記載されている、酵母ベースの染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で公知の方法を使用して、たやすくデザインすることができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号；および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターの制御下でなされる場合もあり、誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化し（抑制解除され）、グルコースの存在下で抑制される、ガラクトキナーゼプロモーターの制御下でなされる場合もある。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
近年、古細菌および多くの細菌において、真核細胞ＲＮＡｉ経路に匹敵することが仮定される、ＲＮＡ媒介型ゲノム防御経路の存在について、有力な証拠が現れている（総論としては、ＧｏｄｄｅおよびＢｉｃｋｅｒｔｏｎ、２００６年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、６２巻：７１８〜７２９頁；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら、２００６年、Ａｒｃｈａｅａ、２巻：５９〜７２頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁；Ｓｏｒｅｋら、２００８年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６巻：１８１〜１８６頁を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核細胞ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として公知の経路は、進化において連関し、物理的にもしばしば連結された２つの遺伝子遺伝子座：系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、１巻：ｅ６０頁）から生じることが提起されている。微生物宿主内のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せのほか、ＣＲＩＳＰＲ媒介型核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントも含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核細胞ＲＮＡｉ機構のタンパク質構成要素と著明な配列類似性を共有しないが、予測される類似の機能（例えば、ＲＮＡ結合機能、ヌクレアーゼ機能、ヘリカーゼ機能など）を有する（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイと会合していることが多い。４０を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーについて記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうちで、Ｃａｓ１は、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系間で遍在すると考えられる。それらのうちのいくつかが、ＲＡＭＰ（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連する、８つのＣＲＩＳＰＲ亜型（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）を定義するのに、ｃａｓ遺伝子とリピート構造との特定の組合せが使用されている。単一のゲノム内では、複数のＣＲＩＳＰＲ亜型が発生しうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ亜型の散在的分布からは、この系が、微生物の進化において、遺伝子の水平移動を受けていることが示唆される。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系のうちの１つであり、４つの連鎖的ステップでターゲティングされたＤＮＡ二本鎖切断を行う。第１に、２つの非コードＲＮＡである、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写する。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡのリピート領域とハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対合を介して標的ＤＮＡに方向付けるが、これが、標的認識のためのさらなる要件である。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を創出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性化は、３つのステップ：（ｉ）「アダプテーション」と呼ばれる工程における、その後の攻撃を防止するための、外来ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関与性のタンパク質の発現のほか、アレイの発現およびプロセシングの後、（ｉｉｉ）外来核酸によるＲＮＡ媒介型干渉を含む。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のうちのいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与する。

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一次産物は、インベーダーターゲティング配列を含有する短鎖ＲＮＡであると考えられ、経路内で仮定されているそれらの役割に基づき、ガイドＲＮＡまたは原核細胞サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ：ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ＲＮＡ）と称する（Ｍａｋａｒｏｖａら（２００６年）、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁；Ｈａｌｅら（２００８年）、ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。ＲＮＡ解析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写物が、リピート配列内で切断されて、個々のインベーダーターゲティング配列およびフランキングリピート断片を含有する、約６０ｎｔ〜７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出することを指し示す（Ｔａｎｇら（２００２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９９巻：７５３６〜７５４１頁；Ｔａｎｇら（２００５年）、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５巻：４６９〜４８１頁；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら（２００６年）、Ａｒｃｈａｅａ、２巻：５９〜７２頁；Ｂｒｏｕｎｓら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：９６０〜９６４頁；Ｈａｌｅら（２００８年）、ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓでは、これらの中間体ＲＮＡが、豊富で安定的な約３５ｎｔ〜４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡにさらにプロセシングされる（Ｈａｌｅら（２００８年）、ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。

Ｃａｓタンパク質
「Ｃａｓ１」ポリペプチドとは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質１を指す。Ｃａｓ１（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍのＣＯＧ１５１８）は、ＣＲＩＳＰＲ関連系（ＣＡＳＳ：ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）の最良のマーカーである。系統発生比較に基づき、ＣＲＩＳＰＲ関連免疫系の７つの異なる変化形が同定されている（ＣＡＳＳ１〜７）。

本明細書で記載される方法において使用されるＣａｓ１ポリペプチドは、任意の原核生物において存在する任意のＣａｓ１ポリペプチドでありうる。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、古細菌微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓのＣａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ１〜７のうちの１つのメンバーである、Ｃａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３のメンバーである、Ｃａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ７のメンバーである、Ｃａｓ１ポリペプチドである。ある種の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３またはＣＡＳＳ７のメンバーである、Ｃａｓ１ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋの、例えば、ＧｅｎｅＩＤ番号：２７８１５２０、１００６８７４、９００１８１１、９４７２２８、３１６９２８０、２６５００１４、１１７５３０２、３９９３１２０、４３８０４８５、９０６６２５、３１６５１２６、９０５８０８、１４５４４６０、１４４５８８６、１４８５０９９、４２７４０１０、８８８５０６、３１６９５２６、９９７７４５、８９７８３６、もしくは１１９３０１８で提供されているヌクレオチド配列によりコードされ、かつ／またはこれらのポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸に対する相同性（例えば、８０％を超える、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む９０〜９９％）を呈示するアミノ酸配列であって、それらのポリペプチドがＣａｓ１ポリペプチドとして機能するアミノ酸配列を含む。

