CN108883133A - 使用红细胞的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过用调节与红细胞相关的蛋白的水平的各种药剂或条件引发红细胞并向对象施用引发的红细胞来调节对象或靶细胞中蛋白水平的方法。所公开的方法代表了被引发以表达许多蛋白的红细胞作为许多疾病或障碍的细胞疗法的新用途。

Description

使用红细胞的治疗方法
技术领域
本发明一般涉及血液学领域。更具体地，本发明涉及改性的红细胞(RBC)/红细胞(erythrocyte)和利用它们的细胞疗法。
交叉引用
本申请要求2015年12月22日提交的题为“使用红细胞的治疗方法(TherapeuticMethods Using Erythrocytes)”第2015905309号澳大利亚申请的优先权并且与其相关。本申请通过引用整体并入本文。另外，本发明中提及的其他参考文献或出版物也通过引用整体并入本文。
背景
细胞疗法已成为许多疾病和病症的有希望的治疗方式，包括癌症、感染性疾病、移植、自身免疫疾病、感染性疾病、炎症和免疫缺陷。这样的疗法也用作标准治疗的辅助手段。
在许多情况下，细胞疗法试图调节患者自身免疫系统的要素以减轻关注的疾病或病症。免疫系统由组织、器官和细胞网络组成，例如T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、细胞因子等。细胞疗法可以改变称为细胞因子的信号传导分子的活性，所述细胞因子介导/调节许多过程，包括免疫、炎症和造血作用。
RBC是血液中丰富的细胞组分，占其体积的40％-50％。尽管如此，除了那些旨在治疗直接涉及RBC的疾病和病症的治疗方法外，在治疗方法的设计中没有给予其足够的考虑。传统上认为RBC几乎不参与免疫应答的产生或细胞发育、生长和修复。因此，他们作为操纵这些过程的潜在手段被忽视。例如，尚未考虑或证明使用RBC来调节细胞因子环境。
尽管迄今为止已经从一些细胞疗法中产生了一些鼓舞人心的结果，但是需要改进以提高现有和未来治疗的有效性。这些改进的治疗可以至少部分地依赖于利用RBC，因为它们是血液中丰富的细胞类型。
发明概述
本发明人惊奇地发现，RBC通过分泌和/或汇集各种蛋白如细胞因子、趋化因子和生长因子，在调节细胞因子环境中起重要作用。
不受理论束缚，假设RBC可以充当可以在各种条件下释放的各种蛋白的储库。如本文所证明的，可以诱导RBC汇集或释放这些蛋白，从而提供调节其他细胞类型和生物过程的手段。这转而有助于设计改进的治疗方法。
以下列出了本发明的非限制性实施方案。
某些实施方案涉及用于调节对象中的至少一种蛋白的水平的方法，包括：通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或至少一种条件接触，产生引发的红细胞；和向所述对象施用一种或多种选自以下的引发的红细胞组分：引发的红细胞、通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液、由引发的红细胞获得的裂解物、由引发的红细胞获得的膜和由引发的红细胞产生的红细胞血影或膜，其中向对象施用一种或多种引发的红细胞组分调节对象中的至少一种蛋白的水平。在一些实施方案中，一种或多种引发的红细胞组分在引发红细胞的过程中和/或引发红细胞之后获得。在其他实施方案中，红细胞是从所述对象获得的。在又其他实施方案中，红细胞不是从所述对象获得的。在其他实施方案中，施用的一种或多种引发的红细胞组分是通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液。
在一些其他实施方案中，至少一种药剂是选自以下的一种或多种药剂：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂和细胞。在其他实施方案中，至少一种药剂选自蛋白酶抑制剂、抗凝剂、癌细胞、干细胞和免疫细胞。在又其他实施方案中，至少一种条件是剪切应力、低氧或高氧。在其他实施方案中，红细胞从一种或多种选自以下的来源获得：至少一种对象、至少一种细胞库和至少一种细胞系。在再其他实施方案中，对象是人或非人哺乳动物。在某些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的方法向所述对象施用一种或多种引发的红细胞组分。
在再其他实施方案中，一种或多种红细胞蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质组分和酶。在一些实施方案中，一种或多种红细胞蛋白是细胞因子、趋化因子或生长因子。
某些实施方案涉及调节靶细胞活性的方法，包括：通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或条件接触，产生引发的红细胞；和将所述靶细胞与一种或多种选自以下的引发的红细胞组分混合：引发的红细胞、通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液、从引发的红细胞获得的裂解物、从引发的红细胞获得的膜和由引发的红细胞产生的红细胞血影或膜，其中将所述靶细胞与一种或多种引发的红细胞组分混合调节靶细胞活性。在一些实施方案中，引发的红细胞调节一种或多种选自以下的靶细胞活性：细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和细胞修复。在其他实施方案中，靶细胞是选自以下的一种或多种：免疫细胞、永生化细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和滑膜细胞。在再其他实施方案中，免疫细胞是选自以下的一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在再其他实施方案中，癌细胞是选自以下的一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞和/或癌性血细胞。在又其他实施方案中，干细胞是选自以下的一种或多种：全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如，来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
在某些实施方案中，混合包括选自以下的过程：将靶细胞与引发的红细胞一起孵育、培养、共培养和组合。在其他实施方案中，靶细胞来自对象。在再其他实施方案中，靶细胞在对象内。
在又其他实施方案中，向对象施用靶细胞。在再其他实施方案中，向对象施用一种或多种选自以下的靶细胞组分：靶细胞、靶细胞血影、靶细胞膜、靶细胞裂解物、靶细胞级分和通过孵育或培养靶细胞产生的上清液。在一些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向对象施用以下一种或多种：引发的红细胞、引发的红细胞组分、靶细胞和靶细胞组分。
在某些其他实施方案中，对象患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及预防、治疗或改善疾病或障碍的方法，包括向有需要的对象施用根据本文提供的方法中的一种或多种产生的红细胞和/或靶细胞。在一些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述对象施用红细胞和/或靶细胞。在其他实施方案中，对象是人或非人哺乳动物。在又其他实施方案中，疾病或障碍选自癌症、感染性疾病、器官衰竭、自身免疫疾病、自身免疫障碍、炎症和免疫缺陷。
在一些实施方案中，与红细胞相关的蛋白中的一种或多种的水平升高和/或降低。在其他实施方案中，一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平升高和/或降低。在某些其他实施方案中，一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平升高。在再其他实施方案中，一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平降低。
在又其他实施方案中，使用一种或多种抗体测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平。在一些其他实施方案中，一种或多种蛋白选自：趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质组分和酶。在再其他实施方案中，一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子和生长因子。
在其他实施方案中，至少一种药剂是选自以下的一种或多种药剂：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂和细胞。在一些实施方案中，至少一种条件是剪切应力、低氧或高氧。在再其他实施方案中，引发的红细胞调节一种或多种靶细胞的活性。在又其他实施方案中，向对象施用所述引发的红细胞。
某些实施方案涉及引发红细胞的方法，所述方法包括：测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平，使红细胞与至少一种药剂或至少一种条件接触，测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平，和将一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之前与红细胞相关的蛋白的水平与一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之后与红细胞相关的蛋白的水平进行比较，其中，一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平差异表明红细胞已经被引发。在一些实施方案中，测量与红细胞相关的一种或更多种蛋白、两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白、十种或更多种蛋白、十一种或更多种蛋白、十二种或更多种蛋白、十三种或更多种蛋白、十四种或更多种蛋白、或十五种或更多种蛋白的水平。在其他实施方案中，测量与红细胞相关的三种或更多种蛋白的水平。在还其他实施方案中，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种或至少十五种的水平存在差异。在再其他实施方案中，至少三种与红细胞相关的蛋白的水平存在差异。在某些其他实施方案中，一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之前与红细胞相关的蛋白的水平与一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之后与红细胞相关的蛋白的水平相比的差异通过选自以下的统计分析确定：学生T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和和Spearman秩相关。
某些实施方案涉及升高或降低在对象的细胞上或细胞内的靶蛋白的水平的方法，所述方法包括：处理红细胞(RBC)以使存在于RBC内和/或与RBC表面相关的靶蛋白的水平升高或降低，和向所述对象施用以下一种或多种：(i)所述处理后的RBC，(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解RBC获得的RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤RBC获得的细胞洗液，(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的RBC的培养物获得的培养上清液，(v)(i)-(iv)的组合，从而升高或降低细胞上或细胞内的靶蛋白的水平。在一些实施方案中，进行所述处理的RBC是从对象获得的。在另一个实施方案中，进行所述处理的RBC不是从对象获得的。
在某些实施方案中，向对象使用的RBC是RBC血影。在某些其他实施方案中，靶蛋白的升高或降低的水平诱导或调节细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和/或细胞修复。在其他实施方案中，靶蛋白的升高或降低的水平诱导或调节对象中的免疫应答。在某些其他实施方案中，向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：(i)RBC，(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)细胞洗液，(iv)培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。在一些其他实施方案中，对象是哺乳动物对象、人对象或二者。
某些实施方案涉及诱导或调节靶细胞的功能的方法，所述方法包括：处理RBC以使存在于RBC内或与RBC表面相关的靶蛋白的水平升高或降低，和将所述靶细胞与以下一种或多种混合：(i)所述处理后的RBC，(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解RBC获得的RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤RBC获得的细胞洗液，(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的RBC的培养物获得的培养上清液，(v)(i)-(iv)的组合，从而诱导或调节靶细胞的功能。在一些实施方案中，靶细胞是以下一种或多种：免疫细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和/或髓样细胞。在又其他实施方案中，免疫细胞是以下一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一些其他实施方案中，癌细胞是以下一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞和/或癌性血细胞。在再其他实施方案中，所述干细胞是以下一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、间充质干细胞或其组合。
在某些实施方案中，靶细胞是干细胞，并且混合朝向特定细胞谱系引发干细胞。在某些其他实施方案中，该方法还包括向患有或易患给定疾病或障碍的对象施用：(i)所述混合后的靶细胞，(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解靶细胞获得的靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤靶细胞获得的细胞洗液，(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的靶细胞的培养物获得的培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。在其他实施方案中，向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：(i)靶细胞，(ii)靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，(iii)靶细胞洗液，(iv)靶细胞培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。
在某些实施方案中，所述方法还包括向对象施用：(i)RBC，(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)细胞洗液，(iv)培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。在一些实施方案中，向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：(i)RBC，(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)细胞洗液，(iv)培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。在某些其他方面中，向对象局部施用：(i)靶细胞，(ii)靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，(iii)靶细胞洗液，(iv)靶细胞培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合；并且向对象全身或局部施用：(i)RBC，(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，(iii)细胞洗液，(iv)培养上清液，或(v)(i)-(iv)的组合。
在某些实施方案中，对象是哺乳动物对象、人对象或二者。在某些其他实施方案中，对象患有组织损伤、癌症、炎性疾病或病症或免疫障碍。在一些其他实施方案中，RBC和/或靶细胞是从对象获得的。在再其他实施方案中，RBC和/或靶细胞不是从对象获得的。
在某些其他实施方案中，处理包括以下一种或多种：使红细胞与蛋白酶抑制剂接触，使红细胞与抗凝剂接触，裂解红细胞，使红细胞经受剪切应力，用氧处理所述红细胞，和/或使红细胞丧失氧。在其他实施方案中，蛋白酶抑制剂选自：抑肽酶、亮抑酶肽、α2-巨球蛋白、抗蛋白酶二盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、TLCK(CAS 131918-97-3)、胰蛋白酶抑制剂、Pefabloc SC(Roche)、PMSF(C6H5CH2SO2F-Thermo Fisher Scientific)、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)或其组合。在一些实施方案中，抗凝剂选自群组。
在某些其他实施方案中，靶蛋白是细胞因子、趋化因子或生长因子中的一种或多种。在再其他实施方案中，靶蛋白是炎性细胞因子或炎性趋化因子。在某些实施方案中，靶蛋白的水平升高。在其他实施方案中，所述靶蛋白选自：CTACK、GRO-α、βFGF、G-CSF、CM-CSF、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2rα、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12-40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IP-10、LIF、MCP-1、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-bb、RANTES、SDF-1α、TNF-α、TNF-β、TRAIL、VEGF或其组合。在某些其他实施方案中，靶蛋白水平降低。在一些实施方案中，靶蛋白选自：IFN-α2、IFN-γ、IL-1β、IL-8、IL-9、IL-12p70、IL-16、IL-17、IL-18、MIF、TNF-α、IL-2rα、IL-4、CTACK、GRO-α、IL-18、MCP-1、MIP-1、GRO-α、MIP-1β、RANTES、SDF-1α、βFGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IL-3、IP-10、M-CSF、PDFG-bb、VEGF、IL-2、IL-6、IL-12p40及其组合。
在某些实施方案中，所述方法用作辅助疗法。在其他实施方案中，所述方法用作治疗组织损伤、癌症、炎性疾病或病症和/或免疫障碍的辅助疗法。
附图简述
现在将参考附图仅通过示例的方式描述本公开的本发明实施方案。
图1含有用不同浓度的肝素和EDTA孵育或培养的RBC或血影的血浆中的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)浓度(n＝1)。
