KR20040044436A

KR20040044436A - 혈구생성의 자극제로서 골 형성 성장 올리고펩티드

Info

Publication number: KR20040044436A
Application number: KR10-2004-7001275A
Authority: KR
Inventors: 밥이타이; 쵸레브미카엘; 스테이어어라이; 물라드안드라스; 맨서르누라; 구레비치올가; 그린버그즈비; 로시니세르지오; 트라시아티실비아; 페트리니마리오
Original assignee: 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘
Priority date: 2001-07-29
Filing date: 2001-07-29
Publication date: 2004-05-28
Also published as: IS7129A; SK912004A3; CZ2004300A3; CN1551779A; HUP0400667A2; JP2004536876A; IL160016A0; AU2001282436B8; CN1310672C; WO2003011313A1; EE200400062A; NO20040378L; US20050004037A1; AU2001282436B2; CA2456092A1; WO2003011313A8; BR0117087A; NZ530904A; HRP20040135A2; EP1414480A1

Abstract

본 발명은 효과적인 성분으로서 OGP의 C-말단 부분과 동일하거나 유사한 올리고펩티드를 포함하고, 조혈모 세포의 생산에 대하여 자극 활성을 가지는 약학적 조성물과 관련된다. 사용되는 적절한 올리고 펩티드는 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 또는 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly가 된다. 보다 구체적으로, 이러한 올리고 펩티드는 골수 이식의 주입, 혈구의 재생산, 골수의 재증식 및 말초 간 세포의 이동성을 향상시키고, 보다 적절하게 화학요법이나 방사선 요법 후에 이러한 향상성이 나타난다. 본 발명은 추가적으로 약학적 조성물에 있어서 이러한 올리고 펩티드를 이용한 치료 방법 및 사용 방법을 제공한다.

Description

혈구생성의 자극제로서 골 형성 성장 올리고펩티드{Osteogenic Growth Oligopeptides As Stimulants Of Hematopoiesis}

뼈와 뼈 골수 사이의 생물학적 및 생화학적 상호 작용에 대해서는 완전한 지식이 갖추어져 있지 아니하다. 그러나 최근의 연구는 조혈세포의 발달을 지지하는데 있어서 혈구 생성 세포를 유도하는 뼈 골수의 역할을 확신시켜 준다[Teichman, R.S., et al., Hematol.4:421-426(2000)].

뼈 골수 이식 연구는 두 개의 시스템 사이에서 양-방향성 상호 작용을 확신시켜 주었다. 뼈 골수의 제거 또는 방사선 요법은 초기의 국소적, 일시적 골 형성 반응을 유발한다[Amsel, S., et al., Anat. Rec. 164:101-111(1969); Patt, H.M.,and Maloney, M.A., Exp. Hematol. 3:135-148(1975)]. 이러한 골 형성 단계(osteogenic phase)에 있어서, 트라베쿨라(trabeculae)는 골수강(marrow cavity) 내에서 형성된다. 이러한 트라베큘라는 일시적이며 조혈 골수의 재구성 과정에서 다시 흡수된다. 더구나, 인간의 뼈 골수 제공자에 있어서, 혈청 골 형성 표지 오스테오칼신(serum bone formation markers osteocalcin) 및 알칼리성의 포스파타아제의 증가는 장골 뼈 골수(iliac bone marrow)의 실질적인 부분의 제거 후에 나타났다[Foldes, J., et al., J. Bone Miner. Res. 4:643-646(1989)]. 인간 조골 세포(osteoblasts)는 인간의 조혈 선구 세포를 지지한다는 가정은 매우 흥미로운 것이다: 이러한 세포는 외인성으로 제공된 성장 인자가 추가되지 않고 조혈 콜로니(hematopoietic colonies)의 형성을 직접적으로 자극하는 인자를 생산하다. 실질적으로, 조골세포는 과립백혈구 콜로니-자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor:G-SCF), 과립백혈구-매크로파지 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor:GM-CSF), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor:TNF) 및 인터류킨 6(interleukin 6:IL-6)를 포함하는 여러 가지 사이토카인(cytokines)을 분비한다. 뿐만 아니라, 배양된 조골세포는 조혈간세포(hematopoietic stem cells)에 있어서 성숙하지 않은 표현형(phenotype)의 유지를 지지한다[Taichman, et al., Blood 87:518-524(1996)].

여러 가지의 이러한 성장 인자는 높은 강도의 약물 화합 요법 후에 생체 내에서 뼈 골수의 재증식 및 말초 간 세포 동원성(peripheral stem cellmobilization)을 향상시킨다. 이러한 성장 인자 중에서, G-CSF, GM-CSF, IL-3(interleukine-3) 및 SCF(Stem Cell Factor)는 확장성을 가지는 것으로 평가되어 왔고[Bungart, B., et al., Br. J.Haematol. 76:174(1990); Lant, T., et al., Blood 85:275(1995); Brugger, W., et al., Blood 79:1193(1992); MOlinex, G., et al., Blood 78:961(1991)], FLT-3와 같은 다른 인자는 임상적 사용을 위한 연구 중에 있다[Ashihara, E., et al., Europ. J. Haematol. 60:86(1998)]. 최근 이러한 분야의 발전은 뼈 골수 기능의 여러 가지 생리학적 양상에 대한 이해를 가져왔다. 게다가, 조혈 선구 물질(haematological precursors)의 분화 및 증식을 조절하는 능력은 말초 혈관 간 세포 이식, 유전자 트랜스펙션(transfection) 및 간 세포의 생체 외(ex vivo) 증식 등과 같은 보다 혁신적인 치료 방법에 기초한다. 이러한 눈에 띄는 발전에도 불구하고, 간 세포 생리학의 여러 가지 특징은 명확하게 밝혀지지 않았고, 가용성 또는 관련된 세포 멤버레인 양쪽 모두에 대한 여러 가지 인자는 생리학적 또는 병리학적 뼈 골수 세포의 증식/분화와 관련된 것으로 추측되어 왔다. 조혈(hematopoiesis)을 조절할 수 있다는 것을 보여주는 제제(agents)의 증가는 조혈 조절제의 과잉 또는 민감성과 관련되는 결정적인 문제를 뒷받침한다[Metcaff, D., et al., Blood 82:3515(1993)].

종래부터 정의된 성장 인자의 역할에 추가하여, 다양한 생물학적 제제 및 세포 형태가 생체 내 및 생채 외에서의 치료 방법을 향상시키거나 수정시킬 수 있었다. 인간 뼈 골수-유도 내피 세포(endothelial cells)는 장기간에 걸친 골수 및거핵 세포 선구 물질(myeloid and megakaryocytic progenitors)의 증식 및 분화를 유지한다[Rafii, S., et al., Blood 86:3353(1995)]; 보조 세포가 뼈 골수 이식 후에 조혈 회복을 유지할 수도 있다[Bonnet, D., et al., Bone Marrow Transpl. 23:203(1991)]; 그리고, 본 발명의 목적을 위하여 보다 흥미로운 것으로서, 조골 세포는 생쥐의 경우 HLA-비관련성 뼈 골수 이식(HLA-unrelated bone marrow transplant) 후에 접목(engraftment)을 향상시킬 수 있다[El-Badri, N.S., et al., Exp. Hematol. 26:110(1998)].

많은 화학적 구조가 뼈 골수 생리학에 있어서 가능한 역할을 평가하기 위하여 연구되어 왔다. 예를 들어, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 효과는 백혈병-유도 세포 라인[Volpi, N., et al., Exp. Cell Res. 215:119(1994)] 및 인간 코드 혈액-유도 간 세포(human cord blood-derived stem cells) 상에서 클론원성 분석(clonogenic tests)[Da Prato, I., et al., Leuk. Res. 23:1015(1999)] 양쪽에 대하여 평가되어 왔다. 심지어 짧은 펩티드(short peptides)가 혈구 조절 및 다혈통 효과(hemoregulatory and multilineage effect)에 도달하기 위하여 합성되었고, 간질 세포(stromal cell)에 의한 사이토카인 생산의 향상에 의하여 이러한 것이 가능해졌다[King, A.G., et al., Exp. Hematol. 20(4):531(1992); Pelus, L.M., et al., Exp. Hematol. 22:239(1994)].

어떤 개인에게 특유한 골수 섬유증(idiopathic myelofibrosis:IMF)은 가장작은 공통성을 가지며 가장 나쁜 만성적인 골수증식성 질환(myeloprofiferative)이다. 주요 병리 과정은 클론성 조혈 간 세포 장애(a clonal hematopoietic stem cell disorder)이며 이 질병은 빈혈증(anemia), 불규칙적인 거핵세포 과형성(atypical megakaryocyte hyperplasia), 비장비대증(splenomegaly) 및 다양한 수준의 골수외조혈(extramedullary hematopoiesis)로 진행된다. 이와 대조적으로, 특징적인 간질 증식(stromal proliferation)은 거대세포/혈소판-유도 성장 인자의 부적절한 방출로 인하여 발생하며, 이러한 성장 인자는 혈소판-유도 성장 인자(platelet-derived growth factor:PDGF), 전환 성장 인자-베타(TGF-beta), 기초 결합조직형성세포 인자(basic fibroblast factor:bFGF), 상피 성장 인자(epidermal growth factor:EGF) 및 단백질(calmodulin)을 포함한다[Groopman, J., Ann.Intern.Med.92:857-858(1980); Chvapil, M., Life Sci. 16:1345-1361)(1975)]. IMF 환자의 평균 생존기간은 약 4년이다. IMF에서 치료 방법은 신체의 밸런스를 유지하기 위한 것에 집중되고 증상의 완화와 생활의 질을 향상시키는 방향으로 이루어진다. 가장 일반적인 방법은 혈액 수혈(blood transfusions), 안드로겐 및 하이록시뇨소(hydroxyurea)와 같은 사이토감소제(cytoreductive agents)이다. 뼈 골수 이식을 고려하는 것이 증가하고 있지만, 여전히 그러한 것은 실험적인 접근으로 간주된다. 인터페론-알파 (inferferon-alpha:IFN-alpha)는 IMF의 초기 과도 증식 단계에서는 가망성을 가진 결과를 보여주었지만 질병의 보다 진전된 단계에서는 아무런 효과를 나타내지 않거나 또는 그 효과가 미미하다.

일찍이 골생성 성장 펩티드(osteogenic growth peptide:OGP), 14-아미노 산, 매우 보존성이 높은 H4 히스톤-연관 펩티드(highly conserved H4 histone-related peptide)는 혈액 및 뼈 골수 세포충실성을 증가시키고, 생쥐의 경우 뼈 골수 이식의 접목을 향상시킨다는 것이 몇몇 연구자에 의하여 밝혀졌다[Bab, I.A., Clin. Orthop. 313:64(1995); Gurevitch, O., etal., Blood 88:4719(1996) 및 US 특허번호 5,461,034]. OGP는 후기-제거 뼈 골수 재생의 골수 형성 단계로부터 분리되었고[Bab, I., et al., Endocrinology, 128(5);2638(1991)], 혈액 내에서 생리학적으로 매우 풍부하게 존재하며 주로 α₂-매크로글로빈(α₂-M)을 가진 복합체로서 존재한다[Gavish, H., et al., Biochemistry, 36:14883-14888(1997)]. 생체 내에 투여되는 경우, OGP는 뼈의 형성을 향상시키고 섬유주 뼈 질량(trabucular bone mass)를 증가시킨다; 시험관 외 또는 생체 외에서, OGP는 골수 생성 세포 라인에서 증식 및 알칼리성의 포스페타제 활성을 자극한다; 추가적으로, OGP는 결합조직형성세포(fibroblasts)에 대하여 분열을 촉진시킨다[Greenberg,Z., et al., Biochim. Biophys. Acta.1178:273(1993)]. 뼈의 재생, 조골세포(osteoblast) 활동화 및 결합조직형성세포의 증식에 대한 OGP의 활성에 추가하여, OGP는 생체 내에서 백혈구(white blood cell:WBC) 총수의 균형적인 증가 및 골수 모세포 방사선 요법 및 선천성 또는 반동종이계 뼈 골수 이식(semiallogeneic bone marrow transplants)을 받은 생쥐에 있어서 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 유도한다[Gurevitch, O., et al., ibid.(1996)].