Ｃａｓ６は、別のＣａｓポリペプチドであり、本明細書では、そのエンドリボヌクレアーゼ活性を、Ｃａｓ６エンドリボヌクレアーゼ活性と称する。適切なＣａｓ６ポリペプチドの非限定的例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ８１２５５に示されている。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座を有する微生物であって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓなどであるがこれらに限定されない微生物から濃縮、単離、または精製することもでき、組換え技法を使用して作製することもでき、日常的方法を使用して化学的または酵素的に合成することもできる。いくつかの態様では、Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有さない微生物から濃縮、単離、または精製することができる。Ｃａｓ６ポリペプチドは、Ｃ末端の近傍において、ＧｈＧｘｘｘｘｘＧｈＧ（配列番号１３３モチーフ（配列中、「ｈ」は、疎水性アミノ酸を指し示す）を含みうる。ＡｒｇまたはＬｙｓは、中央部の５アミノ酸の連なりにおいて見出される場合があり、中央部の５アミノ酸の連なりにおいて見出されることが多い。Ｃａｓ６ポリペプチドは、触媒において役割を果たしうる少なくとも１つの残基、またはその保存的置換を含有する。Ｃａｓ６ポリペプチドは、これもまた触媒において役割を果たしうる他の残基、またはその保存的置換も含有しうる。触媒において役割を果たすことが予測される残基は、タンパク質の三次元構造においてＣａｓ６署名モチーフを含有するＧに富むループの近傍に位置しうる。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＴＩＧＲＦＡＭデータベースの受託番号ＴＩＧＲ０１８７７およびＰＦ０１８８１に存在するドメインを含みうる。ＴＩＧＲＦＡＭデータベースは、その機能が保存されているポリペプチドのファミリーを含む（Ｈａｆｔら（２００３年）、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：３７１〜３７３頁；ＢａｔｅｍａｎおよびＨａｆｔ（２００２年）、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３巻：２３６〜２４５頁；ならびにＨａｆｔら（２００５年）、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁）。

本明細書で提示されるＣａｓ６ポリペプチドの他の例は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ遺伝子座を有する原核微生物において存在するＣａｓ６ポリペプチドを含む。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む任意の微生物において容易に同定することができる。Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域は典型的に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と近接して位置するｃａｓ遺伝子座内にある。Ｈａｆｔら（（２００５年）、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁）は、Ｃａｓタンパク質ファミリーについて総説し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の特殊な亜型を同定するための規則を創出した。Ｈａｆｔらは、Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域について、少なくとも４つの個別のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ亜型（Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）と関連して見出され、典型的にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対して最も遠位に位置するｃａｓコード領域であるものとして記載している。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＪＣＶＩ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて利用可能なリソースを使用して同定することができる。したがって、当業者は、本明細書で記載される方法において有用なＣａｓ６ポリペプチドを、日常的方法を使用して同定することができる。

Ｃａｓ６ポリペプチドをコードすることが予測されるコード領域を含有する公知の全ゲノム配列を伴う原核微生物の例は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ＡＴＣＣ ２５５８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＧ １８３１１、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ ＭＢ４（Ｔ）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ Ｙ５１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＳＭ１０１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＱＣＤ−３２ｇ５８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｈａｌｌ Ａ Ｓａｎｇｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ１ Ｏｋｒａ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ Ｈａｌｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ ＡＴＣＣ １９３９７、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ Ｚ−２９０１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｃｕｓ ｓｐ．ＯＳ Ｔｙｐｅ Ｂ ｐｒｉｍｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｃｕｓ ｓｐ．ＯＳ Ｔｙｐｅ Ａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＹＣＨ４６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ９３４３、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ９９４１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ（実験室株）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＤＣ１５５１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｂｏｖｉｓ ＡＦ２１２２／９７、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ ＡＣＮ１４ａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ ＧＳＳ１、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ ＤＳＭ ９７９０、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ｓｈｉｎｋａｊ ＯＴ３、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＧＥ５、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ ｆｕｓａｒｏ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃ２Ａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ ＤＳＭ ６２４２、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＤＳＭ２６６１、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ｄｅｌｔａ Ｈ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ＡＴＣＣ ４３０４９、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＤＳＭ４３０４、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ １Ｍ２、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ ７、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ Ｐ２、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ６３９、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１を含む。Ｃａｓ６ポリペプチドの他の例は、当業者に公知であり、例えば、ＣＯＧ１５８３群のポリペプチドのメンバー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネットサイトを介して、Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＯＧ）のウェブページで入手可能であり、また、Ｔａｔｕｓｏｖら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：６３１〜６３７頁；およびＴａｔｕｓｏｖら（２００３年）、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、４巻（１号）：４１頁も参照されたい）、受託番号ＩＰＲＯ１０１５６であるＩｎｔｅｒＰｒｏファミリーのメンバー（Ｍａｋａｒｏｖａら（２００２年）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０巻：４８２〜４９６頁；およびＨａｆｔら（２００５年）、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁、４７４〜４８３頁）を参照されたい。

全てがＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を組み込む３種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が存在する。Ｉ型およびＩＩＩ型のいずれも、ｃｒＲＮＡに完全にプロセシングされると、ｃｒＲＮＡと相補的な核酸を切断することが可能な多重Ｃａｓタンパク質複合体をアセンブルするプレｃｒＲＮＡをプロセシングするＣａｓエンドヌクレアーゼを有する。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、ｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡ内のリピート配列と相補的なトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩによるプロセシングを誘発する、異なる機構を使用して産生される。次いで、Ｃａｓ９は、成熟ｃｒＲＮＡと相補的な標的ＤＮＡを切断することが可能であるが、Ｃａｓ９による切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合、およびｃｒＲＮＡ内のＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）と称する短いモチーフの存在の両方に依存する（Ｑｉら（２０１３年）、Ｃｅｌｌ、１５２巻：１１７３頁を参照されたい）。加えてまた、ｔｒａｃｒＲＮＡも、その３’端においてｃｒＲＮＡと塩基対合するので存在しなければならず、この会合により、Ｃａｓ９活性が誘発される。