图2用不同浓度的肝素和EDTA孵育或培养后的RBC裂解物和血影“裂解物”的MIF浓度(n＝1)。
图3在含有或不含rMIF的情况下，在肝素、EDTA、柠檬酸盐或无抗凝剂中收集RBC并在PBS中培养24小时(n＝1)。
图4A-图4O在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，从RBC释放或分泌到PBS中的促炎蛋白的总结，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图5A-图5E是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，从RBC释放或分泌到PBS中的抗炎蛋白的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图6A-图6K是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，从RBC释放或分泌到PBS中的趋化因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图7A-图7M是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，从RBC释放或分泌到PBS中的生长因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图8A-图8D是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，从RBC释放或分泌到PBS中的具有多种功能的蛋白的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图9A-图9O是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的裂解物中的促炎细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图10A-图10E是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的裂解物中的抗炎细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图11A-图11K是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的裂解物中的趋化因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图12A-图12M是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的裂解物中的生长因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图13A-图13D是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的裂解物中的具有多种因子的细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图14A-图14O是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的分泌物、裂解物和重组蛋白加标中的促炎细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图15A-图15E是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的分泌物、裂解物和重组蛋白加标中的抗炎细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图16A-图16K是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的分泌物、裂解物和重组蛋白加标中的趋化因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图17A-图17M是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的分泌物、裂解物和重组蛋白加标中的生长因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图18A-图18D是一系列图表，显示在含有和不含蛋白酶抑制剂的情况下，在PBS中孵育后，RBC的分泌物、裂解物和重组蛋白加标中的具有多种功能的细胞因子的浓度，和在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的BioPlex标准。数据表示为平均值±SD，*表示p<0.05的显著差异(对于27-元，n＝3，对于21-元，n＝5)。
图19A-图19O是一系列图表，显示在与MSC孵育之前和之后，RBC的裂解物中的促炎细胞因子的浓度，和在37℃下在72小时后通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的MSC和/或RBC的分泌物。数据表示为平均值±SD(n＝1)。
图20A-图20E是一系列图表，显示在与MSC孵育之前和之后，RBC的裂解物中的抗炎细胞因子的浓度，和在37℃下在72小时后通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的MSC和/或RBC的分泌物。数据表示为平均值±SD(n＝1)。
图21A-图21K是一系列图表，显示在与MSC孵育之前和之后，RBC的裂解物中的趋化因子的浓度，和在37℃下在72小时后通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的MSC和/或RBC的分泌物。数据表示为平均值±SD(n＝1)。
图22A-图22M是一系列图表，显示在与MSC孵育之前和之后，RBC的裂解物中的生长因子的浓度，和在37℃下在72小时后通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的MSC和/或RBC的分泌物。数据表示为平均值±SD(n＝1)。
图23A-图23D是一系列图表，显示在与MSC孵育之前和之后，RBC的裂解物中的具有多种功能的蛋白的浓度，和在37℃下在72小时后通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uLPBS中有2000万个RBC)的MSC和/或RBC的分泌物。数据表示为平均值±SD(n＝1)。
图24是一系列图表，显示在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的从RBC释放或分泌到PBS中的蛋白的浓度。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图25是一系列图表，显示在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的从RBC释放或分泌到PBS中的蛋白的浓度。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图26是一系列图表，显示在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的从RBC释放或分泌到PBS中的蛋白的浓度。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图27是一系列图表，显示在37℃下在24小时内通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的从RBC释放或分泌到PBS中的蛋白的浓度。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图28A-图28O是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在24小时内从RBC释放或分泌到PBS中的促炎细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的促炎细胞因子的浓度。数据表示为在添加PI±95％CI后的倍数变化，其中●表示与无PI相比，添加PI时分泌物的倍数变化，■表示与无PI对照相比，添加PI时裂解物中的浓度倍数变化(n＝7)。
图29A-图29E是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在24小时内从RBC释放或分泌到PBS中的抗炎细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的抗炎细胞因子的浓度。数据表示为在添加PI±95％CI后的倍数变化，其中●表示与无PI相比，添加PI时分泌物的倍数变化，■表示与无PI对照相比，添加PI时裂解物中的浓度倍数变化(n＝7)。
图30A-图30K是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在24小时内从RBC释放或分泌到PBS中的趋化因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的趋化因子的浓度。数据表示为在添加PI±95％CI后的倍数变化，其中●表示与无PI相比，添加PI时分泌物的倍数变化，■表示与无PI对照相比，添加PI时裂解物中的浓度倍数变化(n＝7)。
图31A-图31M是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在24小时内从RBC释放或分泌到PBS中的生长因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的生长因子的浓度。数据表示为在添加PI±95％CI后的倍数变化，其中●表示与无PI相比，添加PI时分泌物的倍数变化，■表示与无PI对照相比，添加PI时裂解物中的浓度倍数变化(n＝7)。
图32A-图32D是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在24小时内从RBC释放或分泌到PBS中的具有多种功能的细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的具有多种功能的细胞因子的浓度。数据表示为在添加PI±95％CI后的倍数变化，其中●表示与无PI相比，添加PI时分泌物的倍数变化，■表示与无PI对照相比，添加PI时裂解物中的浓度倍数变化(n＝7)。
图33A-图33O是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在48小时内从RBC释放或分泌到PBS中的促炎细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的促炎细胞因子的浓度。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图34A-图34E是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在48小时内从RBC释放或分泌到PBS中的抗炎细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的抗炎细胞因子的浓度。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图35A-图35K是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在48小时内从RBC释放或分泌到PBS中的趋化因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的趋化因子的浓度。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图36A-图36H是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在48小时内从RBC释放或分泌到PBS中的生长因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的生长因子的浓度。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图37A-图37D是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在48小时内从RBC释放或分泌到PBS中的具有多种因子的细胞因子的浓度，和在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下，在37℃下的相应RBC裂解物中的具有多种因子的细胞因子的浓度。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图38A-图38O是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下在37℃下孵育48小时后从RBC的裂解物释放或分泌的和在RBC的裂解物中的总测量的促炎细胞因子。数据表示为平均值±SD(n＝3)。蛋白的总浓度(分泌物+裂解物)
图39A-图39E是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下在37℃下孵育48小时后从RBC的裂解物释放或分泌的和在RBC的裂解物中的总测量的抗炎细胞因子。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图40A-图40K是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下在37℃下孵育48小时后从RBC的裂解物释放或分泌的和在RBC的裂解物中的总测量的趋化因子。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图41A-图41H是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下在37℃下孵育48小时后从RBC的裂解物释放或分泌的和在RBC的裂解物中的总测量的生长因子。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图42A-图42D是一系列图表，显示通过BioPlex测量并报告为pg/mL(在100uL PBS中有2000万个RBC)的在含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)的情况下在37℃下孵育48小时后从RBC的裂解物释放或分泌的和在RBC的裂解物中的总测量的细胞因子。在24小时将细胞在PBS中洗涤，并在含有或不含蛋白酶抑制剂的PBS中重悬。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图43A-43VV是一系列图表，显示在含有(引发的RBC)或不含(未引发的RBC)代表性细胞系的情况下共培养3天后从红细胞释放的蛋白浓度。
图44A-44VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)来自T淋巴细胞细胞系(Jurkat)的细胞的情况下共培养3天后从红细胞释放或分泌的蛋白浓度。
图45A-45VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)间充质干细胞(MSC)的情况下共培养3天后在红细胞膜中的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图46A-46VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)间充质干细胞(MSC)的情况下共培养3天后由红细胞膜释放的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图47A-47VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)间充质干细胞(MSC)的情况下共培养3天后在红细胞中的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图48A-48VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)间充质干细胞(MSC)的情况下共培养3天后来自红细胞的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图49A-49VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)乳腺癌细胞系细胞(MCF-7细胞)的情况下共培养3天后在红细胞膜中的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图50A-50VV是一系列图表，显示在含有或不含(引发的或未引发的)乳腺癌细胞系细胞(MCF-7细胞)的情况下共培养3天后由红细胞膜释放的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图51A-51VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)乳腺癌细胞系细胞(MCF-7细胞)的情况下共培养3天后在红细胞中的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图52A-52VV是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)乳腺癌细胞系细胞(MCF-7细胞)的情况下共培养3天后从红细胞释放或分泌的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
图53A-53UU是一系列图表，显示在含有(引发的)或不含(未引发的)肺癌细胞系(A549细胞)的情况下共培养3天后在红细胞中的蛋白浓度。使用学生T检验确定显著差异(p<0.05)。
定义
如在本申请中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该”包括复数指称，除非上下文另有明确说明。例如，术语“细胞裂解物”包括多种细胞裂解物。
如本文所用，术语“包含(comprising)”是指“包括(including)”。词语“包含(comprising)”的变体，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相应变化的含义。因此，例如，“包含(comprising)”步骤“A”和“B”的方法可以仅由步骤“A”和“B”组成，或者可以包括一个或多个另外的步骤(例如步骤“A”、“B”和“C”)。
如本文所使用，术语“红细胞(red blood cell)”、“RBC”和“红细胞(erythrocyte)”是指通过一种或多种红细胞分离或纯化技术(白细胞耗尽、红细胞耗尽、血小板耗尽等)实现的可以包含超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.75％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.5％、约100％的红细胞或100％的红细胞的细胞的集合。RBC将被理解为包括全RBC、RBC血影、RBC膜，RBC裂解物、RBC级分、从RBC分离的糖脂受体及其组合。
如本文所使用，术语“红细胞组分”、“红细胞产物”或“RBC产物”是指红细胞的部分或与红细胞相关，包括全RBC、RBC血影、RBC膜、RBC裂解物、RBC级分、从RBC分离的糖脂受体和通过在例如培养基/介质中孵育或培养红细胞产生的上清液。