OGP(10-14)로 표시되는 OGP의 C-말단 펜타펩티드는 α₂-M을 가진 활동하지 않은 복합체(complex)의 분해 시 충분한 길이(full length)의 OGP의 단백질 가수 분해로 인한 쪼개짐으로부터 생성되는 것으로 보이며 포유동물 혈청 및 골수 형성 세포 배지에서 높은 수준으로 존재한다[Bab, I., et al., J. Pept. Res. 54:408(1999)]. N-말단 변형 OGP는 세포 증식에 있어서 OGP-유사 투여-의존 효과(OGP-like dose-dependent effect)를 유지하고, 카르복시-말단 펜타펩티드가 추정되는 OGP 수용체에 대한 결합에 영향을 미친다는 것이 제안되었다[Greenberg, Z., et al., ibid.(1993)]. 추가적으로, 연구자들은 전에 골수 형성 MC3T3 E1 세포 내에 OGP가 아니라 OGP(10-14)의 분열 촉진성 투여는 시간 또는 투여량 의존 방식으로 MAP 키나제 활성을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 이러한 발견은 OGP(10-14)는 다운스트림 신호(downstream signaling)에 영향을 미친다는 것을 나타낸다[Gabarin, et al., J. Cell Biol. 81:594-603(2001)]. 추가적으로 OGP의 활성 형태는 카르복시 말단 펜타펩티드 OGP(10-14)라는 것을 보여주었다. 주목할 사항으로서, OGP(10-14)는 α₂-M를 가진 복합체 또는 다른 OGPBP(OGP 결합 단백질)을 형성하지 않는다[Bab, I., J. Peptide Res. 54:408-414(1999)].

그러므로, 자연적인 OGP의 C-말단 영역에 유사한 합성 올리고펩티드의 가능한 조혈 활성은 본 발명에서 평가되었다. 몇몇 그러한 골수 형성적 활성 특이적 펩티드는 US 특허 번호 5,814,610에 개시되어 있다. sOGP(10-14)는 마취제로서 및진통제로서 활성을 가지는 것으로 기술되어 왔다[Kharchenko et al., Vepr. Med. Khim., 35(2) 106-109, (1989)].

중요한 점으로서, 본 발명은 이미 공지된 골수 형성적 활성 올리고펩티드가 조혈 시스템의 자극제로서 역할을 할 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, OGP(10-14)로 표시되는 합성 OGP-유도 펜타펩티드는 생쥐에 있어서 혈액 및 뼈 골수 세포충실성을 증가시키고 뼈 골수 이식의 접목을 향상시키는 것과 같은 여러 가지 펩티드를 가진다. 이러한 펜타펩티드는 시클로포스파미드(CFA)-유도 발육 부전(cyclophosphamide-induced aplasia) 후의 말초(peripheral) 혈액 세포 회복 및 간세포 동원성(stem cell mobilization)에 대하여 현저한 활성을 나타내었다. 더욱이, IMF 환자로부터의 뼈 골수 조직 샘플 내에서 합성 OGP(10-14)의 생체 외 효과가 시험되었고 조혈 세포 수에 있어서 전체적으로 실질적인 증가를 나타내었다. 그뿐만 아니라, OGP(10-14)의 효과의 크기는 IMF의 증세의 심각한 정도(severity)와 직접적으로 관련된다. 이러한 결과는 OGP(10-14)가 혈액 세포 형성을 자극하고 조혈을 회복할 수 있다는 것을 나타낸다.

그러므로, 본 발명의 목적은 OGP-유도 올리고펩티드를 조혈 성장 인자로서 사용하는 것이다. 본 발명의 이러한 그리고 다른 목적은 발명의 상세한 설명을 개시함에 따라 상세하게 설명될 것이다.

본 발명은 혈구 생성 자극제로서 OGP의 C-말단 부분에 해당하는 올리고펩티드의 사용과 관련된다. 보다 구체적으로, 이러한 올리고펩티드는 뼈 골수 이식, 조혈 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 재 증식 및 간세포의 순환 횟수를 향상시키며, 특히 이러한 향상은 화학요법이나 방사선 요법 후에 발생한다. 본 발명은 추가적으로 이러한 올리고펩티드를 사용하는 방법 및 이들을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

도 1은 결합 제거 방사선치료/BMT(combined ablative radiotherapy/BMT) 후에 생쥐 내의 대퇴부 골수 세포의 전체 수에 미치는 sOGP(10-14)를 이용한 예방 치료(pretreatment)의 투여 의존 효과를 도시한 것이다.

지시된 투여량에 있어서 OGP(10-14)는 암컷 C57 BL 생쥐에게 12일 동안 매일 피하에(subcutaneously) 주사되었다. OGP(10-14) 치료의 시작 후 8일째 되는 날, 생쥐에게 900 Rad X-ray를 조사하였고, 10⁵선천성 비선택 뼈 골수 세포의 정맥 주사 투여가 이어졌다. 치료를 시작한 후 14일 되는 날, 생쥐는 실험을 위하여 희생되어 그의 대퇴부 뼈 골수는 인산염 버퍼 염수(phosphate buffered saline)로 세척되었다. 단일 세포 현탁액(a single cell suspension)이 선별된 주사기 바늘을 통하여 여러 차례 표본을 끌어당기는 것에 의하여 준비되었다. 세포 수의 측정은 혈구 측정기(hemocytometer) 내에서 행해졌다. C-제어(C-control) 생쥐는 단지 포스페이트 버퍼 염수로만 처리되었다. 데이터는 각 조건에 대하여 적어도 7마리의 생쥐에 대하여 얻어진 평균 ±SE이다. 약어는 다음과 같은 것을 나타낸다: Fem(대퇴부:fermoral), Marr C(골수 세포:marrow cells), D(day:날짜), mou(mouse:생쥐), premed(premedication:예비마취), stimu(stimulation:자극) 및 cellu(cellularity:세포충실성).

도 2의 2A-C는 OGP(10-14)가 생쥐에 있어서 조혈 조직의 화학적 제거를 행하는 투여 및 시작 의존 방법에 있어서 혈액 세포 총수를 자극하는 것을 도시한 것이다.

몸무게가 25mg이 되는 각각의 수컷 ICR 생쥐에 대하여 클로로포스퍼마이드(CFA)를 사용하여 화학적 제거(chemoablation)가 실시되었고, 쥐 한 마리 당 5mg(5mg/mouse)이 0번째 날과 첫 번째 날에 복강 내로(intraperitoneally) 주사를 하였고, 해당 일에 각각 주사되었다. OGP(10-14)는 "주사를 위한 살균된 물" 내에서 용해되었고 지시된 투여량의 0.1 ml 또는 물만(감염매개체(vehicle))이 -7일부터 -1일까지 및 +2일부터 +8일까지 매일 목덜미(nape)에 피하 주사되었다. 데이터는 각 조건에 대한 20 마리의 쥐로부터 얻어진 평균 ±SD를 나타낸다. *: CFA+감염매개체(vehicle)에 대한 현저함, p<0.05; **: 1 nmol OGP(10-14) 그룹에 대한 현저함, p<0.05.

도 2A는 전체 백혈구의 수를 나타낸 것이다.

도 2B는 전체 단핵세포(monocytes)를 나타낸 것이다.

도 2C는 전체 미성숙 세포(immature cells)를 나타낸 것이다.

약어는 다음과 같은 것을 나타낸다: cont(control, untreated:대조), v도(vehicle:감염매개체), ce(cell:세포), T(time-day:시간-날짜).

도 3은 조혈 조직의 화학적 제거를 실시하는 생쥐에 있어서 순환성 이중 양성 CD34⁺/Sca-1+의 수를 자극하는 것을 도시한 것이다.

각각 몸무게가 25mg이되는 수컷 ICR 생쥐에 대하여 클로로포스파미드(CFA)를 사용하여 화학적 제거를 행하였고, 하루에 한번씩 주사하여 0번째 날과 첫 번째 날에 생쥐 한 마리 당 5 mg 씩(5mg/mouse) 복강 내에 주사되었다. OGP(10-14)가 "주사를 위한 살균된 물"에서 100nmol/ml 농도로 용해되고 이 용액의 0.1ml 또는 단지 물만(감염 매개체) -7일부터 -1일까지 및 +2일부터 +8일까지 매일 목덜미에 피하 주사에 의하여 투여되었다. CFA 제거 생쥐가 +2일부터 +8일까지 10⁶UI/0.1 ml G-CSF로 치료되었고 양성 참조(positive reference)로서 사용되었다. 데이터는 각 조건에 대하여 33마리의 생쥐로부터 얻어진 평균 ±SD(오차 막대가 너무 작아서 표시되지 않았다)를 나타낸다.

약어는 다음과 같은 것을 나타낸다: v도(vehicle:감염 매개체), T(time-day:시간-날짜), *: CFA+감염매개체에 대한 현저함, p<0.01.

도 4A-C는 조혈 조직의 화학적 제거가 실시되는 생쥐의 뼈 골수로부터 유도된 생체 외에서의 콜로니 형성 유니트(colony forming units)에 대한 OGP(10-14) 치료 처방 계획의 효과를 도시한 것이다.

각각의 몸무게가 25mg이 되는 수컷 ICR 생쥐에 대하여 클로로포스파미드(CFA)를 사용하여 화학적 제거가 실시되고, 0번째 날과 첫 번째 날에 생쥐 한 마리당 5mg씩 복강내에 주사되었으며, 각각의 주사는 해당 일에 각각 시행되었다. OGP(10-14)가 "주사를 위한 살균된 물"에서 100nmol/ml의 농도로 용해되고 이 용액중의 0.1ml 또는 물만(감염 매개체) 지시된 기간 동안 매일 목덜미에 피하 주사되었다. 뼈 골수가 9일째 얻어졌고 콜로니 형성 유닛을 위하여 분석되었다. 데이터는 각 조건에 대하여 10마리로부터 얻어진 평균 ±SD를 나타낸다.

도 4A는 CFU-GM을 도시한 것이다.

도 4B는 CFU-GEMM을 도시한 것이다.

도 4C는 BFU-E를 도시한 것이다.

약어는 다음과 같은 것을 나타낸다: Colo/di(colonies/dish:콜로니/접시), Veh(vehicle:감염 매개체).

도 5A-B는 뼈 골수 생체 검사의 현미경 사진(micorphotography)를 도시한 것이다.

도 5A는 OGP(10-14)가 없는 상태에서 14일 동안 생체 외에서 배양된 개인 특이성 골수 섬유증(IMF) 환자로부터 채취된 뼈 골수 표본의 두 개의 부분에 대한 현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 5B는 10^-8M OGP(10-14)의 존재 하에서 14일 동안 생체 외에서 배양된 개인 특이성 골수 섬유증(IMF) 환자로부터 채취된 뼈 골수 표본의 두 개의 부분에 대한 현미경 사진을 나타낸 것이다. OGP(10-14)를 이용하여 배양된 표본에 있어서 증가된 세포 밀도가 나타난다.

도 6A-B는 뼈 골수 생체 검사의 현미경 사진을 도시한 것이다.

도 6A는 OGP(10-14)가 없는 상태에서 14일 동안 생체 외에서 배양된 개인 특이성 골수 섬유증 환자로부터 채취된 뼈 골수 표본의 두 개의 부분으로부터 망상 조직 착색 부분(reticulum stained sections)의 현미경 사진을 도시한 것이다.

도 6B는 10^-8M OGP(10-14)의 존재 하에서 14일 동안 생체 외에서 배양된 개인 특이성 골수 섬유증(IMF) 환자로부터 채취된 뼈 골수 표본의 두 개의 부분으로부터 망상 조직 착색 부분의 현미경 사진을 도시한 것이다. OGP(10-14) 치료 조직의 정상적인 외형(normal appearance)이 주목된다.

도 7은 IMF에 있어서 퇴화 분석(regression analysis)을 도시한 것이다.

헤모글로빈 수준과 OGP(10-14)로 치료되지 않은 환자에 대한 치료된 환자에 있어서 생체 외에서 조혈 세포 수의 비율(T/C ration) 사이에 개인 특이성 골수 섬유증 환자(IMF)에 있어서 퇴화 분석을 도시한 것으로서, IMF의 격심함과 OGP(10-14)사이에 직접적인 관계를 제시해준다.

약어는 다음과 같은 것을 나타낸다: Hem(hemoglobin:헤모글로빈), Hemato(hematopoietic:조혈 작용), rat(ratio:비율), cellu(cellularity:세포충실성).

세포 생물학 및 펩티드 화학분야에서의 많은 방법이 본 명세서에서 모두 기술되지 않으며, 이는 이러한 것들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있기 때문이다. 이러한 방법은 펩티드 합성 및 구조 분석, 분화세포 수(differential cell counts), 세포 정렬 분석(cell sorting analyses), 콜로니 형성 분석 등과 같은 것을 포함한다. 이러한 방법을 기술하고 있는 기술 문헌의 예를 들면 Current Protocols in Immunology, Coligan et al.(eds), John Wiley & Sons. Inc., New York, NY and Stewart, J.M. 및 Young J.D., in: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, pp.1-175(1984) 등이 이에 속한다. 이러한 공개된 문헌들은 전체적으로 본 명세서에 포함된다. 추가로, 수많은 면역 기술은 본 명세서에서 상세하게 각각의 예로서 본 명세서에서 기술되지 않으며, 이는 이러한 기술들은 당업자에게 자명한 것이기 때문이다.

본 명세서에서 아래와 같은 약어들이 사용된다:

OGP(s)-골수 형성 성장 폴리펩티드(osteogenic growth polypeptide(s)).

