HU230341B1 - A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei - Google Patents

A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei Download PDF

Info

Publication number
HU230341B1
HU230341B1 HU1200239A HUP1200239A HU230341B1 HU 230341 B1 HU230341 B1 HU 230341B1 HU 1200239 A HU1200239 A HU 1200239A HU P1200239 A HUP1200239 A HU P1200239A HU 230341 B1 HU230341 B1 HU 230341B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
smf
membrane
expression
binding
red blood
Prior art date
Application number
HU1200239A
Other languages
English (en)
Inventor
Sarkadi Balázs 50% dr.
Várady György 35% dr.
Kasza Ildikó 15% dr.
Original Assignee
Advancell Diagnosztika Kft.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advancell Diagnosztika Kft. filed Critical Advancell Diagnosztika Kft.
Priority to HU1200239A priority Critical patent/HU230341B1/hu
Priority to PCT/HU2013/000034 priority patent/WO2013156806A2/en
Priority to US14/395,524 priority patent/US9465038B2/en
Priority to EP13766655.8A priority patent/EP2839293B1/en
Publication of HUP1200239A2 publication Critical patent/HUP1200239A2/hu
Publication of HU230341B1 publication Critical patent/HU230341B1/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1488—Methods for deciding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A TALÁLMÁNY SZAKTERÜLETE
A találmmiy tárgya plaztnamen^bfán fehérjék. mini blomarkerek kvantitatív meghatározása a vörösvémejt-metobránbsn. A tnlábnány egyszerű. viliidéit, kvantitatív vizsgálatokból épül fel. mely révén az eljárás bármely diagnosztikai labor által tnegvaloíithstfö. Az eljárás lehetőséget sd a mnuforánfehérjék rág kóré esetén a direkt expressxtós szint személyre szabott, mennyiségi meghatározására kis mennyiségű vérmintából és előbb; eredményeket összeköti az egyedi genetikai változatossággal. közállapotokkal, betegség stádiumokkal és következményekkel, kezelési protokollokkal, gyógyszer válaszreakciókkal vagy toxikus mellékhatásokkal,
A TALÁLMÁNY MŰSZAKI HÁTTERE
A személyre szabott orvoslás bfemarker-űlagsmszfekat módszerek kidolgozását igényli, melyek tükrözik az egyének közötti változatosságét és lehetővé teszik személyre szabott tetdpíás eljárások alkalmazását. A plazmamembrán-fehérjék kulcsszerepe? játszanak a legkülönbözőbb fiziológiás funkciókban és patológiás állapotokban, ennek ellenére jelenleg még nem áll rendelkezésre azok kvantitatív meghatározására alkalmas, egyszerűen megvalósítható eljárás. Mivel evek & fehérjék komplex processzálási {feldolgozást} és „tratlickiag” {vándorlási) folyamatokon mennek keresztül, az· mR\S *Mt nem köven svmw u uhmpk v„gfe evnc-A/to» x? nfet x tfe\ga»t vfe’-'brfebá 1 zen íűlmt-nöen, humán szóverminták esetén sem a mRNS, sem a végső fehériesximek nem határozhatóak meg megbízhatóan, a megfelelő hőmön szövetek vételének és feldolgozásának nehézségei miatt. Számos adat létezik membrásfebérjék expressziéiül befolyásoló genetikai polimorf zmasokm é§ motádékra Vöinbkozőso, de humán fehérjék esetén a tényleges expressziás szintekre vonatkozó adatok szórványosak. Amint az feni mát említésre ksrűh a legtöbb metnbtónfehérje «setén az. mRNS eaprosszíós szintje nem követi a fehérje kifejeződését, és a humán szövetminták vétele periig nehézkes. Ugyanakkor traszporterek és receptorok, melyek ADME-Tox tulajdonságok, gyógyszer-érzékenység, receptorsnge'kv és autios \xgy «RiLalaa' modmntas hopvr.ben almuk. e\ ame'sek kuleobö’v hGegaegekke gyógyszeres kezelésekkel hozhatok összefüggésbe, jelentős egyedi változatosságot mulatnak. Előbbi változatosságok pontos kimutatása, különösem a fehérjék szintjén, mely a személyre szabott, orvoslás fejlődését hozná, még mindig hiányzik.
Amint azt mik korábban bemutatták, a barnán vőrösvérsejtek iVV’F) szimpla ptmmntmesnbrániában számtalan membrán fehérje kifejeződik, trsnszporterek és receptorok egyaránt [Goodman S. R. ás tsak, “The Muman Red ötóod Coli Rroteome and hncrsetome Expcrimcntai Rioiogy and Medteíne (2007), 232: tőül-1408; Pasink E. és tsai, Í2010) Red blood eeli (RRC) membráné prnteomies-Part L Proteonnes und RBC pbystology,' 1 Rrofeonnes 73(3): 403-20.1. A vérminták véreiének egyszerűsége, és a szövet -specifikus membránfebérje expressziós szintek tükröződése a vörösvérsejt-snembrártbenalkai·· mássá feszi ezt a metodológiát (platformot) egyszerű és gyors, kvantitatív öitmw'kernperfesr'Vizsgálatokra. A vörnsvérsejlmenthrán-proteomtól jelenleg rendelkezésre álló adatok alapján számos fehérje mérhető mennyiségben kifejeződik s vffeöw4^’Lmemhráuh.'»a (hód IfemAtócz-riernandez A es tsal., AÁUezaiions ín erythreoyte membrarts protein eempostfion ín advnneed non-amali eell hmg cancer
JBlood Cells Mól Dia. (2006) 36(3):355-63: Goodman S, R. és tsai,, lásd fent), 'melyek isxnetten bizonyos betegségek hátterében állnak, és amelyekről azt gondoltuk, hegy csak bizonyos szövetekben és szervekben expresszálódnak.
Számos technikát alkalmaztak már eddig is bizonyos vőxösv&sejt-membránfehégék működésének és/vagy ezpressziójának mérésére, ahol. az a betegségekkel függött össze. A vörösvérsejt Na-Li és Ns-H eseretmnszpört aktivitásról kimutatták, hogy etöm jelzi a cukorbetegségben az. érintettséget, vagy a magas vérnyomás esetén a hajlantot (lásd Korén W, és fsai., Bxhwed erytínocyte Na-t/R·*· exchange piedicts dlabsíic nephropathy in patieats wlth ÍDDM. Diabstologia. KW Feb;41(2):20.1-5; Weder A.B, és fsai. Bryűttwyte Sodium-Ltthium Counterttünsport and Blood Pressere, .Hypestensioa 2803, 41:84284Ö, Deák B, és tsai., Diahetes and eryíhrocyte Na-Iá -exehanger, Ácta Diabetol (2003) 48:9-13),
Számos példa mellett Sprague R. S. és társai ('‘Rcduced Expressoin of Gi in Eryfhroeytes of Homans With Type 2 Diabctes is Associated With Impairment of Both cAMP Generálion and AT? Reáease”' Diabetes (2006) 55 3588-3593} a fehérje kifejeződést Western analízissel vizsgálva megállapították, hogy a Gi heterotrimer G-fehérje kifejeződése szelektív módon csökkent .a. 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek vőrősvérsejíjeiben. Anionéin» Μ. H. és társai pApolipoprofeln J/Oasterin Is a Növel Simonnal Componení of Humán Eryífaoeyíes and a Blomarker of Céllular Stress and Senescen.ee” P'LoS ONE, (2811) 6(18) «26832 1-9] azonosították a Szekretoros Apol^eprötein J/CInsterin (sCLU) chaperoat, mely egy barnán vörösvérsejthez kötődő alkotóelem, és összefüggésbe hozták számos patológiás állapottal. A szerzők & vörösv&sejt-membránhoz kötött sCLV-t vizsgálták, mokkuláns, biokémiai és nagy felbontású mikroszkópos módszerekkel, .Megállapították, hogy a sCLU fehérje csökkent kifejeződése érzékeny btomarkem az öregedésnek és a sejtes símm-fölyamatoknak. Mindemellett. az sCLl nem integráns membránfehége,
A fent említett vizsgálatokban alkalmazott valamennyi teehöölógb (pl, Western biot, transzport aktivitás-mérés, speciális mikroszkópos vizsgálatok) csak specializált kutatólaborban elvégezhető módszer. Illetve előbbi technológiák alkalmazásával a memhránfehérje expresszió mennyiségi meghatározása nagyon nehéz. Néhány esetben áramlási citotnetöáí alkalmaztak a vörös verse jtmemhránfehésjék detektálására (lásd Saison, C, és fsai. (2012). ”Noll alleles of ABCG2 encoding the breast cancer resistance protein defme the new blood group system Junior. Nat Génét 44(2): 174-7], de ez esetben nem javasolták a tómolőgia felhasználását membránfehétjék expressziőjának kvanütálásám.
Ennek következtében, ú^ tűnik, továbbra Is Igény van hatékony és egyszerű biomarksrdiagnosztikai vizsgálatokra, amelyek a vörósvérsejí-membránfehérjék cxpresszíöián alapulnak, ugyanúgy, mint a betegek egyedi változatosságát tükröző vizsgálatokra és ezek által lehetővé váló személyre szabott terápiás eljárásokra. Továbbá, úgy tűnik, igény van hatékony és gyors eljárásra a membránfehéíje expressziós szintek kvantitatív mérésére a vörösvérsejtekbes, miáltal adatokat lehet nyerni az egyén állapotáról, Nagy előnye egy ilyen teehnolégiánsk,...hogy a memhrátdehérféket azok .natív vagy enyhén fixák, membránba ágyazott formájában detektálja. 1 ovahhmenve, úgy tűnik, a technika állása szerint nem javasolják a membrárifehérje-expresszió diagnosztikai alkalmazását, beleértve a membtttnreecptor<A GsLu.m· t-AfeGttd v v,;gy apu trm'.ív,p<Wtex vörösvómejibe.H expressziójának hetegségmarkerkém való alkalmazását.
.A jelre; tehaktiók gyors, érzéken) es kvasiitahv tuembránleherie detektálást mősbzert ía ahak fel, o\ összefüggést találtuk n xürówőrxqibeb i«embfáöíefeérje-e\press?.u ös gettónkat mutációk, pnltmorftzmusok, illetve gyógyszer- és sej'í-vál«meakeiók közöd, Emellett a humán vőresvérsejtek. esetén a relatíve lassú bunover és hosszá élettartam (kb. 120 nap) a rendszert stabli viszonylag lassan reagáló biomarker-metodológiává teszi, amely elsősorban a mernhrúnfehérjék egyedi változatosságát vagy azok krónikus változásait tükrözi
A TÁLÁLMÁNY RÖVID LEÍRÁSA
Egy szempootból a jelen találmány tárgya módszer......sejtmembráofehérie_____(SMTj fogtálja a következő lépéseket:
- vörösvérsejteket tartalmazó vérminta vételét említett egyéntől,
- vörösvémeit vagy vörösvérsejt-tnembtún tesztminta készítését a vérmintából, ahol egy, a Yőrösvérsejt-membrinbao jelen lévő SMF egy vagy több ephópia elérhetővé vart téve egy vagy több epkóphoz specifikusan kötődni képes, mcmbráafebérjéí (MF) kötő ágens számára, és ahol előnyösen a rort'sveree'tek egréz &C iA,
- az SMF~khtö ágens hozzáadását a tesztmintához olyan körülmények között, ahol az SMF-kötő ágens specifikusan kötődik a vörösvérsejf-membránjában lévő SMF egy vágj-' több epitöpjához, telítési mennyiségben az egy vagy több epítöp telítésére, ahol előnyösen az említett telítési mennyiség olyan χ,οο ree\ rémére \ <-grem, ,u ke. * „v’Mj reg\ r cos op (VveSMl 'tóton sCze^vk meghatározása alapján lett kiszámolva, ·· a kötődés révért létrejött jel uj eresét, ahol az SMF-köíő ágensek kötődnek a teszuuima vőrösvéreejkrnernbránjábnn jelen lévő SMF-hez,
- a nyert jel átalakítását egy olyan értékké, moly korrelál a vörösy&sejtsk meszthtánjáhau jelen lévő SMF molekulák számával mgvnemn megesel, ahol ?,z rezek olyannak tekinthető, amely st? SMb memöránexpmssztós szintjét jelzi.
ggy további szempontból a találmány tárgyát képezi^fei^fcMSMe' » vörösvérsejt-membránixm lévő SM'F expressziős szintjének kvantitatív mérése útján az egyénben, ahol az $MF tipikus vagy normái vagy szabályos membránexpressztós tartománya a vörosvmejt-tnetnbrúnb&n előre meghatácozob vagy ismert, ás a módszer tartalmazza a következő lépéseket:
- vörösvémejteket tartalmazó vérminta tételét az egy éritől, . vörösvérsejt tevzbmnta vagy vörősvérsejtinenfomn-tesztminía készítését a vérmintából, ahol a vőrösvérsejt-meíubtinban jelen lévő SMF egy \agy több epttópia elérhetővé van téve egy vagy több epitópboz specifikusan kötődői képes SMF-kötó ágens számára.
- az SMF-kötö ágens hozzáadását a tesztmintához olyan körülmények között. ahol az SMí'-kötő ágens spéci Okosan kötődik a vőrösvérsejí trtcmbtáíúábati jóién lévő SMF egy vagy rőbb epitópjához, telítési mennyiségben az egy vagy több epitóp telitéaére, ahol a telítési mennyiség tebtésí vizsgákittat t-reo. ' '1, o v, x re t l v < nre . x., ktszátroha.
- & kötődés révén létrejött jól nyerését, ahol a kötő molekulák kötődnek atesztminta vörösvérsejt'membránjában jelen lévő SMF-hez,
- a nyert jel átalakítását olyan értékké, amely a vörösvérsejtek membránjában jelen lévő SMFmolekulák számával vagy mennyiségével kortelák ahol az érték az $MF roembránexpressziós szintjének toki.ttthetö,
- az egyénben ne SMF így nyert ntembránesprvssziös szintjének összehasonlítását az SMF vörösvérsejt-membrártheU tipikus vagy normái vagy szabályos membrán expressziős szintjével, és a tipikus vagy normál vagy szabályos membránexpressziós tartománytól való szignifikáns eltérés hiányát, a tipikus vagy normál vagy szabályos állapot jelének tekintjük az említett egyénben, a tipikus vagy normál vagy szabályos membrán espressziős tartománytól való szignifikáns eltérést nem tipikus vagy szabálytalan vagy nem normái állapot jelének tekintjük az említett egyénben..
Előnyösen, az állapot az egyénben összefügg az SMF megváltozott ezpressziöjával egy. a vörösvérsejttől eltérő szövetben az említett egyénben
Még előnyösebben, az SMF expressziójával összefüggő állapot az egyénben az alábbiakat tartalmazó csoportba sorolható; genetikai variációk, genetikai betegségek, az. SMF gén mutációja következtében kialakuló állapotok, az SMF gén expressziét; szabályozásának változása következtében kialakuló állapotok, előnyösen sz említett SMF fokozó regulációja íup-regnláeiőja) vagy csökkentő regulációja (domomegnláelőja).
Egy előnyös megvalósítási mód szerien a módszer lépései több alkalommal ismétlésre kerülnek és ezáltal a beteg állapotának monitrsrozásn történik, előnyösen az említett egyén állapotában idővel vagy bármely hatásra bekövetkező bámulván változás monitorozására, pl, gyógyszere lés, betegség kialakítlása, öregedés, stb,
Ihmoven s sorosvérsejtck ege»* \epsh. ciómőscn ep Xrtek c\ *zcllemsvjtek keveréke Előnyösen, a tesztmhUában ép sejteket és/vsgy vörösvérsejt-szellemeket is felhasználunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy kontroll kötő ágenst és/vagy egy kontroll SME-t ív alkalmazunk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a telítést mennyiség meghatározásra kerül az SMF kötőhelyeinek vagy epitópjamak SMF-kötö ágenssel történő titrálása útján,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint a vörosvérsejt tesztminta készítése során fixálást alkalmazunk, előnyösen kere-sztkötö fixáló ágenssel és/vagy aldehid fixáló ágenssel.
Előnyösem a vörösvérsejtek legalább egy részének membránját petmoábihzáijuk membránper''’X.UvIpí „ ágense usucls k t bta'\>crt\ ao v cts edme \cz vχχ,η dcfo zet s*ct szaporítanak így tehetővé tesszük az SMF-kötő ágens (pk antitest) inttacelluláris kötődését.
Egy megvalósítást tutid szerint tt íesztmimáhítn a víirösvérsejt-membrátttől különböző membránok mennyisége elhanyagolható a k\ wilztiv mérés során.
A módszer egy megvalósítási módja szerint a jel nyerése egy további, az SMF-kötő ágenshez kötődni képes, jelölt kötő ágens hozzáadása révén történik. Altemativakóot, az SMF-kötö ágens jelölve van, és a jel nyerése az említett jelölés révén történik. Előnyösért, a jelölés egy- fenyelnyelő rész, fiootesívonstesz.en/mn-t GΆο<ηΆ\\;\χΜ őm. ölök,'
Igen előnyösen, a jelet áramlási eitometi'tai vizsgálatul nyerjük, és az SMF-st a .membránjukban urtalrmtzö sejtek számát Itatározzok meg.
Alternatívaként, a jelet olyan eljárással nyerjük, ahol a minták keselése párhuzamosan, különálló edényekben történik, előnyösen lemez ímásuéven tálca, „piatcM fermáttimü eljárássat és a jel mennyiségét határozzuk meg, előnyösen egy itnmonoszorbens eljárás révén. Előnyösen, az eljárás BUSA eljárás.
Előnyösen, fal az ep ^örőavcrvejt-fmhcmban a kotevj esemeoyvk eövetke/toben \ags a/okot \pee'Jiku5f \ag> azok alt/ Mvúhoít ie\t, sag> tb) x M'ei'cm vctox'-vrven tmkcn'Km a kötess csenem ek kövelkeztöben vagy azokra specifikus vagy azok által, kiváltott jelet, vagy (só és tb) típusú jelel is belehalunk es alakítónk at olyast értékké, mely korrelál műtökét trakvaKm az SMF molekulák számúval vagy rnrsxnylségővek Egy megvalósítási mód szerint az ép vörcsvérselt frakció és a szellem vöresvérseji frakció el vannak különítve.
s:to előnyős megvalositáss mód s/ettm a tészta ma készsáse sorún sejteket merünk a vérmintából, előnyösen ecntritbgálással es újrafeloldássak
Egy tovább- szempont szerint a találmány tárgyi képezi a^rgsc^iE^ §MLsgh.YWlőbLkBlÉkúiLsiMc^^ ö^W.^OU§P3>L9?Xéj^lé|S^Ítl^...áJ^ákét^.dP^b.?Élta.lé^SM£^.m§azKjs.sgH5<jépek fesMÜ^iyjg^.^^.egyénbem
Előnyösen, stz állapot az egyénben összefügg az SMF megváltozott expressziójával egy, a vőrösvérsejftöl eltérő szövetben az egyénben.
Még előnyösebben, az SMF expresszlóiávai összefüggő állapot az egyénben s következők alkotta csoportból választott; genetikai variációk, genetikai betegségek, az. SMF gén mntáesója következíóben kialakuló állapotok, az 5M.F gén. expreseziós szabályozásának változása következtében kialakuló állapotok, előnyösen az SMF fokozó regulációja vagy csökkentő regulációja.
Egy további szempont szerint a találmány tárgyát képezi í^S?^i?.sgáLSME^fJ^l&év§i iMSákfeljiltepok értőimig §2fe^ö«kA^iMll^..mÉéae..tá^...§^«§yéag£S» «hol az SMF tipikus vagy «ónnál vagy szabályos mcmbráttexpressziős tartománya a vörösvórsejt-membtánban előre meghatározott vagy·' ismert, és a rendszer a következőkből áll, vagy azokat foglalja magáim;
- eszköz, egyénből nyert vérmintából készített vörősvénsejt-tesztmiuta vörösvérsejúeinek 'ttO\\óvt ,e.mb'v'Ot'an ~t'ee ou MMl egs < κ·> ,0xb eo u pjaeoz x|\zcFt\an kő » lo eMi kőn ágens fosai koaiteti nü xag> jelek «sörösöm, ahol votősvso-ep membtanban K'len levő SMF ecy vauy több epitőpja elérhetővé van teve egy vagy több epltöphoz specifikusan kötődni képes SMF-kötő ágens számára, ha a kötő molekulák kötődnek a tesziminöt vőrösvérsejMnembránjában jelen lévő SMFdiez, os'ko' t ’vert c! at.UakmAám ce, í^v e e^okke \'t ·,. v \?\χχ*λ m.untom abm efon leső FMF'toofohufok szántásul \ftg\ menüs taégose< hűre·/, ahol n ötkk .v bMF-mojnbom vvomsícma szintiének tekinthető,
- eszköz az. egyénben az SMF így nyert membrán expressziós szintjének Összehasonlítására a.
s.messemetlmtvtohtonb.o' s - \W *-p-t <'< ' u?m.,d ·.,; s nv.nj'.o;. cxprowzm^ szjot-ctei
Az említett rendszer lehet pl, eszköz, vagy készlet (kit), vagy eszköz és készlet (kit) kornbináelöja.
Fíőmóson, η rentózcr egy snmtói eitomeoko eszköz egy stótntógép tónmtóm obit, ahol 3 ;d rtyorésétv yzoígáló eszköz. detektor, előnyösen egy fluoreszcens detektor.
Előnyösen, a rendszer egy lemezleolvasó („piaié reader”) egy számítógép kontrolija alsít, ahol a m seu'Mfn. -««IgJó ?\ím\ <.tótekfon ei, '\Kuo , \ Mtó^-o Geo χ-,λ,ο , » etektó, ,'ηυχχ < letnezleolvnsó egy BUSA lensszíeoívasó.
Egy előnyös megvalósítási mód szedni a talátósfeytóz tartozó rendszer fel w ezerolvo egy számkógóppet, mely programozva van
- a jelek elemzésére,
- j nyert jel átalakítására em han értékké, moh. 3 vőrosvéraeik-k membrán tóban vlen leső SM.tó molekulák azmiuvtó vaey moonytaegevel kcnekrl, ahol sx erek a? SMF'iu<znhmn expievs/íoe szintiének totó atható,
- az egyénben az SMF így nyert membraoexpressziós szintjének összehasonlítására a vöröavérsejtrtzembrán SMF tipikus vagy normál vagy szabályos membrán ezpressziós szintjével
I O 0 0«V ' i'O'í. , Otód -„«ΪΓ* t !?l 1Ϊ5 xVVlí < ,v Cs/C5 Λν,ν lx \,,htó Ok 'VsVi!
készlet (kit) formájában, egy vagy több, a kővetkező csoportból választóit elem:
- SMF-kötó ágens,
- eszköz az egyéntől vörősvárseitekst tartalmazó vérminta vételéhez,
- mktó s vénmutáhél vöttóvémep íesztmínta késziléséhez, ató a vífrösvérspjrtrtieinbrtóbms jelen lévő $MF egy vagy több cpítópja elérhetővé van téve egy vagy több epltópboz specifikusan köiőöni képes SMF-hörő ágens száméra,
- eszköz egyénből nyert vérmintától készíteti vór^vétscgKasztmmtn feldolgozására, előnyösen a mérési teltételek biziosrtásám, ától n vörősvérseli'.membíánban jelen lévő SMF egy vagy több epitópja elérhetővé van léve egy vagy több epiióphoz specifikuson kötődni képes f MF-kötő ágens számára As egy, vörösvórsejrtmemhránban jelen lévő SMF egy vagy tóhb eptópjához speeífíkusan kötődni képes S,M F-kötő ágens,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint az SMF esprcsszáöjávnl összefüggő állapot zz „ne, »ö'< 4 tó x1',tórotó s«-> ni o„t ί\,ιρ>' , , e t z , η tó s- oc J λ sorolható: geneiikaí variációk, genetikai betegségek, az Shir-gén mutációja következtében kialakuló állapotók, az SbfE-géu expresazlós szabályozásának változása következtében kialakuló állapotok, e ,0 az enhtert tóti tokoro ox faetój' x.igy , sekken,» as. ,\<ί '<a levrtbbí előnyös megvalósítási módok szeriül az állapot hszégség, melyhez az SMF fokozott expressziója társuk ahol az SMF membrártexpiessziós színije a típusos vagy szabályos vagy normál expresszié* tartomány fölött van, vagy
- betegség, amely az SMF csökkent vagy elégtelen expresszíőjával függ össze, eltel az SMF x v 'i\x,V\p 0Sx-<tm C< s , x\ \;s„ </-, n x , ,, x g,
- birtegség, mely az SMF expressziöjának hiányával flgg össze, ahol az SMF memhntóexpressziós színre nem tói el azieni ök ·>ηχ ϊ5> t h v*a- »»χ xtómne erre,z„ s s, »mtó
Viómo\en, a exmtfkm várton az SMF genvnkm oo<,metf’<;;'Uis.,t, tw's íz hMt evn csinosai befolyásolja.