如本文所使用，术语“RBC血影”将被理解为是指从其中去除了一些(例如超过：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％)胞浆蛋白的RBC。可以例如通过裂解和洗涤RBC除去胞浆蛋白。
如本文所使用，术语“蛋白”是指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物。
如本文所使用，术语“红细胞蛋白”或“与红细胞相关的蛋白”是指与红细胞相关或在红细胞附近的蛋白，包括位于细胞内(例如，在红细胞内或在红细胞裂解物内发现的)的蛋白，部分或完全在红细胞表面(例如，在红细胞膜中)的蛋白，或从红细胞释放或释放或分泌到外部环境(例如，培养基或血浆/血清)中的蛋白。红细胞蛋白包括外部添加的蛋白(例如，纯化的、重组的和/或质粒/载体表达的蛋白)，其例如被红细胞内化或外化，或者特异性地或非特异性地结合到红细胞表面。
如本文所使用，术语红细胞蛋白“释放或分泌”或由红细胞“释放或分泌的”蛋白是指通过活性或非活性机制从(i)RBC的细胞内区域或内部移动到RBC的表面和/或细胞外或外部区域(例如，血浆、血清或培养基)的蛋白，或(ii)从RBC的细胞外或外部区域(例如，从血浆、血清或培养基)移动到RBC的表面和/或细胞外区域或外部的蛋白。蛋白可以通过本领域已知的细胞表面-蛋白结合相互作用(例如，受体，共价连接，非共价连接，粘附)与红细胞表面结合。表面结合的蛋白可以释放回RBC的细胞外或外部区域(例如，进入血浆，血清或培养基)。蛋白可以通过本领域已知的细胞表面-蛋白结合相互作用(例如，受体、共价连接、非共价连接、粘附)与红细胞表面结合。表面结合的蛋白可以释放回RBC的细胞外或外部区域中(例如，血浆、血清或培养基中)。
如本文所使用，术语“药剂”是指对细胞(例如，红细胞或靶细胞)具有作用(例如，对细胞活性和/或蛋白水平具有作用)的一种或多种物质，并且包括例如，蛋白(例如，合成蛋白、纯化蛋白、重组蛋白或载体表达蛋白)，酶(例如，加速或催化化学反应，例如蛋白反应的物质)，核酸(例如，RNA、DNA或合成核酸)，蛋白酶抑制剂(例如，特异性或非特异性蛋白酶抑制剂)，蛋白变性剂(例如，氧化或还原剂)，RNA稳定剂(例如，化学药剂(例如，RNA酶失活剂)、小分子药剂或生物药剂(例如，氨基糖苷))，抗凝剂(例如，香豆素、肝素、螯合剂(例如，EDTA、EGTA))，化学药剂(例如，合成或天然存在的化学化合物)，和细胞(例如，来自对象的原代细胞或其他健康/正常细胞、癌细胞、永生化细胞或细胞系(例如，源自对象(例如，人)的细胞系)，包括例如，免疫细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和滑膜细胞)。
如本文所使用，术语“引发的”或“处理的”红细胞或RBC是指红细胞与药剂(多种药剂)接触(例如，孵育、培养或组合)或暴露于特定条件(多种条件)(例如，剪切应力、低氧、高氧)后，红细胞蛋白的存在或水平升高或降低。
如本文所使用，术语“引发的红细胞组分”是指源自已经用药剂(多种药剂)或条件(多种条件)引发或处理的红细胞的红细胞组分。
如本文所使用，术语“靶细胞”是指将与引发的红细胞或引发的红细胞组分接触的一种或多种细胞，并且可以包括来自对象的原代细胞或其他健康/正常细胞、癌细胞、永生化细胞或细胞系(例如，源自对象(例如，人)的细胞系)。在一些实施方案中，靶细胞包括免疫细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞或滑膜细胞。
如本文所使用，术语“靶细胞组分”或“靶细胞产物”是指靶细胞的部分或与靶细胞相关，包括从靶细胞和通过在例如培养基/介质中孵育或培养靶细胞产生的上清液分离的全细胞、靶细胞血影、靶细胞膜、靶细胞裂解物、靶细胞级分、糖脂受体。
如本文所使用，“培养基”或“介质”是指具有维持细胞或细胞组分活力的能力的组合物。培养基可以刺激细胞生长和增殖(例如，细胞培养基)或将细胞维持在特定和/或现有的生长状态(例如，细胞孵育培养基)。培养基的非限制性实例包括等渗盐溶液、平衡盐溶液、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank平衡盐溶液(HBSS)、Earles平衡盐溶液(EBSS)、Roswell Park Memorial研究所培养基(RPMI)、极限必需培养基(MEM)、改良极限必需培养基(IMEM)、Eagle极限必需培养基(EMEM)、Dubelco改良Eagle培养基(DMEM)和Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。
如本文所使用，“细胞上清液”应理解为是指用于在给定温度或给定温度范围内孵育或培养细胞群达给定时间段，例如超过5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或120小时的细胞孵育或培养介质。
如本文所使用，“细胞洗液”应理解为是指用于冲洗细胞群的液体，并且不同于如上定义的细胞上清液，因为细胞洗液不用作用于细胞培养的介质。因此，用于产生“细胞洗液”的流体可以与细胞群混合小于30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟或30秒的时间段。
如本文所使用，术语“蛋白酶抑制剂”是指阻断或降低蛋白酶的催化(例如蛋白水解)活性的物质(例如蛋白或化学物质)。蛋白酶抑制剂可以阻断蛋白酶切割给定蛋白的肽键的能力，通常通过阻断蛋白酶的活性位点并防止其进入底物。作为非限制性实例，蛋白酶抑制剂可以包括非特异性蛋白酶抑制剂(例如，对特定蛋白或蛋白类别没有特异性的蛋白酶抑制剂)，特异性蛋白酶抑制剂(例如，对特定蛋白或底物具有特异性的蛋白酶抑制剂，例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂)，或双特异性、多特异性或泛特异性蛋白酶抑制剂，例如，对一种或多种蛋白或一种或多种蛋白类别具有特异性的蛋白酶抑制剂，例如，丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
如本文所使用，术语“剪切应力”是指力与面积的比率。
如本文所使用，术语“对象”包括一种或多种动物，包括例如，牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿类动物物种。对象可以是其中血液包含红细胞的动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。在另一个实施方案中，对象可以是小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。
如本文所使用，术语“治疗”或“疗法”是指可以用于预防、管理、减轻或改善疾病、障碍或病症的一种或多种方案、方法和/或药剂，包括预防、减轻或改善疾病、障碍或病症的一种或多种症状和/或与其相关的症状。在某些实施方案中，术语“治疗”和“疗法”是指可用于预防、管理、减轻和/或改善本领域技术人员，例如医务人员已知的疾病、障碍或病症的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。
如本文所使用，术语“辅助疗法”应理解为是指除初级、主要或初始疗法之外给予的疗法，以最大化初级、主要或初始疗法的有效性。辅助疗法可以通过与初始疗法相同的途径或通过与初始疗法不同的途径来施用。任何辅助治疗也可以与初级治疗同时或在不同时间施用。
本文中对现有技术文献的描述，或本文中来自或基于那些文献的陈述，并不是承认文献或推断的陈述是相关领域的公知常识的一部分。
出于描述的目的，除非另有说明，否则本文提及的所有文献均通过引用整体并入本文。
包括在详细描述中使用的主题标题是为了便于参考或读者，并且不应该用于限制在整个公开内容或权利要求中找到的主题。主题标题不应用于构成权利要求的范围或权利要求限制。
发明详述
在很大程度上未认识到RBC通过影响调节体内其他细胞活性的蛋白(如细胞因子和趋化因子)的有效性来调节免疫应答的作用。本发明人已经确定RBC可以在各种条件下汇集或释放一系列蛋白，包括细胞因子、趋化因子和生长因子。因此，尽管以前未认识到，但RBC似乎在调节对细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和细胞修复有影响的各种因子的有效性中发挥重要作用。
以下描述足够详细地传达了本发明的示例性实施方案，以使得本领域普通技术人员能够实践本发明。所描述的各种实施方案的特征或限制不一定限制本发明的其他实施方案或本发明整体。因此，以下详细描述不限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
红细胞
用于本发明的方法中的红细胞(RBC)可以从合适的来源获得，包括从对象(在例如血液样品中)、现有的血液采集/储库(例如，血库)、其他商业来源(例如，红血细胞供应商)等获得。在一些实施方案中，红细胞是从对象(例如，需要治疗或疗法的对象)获得的，可以向该对象施用引发的红细胞组分或靶细胞组分。在其他实施方案中，红细胞可以从另一个/不同的对象(例如，血型匹配的供者(例如，家庭成员))获得。
用于采集血液和分离(separation)或分离(isolation)RBC的示例性方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括例如离心、磁珠技术，荧光激活细胞分选、葡聚糖沉降、密度梯度分离、减白细胞过滤等。合适的方法公开于例如以下参考文献中：葡聚糖沉降—Tenczar FJ.Comparison of inverted centrifugation,saline washing,and dextransedimentation in the preparation of leukocyte-poor red cells.Transfusion,13(4)1973；密度梯度分离—Vettore L,De Matteis MC,Zampini P.A new densitygradient system for the separation of human red blood cells.American Journalof Hematology,8(3)1980；减白细胞过滤—AuBuchon JP,Elfath MD,Popovsky MA,Stromberg RR,Pickard C,Herschel L,Whitley P,McNeil D,Arnold N,O’ConnerJL.Evaluation of a new prestorage leukoreduction filter for red blood cellunits.Vox Sanguinis,72(2)1997。
在一些实施方案中，引发或处理以诱导或触发蛋白的释放、保留或汇集的RBC可以包含RBC血影或由RBC血影组成。RBC血影可以例如去除其胞浆蛋白的超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％或全部。RBC血影可以使用已知技术产生，例如低渗溶血。(参见例如Bramley TA,Coleman R,Finean JB.Chemical,enzymological and permeability properties of human erythrocyte ghostsprepared by hypotonic lysis in media of different osmolarities.Biochimica etBiophysica Acta–Biomembranes,241(3)1971)。
在其他实施方案中，引发以诱导蛋白的释放、保留或汇集的RBC可以包含RBC膜或RBC膜碎片或由RBC膜或RBC膜碎片组成。这些可以使用已知技术产生，例如，低渗溶血和裂解物的冻溶。
在一些实施方案中，可以洗涤RBC以去除与外膜相关的蛋白。细胞洗涤可以使用合适的培养基进行，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、等渗盐溶液、生长介质、培养介质或其组合。在本发明的方法中用作细胞洗液和/或细胞培养基的合适培养基的非限制性实例包括以下一种或多种：等渗盐溶液、平衡盐溶液、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank平衡盐溶液(HBSS)、Earles平衡盐溶液(EBSS)、Roswell Park Memorial研究所培养基(RPMI)、极限必需培养基(MEM)、改良极限必需培养基(IMEM)、Eagle极限必需培养基(EMEM)、Dubelco改良Eagle培养基(DMEM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)或其组合。
在其他实施方案中，可以裂解RBC并分离裂解物和/或RBC膜。可洗涤RBC膜以去除相关蛋白。另外地或供选择地，可以处理RBC膜以直接或间接结合到期望的靶蛋白。
红细胞蛋白
本发明至少部分依赖于发明人对RBC可以充当各种蛋白(例如细胞因子和趋化因子)的储库的确定。如本文所证明的，RBC在内部和/或在其外膜上包含这些蛋白，通常大量包含。本发明人已经表明，可以操纵RBC以汇集、保留或释放这些蛋白(例如，细胞因子、趋化因子和生长因子)。这提供了影响包括细胞生长、细胞死亡、细胞分化和/或免疫应答的过程的手段。
在一些实施方案中，由RBC汇集或保留的蛋白定位在内部。因此，外部蛋白可以被RBC内化。由RBC释放或分泌的蛋白可以从细胞内移动或运输跨过细胞膜并进入外部环境中。
在其他实施方案中，RBC汇集、保留、释放或分泌的蛋白定位在细胞表面上。蛋白可以直接结合到RBC外膜，或通过一种或多种RBC膜蛋白和/或分子间接结合到外膜。
许多蛋白可以通过本发明的方法调节，非限制性实例包括信号传导分子，例如，趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质和细胞外基质组分和酶。例如，生长因子可以包括刺激以下的生长、增殖、愈合或分化的那些：例如皮肤细胞(例如，表皮生长因子(EGF)、角化细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF))，神经细胞/神经系统(例如，神经调节蛋白(例如，神经调节蛋白1-4)和神经营养蛋白(例如，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)))，结缔组织和间充质细胞s(例如，成纤维细胞生长因子(FGF))，血管细胞(例如，血小板源性生长因子(PDGF)、胎盘生长因子(PGF)、血管内皮生长因子(VEGF))，血细胞(例如，促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，和细胞增殖(例如，胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2))以及多效生长因子(例如，转化生长因子-β(TGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF))。
受体可以包括细胞内受体(例如，核受体(例如，转录因子)、细胞质受体(例如，类固醇)和内质网受体(例如，IP3))或细胞表面受体(例如，离子通道偶联受体、G-蛋白偶联受体、酶偶联受体、toll门控受体和配体门控受体、整联蛋白)。激素可以包括源自脂质的(例如，前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素)；源自氨基酸的(例如，肾上腺素、褪黑激素、甲状腺素)；肽(例如，胰淀素、脂联素、血管紧张素原、降钙素、脑利钠肽(BNP)、促红细胞生成素、卵泡刺激素(FSH)、生长素(ghrelin)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)等)；和类固醇(例如雄激素、雌激素、糖皮质激素、孕激素、开环甾类化合物等)。细胞内信号递质或转导蛋白可以包括蛋白和蛋白激酶家族(例如，Ras和Src家族)，和Wnt信号传导家族蛋白。神经递质可以包括氨基酸、肽(例如，β-内啡肽、阿片样物质)、单胺、痕量胺、嘌呤和气体递质。核转录因子可以包括DNA转录的调节剂(例如，fos、myc、N-myc)，和mRNA转录的调节剂，和细胞分裂的抑制剂(例如，p53、pRb)。酶可以包括氧化还原酶(例如，醇、醛、氨基酸、硫、二酚、过氧化物酶等)、NADH、NADPH、核酸酶、蛋白酶、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。
虽然对根据本发明的被RBC汇集、保留和/或释放的蛋白类型(多种类型)没有特别限制，但非限制性实例包括趋化因子、细胞因子和生长因子。
在某些实施方案中并且同样没有特别限制，可以被RBC汇集、保留和/或释放的蛋白包括表1中列出的蛋白中的一种或多种。
表1：可以被根据本发明的RBC汇集和/或释放的单个蛋白的非限制性实例.
在某些实施方案中，通过本文提供的方法在对象中调节至少一种蛋白的水平。在其他实施方案中，在对象中调节至少一种蛋白、至少两种蛋白、至少三种蛋白、至少四种蛋白、至少五种蛋白、至少六种蛋白、至少七种蛋白、至少八种蛋白、至少九种蛋白、至少十种蛋白、至少十一种蛋白、至少十二种蛋白、至少十三种蛋白、至少十四种蛋白、至少十五种蛋白、至少十六种蛋白、至少十七种蛋白、至少十八种蛋白、至少十九种蛋白、至少二十种蛋白、至少二十一种蛋白、至少二十二种蛋白、至少二十三种蛋白、至少二十四种蛋白、至少二十五种蛋白、至少二十六种蛋白、至少二十七种蛋白、至少二十八种蛋白、至少二十九种蛋白或至少三十种蛋白的水平。在一些实施方案中，在对象中调节至少两种蛋白的水平。在其他实施方案中，在对象中调节至少三种蛋白的水平。在再其他实施方案中，在对象中调节至少四种蛋白的水平。在其他实施方案中，在对象中调节至少五种蛋白的水平。在另一个实施方案中，在对象中调节至少六种蛋白的水平。在一些其他实施方案中，在对象中调节至少七种蛋白的水平。在另一个实施方案中，在对象中调节至少八种蛋白的水平。在再其他实施方案中，在对象中调节至少九种蛋白的水平。在又其他实施方案中，在对象中调节至少十种蛋白的水平。
在某些实施方案中，使红细胞与药剂(多种药剂)接触调节一种或更多种红细胞蛋白、两种或更多种红细胞蛋白、三种或更多种红细胞蛋白、四种或更多种红细胞蛋白、五种或更多种红细胞蛋白、六种或更多种红细胞蛋白、七种或更多种红细胞蛋白、八种或更多种红细胞蛋白、九种或更多种红细胞蛋白、十种或更多种红细胞蛋白、十一种或更多种红细胞蛋白、十二种或更多种红细胞蛋白、十三种或更多种红细胞蛋白、十四种或更多种红细胞蛋白、十五种或更多种红细胞蛋白、十六种或更多种红细胞蛋白、十七种或更多种红细胞蛋白、十八种或更多种红细胞蛋白、十九种或更多种红细胞蛋白、二十或更多种红细胞蛋白、二十一种或多种红细胞蛋白、二十两种或更多种红细胞蛋白、二十三种或更多种红细胞蛋白、二十四种或更多种红细胞蛋白、二十五种或更多种红细胞蛋白、二十六种或更多种红细胞蛋白、二十七种或更多种红细胞蛋白、二十八种或更多种红细胞蛋白、二十九种或更多种红细胞蛋白或三十种或更多种红细胞蛋白的水平。在一些实施方案中，药剂(多种药剂)调节两种或更多种红细胞蛋白的水平。在其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节三种或更多种红细胞蛋白的水平。在再其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节四种或更多种红细胞蛋白的水平。在一些其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节五种或更多种红细胞蛋白的水平。在其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节六种或更多种红细胞蛋白的水平。在再其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节七种或更多种红细胞蛋白的水平。在又其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节八种或更多种红细胞蛋白的水平。在一些其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节九种或更多种红细胞蛋白的水平。在其他实施方案中，药剂(多种药剂)调节十种或更多种红细胞蛋白的水平。