Ｃａｓ９タンパク質は、一方のヌクレアーゼドメインが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似するのに対し、他方のヌクレアーゼドメインは、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインと相似する、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＨＮＨ型のドメインが、ｃｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖の切断の一因となると考えられるのに対し、Ｒｕｖドメインは、非相補的鎖を切断する。

ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要請は、通常ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングにより形成されるヘアピンを含む、操作された「単鎖ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を使用することにより回避することができる（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻：８１６頁；およびＣｏｎｇら（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が、Ｃａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成されると、操作ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡを切断するように、Ｃａｓ９を誘導する。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作ｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡ誘導型ゲノムエディティング（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ、同上を参照されたい）に使用され、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるゼブラフィッシュ胚のゲノムエディティングに有用となっており（Ｈｗａｎｇら（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻（３号）：２２７頁を参照されたい）、エディティング効率は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様である。

ある種の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、自然発生Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」でありうる。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、定性的な生物学的特性を天然配列ポリペプチドと共有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらが、対応する天然配列ポリペプチドと生物学的活性を共有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定される生物学的活性とは、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合的修飾体、およびこれらの融合体を包摂する。

「Ｃａｓポリペプチド」とは、全長Ｃａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素的に活性の断片、およびＣａｓポリペプチドまたはその断片の酵素的に活性の誘導体を包摂する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合的修飾体が含まれるがこれらに限定されない。

Ｃａｓタンパク質およびＣａｓポリペプチドは、細胞から得ることもでき、化学合成することもでき、これらの２つの手順の組合せを介することもできる。細胞は、天然においてＣａｓタンパク質をもたらす細胞の場合もあり、天然においてＣａｓタンパク質をもたらし、かつ、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルでもたらすか、または外因的に導入された核酸であって、内因性Ｃａｓと同じであるかもしくは異なるＣａｓをコードする核酸に由来するＣａｓタンパク質をもたらすように遺伝子操作された細胞の場合もある。いくつかの場合には、細胞は、天然ではＣａｓタンパク質をもたらさず、Ｃａｓタンパク質をもたらすように遺伝子操作されている。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、遺伝子発現を阻害するのにも使用することができる。Ｌｅｉら（（２０１３年）、Ｃｅｌｌ、１５２巻（５号）：１１７３〜１１８３頁）は、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、触媒的に不活性のＣａｓ９を、ガイドＲＮＡと共に共発現させると、転写的伸長、ＲＮＡポリメラーゼの結合、または転写因子の結合に特異的に干渉しうる、ＤＮＡ認識複合体を生成させることを示している。この系は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と呼ばれ、ターゲティングされた遺伝子の発現を効率的に抑制しうる。

加えて、それらの切断ドメイン内に、それらが二本鎖切断（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を誘導することを不可能とし、代わりに、標的ＤＮＡにニックを導入する突然変異を含むＣａｓタンパク質（「Ｃａｓ９ニッキング酵素」；Ｃｏｎｇら、同上を参照されたい）も開発されている。

本発明のＣａｓタンパク質は、機能性を変化させるように突然変異させることができる。ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号のほか、ＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７において開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合性ドメインへの結合特異性の増強については、例えば、共有のＷＯ０２／０７７２２７においても記載されている。標的部位、ＤＮＡ結合性ドメイン、ならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）をデザインおよび構築するための方法の選択は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号において詳細に記載されている。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡの構成要素
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成要素：ｔｒａｃｒＲＮＡと、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）がそれぞれの間に介在しているヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイとを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ゲノム操作を達成するには、これらのＲＮＡの機能のいずれもが存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を介して、または別個のＲＮＡとしてもたらされる。他の実施形態では、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（また、単鎖ガイドＲＮＡとも称する）を創出するように、操作成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）を、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用をもたらす）に融合させた、キメラＲＮＡ（Ｊｉｎｅｋ、同上；およびＣｏｎｇ、同上を参照されたい）を構築する。

キメラＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的と相補的な配列を含むように操作することができる。ＲＮＡは、標的に対して相補性であり、Ｇ［ｎ１９］の形態の２２塩基に続いて、ＮＧＧの形態のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。したがって、一方法では、ｓｇＲＮＡは、対象の遺伝子内の公知のＺＦＮ標的を活用して、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関与性のゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種の）の基準配列で配列決定すること；（ｉｉ）ＺＦＮハーフ部位の間のスペーサー領域を同定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域（複数のこのようなモチーフがスペーサーと重複する場合は、スペーサーに対して中央よりのモチーフを選択する）と最も近接するモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定すること；（ｉｖ）このモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することによりデザインすることができる。この方法は、立証されたヌクレアーゼ標的に依拠して有利である。代替的に、ｓｇＲＮＡは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧの式に適合する適切な標的配列を同定することによるだけで、任意の対象の領域を標的とするようにデザインすることもできる。

標的部位
上記で詳細に記載した通り、ＤＮＡ結合性ドメインは、遺伝子座内、例えば、グロビン遺伝子内またはセーフハーバー遺伝子内の任意の選り抜きの配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合性ドメインは、自然発生のＤＮＡ結合性ドメインと比較して新規の結合特異性を有しうる。操作法は、合理的デザインおよび多様な種類の選択を含むがこれらに限定されない。合理的デザインは、例えば、三連（または四連）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、亜鉛フィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースであって、各三連または四連のヌクレオチド配列が、特定の三連または四連の配列に結合するＤＮＡ結合性ドメインの１または複数のアミノ酸配列と関連するデータベースの使用を含む。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、ＴＡＬエフェクタードメインの合理的デザインも実施することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