Előnyősén, a genetikai variáció sz SM.F mutációja, mely az SMf vxpresszióját befolyásolja.
Előnyösen, az SMF géuexpfeesziós szabályozását változása korábbi gyógykétóés (pl. ^.op'noi tc.veeok >A\\m *»«. *\e\ oa >v ' k^ s^s os < K-?o? vmkns betegségek vagy előbbiek kombinációjának következménye,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint az SME membránba integrált fehérje vagy specifikusan metnbráakütött fehérje vagy integráns membránfehérje.
A találmány egy előnyös megvalősilási módja szerint az $MF a következő csoportból lett választva
- membxániranszporter fehérjék, előnyösen ABC tmsmbtmnráészperlemk, ATlMhggó ion Ittmazpertezek éa sóimé «dér (SIX) típusú i'tuaszpm'lemk,
- membrán csatornák, • menésán receptorok.
Egy ige» előnyős megvalósítási mód szerint ac $MF ÁBC-mombránir&nszpon^, előnyösen. AfXö>memtebttmos-zj?ó,tief·.
Egy megvalósítási mód szerint az SMF-kötó ágens egy ligand, egy aptatner, egy mtnibody vagy egy antitest, előnyösen egy tnnnoklonális antitest Egy előnyős megvalósítási mód szerint a törő ágens egy monoklooális antitest vagy annak ifegmeníje vagy annak variánsa.
\ tzkdmmp eg> n'egsaloí'tást m,\'fes. x/snni az ^Mf imnceílnmris jevehec kotodiu képes S\5Fköéö ágenst n'kalrnaznnk, Egy további megvalósítást mád szerint az SMF extruceilniáris iCxcebez kötődni képes SMFAötő ágenst alkalmazunk. Egy megvalósítási mód szerint mindkét fajta. kőn? ágenst alkalmazzuk. Egy külön megvalósítási mód szerint több «piíopkötö molekulát alkalmazunk.
A találmány egy előmos megvalósítási módja szerint legalább egy referencia SMEAötö ágenst alkalmazunk, amely képes specifikusan kötődni a vötösversejőtnembránbanjelen leső másik SMFdtez.
A találmány egy előnyös neon ve,' t az egven ge«uA ek^vo^n cos <x előnyösen emberi személy vagy beteg,
DEFINÍCIÓK
Az „epítóp” jelentése a fehérjesnoleknla egy része vagy egy hely a feherjetnoiekulán, amelyet specifikusan felismer vagy köt egy fehérjeköfő molekula, előnyösen egy antitest vagy egy specifikus ephőpfelismerö molekula, Epitóp lehel bármely rész vágj' hely, amely biztosítja a megfelelő erősségű kötés lehetőségét. Például, az epitőp lehel lineáris epitóp, vagy kontbrmáeiős epriöp.
A ,.vőrik;>Crs'e/r a gerincesek egy vérscjlje, mely atutak aktív formájában a vörös pigment hemoglobinhoz kötve oxigént és széndioxidot szállít a szövetekbe és onnan el. A humán vörősvézsejtek bikortkáv korong morfölőgtájúak. Emlősökben az. éren vöröwérsejíeknek nincs sejtmagjuk, tnlg egyéb gsrincesekben a sejtmag összezsugorodott es a kromaím kondenzált. Tágabb értelemben a vöröavérseiiek fogalomkörébe mriuzík a vöröevérscjtek minden formája, bekéri ve az ép és serük formákat, pl. a vórbsséuan Mcllermkot * >»y .'xtGW' nnrienrin , ,ι << α;λa < no. <on s\crtesteK mgairnsba •δ tartozik amdea fújta vörősvérsejg mely tartulmazza azok citoplazmutikus tartalmat, beleértve a hsmoglohite.
A ,azü?terézmy'í izeZ/mseÁ' esetén a vőrösvérsejt-membrán és eitoszkeletáhs elemek, valamint az creéeti morfológia megmaradnak, ugyanakkor ezek nem tartalmazzák az eredeti eitepbzmatíkns tartalmat. Λ. vőrösvérsejteket egész sejteknek tekintjük a jelest találmány szented áttétemben.
A a vörösvérsettek külső része, amely a belső vagy íntmcelfulám tetei a külső vagy extrac^llulárts tértől elválasztja, amikor a vörösvérsettek egész, sejtek.
A .AtegrtefoteímA kifejezés ate.it stteisztikat szlgmílkaociát értünk valamely, az adott vizsgálati reudszethez illő statisztikai, hipotézis-vizsgáló módszer alapján, Szakember jártas a statisztikai Isipotéztevizsgáló n?telszerskbem
A ,ptegüu/i.fote áw/áteőség'’ fogalmát nteréai eredmények két adatham-nza közölt, vagy egy .etetési eredmény és a mérési eredményeket leíró adattanomáxty (pl. konfidencia huervalhmsj között, érijük, mint statisztikailag szignifikáns különbséget. Előnyösen, ebben az esetfon a hipotézist, mely szerint nincs kapcsolat sz értékek két adathalmaza közölt vagy egy ették én egy aítefoalntaz között, nem tehet elvetni egy alktemazott statisztikai módszer alapján.
tegfou se/teif fogalma alatt sejteket értitek, melyek aepmembránja kompatltsetsósmoi alkot vagy meghateroz egy belső és egy külső terel, akkor is, ha m említett membrán pemieábiltesá van téve vagy az esoMteit sejt funkciójában sérült.
..ég? Sígtek olyan sejtek, melyek esetén na alapvető sejtes funkciók megmaradnak.
Az egyének egy ,/.?o/.ntekhA ,jg egy közös tulajdonságban osztozó egyének összessége. Korlátozás nélkül, a közös jellemző lehet pl., egy bizonyos földrajzi területhez váló tartozás, nemzethez, rakáshoz, korhoz vagy nemhez való tartozás, egy közős fenotlpusban vagy genotípusban való egyezés, vagy sgy állepot, mely az. említett egyének jellemzője vagy egy betegség, vagy egy rendellenesség, wgy egy tünet, melyben szenvednek.
Az „egyének οοοροφι” az ügyének egy nagyobb csoportjából kivétesztolt egyedok sokaságai je~ letel, akár östkényesen, akár közös tulajdonságok vagy jellemzők alapján történt a kiválasztás, pl. egy közös feöodpus vagy genotípus alapján, egy éket jellemző állapot alapján, vagy’ egy betegség, vagy egy rendellenesség, vagy egy tünet alapján, melybe» szenvednek. Az egyének száma a csoportban nincs specifikusan korlátozva, viszont meghatározandó vagy eldöntendő a vizsgálat alapján, melybe bevonásra kerülnek.
Egy „ttetepof az egyén vagy az egyének egy esopoítjának céltudatosan ki választott jellemzője. Az állapot leírhatja az említek egyén kondícióját vagy státuszát. Állapot lehet például egy betegség, vagy egy rendellenesség, vagy egy ttereiegykttes, egy egészséges állapot, vagy egy genetikai jelleg, vagy egy lénodpox
Zr mérési eredmények „n/kárn? zer/msdfty’-a vagy „eznAiAor ö-nvo.oídtey'fo egy csoport vagy egyének egy populációja esetén az az értéktartomány, mely tipikus az egyének többségére vagy az egyének egy közös jellegben osztozó alcsoportjára, ahol az említett alcsoporthoz tartozik ez említett csoport vagy populáe-ö cmzteetefo
-pAz egyének .»z#*Áw d&poAs vagy .mmődhw dZ/npo/’W a csoport vagy populáoíö egyéneinek többségére jellemző állapot
A mérési eredmények »»norwi to?7<»«<?,yyfy’ egy csoport vagy egyének egy populációja esetén sz az értéktartomány, mely valamilyen vagy bármilyen előnyt jelent az azzal jellemzett egyenek számára a tartományon kívül eső értékekkel szemben, melyek a többi egyén esetés tipikusak.
Az egyén ^K»wé/ dBcpom” egy állagok mely valamilyen vagy bármi íven előnyt jelent az említett egyén számára a többi egyénekre jellemző egyéb állapottal szemben.
.A „s'iyrtneAmViknMibye' (SMF) egy tehétjemolekula vagy &héríemol«kttlák összessége, mely speeíüku.sim kötődik vagy kapcsolódik a sejt sejtmembránjához.
Egy „mmőráaő# mícyrííA /bőGyA vagy egy integráns mcmbtán&hérjc egy SMF, mely folyamatosan kötődik, vagy szilárdan oda van horgonyozva a sejtmembránhoz annak membrán fbszfolteidekkel kölcsönható hiötoföh doménje révén.
Egy ,jwm^ú»WKS®porteA egy integráns memfetínfebérje, mely képes anyagokat transzponálni, pl, kifelé transzponálni» vagy kilökni, vagy befelé transzportálni, akár aktív, akár passzív módon, azon s membránon keresztül, melybe integrálódva van, Az anyag lőhet pl, egy molekula vagy egy Ion.
Az ,,XŐÜ trtrrtrzportce’ kifejezés az ATP-köíö kazetta lraosz.port.er fehérjéket jelöli, mely a membrántranszportetek egy szupercsaládja, melynek tagi ni az adenozm tríioszfát t'.ATP} hidrolízisének energiáját felhasználva bizonyos biológiai folyamatokat visznek véghez, beleértve anyagok membránon át való transzportját. Az ABC transzporterek elnevezéseit és alcsaládjatt a HUGÓ Gén Nómenklatúra Bizottság iHGNC) megjelölése; szerint használjuk.
lAbbol, az. UBCG csaAf5 memhrásúraszportertó az ABC transzportotok ö siesaládjához tartoznék, mely féléranszportemkből áll, és melyek ollgommlzálödstak a fenkciéképes transzportét’ kialakításához.
Az Út használt egyes számú »,egys'» és ha a szövegkörnyezet engedi, az „a” névelők alatt többes vánt' alakok \ xí 'hetoj.it, hu A . \ wo^k'^SAe’ nn^x >p m n xove ' 4 eg ,,Αο/όΑ alatt a természetes helyzet „emberi kéz sitaf' történő mcgváltozhdását értjök. Ha egy molekula vagy egy vegyüld a természetben meginlálhrnő, akkor válik „tzofálAtá, ha az eredeti környezetét megváltoztatják, vagy onnan eltávoliiják.
Az „dB mtosíMT vagy „fmzyóáíí /egW* vagy ,,ήοΑζύηοζ·'' kifejezések magyarázatéul, ezek jelentése nem kizárólagos jellegű, és megengedi egyéb jellemzők vagy eljárási lépések, vagy összetevők hozzáadását vagy bevonását bármihez vagy bármibe, ami a felsorolt jellemzőket vagy eljárási lépéseket vagy összetevőket tana tmazza.
Az „ö/opvefőeH w/mm'M/ d/A és „lAoegééen ó/A kifejezések ügy értendők, hogy kötelező jellemzőkből» vagy eljárási lépésekből vagy összefos ókból áll, melyek valamely felsorolásban pt egy igénypontban fel vannak sorolva, de azon felül megengedett további jellemzők vagy eljárási kposek \ ,tg> OAs-tcvők jckníete méhek s5a?nemon nem betblvsscljsk .v .dapsetö jdlegeciexsegest a-·· >. k ArtémA A ο, t ö\xA > xrt\,xteteh?\ \'Λ ? \ ,eA ν' e ujvo”sk FA ν'< , > ,'/ι ΐ,ό'η * ' μ »> - . \ v. χ χ'-χ& xío ’? > . > esetv
-ίο Itelyetleshhetök a Hrt/wówi sztfenrO d/F és „dfeyegéfem t-W<m;M? 4/F kifejezésekkel, ha ex nem igényit új Anyag hozzáadását.
WMxeto GlyA: Giikoferin A mAi; mnnnldonáHa aaÜtM PMCA: Plazma meratóa kalolötu ÁTP-áx «L: miteliw SMF: sotemmtozitttehérte SSC; oldalszórás, (side scatter) áTF: adenozin. triibszizt
Igék itnmunogiobulin G,
PFA: pAmfermcldéhid,
SNP; egyodi tttödeoisd poltmodizmtrs kolngle noéteoóde polymorsfilsné') PBS: fesztát-pufferelt sóoldat («phospfiate btt Béred saltoeC)
FSC: efcwórás tbbrwrd xcatter)
ABC ΛΓΡ-Ή6 kazetta t A IP hmdmg camctfe)
AZ z^BRÁK. RÖVID LEÍRÁSA k áteo Az ABCO2 espxmztójának kvantitatív meghatátozssa a vor^x^sejt-mantoánfcaa rámmhbtcifemetdáv'Al
A frissen vsS humán vér (25u1) 1% pamtormaldehidef (FF A) tartatomé 4ml foszfát-paífterelt sóoldattal CFBS) volt hígítva és fixálva öö percen keresztül 25cC-oí5. á sejtek 3ÖÖÖ x g ló perces etmkifhgálása után az üdék ifit) ul PBS-beo lett feloldva. Az antitest-jelölés 40 percig, 3?°C'-oa történt a BXP34 (B Panel), a RXF2I |€ FanG) és az 503 (D Panel) 4BCG2-spécilikas tnottoklooálts antitestek,, illetve a megfelelő feG kontroll atfihesf felhasználásávah Az laG-tiposnak megfelelő, AkoeBüiucel (phycoemhnn, PC jelöli másodlagos Andtcsfeket. adva a -sejtekhez, Azok ŐŐ perces 3P& os inkubációja következett, reted .mosás és FB.S-ben való ájra-fefeldás. Αχ E Panel a FflO-konjugált amiAiltkoibriu A monokkmáfis anhtesitsl közvetlenül jelöli sejteket mutatja, á» en v?rex\eretek c\ & vop^setvejt v-alkovn, a? előre í>en& Goráid scatter, ΙΉ) és oldalssöofi, yo le ,%attet, SSC) pat^mAeick atepptu lettek kikaparta t,\ Fnsefl őfntdkct fiukem antitest jelöléssel történő vizsgálata megtörtént. Az InG kontroll jelölés vékony vonallal, a szellem vagy ép sejtes frakció antitest jelölése pedig vastag vonallal van ábrázolva tnindert egyes esetben,
2, ábra, Az ABGC2 exprassziéjártak változóvá vad-tipnsö, pohreorfszusast vagy mutáns dPCG? altéit hordozó egyének vörösvátsejtjeiben
A. ábra. Az ABCG2 expresszíöja vad-tlpusó (wild typc, Vélj, vagy polimorfizmust tartalmazd (Q14LK, VI2M) ABGG2 allék hordozó, vagy stop (STOP) oattációm hetemzigóta egyének esetén.
Az Ábra az adatok és konfidencia intervallumok doboz-diagrammal történő ábrázolását mutatják. Az ABCGz. expressziő az tu-ti-ABCGF rnAt-ek együttes kötőképessége alapján lett számolva, a három fdggödon antitest használatával, a specifikus kötési eredmények súlyozott átlagának számításával.
2B, ábra, Két család családfája, melyek az ABCG2 különböze korai stop mutánsait tsonáozzik ™ a cGe c? ve x! > * »cte w s Ά\, , χ -. „ <·η A családok két egészséges önkéntes tagjától akik a korai stop mutációt hordozzak (lásd 2A, ábra, nyilakkal jelölve) vérmintát véve az AÖCG2 expressmó és a kapcsolódó mutációk Gotuzóse történt.· M A.BCO',1 vörösvétzejtbeb oxpressziöját tükröző· RBC-Gü tektor értekek zárójelben vannak feltüntetve. Az ábrán látszik, hogy a két ktílönbözö X.óCGd gtop mutáció hsbroaigób ltostbzói. valamennyim szignifikánsan csőkkestt ABCG2 expmssaiős szirtteket mutatnak a vötósvérscjbtnsmbtánban. A véneidre nem etethető családtagok vzunén jelbbe vannak íRV
3. ábra, A humán vőrösvfocjtekbcn expresszáiódó humán A8CG2 fehérje, az. St9 n>varsejiekben heterológ cxpresszólódó ABCG2 és a humán K562 tumor sejtekben expresszáit A8CG2 Westem-bioí analízise
1-4. sávok: banán vösösvérscltvsembránptvparútumok. 70 ug mernhttbiehaje; 5~ó. sáv: SI9 sejtmembrán prepatátumok, 0,1 ug és 0,2 ug membránfehérie; 7-8. sáv: K5o) humán tumor .sejtekben rtebovhowd .biteseit ARCG2 (?. sáv) és kontroll K562 sejtek (§. sáv), 10 og menduátdehérje,
4. ábra. Az ABk'02 tehene vstmerlhdáns ephopiöt feiAmeró ''DJ tnonoklonáhs aootesttei méri ABCGŐ exptesstós szint korrelációja a BXP21 és BXF34 aatitesUXkel mért uzptessxlés szintek stdyozoft átlagával [(MXP34/3t.8.XP21 R2 j, A korreláció lineáris, a korrelációs koetndeos R»0,859,
A ábra. Marom kiválasztott ntembránfehérje vőrosvérsejt-membránbeli expressziója a 2. család olyan tagjainál akiknél az egyik ABCG2 alléi hteesuzigőta ftameshift nuaációt hordoz ót A jól ), ugyanazon csalod vad tipusm ^BCG2»t hordozd argpsb&i sószchasonllrva tr.'t jel). Λ családtagok generációnként G, II, 01) és vérmintánként t'l«4) vannak jelölve.
A ábra, Az ABCG2 expresszi szintjének meghatározása a vőrösvémjt-msmbránfesn fagyasztcit-olvasztob vérmintákon. Három különböző anti-ABCQ2 mönoklonáiis antitest alkalmazása történt, óA. ábra. Perifériás vésminták - fagyasztva tárolt és felolvasztott vörösvérsejtek. Az ASCG2 «agressziójának megt atvrozósa különböző specifikus monokfonális antitestek bászaálatával $$C/FSC sível, kontroli fgC c\ BXP34 kötődés a fagyasztva tárolt humán vörösvérsejteken.
&B. ábra, Az ABCG2 fehérje kimutatása a három monokkmáiis antitest: (BXRJ4, SXR2R 5X>3) alkalmazásával
7, ábra. .Az ABCG2 eapmsziós szbtjönek m^inttározása a vörósvétsejt-mvn<bmuban bgymteii-olvasziAf csontvelő mintákon. Három kálönbözö anthABOOS mrnmklonálü ameu kenik alkalnuteásm.
M. ábra. Csontvelő sspirátum minták ~ SSC/FSC nézel, kontroll ígG és SXF34 kötődés a fagyasztva tárolt humán vöAtevérsvjteken, ?B, ábra. Az ABCG2 fehérje kimutatása a bárom inonokionátis antitest (BXPJ4, BXF2I, 5 DJ) atohttszásávál.
8. ábra. Az ABCG2 ozpressziós szintjének kvantitatív meghatározása a vörösvémejt-membánbm fagyasztött-oi vssztdtí vémbtákon,
8A. ábra, az eapréssziós szintek a három mAt kötődésének átlagával leírva (adag u- SD értékek) bR, ábra .A RXV.'t kötődés k,-rreiac;ota nz atkmos utót kötődésnél meX a latunt thggetten .tutiV.kV uu testx«te'o out ιΛ«· v'.'i k' ' «· » t--pu' '<: * 'vív < s.-fcu-c-en^vs sn \ t1
-12» fe ábra. Az ABCG2 expressziós színijének kvantitatív meghatározása a vorösvérsejt-memhránhan i snkruplue-cn Három iúggotfen (tenortól al'k amedásn oíIóuíwk» mércéd harcaié \BCGd expressziót mutattak (vad típusú fifiCGl?) szarutsaő vérminták mikroplate-en szétosztva, adudén .minta háromszor. A z»At kötést tükröző átlagos fiuoreswncia értékek láthatóak a három különböző donortól származó mintákon, különböző színekkel ábrázolva.
10. ábra, Az ABCB1 kimutatása -a humán vörösvémejíekhen az M.RK16 specifikus monoklonális uíttltestfel .Frissen, vett huuw vérminta 1% PFA-val fixálva, A szellem frakció specifikus jelölése MIK fis mAt.
Ifi ábra, Az ABVBi kimutatása a humán vőrösvérsejtekösn két különböző ABC81 specifikus naoaoklonahs antitesttel. bnssen vek vérminta - fixált és mponin-permeábilizák sejtek - specifikus jelölés MRK.16 és U1C2 mAfitek M8KIÓ mAt, 11IC2 mAt
ÍX ábra. Az ABCBi kimutatása a humán vörösvérsejtekbeu két különböző AÖCB1 specifikus mmokfenáíls antitesttel Fagyasztott és felolvasztott vérminta - fixált és szaponin-pennsábílfeáh sejtek ™ speciőkus jelölés MRKlö és U1C2 mAt-teh MRK.16 mAt, U1C2 mAt
33, ábra. Az ABCB6 kimutatása a humán vörösvérsejtekbea az ABCB6 sejtfelszíni epitópját felismerő mönoklonáiis antitesttel Frissen ved humán vér 1% FFA-val fixálva; szellemek, ép sejtek
14, ábra. Az ABCC1 kimutatása a humán vörösvérsejtekhen két különböző monoklonális antitesttel (M6 egér monoklonáks amúesl Rí patkány monokionélís antitest), melyek a humán ABCC1 fehérje íntracelluláris epitőpjaihoz kspcsukktnak (fiissen ved vér, fixálás nélkül) .15, ábra, Az ABCC4 kimutatása a humán vörösvársejíekben egér monoklonális antitesttel (M4-110), mely & humán ABCC4 fehérje inhacelluláris epitópjához kapcsolódik (frissen ven vér, fixálás nélkül)
Jő,.ábra,.Az ABGÁ1 khuututásu a humán v<ühsvérsejtekb<m kát monoklonális· antitesttel <A Panelt AB7360 uyöl polikíorsálb antitest, 8 Panel: ABRI 0 egér munokloaábs antitest), melyek a humán ABCA1 fehérje intmcellulárís epitőpjaihoz kapcsolódnak (frissen vett vér, fixálás nélkül). Kontrollként, a vőrösvérsejtefcben az ABCC6 fehérje hiányát--az Mó-Il-7, ABCC6 specifikus mönoklonáiis antitesttel vizsgáltuk. A B Panel az ABHIÖ mAt ti&áiását untttója be a maximális kötödés/jelöiés elérése érdekében.
17, ábra. Az ABCC3 fehérje künnunása & humán vörösvérssitekben az Ν·Β»Π-4 snonokloiudis antitesttel, mely á humán ABCG3 fehérje íattacehuíáris epítópjához kapcsolódik tfossea vett vér, 1% FFA-ban fixálva). Színien bemutatjuk n mAt tíirálésát a maximális lötődés/jelöíés eferése «delében,
Ife ábra, A nivnhrán-kötőtt aktin kimutatása a humán vötösversejlekben TFITC-falloidm kötődés révén. Frissen vélt humán, vórsejtek fixálása 1¾ PFA-val történt. Specifikus jelőlődés csak a szellem .frakción volt tapasztalható (A Panel), szaponin hozzáadása nem változtatta meg a tailoidin kötést (C Panel). A tailoidin kötődet; telítődése inár kis mennyiségű (0,125 ul) jelölt falíoidio hozzáadását \u\etucn felrew Λ Panel- szelén ‘u Veio B Panel· ep v 'msvcscft r. o C Paud υηοο, vn permeáfeiiizált sejtek,
ÍV.áhrs» A»*»· «'Oll,'t. fel,!?vkknhuviuivi inauun vorowersvpekOvs i n.v»en\*.tt humán vérsejtek I % PFA-val. fixálva.