红细胞引发
根据本发明的方法，可以用各种药剂或各种环境条件引发或处理RBC，以调节红细胞蛋白的水平。在某些实施方案中，提供了通过测量红细胞与药剂或条件接触之前和之后一种或多种红细胞蛋白水平的差异来引发红细胞的方法。
在某些实施方案中，测量一种或多种与红细胞相关的蛋白、两种或更多种与红细胞相关的蛋白、三种或更多种与红细胞相关的蛋白、四种或更多种与红细胞相关的蛋白、五种或更多种与红细胞相关的蛋白、六种或更多种与红细胞相关的蛋白、七种或更多种与红细胞相关的蛋白、八种或更多种与红细胞相关的蛋白、九种或更多种与红细胞相关的蛋白、十种或更多种与红细胞相关的蛋白、十一种或更多种与红细胞相关的蛋白、十二种或更多种与红细胞相关的蛋白、十三种或更多种与红细胞相关的蛋白、十四种或更多种与红细胞相关的蛋白、十五种或更多种与红细胞相关的蛋白、十六种或更多种与红细胞相关的蛋白、十七种或更多种与红细胞相关的蛋白、十八种或更多种与红细胞相关的蛋白、十九种或更多种与红细胞相关的蛋白或二十或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在一些实施方案中，测量两种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在其他实施方案中，测量三种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在再其他实施方案中，测量四种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在一些其他实施方案中，测量五种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在其他实施方案中，测量六种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在再其他实施方案中，测量七种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在又其他实施方案中，测量八种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在一些其他实施方案中，测量九种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。在其他实施方案中，测量十种或更多种与红细胞相关的蛋白的水平。
在某些实施方案中，红细胞相关蛋白(多种红细胞相关蛋白)的水平变化是不同的或基本上不同的。一种或多种蛋白的不同或基本上不同的水平可以例如从不同的蛋白水平(例如，不在本领域技术人员确定的相关统计分析内)到超过本领域普通技术人员通过例如统计分析或阈值倍数差异确定为相似蛋白水平的蛋白水平(例如，蛋白水平差异超过两倍)。在一些实施方案中，在与药剂(多种药剂)或条件(多种条件)接触之前和之后，一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平是不同的。在又其他实施方案中，在与药剂(多种药剂)或条件(多种条件)接触之前和之后，一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平是基本上不同的。在其他实施方案中，在与药剂(多种药剂)或条件(多种条件)接触之前和之后，通过本领域技术人员可获得的统计学方法(例如，p-值为0.05或更高的学生T检验)确定的一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平差异是基本上不同的。许多统计分析方法适用于确定在与药剂(多种药剂)或条件(多种条件)接触之前和之后，与红细胞相关的蛋白的水平差异，包括例如，学生T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和或Spearman秩相关。与红细胞相关的蛋白(多种蛋白)的水平差异在一些实施方案中可以是由于一种或多种蛋白的水平升高；在其他实施方案中，可以是由于一种或多种蛋白的水平降低；或在再其他实施方案中，可以是由于一种或多种蛋白的水平升高和降低二者。
在某些实施方案中，药剂或条件诱导或触发蛋白的释放。蛋白可以从细胞内部跨过细胞膜转运到外部环境中，或供选择地，其可以从RBC的外表面膜释放。另外地或供选择地，RBC可以被引发或处理以诱导外部蛋白的汇集。蛋白可以被汇集到细胞内部，和/或汇集到RBC的外表面膜上。另外地或或供选择地，RBC可以被引发或处理以促进位于RBC内和/或RBC的表面或膜上的蛋白的保留。
以下是可以应用于根据本发明的RBC的特定药剂/处理或条件的非限制性实例。在一些实施方案中，可以用药剂引发或处理RBC以诱导蛋白的释放、保留或汇集。示例性药剂可以是以下中的一种或多种：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂、细胞或其组合。特别地，RBC可以用以下引发：一种或多种蛋白(例如，合成蛋白、纯化蛋白、重组蛋白和/或载体表达蛋白)，酶(例如，加速或催化化学反应，例如蛋白反应的物质)，核酸(例如，RNA、DNA或合成核酸)，蛋白酶抑制剂(例如，特异性或非特异性蛋白酶抑制剂)，蛋白变性剂(例如，氧化或还原剂)，RNA稳定剂(例如，化学药剂(例如，RNA酶失活剂)、小分子药剂或生物药剂(例如，氨基糖苷))，抗凝剂(例如，香豆素、肝素、螯合剂(例如，EDTA、EGTA))，化学药剂(例如，合成或天然存在的化学化合物)，和细胞(例如，来自对象的原代细胞或其他健康/正常细胞、癌细胞、永生化细胞、细胞系(例如，源自对象的细胞系))。
在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂可以例如选自抑肽酶、亮抑酶肽、α2-巨球蛋白、抗蛋白酶二盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、TLCK(CAS131918-97-3)、胰蛋白酶抑制剂、Pefabloc SC(Roche)、PMSF(C6H5CH2SO2F-Thermo FisherScientific)、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)或其组合。
在其他实施方案中，抗凝剂可以例如选自肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA二钠盐、EDTA四钠盐、EDTA二钾盐、EDTA二铵盐、亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)、EDTA三钠盐、EDTA三钾盐、乙二醇-O,O-双(2-氨基乙基)-N,N,N,N-四乙酸、N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N,N-三乙酸三钠盐、柠檬酸盐、酸-柠檬酸-葡萄糖、柠檬酸氢二铵、酒石酸二铵、华法林、N-(2-双(羧甲基)氨基乙基)-N-(2-羟乙基)甘氨酸盐二水合物、柠檬酸、柠檬酸单钠盐、柠檬酸二钠盐、柠檬酸三钠盐、柠檬酸单钾盐、柠檬酸三钾盐，蛋白C/蛋白S、次氮基三乙酸、酒石酸钾钠、D-酒石酸氢钾、L-酒石酸单钠盐、L-酒石酸二钠盐，L-酒石酸二钾盐、链激酶、硫酸鱼精蛋白、三(羧甲基)胺、抗凝血酶III、苯丙香豆素、水蛭素、醋硝香豆素、香豆定、糖胺聚糖、布洛芬、乙酰水杨酸、吲哚美辛、前列腺素、磺吡酮、尿激酶、水蛭肽、组织纤溶酶原激活物、香豆素及其组合。
因此，在一些实施方案中，用蛋白酶抑制剂(例如，完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))引发RBC，并诱导其分泌/释放以下蛋白中的一种或多种：IFN-α2、IFN-γ、IL-1β、IL-8、IL-9、IL-12p70、IL-16、IL17、IL-18、MIF、TNF-α、IL-2rα、IL-4、CTACK、GRO-α、IL-18、MCP-1、MIP-1GRO-α、MIP-1β、RANTES、SDF-1α、βFGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IL-3、IP-10、M-CSF、PDFG-bb、VEGF、IL-2、IL-6、IL-12p40。在其他实施方案中，用蛋白酶抑制剂引发或处理RBC，并诱导其保留和/或汇集以下蛋白中的一种或多种：CTACK、GRO-α、βFGF、G-CSF、CM-CSF、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2rα、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12-40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IP-10、LIF、MCP-1、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-bb、RANTES、SDF-1α、TNF-α、TNF-β、TRAIL或VEGF。
在另外的实施方案中，用抗凝剂(例如，香豆素、肝素和/或EDTA)引发RBC，并诱导其分泌/释放一种或多种蛋白(例如，MIF)。
在其他实施方案中，用蛋白变性剂(例如，化学药剂)引发RBC，所述蛋白变性剂可以包括甲酰胺、胍(异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍)、十二烷基硫酸钠(SDS)或尿素。
在又其他实施方案中，用核酸如RNA、DNA或人工核酸引发RBC。RBC可以直接用核酸引发(例如转化、转染、转导或注射)或间接通过例如载体(例如病毒或聚合物)引发。
在另一个实施方案中，用RNA稳定剂(例如RNA酶或氨基糖苷)引发RBC。
在再其他实施方案中，用细胞引发RBC，所述细胞包括一种细胞类型和/或细胞系或几种细胞类型和/或细胞系。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和髓样细胞。免疫细胞可以例如是以下中的一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。癌细胞可以例如是肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞、癌性血细胞中的一种或多种。干细胞可以例如是以下中的一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如，来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、间充质干细胞或其组合。在再其他实施方案中，细胞可以是本领域技术人员已知的许多细胞系的细胞，包括例如，HUVEC、HEK-293、HT-29、MEWO、Jurkat、MCF-7或A549细胞等。
在本发明的某些方面，可以使RBC经受某些条件以引发RBC。在一些实施方案中，可以使RBC经受剪切应力以诱导蛋白的释放、保留或汇集。当从静脉循环行进到入毛细血管床时，RBC经常在体内受到剪切力。这可以通过合适的方式模拟，例如，迫使RBC通过窄规格针。剪切力可以在RBC上赋予超过给定个体的标准血压的压力，例如，标准血压的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或超过5倍。
在再其他实施方案中，可以用过量的氧引发或处理RBC，或供选择地使其丧失氧以诱导蛋白的释放、保留或汇集。例如，可以在培养物中用过量氧(例如，高氧条件)引发或处理RBC适当的时间段，使得它们变得高度氧合。在又其他实施方案中，可以用低氧培养基(例如，低氧PBS)引发或处理RBC，密封并培养合适的时间段使得它们变得脱氧。
对象
某些实施方案涉及根据本文提供的方法的对象。对象可以是动物，其包括例如牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类或啮齿类动物物种。对象可以是其中血液包含红细胞的动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。在另一个实施方案中，对象可以是小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。对象可以患有疾病或病症，例如组织损伤、癌症、炎性疾病或病症和/或免疫障碍。对象可以正在接受针对疾病或病症的主要疗法，并且本发明的方法可以用作辅助疗法。供选择地，本发明的方法可以用作对象的主要疗法，另一种疗法用作辅助疗法。在一些实施方案中，辅助疗法(例如，引发的红细胞和/或靶细胞)可以通过与主要疗法相同的途径或与主要疗法不同的途径向对象施用。在其他实施方案中，可以在与主要疗法不同的时间(例如，给药方案)或与主要疗法同时向对象施用辅助疗法。
细胞疗法
在本说明书的实施例中提供的实验数据表明RBC可以被引发或处理以汇集、保留或释放蛋白(例如细胞因子、趋化因子和/或生长因子)。
本发明提供了用于升高或降低对象细胞上、细胞内或细胞周围的靶蛋白水平的方法。本发明还提供了用于(体外、离体或体内)诱导或调节靶细胞类型和细胞群活性的方法。
某些实施方案涉及包括引发或处理RBC以升高或降低RBC内存在的和/或与RBC的表面相关的一种或多种蛋白(例如靶蛋白)水平的方法。RBC可以在向对象施用之前进行引发或处理或与靶细胞混合，例如通过用蛋白酶抑制剂引发或处理，用抗凝剂引发或处理，裂解RBC并任选地分离RBC膜，洗涤RBC，使RBC受到剪切应力，用氧引发或处理RBC，使RBC丧失氧，和/或其组合。
在一些实施方案中，可以向对象施用引发的或处理的RBC和/或引发的或处理的RBC组分或产物(例如，RBC膜、RBC裂解物、RBC洗液、RBC培养上清液、RBC血影)以体内调节靶细胞群(多个靶细胞群)的活性/功能。可以向对象施用以下中的一种或多种：全RBC、裂解的RBC、RBC血影、分离的RBC膜、洗涤的RBC、来自洗涤的RBC的洗涤溶液、来自培养的RBC的RBC上清液、经受剪切应力的RBC、用氧引发或处理的RBC、丧失氧的RBC或其组合。裂解的RBC、分离的RBC膜和洗涤的RBC可以用蛋白酶抑制剂、抗凝剂、细胞或其组合引发或处理，或可以由用蛋白酶抑制剂、抗凝剂、细胞或其组合引发或处理的全RBC产生。经受剪切应力的RBC、用氧引发或处理的RBC和丧失氧的RBC还可以用蛋白酶抑制剂、抗凝剂、细胞或其组合预处理或后处理或引发。
引发的或处理的RBC和/或引发的或处理的RBC组分或产物可以向对象局部或全身施用。例如，RBC/RBC组分或产物可以静脉内、表皮、皮下、关节内、经粘膜(例如，吸入、直肠)、肌内、脑内、鞘内和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，向对象施用RBC可以诱导和/或调节对象中的一种或多种免疫应答。另外地或供选择地，向对象施用RBC可以诱导和/或调节细胞发育。另外地或供选择地，向对象施用RBC可以诱导和/或调节细胞生长。另外地或供选择地，向对象施用RBC可以诱导和/或调节细胞死亡。另外地或供选择地，向对象施用RBC可以诱导和/或调节细胞修复。
在一些实施方案中，引发的或处理的RBC和/或引发的或处理的RBC组分或产物(例如，RBC膜、RBC裂解物、RBC洗液、RBC培养上清液、RBC血影)可以与靶细胞体外或离体混合以形成混合物(例如，细胞培养物)。混合RBC和靶细胞可以包括例如，在基质(例如，细胞培养板或培养瓶)上或在悬液(例如，在管或烧瓶)中组合、孵育、培养和/或共培养细胞。合适的靶细胞的非限制性实例包括但不限于，免疫细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和/或髓样细胞。如果需要，可以将混合物维持适合于实现细胞活性(例如，如果存在，靶细胞活性，和/或RBC活性)改变，和/或靶蛋白(多种蛋白)的汇集，和/或来自混合物中的细胞的靶蛋白的释放(例如，如果存在，靶细胞活性和/或RBC活性)的时间段。可以向对象施用靶细胞和/或靶细胞产物(多种靶细胞和/或靶细胞产物)(例如，靶细胞膜、靶细胞裂解物、靶细胞洗液、靶细胞血影)。在来自混合物的其他组分存在或不存在的情况下，向对象施用靶细胞和/或靶细胞产物(多种靶细胞和/或靶细胞产物)，所述来自混合物的其他组分例如，来自混合物的上清液，和/或来自混合物的RBC，和/或来自混合物的RBC组分或产物(例如，RBC膜、RBC裂解物、RBC洗液、RBC血影)。可以向对象局部(例如，局部(topical))或全身(例如，肠内、肠胃外)施用混合物的一种或多种组分。例如，组分(多种组分)可以静脉内、表皮、皮下、关节内、经粘膜(例如，吸入、直肠)、肌内、脑内、鞘内和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，来自混合物的靶细胞和/或靶细胞产物(多种靶细胞和/或靶细胞产物)可以向对象局部或全身施用。再次作为非限制性实例，来自混合物的靶细胞和/或靶细胞产物(多种靶细胞和/或靶细胞产物)可以向对象局部施用，并且RBC和/或RBC组分或产物可以向对象全身施用。另外地或供选择地，来自混合物的靶细胞和/或靶细胞产物(多种靶细胞和/或靶细胞产物)可以向对象全身施用，并且RBC和/或RBC组分或产物可以向对象全身施用。向对象施用混合物的一种或多种组分(例如，上清液、靶细胞、靶细胞产物(多种靶细胞产物)、RBC和/或RBC产物(多种RBC产物))可以在体内诱导和/或调节以下中的一种或多种：细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和细胞修复。
在本发明的方法中使用的RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物可以获得自或源自或源自一种或多种物种的个体(多种个体)，所述物种不同于向其施用所述RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物的对象的物种(即，同种异体)。个体(多种个体)和对象可以是哺乳动物。
本发明的方法中使用的RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物可以获得自或源自物种的个体(多种个体)，所述物种与向其施用所述RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物的对象的物种相同(即，同种异体)。个体(多种个体)可以具有与对象相同的血型，或与对象的血型相比不同的血型。个体(多种个体)和对象可以是哺乳动物(例如，人)。
本发明的方法中使用的RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物可以获得自或源自向其施用所述RBC、RBC组分或产物、靶细胞和靶细胞组分或产物的对象(即，自体同源)。对象可以是哺乳动物(例如，人)。
在其中RBC、RBC组分或产物、靶细胞、和靶细胞组分或产物获得自或源自不是对象的个体(多种个体)的实施方案中，可以使用本领域普通技术人员已知的用于收集和分离细胞的标准方法(例如离心、磁珠技术、荧光激活细胞分选、葡聚糖沉降、密度梯度分离、减白细胞过滤等)。
在其中从对象获得RBC用于治疗和再施用于对象的实施方案中，可以使用本领域普通技术人员已知的用于收集血液和分离细胞的方法(例如单采法/红细胞采集、离心、磁珠技术、荧光激活细胞分选、葡聚糖沉降、密度梯度分离、减白细胞过滤等)。
根据本发明的方法向对象施用RBC、RBC组分或产物、靶细胞和/或靶细胞组分或产物可以在疾病和病症的预防和/或治疗中提供有利的结果。