ＤＮＡ結合性ドメインに適用可能な、例示的な選択法であって、ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号のほか、ＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７において開示されている。

標的部位、ヌクレアーゼ、ならびに融合タンパク質（および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）をデザインおよび構築するための方法の選択は、当業者に公知であり、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号において詳細に記載されている。

加えて、これらの参考文献および他の参考文献において開示されている通り、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、マルチフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の適切なリンカー配列を使用して、一体に連結することができる。６アミノ酸以上の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書で記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合性ドメインの間の適切なリンカーの任意の組合せを含みうる。また、米国特許出願公開第２０１１０２８７５１２号も参照されたい。

ドナー
上記で言及した通り、例えば、タンパク質を発現させるか、突然変異体遺伝子を矯正するか、または野生型遺伝子の発現を増大させるための、外因性配列（また、「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入が提供される。ドナー配列は典型的に、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことがたやすく明らかであろう。ドナー配列は、対象の位置における効率的なＨＤＲを可能とする相同な２つの領域で挟まれた、非相同配列を含有しうる。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチン内の対象の領域と相同ではない配列を含有する、ベクター分子も含みうる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同な複数の不連続的領域を含有しうる。例えば、正常では対象の領域内に存在しない配列のターゲティングされた挿入のためには、前記配列を、ドナー核酸分子内に存在させ、対象の領域内の配列と相同性の領域で挟むことができる。

ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり；一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり；直鎖状形態で細胞に導入することもでき、環状形態で細胞に導入することもできる。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号、同第２０１１０２８１３６１号、同第２０１１０２０７２２１号、および米国出願第１３／８８９，１６２号を参照されたい。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法で保護する（例えば、エクソヌクレアーゼによる核酸分解から）ことができる。例えば、１または複数のジデオキシヌクレオチド残基を、直鎖状分子の３’端に付加し、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドを、一方もしくは両方の末端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端のアミノ基の付加および、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびＯ−メチルリボース残基、またはデオキシリボース残基など、修飾ヌクレオチド間連結の使用を含むがこれらに限定されない。

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生剤耐性をコードする遺伝子など、さらなる配列を有するベクター分子の一部として、細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として導入することもでき、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体化させた核酸として導入することもでき、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することもできる。

ドナーは一般に、その発現が、組込み部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１など）の発現を駆動するプロモーターに駆動されるように挿入する。しかし、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含みうることが明らかとなろう。

ドナー分子は、内因性遺伝子のうちの全てを発現させるように内因性遺伝子に挿入することもでき、内因性遺伝子のうちの一部を発現させるように内因性遺伝子に挿入することもでき、内因性遺伝子のうちのいずれも発現させないように内因性遺伝子に挿入することもできる。例えば、本明細書で記載される導入遺伝子は、内因性グロビン配列のうちの一部を、例えば、導入遺伝子との融合体として発現させるように、グロビン遺伝子座に挿入することもでき、内因性グロビン配列のうちのいずれも、例えば、導入遺伝子との融合体としては発現させないように、グロビン遺伝子座に挿入することもできる。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、グロビンコード配列を伴う導入遺伝子またはグロビンコード配列を伴わない導入遺伝子）を、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込む。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。

さらなる（例えば、グロビン）配列（内因性配列または導入遺伝子の一部）を、導入遺伝子と共に発現させる場合、さらなる配列は、全長配列（野生型または突然変異体）の場合もあり、部分的配列の場合もある。さらなる（例えば、グロビン）配列は、機能的であることが好ましい。これらの全長グロビン配列または部分的グロビン配列の機能の非限定的例は、導入遺伝子（例えば、治療的遺伝子）が発現させるポリペプチドの血清半減期を延長すること、および／もしくはキャリアとして作用すること、ポリペプチドの宿主細胞からの分泌を引き起こすこと、またはアルファグロビン鎖／ベータグロビン鎖の不均衡および結果として生じるＲＢＣに対するアルファ−ポリマー毒性を予防することを含む。

さらに、発現には要請されないが、外因性配列はまた、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム導入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列も含みうる。

ある種の実施形態では、外因性配列（ドナー）は、対象のタンパク質の融合体、および、その融合パートナーとして、融合タンパク質を細胞の表面上に位置させる、膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。これにより、導入遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＲＢＣの表面上で発現すると、被験体の血清中で作用することが可能となる。環境毒素への曝露のための処置の場合、ＲＢＣの表面上で導入遺伝子融合体によりコードされる酵素は、血清中で蓄積される毒性化合物に作用する。加えて、ＲＢＣ分解の正常なコースの通り、操作された過剰発現タンパク質を保有するＲＢＣが、脾臓マクロファージにより貪食される場合、マクロファージがＲＢＣを貪食するときに形成されるリソソームは、膜結合融合タンパク質または細胞質過剰発現タンパク質を、リソソーム内の異常に高い濃度の毒性産物／代謝中間体に、その酵素により自然に好適なｐＨで曝露するであろう。潜在的融合パートナーの非限定的例を、下記の表１に示す。