OGPBP(s)-골수 형성 성장 폴리펩티드 결합 단백질(osteogenic growth polypeptide binding protein(s)).

sOGP-합성 OGP(Synthetic OGP).

WBC-백혈구(white blood cells).

PBL-말초 혈관(peripheral blood).

CFA-시클로포스파미드(cyclophosphamide).

BMT-뼈 골수 이식(bone marrow transplantation).

IMF-개인 특이성 골수 섬유증(idiopatic myeofibrosis).

몇몇 세포성 또는 가용성 제제가 뼈와 뼈 골수 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 상호 작용은 조혈 간 및 선구 세포의 위임(commitment), 증식 및 분화를 위하여 필수적인 것으로 보인다.

OGP는 골 형성 및 뼈 골수 세포충실성(cellularity)을 증가시킨다 [Greenberg, Z., et al., ibid.(1993);Gurevitch, O., et al., ibid.(1996)]. 더욱이, OGP는 골수 형성 및 결합 조직 형성 세포와 뼈 골수 간질 세포를 위한 효력이 있는 유사분열 물질(mitogen:미토겐)이 된다[Greenberg, Z., et at., J. Cellular Biochem, 65:359-367(1997); Robinson, D., et al., J.Bone Min. Res., 10:690-696(1995)].

골수 형성 세포 라인에서, OGP는 백일해 독성-민감성 G-단백질(a pertussis toxin-sensitive G-protein)을 통하여 미토겐-활성화된 단백질 키나제를 활성화시킨다. 이러한 활성화는 C-말단 펜타펩티드 OGP(10-14)에 대하여 제한적인 것으로 나타나고, 그로 인하여 OGP(10-14)는 OGP의 생물 활성 형태(bioactive form)가 된다[Bab, I., et al., ibid.(1999)]. 면역성 및 독성이 존재하지 않는다는 것과 펩티드의 생산 및 취급이 간편하다는 것을 고려할 때, OGP(10-14)는 가능한 생체내 이용성의 관점에서 극적으로 흥미로운 것이다.

선행의 연구는 정상적인 생쥐에 대하여 2 주일 동안 0.1 nmol로부터 10 nmol까지 매일 s.c. 주사가 이루어진 후 유도된 펩티드는 WBC의 수에 있어서 50%이상 증가하였고 전체적인 뼈 골수 세포 충실성에 있어서 40% 이상 향상되었다는 것을 보여주었다[Gurevitch, O., et al., ibid.,(1996)]. 분화 세포 형태의 비율은 치료에 의하여 변하지 않았고, 이는 조혈 작용에 대한 다혈통 활성(a multilineage activity)을 제시한다. 흥미로운 점으로서, 본 명세서에서 기술된 실험에 있어서 CFA(사이클로포??마이드)의 투여에 의하여 유도된 가역성 발육부전(reversible aplasia) 후에, OGP(10-14)에 의하여 치료된 생쥐는 플라시보(placebo) 및 사용된 투여에 있어 임의의 평가될 만한 독성이 없이 주사된 생쥐에 비하여 보다 빠르게 회복되었다.

이와 같은 방법으로, 첫 번째 특징으로서 본 발명은 유효한 성분으로서 조혈 세포의 생산에 자극 활성을 가지는 적어도 하나의 올리고 펩티드를 포함하고, 적절하게는 아미노 산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 또는 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, 또한 염기 서열 ID 번호:1,2,3 및 4로 각각 표시되는 것과 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물과 관련된다.

적혈구 및 백혈구 세포가 뼈 골수에 위치한 세포의 분화(division)를 통하여 대체되는 혈액 세포 형성과정은 조혈 작용이라고 명해진다. 조혈 작용에 대한 검토를 위하여 Dexter and Spooncer을 참조할 수 있다[Ann. Rev. Cell Biol., 3:423-441(1987)].

여러 가지 많은 형태의 혈액 세포가 있고, 이러한 세포는 명확한 세포 계열에 속한다. 각각의 계열을 따라서, 서로 다른 성숙 단계의 세포가 존재한다. 성숙한 혈액 세포는 서로 다른 기능을 위하여 특성화된다. 예를 들어, 적혈구는 O₂및 CO₂수송과 관련된다; T 및 B 림프구는 세포 및 항체 매개 면역 반응에 각각 관련된다; 혈소판은 혈액응고를 위하여 필요하다; 그리고 과립성 백혈구(granuloctyes) 및 매크로파지는 청소 세포 및 보조 세포로서 기능을 한다. 과립성 백혈구는 추가적으로 호염기성(basophils),호산성(eosinophils), 호중성(neutrophils) 및 비만(mast) 세포로 나누어질 수 있다.

본 발명의 특징에 따른 구체적으로 적절한 실시 예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 염기 서열 번호 NO:1로 나타내는 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 표현되는 펜타펩티드인 올리고펩티드를 포함한다. 이러한 펜타펩티드는 본 발명에 따른 적용의 경우에는 OGP(10-14)로 표현된다.

또 다른 실시 예로서, 본 발명의 약학적 조성물은 염기 서열 번호 NO:2로 표시되고 Tyr-Gly-Phe-His-Gly로 나타내는 펜타펩티드인 올리고 펩티드를 포함한다.

또 다른 실시 예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 염기 서열 번호 NO:3으로 표시되고 Gly-Phe-Gly-Gly로 나타내는 테트라펩티드를 포함한다.

또 다른 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 염기 서열 번호 NO:4로 표시되고 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 나타내는 헥사펩티드인 올리고 펩티드를 포함하고, 이러한 올리고 펩티드에서 메티오닌 잔여기는 아실레이트화(acylated) 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어 유효한 성분으로서 사용된 펩티드는 공지된 유기 화학적 방법을 통하여 인공적으로 생산된다. 이러한 합성방법은 예를 들어 US 특허 번호 5,814,610호에 기술되어 있다.

본 발명의 특징에 따른 적절한 실시 예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 조혈 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용된다.

본 발명의 또 다른 실시 예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 화학적 요법 및 방사선 요법 치료를 받는 환자의 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 조혈 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용된다.

모든 혈액 계통의 일생 동안의 생산을 제공하는 조혈 간 세포의 능력은 특정한 혈액 계통을 생산하는 위임된 선친 세포(committed progenitors cell)의 생산에 해당하는 간 세포 형성성(stem cell plasticity)과 분화되지 않은 상태에 있는 간 세포 복제(stem cell replicaton)(self-renewal:자가-재생) 사이의 균형에 의하여 이루어진다. 생체 내에서 조혈 간 세포 형성성 및 자가-재생 사이를 조절하는 구조는 규정하기 어렵다. 그러나, 주요한 기여 인자는 세포 고유의 영향 및 환경적 영향의 조합을 표현한다[Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10302-1-306(1995)]. 조혈 작용을 위한 미시환경의 중요성은 오랜 기간 동안 뼈 골수 배양 시스템의 사용을 통하여 확립되었고 이러한 시스템에서 스트로마(stroma)에서 배양된 조혈 세포는 비록 낮은 빈도로 나타나지만 HSCs의 유지를 허용한다[Fraser, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992); Wineman, et al., Blood 81:365-372(1993)].

배지에서 조혈 세포 유지에 대한 실시 예는 '간 세포' 인자가 될 수 있는 요소(candidate)를 확인하기 위한 노력을 이끌어 내었다. 간 세포 유지에 있어서 조혈 사이토킨의 역할은 배양된 세포 이식으로 이어지는 간 세포 군집(populations)이 이루어지는 시험관 내 배양지에 대한 정제된 요소의 직접적인 첨가에 의하여 연구되었다[Meunch, et al., Blood 81:3463-3473(1993);Wineman et al., ibid.(1993); Rebel, et al., Blood 83:128-136(1994)]. IL-3, IL-6 및 KL과 같은 공지의 '초기-작용(early-acting)' 사이토킨의 대부분은 보다 많은 위임된 선구 세포의 증식을 자극하는 반면 유지는 허용하지만 증식(expansion)은 허용하지 않는다는 사실과 장기간의 다혈통 증식(repopulation)의 능력을 가진 세포를 자극한다는 사실을 보여주었다[reviewed in Williams, Blood 81(12):3169-3172(1993);Muller-Sieburg and Deryugina, Stem Cells, 13:477-486(1995)]. 이러한 데이터는 세포 형성성 및 증식 기능이 사이토킨 치료에 의하여 보존될 수 있다는 것을 나타낸 반면, 이러한 다수에 영향을 미치는 세포(pluripotent cell)의 자가-재생을 향상시키는 분자는 알려지지 않는 상태로 남아있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용된 폴리펩티드는 순환성 다혈통 선친 세포의 비율을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 다혈통 선친 세포는 순환성 초기 선구 물질 CD34(circulating early precursor CD34) 양성 세포가 된다.

인간과 생쥐에서, 초생의 성숙한 조혈 선구 세포(primitive mature hematopoietic progenitor cell)는 CD34로 표시된 세포 표면 안티겐 발현에 의하여 규정된 세포 클래스에 대한 성질(belongs)로 확인되었다. 이러한 세포는 CD34 양성 세포에 속하는 것으로 볼 수 있다. 생쥐의 경우, CD34 양성 조혈 세포의 초기서브클래스는 이중 양성 CD34⁺/Sca^±세포가 된다. 인간에게 나타나는 유사 Sca-1(analogous Sca-1) 세포 표면 안티겐은 Flk2가 된다. 그러므로, 인간 CD34/Flk2 이중 양성 세포(double positive cells)는 생쥐의 이중 양성 CD34/Sca-1세포와 균등한 것으로 취급된다.

CD34 안티겐 및/또는 Flk2 수용체를 발현하는 인간 조혈 선친 세포는 본 명세서에서 "초생의 선친 세포(primitive progenitor cell)"로 명해진다. 이와 대조적으로, CD34 또는 Flk2 수용체 중의 어느 하나를 발현하지 않는 조혈 세포는 "성숙한 선친 세포(mature progenitor cells)"로 명해진다. 그러므로, 적절한 실시 예로서 다혈통 선친 세포는 순환성 초기 선구 물질(precursor) CD34 이중 양성 세포가 된다.

본 명세서에서 사용되는 것처럼, "선친 세포(pregenitor)"는 임의의 체강 세포(somatic cell)에 속하는 것이며, 이러한 세포는 분화 및 증식(differentiation and proliferation)에 의하여 충분히 분화되고 기능적인 후손(progeny)을 발생시킬 수 있는 능력을 가진다. 선친 세포는 혈액, 신경, 근육, 피부, 소화관(gut),뼈, 신장, 간장, 췌장(pancreas), 흉선(thymus) 및 그와 같은 것을 포함하지만 이에 제한되는 않는 임의의 조직 또는 유기체로부터 유래하는 선조(progenitors)를 포함한다. 선친 세포는 "분화된 세포(differentiated cell)"와는 구별되고, 이러한 분화된 세포는 증식할 수 있는 능력을 가지거나 가지지 않는 세포, 즉 자가-재생(self-replicate)으로 정의되지만, 그러한 세포는 정상적인 생리적 조건에서 다른 세포 형태로 더 이상 분화할 수 없는 세포를 말한다. 더욱이, 선친 세포는 암세포 특히 백혈병 세포와 같은 비정상적인 세포로 추가적으로 분화되며, 이러한 비정상적인 세포는 증식은 하지만(자가-재생) 미성숙 상태 또는 미분화 상태인 것으로 나타남에도 불구하고 더 이상 분화하지 않는다.

선친 세포(progenitors)는 그들의 후손(progeny)에 의하여 정의된다, 즉 과립 백혈구/매크로파지 콜로니 형성 선친 세포(granulocyte/macorphage colony-forming progenitor cells:GM-CFU)는 중성친화성 세포(중성 백혈구) 또는 매크로파지로 분화한다; 초생의 적혈구 배 형성 유닛(primitive erythroid blast-forming units:BFU-E)은 성숙한 적혈구를 발생시키는 적혈구 콜로니-형성 유닛(erythroid colony-forming units:CFU-E)으로 분화한다. 유사하게, Meg-CFU, GEMM-CFU, Eos-CFU 및 Bas-CFU 선친 세포는 거핵 세포(megakaryocytes), 과립 백혈구(granulocytes), 매크로파지, 호산성 백혈구(eosinophils) 및 호염기성(basophils) 백혈구로 각각 분화할 수 있다.