以非限制性实例的方式，用药剂或条件处理RBC可以在一旦向对象施用时引发其汇集某些靶蛋白。另外地或供选择地，一旦与靶细胞混合和/或在施用于对象时，RBC可以被引发以释放一种或多种靶蛋白(即，一种或多种靶蛋白类型)。在没有特别限制的情况下，靶蛋白(多种蛋白)可以是趋化因子(多种趋化因子)、细胞因子(多种细胞因子)和/或生长因子(多种生长因子)。合适的蛋白的非限制性实例列于上表1中。
在施用引发的或处理的RBC时可以被诱导或调节的对象中的靶细胞的非限制性实例包括但不限于，免疫细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和髓样细胞。免疫细胞可以例如是以下中的一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。癌细胞可以例如是以下中的一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞、癌性血细胞。干细胞可以例如是以下中的一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如，来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、间充质干细胞或其组合。
在与引发的或处理的RBC/引发的或处理的RBC组分或产物混合后向对象施用的靶细胞(例如，免疫细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和/或髓样细胞)和靶细胞组分或产物可以具有许多生物学作用，包括但不限于，诱导和/或调节细胞发育、细胞生长、细胞死亡、细胞修复和/或免疫应答。
例如，干细胞的调节的活性可以包括以下中的一种或多种：改变的谱系、改变的细胞因子分泌谱、改变的干细胞归巢、改变的植入潜力、升高或降低的增殖能力或其组合。
向对象施用的靶细胞可以从已经与其混合的其他组分如RBC分离/纯化，或供选择地与其他组分(多种组分)(例如，RBC组分)一起向对象施用。
药物
本发明提供了用于实施本发明的方法的药物。
在一些实施方案中，药物包含已经根据本发明被引发或处理以升高或降低存在于RBC内和/或与RBC的表面相关的一种或多种蛋白或靶蛋白的水平的RBC。
药物可以包含从药物所施用的对象获得的引发的或处理的RBC。另外地或供选择地，药物可以包含从与药物所施用的对象相同的物种的个体获得的引发的或处理的RBC。相同物种的个体可以具有或不具有与对象相同的血型。另外地或供选择地，药物可以包含从与药物所施用的对象不同的物种的个体获得的引发的或处理的RBC。
在其他实施方案中，药物包含已经与根据本发明的引发的或处理的RBC/RBC组分或产物混合(例如，培养)的靶细胞。以非限制性实例的方式，靶细胞可以是免疫细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和/或髓样细胞。免疫细胞可以例如是以下中的一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。癌细胞可以例如是以下中的一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞、癌性血细胞。干细胞可以例如是以下中的一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如，来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、间充质干细胞或其组合。这些药物还可以包含混合物的其他另外的组分(多种组分)，例如，RBC和/或RBC组分或产物。
在一些实施方案中，本发明提供了被引发或处理以升高或降低存在于RBC内和/或与RBC的表面相关的一种或多种蛋白或靶蛋白的水平的RBC，和/或选自裂解物、膜制剂、血影、洗液和/或培养上清液中的一种或多种的引发的或处理的RBC的产物或组分在制备用于在对象中诱导或调节以下中的一种或多种的药物中的用途：细胞信号传导、免疫应答(多种免疫应答)、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和/或细胞修复。
在其他实施方案中，本发明提供了被引发或处理以升高或降低存在于RBC内和/或与RBC的表面相关的靶蛋白的水平的RBC，和/或选自裂解物、膜制剂、血影、洗液和培养上清液中的一种或多种的引发的或处理的RBC的产物，其用于在对象中诱导或调节以下中的一种或多种：细胞信号传导、免疫应答(多种免疫应答)、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和/或细胞修复。
在一些实施方案中，本发明提供了靶细胞在制备用于预防或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中靶细胞已经与以下混合：被引发或处理以升高或降低存在于RBC内和/或与RBC的表面相关的一种或多种蛋白或靶蛋白的水平的RBC，和/或选自裂解物、膜制剂、血影、洗液和培养上清液中的一种或多种的引发的或处理的RBC的产物或组分。
在其他实施方案中，本发明提供了靶细胞，其用于预防或治疗疾病或病症，其中所述靶细胞已经与以下混合：被引发或处理以升高或降低存在于RBC内和/或与RBC的表面相关的一种或多种蛋白或靶蛋白的水平的RBC，和/或选自裂解物、膜制剂、血影、洗液和培养上清液中的一种或多种的引发的或处理的RBC的产物。
根据本文所述的一个或多个实施方案，可以根据本文提供的方法使RBC与药剂接触。靶蛋白(多种蛋白)可以是以下中的一种或多种：IFN-α2、IFN-γ、IL-1β、IL-8、IL-9、IL-12p70、IL-16、IL17、IL-18、MIF、TNF-α、IL-2rα、IL-4、CTACK、GRO-α、IL-18、MCP-1、MIP-1GRO-α、MIP-1β、RANTES、SDF-1α、βFGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IL-3、IP-10、M-CSF、PDFG-bb、VEGF、IL-2、IL-6、IL-12p40、CTACK、GRO-α、βFGF、G-CSF、CM-CSF、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2rα、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12-40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IP-10、LIF、MCP-1、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-bb、RANTES、SDF-1α、TNF-α、TNF-β、TRAIL、VEGF。靶细胞可以是先前列出的那些细胞中的一种或多种。对象可以是哺乳动物(例如，人)。对象可以患有疾病或病症(例如，组织损伤、癌症、炎性疾病或病症、免疫障碍)。
根据本发明的药物可以包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。如本文所考虑的“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂是当施用于特定受者例如人或非人动物时不产生不良反应(多种不良反应)的物质。药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和佐剂通常还与药物的其他成分相容，例如RBC，RBC组分或产品，靶细胞或靶细胞组分或产品。合适的赋形剂、稀释剂和载体的非限制性实例可以在“Handbook ofPharmaceutical Excipients”第4版,(2003)Rowe等人(编),The Pharmaceutical Press,London,American Pharmaceutical Association,Washington中找到。
佐剂(多种佐剂)可以包含在本发明的药物中。可以包含适合的佐剂。通常，在药物的情况下，佐剂活性包括但不限于增强药物中由免疫原性组分(例如RBC、RBC组分或产物、靶细胞、靶细胞组分或产物)(定量或定性地)诱导的免疫应答的能力。这可以降低产生免疫应答所需的免疫原性组分的剂量或水平和/或降低产生期望的免疫应答所需的剂量的数量或频率。
佐剂可以增强由药物的组分(多种组分)诱导和/或增强的免疫应答，从而改善治疗结果。佐剂可以利用较低剂量的其他活性组分(多种组分)(例如，RBC、RBC组分或产物、靶细胞、靶细胞组分或产物)诱导免疫。
适用于包含在药物中的佐剂的非限制性实例及其制备方法包括
通常，根据本发明的药物可以局部或全身施用。例如，药物可以静脉内、表皮、皮下、关节内、经粘膜(例如，吸入、直肠)、肌内、脑内、鞘内和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，药物可以包含不一起施用的单独的组分。例如，药物可以包含引发的或处理的RBC和/或RBC组分或产物的第一组分和靶细胞和/或靶细胞组分或产物的第二组分，其已经与引发的或处理的RBC/RBC组分或产物混合。RBC和/或RBC组分或产物可以通过第一种施用途径(例如，全身途径)施用，并且靶细胞和/或靶细胞组分或产物可以通过第二种不同的途径(例如，局部途径)施用，或反之亦然。
通常，药物以与施用途径和受者的身体特征(包括健康状况)相容的方式施用，并且以这样的方式施用，使其引发期望的作用(多种作用)(即，治疗有效性、免疫原性和/或保护性)。
例如，给定药物的适当剂量可以取决于多种因素，包括但不限于对象的身体特征(例如，年龄、体重、性别)，药物是否用作单一药剂或辅助疗法，给定疾病状态的进展，以及本领域技术人员可以认识到的其他因素。在确定本发明的给定药物的合适剂量时可以考虑的各种一般考虑因素描述于例如，Gennaro等人(编),(1990),“Remington'sPharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USA；和Gilman等人(编),(1990),“Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases ofTherapeutics”,Pergamon Press中。
通常，本发明的药物可以以约50微克至约5毫克活性组分(多种活性组分)(例如，RBC、RBC组分或产物、靶细胞、靶细胞组分或产品)的量向对象施用。在一些实施方案中，剂量为约50微克至约500微克的量。
本领域技术人员能够通过常规实验确定其有效、无毒量的RBC和/或干细胞包含在本发明的药物中以获得期望的治疗结果。
通常，预期有效剂量在以下范围内：约0.0001mg至约1000mg活性组分(多种活性组分)(例如，RBC、RBC组分或产物、靶细胞、靶细胞组分或产物)每千克体重每24小时；通常，约0.001mg至约750mg每千克体重每24小时；约0.01mg至约500mg每千克体重每24小时；约0.1mg至约500mg每千克体重每24小时；约0.1mg至约250mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约250mg每千克体重每24小时。更通常地，预期有效剂量范围在以下范围内：约1.0mg至约200mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约100mg每千克体重每24小时；约1.0mg至约50mg每千克体重每24小时；约l.0mg至约25mg每千克体重每24小时；约5.0mg至约50mg每千克体重每24小时；约5.0mg至约20mg每千克体重每24小时；约5.0mg至约15mg每千克体重每24小时。
供选择地，有效剂量可以最高达约500mg/m2活性组分(多种活性组分)(例如，RBC、RBC组分或产物、靶细胞、靶细胞组分或产物)。通常，预期有效剂量在约25至约500mg/m2、约25至约350mg/m2、约25至约300mg/2、约25至约250mg/m2、约50至约250mg/m2和约75至约150mg/m2的范围内。
通常，在治疗应用中，治疗将用于感染、疾病状态或病症的持续时间。此外，对于本领域普通技术人员显而易见的是，个体剂量的最佳量和间隔可以通过感染的性质和程度，所治疗的疾病状态或病症，给药的形式、途径和部位，以及被治疗的特定个体的性质来确定。而且，这种最佳条件可以通过已知技术确定。
在许多情况下，可能期望数次或多次使用本发明的药物。例如，本发明的药物可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。施用可以是约1至约12周的间隔，并且在某些实施方案中，可以是约1至约4周的间隔。在反复暴露于本发明的药物靶向的特定病原体的情况下，可能期望定期再施用。
根据本发明的药物可以作为疾病或病症的主要疗法的辅助剂施用。因此，根据本发明的药物可以是“辅助药物”。
对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以使用常规治疗确定测试过程来确定最佳治疗过程。
本领域普通技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如本文提供的实施方案中公开的本发明做出许多变化和/或修改。因此，本发明的实施方案被认为是说明性的而非限制性的。
实施例
现在将参考具体实例(多个实例)来描述本发明，这些实例不应被解释为以任何方式进行限制。
实施例1.不同抗凝剂(肝素和EDTA)在培养期间直到18小时对RBC和RBC血影吸收的影响
为了确定抗凝剂的存在是否改变蛋白与红细胞结合的能力，在含有或没有肝素或EDTA的血浆中孵育这些细胞。将来自健康志愿者的全血采集到EDTA真空采血管(3mg/mL)中。从收集到肝素和柠檬酸盐真空采血管中的血液收集血浆。使用葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)从抗凝的全血中分离RBC，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次。通过在低渗水中裂解RBC 5分钟来分离RBC血影，其中包含蛋白酶抑制剂(Roche全蛋白酶抑制剂混合物)。然后通过离心(16,000g，20分钟)分离血影并将其重悬于PBS中。分离后，在添加肝素(17IU/mL或1700IU/mL)或EDTA(30mg/mL)的情况下将1000万个RBC(或1000万个RBC的血影)重悬于PBS或血浆中。然后将红细胞或血影在37℃下培养0、1或18小时。作为对照，在相同条件下培养含有肝素或EDTA的EDTA血浆。孵育后，收集无细胞上清液并储存在-80℃下。在分析之前，对样品进行3次冻融循环。使用MIF ELISA定量样品的MIF浓度。培养18小时后，单独的血浆中的MIF水平升高约50％，并且含有红细胞的红细胞样品的血浆中的MIF水平降低，表明MIF已与完整细胞结合(图1)。RBC血影也能够结合MIF，因此表明该结合活性不需要完整细胞(图1)。向细胞悬液中加入EDTA导致RBC裂解物和血影“裂解物”中的MIF显著低于肝素处理(图2)。这些结果表明，向红细胞培养物中添加抗凝剂可能会影响细胞中蛋白的量和结合更多蛋白的能力。
实施例2.不同抗凝剂(肝素、EDTA和柠檬酸盐)在血液采集时对红细胞的结合能力的影响
为了确定在血液采集时使用的抗凝剂是否改变了蛋白与红细胞结合的能力，将全血收集到含有抗凝剂的多个收集管中。将来自健康志愿者的全血采集到肝素真空采血管、EDTA真空采血管或柠檬酸钠真空采血管中。在没有任何抗凝剂的情况下收集血液的等分试样，并通过在PBS中立即稀释和细胞洗涤来防止凝固。收集后，使用葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)从全血中分离RBC，并在PBS中洗涤两次。然后将这些RBC重悬浮于PBS(1亿个细胞/mL)中，并且在重组MIF存在或不存在(每次测试5ng)的情况下。将该细胞悬液孵育最多24小时(37℃,5％CO2)。孵育后，收集无细胞上清液并储存在-80℃。在分析之前，对样品进行2次冻融循环。使用MIF ELISA定量样品的MIF浓度。向细胞悬液中添加重组MIF(rMIF)改变24小时后上清液中MIF的终浓度。除了肝素处理的RBC之外，rMIF孵育后MIF的终浓度低于对照(图3)。这表明rMIF的添加减缓了内源性MIF的总体分泌，或者rMIF的添加增加了MIF吸收的速率，或者rMIF加速了蛋白酶活性并因此加速了MIF降解。抗凝剂对RBC汇集的MIF的量有明显影响。
实施例3：重组蛋白(BioPlex标准)存在下培养RBC的影响
在培养物中向RBC添加重组MIF导致分泌蛋白组中MIF的产率远低于预期。为了研究在添加其他重组蛋白(以BioPlex标准的形式)的情况下是否会看到相同的情况，在重组蛋白混合物的存在下孵育RBC。将全血从健康志愿者采集到EDTA真空采血管中。使用葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)分离RBC。沉降后，将RBC在PBS中洗涤一次，然后在添加或不添加重组细胞因子(BioPlex标准，25μL，标准品3)的情况下将2000万个RBC重悬于100μLPBS或含有蛋白酶抑制剂的100μL PBS中。然后将这些细胞悬液孵育24小时(37℃,5％CO2)。孵育后，通过离心分离上清液和细胞，每种组分储存在-80℃下。
对样品进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元21-元,Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
从在37℃下在PBS中培养24小时的RBC释放许多蛋白。参见图4A-图8D，蛋白分类为抗炎、促炎、趋化因子或生长因子。在与包括IL-1α、IL-12p70和TRAIL的重组蛋白孵育后，RBC裂解物中一些细胞因子的浓度显著增加(p<0.05)。蛋白酶抑制剂的添加也对红细胞结合的蛋白的量有影响，特别是对于IL-18、CTACK和SDF-1α(图9A-图13D)。无细胞上清液和细胞裂解物二者的总测量的细胞因子概述于图14A-图18D中。对于许多蛋白，包括蛋白酶抑制剂，细胞因子的总浓度降低，例如IL-8、IL-10和GRO-α(图14A-图18D)。蛋白酶抑制剂对RBC的分泌谱有影响。在许多情况下，蛋白酶抑制剂的使用导致较小的标准偏差。蛋白酶抑制剂可以靶向特定细胞类型或RBC群(即，较衰老的RBC)，从而降低样品的可变性。
实施例4.在RBC或RBC衍生物的存在下培养MSC的影响
RBC(和RBC衍生物)包含大量细胞因子。体内RBC和间充质干细胞(MSC)经常接触，特别是在诸如伤口愈合的情况下，其中存在许多细胞并进行信号传导。在该RBC(和RBC衍生物)的简化模型中，将该RBC(和RBC衍生物)与MSC一起温育，并评估分泌谱。将原代MSC在第2代培养至汇合，用胰蛋白酶消化，并接种到T25烧瓶(10,000个细胞/mL)中的培养基DMEM+10％FBS)中。将这些细胞孵育3天(37℃,5％CO2)，然后更换培养基并将RBC、洗涤的RBC或RBC血影(每种条件5亿个细胞)加入相关的烧瓶中。为了制备红细胞，将全血收集到EDTA真空采血管中。通过葡聚糖沉降(6％葡聚糖，60分钟，室温)分离RBC。沉降后，将RBC在PBS中洗涤一次。为了产生“洗涤的RBC”，通过过度摇动细胞悬液并离心细胞，将分离的RBC在PBS中再洗涤两次。通过将RBC置于低渗水中5分钟来分离RBC血影。然后通过离心(16,000g，20分钟)分离血影并将其重悬于PBS中。
用无任何东西、完整RBC、洗涤的RBC或用RBC血影引发或处理MSC。然后将它们孵育72小时(37℃，5％CO2)。孵育后，通过离心分离条件培养基和RBC或RBC血影。用胰蛋白酶消化MSC，并分别用流式细胞仪和血液分析仪计数MSC和RBC。将条件培养基和RBC在-80℃下冷冻，并对样品进行3次冻/融循环以裂解所有细胞。