Specifikus WG& (uhsai germ aggtelüké búza caim aggiuímm) jelölődé? vök tapasztatható mind át szellem frakcióban (A Panel), rnlte az φ vörösvérsejt frakcióban (B Panel). a azaponin nem befolyásolta a WGA kötést (nincs hemutufeu), A WGA kötés telítődése csak nagy* mennyiségű (ő,25 ul) jelólt WGA esetén jött létre,
Panel A, szellem frakció; Panel Ik ép vörösvérsejt frakció
2Ö, ábra. A PMCA fehérje felismerése fixál, humán vörösvfeeitckben 5F1Ö ntenokionális antitesttel, mely valamennyi FMCA i/oforroat tetemed, Λ PMC.A feherje teljes (elismerése a szellem frakcióban volt megfigyelhető (kék vonal), míg az ép sej! frakcióban a fehérjék nagy része nem volt fehsjöertictó (néhány permeábilizált sejt mutat mAt kötődést - piros vonal). Az Izoópos kontrollt világoskék vonal jelöli,
21, ábra, Az 5FIÖ antitest kötődés kalibrálása és telítése. A humán vötösvérsejtek fixálását körtéén aPMCA fehérje mennyiségének meghatározása történt az SFlö monokionáUs antitesttel, mely valamennyi PMC'A izoformát felismeri. Maximális jelötődcs 0,025-0,05 ul (x ug/mf) antitest kotteentráetónái volt tapasztalható, magasabb mAt koncentrációk esetén s specifikus kötődés csökkent,
22, ábra, Az SP.IO antitest kötődés kalibrálása és telítése, A humán vötósvérsejtefe fixálásé után sxapoain permeábilizálás történt (lásd Módszerek). A PMCA fehérje mennyiségének meghatározása au 5F10 uumoklonábs antitesttel lőnénk mely xakunemoo PMC.A. Izcfentet fciíameri. Meuknálís jelölödés 0,05-0,1 »1 (x ug/rtrt) antitest kotmeoteciónál volt tapasztalaté, magasabb mAt kosctmíxáctűk esőién n speeífekus kötődés csökkent.
23« áfrrAx A FMCA4 fehérje felismerése fixált hutnán vőrősvérsejlékbcrt a )A9 monokteréte antitest által, A PM€A fehérje felismerése a szelte frakcióban volt megfigyelhető Maximális jelölődéi A25 uí ix ug'ml) antitest temeentréciőtel volt tapasztalható,. magasabb mAt konecntrácfek esetén a specifikus kötedes csökkent.
24, ábra. Az JA9 antitest kötődés kalibrálása ás telítése, A humán vörösvérseltek fixálása után szspotüti permeabillzálás történt élesd MódszerekΛ PMCA4 fehérje mennyiségének meghatározása az JA9 moooklonáte mdifesuel történt, mely a PMCA4 Izofermát ismeri fel. Maximális jelölődé? 0,25 ul (x ng/mi) antitest konceulráctömál volt tapasztalható, magasabb mAt koncentrációk esetén a specifikus kötődés csökkent.
25. ábra, Λ PMCA4b feltörje felismerése fixált hmán vörösvmajfekím a JA3 tette révén. A PMCA fehérje felismerése a szellem frakcióban vek megfigyelhető. A PMCAdb felismerés fagyasztodolvasztott vérmintákon szintén tnegfígyeihetó (8 Panel),
20, ábra. ráz A8CG2. ABC8Í te a Gllkoíőrm A expressziója a vad típusú AŐCCfe gént hordozó, vagy az AésCfeá gén stop mutációjára helermugóta családtagok vőrösvémejtjeiben, k 1 Al MM hVi Rfefel l feb 11 IX te \
A jelen találmány leit' egy gyors vizsgálati módszert néhány mikroliiec vönmotáből a humán vűrösvömjfek feldoígezástkea év előbbi minták sörösvétvejUemembrártfeltérjétnek speeíStes ligetevagy antífest-aiapu kimutatására < eloxofec;; teegzá»» i - ,vw.,uív,kk vagy a snembruute kihorgonyoáií fehérjék, elouxoseti transZinemörtut-febcrjek, és nem csupán a rnomóránboz
44Smtödő fehérjék. Az olyan fehérjék, melyeknek nincs iranszmembrán szegmense vagy dotnénje, vagy O»ő$ 8 rnetnbránba tetegrálödvíg még akkor is, ha fimkoionálisan a rambánhoz vagy jaembráíüfehárjók1láz kapcsolódnak, előnyösön nem ítteoznsfc az igényelt oltalmi körbe. Például, egy előnyös megvalósítási mőő szerint a trartszauérnbran receptorok, mini. aörfehérje kapcsok receptorok membrtmfefiéríékrtek tekintendők, de a G-fehérjék előnyösen nem, Napjainkban membráófehérto-specifik'us antitestek széles leörfeen elérhetnek a mcmhrtbtfehérplk specifikus és kvantitatív detektálására. Ráadásai, specifikusan felkstaert (Hgand) molekulák, pl. tennészefes vegyüietek vagy mesterséges pl, nuklcotld-álapú aptammk szintén elérhetőek vagy e célból célzottan létrehozhatóak,
A kvantitatív mérések céljából a fchérjeszlnt mennyiségi meghatározását megvalósíthatjuk egy mvteelbendszer febérieexpressziója alapján, vagy ismert polimorfizmus variánsok és/vagy mutánsok esetem a vörősvémcjt fehérjeszlntjmnek összehasonlításai révén. Ajánlatos a kiválasztod menteránfelferje felimszesére specifikus anfitcet gondos értékelése kontroll vizsgálatokkal, így modcUrendazerben végzett fehérleexpreeszióvnl, specifikus gátlás (pl, pepiid, feltétje epiiőp) révén, többszörös; vagy kompétitiv felismerési vizsgálatokkal.. Aa izoterma-specifikus antitestek alkalmazása még jobban kitsrfeszti a nt ödazer alkalmazhatóságának lehetőségeit, miáltal követhetjük specifikus ntembránfohétje-izofermák expresszióját,
A találmány szerint az itt leírt gyors vizsgálati módszerrel meghatározható vőrösvérsejíféfcéíjeexpmssziós szintek összefüggnek az egyén, pl. egy beteg egy állapotával vagy státuszával Jellemzően ez az állapot nem vörösvémejt-spetmfikus, otmdemeiled a vőrösvérssji-mctnbránban mért exjpiwziós szintek az egyén állapotát tükrözik. Az állapra igen sokféle lehet, pl, genetikát variáció, gemrtlkte betegség, egy sejt membránfehétje-gtegének mutációjából adódó állapotok, a gértezpresszió szednályozásának módosulása következtében kialakuló állapotok, állapotok, melyek megváltoztatják memlmtefebőrjék mtímbráncxpresszlös szintjét vagy ugyáttaxon fehérje különböző izotermáinak következtében kialakuló különböző membrán expresszié* szintek. Ily mótlon, a találmány szerint ágy goodoijuk, hogy a vömsvérsep membránjában a fehéfieexpressxió szabályozása összefügg az egyén vagy beteg állapotával akkor is, ha az állapot más szöveteket vagy testrészeket érint,
A jelen találmány alapján az egyén egyedi genetikai háttere összefüggésbe hoiduttó nte«tbráírfe.bé.tje vizsgálatokkal, E célból elvégezhető azon mutációk vagy pofirtrorfizrttusok. oteghatározásm melyek jelentőséggel bírnak előbbi fehérjék kódoló szekvenciájában. A genetikai információ alapján bloinformatikat unalhóssel javaslatot tehetünk a kiválasztott menterániéhérfe várható expresszié? szintjére a kérdéses szövetben, Azonban, ezek a becslések bizocytebtnok, és a diagnózist nem tehet csupán erre alapozni. .A leírásban bemutatjuk bizonyos meotbránfohér|ék vörösvérsejibeli exptwziója és a genetikai háttér közti összefüggés vaiiöálását.
Azon túl., hogy tükrözi egyes metnbrán.tehépék genetikai háttéréi, a vizsgálati ellátó? szintért slkaltnszhaté tuentbtánfehétje-expre?sz,iö? változások, követésére különféle betegségekben, környezeti változások következtében, a táplálkozás függvényében, vagy gyógykezelés (pl gyógyszeres) követkézmótyyeképp, A ntanbránfehetje expressziós szabályozása várhatóan módosítja annak az ezpresszióját a vőrfinvérsrttekbeo =\ ¢4 a? cvw.'wía, sztetek iaccú, áfomtükos teho.tesa (mely részben a vötÖsvérsejtek relatíve hosszú élettartamának köszönhető) lehetővé teszi a menteráufohétje expresszié bosszú távú klneftksi 'tafenzásatnak köteteset \fisd a \ cg ételek tsmeVése nem Imitáló teme.v- οόΰο a dugne-m• ihat eljárásban, a memhránfeh&jo-cxprttsarió változása gyógykezelés vagy egyéb állapotok következtében folyamatosán követhető,
A találmány szerinti, gyors vmsgákttí módszerben mennyiségtbg határozzék meg az «gyén vérmnn.pahost felen khó \etoaset\ejtek membmnfehe»'érnek e\ptew/m$ kintiét egy epttopkote ágens, pl, egy antitest közvetlett a fnembmofcbérjé? tartalmazó vörösvérseit-membmsúmz való hozzáadásával így a mmta előkészítésével kapcsolatba» a minimális követelmény, hogy az ephöp a kötő ágens számáfa hozzáférhetővé váljon. Ma az epstöp a metnhrsmfchétjc extracelluláris részén helyezkedik el, ez a követelmény teljesül Ha az epltőp egy mtoteeiluláris epitóp, a vörősvórsejt-mtsnhránt perrneábilissá kell tenni.
A jelen találmányba vőrösvérsejt-membráook. kerülnek felhasználásra, előnyösen a mérés során egész vörősvérsejtdc alkalmazása történik, nem pedig íisztltott tnemht'ánfehéjjék, mint a Westérmblot, vagy beágyazott mmiik, mint szővri-metetek esetén.
A fixálási lépés előnyös, habár néhány megvalósítási mód szerint, amikor a tnembrnufehériék és/vagy vőrősvérsojt-rrtonsbíánok károsodásának vagy bomlásának reszelve nem. áll fim», ez a lépés elhagyható. Azt tapasztaltuk, hogy egy keresztkőtö fixáló ágens e&'vagy egy aldehid fixáló sigens, előnyösen pamfonnaidehid előnyös.
Előnyösen, a száram eltávolítása és/vagy a vér sejtes elemeinek kinyerése szükséges pl centrifugába és őjra-feioidás révén. Ezáltal kizárható a szolubilis fehérjékkel történő keresztreakolö is.
Előnyős, ha egész sejtek, beleértve ép sejteket és vörtísvérsejt szellemeket, illetve szükség esetén pomteabiiizálf membránnal rendelkező sejtek kerülnek alkalmazásra. Nem szükséges a vörösvérsejtmembránokból tnamhmnpreparámmot készként, és ez a lépés elhagyható; habár néhány megvalósítási mód szerint ez b alkalrnazbalő.
A legtöbb esetheti a ver sejtes elemeinek eltávolítása nem szükséges, mível a»»ak túlnyomó többsége vörősvófseji, és ennek a lépésnek az elhagyásával az eljárás tovább egyszerűsödik.
Előnyösen, a mintához a kötő ágens akkor kerül hozzáadásra, amikor a vörösvérsejt-memfetánok, előnyösen a vörösvérsejtek, előnyösen egész sejtek sztiszpenzlóbnn vanttak, azaz. folyadék fázisba» vannak jelen.
A mlnfaelökész.ítésf módszerek, beleértve a fixálást és pemtezbilizálásí, a technika állása szerint Ismertek és le vannak írva pl. a következő könyvekben “Imamnocytochemíe&i Meihods itnd Protoeete” [Szerkesztők; Conslanee Olivér, Maria Célút Jumnr, Sorozat: Methods in Moíecalar Biolögy, Springer, Kötet Sikk (2009)} és 'Immunohistochemisny’ [Methotis Express Series, szerkesztő; Simon Renshaw, Scton Fttbiíshi.ng Ltd, Qöőöij. Amint azt a. leírásba» bemutatjuk, a mmtaelőkósxítés műszerének sneg kell felelnie a találmány szerinti gyors vizsgálati eljárás támasztotta kővetehnénynek, illetve inog kell, hogy őrizze a memhfánfehórjóket tartalmazó vörösvémjt-msmbránok mérésre kerülő mennyiségét vagy szintjét, és el kell távolítsa a lehetséges szennyeződéseket,
A kötő ágens egy előnyös megvalósítási mód szerint antitest, előnyösen rnonöklonáfis antitest. Ántiíostfmgmensek, mint az egykmeó antitest, fragmens (scEv) és a vanáhíns régiót hordozó Fah fragmens szintén használhatóak n(»«nn»rtik«i xűt^ld;. cr. kéazklvtwk <s í'ági.«v»unai.as nxxtszerevel, vagy egyéb bemutatási módszerekkel, vagy a ma iámért egyéb molekuláris fejlesztést műszerekkel
További kötő ágensek is haszmilhatöak, melyek epifópofcíd ismernek fel Például az antitestek feete-n tulajdonságai kapusán megfigyelt slepclvek felhasználásával molekulák készültek, mohok e„, adott cvlmoleknUm specifikus kötőhelyekkel rendelke.-rek <g-> eben tehénen, mely uedetiieg nem rendelkezett receptor tulajdonságokkal Megfelelő scafibld-nk, mint pl. übronektinG és a ,'uoeabn fEhérie szintén alkalmazhatóak, és az epilópot felismerő kötőhely kialakítható irányított tejfel technikával, pl. egy display módszerrel kombinálva.
A kötés detektálható pl. egy- speüskttsan a kötő ágenshez kötött jelölt', vegyület révén. Alternatív megoldásként maga a kötő ágens is jelűt ve leltet.
Egy előmos mespaloanasi mód szét int az erköphoz kötődé kom ágensek ΐοορΊ kerüümk detektálásra. Ebben az esetben pl. egy jelölt, pl konjugált másodlagos kötő ágens ípl antitest) kerülhet alkalmazásra a meinbránfehérje opitópjához való kötődés kimutatására. A másodlagos kötő ágensnek az: első kötő ágensre specifikusnak kell lennie.
A jelölés jel nyerését teszi lehetővé, mely kvani hálható, Eképpen, - korlátozás nélkül- a jelölés lehel pl. egy koojugátum, amely krornofóri vagy Duorofört (Eoereszeenx jelölést), vagy egy onzúnutíkus jelölést tartalmaz, vagy egy reesptor-ligaod pár. A jelölési módszerek elérhetőek és azokat Ismertetik pisi ‘immuuoeyíoehemieal Methods and Ptotocols (lásd fent), az “Immunoídstoehemistiy^ (lásd fent) vagy az Mmmtmolüstoehmúsiiy. Basies and Meíhods” (1,8. Buehwalow és W. Bőékor, Springer (2010)] efenü könyvek.
Egy előnyős megvalósítási mód szerint a vizsgálat, melyben a kötés és a detektálás folyadék fázisban történik, ahol a sejtek egy médiumban vannak feloldva, és mind a kötő ágens kötése, mind s jel detektálása oldatban történik, előnyösen ugyanabban a médiumban.
Egy előnyős alternatív megvalósítási mód szerint a vörösvérsejt-mentbránok, előnyösen vörösvérsejíek, a hozzáadott kötő ágenst hordozva hozzákötóönek az edény pl a eső, vagy a lemez egy lyukának felszínéhez, és a jelet ebből ez edény bői nyerjük. Egy megvalósítási mód szerint st kötés és a jel detektál vs„ ugvanibo^v e<kvt\n vne A így to\,t,ví 'seuw.OMfeM nőd ocu-t; χ \0fo mothozzáadása «tán ti minta átkerül abba az edénybe, ahol a jel leolvasásra kerül. Előnyösen, a másodlagos, lelök kötő aget-v hozzáadása a jel nyerősete vzoígrto edény beit történik.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a megfelelő kontroiiokal alkalmazunk. A kötő ágens esetében kontrollok lehetnek pl íispaeíükos kötő ágensek, mint lg molekulák, mint IgCI vagy más axpeeibkus immunglobulinok. Az analógiát követve, bit egy másik típusú kötő ágenst alkalmazunk, előnyösen egy analóg ^specifikus vart,m& lesz a kontroli,
Mktnnt'vokeni, xoritiollkeet ob.au koto üeeos A eAsev rdnto, un. A ee, ι«οΆ }<Λ'« l,Ao membránlebériét ismer tél, előnyösen amely nagy mennyiségben elterjedt és/v&gy általában jelen van a vörösvérsejt-membránban. léképpen, az ilyen memöráníehérjék kontroll membránfehérjeként fiaszuálhatónk. Példáid a vőröxvérxejl-mmnbrán íutraeeliulárís vagy exíraceliulám membráníebérjóinék vagy anti’ génjeinek kvantitatív meghatározása kontroUkisérietkönt szolgálhat. Léteznek mernbfemfehérlék, melyekről tudjuk, hogy nagy feleslegben jelen vannak a vörösvérsejtonernbránbtug és az orvosi diagnosztikában e'» ,\t, unw ι„\λ k.'vx' ' <v > ', , ,, ,,,,,,ί,ν,,χ ,,t, v, \ , e i\\' o<. daze^ éiltketOóiiok, pl a plü/ms membrán vhkefbt ,n A tehene, argünmm kotö tehenek, pl bura evm jaggiuünin kötő fehérjék a humán vőrősvérsejt-membtúnban, a vörösvérsejt-mcmbrán akdnja, amely az :I.ntmeelkűáris rnemteteíélszltrhez .kapcsolódik, pl. specifikus faíloídin. jelöléssel leterertóa vagy kontroll reteket teheneként használható.
A kötő ágenst nagy feleslegben kell a memb'-sntehctjekbez hozzáadni, hogy az epitópok ttelitődjenek. Előnyösen a telítő mennyiség egy külön \ ./'-.gto.utel kerül meghatározásra.
.Például; a kötő ágenst különböző kenusán áuekkm \igy mennybégekben adjuk hozzá a vforösvömejí-teembránhoz, és meghatározzuk a kötő ágens specifikus kötődését, A specifikus kötődés megfelelő kontroll alkalmazásával felmérhető. Például, az «specifikus kötődés alternatív kötő ágens vagy essek keveréke révén kimutatható. Ez a kötő ágens «specifikus kötő tulajdonsággal rendelkezhet, vagy kötődhet a vörösvérsejt^msmbránban jelen lévő, vagy ahhoz kötődő, vagy ahhoz kapósaiddá másik fehérjéhez. Ez utóbbi fehérje még egy nonrintegráns fehérje A lehet Előnyösen az említett másik fehérje sariutje Ismén és előnyösen nagy fölöslegben vau jelen a vőrősvéföejtekben.
Például egy áramlást citometriai vizsgálat sorsa a membránfebétjét tükröző jel jól elkülönül az «specifikus- háttánők
Egy előnyős megvalósítási mód szerint a telítés a .kötő ágens íitáálása révén kerül meghatározásra. Pókkiul, amikor a jel erősödése összefügg (előnyösen aranyban van) a kötő ágens koncentrációjával vagy mennyiségével, az epiíúpok-még nincsenek telítve. Előnyösen, a találmány szerint a membráa&bé^je és a k&tő ágens között lineáris kapcsolatot adódik. Egy bizonyos koncentráció fölött a kötő ágens aspecirikns kötésének mennyisége vagy szintje emelkedik Viszonylagos értelemben, a kötőhelyek (epítőpok vagy íwmbtápfehétje) számához {bmcenüáeioKhoz, mennyiségéhez vagy színijéhez) viszonyítva a specifikus kötés csökken.
Előnyösen, a kötő ágens kísérletesen meghatározott, a specifikus kötőhelyek telítő mennyiségének többszörösében alkalmazzuk*
Eg)'· előnyös megvalósítási mád szedőt az egyéntől kis mennyiségű vérmintát veszünk, Előnyösen, a v&mmtá mennyisége kevesebb, mini 20 ml, lő ml, 5 .ml, l ml, átlő ul, 3ÖÖ ul vagy 100 ul, Igen előnyösen, a vérminta kevesebb, mint 80 ul, 611 .ni, 50 ul, 40 ul- vagy 3Ö ul. Még- előnyösebben, á vérminta mennyisége I-5Ö ui, vagy S-30 ul, vagy 10-4Ö ul.
Alább a jelen találmányt tovább szemléhetjük a vízsgáltet módszer egyes megvalósítási módjaival és a találmány membrántohérj élvei. Emellett, példákat is szolgáltatunk a humáa vörösvémeit-teembrám bán jelenleg febsmen xnembunfehérjékre, a kapcsolódé betegségek vagy orvosi kezelésre szoruló állapotok rövid leírásával (lásd a „Példák a vörösvérseji-membránfehérjék kvmnitív mcgltatározására szakaszban) a t&láhnány alkalmazási területének szemléltetésére. Értelemszerűen, szakember köpés előbbi megvalósítási módokra változatokat találni, féltévé, ha képes eljutni az említett megvalósítási módhoz saját, általános tudása és az- adott műszaki területen a technika állása szerint ma rendelkezésre álló információ slepjárt.
Vizsgálati rendszerek a vörősvémjt-membránfehérjék kvantitatív meghatározására
A .„Yhnbv S, yv« ae^es ere, u d >' re ‘' \re ' „ *. < ,5
Yörósvémejfemembránfehérjékhez tettette Hgmd-kötődca kvantitatív meghatározása. Lényeges, hegy a rmttttobránfehéyíék nincsenek a vörüsvérsejí-metnbránbói szeparálva vagy tisztítva, sokkal inkább az esmlúeh membránban vannak jelen s vizsgálat során. Kvantitatív eredmények nyerh&röek abból a tényből adódóan, hogy a kötő ágens telítési mennyiségben kerül alkalmazásra, ami lehetővé teszi, hegy az adott membránfeherje szántával vagy mennyiségével szigorúan korreláló jelet nyerjünk. Az alkalmazás magába .foglalja az alább leírt áramlási eitometrlai és sejtes lemezes („plate) vizsgálatokat, de nem
k. oriátozódtk azokra.
Azt tapasztaltuk, hogy az áramlási dlemetriai módszer megfelelő metodológiai alapot (platformot) biztosít a ^órösvórsejt-memferánokhan a onenbr&nfehétje expresszié kvantitatív «meghatározására specifikus kötő reagensek (kötő ágens) használatával, melyek előnyősön specifikus 11 parténk (pl. természetes ligandok, aptamerek, stb.) vagy antitestek, előnyösen monokíonális antitestek. Λ kötő ágenst telítési koncentrációban alkalmazzuk, így a membrántéhérje-expresszió mennyiségi nxeghatározása minden kívánt tnemhránfehérje esetén megvalósítható. A kiválasztott kötő ágensek alkalmazásával, melyek aa adott membránfehérje izotermáit vagy variánsait ismerik fel, lehetséges élésből izotermák vagy variánsok mennyiségi meghatározása is,
A gyom ntintoelőkeszstes, a mentelelo seufixitlás alkaimuzava es az itt feltart foídolgeza-d módszerek. lehetővé teszik a membnánfehétje-gpiíöpok szelektív felismerését sz intmceílníáris vagy extrseelInláris membráníel&zínen. A vizsgálat kiterjeszthető friss perifériás vénás vagy kapilláris vérminták alkalmazására ugyanúgy, mint fagyasztva tárolt és visszaolvasztott vérmintákra. Adott fehérje speciális betegséghez vagy gyógyszerkezeléshez kapcsolódó kvantitatív vizsgálata tovább fejleszthető endogén membrátdebérjék, mint referencia kontroli egyidejű alkalmazásával. A metodológia lehetőséget biztosít a membtánfohérjék humán vörösvórsejlben való tél Ismerésének gyors és komplex diagnosztikai alkalmazására.
Értelemszerűen, szakember ismer olyan vizsgálati möílszereket, melyek hasonlóak, és az ámmlási eitometria alternatíváját jelentik, ahol egy kőtő ágens révén teljes membránok, előnyősén egész sejtek Vizsgálata történik, pl. ép sejtek vagy··· szelletnek, melyek tartalmazzák a vörősvérsejt által expresszált rne.rnbrmdehdrjét; vagy ajövőben kifejleszthetnek siyon módszereket Szett módszerek közé tartozhatnak az egyeílensejtes kvantitatív képalkotás, a ligand speeillkus mikroszkópos festés vagy más detektálási módok; máz amennyire ezek teljesítik a gyors miniaelőkcszkes követelményéi, biztosítják a kötő ágens kellőképben erős kötődését a vörösvereejt-membranfeherje egy vagy több epú.ópyabo.t, és a kötés gyors és kvantitatív deíekíálását. lehetővé téve udoít vöröcvdmejrmcmbíá.níebér|e mennyiségének vagy számának kvantitatív értékelését.
Az alábbiakban példákat mutatunk ezekre a lehetőségekre ezen diagnosztikai metotdológia kérdőn belül.