다양한 다른 조혈 선친 세포가 특성화 되어 왔다. 예를 들어, 조혈 선친 세포는 이러한 세포를 포함하고, 이러한 세포들은 연속적인 사이클로 분화하고 증식하여 8개의 서로 다른 성숙한 조혈 세포 계통으로 될 수 있다. 조혈 스펙트럼 중가장 초생적이며 분화되지 않은 말단 세포(end)에서, 조혈 선구 세포는 조혈 "간 세포(stem cells)"를 포함한다. 이러한 희귀한 세포는 뼈 골수 세포에서 10,000 중의 1로부터 100,000중의 하나로 나타나고, 각각의 세포는 모든 계통 중에서 10¹³성숙 혈액 세포 보다 더 많은 수를 발생시킬 수 있는 능력을 가지며 유기체의 생애를 통하여 혈액 세포 생산을 지탱하는데 영향을 미친다. 이러한 세포는 활동하지 않는 상태에서 주로 뼈 골수 내에 존재하고 자가-재생(self-renewal)이라고 불리는 과정을 통하여 동일한 딸 세포(daughter cell)를 형성할 수 있다. 따라서, 그러한 위임되지 않은 선친(progenitor)은 "전능적인(omnipotent)" 능력을 가진 것으로 기술될 수 있다, 즉, 모든 형태의 성숙한 세포를 발생시킬 수 있는 필요 충분 조건이 된다. 모든 혈액 세포 계통을 발생시킬 수 있는 능력을 유지하지만 자가-재생의 능력을 가지지 못하는 선친 세포는 "복합적인 능력을 가진(pluripotent)" 것으로 명해진다. 몇몇 혈액 계통 세포를 발생시킬 수 있지만 모든 혈액 계통 세포를 발생시킬 수 없고 자가-재생의 능력을 가지지 못한 세포는 "다중 능력을 가진(multipotent)" 것으로 명해진다.

본 발명에서 사용되는 올리고 펩티드는 단일 능력을 가진(unipotent) 선친 세포, 복합적인 능력을 가진 선친 세포 및/또는 전능적인 능력을 가진 선친 세포를 포함하는 이러한 임의의 선친 세포를 보존하기 위하여(preserving) 사용된다. 이러한 올리고펩티드 및 특별히 OGP(10-14)는 조혈 선친 세포를 보전하는 데 있어 특별한 효능을 나타낸다.

보다 적절한 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효한 성분으로서 사용되는 올리고 펩티드는 미성숙 세포 단핵 세포 회복(immature cell monocyte recovery)을 향상시키고 BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유닛(CFU) 중의 하나를 선택적으로 증가시킨다.

아래의 실시 예 3에서, 생체 외(ex vivo) OGP(10-14)로부터 유도된 조혈 콜로니 형성의 평가(assessment) 및 대조 처리된 생쥐(control treated mice)에 대하여 기술된다. 여기에서 나타난 결과는 감염 매개체 최적 대조 그룹(the vehicle only control group)과 비교할 때 OGP(10-14)-처리된 생쥐로부터 유도된 배지에서 GEMM-CFU 및 BFU-E의 증가를 보여주고, 이와 대조적으로 양성 G-CSF 대조 그룹은 GM-CFU의 현저한 증가를 유도한다. OGP(10-14) 처리된 생쥐로부터 유도된 배지에서 콜로니 형성에 있어 이러한 증가는 단지 처리가 화학적 제거 전 7일부터 시작된 경우에만 명백하게 나타난다. 생체 내 및 생체 외 양쪽 모두에서 OGP(10-14)에 의하여 나타난 결과는 이미 보고된 다른 사이토킨과 비교된 완전한 길이 OGP의 다혈통 활성에 대한 확신을 가져다 주었다. 다른 성장 및 이동성 인자(mobilizing factors)[Fleming, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3760 (1993)]와는 달리, sOGP(10-14)는 뼈 골수 간 세포 구획(compartment)을 감소시키지 않고 말초 혈액에 있어서 조혈 간 세포의 수를 증가시킨다.

그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 백혈구 세포(WBC), 순환성 조혈 간 세포의 수 및 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 증가시키기 위하여 사용된다.

구체적인 적절한 실시 예로서, 본 발명의 조성물은 뼈 골수 이식을 지지하기 위하여 사용된다. 이러한 효과는 간세포의 수를 증가시키고, 뼈 골수 이식의 경우 조혈 재 구성을 가속화시키며 뼈 골수의 세포 충실성을 증가시키는 올리고 펩티드의 활성으로 인한 것이다.

실시 예 1에서 기술되어 있는 것처럼, 본 발명의 올리고펩티드는 뼈 골수 이식의 접목을 향상시키고 조혈 재구성을 자극하는 것으로 나타났다. 뼈 골수 이식(bone marrow transplantation:BMT)은 충실성 암(solid cancer) 뿐만 아니라 임파종(lymphomas), 홉킨스 병(Hodgkin's diseases) 및 격심한 백혈병 특히 충실성 암 중 흑색종 암(melanoma cancer) 및 유방 암(breast cancer)과 같은 조혈 악성 종양(hematological malignancies)의 경우 점진적으로 그리고 빠르게 선택할 수 있는 치료방법이 되어 가고 있다. 최근, BMT는 IMF(idiopathic myelofibrosis)와 같은 척수 증식성 질병(myeloprofiferative disorders)의 치료의 경우 고려 대상이 되는 경우가 증가하고 있다. 잠재적으로, 향상된 방법을 이용하여 BMT는 또한 다른 파멸적인 질병-AIDS,형성 부전의 빈혈증(aplastic anemia) 및 자가 면역 장애와 같은- 을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 모든 BMT의 목적은 화학적 요법, 방사선 요법 또는 질병으로 손상된 전능적인 및 복합적인 숙주 조혈 간 세포를 대체하는 것이다. 이러한 간 세포는 반복적으로 복제되어 혈액 내에 존재하는 다양한 전체 세포 즉 적혈구, 혈소판 및 백혈구를 발생시키도록 분화할 수 있으며 이러한 혈액 세포에는 림프구, 단핵세포 및 중성 백혈구(neutrophils)를 포함한다. 잔류성 매크로파지(resident macrophages) 및 용골 세포(osteoclasts)가 또한 조혈 전능적인 간 세포로부터 유도된다. 이러한 간 세포가 분화함에 따라, 이들 세포는 스스로 특정 계통에 보다 많이 위임하게 되고(commit) 이러한 과정은 위에서 기술한 세포 중의 어느 한가지 종류를 형성할 수 있을 때까지 계속된다.

그러므로, 또 다른 구체적인 적절한 실시 형태에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 질병 또는 형성 부전 빈혈증을 겪고 있는 환자에게 이식된 뼈 골수를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 조혈 장애는 임파종, 홉킨스 병 또는 격심한 빈혈증 및 척수 증식성 질병, 특히 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

IMF의 경우 적혈구 생성이 점진적으로 상실되도록 발전되는데 비하여, 정해진 장소 이외의 조혈 작용(hemopoiesis)이 발전되고 증가된다. 섬유증의 병리적인 석회성 물질의 침작(calcification) 및 섬유 조직성 뼈(trabecular bone)의 변형이 골아세포 분비 인자(osteoblast secreted factors)의 절대적 또는 상대적인 결핍에 영향을 미치고, 이로 인하여 적어도 부분적으로 손상된 뼈 골수 기능에 영향을 미치게 된다.

실시 예 4에서 기술된 결과는 OGP(10-14)는 상당히 짧은 시간에 섬유 조직(fibrosis)을 변형시키지 않고 IMF 환자로부터의 배양된 뼈 단편 내에서 뼈 골수의 조혈 세포 밀도를 증가시킬 수 있다는 것을 강력하게 제시한다. 이러한 세포 증가는 균형이 갖추어진 것으로 나타나고 이는 불규칙적인 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다. 물론, 펜타펩티드가 없는 상태에서 배양된 샘플에서 발견된 세포들과 비교할 때 OGP(10-14)는 단순히 배지에서 IMF 샘플의 뼈 골수 구조 및 세포 충실성을 보존하기만 한다는 것을 배제할 수 없을 수도 있다. 그러나, 천연 상태의 세포에서 발견된 것과 비교될 때 몇몇 OGP(10-14) 배양된 샘플에서의 보존된 또는 심지어 증가된 세포 충실성은 펩티드의 증식 활성을 시사해 준다. 현재, OGP가 혈액 선구 물질에 직접적으로 작용하는지 또는 간질 세포를 통하여 또는 다른 세포 군집을 통하여 작용하는지에 대하여 명확하지 않지만, 적어도 형태상의 수준에서 OGP의 활성은 미시 환경(microenvironment)의 현저한 리모델링에 대하여 무관한 것으로 나타난다.

이러한 관찰로부터 나타나는 한가지 암시 사항은 OGP(10-14)는 사실상 시험관 내에서 인간 조혈 세포의 세 가지 계통의 증식을 향상시킬 수 있다는 점이다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분으로서 위에서 기술된 올리고 펩티드 또는 그러한 올리고 펩티드를 포함하고, 이러한 올리고펩티드는 약학적으로 수용 가능한 캐리어, 부형제(excipient) 또는 안정제 및 선택적으로 다른 치료적 구성성분 내에 존재한다. 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정제는 투여량 및 사용된 농도에서 수용자에 대하여 독성을 가지지 않으며, 인산염 버퍼 염수 및 그와 같이 생리학적으로 수용 가능한 버퍼와 같은 버퍼 및 보다 일반적으로 당해 업계에 공지된 모든 적당한 캐리어, 부형제 및 안정제를 포함한다, 즉 약학적 조성물에 대한 향, 색깔, 활성(lubrication) 및 그와 같은 것들을 추가하기 위한 목적을 가진 여러 가지 성분을 포함한다.

캐리어는 녹말(starch) 및 그들의 유도체, 셀룰로스 및 그들의 유도체를 포함한다, 즉 미정질 셀룰로스, 크사탄 검(xantham gum) 및 그와 같은 것을 포함한다. 윤활제(lubracants)는 수소화된 비버향(hydrogenated castor) 및 그와 같은 것을 포함할 수 있다.

적절한 버퍼링 제제는 포스페이트 버퍼 염수 용액(phosphate-buffered saline solution:PBS)이 되며, 이 PBS는 또한 삼투압을 위하여 조절될 수 있다.

적절한 약학적 조성물(formulation)은 캐리어를 가지지 않은 것이다. 이러한 조성물은 주사의 투여에 적절하게 사용되고, 이러한 투여에는 정맥 주사가 포함된다.

약학적 조성물의 제조는 당해 업계에 공지되어 있고 많은 기사 및 문헌에 기술되어 있으며, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A.R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvannia, 1990 및 특별히 이 문헌의 1521-1712쪽이 참조로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 단위 형태(dosage units forms)로 제조될 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 지속적인 방출 기기(sustained release devices)를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야의 공지된 임의의 방법을 통하여 제조될 수 있다. 그러한 투여 형태는 본래 독성을 가지지 않으며 치료적 효과를 가지지 않은 생리학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함한다. 그러한 캐리어의 예는 이온 교환체(ion exchangers), 알루미나(alumina), 알루미늄 스테아르산염, 렉티신(lectithin), 인간의 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염(phosphates)과 같은 버퍼 물질, 글리신, 소르브 산(sorbic acid), 칼륨 소르빈산염(potassium sorbate), 포화된 식물성 지방 산의 부분 글리세리드, 물,소금(salts), 또는 프로타민 황산염(protamine sulfate)과 같은 전해물, 다이나트륨 수소 인삼염(disodium hydrogen phosphate), 칼륨 수소 인산염(potassium hydrogen phosphate), 나트륨 클로라이드(sodium chloride), 아연 염(zinc salts), 콜로이드성 실리카(colloidal silica), 마그네슘 트리실리케이트(magnesium trisilicate), 폴리비닐 피로리돈(polyvinyl pyrrolidone), 셀룰로스 기초 물질(cellulose-based substances) 및 PEG를 포함한다. 이러한 폴리펩티드의 전형적 또는 겔-기초 형태를 위한 캐리어는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스(sodiumcarboxymethylcellulose) 또는 메틸셀룰로스와 같은 폴리사카라이드(polysaccharides), 폴리비닐피로이돈, 폴리아크릴레이트(polyacrylatsts), 폴리옥시에틸렌 블록 폴리머(polyoxyethylene-block polymers), PEG를 포함하고, 목질부(wood)는 알코올이 된다. 모든 투여를 위하여, 공지의 저장 형태는 적당하게 사용된다. 그러한 형태는 예를 들어 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀(liposomes), 플라스터(plasters), 흡입 형태(inhalation forms), 코 스프레이(nose spray), 설하 정제(sublingual tablets) 및 유지 방출 제조(sustanined-release preparations)을 포함한다.