对样品进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
随着RBC的添加，MSC的分泌谱显著改变。洗涤的RBC和血影观察到的变化较小。在培养后，RBC裂解物中许多细胞因子的浓度升高，表明细胞结合了一些细胞外细胞因子，特别是IL-8和IL-6(图19A-图23D)。细胞计数根据培养条件而不同。与RBC一起培养的MSC在培养后具有最高的MSC产量。类似地，在培养后，洗涤的RBC具有更高的RBC产量(表2)。与完整RBC一起孵育对MSC的分泌谱和增殖具有主要影响，并且RBC汇集了一定比例的某些细胞因子(即IL-8)，这可能是RBC细胞因子缓冲系统的一部分。
表2.通过流式细胞术(对于MSC)以及血液学分析仪(对于RBC)测量的在含有或不含RBC(或RBC衍生物)的情况下培养后的MSC的细胞计数和活力测量(n＝1)
实施例5.剪切力对RBC的影响
当从静脉循环进入毛细血管床时，RBC在体内持续受到剪切力。测试了响应机械应力从RBC或全血(WB)释放蛋白。将全血从健康志愿者采集到EDTA真空采血管中。然后通过葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)分离RBC。沉降后，将分离的RBC在PBS中洗涤一次，并重悬于PBS中以达到40％的血细胞比容。然后通过将500μL血液样品添加到具有29号针头的1mL胰岛素注射器中，使WB或RBC的等分试样经受机械应力。使用砝码，将血液缓慢地从针头中挤出并在底部收集。立即(新鲜)分析WB或RBC，在室温下1小时后(新鲜+1小时)分析WB或RBC，或在分析之前冻融以裂解所有细胞(冷冻)。根据制造商的说明，使用hsCRP试剂盒在iChroma机器上运行所有血液样品。
机械应力确实对CRP的总体水平有影响(表3)，表明CRP未结合或在应力后立即产生。值得注意的是，机械应力后1小时，WB样品中CRP水平从0.95mg/L降至0.21mg/L，但在对照(无应力)样品中没有变化。这表明酶可能已被激活，导致CRP降解。在推过针头后，RBC裂解似乎没有发生。
在这种情况下，RBC似乎不是WB中CRP的主要贡献者。CRP在血液中的分布似乎每天都在变化。机械应力后CRP水平立即升高。这表明CRP是未结合的或立即产生的，这使得能够通过抗体进行检测。
表3.在机械应力刺激(针)存在和不存在的情况下全血(WB)和红细胞(RBC)中的CRP水平(mg/L)。使用hsCRP试剂盒在iChroma仪器上测量CRP水平。
实施例6.低氧对RBC和RBC血影活性的影响
血液是高度氧合的环境，氧含量的变化可能对蛋白含量产生二次影响。为了测试RBC的MIF浓度是否受氧条件改变的影响，在低氧PBS中孵育RBC。通过在氮气室中温育PBS≥18小时(5％CO2,3％O2,92％N2)来产生低氧PBS。将全血从健康志愿者采集到EDTA真空采血管中。然后通过葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)分离RBC。沉降后，将分离的RBC在PBS中洗涤两次。通过在低渗水中裂解RBC 5分钟来分离RBC血影。然后通过离心(16,000g，20分钟)分离血影。将完整的RBC或RBC血影(1000万)添加到含有17IU/mL肝素的Eppendorf管中的低氧PBS或常氧PBS(100μL)中。然后将这些管完全密封，将细胞悬液孵育1小时或18小时(37℃)。在孵育后，收集条件PBS，在-80℃下储存并进行3次冻融循环。然后将在低氧条件下“引发”的RBC或RBC血影添加到自体血浆中，然后再孵育1或18小时(37℃)。该次孵育后，收集上清液(条件血浆)，在-80℃下储存，并进行3次冻融循环。
低氧显著降低了MIF从RBC释放，但似乎不影响MIF从RBC血影释放(表4)。这支持蛋白释放与氧含量有某种联系。在低氧条件下孵育的RBC裂解物中的MIF浓度远低于RBC对照(0小时)，可能的是，在培养期间发生蛋白降解(表5)。
低氧对从RBC释放的MIF水平和细胞内MIF浓度有影响。可能的是，由于低氧环境而发生蛋白降解(表5)。如果正好相反(超氧化环境)，它可能是调节蛋白水平和结合红细胞的方式。
表4.来自在肝素(17IU/mL)存在的情况下在PBS或低氧PBS中孵育18小时的RBC和血影的MIF释放(n＝1).
表5.在存在肝素(17IU/mL)的情况下在PBS或低氧PBS中孵育18小时的RBC裂解物和RBC血影“裂解物”(n＝1).
实施例7.随时间从RBC释放或分泌的蛋白的确定
已经在RBC裂解物中确定了许多蛋白。为了研究RBC是否也可以分泌这些蛋白，将RBC在PBS中孵育过夜并分析条件培养基。对分泌蛋白组的分析否定了RBC裂解物中存在的血红蛋白可能存在的问题。将全血从健康志愿者采集到EDTA真空采血管中。然后通过葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)分离RBC。沉降后，将分离的RBC在PBS中洗涤两次。将分离的RBC等分成含有或不含蛋白酶抑制剂的100μL PBS中的2000万个细胞。然后将这些细胞悬液孵育24小时(37℃,5％CO2)。孵育后，通过离心分离条件培养基和细胞。然后将这些样品在-80℃下冷冻，并对样品进行3次冻/融循环以确保完全细胞裂解。裂解后，将红细胞裂解物和条件培养基样品在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些样品。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元,Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
在将在PBS中孵育RBC 24小时后释放或分泌许多蛋白(图24A-图27)。图24A-图27根据每种蛋白的平均检测浓度分开。在RBC培养期间添加蛋白酶抑制剂也改变了蛋白释放。在细胞悬液中包含蛋白酶抑制剂通常导致条件培养基和细胞裂解物二者中的可检测浓度较低，但是存在一些例外，例如MIP-1β(图28A-图42D)。包含蛋白酶抑制剂还减少细胞因子浓度中生物学重复之间的生物学变异。
实施例8.蛋白酶抑制剂作用的调节
在37℃储存期间在血液样品中包含蛋白酶抑制剂改变RBC的分泌谱。为了测试该活性是否是不可逆的，在孵育24小时后将蛋白酶抑制剂从RBC上洗掉，并将细胞再孵育24小时以监测所得条件培养基的细胞因子谱的差异。将全血从健康志愿者采集到EDTA真空采血管。通过葡聚糖沉降(6％葡聚糖，1小时，室温)分离RBC。沉降后，将分离的RBC在PBS中洗涤两次。分离的RBC在PBS或含有蛋白酶抑制剂的PBS(100μL)中的2000万个细胞的等分试样中，如表5所示。然后将细胞悬液孵育24小时(37℃,5％CO2)。孵育后，通过离心分离上清液和细胞，收集上清液并在-80℃下冷冻。将剩余的细胞在PBS中洗涤两次，然后如表5所示将其重悬于新鲜PBS或含有蛋白酶抑制剂的PBS(100μL)的等分试样中。然后将这些细胞悬液再孵育24小时(37℃,5％CO2)。孵育后，通过离心分离细胞和上清液，将这些样品在-80℃下冷冻，并进行3次冻/融循环以确保完全裂解。
然后用多元细胞因子分析法分析样品。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
实施例9.用各种细胞类型引发后的红细胞分泌物
从健康志愿者(n＝1)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
选择代表中性组织的细胞如内皮(HUVEC)、原代成纤维细胞、肾细胞(HEK-293)以及来自肠癌(HT-29)和黑素瘤(MEWO)的代表性癌细胞系。在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增细胞系。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将细胞以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表6中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表6.所有代表性细胞系和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。
然后将红细胞在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。接下来在37℃和5％CO2下在PBS中孵育红细胞24小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)去除红细胞，并且保留和分析含有红细胞分泌物的上清液。使用两种多元分析法：27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图43A-43VV所示，通过“引发”过程改变红细胞释放或分泌的细胞因子，其在该情况下与许多不同的细胞系共培养。红细胞分泌谱不仅在引发后改变，而且每种细胞类型差异地引发具有不同浓度的细胞因子的红细胞。例如用HEK细胞引发RBC引起细胞因子如IP-10、VEGF、碱性FGF、MCP-1和CTACK的显著升高。相反，用原代成纤维细胞引发RBC导致GROa和MCP-3大幅升高。这些结果表明红细胞细胞因子分泌谱根据其环境而发生变化。此外，数据显示不同的细胞类型能够产生具有显著不同的细胞因子谱的引发的红细胞。
实施例10.在悬液中用永生化人T淋巴细胞(Jurkat细胞)引发后的红细胞分泌物
从健康志愿者(n＝1)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的RPMI，v/v)中扩增Jurkat细胞。细胞每周传代两次，并且使用血细胞计数器计数；用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将Jurkat细胞以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表7中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表7.Jurkat细胞和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。根据制造商的说明书，使用Ficoll密度分离将红细胞与Jurkat细胞分离。用PBS洗涤红细胞级分一次，并使用血液学分析仪(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)计数。
然后将红细胞在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后在37℃和5％CO2下在PBS中孵育红细胞24小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)去除红细胞，并且保留和分析含有红细胞分泌物的上清液。使用两种多元分析法。27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图44A-44V所示，通过“引发”过程改变红细胞释放或分泌的细胞因子，其在该情况下与Jurkat细胞(永生化T淋巴细胞细胞系)共培养。蛋白如IFN-a2、MIF、SCGF-b的红细胞分泌浓度在共培养引发后均显著升高。同时，蛋白如GROa、CTACK、IL-8、TNF-a、RANTES和IL6的水平在共培养引发后均可测量地降低。这些结果表明该引发作用可以在各种培养条件下以及在非粘附细胞的情况下发生。
实施例11.用间充质干细胞(MSC)引发后的红细胞
11.1.RBC膜
从健康志愿者(n≥3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后悬浮在ddH2O中以裂解细胞。涡旋振荡该溶液，然后离心(15000g，20分钟)以沉淀膜。重复该过程，将得到的沉淀重悬于PBS中，用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增MSC。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MSC以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表8中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表8.MSC和红细胞膜在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)将红细胞膜从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞膜一次(15000g,20分钟)。
然后(基于使用的红细胞的原始数目)将红细胞膜在PBS中稀释至相当于来自4亿个细胞的膜/mL。对引发的和未引发的红细胞膜进行3次冻融循环以确保完全裂解。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex ProII，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图45A-45VV所示，通过“引发”过程改变红细胞膜的细胞因子谱，其在该情况下与间充质干细胞(MSC)共培养。IL-8的红细胞膜浓度在共培养引发后显著升高。同时，一些蛋白如碱性FGF和SDF-1a的水平在共培养引发后显著降低。结果表明红细胞膜的细胞因子谱根据其环境而发生变化。在整个红细胞裂解实验中引发后，没有细胞因子显著不同，表明该膜具有与作为整体的红细胞不同的细胞因子结合特性。
11.2RBC膜分泌物
从健康志愿者(n+3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后悬浮在ddH2O中以裂解细胞。涡旋振荡该溶液，然后离心(15000g，20分钟)以沉淀膜。重复该过程，将得到的沉淀重悬于PBS中，用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增从脂肪组织分离的间充质干细胞(MSC)。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MSC以0.1x 106个细胞/mL ADSC培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表9中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表9.MSC和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)将红细胞膜从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞膜一次(15000g,20分钟)。
然后(基于使用的红细胞的原始数目)将红细胞膜在PBS中稀释至相当于来自4亿个细胞的膜/mL。然后在37℃和5％CO2下在PBS中孵育膜24小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)去除红细胞膜，并且保留和分析含有膜分泌物的上清液。使用两种多元分析法。27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图46A-46VV所示，通过“引发”过程仅非常轻微地改变红细胞膜的细胞因子谱，其在该情况下与MSC(间充质干细胞)共培养。GRO-a的红细胞膜分泌物浓度在共培养引发后显著升高。同时，没有分析物在共培养引发后显著降低。这些结果表明，用MSC引发后红细胞分泌谱的变化很大程度上取决于红细胞是否完整。
11.3.RBC裂解物
从健康志愿者(n≥3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增从脂肪组织分离的间充质干细胞(MSC)。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MSC以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表10中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表10.MSC红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。
对引发的和未引发的红细胞膜进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图47A-47VV所示，通过“引发”过程改变红细胞的细胞因子谱，其在该情况下与间充质干细胞(MSC)共培养。分析物如CTACK和GROa的红细胞浓度在共培养引发后显著升高。同时，IL-1a的水平在共培养引发后显著降低。结果表明红细胞的细胞因子谱根据其环境而发生变化。这些结果与引发后红细胞释放或分泌的细胞因子的分析的比较表明，RBC在PBS中延长孵育以产生分泌谱比裂解程序明显更可重复。
11.4.RBC分泌物
从健康志愿者(n＝3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次(PBS，500g，5分钟)，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增从脂肪组织分离的间充质干细胞(MSC)。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MSC以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表11中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表11.MSC和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。
然后将红细胞在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后在37℃和5％CO2下在PBS中孵育红细胞24小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)去除红细胞，并且保留和分析含有红细胞分泌物的上清液。使用两种多元分析法。27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图48A-48VV所示，通过“引发”过程改变红细胞释放或分泌的细胞因子，其在该情况下与MSC(间充质干细胞)共培养。蛋白如Gro-a、MCP-3、IL-2ra、SDF-1a、HGF、bNGF、SCF、SCGF-b、IL-8、Il-4、IL-10、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b、VEGF和IL-6的红细胞分泌浓度在共培养引发后显著升高。同时，一些蛋白如IL-1a、MIF、IL-12(p40)、IL-15、GM-CSF的水平在共培养引发后均显著降低。结果表明红细胞细胞因子分泌谱根据其环境而发生变化。通过在富含蛋白的环境中孵育红细胞，细胞能够结合并释放多种细胞因子。
实施例12.用MCF-7乳腺癌细胞引发后的红细胞
12.1 RBC膜
从健康志愿者(n≥3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次(PBS，500g，5分钟)，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后悬浮在ddH2O中以裂解细胞。涡旋振荡该溶液，然后离心(15000g，20分钟)以沉淀膜。重复该过程，将得到的沉淀重悬于PBS中，用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增MCF-7细胞。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MCF-7细胞以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表12中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表12.MCF-7细胞和红细胞膜在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)将红细胞膜从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞膜一次(15000g,20分钟)。