Egy lemezes vizsgálati torma, pl, egy sejtes lemezes vizsgálati reodvet további lehetséges ntetodofogmí nlapot fontot a \m\A\ersejrimcmbtutfo\n a menftm.mtehenek «xpresamótojtak kvantitatív meghatározására specifikus kötő reagens vagy ágens alkslmazáss révén, előnyösen xpeerükos bgtmdok (pl, természetes ítoaoőok, aptamerek, stb.l vagy antitestek, előnyösen mottekkma.bs antitestek révén soklyokn lemezen vagy azzal egy^ArtZt-a ':rivgékp: mudrtcA·^,. Vöky>«.s«>>í iónt, az aonntast eitometrim metodológiánál lein sajátság óé alkalmazás egyaránt felhasználható ebben a metodológiában tu
Jellemzőéit, ebben a vizsgálati formában, azt mérjük, ahogy a kötő ágens specifikusan kötődik s vf'<t\>A ersejt-membratihun jelen lét ó vórósvérsejVnten fen\n tehenéhez.
Fnzitnköíött immunológiai vizsgálati (BUSA) formák alkalmazása révén a vizsgálat érzékenysége rabvelhetö és a háttér jelentősen csökkenthető. Továbbá, ez a vizsgálati rendszer lehetőséget biztosít a kiválasztott mcnsbráalehétje nagy kapacitású dtagttosziikáiára, lehetővé téve nagy áteresztőképességű (f-lgb'throngbput, HTS) ulkalmazúsok létrehozásit.
Előnyős példaként, egy gyors, egyszerű és megbízható mikmietttezes, sejtes Otzoreszceucia-aíapű vizsgálatot fejlesztettünk ki egy zWC-tf&nszponer, előnyösen egy·· mtüiitftog transzporter kvantitatív trueglubámzására a humán vörűsvérsejtekben. A memkránfehérje expresszíós szintje a. vörősvérsejtmembránban specifikus antitestek alkalmazása fenén került meghatározásra. Az áramlási ettometrsn adatni fo a lemezleolvaső eredményei szoros összefüggést mutattak. Példánk az ABC'transzportét fehérjé.k snlitestfellsmerését meghatároztuk olyan egyének vérmintájában, akik heterozigóta rnódna komi tornz.ináotót eredményező mutációt hordoztak, és szignifikánsan alacsonyabb ABCdraaszpoper expnessziós szintet találtunk. Mivel tt vérkészítményben vörös vérsejtek száma több mint J nagyságrenddel magasabb, mást bármely fehérvérsejté, és a vorlomezkék egyszerű centrifugálási eljárással sltávohtbatónk. így a vörősvérsejtek izolálása nem szükséges jelen vizsgálatok elvégzéshez. Ennélfogva 3 vörösvérsejtmetnhrantéhérje expressztos szintje megfelelőért detektálható mtkrolemezen. tmtnunoszorhens eljárás v&gjy El,ISA vizsgálat révén. Ebben az alkalmazásban lehetséges & vörősvérsejt'rnemhránféhérjék, mint vallóét? biomarkerek expressziójának direkt meghatározása, személyre szabott diagnosztikai célra,
A következe szakaszokban példákul nutamnh ennek a plattonanak dt,tjm,'s?nktt eeiu atkaintmxáxám.
A szabadalmi bejelentés tárgya egy vörősvérsejt-mtsnbránfebétje exptesszíőx szirtijének kvantitatív meghatározása. A bejelentés magába foglalja az alább ismerteiéit rnemhránfehésje példákat, melyek orvost jelentősege exmert. de nem korhbozedik igen előnyös lehetőségként a jelen találmányban membrántranszportereket vizsgálunk. A membtántranszperterek az alábbiak közül egy vagy több csoportba sorolhatók: ATÍMuggö tmnszportoek, pl, ASC'mentbrántramzpoHcrek, ATlMtiggö ion transzporténak; gyógyszer-transzporterek; multidros>· iramzporterek; S1.C (solute carrier j típusú tmrtszporterek; membrátmaatornák.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja az ABC tnembtfenranszporterek kvantitatív snegbttiároxása a hűmért vőfeAvénejt-membránban. Az ABC tnembrántrtmszporterekröl leírtak, hogy jelen tannak a hamun \o?<ísvetxött-menibmnb.tn. de ue> terek rddtg nem vetődött fel, hegy ,vof evgtesse-Os szintjének gyors és kvantitatív meghatározása történjen. Az ABC membrántranszporté? fehérjék meg*a murán te ö^v se* ~nx 'S .„bon e ?. felni, te vnt . ,v!o ?öctp c%\/ <. <»x dug polimorfizmussal vagy mutáns variánsokkal, melyek számos sejtes transzportfunkeróhítn reszt vesznek. Kiragadott példákéin íísr»/ f.MCKfe, .CíCíA fó/CCZ; fo ,ΚΑΑΕΐ íöC'.éfoáztA/ esetén téglák, hogy számos toxikus ágens sejten belüli nteiabotizmusár befolyásolják, Ezek expressziójának meghatározásé-20 n»k predíktív értéke van daganatos megbetegedések gyógykezelésében, ADME-Tox-ban, illetve betegségek gyógyszeres kezelése kapcsán, alkalmazható potenciális hatásosság és/vagy toxieitás meghatározására. Az áBCZí ? expressziójáról leírták, hegy a hatással van a högysav tmnszporttal összefüggő állapotok, pl. a kőszvény kialakulásában. Az XSCSő membránfehóje meglxttározása s humán vörösvérsejlt».es»híáöbaa potenciális prediktiv értékkel rendelkezik ADME-Tox paramtteek terén és hematológiai betegségekben. vagy azok következményes gyógyszeres kezelésében. Az ASCC4 fAÖ?P4) memhrónfehérje expressziós szintje humán vörósvórsejl-memhránban vélhetően Összeillést mutat a hatóttnyagtraaszportíái és a cskliktte mskleottá transzporttal, illetve betegségek gyógyszeres kezelésével. Az J.DC2é/~msmbrántrans;teoner expressziós szintjének meghatározása a humán vörösvér.sírjt-merobráoban feltehetően összeíbggésl mutat a sejtekből kifelé irányuló koleszterin transzporttal. zxírartysgcsere betegségekkel vagy azok kezelésével, stmke-kal és ateroszklernzissal,.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja az ATIMnggő lenítanszpomrek kvantitatív meghatározása'a humán vörósvétsejbmembrónfean, de ógy tönik, mindmáig nem vetődött lei,, hogy szók «sxpresmójának gyors és kvantitatív meglmtárezása történjen. Ezekről a transzporterekrői tudjuk, hogy nagy feleslegben jelen vannak a humán vörősvérsejt-memhráolw. Kiragadott példaként a plazmamembrán Ah-AT .4 FAI? Át'fP/ri/, 4 7P/42j membrintmszporter, különösen az dia-alegység bizonyos izotermáinak meghatározása a humán vőrösvérsejt-membránban, és annak összefüggése a polhnorflzmos variánsokkal és mutációkkal várhatóan prediktfe értékkel bír migrénben és hematológiai betegségekben. A plazmamembrán kalcium ATPáz όΤΓΑΑΑΜ, PA/CáJMj membrántrunszporterek mogiteíározásánsk a humán vőrösvérsejbmembránban, és azok összefüggésének a polimorfizmus variánsokkal és mutációkkal, várhatóan psrsdikítv értéke var* komplex agyi és szívbetegségekben, cukorbetegségben és oxidatív Streaazhez kapcsolódó .áÜapoéokbah, hematológiai betegségekben és a férfi meddőséggel összcíöggésbart. Ezek a fehérjék potenciális standard markelekként is szolgálhatnak az eljárás validálásához.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja az SI.€ (sólate eander) típusúi transzliterek kvandtatlv meghatározása. a humán vörósvéraejl-memhránbaa. Ezekről a imnszporlemkről is tudható, hogy jelen vannak a humán vőrósvém^-membráaban,-de nincs tudomásunk ezek mmtbtánMpfessziős' szintek kvantitatív meghatározásáról vörösvérsejtentetnhránoklm. Kiragadott példaként a plazanamemkáu. glukóz tmoszportotek, a C&C/27-# ÓSIQd/-4j meghatározása a humán vörösvérsejtmembránban várhatóan pmhktlv értékkel rendelkezik pb De Vivo-szindrömában, cukorbetegség esetén a cukortmnszportban, elhízásban, oxidatív stresszben és gyógyszericezdésekhea. A pfazmamemferáa MuAvavóí trunszporter fötege vércsoport ./eáé?A, ó'/.CAi /-éj meghatározásának várhatóan predíktív értéke van maíáríarczisztericiábsn, hsmoütifcus betegségekben, vese .tubuláris acidózisban, oxidatív stresszben és gyógyszerkezelésekben. A plazmamembrán Ah-I/f/'f; ei/en/rnnszporí óVí££7-< á7.CKd/~4/ meghatározása a humán vörösvérseit-membránban várhatóan predíktív értékkel rendelkezik magas vérnyomásban, pszichiátriai betegségekben és gyógyszerkezelósekhen. Λ pla/m.mtembrm /ná.'őr és yó'íoöí fruosc/’omr/áó/e (Λ7 C / o. i 2 áh'/'D tneghatátvrósáv.3Í s humán vörösvérsejt-membránb&B várhatóan prediktiv értéke ven htperiazuiinémiás htpogllkémia és cukorbeteoség esetén, itletv#· gyógyererkezelérekbcn. Λ pia;:»»ai«ivuib»áa /.eígym· »w^rter /cnorte /XLCMÓj meghatározásának várhatóan predíktív értéke ven hágysaveredetö betegségekben, köszvény, vesekövek, cukorbetegség esetén, illetve gyógyszcrkezclésekbert Á yó?Ösvé«ejt-m.mtbráo karbonod transzporté? tehene ATC/At/-<?.. k'éá/ eéraswport áA-b?c; expresszsós szintje várhatóan prediktiv értékkel hír a fehérje meíabohzmus betegségeiben. Az Őóé.bf, 1/ ammónia transzporté? fehérje (ŐfehiG yémpporí, ŐTCd/i várhatóan szerepet játszik számos, az ammónia transzporthoz kapcsolt betegségben. A szetves anion tói Céh és szerves kation (Si,C22A) transzps-rterek expresszíója jelenleg még n-nots jót jellemezve, de ezen soembrirttfeatxszporterek meghatározásának a vőrösvétzei tökben prediku'v értéke lehet gyógyszerek és xenobiohkmnok ADME-Tox paramétereiben,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja a membrán csatornák kvantitatív meghatározása a humán vőrösvérseji-membrártban, Számos plamamembmo ionesafóma ismerten jelen van a humán vörösvérseAmmbrátrb&n, azonban jelen feltalálók nem találtak konkrét tanulmányt azok gyors, kvantitatív meghatározására előbbi membránokban, Á plammuembrán beiehsmónőnkált náttiumosatorna (KCNN4, fntennediate eonductance oalchmneetivoted potassium cbaanel protein 4, Gánáos-csatoma) kvantitatív meghatározásának várhatóan predíktlv értéke van a sejtek túlélése (zsugorodás, KC1- és vízvesztés) terén és sarlósejtes anémia kezelésében, A vóbősvérsejt-membrátt aquspormok (AQP-l, Aquapsrín CHIF, MIP, ÁQFO, Colion vércsoport, és AQF2, CiiL vdcsoport), amelyek víz és szerves ion transzportjáért felelnek számos szövetben, várhatóan, prediktív értékkel bírnak vesehetegségskhen. További, jelenleg még nem vizsgált íőhesaíoma fehéíje-kompfexck (pl. SOR. ABCCS-9 típusó ioneestomákj expresszíőjának a vörösvérsep-men-bránbari predtktív értéke lehet cokorhelegségbetr és más mrtshohkus betegségekben ugyanúgy, nuut gyógy szsr-válassneakciókban.
További előnyös lehetőségként a találmány szerint membrtmreceptorokst vizsgálnak,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja a tanszmembráa receptorok kvantitatív meghatározása a humán, vőröss-érsej t-metnbrártban. Számos pleznaímembrén-reeepíorfől ismert, hogy jelen. van. a .hamárt vörösvfezejt-membfertbun, azonban nem találtunk olyan spedfíkos umolmányt, mely azok gyors, kvantitatív meghat&ozására vonatkozna előbbi membránokban. A plazmamemhrán Immláí mof.yhör fehérjéje meghatározásának a humán vörősvérsejtekbea várhatóan prcdíkiív értéke van a diabetes kialakulása és kezelése terén, illetve ahhoz kiesőit állapotokban. A plazmamembráe őém~ odbeeerg- receptor fehérje- meghatározása a komán vöröesőrsejt-membrámbau -várhatóan prediktív értékkel bír makkia klakkolásáhen és kezelésében, allergiás reakciókban és különböző egyéb gyógykezelésekben, 'Tanulmányok kimutatják az torgfeto.ódk az Z.-/M rai/vor-ok; írtátok/ 'ttsrv< el ν,χ ♦<' 1<U fkokat a \jtv,'ot t <x vök extrás. ot ?a<
kvantitatív meghatározása várhatóan prediktív értékkel bír komplex betegségekben, mint a magas vérnyomás betegség, a cukorbetegség vagy a stoke.
A találmány egy további megvalósítási módja a jellegzetes intrscdluíám és extraeeihdáris membraníehéyjék és antigének kvmoattv megfen,uo/exs hűmen vsosv^ep-memhőmbím Vannak memhránfehétjék, melyek isoterten nagy feleslegben jelen vannak a humán vörös', érsejt-mmbobföíut, és elsösorbtto aatigenikus vagy más kötő tulajdonságaik révén jellemezve vannak az orvosi diagnosztikában, Ezek & fehérjék szintén alkalmazhatóak, előnyösen kontrollként, a jelen találmányban leirt eljárás sőréik
Kfevezefescn, a phwtamemhrátt ,4 fehérje, és általába» a /Geo ca/h? oggímőíó?
fvíhópcá megitatarozáss a humán vOrösvérsejt-nunnbránbai} referencia markerkésü szolgálhat. Hasonlók.épp, az sntraeeHoláris membrán felszínhez kötődő októs meghatározása a vörösvérsejt-menibránhan. pl. sspecsdkus fhHokhn jelölés revén, snísttéu alkalmazható referencia fehérjeként. Λ HotíZ/úí J-2 fehérjék írsegkttározásáoak várhatóan prediku'v értéke van. díabetes kialakulása és kezelése terén, a hszülis sejt adhéziós molekula (ECáM CD25P. Euófmw vámoprafe (mGnnnrz^yvon prediktiv lehet epíthelsejtes ktareinóma kialakulásában és sarlósejtes betegséghez kapcsolódó vrelzárodásokban, a CDI51 tetraspanin gllkopmleln (RAPH/MER2 vércsoport) ped-g hatással lehet sejtsdhézióxa. mctasztázis vagy tunror kialak-Vlásáta. A oasigin (CD 147, OK vércsoport fehérje) kulcs szerepet játszik a malária paraziták receptemként és különböző immunológiai funkciók modulátoraként, így ezek mennyiségi meghatározása értékes információt jelenthet különböző betegségekben. Ritka vércroport ««tígmö&et képviselő membrángi ikoproteinek (pl. Kell, Domhroek, Duffy vagy Kidd antigének) közvetlen és kvantitatív meghatározása jelentős segítséget jelenthetiá teszluzió és kapcsolódó terápiák alkalmazása során és az inteted» magzati betegségek kivédésében (részletekért .lásd Blood Group Antigén Getm Mntaiion. Database [Blumenteld OO, Patn&ik SK Ailelic genes of Wood group aniígens: a settrce of hatna» muiations and cSNPs documentcd in tbc Blood Group Antigén öw Mulatton Daíabase, Humán Motatlon, .2004 Ja»; 23(1):8-16.] és a Biood Group Antigén Gene Mutaíion Gatafease:
Egy előnyös megvalósítást mód szerint a különböző ABC fehérjék expressziős szintjének meghatározása a vőrösvérsejt-mem.bráítban specifikus mtmokionális antitestek alkalmazása révén történt. A mintákat perifériás vénából vagy kapilláris (ujjbegy) vérből, nyertük, Ugyanis irebszonyosodott, hogy egészen kicsi mennyiségű vérminta is elegendő, Valamennyi vizsgált humán ABC transzportért jól mérhető mennyiségben találtuk a vörösvéreejl-memhránban. Ezek ez eredmények arra utalnak, hogy ssőrösvérsejt-momhránban lehetséges az ABC fehérje mtpressztó direkt meghatározása, és az, mint validált blomarker használható a személyre szabott orvoslásban.
Előnyös megvalósítási mód szerint több fehérjét mérünk párhuzamosan. Egy előnyös megvalósítási mód szerint egy integráns membranféltéqót és egy kontroll fehérjét mentük párhuzamosan. Egy további előnyős megvalósítást mód szerint több integráns mmbráníehérjéi mérünk párhuzamosán, akár egyszent ^«smrma s?éíev,a»a ;e\e» tp' 'eme? tbimátvr.ú elfoavA s»oCuő V'.titutA.'w.·!, ízü'uox integráns membránfehéfiét mérünk különböző kötő ágensek révén egyazon vérmintában (pl, egész sejtes eljárási formában vagy folyadék fázisú eljárási formában, pl. egy áramlási citoruet.rlai eljárással).
A találmány egy··' különösei? előnyös megvalósítási módja egy gyors, egyszerű és megbízható áramlási eítometriai eljárás az ABC transzporterek kvantitatív meghatározására a hatná» vörös vérsejtmembránban. Meglepő módon, az eljárás szignifikáns különbséget tárt fel a vad-típusu ABC transzporter fehérje ABCG2, és annak heterozigóta (Q141K) polimorfizmus variánsának ezpresszaós szintje között. Emellett, azon egyénekaól, akik az egyik alléién az ABCG2 szintézis korai termináeióját okozó mutációt hordoznak, a fehérje expressziója 5ö%-ka! csökkent vóröavérsejtekben.
A polimorfizmusok módu-öyA· ? beteg éllnpctát, pl. rd«i.>«-0 f«imakokiöetíxai paraméterest, például az A8CG2 esetett a hágysav-metaboliznuist és daganatok terápiával szembeni rezisztet3C.iá|át.
Őrnek következtében az ABCG2 fehére expressziójáaak direkt meghatározása a vörösvérsejtmembránban értékes eszközt jelent előbbi állapotok értékelése, vagy gyógyszer-kezelések megtervezése ssorán A jelen eredmények azt mutatják, hogy a vörösvéjsejt-mentbráöfebórjék szintjei tükrözik a (genotípus-függő általános szöveti expresszit» mintákat,
A módszer egy változatában, az eljárást átdolgoztuk fagyasztva tárok vérminták vizsgálatára. Különösen, az áramlási cltemetna átdolgozása történt meg egy ABC transzportén, az. ABCG2 muítidtog transzportéi kvantitatív meghatározására fagyasztva tárolt humán, vémrintákbars. A. mintákat perifériás vérből vagy csontvelő aspirámmokből nyertük, és -20-iKFC-ou tároltuk különböző ideig (egytől őt évig). A fehérjék expressziős szintjének meghatározása a vörósvérsejt-membfánhan specifikus antitestek révén történt. Hasonlóan a fessen veti vérminta esetén látottakhoz, az expressziős szintek tekintetében smignirtkáns különbség mutatkozott a vad-típusú ABC02 fehérje és a heterozigöts Q141K polimorfizmus variáns, vagy a korai termtnácíöt eredményező mutáns között Bmélfogva, a vörösvérsejimombránfehéije expresszió gyom és megbízható kvantitatív meghatározása lehetséges fagyasztva tárolt, vérminták esetén. Bz retrospektív elemzés nwgvalósításáfa teremi lehetőségek mely hasznos betegek nyomon követése, személyre szabott diagnosztika és gyógyszerek biológiai hatásainak .becslése terén.
Tigy előnyös megvalósítást mód szerint a beíegtníntákat nlemeztttk, és azt találtuk, hogy amíg a betegek egy része egy ABC transzportét' csökkent nxpressziöiáí mutatta, sz említett ABC transzportot vörösvAzojf-membrárt expressziója szignifikánsan megemelkedett a vizsgált betegség kezelését célzó hosszé távó gyögyszems kezelést kővetően. A találmányiam foglalt eljárás alkalmas a msmbránfehérjeexpresszíó dtmmúkns, ídofilggö változásainak követésére. A vöJÖsvémojt-membfártfehérjo exprezszíőjának dimkt meghatározása, különösen az ABC-transzportsr expressztojáé, lehetőséget teremi a beteg vagy egy kezdés hosszá fává megfigyelésére, A találmány vonatkozásában a rnembránfehérjék használhatóak pl. validák hiomarkerekkéní diagnosztikai célra, ggy előnyős példa szerint a betegek hermrtológiai betegek és/vagy daganatos betegek. A membrán expressziós szint kvantitatív meglmtározásánsk módszere, különösem egy ABC-fehésje esetén, személyre szabott megközelítést tesz tehetővé a gyógyszoilttdomány terfllctéo. Igen előnyősért, egy olyan ABC transzportét kerül vizsgálattá, mely az ÁDM8Tox tulajdonságokért és győgyszer-szemötmtásért felei, Egy megvalósítási mód. szerint az ABCtrsaszportor egy muitidrog bansxporter, pl. ABCXJ2,
Egy pékkmdo eljárásban krónikus graoulomatozne knkmnta rfi.il.) diagnózisé hematológiai betegek fegs-wrinn-oivasziotr vérmintáit vizsgáltuk. Mintavétel mind a betegség kezdetem mind a daganatellenes gyégyszerkezeiés idején főném. összesen 300 vérmintát elemeztünk; és körülbelül 60 beteget tniáhrmfc ABCQ2 Q141K. heterozigöta poiimorfízmnssai, 3 beteg esetén pedig az .,d/ICöö gén Ö141.K homozigóta volt.. Az eredmények azt mutatják, hogy a Q14ÍK homozigóta betegek esetén az ABCCs.2 expressziója szignifikánsan alacsonyabb a vörösvérseít-membránban, őrig a gyógyszeres kezelés hatására nagymértékben megemelkedett az. ABCG2~expresszíó, mivel annak szintje szigniükássan felfelé reguláíódott hosszá távú ímatmlb-mezllát íGliveo) gyógyszeres kezelés következtében.
Ezek az eredmények is mulatják, hogy a vőrösvémoji-ruembuUtbrii exprcsszíós szint diagnosztikus btomarkerkéuf alkalmazható wíTívsp^y»,'
-22 További megvalósítási módok szerint » ABC feaas&porfer egy Irtinszporter, mely azt ABCA, ABCB, ÁBCC, ABCD, ABCE, ABCF vagy ABCG család fogja. A isten példában az alábbi ABC tyanszporteíok kvantmuiv megjuhiotzésa teül Iws^te: ABCB1 (MBR1), ABCCE ABCC4, ABCAi rt.Alit'C1'
Egy további megvalósítási mód szerűn egyszerre két vagy több ABC uanszporier membrán oxpressaiős szintjének meghatározása történik. Egy póklábam az .ABCGő és az ABCB1 lekérjék expmsszlós szintje kozott fordított összefüggést telálomk, ami azt sugaűjfe hogy az ABCBl expresszió felfelé regnlálmhk alacsony ABOŐŐ oxpressziós szintet mutató egyénekben
Ezen túlmenően, a phwimncnforáo Ca-ATPáz (PMCAf Iranszpocter fehérjék ineghatározása történt a bontan vörösvérsejtekben, A minták vétele ismét perifériás vénás vagy kapilláris (ujjbegy) vérttel történt, A PMCA izotermák expressztös szintjének meghatározása a vörősvérsejt-membránbaa specifikus monoklonális antitestek révén történt. Jól mérhető mennyiségeket találtunk a vörösvérsejtmembránban a FMCA trsmszporterek esetén, beleértve a PMCA4, különösen a EMCA4b izotermát. Ezek az, eredmények azt sugallják, hogy a találmányban lein ellátás lehetővé feszi a vörősvérsejt-membránban a PMCA fehérje, illetve annak izotermái esetén az expresszi kvantitatív meghatározását és így valida.lt biomarkerként szolgálhat a személyre szabott orvoslásban,
Egy megvalósítási mód szerint, vizsgálati eljárást alkalmazunk a humán vörösyórsejtekhea a membránhoz mtraeeihdárisan vagy extraceiloiáman kötődő fehérjék kvantitatív meghafározásám, A minták vétele perifériás vénás vagy·' kapilláris (ujjbegy) vérből történt. Λ vörttevémcjt-?,membránokban az Ismert mtraceltuláris és exímcelinláBs fehérjék espressziójának meghatározása specifikus Ugandok réven történt, A vörösvérsejt-memhránbaa jól mérhető mennyiségű aktin volt kimutatható annak specifikus· hgundjs, a falloidin használata révén. Ezen túlmenően, bemutatásra került az extracelhdáris lektinkotö iebórjék, különösen a búza esim agghtmh kötő fehérjék meghatározása a humán vörttev érvéitnwnbrtmban fluoreszcens búza csíra aggíttiűüu ptopsmbtnnok alkaltsnizása révön. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy előbbi vörösvérseibmemhrásfeltAjék kvantitatív meghatározása segíthet személyre szabott orvoslás eszközeként valutáit htomarkerekst nyerni és különösen, hogy ezek a megfelelő referencia v&gy kontroll fehérjeként szolgálhatnak.