유지 방출 제조의 적당한 실시 예는 본 발명에 따른 올리고펩티드를 포함하는 고체성 비 친수성(hydrophobic) 폴리머의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 외형을 구비한 약품 형태가 된다, 즉 필름 또는 마이크로-캡슐과 같은 형태를 이룬다. 유지 방출 메트릭스의 실시 예는 폴리에스테르, 히드로겔, US 특허 번호 3,377,919에서 기술된 것과 같은 폴리락티드(polylactides) 및 L-글루타민 산 및 감마-에틸-L-클루타민 산 염(glutamate)의 코폴리머(copolymers), 분해되지 않는 에틸렌-비닐 아세테이트, Lupron Depots(등록상표)와 같은 분해성 락틱 산-글리콜릭 산 코폴리머(락틱 산-글리콜릭산 코폴리머 및 루프로라이드 아시테이트(leuprolide acitate)로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-하이드록시부틸 산을 포함한다. 에틸렌비닐 아세테이트 및 락틱 산-글리콜 산과 같은 폴리머는 100일 이상 동안 분자들의 방출이 가능한 반면, 몇몇 하이드로겔은보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡술화된 경우, 펩티드는 장시간 동안 체내에 남아 있어 37℃의 습기에게 노출되면 변성되거나 집합체를 형성할 수 있으며, 이러한 경우 생물학적 활성 및 면역성에 있어서 가능한 변화 기능을 상실할 수 있다. 합리적인 방법이 관련된 매커니즘에 의존하도록 안정화를 위하여 고안될 수 있다. 예를 들어, 집합체 구조가 황-이황화물(thio-disulfide) 상호 교환을 통한 분자 상호간의 S-S 결합(bond)인 것으로 밝혀지면, 안정화(stabilization)는 설피드릴 잔여기(sulfhydryl residues)를 변형시키거나, 산 용액으로부터 감압하에 동결 건조하거나(lyophilizing), 습기 내용물을 제어하거나, 적당한 첨가물을 사용하거나 특이적 폴리머 메트릭스 조성물을 개발하는 것에 의하여 이루어질 수 있다.

유지 방출(sustained-release) 올리고 펩티드 및 특별히 sOGP(10-14) 조성물은 또한 리포솜 형태로(lipsomally) 포획된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 포함하는 리포솜(lipsomes)은 당해 업계에서 공지된 방법에 의하여 제조되며, 예를 들어 이러한 방법은 Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:3688-3692);Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4030(1980); US 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기술되어 있다. 일반적으로, 리포솜은 작은(약 200-800 Angstroms) 단일라멜라(unilamelar) 형태를 가지며 이러한 형태에서 지질 성분은 약 30 mol.% 콜레스테롤(cholesterol)보다 큰 값을 가지며, 이러한 선택된 비율은 최적의 폴리펩티드 치료를 위하여 조절될 수 있다. 향상된 순환 시간을 가지는 리포솜은 US 특허 번호 5,013,56에 기술되어 있다.

올리고 펩티드의 치료 제제형(formulations)은 선택적 생리학적 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정제[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed.,(1980)]을 이용하여 필요한 수준의 순도를 가지는 이러한 폴리펩티드를 혼합하여 감압 하에 동결 건조된 케이크 형태 또는 수용성 용액(aqueous solutions)의 형태로 만드는 것에 의하여 저장을 위하여 제조된다. 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 독성을 가지지 않으며,그리고 인산염, 구연산염(citrate) 및 다른 유기 산; 아스코르브 산을 포함하는 산화방지제; 적은 분자량(약 10 레지듀(residues) 보다 작은) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역 알부민과 같은 단백질; 폴리비닐피로리돈과 같은 친수성 폴리머;글리신,글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노 산;모노사카라이드, 다이사카라이드(disaccharides) 및 글루코스, 만노스(mannose) 또는 텍스트린을 포함하는 다른 사카라이드; EDTA와 같은 키레이팅 제제(chelating agents); 만니톨(mannitol) 및 소르비톨(sorbitol)과 같은 슈가 알코올; 나트륨과 같은 슬레이트 형성 카운터 이온(counter-oins); 및/또는 투윈(Tween), Pluronics(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비-이온성 계면 활성제(surfactants)를 포함한다.

올리고 펩티드는 또한 제조된 마이크로-캡술 내에 포획될 수 있으며, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합 반응(interfacial polymerization)(예를 들어 하드록시에틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메스아실레이트(methylmethacylate)) 마이크로 캡슐의 형태과 같은 형태로 각각 이루어지는 경우)에 의하여 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜(liposomes), 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자(nanoparticles) 및 나노캡슐의 형태) 또는 매크로에멀젼(macroemulsions) 형태로 제조된다 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, ibid에 기술되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 필요한 환자에 대하여 적절하게 매일 한 차례의 사용을 위하여 제조되고, 적절하게 약 0.001부터 50 nmol의 활성 성분의 투여를 포함하고, 보다 적절하게는 약 0.05부터 25 nmol의 투여를, 가장 적절하게는 약 0.1로부터 10nmol의 투여를 포함한다.

기술된 올리고펩티드에 추가하여 본 발명의 이식-지지 성분은 추가적으로 다른 치료 성분을 선택적으로 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 치료 성분으로서 예를 들어 IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF 및 GM-CSF(과립백혈구매크로파지 클로니 자극 인자)와 같은 공지의 하나 또는 그 이상의 사이토킨이 될 수 있다. 그러한 추가적인 성분이 본 발명의 조성물에 결합된 경우, 뼈 골수 이식을 지지하기 위한 본 발명의 조성물의 효과는 시너지적으로(synergistically) 증가될 수 있다.

두 번째 특징으로서, 본 발명은 위에서 기술된 올리고 펩티드, 특히 각각 서열 번호:1, 2, 3, 4로 표시되는 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 나타내는 것 중의 어느 하나의 사용과 관련되며, 이러한 올리고펩티드는 뼈 골수 이식, 조혈 재구성, 뼈 골수 재 구성 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 조성물의 제조에 사용된다.

추가적으로, 본 명세서에서 기술된 올리고펩티드는 뼈 골수 이식의 접목을 가속시키고, 이식된 간 세포의 증식을 향상시키고 이로 인하여 적혈구를 포함하는 모든 형태의 조혈 세포의 이용 가능성을 증가시키고 이로 인하여 적어도 여러 주 동안 이러한 세포를 이용하는 숙주를 지지할 필요성을 피할 수 있는 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 간질 세포수의 증가 및/또는 조혈 작용을 지지하는 간질 세포 유도 인자의 발현에 의하여 발현 간질 세포 조혈 미시환경을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 조혈 작용을 지지하는 인자들에 대한 수용체의 조혈 작용 간 세포 발현을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 숙주 뼈 골수에 대한 정맥 주사로서 투여되는 뼈 골수 이식의 "귀환(homing)"을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다; BMT 후에 혈액 세포충실성의 회복을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 감소된 세포 수를 이용하여 성공적인 이식을 가능하게 하고 이로 인하여 기증자로부터 (복합적(multiple)) 골수 추출의 수를 감소시키고 그리고 10-15 ml(1000 ml 대신)의 소량으로 이식의 이용을 가능하도록 하는 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 기증자의 말초 혈관에 있는 조혈 전능성 및/또는 복합적인 능력을 가진 간 세포의 수를 증가시키고, 이로인하여 말초 혈관으로부터 이식성 간 세포의 수를 실행성을 향상시키는 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 이식을 위하여 이용도기 위한 장기간에 걸친 뼈 골수 배지에서 시험관 내에서의 조혈 간 세포의 수를 증가시키고 그리고 또한 백혈병 환자로부터 타가 이식(allografts)에 있는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 화학적- 및/또는 방사선 치료 후에 골수 및 혈액 세포 충실성을 내생적인(endogenous) 회복을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다; 그리고 MBT 또는 화학적- 및/또는 방사성 치료 요법 후에 잔류 매크로파지(resident macrophages)의 군집성(population)의 회복을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다.

본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 조성물의 치료를 위한 투여량은 당연히 환자 그룹(나이, 성별 기타 등등), 치료되어야 할 조건의 성질에 따라 다양해지고 그리고 사용된 특정 올리고 펩티드 및 투여 경로에 따라 다양해 질 것이다. 임의의 경우에 있어서, 치료 투여량은 관여된 의사에 의하여 결정될 것이다.

투여를 위한 임의의 적당한 경로는 포유 동물, 특히 인간에 대하여 본 발명에 따른 효과적인 투여량의 폴리펩티드를 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 정맥 주사, 피하 주사 및 경구를 통한 투여가 적절할 것이다.

적절한 실시 예로서, 이러한 올리고 펩티드는 순환성 다혈통 선친 세포 비율을 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조를 위하여 사용된다. 이러한 다혈통 선친 세포는 순환성 초기 선구 물질 CD34 양성 세포가 되고, 그리고 보다 적절하게는 CD34/Flk2 이중 양성 세포(double positive cells)가 된다.

위에서 기술된 것과 같은 "조혈 간/선친 세포(hematopoietic stem/progenitor cell)" 또는 "초생적 조혈 세포(primitive hematopoietic cell)"는 보다 위임성이 강한(more committed) 또는 성숙한 혈액 세포 형태를 형성하기 위하여 분화할 수 있는 세포가 된다. "조혈 간 세포" 또는 "간 세포"는 구체적으로 장기간 동안 치명적으로 방사선에 노출된 숙주의 접목(engraftment)이 가능한 것이 된다.

"CD34⁺세포 군집(cell population)"은 조혈 간 세포를 위하여 풍부해진다. CD34⁺세포 군집은 예를 들어 배꼽(umblical) 혈액 또는 뼈 골수로부터 얻어질 수 있다. 인간 배꼽 다발 혈액(umbilical cord blood) CD34⁺세포는 제조자의 지시에 따라 Miltenyi(Calfornia)사에 의하여 판매되는 면역학적 비드(immunomagnetic beads)를 사용하여 선택될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 약학적 조성물의 제조를 위하여 사용되는 올리고펩티드는 성숙한 세포 및 단핵 세포 회복을 향상시키고 BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유닛(CFU) 중의 어느 하나를 선택적으로 증가시킬 수 있다.

따라서, 그러한 올리고펩티드는 백혈구(WBC), 순환성 조혈 간 세포의 수를 증가시키고 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 뼈 골수 이식을 지지하기 위한 약학적 조성물의 제조에서 이러한 올리고펩티드의 사용 방법을 제공한다. 이러한 효과는 간 세포의 수를 증가시키고, 뼈 골수의 이식 시에 조혈 재구성을 가속화시키고 그리고 뼈 골수의 세포 충실성을 증가시키는데 있어 올리고펩티드의 활성으로 인한 것이다.

또 다른 구체적인 적절한 실시 형태에 따르면, 본 발명은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및 형성 부전의 빈혈을 겪고 있는 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에서 상기 올리고 펩티드의 사용과 관련된다. 보다 구체적으로, 조혈 장애는 임파종(lymphomas),백혈병(leukemias),홉킨스 병(Hodgkin's diseases) 및 척수종식성(myeloproliferative) 질병이 될 수 있다. 특별히, 척수 종식성 질병은 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)이 될 수 있다.

세 번째 특징으로서, 본 발명은 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 재 구성 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 필요한 환자에 대하여 위에서 기술된 것과 같은 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 유효량의 올리고 펩티드 또는 본 발명의 조성물의 투여를 하는 것을포함한다.

다른 실시 형태에 따르면, 본 발명은 화학적 치료 또는 방사선 치료를 받는 환자에 대하여 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키는 방법을 제공한다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 효과적인 양의 올리고펩티드 또는 조성물은 뼈 골시 이식의 접목을 향상시키거나 또는 포유 동물의 말초 혈액 세포로부터 조혈 선구 세포에 선행하는 포유 동물에 있는 조혈 간 세포의 동원성(mobilization) 및/또는 증식을 자극하기 위하여 사용될 수 있다.

이러한 특징을 가진 구체적인 실시 예에 따르면, 본 발명은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 장애 또는 형성 부전 빈혈증을 겪고 있는 환자를 치료하기 위한 방법과 관련되고 이러한 치료 방법은 조혈 세포의 생산에 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드 또는 본 발명에 따른 올리고 펩티드를 포함하는 조성물을 치료에 대하여 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 방식으로 이루어진다

또 다른 구체적인 실시 형태에서, 이러한 방법은 뼈 골수 이식에 의하여 환자의 치료를 지지하는 데 사용될 수 있다.

치료적 응용을 위하여, 본 발명에 따른 유용한 올리고 펩티드 또는 약학적 조성물은 생리학적으로 수용 가능한 투여량으로 포유 동물, 적절하게는 인간에게 투여될 수 있고, 인간에게 일정한 시간에 걸쳐 환약 형태로 또는 연속적인 주입에 의하여 정맥 주사로서 투여 될 수 있는 것을 포함한다. 투여의 다른 형태는 근육 내(intramuscular), 복막 내(intraperitoneal), 뇌 척수 내(intra-cerebrospinal), 피하 주사로(subcutaneous), 관절 내(intra-articular), 활액 내(intrasynovial), 포막 내(intathecal), 경구 또는 국소성(topical) 경로를 포함할 수 있다. 올리고펩티드 또는 본 발명에 따른 조성물은 또한 또는 체계적인 치료 효과를 가지도록 할 뿐만 아니라 국소적으로 작용하도록 하기 위하여 종양 내로(intratumoral), 종양 근처에(peritumoral), 손상된 부위 내로(intralesional) 또는 손상된 부위 근처(perilesional)로의 경로 또는 임파액(lymph)에 적절하게 투여될 수 있다.