さらに、本発明のドナー（導入遺伝子）は、対象の化合物に作用し、対象の化合物を分解し、かつ／または対象の化合物の解毒が可能な特異的タンパク質を含みうる。毒素が血流を介して移動する間に、毒素のＲＢＣ内への拡散の後で、毒素の分解が生じるように、これらのタンパク質は、ＲＢＣ内で産生され、保持されることが可能である。代替的に、タンパク質（例えば、酵素）は、ＲＢＣの表面にアンカリングすることができ、この場合、タンパク質（例えば、酵素）は、ＲＢＣの外側の血清中で毒素に作用するであろう。タンパク質はまた、ＲＢＣにより、血流に放出または分泌させることもできる。考慮されうるタンパク質は、毒素がもはや毒性でなくなるように、毒素を部分的または完全に分解するタンパク質を含む。他の種類の導入遺伝子は、ＲＢＣが循環から除去されるまで、化合物（すなわち、重金属原子）を隔離する導入遺伝子でありうる。複数の導入遺伝子を、任意の組合せで使用することができる。

毒素（例えば、神経作用物質）の機能を遮断する任意の遺伝子産物を使用することができる。毒素の分解および／または遮断において有用な遺伝子産物の非限定的例は、広範なスペクトルにわたる有機リン酸神経作用物質を分解するように操作しうる、カルボキシルエステラーゼ（ＣａＥ）、抗体、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）、ウシ胎仔血清ＡＣｈＥ（ＦＢＳ−ＡＣｈＥ）、ウマ血清ブチリルコリンエステラーゼ（ＥｑＢＣｈＥ）などのコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａに由来するホスホトリエステラーゼ、および／または血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＰＯＮ１）；ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）を分解するためのペルオキシダーゼ；重金属を解毒するためのメタロチオネインであるフィトケラチンを含む。

他の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積症を伴う被験体において欠如または欠損する産物を産生させる。なおさらなる実施形態では、産生されるタンパク質産物により、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ：ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）と関連する症状を処置、予防、および／または改善する。ＬＳＤとは、正常では老廃物である脂質、糖タンパク質、およびムコ多糖の分解に関与する、機能的な個別のリソソームタンパク質の欠如を特徴とする、稀な代謝性単一遺伝子疾患の群である。例えば、表２を参照されたい。これらの疾患は、特異的酵素の機能不全に起因して、それらをリサイクルのために処理することが不可能であるので、細胞内のこれらの化合物の蓄積を特徴とする。最も一般的な例は、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症：遺伝子名ＧＢＡ）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ欠損症：ＧＬＡ）、ハンター病（イヅロン酸−２−スルファターゼ欠損症：ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ−Ｌ−イヅロニダーゼ欠損症：ＩＤＵＡ）、およびニーマン−ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症：ＳＭＰＤ１）である。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／８３９，３３６号を参照されたい。

リソソーム蓄積症は典型的に、５つのクラスに分けられる。これらのクラスを、疾患の具体例と共に下記の表２に示す。したがって、本明細書で記載されるドナー分子（導入遺伝子）は、リソソーム蓄積症を伴う被験体において欠如または欠損する１または複数の酵素であって、表２に示されるタンパク質を含むがこれらに限定されない酵素をコードする配列を含みうる。

いくつかの場合には、ドナーは、改変された内因性遺伝子でありうる。酵素置きかえ療法に対する抗体応答は、問題の特異的治療用酵素および個別の患者に応じて変化するが、酵素の置きかえで処置される多くのＬＳＤ患者において、著明な免疫応答が認められている。加えてまた、これらの抗体の、処置の有効性に対する関与性も可変的である（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｐｏｎｄｅｒ（２００８年）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８巻（８号）：２６８６頁を参照されたい）。したがって、本発明の方法および組成物は、このようなドナーにより産生されるポリペプチドの免疫原性が小さくなるように、内因性免疫応答のためのプライミングエピトープであることが公知の部位において、機能的にサイレントのアミノ酸変化によりその配列を変化させたドナー分子の使用を含みうる。

本発明の方法および組成物は、治療剤の脳への送達を増大させる方法と共に使用することができる。脳毛細血管の細胞間の密着結合の一過性の開裂を引き起こすいくつかの方法が存在する。例は、高張性マンニトール溶液の頸動脈内投与の使用、焦点化された超音波の使用、およびブラジキニン類似体の投与を介する一過性の浸透圧性破壊を含む。代替的に、治療剤は、脳への特異的輸送のための受容体または輸送機構を使用するようにデザインすることもできる。使用しうる特異的受容体の例は、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１および２（ＬＲＰ−１：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ １およびＬＲＰ−２）を含む。ＬＲＰは、ａｐｏＥ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１など、ある範囲の分泌タンパク質と相互作用することが公知であるので、これらのタンパク質のうちの１つに由来するＬＲＰの認識配列を融合させることにより、ＲＢＣ前駆体内の治療用タンパク質の発現および成熟ＲＢＣから血流への分泌の後において、酵素の脳への輸送を容易とすることができる（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ（２０１０年）、同上を参照されたい）。

送達
本明細書で記載されるヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段によりｉｎ ｖｉｖｏで送達することもでき、ｅｘ ｖｉｖｏで送達することもできる。

本明細書で記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、それらの全ての開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号において記載されている。

本明細書で記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物はまた、亜鉛フィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のうちの１または複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系を使用することができる。また、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのうちのいずれかは、処置に必要とされる配列のうちの１または複数を含みうることが明らかとなろう。したがって、１または複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞に導入する場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクターにより運び入れることもでき、異なるベクターにより運び入れることもできる。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１または複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含みうる。

従来のウイルスベースの遺伝子導入法および非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を、細胞内（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織内に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達媒体と複合体化させた核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後においてエピソームゲノムまたは組込みゲノムを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）（１９９５年）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。

核酸の非ウイルス的送達法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強取込みを含む。また、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。

さらなる例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供される核酸送達系を含む（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号において記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識型リポフェクションに適するカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４によるカチオン性脂質および中性脂質を含む。