Alább bizonyos konkrét és nem korlátozó példákat tüntetünk, be a teiábnány szemléltetésére.
PÉLDÁK t Félda
Az ABCG2 multklrog transzportét elsősorban a Ibonakolögiai karrierek területén, a májban, a vesében és az őssejtekben expresszálödik. Ez a. fehérje számos gyógyszer és xenobiotiknm abszorpcióját.. ' B.öte ?n usv< ,... i, „„..w ». Λ v«, kteívOéert ,> v
[.ütekiutefert iásfi Alléé. JI> és belünkéi AH Caree? Ther AAKfeO;ΑΤ'-,ί KBsho.afierthv F és
Schueíz 3D. Anno Rév Pfesrmacol Toxleol. 2006(46):381-410.; Sarkad! B és tsal Physiol Rév, 2006(56): 1179-1236; Szakács G és tstti, Dmg Dlseov Today, 2008(13):37))-393, lmot Y és ts«L Mól CancerTher. 2002(1):611-616.]. Az ABCG2 polimorfizmus variánsai vagy noasense mutánsait vizsgálva összefüggést mutattak k; az egyének közti változatosság és dagastaí-ellenes kemoterápiára adott válasz terén, psoriasis vagy sclerosls multiplex kezelésének kimenetele terén (kast Y és lsei. Mól Cancer Ther, 2002(11:611-616.; Spaxrehoom Λ és isttl. Cím Pharmaeol Tber. 2404(76):38-44,, Gardner E R és tsai. Cltn Pharmacol Thcu 2006(80):192-201Akasatea K és tsai., Cancer Ühemeíher PharmacoL 2010(66):691-698.1, A. közelmúltban az ABCG2 egyik vámosának (Q141K) koszvéanyel való szignifikáns összefüggését ifink le (Matsuo H és lsek, Sci Trated Mén, 2009(1 kárai 1.; Yang Q és tsak, Circ Cardiovase Génét. 2ÖiO(3):523-S3Ö.; Robey RW és fisai., Curr Pharm öietechnol, 2011 (12):595608.; Morisáki K és fsai Caneer Chemőther PfearmaeoL 2005(56): 161-172; Ic.fitdtt K. és tsai, Natúré Commutúcattons, Aprít 3,2012, DOk í0-1038/acommsl756].
Mivel a. tncmlsánfebérjék komplex proce'sszálást ee tratficklng folyamatokon mennek keresztül, az mRNS szint számos esetben nem követi szorosan a fehérjék végső expressziós szintiéi a vizsgáit membránban, Ezen túlmenően, a mutációk és pollmoríizmusok hibás traflRckmg folyamatot és korai degradációt enedméttyezhetaek, mely hozzájárni a Hxéne expresszit) csökkenéséhez. Mindez jól dokumentált az ABCG2-QÍ41K Variáns esetén, mély csökkent membma expressziét suttal modell sejtekben a változatlan mRNS szintek ellenére (Robey RW és tsai. Curr Pharm Btofeelmoi. 2011(3 2):595-608.; Morlsaki K és fink, Cancer C'hemother Phanaacek 2005(56):161-.172.- Fanikaw T és tsai,, Pharm Rés. 2009(26):469-47().]. Az ABCG2-Q141K. emissziójának alacsonyabb szintje még nincs bizonyítva a fiziológiás szempontból jelentősebb szövetekben, a komán szövetekből, történd mintavétel és a minta-feldolgozás nehézséget miatt. A közelmúltban két cikk is megjelent, mely a Jun vércsoportot összefüggésbe hozta az. ABCG2-vel (Saison C és fsai. Nat Génét. 2012;44:174-177,; Zelinski T és isai. Nat Génét, 20l2;44;i31-132.], Mivel & vörösvérsejt. funkcsóképes ABCG2-t tartalmaz (MaliepaardM ét? ísai, Cascer Rés. 2001(61):3458-3464.: de Wolf CJ ós tsat. Félts 3. 2007(274):439-45ö.; Leimsnis ML és George® B, 2007(354):345-350.] vizsgáltuk, vajon az ABCG2 fehérje szintje -a vörösvérsejt-menferátfean összefúgge polhnorüzmusokkal, melyek a fehérje expresaziöját ismerten befolyásolják.
Egészséges önkéntesektől származó aivadásgátoh vérminták .a .pataformaldcbiádei (PFA) történő óxnkts, G a humán \BCG2-t íehmunó monoklvuabv anttn^tel mfr jdolcst követően ámmfesi eilometriai (FACS) vizsgálatra kerüllek. Párhuzamosan, a vérmintákból izolálásra került a genomíális DNS; az AFCG2 gén. gyakori SNP-inek vizsgálata kvantitatív PCR-rel, míg a mutációk azonosítása direkt szskveittUássai történt. A vérmintákat egészséges Önkéntesektől nyertük, a vizsgálatba való bevonásba minden egyén írásos nyiknkozal révén egyezeti bele. A vizsgálatot a regionális etikai bizottságok engedélyezték; valamennyi eljárás a Helsinki Deklarációban foglaltaktod összhangban zajlott.
.d«trn/d,'í? oéWífi'fe.’
A vizsgálatban egymással rokont kapcsolatban. nem álló, egészséges önkéntesek vettek részt; akik semmilyen svőavszerec kezelést igényűt »k»t <^gy kröfek::s betegségben r.em szenvedtek. A,·, A «ί.,ΑΙΑ citometriai vizsgálatok céljából a frissen ved, BDTA-val aivadásgátoh vérminta (25 trl) !.% pamfoftnaldebőet (FF A) tartalmazó 4mi loszfát-pttttcrel? sóoklaítal (FBSt volt hígítva és fixálva 60 percen kérésről 25'\-O'v nte?d a A\ak mtnAtk erteee selok'sc foeent v em,e\ tehetőket íebxxué, speedlferc umehlernhs enhtesrekkel Mokfevtlenk ¢,0^- vusyalttrc a ktdeelwó Ft \ keoceoo'aeRfe (Ö,S-4%}< foszfát- vagy Ttis-puffér koncentrációk, fixálási időtartamok (IÖ-120 pere) és fixálási hőmérsékletek Η-ΜΎΛ hutásat, <>: azt tapasztaltak, hogy a fenő körülmények bí/tossoák az ép vörösvérsejt / szellem populáció optimális keverékét ugyanúgy, mint az antitest felismerést,
A fixálást kővetően sejtek 3000 x g 10 perces centrifugálára következek, maid az üledék 1.00 ni FBS-betv lett feloldva, Az antitest-jelölés 40 percig, 37*C-o« történt a BXP34 és a BXP21 (készítette G, Scheffer (SchetTer GL, és fsai, Cancer Kés. 20IXi(6Öt:2589-2593 i, illetve az SD3 (BD-Phurrtüngee 503167) A.8CG2-specifikus nuurcklortáus antitestek haszttálulával, valamint a megfelelő IgG kontroll antitest alkalmazásával (IgGl: Invitrogeo, MG100, Igíérca: Invltrogen, MG2AOO, IgCCh: Invitregetj, MG2BÖ0). Hozzá kell tenni, begy a BVF21 Westerc-bkrt esetén 1? alkalmazható Górd Melléklet l.A ábráján), míg a BXP34 mAt nem ismeri fel az ABCG2 fehérjéi Westetn-hlot-en, de szövetprsparáftsmokort specifikusan kötődik a fehérjéhez [Diestra 3E, és fsai, J Patkok 2002(1981:21321 fej, A vörösvérsejl-membrán PMCA jelölésére az 3Hö monoklonáiis antitestet használtuk (A&CAM, Ab2S2S), mely mind a négy humán PMCA izoformát felismert (Caríde AJ, és fsai, Bioehem ,F 1996 316 (Ft 1),353-359,]
Az elsődleges antitestek mosása után a/ IgG opusnak megfen le·, ftkrcrtd lnnél (ploeecrvtbrsrt, ‘feá !„ d! '•''x'dl ues mixd, e\G, (k k-eee* \\s Pl 1h m,>.e 02' '?< , i-r$ő
IgC}2á'PIl: Invitrogen P21139, anh-egé? igG2b-FE: Invitrogen, F21149}, azok 30 perces 37*ü-ns inkubációja történt, majd mosás és FBS-hen való újra-feloldás, Párhuzamos csövekben a sejtek közvetlenül 1 FFC-koojngált anb-ükkoform A men<4denalív amóeshet sokuk -elölve íGly-A-hTTC' Beckman Üonker, 22,12).
Az ép vörösvérsejtok és a vörösvérvejt szellemek az Bőre szórás (íotvvzrd scafter, ESC) és oldalszótás (ssde szaftét,. $50 paraméterek alapom lettek k.kzpuz<a. Mmnfet frakzto antitest felelése? vizsgálata FACSCalibur áramlást chontétettel történt (gerjesztési nt-ilóínbossz: 4S8 nm (Argon ion lézer), emissziós filterek; 583/42 ntn a Pb, 530610 a FfTC esetén). Ilyen körülmények között a vörösvérsejfekföj elférő, egyéb vérsejfek nem ábrázolódnak az, áramlási citometriai mérés során a vörösvérsejtek nagy fölöslege és az alkalmazott fixálási eljárásnak köszönhetően. Valamennyi monoklonáiis antitest esetén megtörtént a maximális antitest jelölés getfercs eptunulizdlásu. Az antitest tltrálúsái kővetően valamennyi releváns monoklonáiis antitest a maximális kötéshez szükséges mennyiséget ntsghatadö mennyiségben került alkalmazásra Emellett, ko.otrc.ll kísérletek során patkány ' οζ\·*\Χί·,ν mk v->rc „ v seA^ , ·> w \ e n G<-G -urosmv 'fx* AG tukllrck, hegy a feutnau-spretllkus ?1>3 amö-oö nem ennett fel ,sz A.BCG2 feltörtét sem ep, sem Írnak patkány vórcsx érsekekben, tűig a több? mAt nem veit ótmtún-speet fekte-.
őfefefewok
Annak érdekében. hogy az A.BCG2 vötösvémejtbek memsytségéuek meghatározása sétán valamennyi fontos uun-ABGtV» s^íímw »,»· -ntercn vcbiseul.· Ο,.^η·-». a Beme, remiiv tetotem hatékonyságok alapján egy átlagos kötést faktort számoltunk. ,A kísérletek sétán a BXF34 háromszor rmgssahh relatív jelölést mutatod, mint akár a BXP2I, akár az 5I>3 antitest (a pontos epitópok ős a mAí leölés esetleges többszörös volta nem ismert), így a számlmtl ABCG2 faktort a kővetkező egyenlet a. lapján határoztok meg:
KBXP34G) -G3XP2 t i5D3)fo, (i)
Vsunt azt a ábra mulatta, lmom Is Gmm.uuo mutatkozott az nrstaeedekros eoóöpot felfemeto tnÁl-ek, a BXP34 ás 8XF21 kötődésének súlyozott átlagai, és a sejtfelszíni kötődésű, humán specifikus 5 J>3 mAl kötődése között.
Gbnedfcm vfevmkdp
Az ABCG2 pclunorítzmusamak és ntuláetómuk tsntdroáryozásám az EDTA~val alvadásgátoh perifériás vérből DNS izolálás törtöm a Gentra Porege Bloed Kit íQuiagen, Hamburg, Németország) alkalmazásával, Az ABCG2 leggyakoribb $NP*i [VI2M (e,34G>A, p.l2Val>Met a 2. oxonon, SAP adatbázis. ÍD: rs223H37) és 0141K fc.42tOA, p,Í41öb->I,ys az ?, esonon, SNP adatbázis 1D: rs223 H42) genntipszáiása LtghtCyclerdgí? (llocbe Lhagnosttcs, Bázel, Svájc) ailéldiszkfesninálé rer-d.vzer használatával tőriétst, amint az korábban részletesen bemutatásra került p'feoher S ás tsai, Seeud j Gísstmetsterol 2007;42:726-733.), Az ABCG2 kódoló régiójának és az eaon-mtroa átmenetek (esőn ΟΙ fej Sattger szekvenálásn az Applied Biosystems 310 Geoette Aoalyzer (Life Technologies, Carlsbad, USA) használatával törlést.
bkomra Őfel.'
A barnán vörösvérsejtek és az ABCG2 fehérjéi expmssxálö Sf9 sejtek membránfehérjésnek preparálása a korábban leirt módon törtem [Özvegy C és tsai. ,1 Síel Chem. 2002:277:47930-47990.: felossz A és tsai, Biochim Ölnphys Acta, 2007; 1768:269S-2713.1. Az Á8CO2 expressziéig céljából a K5Ö2 sejtek retrovímsos trsnszdukciójs történt, amint az korábban bemondásra került [Hegedős C é$ ts&L Br ϊ Phamtaeol, 2009:1153-04. EMID; I978SÖ62}. A tnembránfehérjék elválasztása 7<S%-es kaemmlkféla SDS gélen, elektroferezis revén történt, majd a fehérjék, eleklroblottja történt FVDF membránokra (lehida K és tagi, Natúré Connrtunicatsons, ApHl 3,20.12, DOl: iÖ.K)3fefeemonn;l5őj.
Eredmények és Diszkusszió
Kidolgoztunk egy FACS-alapú eljárást az ABCG2 expressziójának vérmintákban való meghatón'?,s5Ufíi Az előre \/er,is efefetezeué- diagramon két nagyobb pptsfec:o sörtvolofeát, méh a FEA'öxák vörösvérsejteknek és a vőrösvénejomembrán „szellemeknek'’ (eleit meg (1. ábra). Az ABCO2 tnítaeelloláris epitópját felismerő antitestek a szellem frakcióhoz, kötődtek, ahol a membrán mindkét oklalnhozzáférhetőGH-Gabra) [Sehetler Gl es ts,u Curcer Rés, 2000(001,3589-75^3 t Divatra 3B ős tsai, 3 Pnlhol. 2002(193):313-219}. ezzel ellentétben. az SG3 mouokiomtlts antitest, mely az ABCG2 fehérje extracellulárts epitópját fe.sr.teri tél a PPA-fixáh sejteken is ummtotr kötődést (1D. ábra) [öxvegy-Lítozka C és tsai. ,1 Bioi Chem. 2ööb(2K3):3ööS9~26070), A mesubránnak est az orientációját igazoltak a Gbkofonn A extraeetlulám epdömát, ideivé a humán plazmssnemfean kakmsnt .AÍF-ne fefeérjX (PMC.A) felismerő antitestek is (Caride AJ és tsai. Bie-uhcni A 1996(3 lő (’ Pt 1)):353-359.),
Aratni az az 1. ábrán bemutatásra kerül, az ABCG2 fehérje mindhárom antitesttel szignifíxáns menny'secbeo kmutsunasó \,>h « \ felferc kvr«-.óh.t > .néhaié υ..« érdesmoen irháitok az antitesteket, bogi ezdtal a mannáim G-tost érrozdfe el ilyen kmuonOnyek közőst a három ^ztft-ABCG2 antitesttel összhangban levő eredményeket kaptunk, amit &z ,,VVT-G2 vagy „vörösvétsek ABC02 faktor5' fbrunöábsn fejeztünk ki.
Ezek után megltatároztztk az <\BCG2 expmsriöjának mennyiségén a vörősvérsejtekben 47 nem rokon, egészséges egyén esetén, és ugyanezen egyéneken teszteltük a kaukázusi populáció két leggyakoribb ABCG2 jxúitnorímuus variánsnak (VUM és Ql 4IK) jelöniéi ét is (lásd Imái Y és fsai. Mól Caneer Íher roi i<rib„ Spatrcb^un A ös tsm Clín khmtnacol Tlnr, 20tVHí').J$-4o„
Gatdner BR, Clin Pharmaeol The?. 20öó(áÖ); 192-201,; Akasakn .K és esni, Cancet Chemoiher Rháfmaeol. 2€H0(óö)'.691 -ó9Sj. Az expresszié tág határai között szignifikáns ABCG2 szintek kerültek detektálásra valamennyi egyén vőrösvérsejtjeihen. Az ABCG2 expressziójának változása a vörösvéraejtekben nem volt nemhez, vagy korhoz kiüthető. Azonban, sutikor a oinfák a genotípus szerint lettek esoportnsitva azt tapasztaltok, hogy azon egyének, akik ti hetetozigóta Q141K. variánst hordozták, szignifikánsan aloesosysbh ABCG2 expressziét mutattak (5,27 A 1,19), mint a homozigóta vad-típusú egyének (6.12 ,e 0,óE p-~ 0,911} (2. ábra). A vad-tiposó AfKXG-t és a V 12M variánst hordozó egyének között nem volt szigmflkáns különbség, jóllehet ezen variáns esetén a hordozók szánts alacsony volt.
Érdekes módon találtunk két egyént, akik jelentősen (kb. 50%-kai) csökkent vörnsverseji ABCG2 expressziöt matattak (2,65 a 0.29X2A. ábra). A teljes ABfXE? gén. szekvettálása tárta isi, hogy ezek az egyének korát tennmáclöf eredményező heterozigóta mutációt hordoztak (e.706C>T, R236X; és e.79l 79200111' következtében Ϊ..264ΑΧ17). Annak tisztázására, vajon v&a-e ditekf kapcsolat a hetee/mom \,<-p ev.uue as a s νόΌΟ',.ν * \BCG7 e\ps,c»,<. tA s, jm k,<, v, χονονχΆ,η seuvnö u Aop mutációt hordozó donorok családtagjaitól. Amint a 2B, ábra mutatja a csökkent vórösvérsejt ABCG2 expressziós szintek (kb. >ö%~os csökkenés} összefüggést mutatod ;s két család megfelelő mutációival. Bzek az eredmények azt matatják, hogy öirekf összefüggés van az ABCG2 variánsok és a vörösvérxejlmembrán expresszió között; és egy szokásos bi-alléliktn sxpressztós mintázat utat átkozik az XBCG2 esetést, smmt azt korábban mRNS adatok alapján már jósolták [Kohayashi D és tssti,, Drog Meíab Gispos. 2005( By.94-101.1.
Annak érdekében, hogy az ABCG2 expressziója a vörösvérseif-ínembróubttrt dokementálásm kerüljön, és, hogy összehasonlítsak az expressziós szitkokét ismert expressziós szintek esetén mért értekékkel, Westexn-blnt vizsgálatokat tegeztünk izolált vönAverceltmacmbrsnr'k, s hmnán ABCG2 fehérjét expresszáló 5f> ravarsejtekból izolált metnbránnk, év az ABCG2-1 nverexptcsazáió A431 sejtek feihnsználásávíd (Szskacs G és fsai, Grug Giscov Today. zööát 12):379-393,; Imái Y és lsei. Mól Cancer Eltér, 20ö2(l):öl b-616,i. Amint a 3. ábra mnlatja, korábbi irodalmi adatokkal össsfentebat) [Spamrboom. Λ va 5\Ο5 Cím Hurmaeol íher 2iG4f';\',?x-d4. Gcrdner FA <:- Fax Chn ITannacol liter. 200e(AB, i.02-201 , .Masaku K es tsas, t attcet Chsntufex Chamvtcei, A IvAtAM l-Mk I as ABCG2nek mind a monomer, rrtittd a dimer .tormáéi kimutatható volt a vörösvérseji-membránhan. Számos haso'dö biot, tllcuc ,v -\Bf CG FtP rCvXofeOaóun sale exprem-u ,cv.k ,,!? \BCG3 képxtsok ,m összes membránfehétje kb. -GCáf} a vöröavcravst-ntezsfeoáubeh expmsz.löjárat való összehasonlítása alapján, szánntásmok szerint s normál humán vörösvemenekben loGkAW ABCGO téhörfe kópia van jelen
Áx iiramláci eitoosesri.G vi-zj-«45«#c.t-. s-zrón 'zf.mv.cmOíl ABCG2 usétés aikaünavm smerrei alkahttoztek,t hatom 'roituMo'ulfe .auvmcet 5 HATIG, BVfB es 5BM ;u szoros ő-uzeinggosr maketska
-29 Itárom antitesttel meghatározott A.BCG2 relatív expressziós szintek között, Annak érdekében, hogy az XÖCG2 expreasziójára vonatkozóan egy átlag értékét kapjunk, a súlyozott átlagot használtuk, ahol a SBXP34 értékek bnmmdával számolniuk (lásd Módszerek). Amint az a 4. ábrán bemutatásra kerül lineáris Összefüggés volt tapasztalható a számolt ABCG2 faktor és ahttmán-speetfikus 5D3 kötés között.
Annák érdekében, hogy elemezzük a membránfehérjék relatív kvantitatív espresaziöiát, vizsgáltuk számos rneinbrán-köiöft vörösvétsejt fehérje antitest felismerését. Példák ént bemutattuk a kvantitatív expresszién mintázat összehasonlítását a PMCA kalcium pumpa fehérje, a Glikoform A fehérje, és az ABCÖ2 tehene esetén, egy családon beiül, álról a genetikai variációkat vizsgáltuk (5, ábra). Az írt kíísznált 5F10 monoklonélís antitest felismeri mind a négy PMCA izofermát, melyek ugyanazon epítópol hordozzák [lásd Caride és tsan (1996) Illetve Krishnamurthy P és Suhttetz ,1'D, .Anna Rév Phatmaeol Texicol. 2Ö0b(46):3Sl~41ö.]. Látszik, hogy «dg az ÁBCG2 expressziós mintázata sxlgmfíkáns különbségeket tpuial á hetetöZignfa stop mutáció jélénlefenek megfelelően fáz— nuutea), addta a PhdL,,A vögy a Gltkoform A ezpressziós szintek, habár némi ingadozást mutatnak, az ABCG expresszié® szántóktól független voltak.
.Az ,4fiCG2 genetikai eredményeinek tekintetében a 47 donor között 11. egyént találtunk, akik a heáemzigöta módon hordoztuk a Q141K variánst kódoló DNS szekvenciát (23,4%), és 3 egyént, akikben heteroztgófa jelleggel a V12M variáns volt jelen (2,734). Ezek az eredmények megfelelnek az -európai populációim» áltslánam leírt polimorfizmus-eloszlásnak (lásd Sarkad! B és festi. Physiol Rév. 2006(86); 1179-1236,), A nonsense mutációt, mely egy argínnj siop-ködonná történő átalakulását eredményezi a 7, exonőn fe. 706OT, p.R23őX, rsl40207606) [Akasaká K és fsai. Csncer Chemother Prtarrnaeot 2öKlí66}:6$M-698. ; Matsuo 11 és tsttt, Scí Transl Med. 20091 l);5ra 1 l.j hetetözlgőta formában találtuk meg az ' -e> családban. Bgy kb deléelót (c,?91_792deiT.r,L264.Hf'sX13), melyet nmxifegiben irt le Saison cs farx.t'. {AkasakaR óstsai Csnee? Chemother Pharmacol. 20töt66):691 -ö98.]s mely rrameshlffieí okozva, a fehérjén sz azt kővető 14 asnisosav csonkolását eredményezi, a 2-es családban találtok meg.
Összefogta Jva, kidolgoztunk egv egyszeri? és megbízható áramlási éitometri&i eljárást SZ.ABCG2 fehérje expressziöjámüí kvantitatív meghatározására a vőrösvérsejtekben, és szoros korrelációt találtunk a fehérje expresszié és az ABCG2 genotípus között. Mivel a vörösvérsejt Á.BCG2 szint tükrözi az általános szöveti expressziét; mintát, az Itt bemutatott FACS-aíapú eljárás alapját jelentheti egy membrán-fehérje alapú blomarkcr eljárásnak. Az ABCG2 espressriójának kvantitatív mérése, mely szerepet játszik az ADME-Tox tulajdonságokban és gyógyszer-éí'zéketsységben, szignifikánsan előmozdíthatja a gyógyszertan szentélyre szabott megközelítését. Folyamatban van egy vizsgálat, mely hematológiai betegekben az ABCG2 vörösvérsejtbeii expressziójának Időbeli változását követi a környezeti hatásokkal vagy gyógyszer-kezeléssel összefüggésben.