생체 내 투여를 위하여 사용되는 올리고 펩티드 또는 약학적 조성물은 살균되어야 한다. 이러한 살균은 살균 여과 막(sterile filtration membranes)을 통한 여과에 의하여 용이하게 이루어질 수 있고 이러한 여과는 감압 하의 동결 건조(lypophillization) 및 재구성(reconstitution) 전에 행해진다. 올리고펩티드는 용액 내에 저장될 수 있다. 치료용 올리고 펩티드 조성물은 일반적으로 살균 가능 포트(a sterile access port), 예를 들어 피하 주사용 바늘이 관통할 수 있는 스토퍼가 설치된 정맥 주사 용액 백(intravenous solution bag) 또는 물약 병(vial)을 가지는 용기 내에 담겨진다.

치료를 위하여 사용될 수 있는 본 발명에 따른 올리고 펩티드 또는 조성물의 임의의 "효과적인 양(effective amount)"은 예를 들어 치료 대상, 투여 경로, 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 최적의 치료 효과를 얻기 위하여 필요에 따라 치료 전문가가 투여량을 적정 농도량으로 조절하고(titer) 투여 경로를 수정하는 것이 요구될 것이다. 전형적으로, 임상자(clinician)는 요구되는 효과를 얻을 수 있는 투여량에 이를 때까지 올리고 펩티드를 투여할 것이다. 체계적 치료를 위하여 매일 이루어지는 전형적 투여는 0.001 nmol/Kg로부터 50 nmol/Kg 또는 그 이상이 될 수 있지만, 이러한 양은 위에서 언급한 것과 같은 여러 가지 인자에 따라 달라진다.

또 다른 구체적인 실시 형태는 이식을 행하는 환자의 치료와 관련되고, 이러한 경우에 생체 외로 행해지는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법의 경우, 이식을 위한 세포는 이식 전 본 발명에 따른 올리고 펩티드 또는 조성물의 효과적인 양으로 직접 영향을 받게 된다(exposure).

이식을 위한 충분한 양의 조혈 간 세포를 얻기 위한 현행의 이용 가능한 가장 일반적인 방법은 바늘 또는 주사기(syringe)를 이용하여 기증자의 뼈 내의 여러 장소로부터 1 리터 또는 그 이상의 골수 조직을 추출하는 것이며, 이러한 과정에서 일반적으로 마취가 행해진다. 동종 이계성(allogeneic) BMT의 기증자는 일반적으로 조직 형태가 적합성을 가지는 자손(siblings)이 되고 때때로 HLA 혈병(typing)에 의하여 수용자(recipient)에게 결합될 수 있는 관련성이 없는(unrelated) 기증자가 된다. HLA 결합(matching)을 위한 필요성을 제거할 수 있는 자기 이식(autologous transplants)은 충실성 종양의 제거를 위한 절제 방사선 화학 요법 치료(ablative chemoradiotherapy)를 행하는 환자에게 사용될 수 있다. 자가 이식성 간 세포는 또한 출생 시 탯줄 혈액(the umbilical cord blood)으로부터 채취되어 장래의 투여를 위하여 저장될 수 있다.

이식 후 및 기증자-유도 기능성 골수(a donor-derived functioning marrow)의 정착 전에 BMT를 호스팅하는 환자는 그들을 감염(infections)에게 노출시킨 일시적으로 표시된 범혈구 감소증(pancytopenia)이 나타난다. 박테리아성 및 균성(fungal) 감염의 발생은 범혈구 감소증의 격심한 및 지속성 양쪽 모두에게 관련된다[Slavin, S. and Nagler, A., Transplantation(1992)]. 유사한 이유로서, CSF는 적혈구 생성 및 혈소판 형성을 지지하는데 실패한다.

조혈 작용을 유지하는 올리고 펩티드는 또한 다른 방법에 있어서도 유용한 것으로 판명되었다. 몇몇 연구자는 뼈 골수로부터의 간 세포에게 말초 혈액으로부터의 간세포를 추가하는 것은 접목을 현저하게 증가시키고 말초 혈액으로부터 충분한 수의 간 세포를 추출하는 것은 복잡한 절차라는 것을 발견했다. 혈액 내 간 세포의 수를 증가시키기 위하여 기증자에게 그러한 올리고 펩티드를 투여하는 것은 말초 혈액으로부터 간 세포의 이식의 실행성을 향상시킬 것이다[Golde, D.W., Sci.Am. 36 December(1991)].

조혈 작용을 위한 필수적인 요소 및 그로 인한 성공적 BMT는 조혈 작용의 미시적 환경과 조화되고 순환으로부터 뼈 골수로의 주사된 간 세포의 귀환(homing)을 결정하고 그리고 조혈 작용을 지지할 수 있는 기능성 간질 세포 및 조직의 존재이다[Waston, J.D. and McKenna, H.J. Int. J. Cell Cloning 10:144(1992)]. 간질 조직으로부터 유도된 뼈 골수는 또한 시험관 내에서 장기간 뼈 골수 배지의 시험관 내에서 간 세포를 유지하는 조건을 제공한다. 지금까지, 이러한 기술은 간 세포가 살아있는 것으로 유지하기에 충분하다. 이러한 배지(cultures)에 조혈 작용을 하는 적당한 올리고 펩티드를 추가하는 것은 시험관 내에서 간 세포의 군집을 증식시키는 것을 돕고, 이것은 이식을 위한 이러한 세포의 수를 증가시키도록 만든다.

시험관 내/생체 내(in vitro/in-vivo)의 조합된 접근은 장래의 전망적인 방법의 기초를 제공하고 이는 (i) 기증자 혈액 또는 골수로부터 소량의 간 세포 제조를 얻고 (ii) 심각한 질병을 치료하기 위하여 이러한 세포가 요구될 때 그들의 간 세포를 가지는 건강한 각각의 개인들과 이로 인하여 동종 이계성 BMT의 사용과 관련된 복잡성을 회피하는 방법의 기초를 의미한다.

그러므로, 현행의 응용에 있어 기술된 올리고 펩티드와 같은 소량의 펩티드를 사용하는 것은 치료에 대하여 중요한 요소가 되고, 이러한 올리고 펩티드는 중요한 구성 요소가 되는 섬유 조직 뼈 및 뼈 세포의 조혈 작용 미시환경을 생체 내, 생채 외 및/또는 시험관 내에서 향상시키는 것에 의하여 후기-BMT 조혈 재구성을 자극한다. 그러한 펩티드는 또한 BMT가 필수적으로 포함되지 않은 자발적인 발생 또는 유도된 골수 억제(myelosuppression) 상태에서 조혈 작용을 지지할 것이다.

현행의 적용에 있어서 기술된 올리고 펩티드 및 적절하게 펜타펩티드 OGP(10-14)는 초기 조혈 선구 물질의 수준에서 직접적으로 작용하는 것으로 나타난다(즉, 조혈 간/선친 세포). 그러한 증식된 간 세포 군집은 골수 형성, 적혈구 형성(즉, 비장(splenic)의 적혈구 생성) 및 임파구 생성(lymphopoiesis)의 원천(source)으로서 역할을 한다. 따라서, 이러한 올리고 펩티드는 시험관 내 또는 생체 내 어느 쪽에 대하여 조혈 간/선친 세포의 증식 및/또는 유지를 자극하기 위하여 사용될 수 있다(즉, 조혈 질병 또는 장애를 치료하기 위하여 사용될 수 있다).

그러므로, 적절한 실시 형태는 조혈 간/선치 세포의 증식을 향상시키는 방법과 관련된다. 본 발명에 따르면, 이러한 방법은 위에서 기술된 것처럼 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 효과적인 양의 올리고 펩티드에게 또는 이러한 올리고 펩티드를 포함하는 효과적인 양의 조성물에게 이러한 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라, 이러한 노출은 상기 세포의 증식을 향상시키는 데 있어 효과적이다.

"세포의 증식을 향상시키는 것(enhancing proliferation of a cell)"이란 용어는 시험관 내 또는 생체 내 어느 하나에 대하여 성장 및/또는 재생산의 범위를 증가시키는 단계를 포함한다. 세포 배지에서 세포 증식의 증가는 관련된 분자에 대한 노출 전 및 후에 세포의 수를 계산하는 것에 의하여 탐지될 수 있다. 증식의 범위는 군집의 정도(the degree of confluency)의 현미경적 시험을 통하여 양적으로 나타낼 수 있다. 세포 증식은 또한 티미딘(a thymidine) 또는 BrdU 결합 분석을 사용하여 양적으로 나타낼 수 있다.

구체적인 적절한 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 CD34 양성 세포, 적절하게는 Flk2 양성 세포의 증식을 향상시키기 위하여 사용된다.

올리고펩티드 또는 본 발명의 조성물은 생체 내 또는 생체 외에서 조혈 간/선친 세포의 수 및/또는 증식 및/또는 분화 및/또는 유지를 향상시키는 데 유용하며 이러한 세포의 군집을 증식시키고 그리고 포유 동물에서 복합 계통의 그러한 세포 및 혈액 세포의 증식을 향상시킨다.

하나의 구체적인 적절한 실시 형태로서, 이러한 세포는 세포의 배지 내에 존재하며, 그로 인하여 이러한 세포는 생체 외/ 생체 내 방법이 될 수 있다.

다른 방법으로, 본 발명의 방법은 생체 내 치료 방법으로 사용될 수 있으며,이는 치료된 세포가 포유 동물 내에 존재하는 경우에 해당한다.

"치료(treatment)"는 치료적 처리 및 예방적 또는 방지적인 처방 모두를 의미한다. 치료의 필요에 있는 사람은 질병 또는 장애가 방지되어야 할 사람뿐만 아니라 질병 또는 장애를 이미 가진 사람을 포함한다.

치료 목적의 "포유 동물(mammal)"이란 인간, 가정 또는 농장의 동물 및 동물원, 게임장 또는 애완 동물을 포함하여 포유 동물로 분류된 모든 동물을 포함하고, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등이 이에 속한다. 적절하게 포유 동물은 인간이다.

구체적인 실시 예에서, 본 발명의 방법에 의하여 치료된 포유 동물은 화학적 요법, 방사선 치료 요법, 뼈 골수 이식 치료 또는 다른 임의의 치료로 인하여 또는 자연 발생적인 원인으로부터 야기된 감소된 혈액 세포 수준을 겪고 있거나 영향을 받기 쉬운 동물이다.

화학적- 및 방사선 치료는 암 환자에 있어서 혈액 세포의 군집을 격심하게 감소하도록 만든다. 적어도 500,000명의 암환자가 매년 미구 및 유럽에서 화학적 치료 및 방사선 치료를 받고 있고 또 다른 200, 000명의 암환자가 일본에서 그러한 치료를 받고 있다. 형성 부전 빈혈증, 주요한 면역 결핍증(primaryimmunodeficiency), 심한 백혈병 및 충실성 종양에 있어 뼈 골수 이식 치료의 평가는 의료 센터에 의하여 보다 광범위하게 실시되고 있다. 적어도 15,000명의 미국인은 매년 뼈 골수 이식을 받는다. 다른 질병은 전체적인 또는 특정한 혈액 세포 계통의 감소를 초래한다. 이러한 상태에 대한 실례는 빈혈증(anemia)(큰 적혈구 (macrocytic) 및 형성 부전 빈혈증을 포함한다); 혈소판 감소증(thrombocytopenia); 형성 부전(hypoplasia); 면역(자가 면역) 혈소판 감소 자반병(purpur)(ITP); 및 HIV 유도 ITP를 포함한다. 약학적 생성물은 이러한 환자의 혈액 세포 군집의 재구성을 향상시키기 위하여 필요한 경우이다.

따라서, 본발명의 목적은 초생의 조혈세포의 증식 및/또는 분화 및/또는 유지를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 그러한 방법은 조혈 간 세포 및 이로 인하여 성숙한 혈액 세포 계통의 증식을 향상시키기 위하여 유용할 수 있다. 이러한 것은 포유 동물이 질병, 방사선 또는 화학적 치료 요법의 결과로서 조혈 또는 성숙한 혈액 세포의 감소를 겪고 있는 경우에 필요하다. 이러한 방법은 또한 생체 외에서 그러한 조혈 세포로부터 그러한 간 세포 및 혈개 세포 계통의 증식된 군집을 발생시키기 위하여 유용하다.

또 다른 적절한 실시 형태로서, 본 발명은 시험관 내/생체 외에서 간 세포의 유지 및/또는 증식시키기 위한 방법과 관련된다. 이러한 방법은 혈액 샘플로부터 말초 혈액 세포를 분리시키는 것, CD34 안티겐을 발현하는 혈액 선구 세포를 풍부하게 하는 것, 적당한 조건 아래에서 풍부하게 된 혈액 선구 세포를 분산시키는 것(cluttering), 및 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드 또는 본 발명에 따라 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드를 효과적인 성분으로서 포함하는 조성물을 이용하여 상기와 같은 세포를 치료하는 것을 포함한다.