然后(基于使用的红细胞的原始数目)将红细胞膜在PBS中稀释至相当于来自4亿个细胞的膜/mL。对引发的和未引发的红细胞膜进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex ProII，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图49A-49VV所示，通过“引发”过程改变红细胞膜的细胞因子谱，其在该情况下与MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)共培养。蛋白如IL-3和IL-8的红细胞浓度在共培养引发后显著升高。同时，IL-2ra的水平在共培养引发后显著降低。结果表明红细胞膜的细胞因子谱根据其环境而发生变化。IL-3是唯一在整个红细胞裂解实验中引发后其水平也显著改变的细胞因子，表明该膜具有与作为整体的红细胞不同的细胞因子结合特性。
12.2红细胞膜分泌
从健康志愿者(n＝3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后悬浮在ddH2O中以裂解细胞。涡旋振荡该溶液，然后离心(15000g，20分钟)以沉淀膜。重复该过程，将得到的沉淀悬浮于PBS中，用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增MCF-7细胞。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MCF-7细胞以0.1x 106个细胞/mL培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表13中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表13.MCF-7细胞和来自红细胞(RBC)的等价膜在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞和膜在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)将红细胞膜从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞膜一次(15000g,20分钟)。
然后(基于使用的红细胞的原始数目)将红细胞膜在PBS中稀释至相当于来自4亿个细胞的膜/mL。然后在37℃和5％CO2下在PBS中孵育膜24小时。孵育后，通过离心(15000g,20分钟)去除膜，并且保留和分析含有红细胞膜分泌物的上清液。使用两种多元分析法。27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图50A-50VV所示，通过“引发”过程改变红细胞膜的细胞因子分泌谱，其在该情况下与MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)共培养。蛋白如IFN-a2、IL-18、MIF、TNF-b、IL-2ra、CTACK、GRO-a、MIG、SDF-1a,IL-16、IL-3、LIF、IL-8、IL-9、TNF-a、IL-1ra、IL-4、MCP-1、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF-bb和VEGF的红细胞分泌浓度在共培养引发后显著升高。同时，嗜酸性粒细胞趋化因子和碱性FGF的水平在共培养引发后显著降低。这些结果表明，当用MCF-7细胞引发时，红细胞膜广泛地促进红细胞的细胞因子分泌谱的变化。
12.3RBC裂解物
从健康志愿者(n≥3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次(PBS，500g，5分钟)，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增MCF-7细胞。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MCF-7细胞以0.1x 106个细胞/mL ADSC培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表14中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表14.MCF-7细胞和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。
对引发的和未引发的红细胞膜进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图51A-51VV所示，通过“引发”过程改变红细胞的细胞因子谱，其在该情况下与MCF-7(乳腺癌细胞系)共培养。蛋白如IL-1a、CTACK、IL3和IL-12p40的红细胞浓度在共培养引发后显著升高。同时，IL-18的水平在共培养引发后显著降低。结果表明红细胞的细胞因子谱根据其环境而发生变化。通过在富含蛋白的环境中孵育红细胞，细胞能够结合并释放蛋白。这些结果与引发后红细胞释放或分泌的细胞因子的分析的比较表明，RBC在PBS中延长孵育以产生分泌谱比裂解程序明显更可重复。
12.4.RBC分泌
从健康志愿者(n＝3)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次(PBS，500g，5分钟)，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增MCF-7细胞。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将MCF-7细胞以0.1x 106个细胞/mL ADSC培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表15中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表15.MCF-7细胞和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。
然后将红细胞在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后在37℃和5％CO2下在PBS中孵育红细胞24小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)去除红细胞，并且保留和分析含有红细胞分泌物的上清液。使用两种多元分析法。27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，和21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图52A-52VV所示，通过“引发”过程改变红细胞的细胞因子分泌谱，其在该情况下与MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)共培养。蛋白如IL-1a、MIF、TRAIL、IL-2ra、GRO-a、IL-16、IL-3、SCF、IL-12p40、LIF、IL-8、IL-9、IL-12p70、IL-17、TNF-a、IL-1ra、IL-4、IL-13、MCP-1、RANTES、G-CSF、IL-7、IP-10、PDGF-bb、VEGF、IL-2和IL-6的红细胞分泌浓度在共培养引发后均显著升高。同时，仅有IFN-a2的水平在共培养引发后显著降低。这些结果表明红细胞的细胞因子分泌谱根据其环境而发生变化。通过在富含蛋白的环境中孵育红细胞，细胞能够结合并释放蛋白。
实施例13.用A549肺癌细胞引发后的红细胞
从健康志愿者(n≥1)采集全血。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接采集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。采集血液的所有级分，并在采集后4小时内在室温下处理。对于多元分析(BioPlex分析)，将所有样品储存在-80℃下并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前完全细胞裂解。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并弃去上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(6％w/v，在0.15M氯化钠中)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)添加到该细胞悬液中。将该溶液在室温下静置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞级分。将红细胞级分在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次(PBS，500g，5分钟)，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后用于引发实验。
在37℃和5％CO2下，在A549培养基(含有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM，v/v)中扩增A549细胞。当细胞达到融合时，细胞每周传代两次。使用血细胞计数器对细胞计数，并且用台盼蓝染色测定活力。
对于共培养实验，将A549细胞以0.1x 106个细胞/mL ADSC培养基的浓度接种到T75烧瓶中并孵育24小时，以确保板粘附(37℃,5％CO2)。孵育后，使用新鲜分离的红细胞准备表16中列出的条件。对于与红细胞的共培养，T75烧瓶中培养基的总体积为18mL。
表16.A549细胞和红细胞(RBC)在37℃，5％CO2下以1:100的比例持续72小时的共培养条件.
然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过离心(500g,10分钟)将红细胞从条件培养基中分离出来。通过离心(2000g,10分钟)去除条件培养基中的任何剩余颗粒，然后将其储存在-80℃下。用PBS洗涤红细胞一次，并使用血液学分析仪(Coulter ActDiff,Beckman Coulter)计数。然后将红细胞在-80℃下冷冻以产生裂解物。
对引发的和未引发的红细胞进行3次冻融循环以确保完全细胞裂解。分析后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多元细胞因子分析法分析这些裂解物。使用两种多元分析法。第一种是27-元人细胞因子组，其针对碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF进行分析，第二种是21-元人细胞因子组，其针对IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL进行分析(Bio-Plex Pro 27-元和21-元，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用用于洗涤步骤的自动磁力清洗站(BioPlex Pro II，Bio-Rad)进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图53A-53UU所示，通过“引发”过程改变红细胞的细胞因子谱，其在该情况下与A549细胞(肺癌细胞系)共培养。分析物如IL-8、IL-10和M-CSF的红细胞浓度在共培养引发后显著升高。同时，一些分析物如IL-1a和IL-12(p40)的水平在共培养引发后显著降低。这些结果表明红细胞的细胞因子谱根据其环境而发生变化。通过在富含蛋白的环境中孵育红细胞，细胞能够结合并释放分析物。在与间充质干细胞孵育后，红细胞的细胞因子谱也被调节(或引发)(数据已经在引发专利中)。
实施例14.其他示例性非限制性实施方案
通过描述所要求保护的主题的某些实施方案的以下实例，所要求保护的主题的其他优点将变得显而易见。
1.一种用于调节对象中的至少一种蛋白的水平的方法，包括：
a.)通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或至少一种条件接触，产生引发的红细胞；和
b.)向所述对象施用一种或多种选自以下的引发的红细胞组分：
(i)引发的红细胞；
(ii)通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液；
(iii)由引发的红细胞获得的裂解物；
(iv)由引发的红细胞获得的膜；和
(v)由引发的红细胞产生的红细胞血影或膜，
其中向对象施用一种或多种引发的红细胞组分调节对象中的至少一种蛋白的水平。
2.根据实施例1所述的方法，其中所述一种或多种引发的红细胞组分在引发红细胞的过程中和/或引发红细胞之后获得。
3.根据实施例2所述的方法，其中所述红细胞是从所述对象获得的。
4.根据实施例2所述的方法，其中所述红细胞不是从所述对象获得的。
5.根据实施例中1至4中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是引发的红细胞。
6.根据实施例1至4中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液。
7.根据实施例1至4中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组是从引发的红细胞获得的裂解物。
8.根据实施例1至4中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是从引发的红细胞获得的膜。
9.根据实施例1至4中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是由引发的红细胞产生的红细胞血影。
10.根据实施例1所述的方法，其中所述至少一种药剂是选自以下的一种或多种药剂：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂和细胞。
11.根据实施例10所述的方法，其中所述至少一种药剂选自蛋白酶抑制剂、抗凝剂、癌细胞、干细胞和免疫细胞。
12.根据实施例1所述的方法，其中所述至少一种条件是剪切应力、低氧或高氧。
13.根据实施例1至12中一项或多项所述的方法，其中所述红细胞从一种或多种选自以下的来源获得：至少一种对象、至少一种细胞库和至少一种细胞系。
14.根据实施例1至12中一项或多项所述的方法，其中所述对象是人或非人哺乳动物。
15.根据实施例1至12中一项或多项所述的方法，其中通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的方法向所述对象施用所述一种或多种引发的红细胞组分。
16.根据实施例1至12中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种红细胞蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质组分和酶。
17.根据实施例16所述的方法，其中所述一种或多种红细胞蛋白是细胞因子、趋化因子或生长因子。
18.一种调节靶细胞活性的方法，包括：
a.)通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或条件接触，产生引发的红细胞；和
b.)将所述靶细胞与一种或多种选自以下的引发的红细胞组分混合：
(i)引发的红细胞；
(ii)通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液；
(iii)从引发的红细胞获得的裂解物；
(iv)从引发的红细胞获得的膜；和
(v)由引发的红细胞产生的红细胞血影或膜，
其中将所述靶细胞与一种或多种引发的红细胞组分混合调节靶细胞活性。
19.根据实施例18所述的方法，其中所述引发的红细胞调节一种或多种选自以下的靶细胞活性：细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞生长抑制、细胞死亡和细胞修复。
20.根据实施例18所述的方法，其中所述靶细胞是选自以下的一种或多种：免疫细胞、永生化细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和滑膜细胞。
21.根据实施例20所述的方法，其中所述免疫细胞是选自以下的一种或多种：T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
22.根据实施例20所述的方法，其中所述癌细胞是选自以下的一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞和/或癌性血细胞。
23.根据实施例20所述的方法，其中所述干细胞是选自以下的一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如，来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
24.根据实施例18至23中一项或多项所述的方法，其中所述混合是选自以下的过程：将所述靶细胞与引发的红细胞一起孵育、培养、共培养和组合。
25.根据实施例18至23中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是引发的红细胞。
26.根据实施例18至23中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液。
27.根据实施例18至23中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是从引发的红细胞获得的裂解物。
28.根据实施例15至20中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是从引发的红细胞获得的膜。
29.根据实施例18至23中一项或多项所述的方法，其中所述施用的一种或多种引发的红细胞组分是由引发的红细胞产生的红细胞血影。
30.根据实施例24所述的方法，其中所述靶细胞来自对象。
31.根据实施例24所述的方法，其中所述靶细胞在对象内。
32.根据实施例18至30中一项或多项所述的方法，其中向对象施用所述靶细胞。
33.根据实施例18至30中一项或多项所述的方法，其中向对象施用一种或多种选自以下的靶细胞组分：靶细胞、靶细胞血影、靶细胞膜、靶细胞裂解物、靶细胞级分和通过孵育或培养靶细胞产生的上清液。
34.根据实施例18至30中一项或多项所述的方法，其中向对象施用以下一种或多种：引发的红细胞、引发的红细胞组分、靶细胞和靶细胞组分。
35.根据实施例18至30中一项或多项所述的方法，其中通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向对象施用以下一种或多种：引发的红细胞、引发的红细胞组分、靶细胞或靶细胞组分。
36.根据实施例中一项或多项所述的方法18至35，其中所述对象患有疾病或障碍。
37.一种预防、治疗或改善疾病或障碍的方法，包括向有需要的对象施用根据实施例1至36中一项或多项产生的红细胞或靶细胞。