免疫脂質複合体など、ターゲティングされたリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

さらなる送達法は、送達される核酸の、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達媒体（ＥＤＶ：ＥｎＧｅｎｅＩＣ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが、標的組織への特異性を有し、他方のアームが、ＥＤＶへの特異性を有する、二特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体により、ＥＤＶは、標的細胞表面に到達し、次いで、ＥＤＶは、エンドサイトーシスにより、細胞に到達する。細胞内に至ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）：６４３頁を参照されたい）。

操作されたヌクレアーゼおよび／またはドナーをコードする核酸を送達するための、ＲＮＡウイルスベースの系またはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特異的細胞にターゲティングし、ウイルスのペイロードを核にトラフィキングするための、高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与（ｉｎ ｖｉｖｏ）することもでき、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて処置し、改変細胞を被験体に投与（ｅｘ ｖｉｖｏ）するのに使用することもできる。ヌクレアーゼおよび／またはドナーを送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法により可能であり、挿入された導入遺伝子の長期間にわたる発現を結果としてもたらすことが多い。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。

レトロウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を増殖させることにより変化させることができる。レンチウイルスベクターとは、非分裂細胞に形質導入または感染することが可能であり、典型的に高いウイルス力価をもたらすレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来の配列に対するパッキング能を伴う、シス作用型の長末端リピート（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含む。ベクターを複製およびパッキングするには、最小限のシス作用型のＬＴＲで十分であり、次いで、これらを使用して、治療用遺伝子を、標的細胞に組み込み、恒久的な導入遺伝子発現をもたらす。広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組合せに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

一過性の発現が好ましい適用では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要請しない。このようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生させることができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ」）ベクターも、細胞に標的核酸を形質導入するのに使用され、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核酸およびペプチドの産生、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療手順に使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含むいくつかの刊行物において記載されている。

現在、ヘルパー細胞系に挿入される欠損ベクターの、遺伝子による補完を伴う手法を使用して、形質導入剤を作り出す、少なくとも６つのウイルスベクター法が、臨床試験における遺伝子導入のために利用可能である。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓによりパッキングされたベクターについては、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年））。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターは、２型アデノ随伴ウイルスである、欠損性で非病原性のパルボウイルスに基づく、有望な代替的遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットを挟む、１４５ｂｐのＡＡＶ逆位末端リピートだけを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノムへの組込みに起因する、効率的な遺伝子導入および安定的な導入遺伝子送達が、このベクター系の鍵となる特徴である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ、３５１巻：９１１７号、１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。また、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶなどを含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従い使用されうる。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ：ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）は、高力価で産生させ、いくつかの異なる細胞型にたやすく感染させることができる。大半のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子により、Ａｄ Ｅ１ａ遺伝子、Ａｄ Ｅ１ｂ遺伝子、および／またはＡｄ Ｅ３遺伝子を置きかえ、その後、欠失させた遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において複製欠損ベクターを繁殖させるように、操作する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉において見出される細胞など、非分裂性の分化細胞を含む複数種類の組織に、ｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな搬送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用さらなる例は、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）を含む。

パッキング細胞を使用して、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成する。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターを、ウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞系により作り出される。ベクターは典型的に、パッキングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に要請される最小限のウイルス配列、発現させるタンパク質をコードする発現カセットにより置きかえられる他のウイルス配列を含有する。欠失するウイルス機能は、パッキング細胞系により、トランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは典型的に、ＡＡＶゲノムに由来する逆位末端リピート（ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列であって、ゲノムのパッケージングおよび宿主への組込みに要請されるＩＴＲ配列だけを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系内にパッキングされる。また、細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子のヘルパープラスミドからの発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、著明量ではパッキングされていない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスの感受性がＡＡＶより大きい熱処理により低減することができる。

多くの遺伝子治療適用では、遺伝子治療ベクターを、特定の組織型に対する高度の特異性により送達することが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてのリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、対象の細胞型に存在することが公知の受容体に対するアフィニティーを有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合させたヒトへレグリンを発現させるように改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現させる、ある種のヒト乳がん細胞に感染することについて報告した。この原理は、標的細胞が、受容体を発現させ、ウイルスが、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現させる、他のウイルス標的細胞対へも拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞性受容体に対する特異的結合アフィニティーを有する抗体断片（例えば、ＦａｂまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上記の記載は主に、ウイルスベクターに適用されるが、同じ原理は、非ウイルスベクターへも適用することができる。このようなベクターは、特異的標的細胞による取込みに好適な特異的取込み配列を含有するように操作することができる。

遺伝子治療ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、個別の被験体への投与により、典型的には、下記で記載される全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、筋内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）または局所適用により送達することができる。代替的に、ベクターを、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、個別の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞に送達した後、通常ベクターを組み込んだ細胞について選択した後において、細胞を、患者に再移植することができる。

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、細胞を形質導入するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、生物に直接投与することもできる。代替的に、ネイキッドＤＮＡを投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるのに通常使用される経路のうちのいずれかであって、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない経路を介する。このような核酸を投与するのに適する方法は利用可能であり、当業者に周知であり、特定の組成物を投与するのに複数の経路を使用しうるが、特定の経路により、別の経路より即時的で、かつ、より効果的な反応をもたらしうることが多い。

本明細書で記載されるポリヌクレオチドの導入に適するベクターは、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁；米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により部分的に決定されるほか、組成物を投与するのに使用される特定の方法によっても決定される。したがって、下記で記載される通り、多種多様な適切な処方の医薬組成物が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７版、１９８９年を参照されたい）。

ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物は、同じ系を使用して送達することもでき、異なる系を使用して送達することもできることが明らかであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドを、プラスミドに保有させうる一方で、１または複数のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターに保有させうる。さらに、異なるベクターは、同じ経路（筋内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与、および／または筋内注射）で投与することもでき、異なる経路で投与することもできる。ベクターは、同時に送達することもでき、任意の逐次的順序で送達することもできる。

ｅｘ ｖｉｖｏ投与およびｉｎ ｖｉｖｏ投与のいずれのための処方物も、懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分と適合的な賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せを含む。加えて、組成物は、保湿剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬など、少量の補助物質も含有しうる。

適用
本発明の方法および組成物は、治療剤がＲＢＣ内および／または造血幹細胞内で産生されるように、これらの細胞に由来する成熟ＲＢＣが治療剤を含有するように、１または複数の治療剤をコードする導入遺伝子を供給することが所望される、任意の状況下で使用することができる。

したがって、本明細書で記載される組成物および方法は、環境的曝露、業務災害を介して、または化学戦争を介して毒素に曝露されている被験体における毒素を分解するために使用することができる。この技術では、化学兵器剤への曝露の後で、神経毒素を分解することが可能な成熟ＲＢＣ内または成熟ＲＢＣ上の解毒酵素の発現が特に有用である。

加えて、本発明の組成物および方法を使用して、遺伝子疾患、例えば、リソソーム蓄積症を処置することもできる。治療用タンパク質は、成熟ＲＢＣが、タンパク質を含有するように、ＲＢＣ前駆体内で発現させることができる。このようなＲＢＣは、被験体では、タンパク質の正常な発現が異常となる疾患を処置するのに有用である。

以下の例は、ヌクレアーゼが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは、例示だけを目的とするものであり、他のヌクレアーゼ、例えば、操作されたＤＮＡ結合性ドメインを伴うホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／あるいは自然発生であるかまたは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合性ドメインと、操作された単鎖ガイドＲＮＡを含む異種切断ドメインまたはＴＡＬＥＮおよび／もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との融合体も使用しうることが察知されるであろう。

実施例１：亜鉛フィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のデザイン、構築、および一般的特徴付け
本質的には、Ｕｒｎｏｖら（２００５年）、Ｎａｔｕｒｅ、４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁；Ｐｅｒｅｚら（２００８年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻（７号）：８０８〜８１６頁において記載されている通りに、かつ、米国特許第６，５３４，２６１号において記載されている通りに、亜鉛フィンガータンパク質をデザインし、プラスミド、ＡＡＶベクター、またはアデノウイルスベクターに組み込んだ。ヒトベータグロビン遺伝子座およびヒトＨＰＲＴ遺伝子座に特異的なＺＦＮ、ならびにヒトＨＰＲＴ遺伝子座に特異的なＴＡＬＥＮについては、米国特許第７，８８８，１２１号、ならびに米国特許出願公開第２０１３１２２５９１号および同第２０１３０１３７１０４号を参照されたい。ヒトＡＡＶＳ１に特異的なＺＦＮについては、共有の米国特許第８，１１０，３７９号を参照されたい。ＣＣＲ５に特異的なＺＦＮについては、共有の米国特許第７，９５１９，２５号を参照されたい。ＡＡＶＳ１およびＣＣＲ５に特異的なＴＡＬＥＮについては、共有の米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。ｍＲｏｓａに特異的なＺＦＮについては、共有の米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号、ｍＲｏｓａに特異的なＴＡＬＥＮについては、米国特許出願公開第２０１１０２６５１９８号を参照されたい。アルブミンに特異的なヌクレアーゼについては、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３０３０４４００８号を参照されたい。

実施例２：グロビン特異的ＺＦＮの活性
ヒトグロビン遺伝子をターゲティングするＺＦＮ対を使用して、これらのＺＦＮの、特異的標的部位においてＤＳＢを誘導する能力について調べた。表示されるＺＦＮの認識へリックス領域のアミノ酸の配列を、それらの標的部位（ＤＮＡ標的部位を大文字で表示し、非接触ヌクレオチドを小文字で表示する）と共に下記の表３に示す。また、米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号、および同第２０１３０１２２５９１号も参照されたい。

Ｐｅｒｅｚら（２００８年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻：８０８〜８１６頁；およびＧｕｓｃｈｉｎら（２０１０年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、６４９巻：２４７〜５６頁において記載されている、Ｃｅｌ−Ｉアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、ＺＦＮ誘導型改変を検出した。このアッセイでは、標的部位のＰＣＲ増幅の後、ミスマッチ検出酵素であるＣｅｌ−Ｉを使用して、挿入および欠失（インデル）の定量化を行い（Ｙａｎｇら（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９巻：３５３３〜３５４１頁）、これにより、ＤＳＢ頻度の下限の推定値をもたらした。ＺＦＮ発現ベクターの、標準状態（３７℃）におけるトランスフェクション、または低温ショック（３０℃；米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号を参照されたい）を使用するトランスフェクションの３日後、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡをＫ５６２細胞から単離した。

Ｃｅｌ−Ｉアッセイからの結果により、ＺＦＮが、それらのそれぞれの標的部位における切断を誘導することが可能なことが裏付けられた（また、米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号も参照されたい）。