특정한 실시 예로서, 본 발명의 방법은 사이토킨에게 치료된 세포를 노출시키는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 제한되지 않는 실시 예로서, 그러한 사이토킨은 TPO(트롬보포이에틴:Thrombopoitin), EPO(에리스로포이에틴:Erythropoietin), M-CSF(매크로파지-콜로니 자극 인자:Macrophage-colony stimulating factor), GM-CSF(과립백혈구-매크로파지(granulocyte-macrophage)-CSF), G-CSF(과립백혈구 CSF), IL-1(인터류킨-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12, LIF(류키미아 억제 인자:Leukemia inhibitory factor) 및 KL(키트 리간드:kit ligand)로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

생체 내 치료에 대한 실시 예로서, 본 발명은 포유 동물 내에서 혈액 세포를 증식시키기 위하여 사용된다. 이러한 방법은 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 유효량의 올리고 펩티드 또는 본 발명에 따른 유효량의 조성물을 치료를 위하여 상기 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 조혈 세포는적혈구(erythroid), 골수 조직(myeloid) 및 임파절상 조직(lymphoid cell)을 만드는 세포 중의 임의의 하나가 될 수 있다.

"임파절상 조직 혈액 세포 계통(lymphoid boood cell lineages)"는 림프구(B-세포 또는 T-세포)를 형성하기 위하여 분화하는 이러한 조혈 선구 세포를 말한다. 마찬가지로 "임파구 생성(lymphopoiesis)"은 림프구를 형성하는 것을 말한다.

"적혈구 형성 혈액 세포 계통(erythroid blood cell lineages)"는 분화하여 적혈구(적혈구 혈액 세포:red blood cells)를 형성하는 이러한 조혈 선구 세포를 의미하고 "적혈구 생성(erythropoiesis)"는 적혈구를 형성하는 것을 말한다.

본 명세서에서 제시된 목적을 위하여 "골수 형성 혈액 세포 계통(myeloid blood cell lineages)"는 위에서 정의된 것과 같은 임파절상 조직 형성 및 적혈구 형성 혈액 세포 계통과 다른 모든 조혈 선구 세포를 포함하고, 그리고 "골수 형성 작용(myelopoiesis)"는 혈액 세포의 형성(림프구 및 적혈구와는 다른)을 포함한다.

개시되고 기술된 것처럼, 본 발명은 특정한 실시 예, 진행 단계 및 그러한 진행 단계로서 본 명세서에서 개시된 물질에 제한되지 않고, 이러한 물질은 다소간 다양한 형태가 될 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용된 전문 용어(terminology)는단지 특정한 실시 형태를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것으로 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구한 및 그들의 균등물에만 한정되므로 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 것으로서 단수 형태의 표현은 그 내용이 명확하게 달리 규정되지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로서 주의되어야 한다.

뒤따르는 본 발명의 명세서 및 청구항 전체를 통하여, 그 내용에서 다른 것을 필요로 하지 않은 한, "포함한다"라는 용어는 그에 대한 다른 표현으로서 "가지는" 및 "포함하는"이란 용어는 기술된 수(integer) 또는 단계 또는 그룹을 모두 포섭하는(inclusion) 것으로 이해되어야 하며 수들(ingegers) 또는 단계들 또는 그룹들 중의 임의의 것을 제외하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

아래의 실시 예들은 본 발명의 특징을 실행하기 위하여 발명자에 의하여 사용된 기술을 대표하는 것이다. 이러한 기술은 본 발명을 실행하기 위한 적절한 실시 형태에 대한 예가 되는 반면 당업자는 본 발명의 관점에서 본 발명의 사상 및 의도된 범위를 벗어나지 않고 많은 변형 발명을 만들 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

첫 번째 특징으로서, 본 발명은 조혈 세포의 생성에 대하여 자극 활성을 가지는 적어도 하나의 올리고 펩티드를 유효한 구성 인자로서 포함하는 약학적 조성물과 관련된다. 본 발명에 따라 사용된 올리고펩티드는 200 내지 1000 Da의 분자량을 가지고 아미노 산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Try-Gly-Phe-Gly-gly 중의 어느 하나를 포함하는 올리고펩티드가 될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 수용 가능한 캐리어, 희석제 또는 부형제(carrier, diluent or excipient)를 선택적으로 포함한다.

본 발명에 따른 하나의 적절한 실시 예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly의 형태로 표현되는(OGP(10-14)로 표시됨) 펜타펩티드가 되는 올리고펩티드 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함한다.

다른 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 Tyr-Gly-Phe-His-Gly로 표현되는 펜타펩티드인 올리고 펩티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 Gly-Phe-Gly-Gly로 표현되는 테트라펩티드인 올리고펩티드 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 아미노산 서열 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly을 포함하는 올리고펩티드 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함하고, 이러한 약학적 조성물에는 메티오닌 잔기(methionine residue)가 적절하게 아실레이트화가 되고(acylated), 이러한 결과로서 올리고펩티드는 Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 표현된다.

본 발명의 약학적 조성물은 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용된다.

또 다른 실시 형태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 뼈 골수 이식, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용되고, 특히 화학요법 및 방사선 요법의 치료를 받는 환자에 대하여 사용된다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용되는 올리고펩티드는 순환성 다혈통 선친 세포 비율(circulating multilineage progenitor cell percentage)을 증가시킨다. 이러한 다혈통 선구 세포는 순환성 초기 선구 물질 CD34 양성 세포이다.

추가적으로, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효한 성분으로서 사용되는 올리고펩티드는 미성숙 세포 및 단핵 세포의 회복을 향상시키고 BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유니트(CFU)중의 어느 하나를 선택적으로 증가시킨다.

그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 전체적인 뼈 골수 및 혈액 세포충실성 뿐만 아니라 백혈구(white blood cells:WBC), 순환성 조혈 간 세포의 수를 증가시키기 위하여 사용된다.

구체적으로 적절한 실시 형태로서, 본 발명의 조성물은 뼈 골수 이식을 유지하기 위하여 사용된다. 이러한 효과는 조혈 간 세포의 수를 증가시키고, 뼈 골수 이식의 경우에 조혈 재구성을 가속화시키고 뼈 골수의 전체적인 세포충실성을 향상시키는 것에 대한 올리고펩티드의 활성으로 인한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 적절한 실시 형태에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 장애(immunological disorders) 및/또는 무형성 빈혈(aplastic anemia)을 겪고있는 뼈 골수 이식된 환자를 치료하기 위하여 사용된다. 보다 구체적으로, 조혈 장애는 임파종(lymphomas),백혈병(leukemias),홉킨스 병(Hodgkin's diseases) 및 척수종식성(myeloproliferative) 질병이 될 수 있다. 특별히, 척수 종식성 질병은 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)이 될 수 있다.

두 번째 특징으로서, 본 발명은 아미노 산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-PHe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly 중의 어느 하나를 포함하고 뼈 골수 이식, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 자극시키는 것을 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 사용과 관련된다.

구체적인 실시 형태로서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용되고, 특별히 방사성 요법 및 화학 요법의 치료를 받는 환자에 대하여 사용된다.

본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 특이적 올리고 펩티드는 순환성 다혈통 선친 세포의 수를 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다. 이러한 다혈통 선친 세포는 순환성 초기 선구 물질 CD34 양성 세포이다.

추가적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 제조에서 사용되는 올리고펩티드는 미성숙 세포, 단세포 회복을 향상시키고 BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유니트(CFU) 중의 어느 하나의 선택적인 증가를 위하여 사용된다.

따라서, 상기와 같은 올리고펩티드는 백혈구(WBC), 순환성 조혈 간 세포, 및/또는 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 뼈 골수 이식을 유지하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용에 관한 것을 제공한다. 이러한 효과는 뼈 골수 이식의 경우 간 세포의 수를 증가시키고, 조혈 재구성을 가속화시키는 것 및 뼈 골수의 세포충실성을 증가시키는 것에 대한 올리고펩티드의 활성으로 인한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 적절한 실시 형태에 따르면, 본 발명은 약학적 조성물의 제조에 있어서 상기 올리고펩티드의 사용과 관련되고, 이러한 약학적 조성물은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및/또는 무형성 빈혈을 겪고 있는 환자를 치료하기 위하여 사용된다. 보다 구체적으로, 조혈 장애는 임파종(lymphomas),백혈병(leukemias),홉킨스 병(Hodgkin's diseases) 및 척수 종식성 (myeloproliferative) 질병이 될 수 있다. 특별히, 척수 종식성 질병은 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)이 될 수 있다.

세 번째 특징으로서, 본 발명은 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용된다. 이러한 방법은 위와 같은 작용이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 올리고펩티드의 유효량은 위에서 기술된 것과 같은 조혈 세포 또는 본 발명의 조성물의 생산에 대하여 자극 활성을 가진다. 본 발명의 이러한 방법은 뼈 골수 이식, 조혈 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용되고, 특히 화학요법 및 방사선 요법의 치료를 받는 환자에 대하여 본 발명의 적절한 실시 형태에 따라 사용된다.

이러한 특징의 구체적인 실시 형태에 따르면, 본 발명은 조혈 장애, 충실성 종양, 면역 장애 또는 무형성 빈혈을 겪고 있는 환자를 치료하기 위한 방법과 관련된다. 본 발명에 따른 방법은 위에서 기술한 것과 같은 조혈 세포의 생산에 대한 자극 활성을 가지는 치료를 위한 유효량의 올리고 펩티드를 환자에게 투여하거나 이러한 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 구체적인 실시 형태에 따르면, 이러한 방법은 뼈 골수 이식에 의한 환자의 치료을 유지하기 위하여 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 조혈 장애는 임파종(lymphomas),백혈병(leukemias),홉킨스 병(Hodgkin's diseases) 및 척수종식성(myeloproliferative) 질병이 될 수 있다. 특별히, 척수 종식성 질병은 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)이 될 수 있다.

적절한 실시 형태는 조혈 간/선친 세포의 수를 향상시키기 위한 방법과 관련된다. 본 발명에 따르면, 이러한 방법은 위에서 기술한 것과 같은 조혈 세포의 생산에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고펩티드의 유효량을 이러한 세포에게 노출시키는 단계 또는 올리고 펩티드를 포함하는 조성물을 이러한 세포에게 노출시키는 단계를 포함한다.

보다 구체적인 적절한 실시 형태로서, 본 발명의 방법은 CD34 양성 세포의증식을 향상시키기 위하여 사용된다.

보다 구체적인 하나의 실시 형태로서, 세포는 세포 배양지(cell culture)에 존재하며 이러한 방법은 생체 외 또는 시험관 내에서 사용될 수 있다.

대안으로서, 본 발명의 방법은 생체 내에서 치료 방법으로 사용될 수 있고, 적절하게 표유 동물에 대하여, 특별히 인간에 대하여 사용될 수 있다.

치료되는 환자는 감소된 혈액 세포로 인한 장애를 가지거나 민감하게 영향을 받는 환자들이며, 이러한 것들은 화학요법, 방사선 요법 또는 뼈 골수 이식 치료로 인하여 야기될 수 있다.

또 다른 실시 형태로서, 본 발명은 혈액 샘플 내에 존재하는 조혈 간 세포를 유지하거나 및/또는 증식시키기 위한 생체 외 또는 시험관 내의 방법과 관련된다. 이러한 방법은 말초 혈액 세포를 혈액 샘플로부터 분리시키고, CD 34 안티겐을 발현시키는 혈액 선친 세포를 충분하도록 만들고, 적당한 조건 하에서 상기 충분하게 만들어진 혈액 선친 세포를 분산시키고(cluttering), 그리고 위에서 기술된 것과 같은 조혈 세포의 생산에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 이러한 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 이용하여 상기 세포를 치료하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 생체 내의 치료는 포유 동물에 있어서 혈액 세포를 증식시키는 것과 관련된다. 이러한 방법은 위에서 기술된 것과 같은 조혈 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드 또는 이러한 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 치료를 위한 유효량으로 상기 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 조혈 세포는 적혈구 세포(erythroid cell), 골수 세포(myeloid cell) 또는 임파 세포(lymphoid cell)가 될 수 있다.

실시 예

시약(reagents)

1. 골수 형성 성장 펩티드(10-14)[Osteogenic Growth Peptide(10-14):sOGP(10-14)]의 C-말단 펜타 펩티드: Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly;M.W.499.7(염기 서열 번호:1)을 Polypeptides Laboratories Inc.(Torrance, California 90503 USA Batch No.9712-006)를 통하여 준비하였다.