A személyre szabott orvoslás blomarker-díagnosztikai eljárások kidolgozását teszt szükségessé, melyek tükrözik az egyedi változatosságot és lehetővé teszik személyre szabod terápiás eljárások alkA s > ' v \ vvü't,’ fes u k'A » ' ιτ^ν a’sm \ ,πνΛΆ au petb, t „mA ellenére jelenleg «-%” n'x> ól5 rendeli;ezásre ,<.zA kvauutuúv meghatarozasara alkalmas, egyszerűen, megvalósítható eljárás. A humán vörösvérsejtek számos integráns membráníehcrjéf expresszálouk.
-30beleértve különböző fraszporéereket, receptorokig és membránfehérjéket, melyek igazoltan humán botot vére rekv cy*>ál t A ' 1 M ?s ve '3 \\» \Ά\0 v< x '- »1 \cu\iA'4 1\ ect KePtoteomico. 201(87):165-168.1. A vötösvGsejt-metnbnu-t széles körben nlkahnazheto bloruarker eljárássá teheti a vérminták könnyű bozzáferbetősége, és az egyszeri) és gyors» kvantitatív membránfébérje vizsgálatok.
'1 wáJíí»
Az ABCG2 fehérjéről leírták. hogy funkciókéba formában jelen vsa a vörösvérseji-rnembránbun (de Wolf Ci és tsai. Febs 3. 2Ö07(2?4);439-450.; Letmanis MI, rés Georges E Bioebem Biophyx Rés Comman. 2007(354):345-350.: Öxvegy-Uezka C és tsai. I Biot Cltem. 3008(203):26050-26070.1,
Olyan egyéneket vizsgálva, átok az ,-03002 gén pultmtrrftzmus vadasait vagy korai termináeíöjál eredményező «mutatón hordozzák, leírtak, bouy megváltozik a venobioukütnek e» ettotoxikaa ágensek teUo ge wt 1 ’vt túlmenőim ,u WG? óOf-ré eresze,gee*’ mmaVre ré<w.A. kezűit ap-cremak kimenetével, pikkelysömör vagy selenoxis multiplex kezelésével (Spaneboom A és tsai. €lin Phnrmacol Ther. 2004(76):33-44.-, Garduer ER és txai. Cint Pnarmacol Ther. 7006100):102-201.: Akaxaka IE és fsai. Cancer Cheruotfeur Phítrm&ttol. 2010(66):691 -695.; Matsuo H és tsas. $ei Trnttsl Med. 2000(l):5ml i].
Továbbá, rosszindulatú hematológiai megbetegedések eitotoxikus vagy célzott daganatellenes gyógyszerekkel való kezelése az ABCG2 expresszié növekedését eredményezte (lásd Bmrn EE étt tsai. Neopiasta 2000;! li’l2);l350-70; Caleag.no AM és tettre Br 1 Cancer 2000,08(0):1515-24). Ezek vulőszittéleg epígenetikai változásoknak köszönhetőek, melyek az ARC multidrog (ranszporterek expresszijét gyorsan indukálják. Krónikus im&tiotb kezelés kapósért leírták, hogy az ABCG2 fehérje exptesszáóját indukálja leukémia és kelen adenoksreinöma sejtekben (Szatmári .1 és tsai. J Bioi Chem. 2006; 281(33):23612-23; Tan KP és tsai. Mól Pharmacol 20lík?8(2):l75-85).
Az l. példában kidolgoztunk egy kvantitatív vizsgálatot a vörösvémest-mmthtia ABCG2 fehérjére, és bemutattuk az összeluggcst az ABCG2 transzportot expressziőja és a genetikai- variánsok között. A jelen munkában azt vizsgáltuk, vajon a vőrösvétstpt-membráa KBCG2 iehetjn expreaeziójátmk hasonló kvantitatív meghatározása megvtslősíthatő-e perifériás vér vagy csontvelő aspkittzm eredete fagyasztott vem? imákon.
.Módszereit zk mrsnbráníbhérjék áramlási cttometrúu vtzsgáiaíára egészséges önkéntesektől vagy- heutafoiögiai betegektől vett, EDTA-val nlvadásgámlt perifériás vér vagy csontvelő aspirátum mintákat -2(CC-on tároltunk több miül két (tétig, A felolvasztott vérmintákból 25 ni vér parafbrmaidebiddel (ΕΕΛ) történő Bxáfásáí követően antitest jelölés történt a humán ABCG2-Í felismerő speetfikus monoklimé lés antitestek haszrtálatával, Előzetes vteswAUo-4· '2kőre :-\<i ''hx·ok, hogy a maabtálb mAt kötés olyan komimonek ko/dt érhetőel, Iret az mmtoto kto, ideu'to 0, 1 . \zagottim adtunk a ηηοί,ΑΕ'?
•S| t
Korábbi vusgálatamkltoz hasonlóan, a vörösvörsejt-metrsbránban az ABCG2 expresszió áramlási <ο 'V ete le, tW' e LmUdrt neghut». VM? '. tv'tele áfb »P CA.xx xonA-vív m te\ A iaasznáhunk. A hamm mAt súlyozott átlagát azok maximális kötö-kstpaoitásának korábban talált aránya alapján számoltuk, miszerint a BXF34 háromszoros nrlstiv kötődési értékeket mutatott.
Párhuzamosén, a vérmintákból izolálásul kenik a gcnomiális ÖNS. és az ,-iACö? gyakori S.MFtnek vizsgálata kvantkáiv PCR-rei, min a mutációk azonosítása dtrekt szekvenáiással történt (részletes Módszerek ο 1. példán belül).
Eredmények és diszkusszió
Az alkalmazott vizsgálati körülmények között az. összes fagyasztottoivaszlotí vörősvérscjt pertrte&bilisss vált, amint az az áramlást cttomeírtai ereslntóusek előre szórásfoldalszórás ábrázolásé aUp'm iuhato v k fa p^fetúss se. c- e^evelő ma ukai !.t,-U a o tíktve «bot A álom untaké ¢,, és ezek a sejtek a vörösvérsejí-mewbráo „S2ellemek-aek felelnek meg, melyek a membrán mmdkéi oldala felől elérhetőek. Ez a nyitott membrán alakzat, melyet a mAt kötés idején a szaponin jelenléte Is biztosított, tsnten fehérje epitópckat felismerő antitestek segítségével lett igazolva. Az aníi-öiikoíortu A mAt, mely extr&celluláíiu epitópoí ismer fel. illetve mfeditárom antio\BCG2 antitest, melyek egyrészt inintcelinláns (BX.P34 és BXP21), másrészt extrseellulátás f.$fX>) epitőpvikat ismernek fel, mindegyik hasonló szinten kötődött ezen a sejtpopulációit (6S. ábra).
Amint az s. 6B és 7B ábrán bemutatásra kérik, ezeken a sejteken az snihABÜG2 arditestek esetén az ABCG2 fehérje felismerése nyilvánvaló, jól elkülöníthető a kontroll IgG háttér festödéstöi. A kvantitatív fehérje meghatározás érdekében antkest-titíáiást végezténk, hogy valamennyi alkalmazott mAt esetén maximális kötődést kapjunk. és lineáris összefüggést találtunk a három mÁBtei mért ABCG2 szintek között riüB. ábra).
Μ-,ο \λλ,\\ \Bt G? ν,\ίΛ \ve χ ,.', meg\/.,v o s ,o hír-.'oxsu t m is *ot olvasztott vőrősvérsejt-membránoko-Í. összehasonlító vizsgálatot végeztünk 47 nem-rokon, egészséges egyén mmtáin, amint az az 1. példában leírásra került. Párhuzamos kísérletekkel elvégeztük a DNS-alapó genetikát vizsgálatát az AMÍG? gén két feglcntosabb (Európában a leggyakoribb) pohmorftzmus variánsának (V12M és Q141K) (lásd Sparmboom A és tsal. C.'liti Fharruseol Ther, 2004(76):38-44.; Gardner ER és tsal. Cint Fharmacol Iher. '2006(001:192-201Akasaka & és tsat, Caneer Chemother Pharmscol. 201Ö(öő):69Í~698.t Mstsun H és tsai. Sct Trans; Med, 2009( Ikfe&l 1,1.
\;m\er a \eces><wu -VBGG2 tehene e'-ptvvzsex sont a kodein v,u;,mvek'k ti kendi összehasenlitásra (IsA, ábra), érdekes módon szignifikáns, kh. 20%-kal csökkent expressziöt találtunk szón egyéneknél, akik a heteroztgóta Q141R variánst hordozták (3,$4 -a 0,53), a vad típusú egyénekkel összehasonlítva (5,70 a- E-iR p==- 0.000014). Az előző eredményekhez hasonlóan, nem volt kimutatható különbség a vad-típusú AB\Xj2~í és a YI2M variánst hordozó egyesiek között, jóllehet az esetszám ebben az esetben aránylag alacsony volt. Az A.8CG2 expresszié és a donor életkora vagy neme közöd nem volt kimutatható szignifikáns különbség.
Ugyancsak tnegismeteitrik & vörősvéraejt-membrán ABCG2 méréseket fegyaszioti-féfelvíiszmti xe,eAot \KíG ,u k' t i-m-» - χ- „í víx«,x,^, iow?e tagjain fe-7060'Γ, F.236X- lásd h példa). Hasonlóimé friss vérmintán tapasztaltakhoz, jól üteg lehetett ,42
Irülöabózteöti a stop mutációkat bordoző donorok sEmotlibon az alacsony szinte ABÖG2 expressziét t'íássl 5£Á. ábra),
Jelenleg folyamatban lévő etek isértetek sorát- vizsgáltuk kfontkus prsnr;km';déz.us leukémia C'CLE} dispnőzisá hematológiai betegek fagyaszíott-feloivasztr>ít vérmmtáit, .M'hv.uetE mtnd a betegség Kezdetén, mind s daganatellenes gyógyszerkezelés alatt történ·. 300 vermuttá elemzése történt, és Körülbelül 60 beteget tstálmrtk ABCG2 QI41K hetem?.}guta potimorEzmtsssal, o beteg esetért pedig aa ABCG2 gért QbliK homozigóta volt. Előzetes eredmények azt mutatják, hogy a Q141K btnnozigófa betegek vörósvérsejtjei sAgnlökánsan alacsonyabb ABCG2 exptessztőf mutatnak, illetve a gyógyszerkezeiés hatására ttz ABCG2 expresszié jelentősen megnövekszik
Összefoglalva, bemutatjuk, hogy az ABCG2 multidrog. Uansz.porter expresszíos szirtije a v^rösverzejt-memhmnban megfelelően mérhető fagyasztva okolt vérminták esetén. Ezek az eredmények is? azt mutatják, hogy a vörösvórsejt ABCG2 szint diagnosztikus biomarkerként alkalmazható. illetve, ba$x >t'> smoös s, -,, dil· kát tcx. étűm!. A\.tbmevo, gj-unme c ,alkatú”-< \BC\t2 iteteov v\pi<sszm fonaoukna, foolvb vattozn^unus. Goeteseru l'z a Uerp ejtett mödvet, mellyel kvantitatív módot? meghatározható az ADME-Tox tulajdonságokért és gyógyszer-érzékenységért felelős A.BCG2 fehérje mombrártbeh szintje, utat nyit & személyre szabott tnegközclhésnek a farmakológia területén,
o. Eébfe
AzAlMAtA,@CM.^Í^).teS^Wfelhi?ÍfeteÍfevten5ezmlapásky;niötatfe ..mcgfoferofo;uysjíonfep
Az ASCG2 fehérjéről leírták, hogy funkcionális formában jelen van a vörösvérsejf-menfotürtfeau, ,felen beadvány t. példájába? kidolgoztunk egy kvttohf&nv vizsgálatot a vörtksvétvejt-meotbráo ABCG2 fehérjére, és bemutattunk az összefüggést az ABCG2 Inmszporler exprsssziője és annak genetikai variánsai közöd, A jelen munkában vizsgáltuk, hogy a vőrösvérseit-uietnbráu ABCG2 fehérje hasonló kvauthallv meghatározása .megvaloshható-e mlkroplato-alapú tluoreszcens eljárással, .Módszerek
A vörösvérsejteket artfo.AB€G2 mAbtel jelöltük, amint ttz az 1, példában leírásra kerül. A felolvasztott mintákból 25 ul vér pamfórmaldehíddei fPEA) történő fixálását kővetően antitest jelölés történt a humán ABCG2~t felismerő, specifikus mottokioaáiis antitestek slkalmxmsa révén. A jelölt mintákat au itták, fő lyuká nnkroptete-re és a finoreszeortefe értékekei VR'IOR Eooroxzceuda tniterolemezleoivasóval határoztuk meg,
Párhuzamosan, a vérmintákból izolálásra került a geoomiáhs DNS és az AC© gén gyakori SNPinck vizsgálata kvantitatív PCR-rel, míg a mutációk azonosítása dtrekt sxekveoáhbsai történt {részletes Módszerek az 1. példán beiül),
A sejtes híJSA rendszer, a kereskedelmi forrásból elérhető felőieífen elsődleges antitestek (BXP34. BXP21, 5.1)31 és peroxldáz tH$F)-konjugáh vagy alfosiikus losztatáx í APj-kofengnit a Ütőnek használatával, ntég fejlesztés alatt all. Annak érdekében, hogy elkerüljük az s\ neki* seu tooígóisst léptet pok In- tűnői bevont mutter eh pUie-e* h.cun.nttsstk, mertek lehetődé teszik δ >x uo»m\m tartós áttapadssst a ptate-hez. A háttér festödés csökkentése és a referencia festés HRP- vagy AP-konjugált G-iikoferdt A-val jelenleg folyatnatbon vtsn, annak érdekében, hogy st arakroletnez-eljárassat standardizált, kvantitatív vötösvcraejt-membián expressziós eroiáményekei nyerjüiík, .Eredmények és Dlazknaszíó
V eora'et'xh ».t> ts»u-«epm<,mb >t'prtp mmn'x η'»Άο> tzek<. t\ nx vx\ , t ,er < «κ/ ,< x$ mérhető Rnoraszeeneiát marattak (9. ábra). Mindhárom antt \BCG7 tntsnvf. rend az tníracolloláns (B\FM <7 B\P,d innal az evrateoktes feCcpnepokat tehautero ármérték, mindég»· A megfelelő szintű kötődési motelon a pbte leolvasóval, a FACS eredményeknek megfelelően. Mindhárom mün ABCG2 antitest esetén az ABCG2 fehérje felismerése nyilvánvaló, jól elkülöníthető s kontroli IgG háttér fejődéstől.
Ezzel s módszerrel ugyancsak vizsgáltuk az ABCG2-fehérje antitest-felismerését. olyan egyének vérmintái esetén, akik heterozágéta módon hordozták sz dBCGé gén korai termlnáciőját eredményező mutációi, és szignifikánsan csökkent ABCG2 expressztós szintet találtunk, A mikrolemez-ieohnológta további validásása és .fejlesztése jelenleg folyamatban vsa.
Összefoglalva, bemolshuk, hogy az ASCOz mttihdrog transzporté? expressziós szintje a vőróswsejt-meoibfenban megfelelő módon detektálható mikralcmez-eljárassal Az AÖMIő-Tox tulajdonságokért és gyógyszer-érzékenységért felelős AEQ33 fehérje kvamiratív meghatározásának ez a kiterjesztett média jelentősen előmozdíthatja a személyre szabott megközelítési a farmakológia ferhlefón,
4, példa
AfeABCM.AfOL.Üffllk^^ w ' fesrréx sU'U,'. t'> te'· ό tfeotete pöyrtii 'raiox,<\te.ra <m texok
Az &8CB1, ABCBő, ABCC1, é.s ABCC4 fehéíjékről leírták, hogy leien várnánk a vőrösvérsejtmembránb&n (Pastnl EM és mai, Blood. 200ö(10á):?9i-SÖE: Alexandra BM és tsal.. Export Rév Proteomics. 2010(2):165'iőő.; de WolíCJ és tsal„ Eefea ,1 2007(274):439-451).: Leírnám? ML és fsai., Bioehem Btophys Rés Comtxtun. 2öö7i 354):345-350.
teíÖSK-sStiÉata^
Az 1. példában kido.lgoz.tonk egy kvandí&Üv eljárást az ABCG2 fehérje exprassziöjferak f'xgalohte s s<--í , ·.>. tvmo, o.\ a> Oxso ,\next \Ft\< ten-ztv rar expressziőja és a genetikai variánsok közön. A jelen példában vizsgáltuk, hogy a vörösvérsejt-ínembráo ABC .fehérje exprasszlőjának hasonló kvartt.if.at.lv meghatározása ntegvaióshhatő-e & fent említeti ABC transzporté? fehérjék eseten Korábban az ABCAl és az ABCC3 íeS»étiéLrői nem Írlak le. hogy jelen lennének a vötősvéraejt'membránban, Így megvizsgáltok, vajon érzékeny snittest kötést eljárással ezek a fehérjék, szinten kitnnwfhatök-o vörősvérsejfekben.
Módszerek
A membránfehérjék áramlást ettotnotnaí vizsgálata céljából egészséges -Önkéntesektől származó, ncrifertás vénás veyy terdmiksí ‘tesztelte, A. A vGeumákbót 25 ut ver paraíortnaidehíddci tPR-U történő fraálasat követően etettest jelölés törtem a bemén .AB» felterjekvt teilsmero spveiftkus yisonokhmálix antitestek használatával. Előzetes vizsgálatok sorén meghatároztuk, hogy egyes esetekben «twdotáh's m.A.t kötés akkor kapható, ha az. antitest kötődésének .idején 0,1% szaponint adtunk a ísarétákhoz Ugyancsak vizsgáltuk a fagyasztott-olvasztott vérminták haszna tatának tehetőségét fenti mcmhráuíehérjék kvantitatív meghatározására.
Korábbi vizsgámúnnkhoz hasonlóan, amikor átamláai ettometrmi eljárással történt az ABCC12 expresszió kvautiataiiv meghatározása a vörősv&sejVmtzahránbau, most is ABC-fehátje specifikus rrsonokioöális antitestekéi használtunk.
Eredmények és Diszkusszió
Ϊ. Amikor az ABCDUMDRi jelenlétét vizsgáltak a sorovxctven-metrbánban két ABCB1 specifikus monoklonáiis antitestei (M'RK.16 nőd U1C2) használtunk, melyek a humán ABCB1 sejtielszmi opitópjával lépnek kapcsolatba. Mivei ezekről az. antitestekről leírták, hogy komplex epitópokkal lépnek kapcsolatba, és ez a kapcsolat nagymértékben függ & membránfehérie konformációjától vagy fixálásától, mind frissen vett, mind fagyasztott-felolv-asztoít vérmintákat használtunk, 1% FFA-han fixálva, egyes esőtekben 0,1% szopomnnal fixálva (Rt, és 12, ábra).
2. Annak érdekében, hogy trteghatározzuk az ABCB6 fehérje szituiét a hmmán vörösvérsejtokbun egyy a humán ABCB6 sejtfelszíni epitópjával kapcsolatba lépő monoklonáiis antitestet hasznáteoks BfeWO vizsgálatban a frissen vett vérsejtek 1% PfA-val voltak fixálva (13, ábra),
3. Az ABCCI kimutatásit a humán vötösvémejtektten kút monoklonáiis antitesttel tüstént (Mő egér oxmoklonális antitest, R1 patkány monoklonáiis antitest), melyek a .hnrnán ABCCI fehérje tötracellulária optlepneal lépitek kapcsolatba. A steteket frisses vett vérből nyerték, a memluinok ebben a vizsgákéban nem veitek fixálva (la, ábra).
4. Az ABCC4 kimutatása a humán vörös vernéitekben egy egér monoklonáiis antitesttel történt (ΜΑΙ-ΙΟ.?, mely a humán ABCC4 fehérje mtraeeSlulárís «piíópjávaf láp kapcsolatba. A sejteket frissen vett vérből nyert ők, s membránok nem voltak fixálva 115. ábra),
5. Az ARCAI meghatátozása a humán vörösvémejiekbcn két mutmklonáiia antitesttel törtem 116. ábra, A Panel: AB73Ó0 nyál políkloöáÜs antitest, és B Panel: AB.H.1Ö egér mortokkatelis antitest), melyek a li.mtan \BCAI kbesm mirxcC.lalaoa ep.topánul léptül CgvsokitbA \ \eueket bitest sett vérből nyertük, a membránok ebben a vízsgtUmban nem voltak fixálva (lő. ábra), Kontrollként, a vö.t'ősvóraejt-.mgmbréttbán az ABCC6 febőije .hiánya az Mő-H-2 ABCCŐ-specififete monoklooális tmíif.estf.e.1 kát kimutatva. Annak érdekeltem, hogy tcltfési kötődést kapjunk az ABH10 antitesttel elvégeztük a kötőhelyek bírálását (Ibiik ábra),
6. Az ABCC3 kimutatása a humán vmösvémeitekberi az M3-11-9 monoklonáiis antitesttel történt, mely a humán ABCC3 fehérje t«tmcefialárí,$ eplfőpjávai lep kapcsolatba. A sejteket frissen vett vérből nyertük; rs ?\> PFA-ban toltak fixálva. .kunok éidekobette bog> tehttsl k-'aödéé kapjunk az M3-1P> antitesftel elvégeztük a kötőhelyek tltrélását (17. ábra).
te példa ♦ χ r vV κν,,ί,ην ' W<teUöz,K egy 'pPW »35 ..bÓ2gjŐ>tr§Aggl«tílSaköt§J ttoskafi^
A memhránfbhé(jék áramlási cítomeirfeí vizsgálata céljából egészséges önkéntesektől származó, perifériás vénás vagy kapilláris vérmintákat használtunk, A vénnhttákból 25 ni vér pnruformaldehiddel (PFA) történő fixálását követően fluoreszcens ligand festés történt az aktin.esetén TfiíTC-jelölt falióráin, s iektsn kötő tehénék esetén Alexa 647 jelölt WöA lutszttálatával. tl^ancsak vizsgáltok a fagyasztottolvasztott minták használatának lehetőségét .fenti membránfehérjék kvantitatív meghatározására,
Eredmények és .Öhzkassoáő
A membrán-kötött aktín klurutafása a humán vősösversejtekben TRH'C-falIoidin kötés révén történt A frissen vett humán vérsejtek fixálása 1% PFA-vai történt Specifikus jelölődé» csak a szellem ftakdón. (Á Panel) volt tapasztalható, szaporán hozzáadása (C Panel) nem változtatta meg a faliokim kötési. A falióráin kötődés telítődése már kis mennyiségű (0,125 ni) jelölt falíoídin hozzáadását követően létrejött (.IS. ábra).
Egy további kísérletben az extraeellularis WGA kötő fehérjék kimutatása történt humán vőrősverseitekbea, A frissén. vett humán s érsejtek fi válása 1% PEA-val történt, Specifikus WGÁ. jelölődes volt tapasztalható mind a szellem fiukcióbun GA-k. ábra), mind az ép vörösvérsejt fiakcióban (19.8, ábra). a szaporán nem befolyásolta a WOA kötést (nincs bemutatva), A WGA kötés telítődése csak nagy mennyiségű (0,25 ni felett) jelölt WGA esetén jött létre.
A..gb^AA.WfibrM..kaÍfe^A...<VrPtiz.XPW7AÍJiienű^uttns^prtorJ§..ízp^5gnak.<fi^toásí eittoWÍagMí.i®ÜÍsói^
Á plazma membrán Ca ÁTPázok (PMCA .1-4, vagy ATP2BI-4) fontos szerepet játszanak az íntraeellnSárh kalcium koncentráció alacsony szinten torulsábnu, A humán vörösvérsejtek elsősorban két pumpa izotermát tartalmaznak, név szerint az ATP2BI-PMCÁ1 és az ATP2B4-PMCA4.
Három PMCÁ izoforma, a PMCA 1-4 a-szövetekben különböző eloszlásban van jelén, á PMCÁI minden humán szövetben jelen lévő forma. Az elégtelen működésé PMCA fehérjék kapcsán azt találták, hogy összefüggést mutatnak bizonyos állapotokkal, mint halláskárosodással vagy egyensúlyérzék, károsodásával, ügyi diszfónkeiőkkal, inferfilitással [lásd Carafnfi, E-Fáytío/ogíCö/jRevtew 71 (1); 129153. (1991); Stfohkr, fik és Zacbarias DA, /bWto/ogfenl áerien-,? SÍ (1): 2I--50. (2001); Holton, ML A: tsai. World I Bioi Chem. 2010 June 26; 1(6); 2Ö1-20S], A PMCA expressziőjának· változása összefüggést mutat egyéb betegségekkel Is, így katarakm kialakulásával, daganatos megbetegedésekkel, cukorbetegséggel, magas vérnyomás betegséggel és szívizom hipertrófiávak Előbbi betegségek súlyosságát befolyásolhatja a PMCA izo&rmák expressziójának finom változása a szövetekben (Tompéi
8.L és Shdllng Dj, Snhesll Bioéként, (2007):45:365-83. Brini M. Pfiogers Arcú. 2009\, 457(3):657-64.1. A PMCÁ4 izoforma ágy tűnik különös jelentőséggel bír a spermatogenezis folyamatában és a fehérje hiánya férfi isforriíilást eredményez íöraudcnbtn'ger T, és fsai., .1 Bioi Chetn. (2011) Mar 1 i;28ő( 10):7938-46. Epub 2010 Bee ?.? j
-36 A viszonylag állandónak gondolt FMCA-felté?je-szlnt meghatározása segíthet s. kalcium transzporté?· memtytségi megbat-ározósáhan egy általános, egyed? szinten. Ráadáséi, az izoterma.specifikus monokionáfis antitestek lehetőséget adnak a FMCA izotermák meghatározására a vörösvérsejtekhen. A PMCA fehérjék, és különösen a PMCA4 izofotma Általános szintjének kvantitatív meghatározása a humán vötősvérsejiekbendiagnosztikíti célokra alkalmazható eljárás lenne.