実施例３：ＢＣＨＥ遺伝子のベータグロビン遺伝子座への挿入
以下の通りに、ＺＦＮを使用して、ドナーＤＮＡを、ベータグロビン遺伝子座に導入する。ドナーＤＮＡは、ＢＣＨＥ酵素をコードする配列が、ベータグロビン遺伝子内のＺＦＮ切断部位の周囲の領域と相同な配列（相同性アーム）で挟まれるようにデザインする。相同性アームは、約５００〜６００塩基対の長さである。ＢＣＨＥドナー配列は、ベータグロビン標的部位に挿入されると、ドナーの発現が、ベータグロビンプロモーターおよび他の任意のベータグロビン調節配列により調節されるように、いかなる非コード配列も欠く。挿入されると、ＢＣＨＥドナーは、内因性グロビン配列と同じフレームで融合し、融合タンパク質を結果としてもたらすか、または、代替的に、ＢＣＨＥドナーは、ベータグロビンプロモーターからのドナーの発現により、ＢＣＨＥコード配列だけを含有するタンパク質が結果としてもたらされるように挿入される。

挿入を実行するにはまず、Ｋ５６２などの細胞系を使用する。細胞を、ＺＦＮをコードするｍＲＮＡで処置し、次いで、これに、ＢＣＨＥドナーを含む、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、または一本鎖ＤＮＡを形質導入する。

ＣＤ３４＋細胞に挿入し、その後成熟改変ＲＢＣに分化させるために、同じＺＦＮおよびドナー構築物を使用して、ＢＣＨＥを、ベータグロビン遺伝子座にターゲティングする。ＺＦＮを、ｍＲＮＡとして細胞に導入し、ドナーを、当技術分野で公知の方法（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を使用して導入する。標的領域においてＰＣＲを実施することにより、形質導入細胞を遺伝子挿入について解析し、適切な制限解析および／または配列解析を実施して挿入を確認する。

トランスジェニックＣＤ３４＋細胞を、成熟ＲＢＣに分化させるために、当技術分野で公知の方法を使用する。例えば、製造元の指示書に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＣＤ３４^＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＳＣＤ ＣＤ３４^＋細胞を精製する。ＣＤ３４^＋細胞を、成長因子の存在下、ＢＩＴ ９５０００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴うイスコーブＭＤＭ中で培養する。二相式液体培養モデルを使用して、細胞を、赤血球系列に分化させる。最初の６日間（第１相）では、ＣＤ３４^＋細胞を、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）により増殖させる。次いで、増殖させた細胞を、Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）およびＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）により、赤血球系列に拘束および分化させる（第２相）。

実施例４：ヒト患者の集団を処置するための赤血球プールの構築
操作赤血球治療剤を発生させるために、選り抜きの導入遺伝子をコードするドナー（例えば、毒素を遮断もしくは分解するためのＢＣＨＥ、またはＬＳＤなど、遺伝子状態のための治療用タンパク質）を使用して、導入遺伝子を、Ｏ血液型陰性造血幹細胞（ＨＳＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）集団に挿入する。内因性遺伝子（例えば、グロビン、アルブミン、Ｒｏｓａ、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５など）にターゲティングされたヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を、ＲＮＡを介して幹細胞に導入し、任意の適切な送達系、例えば、ＺＦＮコード配列および／またはＴＡＬＥＮコード配列のためのアデノウイルスベクターを使用して、ドナーを細胞に形質導入する。ＨＳＣ内の標的へのドナーの挿入は、ＰＣＲおよび／または配列解析を使用して確認する。次いで、当技術分野で公知の技法を使用して、細胞を、赤血球に分化させ、それを必要とする患者、例えば、神経ガス剤に曝露されているもしくは曝露される可能性がある患者、またはＬＳＤなどの遺伝子状態を伴う患者に輸血する（薬学的に許容される細胞処方物を作り出した後で、かつ／または適切な状態、例えば、凍結状態において保存した後で）。

本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。

理解の明確さを目的とする例示および例として、ある程度詳細に開示を行ったが、本開示の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、当業者には、多様な変化および改変を行いうることが明らかであろう。したがって、前出の記載および例は、限定的なものとしてみなすべきではない。

Claims (12)

1. タンパク質を発現させる組込み型導入遺伝子を含む単離された遺伝子改変Ｏ型陰性（Ｏ−）赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞であって、前記タンパク質が、１種または複数種の毒素を分解もしくは解毒し、さらに、前記導入遺伝子が、グロビン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子に組み込まれている、ＲＢＣ前駆細胞。
2. 前記グロビン遺伝子が、ベータグロビン遺伝子またはガンマグロビン遺伝子である、請求項１に記載のＲＢＣ前駆細胞。
3. 前記タンパク質を前記細胞中に保持する、請求項１または２に記載のＲＢＣ前駆細胞。
4. 前記導入遺伝子が膜タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列を含み、かつ前記膜タンパク質が、前記細胞の表面上に局在化している、請求項１または２に記載のＲＢＣ前駆細胞。
5. 前記導入遺伝子が内因性配列と共に発現される、請求項１から４のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞。
6. 前記内因性配列が、前記導入遺伝子タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分またはカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する、請求項５に記載のＲＢＣ前駆細胞。
7. 前記導入遺伝子が、前記ＲＢＣ前駆細胞のゲノムに、ヌクレアーゼにより前記ゲノムを切断した後で組み込まれる、請求項１から６のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞。
8. 前記ヌクレアーゼが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ系を含む、請求項７に記載のＲＢＣ前駆細胞。
9. 胎児性ヘモグロビンを発現させる、請求項１から８のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞。
10. 毒素の分解または毒素の作用の解毒を必要とする被験体において毒素を分解するかまたは毒素の作用を解毒するための組成物であって、請求項１から９のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞を含む、組成物。
11. 注入で投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
12. 請求項１から９のいずれかに記載のＲＢＣ前駆細胞から分化したＲＢＣであって、毒素を分解もしくは解毒するタンパク質を含むＲＢＣ。