38.根据实施例37所述的方法，其中通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述对象施用所述红细胞或靶细胞。
39.根据实施例37所述的方法，其中所述对象是人或非人哺乳动物。
40.根据实施例37所述的方法，其中所述对象是哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物。
41.根据实施例37所述的方法，其中所述对象是人、小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。
42.根据实施例37所述的方法，其中所述疾病或障碍选自癌症、感染性疾病、器官衰竭、自身免疫疾病、自身免疫障碍、炎症和免疫缺陷。
43.一种引发红细胞的方法，包括：
a.)测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平；
b.)使红细胞与至少一种药剂或至少一种条件接触；
c.)测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平；和
d.)将一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之前与红细胞相关的蛋白的水平与一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之后与红细胞相关的蛋白的水平进行比较，
其中，一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平差异表明红细胞已经被引发。
44.根据实施例43所述的方法，其中测量与红细胞相关的一种或更多种蛋白、两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白、十种或更多种蛋白、十一种或更多种蛋白、十二种或更多种蛋白、十三种或更多种蛋白、十四种或更多种蛋白、或十五种或更多种蛋白的水平。
45.根据实施例44所述的方法，其中测量与红细胞相关的三种或更多种蛋白的水平。
46.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种或至少十五种的水平存在差异。
47.根据实施例46所述的方法，其中至少三种与红细胞相关的蛋白的水平存在差异。
48.根据实施例43至47中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之前与红细胞相关的蛋白的水平与一种或多种与至少一种药剂或至少一种条件接触之后与红细胞相关的蛋白的水平相比的差异通过选自以下的统计分析确定：学生T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和和Spearman秩相关。
49.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平升高和/或降低。
50.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平升高和/或降低。
51.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平升高。
52.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中一种或多种与红细胞相关的蛋白中的至少一种的水平降低。
53.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中使用一种或多种抗体测量一种或多种与红细胞相关的蛋白的水平。
54.根据实施例43至48中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自：趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质组分和酶。
55.根据实施例54所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子和生长因子。
56.根据实施例43至49中一项或多项所述的方法，其中所述至少一种药剂是选自以下的一种或多种药剂：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂和细胞。
57.根据实施例43至49中一项或多项所述的方法，其中所述至少一种条件是剪切应力、低氧或高氧。
58.根据实施例43至57中一项或多项所述的方法，其中所述引发的红细胞调节一种或多种靶细胞的活性。
59.根据实施例43至58中一项或多项所述的方法，其中向对象施用所述引发的红细胞。
60.一种升高或降低在对象的细胞上或细胞内的靶蛋白的水平的方法，所述方法包括：
处理红细胞(RBC)以使存在于RBC内和/或与RBC表面相关的靶蛋白的水平升高或降低，和
向所述对象施用以下一种或多种：
(i)所述处理后的RBC，
(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解RBC获得的RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，
(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤RBC获得的细胞洗液，
(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的RBC的培养物获得的培养上清液，
(v)(i)-(iv)的组合；
从而升高或降低细胞上或细胞内的靶蛋白的水平。
61.根据实施例60所述的方法，其中进行所述处理的RBC是从对象获得的。
62.根据实施例60所述的方法，其中进行所述处理的RBC不是从对象获得的。
63.根据实施例60至62中一项或多项所述的方法，其中向对象使用的RBC是RBC血影。
64.根据实施例60至63中一项或多项所述的方法，其中所述靶蛋白的升高或降低的水平诱导或调节：对象的免疫应答、细胞发育、细胞生长和/或细胞修复。
65.根据实施例64所述的方法，其中所述靶蛋白的升高或降低的水平诱导或调节对象的免疫应答。
66.根据实施例60至65中一项或多项所述的方法，其中向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：
(i)RBC
(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影
(iii)细胞洗液
(iv)培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合。
67.根据实施例60至66中一项或多项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物对象、人对象或二者。
68.一种诱导或调节靶细胞的功能的方法，所述方法包括：
处理RBC以使存在于RBC内或与RBC表面相关的靶蛋白的水平升高或降低，和
将所述靶细胞与以下一种或多种混合：
(i)所述处理后的RBC，
(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解RBC获得的RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，
(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤RBC获得的细胞洗液，
(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的RBC的培养物获得的培养上清液，
(v)(i)-(iv)的组合；
从而诱导或调节靶细胞的功能。
69.根据实施例68所述的方法，其中所述靶细胞是以下一种或多种：免疫细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞和/或髓样细胞。
70.根据实施例69所述的方法，其中所述免疫细胞是以下一种或多种：T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
71.根据实施例69所述的方法，其中所述癌细胞是以下一种或多种：肿瘤细胞、实体瘤细胞、播散肿瘤细胞和/或癌性血细胞。
72.根据实施例69所述的方法，其中所述干细胞是以下一种或多种：全能干细胞、多能干细胞、多能干细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人胚胎干细胞(HeSC)、体干细胞、造血干细胞(例如来自脐带血、骨髓)、骨髓基质干细胞(骨骼肌干细胞)、诱导多能干细胞(IPSO)、表皮干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和/或其组合。
73.根据实施例69或实施例72所述的方法，其中所述靶细胞是干细胞，并且所述混合朝向特定细胞谱系引发干细胞。
74.根据实施例68至73中一项或多项所述的方法，还包括向患有或易患给定疾病或障碍的对象施用：
(i)所述混合后的靶细胞，
(ii)在所述处理期间和/或之后通过裂解靶细胞获得的靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，
(iii)在所述处理期间和/或之后通过洗涤靶细胞获得的细胞洗液，
(iv)从在所述处理期间和/或之后产生的靶细胞的培养物获得的培养上清液，
(v)(i)-(iv)的组合。
75.根据实施例74所述的方法，其中向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：
(i)靶细胞，
(ii)靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，
(iii)靶细胞洗液，
(iv)靶细胞培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合。
76.根据实施例74或实施例75所述的方法，还包括向对象施用：
(i)RBC，
(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，
(iii)细胞洗液，
(iv)培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合。
77.根据实施例76所述的方法，其中向对象全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和/或腹膜内施用：
(i)RBC，
(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，
(iii)细胞洗液，
(iv)培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合。
78.根据实施例76或实施例77所述的方法，其中向对象局部施用：
(i)靶细胞，
(ii)靶细胞裂解物、靶细胞膜和/或靶细胞血影，
(iii)靶细胞洗液，
(iv)靶细胞培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合；
并且向对象全身或局部施用：
(i)RBC，
(ii)RBC裂解物、RBC膜和/或RBC血影，
(iii)细胞洗液，
(iv)培养上清液，或
(v)(i)-(iv)的组合。
79.根据实施例74至78中一项或多项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物对象、人对象或二者。
80.根据实施例74至78中一项或多项所述的方法，其中所述对象患有组织损伤、癌症、炎性疾病或病症或免疫障碍。
81.根据实施例68至80中一项或多项所述的方法，其中所述RBC和/或靶细胞是从对象获得的。
82.根据实施例68至80中一项或多项所述的方法，其中所述RBC和/或靶细胞不是从对象获得的。
83.根据实施例60至82中一项或多项所述的方法，其中所述处理包括以下一种或多种：
使所述红细胞与蛋白酶抑制剂接触，
使所述红细胞与抗凝剂接触，
裂解所述红细胞，
使红细胞经受剪切应力，
用氧处理所述红细胞，
使所述红细胞丧失氧。
84.根据实施例83所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自：抑肽酶、亮抑酶肽、α2-巨球蛋白、抗蛋白酶二盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、TLCK(CAS 131918-97-3)、胰蛋白酶抑制剂、Pefabloc SC(Roche)、PMSF(C6H5CH2SO2F-Thermo Fisher Scientific)、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)及其组合。
85.根据实施例83所述的方法，其中所述抗凝剂选自：肝素、柠檬酸盐、酸柠檬酸盐葡萄糖、EDTA及其组合。
86.根据实施例60至85中一项或多项所述的方法，其中所述靶蛋白是细胞因子、趋化因子或生长因子中的一种或多种。
87.根据实施例60至86中一项或多项所述的方法，其中所述靶蛋白是炎性细胞因子或炎性趋化因子。
88.根据实施例60至87中一项或多项所述的方法，其中所述靶蛋白的水平升高。
89.根据实施例88所述的方法，其中所述靶蛋白选自：CTACK、GRO-α、βFGF、G-CSF、CM-CSF、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2rα、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12-40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IP-10、LIF、MCP-1、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、β-NGF、PDGF-bb、RANTES、SDF-1α、TNF-α、TNF-β、TRAIL、VEGF及其组合。
90.根据实施例60至87中一项或多项所述的方法，其中所述靶蛋白水平降低。
91.根据实施例90所述的方法，其中所述靶蛋白选自：IFN-α2、IFN-γ、IL-1β、IL-8、IL-9、IL-12p70、IL-16、IL17、IL-18、MIF、TNF-α、IL-2rα、IL-4、CTACK、GRO-α、IL-18、MCP-1、MIP-1、GRO-α、MIP-1β、RANTES、SDF-1α、βFGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IL-3、IP-10、M-CSF、PDFG-bb、VEGF、IL-2、IL-6、IL-12p40及其组合。
92.根据实施例60至91中一项或多项所述的方法，其中所述方法用作辅助疗法。
93.根据实施例92所述的方法，其中所述方法用作治疗组织损伤、癌症、炎性疾病或病症和/或免疫障碍的辅助疗法。

Claims (21)

1.一种用于调节对象中的至少一种蛋白的水平的方法，包括：
a.)通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或至少一种条件接触，产生引发的红细胞；和
b.)向所述对象施用一种或多种选自以下的引发的红细胞组分：
(i)引发的红细胞；
(ii)通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液；
(iii)从引发的红细胞获得的裂解物；
(iv)从引发的红细胞获得的膜；和
(v)由引发的红细胞产生的红细胞血影，
其中向对象施用一种或多种引发的红细胞组分调节对象中的至少一种蛋白的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述红细胞是从所述对象获得的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述红细胞不是从所述对象获得的。
4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其中所述至少一种药剂是一种或多种选自以下的药剂：蛋白、酶、核酸、蛋白酶抑制剂、蛋白变性剂、RNA稳定剂、抗凝剂和细胞。
5.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其中所述至少一种条件是剪切应力、低氧或高氧。
6.根据权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其中所述对象是人或非人哺乳动物。
7.根据权利要求1至6中一项或多项所述的方法，其中通过选自以下的一种或多种方法向对象施用所述一种或多种引发的红细胞组分：全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内。
8.根据权利要求1至7中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种红细胞蛋白是细胞因子、趋化因子或生长因子。
9.一种调节靶细胞活性的方法，包括：
a.)通过使红细胞与调节一种或多种红细胞蛋白的水平的至少一种药剂或条件接触，产生引发的红细胞；和
b.)将所述靶细胞与一种或多种选自以下的引发的红细胞组分混合：
(i)引发的红细胞；
(ii)通过孵育或培养引发的红细胞获得的上清液；
(iii)从引发的红细胞获得的裂解物；
(iv)从引发的红细胞获得的膜；和
(v)由引发的红细胞产生的红细胞血影，
其中将所述靶细胞与一种或多种引发的红细胞组分混合调节靶细胞活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述引发的红细胞调节一种或多种选自以下的靶细胞活性：细胞信号传导、免疫应答、细胞发育、细胞生长、细胞死亡、细胞生长抑制和细胞修复。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶细胞是选自以下的一种或多种：免疫细胞、永生化细胞、癌细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和滑膜细胞。
12.根据权利要求9至11中一项或多项所述的方法，其中所述靶细胞来自对象。
13.根据权利要求9至11中一项或多项所述的方法，其中所述靶细胞在对象内。
14.根据权利要求9至12中一项或多项所述的方法，其中向对象施用所述靶细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中向对象施用一种或多种选自以下的靶细胞组分：靶细胞、靶细胞血影、靶细胞膜、靶细胞裂解物、靶细胞级分和通过孵育或培养靶细胞产生的上清液。
16.根据权利要求9至15中一项或多项所述的方法，其中通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向对象施用以下一种或多种：引发的红细胞、引发的红细胞组分、靶细胞或靶细胞组分。
17.根据权利要求9至15中一项或多项所述的方法，其中所述对象患有疾病或障碍。
18.一种预防、治疗或改善疾病或障碍的方法，包括向有需要的对象施用根据权利要求1至17中一项或多项产生的红细胞和/或靶细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述对象施用所述红细胞和/或靶细胞。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述对象是人或非人哺乳动物。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述疾病或障碍选自癌症、感染性疾病、器官衰竭、自身免疫疾病、自身免疫障碍、炎症和免疫缺陷。
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