Módszerek
A tuesnhrá?rtcl:ésjék áramlást citometriai vizsgálata céljából egészséges Önkéntesektől származó, perifériás vénás vagy kapilláris vérmintákat használtunk. A vermlniákbóí .25 ul vér pstraformaldehiddel í'PFAi történő fixálását követően antitest jelölés törtéi?! a humán PMCA transzportereket feiisroerö specifikus monoklonális antitestek használatával. Előzetes vizsgálatok sorát? meghatároztuk, hogy egyes esetekben a maximális mAt kötés akkor kapható, ha az antitest kötődés idejét? 0,1% szaponint adtunk a mintákhoz. Ugyancsak vizsgáltuk a fagyasztott-olvasztott vémtis?ták használatának lehetőségét Fenti m«.ntbumtexc?ték kvuet'tatA •'t'eghm.mo.'ós.ua Kombh, vu^galatarnkhoz haaműoun, .műkor múmiái cifomettiai eljárás revén határoztuk meg az. ABCG2 expressz tóját a vösöavérsej tökben {lásd 1. példa), PMCA fehérje specifikus monoklonális antitesteket feasz??áltunk.
Eredmények és Diszkusszió
Ά» Az í1TF2B»PMCá fehérjék meghatározása az 5F1Ö monoklonális antitesttel
Az 5F10 monoklonális antitest valametmyi PMCA izofonnát íelisxneri (Caride AJ és Isai. Bíochem 1. (1996) 316 { Ft 1):353-359.). A PMCA egy lineáris tntraceíluláris epitóppul rendelkezik a kötődéshez, mely kötődés nagymértékben csökkenthető az cpitöpot utánzó specifikus pepiid hozzáadásával (Caride AJ és isai., 11996), lásd fent].
Vizsgálataink sorát? a Módszerek fejezetben leirt módon fixáltak a vörösvérsejseket, és KACS ínéréseket végeztünk a PMCA kvantitatív meghatározására. Azt tapasztaltuk. hogy PMCA jelölődé:? a szellem frakcióban tapasztalható (20. ábra), az SF10 rnsr alacsony koncentrációban telítésbe jutott ős nsaximáhs jeh adott (21. ábra), és a szaponin permeáhillzatás r?ero volt jelentős hatással a kvantitatív jelö-é»i eredményekre 122, óhr.ty Itt he ttem mthátott kísérletek sorsa? art tapasztaltuk, hogy a specifikus epifőp pepiid nagymértékben gátolta a vörösvéisejt-?ne???bmi?ok 5F1Ö jelötödését. Annak érdekében, hogy telítési kötődést kapjunk az 51Ί Ö antitesttel, elvégeztük az aaütesí kötés kalibrálását és a ?naxí?t?óiis jelölést eredményező körül menyek mellen végeztük a PMCA expressziős szintek kvantitatív meghatározását.
B, Az ATF2B4-PMCA.4 fehérje meghatározása 3Ά9 monoklonális antítestíel \ 3A9 monoklocafiü. antitest szeloktften a PMt '.44-u smen tói, méh a humán vörösvéncyckben o legnagyobb mennyiségben jelen lévő PMCA izoterma (Caride é.s tuti, (1996)}. A PMCA egy ii.oeáfis iutracelhdátis epslóppal rendelkezik a kötődéshez, mely kötődés nagymértékben csökkenthető az epitópot utánzó specifikus pepiid hozzáadásával ICaride ZC és tssi„ (1996), lásd fent].
Vizsgálataink során egy, a Módszerek fejezetben leírt vöfiAvérscjt fixálási ijtódszert használtunk, és PACő itiéreseket végeztünk a PMCA kvunbtstit megluiurceásám Azt tapu^Dtittik. bocs PMC -VI ielölŐdés a szellem frakcióhím « u\<> j«;oU <A ui«AÜaaii» jelt ártott (c.í. soráé es a szaponin permeábílizálás fokozta a kvantitatív jclölötiés eredményeit (24. ábra?.
C. Az, megbatáí'oz.ása JA3 monokfenáhs antitesttel
A JA3 monokionáífe antitest szelektíven a PMCAdb izotermát ismeri fds mely a legnagyobb mennyiségben jelen lóvé FMCA izofbrma a humán vötösvérsejtekhen (Caride és tani, (1996)], A FMCA4b egy lineáris intmcelhilárís epitóppal rendelkezik a kötődéshez, mely kötődés nagymértékben osökkeothetö az epltópet utánzó specifikus pepiid hozzáadásával [Caríde AJ és fsai., (1996)].
Vizsgálataink során egy, a Módszerek fejezetben lein vőrösvérsejt fixálási módszert használtunk, ős FACS méréseké· végeztünk a FMCA4b kvantitatív meghatározására. Azt tapasztaltok, hogy PMCA4b jeíöiődés a szellem frakcióban tapasztalható, a JA3 telítésbe jutott és maximális jelt adott (25. ábra). Annak érdekében, hogy telítési kötődést. kapjunk a JA3 mrdtesttel, elvégeztük az antitest kötés kalibrációját és a maximális jelölést eredményező körülmények melleit végeztük a F.MCAőb expressziós szikitek kvantitatív meghatározását.
7, példa
Az ABCG2 (BCRF, MX.R) és az, ABCBI (MDR.l) mombránfebéríékuek áramlási citometria alapó kvantitatív, párhuzamos meghatározd frissen vett perifériás vér vörüsvérsejtememb^ánjaiban szelektív monoldooáiis antitestek alkalmazása révén ·» fordított összefüggés a két ABC transzport®: expressziója között.,
Módszerek
Részletekért lásd az Γ. és 3, példát Az afeadásgálob vérminták pmformaldehiddel (FFA) történő fixálás, és barnáé A8CG2 és ABCB1 fehérjéket specifikusan felismerő monoklonális antitestekkel való jelölést követően áramlási cbometrlai (FACS) vizsgálatra kerültek. Az ép vörösvérsejtek és a vörösvársejt szellemek az élőm szórás ffbrward scatfep ESC) és oidalszórás (sídé scatter, SSC) paraméterek alapján lettek kikapuzva, Mindkét frakció antitest jelöléses vizsgálata FACSCalrbur áramlást c.íWtéfesrd történt í gerjesztési 'hullámhossz; 4§k nm (Argon ion lézer), emissziós filterek: 585/42 m a PE, 530/30 a FFÍC esetén).
Eredmények és Öisztesszlé
Ugyanazon vérmintában vizsgálva az -ABGG2 A ABCBI «agresszióját .azt lapasáfaltuk, hogy' az alacsony ABCG2 szintet mutató egyének esetén magasabb sztnren expresszálódott az ABCBI fehérje. Ez különösen az 1. példában bemutatott család tagjainál volt jelentős, akik heterozigóía jelleggel az ABCG2 stop mutációját hordozták,. Antínl azt ..a 2ö, .áhmn bemutattuk, az alacsony A.BCG2 szintet mutató családtagok esetén változatlan Glikoíórín A szinteket ménünk (lásd S. példa), de a?. ABCG2 és ABCBI expresszió lényegében fordított arányban állt egymással, A jelenség, mely 3?. alacsony ABCG2 szinteket mutató egyénekben az ABCBI fokozó regulációján alapul, részletes kivizsgálása jelenleg folyamatban van. laborunkban.
IPARI. ALKALMAZHATÓSÁG
Jelen találmány diagnosztikus eszközrendszert kínál a plamtamembrá»· fehérjék, mint blemarteefe kvantitatív meghatározására a vörösvérsejí-membránban. A találmány egyszerű, ud Idáit kvantitatív vizsgálatokból épül fel, mely révén az eljárás bármely diagnosztikai labor által megvalósítható. Ár magában fagbdja egy LA mennyiségű vérminta, feldolgozását fA a vörösvérscjtanemfebnfebétjéfe kvantitatív meghatározására, való felhasználását, nagy zft tu ú .especiftkos kapcsolatok, előnyösen antitest-alapú módszerek tévőn, Ugyanazon vérmintából párhuzamosat: /végzett DNS alapú vizsgálatok igazolhatják a tapasztalt kvantitatív fehérje expreseztós szintek genetikai hátterét. Az eljárás lehetőséget ad a membránteltétjók tág köre esetén s dírekt oxpmssziós szint személyre szabott, mennyiségi -neghatározásársí es előbbi eredményeket összeköti az. esgyeái genetikai váltoanirscsággak kórátlapotokkztb betegség stádiumokkal és következményekkel, kezelési protokollokkal, gyógyszer válaszreakciókkal vagy toxikus mellékhatásokkal.
HIVAKOZÁSOK
Akaaaká R, Kaburagi T, Yasuda 7, és tsal. lmm:ct ot itsnetional ASC02 polymorphisms ott the adverse eífeets ot'geütoob vt sáp, mese oaeents nvh m-'n-cmaP-ccd hmgeveeet sAtece, Chemether 'Atarnoo,? (2010) (éó};ö9l-é9K
Alesandre, B. M. Proteomie. minbtg oft.be rsdhlooá cell: focus on (he metohrane proteome. Export Rév Proteomics (2010) 7(2}; 163-3.
Akist: JD, Szóinkéi AH. Muitidrog resisiance and pltarmaeological proíeetionmediated by thehreasí caneer resisian.ee protein (BCRP/ABCX52} Mól Caneer Th«r, (2002) (1):427-434.
Aruonelou M. H. és tsai. Apolipoprotetn JZClusteein Is a Növel Síruotural Component of Humán Erythrocyles mxl a Blomarker of Cellnlar Stress and Seoescence PLeS ONE, (20.11} 6( 10) ©26032 1 -9 Blumenfetd OO, Pattjaik SK. Állatié genes of blood gnoup antigens; a sornce of bontan mutstions ttnei cSNPs doeumetded in the Biotxl Group Antigén Gene Mutatton Batabass, Humán Mulatton. (2004) Jao; 23(0:3-16.
Brandeoéutger f. Strettler FF, PG»íeo KO, e\r:0e V, \uo:uF.et G, Pest Η, ΆΡν,,ηγ A. WtlmGö A $'λ nch ofRMCAd sphee saran-A m hevme eptdtdymts umltis in aheted uoterm expresatou deocg fortéimnál spma matoratiom I Biot Chem. (20O) Mar í 1:236(10):7930-46. Epub (2010) Oec 27.
Btirtí M. Plasms membráné Ca(2O-ATFsise: írom a housekeeping .mnctínn to a versaüle stgnaling relé. Pftvgers Andi. (2ÖÖ9). 457(3): 657-64.
Ércnek, A., C. Hegedűs, ős tstu, Tyrosiue ktnase mlubttetv as modulátora ol'ATP bíndlng cassette mnlAdum nanapnrtem, subvtrates, ehcmosensmzers ot mc'uccry ef ,«.'uutivd multtdrng reaufmee’' l'vpert Opin DrugMetab Tcoúcol (2011) 7(5): 623-42,
Budnvalow l.B. and Bőékor W., Immtmohistoehemlslty; Basica and Methods Springer (2010)
Garatok, E Caleitun puutp of the piacom membráné, Physioiogical Reviews (1991} 71 (1): 129-133. Caride AJ. Filoíeo AG, Bnyedi A, Verrna AK, Penniston JT. Heteetion of tsoform 4 of the piasrna membráné ealcium pump in humán ítssues hy ttstng isofotm-speetEc mortnofonaí antibodies. Bsoehem J> (Í99G) May 15:316 (Ft 1):353-9.
Cartron, J. P. and C, Raknék Humán erytljroeyíe glysopfenuru; protein and gene stmeture anatyses. TmnMhs Mcd Rév ti992 j 6(2): 63-92.
Cosalis, G„ V. Gregore, és buti. Fharmaeogtmcties of ABGG2 and sdverse macüons to geftthtib. 3 Háti Carmer Irtat (200ó) 90(23): 1739-42.
ib'. WnlfT! ö'^magnek;; 1, vett de,;· 1 kAAn 1, és i»i. cGívsV uaospoö by vestcles Írom humán and mouse erythfocytes, Febs J, (2007) (274):439-450,
Pesk B, ós tani., Diabetes and erythrocyte Na-Li exchartger, A«ta Diafeetoi (2.(233) 40:9-13).
Oiestra Ili. Scheftér GL, Catala L és tsai. Frequent expressten of the sntnti-drog vesistance-assuetatcd protein 8CRP/MXR/ABCF/ABCG2 in humán tumours detectsd by the BXF-2: monodénál aotibody tn par&rnn-embedded matéria! J Fathol. (2002) (t$8):213-2!9,
Doyte, I... A., W. Yang, és teái. A moltidrug resishmce trartsporter írom humart MCF-7 bceasí caneer cetls. Proc Nad Aead Sei V S A(199$) 95(26): I $665-71).
Fiaeher, S., F. t... Lakatos, és tsai.. ATP-btrtdútgeassetteírtttrapoíter A8CG2 (BCRF) and A.BCB1 (MDR1) varisnte are nőt associated ΆΑ dtsease susceptibiüíy. átse&se phenotype respouse to modic-al therapv or naed fór stsrgeryis Hungáriái: petients with müammstoty bowel diseases. Scand 3 önsteocnterol (2007) 42(6): 720-53,
Furukwa T, Wakabayashi K. Tantora A. és tesz Major SNF (Q14IK) vartanr of humán .ABC imnsporter ABCC2 tmdergoes iysosomai and pmteasomal degradations Pharm Rés (2()09) (26):469-479.
Gnrdner EH, Bnrger B, van Schaik RH, és tsai. A^sociatjeaofenzy'ate and trarntperier geootypes with the pharmaeokmetics of intatmib. Clin Pbamtaeel Ther. /2006) ($0):192-201,
Gisvirtas, H,, F. Kra-csi. és tea! The role of ABC transpobers in drog resistanee, mstaboÜsut and toxicity. OurrDrugDeltv (2OG4) 1(1 y 27-42.
Goodman, S. R., A, Kordia. és tsai.The humánred hioodcélt proteomeand ímemetome. Exp Bioi Med (M'ayvtwxl) (2007) 232(11): 1391-40K
Uerxtándex-Hemrhxlez A és tsai., Álíerattörts in erythroeyte membráné protein compostdon m advtntsed nmt-sntaU eei! lungearscer Btood Ccils Mól Dis. (2006) 36(3):355-63
Honje, Y., K. MorisafcL és sssi, Single-msedeotide peiymotplüsm (SXF) anslysis tn the ABC halitmnsponer ABCG2 (MXR/BCB3S/ABCF)y Cancer Bioi Ther (2(732) 1(6): 696-702. fchída K. és fsai, Natúré Couanunteatiorts, April 3,2012, 1X31: lO.XöWneomnts! 756 Im&i, Y„ M. .Kakaae, és teái. C42.1 A pölymwphísm in the huntan breast eancer resistance protein gene is as&xíated with lotv expressiort of Q! 4tK protein and iow-levet drug resistance. Mól Cancer Tber (2002) 1($>; 611-6.
ifoiU, Μ., Y. Sajtó, és test. Eight. növel singie nuelerttide pelymetphtvms in ABCG2-BCRF in Jdpancse eaneerpatienfs sdudristered irinotaean, Drug Metah Fhanancokmet (2005) 1$(3): 712-7.
Jónkét·, b W„ M. Buitelaar, és tsai. The breast caueer reststance protein protecfs agaitól a major chlomphyll-derived dietary phototoxm and prefoperphyria, Pme Natl Acad $G li S A (2002) 99(24); 15649-54.
Kast, H. R., B. Goodwin, és teái. Reguládon oíntuhidrug restatance-assímiated protein 2 (ABGC2) by the noeiosr receptora pregnsne X receptor, f&mesotd X-oetis-ated receptor, atxi constiiuüvc androstarte receptor. 3 Bioi Chem (200.2) 277(4): .2.903-15,
Kohayashi D, kéri I, Hirota T. és tani. Funeíional assessment of ABCC2 (BC.RF) gene potyám:ghtMus to protein expresslon in hűtőim placenta. DmgMeíab DBpos. (.2005) (33):94-101,
Korsdo, €., I I. Smeoki, és tani, Fmtetional artalysis of SNFs varúmts of BCRP/ABCG2. Fharm Rés (2004) 2ICO): M9A0ÍA
Korea W, és tsai., Enhanced etythrocyte Na+ZíR exchange .predtets díabetic nephropathy fe pattenis wítii IDOM. Diahelolögia, (1998) Feh;41(2):201 -5;
Kn*hrs&nwrlhv F. Sehuew JD. Role of ABCG2/BCR? ín bíology aad medioine. Anna Rév Phannacol fo\icfe. (200ο) (4o>'38l-410.
emnuus ML, Geetges E aBCG2 membráné tmnsporter sn inature humán emhroeyfes is exriusiveiy bomodimcí Bioéként Fhophys Rés Contmun, (2007) (354):345-350,
Lu X és tsai. Associanon ofwrísBt. ABCG2 and ike phamuteokiuelics of epidermsl grmvth factor receptor tvrosine tónase inhibitors in caneer patients. CancwBíof Ther(2CO7) 6(3): 432-8.
MaliepaardM, Schefíbr GL, Faneyts IF, és tsai. Sübcelíuíar locahzatíonand distribuüon of tbe breast cancer reslstsnoe protein transporter la normál humán tissucs, Caneer Rés. (2001) (61 ):3458-3464,
Mary Louisa Holton, Weíguang Waag. M'ichael Fmersoa, Ludwg Neyses and Angel l, Armesilla. .Piama membnme caleium ATPase protems as növel regulators of signaí iransducdoo pathways. World J Bioi Cbem. (2010) Jnne 26; 1(6): 201-208.
Maísno H, Takada F, lebída K, és tsai. Costmon defects of ABC. 02, a high-eapaeity urste exportőr, cause gout: a fnnctíon-based genetie analysfe ín a Japanese populahoa. Sci Transí Med, (2009t (1 |:5ral 1> Miyake, K„ L. Míckiey, és tsai. Moieeular eloning of cDNAs whtofa arc highly overexpmssed in mítmankone-mí^ant eefe demmsinbioo ofhomoiogy to ABC transport geaes, Cancer Rés (1999) 59(1): 8-13.
Mízuaraí, S., N, Aözasa, és tsai. Singte nueleoíide'polymötphísms résük in ímpaíred membráné looafeífen -and reduced atpase aeiivüy in multidrug transporter ABCG2. Iát J Caneer (2004) 109(2): 238-46,
Morísaki K, Rohey R.W, Özvegy-Laczka C, és tsai. Slngk; nseleoűde polymorphisras roodify the tmasponer activity of ABCG2-, Caneer Cfeemother Pharmaeoh (20051 (56): 161-172,
Nafcanishi, T., K, Sfaiozaw, és tsai, Complex interaetíon of BCRP/ABCG2 and imstmíb in BCR-ABLexpressing cella: BCRP-medíated resisteace to imatínib is atíenuatsd by tmatiníb-mduced mduetlen of BCRP expression, fíload (2006) 188(2); 678-84.
Olivér, Consíanee; Jamer, Maria CéhaJnnaanoevtocheiaicai Meihods and Frotocois Series: Methöás ín Moleeular Biology. Springer, Vol. 588, (2069) özvegy C> Varadi A, Sarkad! B. Characterization of drugtranspört, ATP hydrolysis, and nueleoödé trapping by the humán ABCG2 multidrug transporter. Modulation of substrate speolficity by a poiat mutáljon. .1 BiolChem. (2002) 277:47980-47990.
Ozvegy-Laczka C, Laezko R, Hegedűs C, és tsai. Internettől vzifh. the 5D3 monodonal antibody is reguiated by intramoíeeular reanangsanents bút nőt by covalent dlmer rbrmatioa őr ibe humán ABCG2 muítitkng hunspoiter, JBiol Chem. (2008) (283):26059-26070, özvegy-Laezfca, CL G. Varady, és tsai, Function-dependenteonformatioiuil chaages sfthe ABCO2 multidrug transpoder rnodtfy its interneten with a monoeloaal aniihody on the -ceti sur&ee. J Bioi Chem (2005)280(6):4219-27.
-41 Özvegy··Laczka, C.s R. Laczko, és tsat, kueraclion with. the 503 monoelonal anlibody is regulsted by iahamotecular rearrangemcnts bot nőt by covalent dimsar formánon of the humán ABCG2 rouhidrug tmspcríer, J Bioi Chent (2008) 2S3(38)'. 26059-70.
Pasim KM. Kírkegaard M\ Morícnsca P, Lutz ÍRJ, Thomas AW, Maim M. írr-depthanalysásofthe membráné and cylosdle proteoroe of red blood ee.lh, Bíocd. {20061 {108):791 -001,
Ρλίπι, E Μ., B t\ Lutz, és txat. Red hbod ccP. (RBC) membráné proteumics-Pnn í. Proíeotutcs and RBCphysioiogv. J Proteomics (2010t 7313): 403-20,
Phipps-Green, A„ <L, 3. E. DoHis-Moffatt, és ts&i. A sirong roie fór the A8CG2 gene tn susceptibíihy to gout in New Zoal&nd Pacific Ishmd and Caucasian, bút nőt Maori, case and contro.1 sampíe sels, Hűm Mól Génét (3010) 19(24): 4813.9,
Pogumke, Μ., E. Hazai, és tsaí. Drog trsasport by breast carte» resistanee protein. Bxpert Opin Drog Metán Texicol (2010) 6(11); 1363-84.
Renshaw, Simon ímmtmohistochemistry,.Methods Express Series, Edited by, Soron Puhlishing Ltd, ¢2006).
Robey RW« íenaao G, Zhan Z, Bates SE. The ch&Uenge of expknfiog ABCG2 in the dinic. Curr Pharm Bicteehrrol, (201I) (12):595-608.
Rohey, R. W„ O, Polgár, és ísai, ABCG2: determhung its rolcvanee In clinicaí drog rcsistance. Cancer Metastasis Rév (2007) 26(1): 39-57.
Robey, R. W., W. Y. Medina-Perez^ estsai. Overexpressíon of the ATP-feisrdiug eassetle hdfrtmnsporier, ÁBCG2 (Mxr/öCrp/ABCPl), ín fiav^íridol-rosistant 'humán hreast cawer eeüs, Ciín Cancer Rés (2001) ?í .1): 145-52,
Ross, D, D-. X E. R'strp, és tsat, Expressicn of brosst caneer restsmnce protein in blast celís (rom patienls with acuto lenkmia, (3000) Blood 96( 1); 365-8.
Saisnn C,Helias Y, BallífBA, és tsai. Null alleies of ABCG2 encoding the breast eaneer resisíance protein defíne the new blood gronp system Junior. Nat Génét. (2012) 44:174 -177.
Sarkadi B, Komolya L, Szakács G, Yamdi A, Humán roaMidmg resistanee ABCB and ABCö iranspnrters: parücipation itt a chenmimmumty defense System. Fhysiol Rév. (2006) (86); ((79-1236, Sarkadi, B. and G, Szakács Uaderstaading ironsport through pharmacologicai barriers- -arc we (here yet? bőd Rév Drog Discov (2010) 9((1): 897-8,
Sarkad), B„ C, Özvegy -Laczka, és tsat, ABCG2 - a transporter fór alt seasons. EEBS Led (2004) 567(1); 116-20.
Scheffer öl.·, Maüepaard M. Píjnenborg AC, és tsat. Brosst eancer reslstauce protein is locaiized at the plasma membráné in mitoxantrone- and topoteoan-resi&tant ceti lises, CaacerB.es. 12000) (60):2589259.3,
Sparreboom A„ GelderMom Ifi Marsh S, és tsat, Dsűomotecan pharmacokineties in relafiun lo ABCG2 421 C> A genotype. din Pharmaeol Ther. (2004) (76):38-44,
Sprague R. S, és Inai. Reduced Expressoin of öt irt Erythrocytes of Huntans With Type 2 Dktbeies Is Associated With Intptursnent of «οΛ *R<p GcncrcEo,; ΑΠ' ReHoe Diabetes (zuttö? 65 3588-3593
-42. Strehier, LE; Zaehanas PA .Rule of siscounive splicing in generálion isorbrm diverssiy amurig piasma inernbrsrtecaldumpnrnps, Phystulogical Reviews (Tép; gi (1): 21 -5ö
Sznkscs Ci, Varadi A, Özvegy-Laczka C, Sarkad· B. The tele uf ABC dnospoxters tn drug absorphotg disiribuiinn, mefobolism, exeretion and toxieily (ADME-Tox.). Drog Diseov Today. (2003) (13):5?9-393 Szatmári, I és isai. Peroxisome proiilsrator-aciivated receptor ganuna-regnlated ABCG2 expression c* )\ Aebcn te 'unni ces.0 !, v^o\ ’Bo ΧχχηιϋΙλκΟ Ό h 8 t r 23« t2-23.
Tanaira, A., V. Guishi, és tsai. In viiro evaiuatioa nf pbotosenaitsviiy Ask reíaied, to genetic pclymorphisms eVhumán ABC bansporter ABCG2 and irűiibnion by drugs, Dnsg bfeiah Phs.nnaeokinet (2007) 22(6): 423-40.
FeTta1' A Midiét M:. rXncg) -Luozku C« és tani. Mernbmreoho esteid centek tc-odOtics ;be auorty of íhe humán ABCG2 rnusbdrng transpnrinr. Bioehtm Biophys Aeía. (2007) 1763:2698-2713.
Tempel Sí.,, Shilling DJ. Thepíastnu membrasse ealcium ATPuse and áisease. Subceil Biochem. (2007) 45:365-33.
Viuming, M, L., T S. Lagas, és ísai. Physinlogieai und pbarmasoiogie&l roles of ABCG2 í'BCRP): reeenf fnadisgs in Abcg2 knoekout nhee. Adv Prug Peliv Rév (2009) 61(1); 14-25.
Weder AJX és tsai. Lrytbmeyte Sodium-lithium Countenranspon and Biood Pressuro, Bypebernskm (200?) ci-w-m
Varé Q, Kctigsn A„ Dehghan A, és tsai. Moksple géneké ínéi intlnenee sonmt ntW lesel· .n.d their e\rjc*v tnd eo<, y\ „k e>\ w a dí.e.< s*. κ >n A\ a usukw, C - -Λ ,530,
Zetioski T, Coghlan G, tiu XQ, Reid ME. ABCG2 null alteles deíine the Jr(a-) blood grnup pbenntypo. Kát GenO, (2012)44:131-132.
Zhöu. S,, .1, D, Behuetó, és tsai, The ABC transpöriet 8crpl/ABCö2 is expressed síi a udde variety of stemedls and is a niolmdar determinnni of the síde-poptüatsun pheuniype, Nnt Med (2001) 7(9}; i02§34.
Xhon, 5., 3. 3. Morris, és isse. Bctpl gene expressíonls reptered fór normál nnntbérs of side popufetíoa stem ceiis tn rnice, and cunfers relatíve pmteetien to nútoxantrone in hentatopoieiic ceils in vivő. Frnc Kati Aead Sci B S A (2002) 99{.19); 12339-44.
Alton, S„, ¥, kong, és tsal tncrease»! expresston cf tr.e Ahcg2 tnutsponcr daruig ervthtoid mtenrarknr plnys a tele- in deeresstng celháar prou-potpio rés IX le< él· Bb od s 20* »51 i Ö5(6). 2571 -6,

Claims (11)

  1. I» I hatos \ tzs-gáh senmembtímfehópe tSMl·} o\pres\z-.p>a>al öxszetnggo állapot ettekelesere egyénben, szegyén vörősvérsejtmembránjmban lévő SMF expresszíös szintjének kvantitatív mérése útján, ahol ax SMF normál membránexpressziós tartománya a vörósversejt-mtítnbránbgn előre tnegbatározob vagy isimért, és ahol az egyén állapoté összefügg az SMF megváltozott expressziéjéval egy, & vörösvérssjtiö! «báró szövetben az egyénben, és az említett módszer magába foglalja a kővetkező lépéseket,
    - az, egyéntől vett, vörösvérsejtsket tartalmazó vérmintát biztosítunk,
    - a vérmintából vörnsvérseílAeszitnintát teziKink, ahol a vörösvérsejtmemhránbko jelenlévő SMF egy vagy több ephópja elérhetővé van téve egy vagy több epitöphoz specífíkosaa kötődni képes, SMF-kőtő ágens számára, és a vőrösvérsejt-membránokat egész sejt formájában vizsgáljuk, amely egész sejtek magukba foglalnak intakt sejteket és/vagy vörösvérsejt-szelietneket,
    - az SMF-kötő ágenst telítési mennyiségben Hozzáadjak a tesztminíához olyan körülmények között, ahol az említett SMP-köiő ágens. specifikusan kötődik a vörösvérxepnnembráigában jelenlévő SMF egy vagy több epilópjáhox, a soeeőnros kotode-, ,dk,' keltet' <e',c, detektéo,!, thol a kot oo $M'> ' ob< aven\ a te*ztm»ma vőrösvésrsejt-membránjában jelen lévő SME-her kötődik, és ahol (a) az ép vörösvérsojt-ftukcióbau a kotor események következtében vagy azok által kiváltott jelet, vagy tb) a ,<el om sero;.- vetve, tíeketőMe, ? ese-némek kot ikonéban t,m> azok ,V,ml Loéhot, jelet, vagy (a) és (b) típusú jelet j.s detektálunk ahol előnyösei? az ép vörösvérsejt frakció és a szellem vöiósvérsejt frakció el vannak különítve,
    - a detektált jelet átalakítjuk olyan értékké, amely a vőrösvérsejlek membránjában jelenlévő SMFmolekulák mennyiségével korrelál mindegyik frakcióban, ahol ezt az értéket, az SMF membránevptewt \ * ', ,', tőnek temen A,
    - az egyénben az SMF így ayert mtsnbránekpressxlós szintjG összehasonlítjuk az SMF normál memhránexpressziós szintjével a skm'SvmejimvTtMobáa, és s műméi menfmmevpmsvmis karon.tmvő vGe ok«es monyai a mmeeM ő'ltpos miének 'Ampák az egyénben, a portnál membránexpresszlőstartománytól-való eltérést a normálistól eltérő állapot jelének tekintjük az egyénben.
  2. 2. A? ’ {genypont szettntí eliéru, ahol ;v AU mtraeeUnlsrs» révéhez ketodm köpés AU Tető ágenst ts ulkA'mnmk e\ az SMF evinKeJolúto tevéhet kötődni Mpes AU'-ketö ágenst t.\ aikahnazunk Áz 1, vagy 2, igénypont szerinti eljárás, ahol az SMF normái membrunexpressziós szintjét a vörösvérsejtmembráoban az alábbi lépésekből állő eljárással határozzuk meg:
    1 1GS4MÓ427/SG
    Pl 20023$
    -44 ~ egyének egy csoportjától vagy egy populáción belül több egyéntől vett, vőrösvérsejteket tartalmazó vértmntái biz-osítíiíi.k,
    - vörösvérsejResztndntát készítünk a vérmintákból, ahol a vörösvörsejhnembránbatt jelenlévő SMF egy vagy több epítópja elérhetővé van téve az egy vagy több ephóphoz specifikusan, kötődni képes., SMF-köiö ágens számára. és a vörösvérsejí-membránokat egész sejt formájában vizsgáljuk, amely egész sejtek magukba foglalnak intakt sejteket és/vagy vörösvérsejt-szellen?eket,
    - ez SMF-kötö ágenst telítési mennyiségben hozzáadjuk a teszun írttá hoz olyan körülmények között, ahol az említett SMF-köíö ágens specifikusan kötődik a vörösvérseji-njembiúsyábau levő SMF egy vagy több epitóptához,
    - a specifikus kötődés által kelteit jelei detektáljuk, ahol a kötő molekulák kötődnek a tésztád» vörősvérsejtmemhránjában jelenlévő SMF-hez, és ahol (a) az ép vörösvécsejt-ftakcióban a kötési események következtében vagy azok által kiváltod jelet, vagy (h) a szeltem verösvómett..frakcióban a. kötési, esmények következtében vagy azok altat kiváltott jelet, vagy (a) és (b) típusú jelet ts detektálunk ahol előnyösen az. ép vörősvérsejt frakció és a szellem vörösvérsejí frakció el vannak különítve,
    - a detektált jelet átalakítjuk értékek olyan bahnazává, amely korrelál a vőrösvérsejtek membránjában jelenlévő SMf tón'tokaiak mennyhegével ntinőeyyk frakcióban, ahol az értékek halmazé? az egyénekben .ez SMl'-men?bmne\pressz*o» vintvk halmazának' tekintjük, » a mertibráoexptvssztóa szintek, halmazának elemzésével és kívánt esetben. a membtúaexpressziós szinteket normális állapotú és nem mmnálís állapotú, a osoportban vagy a több egyén között, előnyösen egy vagy több független .módszer vagy vizsgálat tévőn - azonosított egyének értékeivel összehasonlítva egy normál membránexpressziós ftmomáüyt definiálunk, amely a normális állapotot jelzi az: egyének populációjában.
  3. 4, A 3, igénypont szerinti eljárás, ahol az SMF expressziójával összefüggő állapot az említeti egyénben az alábbiak alkotta csoportból választolt; genetikát variációk, genetikai betegségek, az SMF-gén mutációja következtében kialakuló állapotok, az SMF-gén expresszié» szabályozásának változása következtében kialakuló állapotok, előnyösen az említeti SMF fokozó reguláéiba vagy csökkentő regulációja, vagy olyan állapotok, melyek az em'drett SMF aumtbránexpresszíós színijét megváltoztatják, vagy különböző izotermáknak köszönhető különböző snesnbráttexpmssziús szültek.
  4. 5, Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a jelet
    - egyetlen részecske detektálása vagy egy sejtes detektálás révén nyerjük, előnyösen átutalási eitomynuj M.'\gálat tévés, és ahol meghatározzuk azon sejtek számát, amelyek a mmribrátjukhstn-az SMF-et hordozzák, vagy ~ ahol a jelel egy olyan vizsgálati eljárás révét* nyerjük, amelyben páhuzamos mintákat kezelünk különálló edényekben, előnyösen egy lemez, formátumú vizsgálati eljárás során, és a jel mennyiségét határozzuk meg, előnyöse?; egy murumoszorbens vizsgálati eljárásba??.
    1508424 642?/$«
    FI200249 *4·5 *
    Ö, Az 1-5, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vörösvérsejt tesztndaía készítése sorén
    - fixálást alkalmazunk és/vagy
    - peroicarékmktst afeat’OMzcnk tmahul a soromét vettek legalább ego tesztnek ηαηηΐ^ημ permettbifzáli, ann lehetővé teszi az SMF-kötö ágens feíraeelhnárfe kötődését, és ,d\d y'í ,to op s-roo,erveg-baKciObí'tt a Lom-n ese'ocuvok kosetkeGCixn \age vok-o spíx'ftkus» vagy azok által kiváltott jelet, és (b) a szellem vörösvénejt frakcióban a kötési események következtében vagy azokra specifikus vagy azok éltei ki váltod jelet is detektáltuk
  5. 7, Az í-ő, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az SMF membránba integrált tehene., vagy egy specifikusan membréoknlött fehérje, antely az alábbi csoportból választott:
    - sejttuetubrén-fmoszporter fehérjék ÍSMÍF), amelyek magukba foglalnak ABC membráottanszpmWfet, \ip öl,gye -on- víg1, I mmkk„l s mtttvpert eteket, „\ohr,o onrt.eC' VSIO 'tpiteu traoszportsreket és membráncsttfomákat,
    - membrán receptorok,
    -nteutbrén fehétjék, melyek enzsmatlkus szerepet töltenek'be,
    - membrán fehétjék, melyek sejtes vagy’ molekuláris kölcsönhatásokban vesznek reszt.
  6. 8, M ető'feí sgéopoetok bmntelysU sccrstm ehetox ,dtol ez e tánrc Ivposeu több alkalomról megismételjük, és ezáltal az egyén állapodd monitorozzuk, előnyösen az egyén állapotában, az időben vagy bármely hatásra bekövetkező bármely változást mouhorozunk,
  7. 9, Sejtmembrátrfehétje“kbtő (SMF-kötö) ágens, előnyösen antitest slkakoazása, amely ,specifikusan kötődik a vörösvérsejt-mcmhfánban jelem lévő SMF egy vagy több epltőpjához, a vizsgáit SMF -.vpR^síto u, I ov'.xfiggo ,. Ibpo, et.^kekoe s, n *.gy<.5'>e <- u s oo-o nten bn nbon k-o ? expressztős szintjének kvantitatív mérése révén az említett egyénben, ahol az SMF tipikus vagy normál vagy szabályos membáaezpresszlős tartománya & vörősvéréelt-membránban előre meghatározott vagy ismert, és
    J.oí a XRWCxjíA eges< se-ok, a.ueo Cxtvz s^.ge\ '.xumklvt topóinak m„fe: „emko ov mgo vörösvérsejt-szeílemekeí, ahol az egyén állapota összefügg az SMF megváltozott expressziéjával egy, a v&röevérseluől eltérő szövetheti az egyénben.
    Hl, Á 9. igénypont szerinti SMF-köiő ágens alkalmazása az 1-8 igénypontok szerinti eljárásban,
  8. 11. Rendszer, egyénben vizsgált sejtmembráníeitérje (SMF) expresszíójával összefüggő állapot értékelésére az egyén vőrösvérsejt-membránjaiben jelen levő SMF expmssziós szintjének kvantitatív toérésével, ahol az SMF tipikus vagy normál vagy szabályos membrénexpresszlós tartománya a vörösvérsejt-ntentbránban előre mégha tározóit vagy ismert, és a rendszer a következőket tartólmazz&s
    - eszköz egyénből nyert vérmintából készített vörősvérsejt-tesztminta vötösvérsenjeiuek vörösvérsejtotetnbrtutjábau jelen lévő SMF egy vagy több epltőpjához specifikusan kötődő SMF-kötő ágens által kiváltott jel nyeréséte, ahol a vörösvérsejőrtotrtbráobím jelenlévő SMF egy vagy több epiíópja elérhetővé van téve egy vagy több epitóphoz. specifikusan kötődni képes, SMF-kötő ágens számára rmábal az SMF-köt» < ucens képes specifikusan kötődni egy vagy több ephópboz, ha a koto mokkalak kötődnek a tes/hnmts vofe'oersep-mvmhmmubaty’clcn levő SkH'-hoo,
    1 1ÖS42-JŐ427/SG
    01200239 ~4ό ~ ahol a rendszer fel van. szereivé egy számítógéppel, mely progoonozva van
    - a jelek elemzésére,
    - a nyert jel átalakítására egy olyan értékké, mely a vörösvérsejtek membránjában jelen lévé SMFmo'ek,.. ae mén set.es/ ho.teak thel az e' nnt erük a<r 8\u jn.'mro e\pu-e os ^zurKuek tekinthető.
    - ?' epe Kö ./ NVk ifv mert menőn», rexpres-»? < s \,<η p γΛ > s\„'J\*<.rí nmn a un, sse sejtsvemhm.no>'.1. u? SMi epikus v agy n«ainni vem smte.o. 0\ ' névén ánevp'.esszvas 'aromám >o al, és a normál membránexptesszíós tartománytól való eltérés hiányának a normális állapot jeleként történő értékelésére az egyénben egy, 3 vörösvérsejttöl eltérő szövetben, a «orrnál membránexpressztos tartománytól való eltérésnek a normálistól eltérd állapot jeleként történő értékelésére az egyénben egy, a vörösvérsejttöl eltérő szövettón, ahol az egyén állapota összefügg az SMF megváltozott expressziójáv&l az egyénben,
  9. 12, A 11, igénypont xeeurJt rendszer,, ahol a módszer
    - számítógép Koméiba alsn állésejtanalizálo eszköz, előnyösen egy áramlási «ítotnetrlai eszköz, ahol a jel nyerem re szolgáló eszköz detektor, előnyösen egy Ílnorszcens detektor, vagy’
    - egy lenteclsolvase i,pk»<e reader'’) egy számítógép kontrollja alatt, ahol a jel nyerésére szolgáló eszköz, detektor, e.< njosert egy üV/VIS detektor, ós/vagy a rendszer része továbbá, előnyösen reagenskészlet (kit) formájában, a kővetkező esopenhöl választott egy vagy' több elem:
    - SMF-kőto ágens, mely képes specifikusan kötődni a vörösvérsejt-membránhtm jelen lévő SMF egy vagy' több epkoptához,
    - esköz vöröst ersegekei tan almnzö vermnía ·> ételéhez t.z emontok ~ eszköz a vérmintától vörösvérsejt-lesztminta készítéséhez, ahol a vőrösvérs^t-tnembránbaa Jetet lévő SMF egy vagy több epitöpis elérhetővé van téve egy vagy több eptlöphoz, specifikusait kötődni képes SMF-kőto ágens számára,
    - eszközök egy egyénből nyert vérmintából készített vörősvérsejt teszimlnta feldolgozására, előnyösen a mérési feltételek biztosítására
    1 a Az 1 igénypontok bármely Ae s/enntt ebams, ahol 0 báty egv .AtH'-tmnszpo^e’- leltétje
  10. 14, A 94 Ö. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a SMF egy ABC -tnmszporter fehérje.
  11. 15. Az 11-12. igénypontok bármelyike szerinti rendszer, ahol a SMF egy ABC-trsnszporter fehérje.
HU1200239A 2012-04-20 2012-04-20 A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei HU230341B1 (hu)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1200239A HU230341B1 (hu) 2012-04-20 2012-04-20 A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei
PCT/HU2013/000034 WO2013156806A2 (en) 2012-04-20 2013-04-22 Quantitative biomarkers in the erythrocyte membrane
US14/395,524 US9465038B2 (en) 2012-04-20 2013-04-22 Quantitative determination of biomarkers in the erythrocyte membrane
EP13766655.8A EP2839293B1 (en) 2012-04-20 2013-04-22 Quantitative determination of biomarkers in the erythrocyte cell membrane

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1200239A HU230341B1 (hu) 2012-04-20 2012-04-20 A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1200239A2 HUP1200239A2 (en) 2013-10-28
HU230341B1 true HU230341B1 (hu) 2016-02-29

Family

ID=89990696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1200239A HU230341B1 (hu) 2012-04-20 2012-04-20 A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9465038B2 (hu)
EP (1) EP2839293B1 (hu)
HU (1) HU230341B1 (hu)
WO (1) WO2013156806A2 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10684293B2 (en) 2013-05-24 2020-06-16 Nova Southeastern University Associating somatic gene mutations in glycophorin a with complex multifactorial diseases
WO2015009970A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Erythron Llc Spectroscopic measurements with parallel array detector
EP3111216A4 (en) 2014-02-28 2017-11-22 Nueon, Inc. Method and apparatus for determining markers of health by analysis of blood
WO2016144642A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 Chromologic Llc Genetically engineered host cells for malaria research
EP3282937A4 (en) 2015-04-14 2018-11-21 Nueon Inc. Method and apparatus for determining markers of health by analysis of blood
AU2016334875B2 (en) * 2015-10-07 2022-10-27 Sangui Bio Pty. Ltd Blood preparation and profiling
EP3393482A4 (en) * 2015-12-22 2019-08-21 Sangui Bio Pty. Ltd THERAPEUTIC PROCEDURES USING ERYTHROCYTES
WO2017165403A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Nueon Inc. Porous mesh spectrometry methods and apparatus
WO2018085699A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Nueon Inc. Combination blood lancet and analyzer
CN110366597B (zh) 2016-12-20 2024-03-29 善威生物私人有限公司 用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2131830A (en) * 1982-12-10 1984-06-27 Ludwig Inst Cancer Res Monoclonal antibody for use against breast cancer
US5585243A (en) 1993-09-15 1996-12-17 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Method of detecting cytopenia that is mediated by drug-dependent antibody binding to blood cells
US5691157A (en) 1995-10-24 1997-11-25 The Research Foundation Of State University Of New York Method for detecting a mammal's prior exposure to radiation or radiomimetic chemicals
DE60041340D1 (de) 1999-09-01 2009-02-26 Us Gov Health & Human Serv Identifizierung des plasmodium falciparum erythrozn zum chondroitin sulfat a vermittelt
US20020098188A1 (en) 2000-05-24 2002-07-25 Riken Blood coagulation factor-activating protein and antibody thereto
EP1378519A1 (en) 2002-07-05 2004-01-07 Biotest Ag Scianna antigens
US7824874B2 (en) * 2006-05-25 2010-11-02 Litron Laboratories, Ltd. Method for measuring in vivo mutation frequency at an endogenous gene locus
WO2008118390A2 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 Wayne State University Biomarkers for diagnostic and therapeutic methods

Also Published As

Publication number Publication date
US9465038B2 (en) 2016-10-11
HUP1200239A2 (en) 2013-10-28
EP2839293B1 (en) 2017-02-08
WO2013156806A2 (en) 2013-10-24
WO2013156806A3 (en) 2014-01-03
US20150111770A1 (en) 2015-04-23
EP2839293A2 (en) 2015-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230341B1 (hu) A vörösvérsejt-membrán kvantitatív biomarkerei
Barkal et al. Engagement of MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1 suppresses macrophages and is a target of cancer immunotherapy
Nair et al. Identification and characterization of choline transporter-like protein 2, an inner ear glycoprotein of 68 and 72 kDa that is the target of antibody-induced hearing loss
Westhoff The Rh blood group system in review: a new face for the next decade.
Kim et al. Newly identified cancer-associated role of human neuronal growth regulator 1 (NEGR1)
Cojot et al. Differential display cloning identifies motility-related protein (MRP1/CD9) as highly expressed in primary compared to metastatic human colon carcinoma cells
El-Husseini et al. Polarized targeting of peripheral membrane proteins in neurons
Meyer et al. CD96 interaction with CD155 via its first Ig-like domain is modulated by alternative splicing or mutations in distal Ig-like domains
CN101528921B (zh) 人非小细胞肺癌中的易位和突变的ros激酶
Padilla-Benavides et al. The polarized distribution of Na+, K+-ATPase: role of the interaction between β subunits
JP2020505920A (ja) ヒドロキシステロイド１７−βデヒドロゲナーゼ１３（ＨＳＤ１７Ｂ１３）バリアント及びその使用
EP1925667B1 (fr) Protéine spécifique des cellules pancréatiques bêta des îlots de Langerhans et ses applications
CN101523211A (zh) 血细胞分离
Wang et al. A unique region of RILP distinguishes it from its related proteins in its regulation of lysosomal morphology and interaction with Rab7 and Rab34
Wester et al. Characterization of Jk (a+ weak): a new blood group phenotype associated with an altered JK* 01 allele
Suzuki et al. Polysialic acid and mucin type o-glycans on the neural cell adhesion molecule differentially regulate myoblast fusion
Yamamoto et al. Crosstalk between ABO and Forssman (FORS) blood group systems: FORS1 antigen synthesis by ABO gene-encoded glycosyltransferases
López‐Berges et al. The A spergillus nidulans syntaxin PepAPep12 is regulated by two S ec1/M unc‐18 proteins to mediate fusion events at early endosomes, late endosomes and vacuoles
Yang et al. Activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM)/CD166 in pancreatic cancer, a pivotal link to clinical outcome and vascular embolism
Norment et al. Transgenic expression of RasGRP1 induces the maturation of double-negative thymocytes and enhances the production of CD8 single-positive thymocytes
Yamaguchi et al. Identification and localization of the sperm CRISP family protein CiUrabin involved in gamete interaction in the ascidian Ciona intestinalis
Mor-Cohen et al. Disulfide bond disruption by a β3-Cys549Arg mutation in six Jordanian families with Glanzmann thrombasthenia causes diminished production of constitutively active αIIbβ3
Hirata et al. ER entry pathway and glycosylation of GPI-anchored proteins are determined by N-terminal signal sequence and C-terminal GPI-attachment sequence
Urayama et al. Ascidian sperm glycosylphosphatidylinositol-anchored CRISP-like protein as a binding partner for an allorecognizable sperm receptor on the vitelline coat
Jensen et al. The SORL1 p. Y1816C variant causes impaired endosomal dimerization and autosomal dominant Alzheimer's disease