2. CFA-시클로포스파미드(cyclophosphamide)(CFA, SIGMA, 5 mg/mouse)가 골수 제거의 유도를 위하여 사용되었다.

3. 덱스트 종 유사 매개체(dexter-like medium):McCoy's Medium(Gibco-Life technologies, USA)는 12.5% 태아 상태의 보바인 혈청(bovine serum)(FBS, Hyclone, Holland), 12.5% 말 혈청(HS, Sigma, St Louis, MO), 0.8% 필수적 및 0.4%의 필수적이지 않은 아미노 산(Gibco-Life technologies, USA), 1% 글루타민(Sigma, St Louis, MO), 콜린,엽산(folic acid), 이노시톨(inositol), 니코틴아미드(nicotinamide), 피리독살(pyridoxal) HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, D-Ca 팬토테네이트(pantothenate)를 포함하는 0.4% 비타민(Gibco-Life technologies, USA), 1% 앰포테리신 B(amphotericine B)(Fungizone Bristol-Myers Squibb), 1% 젠타미신(gentamicine), 및 10^-6M 하이드로코티손(hydrocortisone)을 포함하고, 이는 재조합 인간 과립백혈구-단핵세포 콜로니 자극 인자(rhGM-CSF 10 ng/mL, Sandoz, Switzerland), 재조합 인간 인터류킨-3(rhIL-3 10 ng/mL, Calbiochem, USA) 및 재조합 인간 적혈구 생성 촉진 인자(erythropoietin)(rhEpo 2 units/mL, Sigma, St Louis, Mo)의 존재 하에 포함되고 이에는 sOGP(10-14)(Abiogen Pharma SpA Research Laboratories)가 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

4. E.D.T.A 산 버퍼(Mielodec, Bio Optica, Milan, Italy).

동물

* ICR 수컷 생쥐가 Charles River's(Italy)로부터 구입되어 특정한 병원균이 없는 상태로 유지되었다.

*CV57 블랙 수컷 생쥐가 Hebrew University Medical School(Jerusalem, Israel)의 동물 이용소로부터 구해졌다. 이들 각 계통의 생쥐는 실험실에 도착했을 때 25g의 몸무게를 가졌다.

통계적 분석

그룹 사이의 비교는 Fisher's PLSD, 인자적(factorial) 또는 반복적 측정, 표분 편차 분석(ANOVA)을 사용하여 행해졌다. Mann-Whitney 테스트가 사용되고 이는 콜로니 분석을 위한 것이다.

실시 예 1

뼈 골수 이식의 접목에 미치는 OGP(10-14)의 효과(effect of OGP(10-14) on engraftment of bone marrow transplant)

물질 및 방법

CV57 블랙 수컷 생쥐가 뼈 골수 이식의 접목에 미치는 OGP(10-14)의 가능한 효과를 조사하기 위하여 사용되었다. 인산염 버퍼 염수 내에 있는 OGP(10-14)가 12일 동안 10 ㎕ 주사량으로 매일 피하 주사에 의하여 투여되었다. 매일 투여량은 쥐 한 마리 당 0.0001부터 10 nmol의 범위가 된다. 대조 생쥐는 단지 인산염 버퍼 염수만을 투여하였다. OGP(10-14) 치료의 시작 후 8일째 되는 날 생쥐는 단일(a single) 900 rad dose를 구성하는 X-ray 방사를⁶⁰Co를 소스(source)로 하여 전신에 투사하였다(Picker C-9, 102.5 rad/min). 이는 10⁵선택되지 않은 선천성 뼈 골수 세포의 정맥 주사에 의하여 곧바로 이어졌다. 상기 생쥐는 OGP(10-14) 치료를 시작한 후 14일째 되는 날 연구를 위하여 죽였고, 양쪽 대퇴부가 절개되고 그들의 골단(ephiphyseal) 끝이 제거되었다. 뼈 골수가 인산염 버퍼 염수(PBS) 내에서 완전히 세척되었다. 단일 세포 서스펜션이 단계적인 주사기 바늘을 통하여 여러 번 표본(preparation)을 당기는 것에 의하여 준비되고 세포는 혈구 계산기(hemocytometer) 내에서 그 수가 계산되었다.

결과

도 1은 후기-방사선 조사/후기-이식 전체 대퇴부 뼈 골수 세포의 수에 미치는 OGP(10-14)의 자극 효과를 도시한 것이다. 이러한 효과는 PBS 제어(controls)에 대한 세포 계산에 있어서 통계적으로 의미를 가지는 2배의 증가(2-foldincrease)를 보여주고, 세 개의 가장 높은 투여량에서 이러한 투여 의존성을 나타내었다.

실시 예 2

OGP(10-14) 독성의 평가(evaluation of the OGP(10-14) toxicity)

위에서 나타난 것처럼, OGP(10-14)는 뼈 골수 이식의 접목을 향상시키는 것으로 나타났다. 그러므로, 추가적인 보다 상세한 상기 펩티드의 약리적 활성의 분석에 앞서 상기 펩티드의 가능한 독성이 다음으로 평가되었다.

55마리의 생쥐가 10 nmol/mouse의 투여량에서 피하 주사에 의한 투여가 이루어지고 15일 후에 가능한 OGP(10-14) 관련 독성을 위한 평가에 사용되었고, 그 결과가 30 플라시보-치료된 대조군(placebo-treated controls)으로부터 얻어진 것과 비교되었다. 아무런 차이점이 생존, 행동, 체중 증가 및 전체 실험과 관련하여 나타나지 않았다. 혈액학적 매개 변수와 관련하여, 펩티드의 보고된 투여는 백혈구 세포(WBC), 적혈구(RBC), 혈소판(PLT)의 수 또는 헤모글로빈(HB) 수준에 있어 어떤 현저한 변형을 유도하지 않았다.

실시 예 3

OGP(10-14)가 뼈 골수 화학적 제거 후 조혈 작용(hematopoietic)을 자극하는 것

물질 및 방법

일련의 실험에 있어서, 벼 골수 제거는 계속되는 이틀 동안("0번째 날(day 0)" 및 "첫번째 날(day 1)"로 표시됨) 150(1 sterile PBS)에서 5 mg/mouse 양의 클로로포파미드(CFA, SIGMA)를 복막 내에 주사하는 것에 의하여 유도되었다. 이러한 실험 계획(protocol)은 L.D.<30을 가진 정밀하고 가역적인 백혈구 감소(leucopoena)를 초래하는 것을 보여주었다[Spangrude, G.J.et al, Science, 241:58(1998)]. 가장 낮은 뼈 골수 세포 수는 첫 번째 주사 후 6번째날로 기록되었다.

WBC 분화 세포 수에 미치는 OGP(10-14)의 영향을 평가하고 및 추가적인 실험에서 사용되어야 할 OGP(10-14) "투여량의 선택(dose of choice)"을 결정하기 위하여, 도 2에 개략적으로 도시된 것처럼 OGP(10-14)가 없는 감염 매개체(OGP(10-14-free vehicle) 또는 서로 다른 OGP(10-14) 투여량을 포함하는 감염 매개체 0.1 ml가 피하 주사에 의하여 매일 치료되었다. 참조 기준 대조(reference baseline controls)의 한 그룹이 치료되지 않은 상태로 남겨지고 CFA도 투여되지 않았고 OGP(10-14)를 가지거나 가지지 않은 살균된 물 감염 매개체도 투여되지 않았다(도 2). 혈액이 레트로오비탈 출혈(retroorbital bleeding)에 의하여 -12, -4, +3, +7, +14, +17, +21 및 +24일째 날에 채취되었다(도 2C). 분화 세포 수 측정이 Coulter Conter(Syamex Microcell Counter F-800)를 사용하여 행해졌다.

혈액 내에 있는 이중 양성 CD34+/Sca-1+ 세포에 미치는 OGP(10-14)의 영향을 G-CSF의 것과 비교할수 있도록 실험하기 위하여, CFA 제거 생쥐가 -7일부터 +7일까지 10 nmol GOP(10-14)를 이용하여 매일 치료하였고 혈액 샘플이 흐름 혈구계산(flow cytometry)을 이용하여 +5, +7 및 +15일에 얻어졌다.

흐름 혈구 계산을 위하여, 생쥐로부터 세 개의 혈액 샘플 그룹이 울혈되도록 만들어지고(pooled), 단핵 세포(mononuclear)가 점진적인 원심 분리에 의하여 얻어지고 1 x 106/ml의 농도를 가진 PBS 내에서 다시 현탁되었다(resuspend). 이 세포는 그 다음 단계로 특이적 단일 세포성 항체(monoclonal antibodies)의 존재 하에서(마지막 희석 비율 1:10) 4℃에서 30분 동안 배양되었다. CD34+ 세포를 탐지하기 위하여 정제된 쥐 안티-마우스 단일 세포성 항체(purified rat anti-mouse monoclonal antibody)(Pharmingen, RAM34)가 최초 레이어로 사용되었다. 세 번의 세척 후, 세포는 PBS에서 다시 현탁되고 FITC 다클론성 염소 안티-렛(polyclonal goat anti-rat)(Pharmingen)을 이용하여 배양되었다. Sca-1+/CD34+ 세포를 탐지하기 위하여, 샘플이 추가로 PBS에서 세 번 세척되고 칼택(Caltag) 사의 쥐 안티-마우스 Sca-1(Ly.6A.2) PE를 이용하여 배양되었다. 관련성을 가지지 않은 면역글로빈으로 주요한 항체를 치환하는 것이 특이적 대조를 만들었다. 데이터 수집 및 분석은 Lysis II 소프트 웨어를 사용하여 FAC-Scan(tm)(Becton Dickinson) 흐름 계수기(flowcytometer)로 평가되었다(도 3).

OGP(10-14)의 서로 다른 투여 섭생(dosing regimens)을 평가하기 위하여, 도 4에 도시된 것처럼 화학적으로 제거된 생쥐에 대하여 매일 OGP(10-14)를 이용하여 치료하였다. +15째 되는 날 실험을 위하여 생쥐를 죽이고, 대퇴부 뼈 골수가 분출되고 단일 세포 서스펜션(위에서와 같은 방법으로 만들어진)에 대하여 생체 외 선친 세포(클로니 형성) 분석이 이루어졌다. CFU-GM, CFU-GEMM 및 BFU-E의 형성에 미치는 OGP(10-14)의 효과가 G-CSF의 효과와 비교되었다(도 4).

선친 세포 분석(progenitor cell assays)

뼈 골수 세포가 모든 그룹으로부터 CFA 주사 후 +10째 되는 날 회복되었다. 세포가 2% FBS를 이용하여 Iscove's Modified Dulbecco Medium(IMFM) 내에서 2x106/ml까지 희석되었고 제조자의 지시(MethoCult, StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada)에 따라 메틸셀룰로스 매개체에게 첨가되었다. 2x104 세포가 각각의 실험을 위하여 평판 배양되었다(plated). M3434(쥐과(murine) GM-CFU 및 GEMM-CFU를 위하여) 및 M3334(쥐과 BFU-E 분석을 위하여) 양쪽이 사용되었다. M3434는 재조합 뮤린 인터류킨-3(rmIL-3, 10 ng/ml), 재조합 인간 인터류킨-6(rhIL-6, 10 ng/ml), 재조합 뮤린 간 세포 인자(rmSCF, 50 ng/ml) 및 재조합 인간 적혈구 생성 인잔(rhEpo), 3 U/ml)을 이용하여 보충되었다. M3434에서 포함된 유일한 인자는 Epo가 된다. 각각의 생쥐를 위한 복제 시험(duplicate test)이 실험 계획 절차를 따른 배양 후 14일째 되는날 무작위적으로(blindly) 시험되었다.

결과

+3일째 날에 실행된 전체 및 분화된 WBC의 수 측정은 모든 CFA-치료된 그룹에서 현저한 감소를 보여주었다(도 2). 7일째 되는 날, 화학적으로 제거된 치료된 감염 매개체에서 전체 WBC 측정 수에 있어서 약 2배의 회복(2-fold recovery)을 보여주었고, 이는 여전히 치료되지 않은 참조 쥐에서 기록된 값에 비하여 현저하게 낮은 값이었다. 다른 한편으로, OGP(10-14) 동물은 시험된 모든 투여량에 대하여 보다 높은 값을 나타내었고, 10 nmol OGP(10-14)/day로 투여된 생쥐에서 가장 높은 측정 수를 보여주었다. 이러한 그룹에 있어서의 측정 값은 치료되지 않은 참조 그룹에서 측정 수 값에 매우 근접하였다. 7일째 되는 날 실행된 분화 세포 측정(differential cell counts)이 또한 단핵 세포 및 미성숙 세포 측정 수에 있어서 OGP(10-14) 유도된, 투여량 의존 증가를 제시해 주었다(도 2B, 2C). 최대 투여량(10 nmol)에서 단핵 세포(monocyte) 측정 수는 정상적인 참조 값과 비교할 때 6배로 높은 값이 되었다(도 2B); 미성숙 세포에 대한 이러한 값은 마찬가지로 참조 값에 비하여 현저하게 높은 것으로 나타났다(도 2C). 모든 동물 그룹에 있어서 전체 WBC 측정 수 값은 10일째 되는 날부터 그 이후로 정상적으로 되었다(도 2A). 그러나, 단핵 세포 측정 수는 여전히 14일째 되는 날(도 2B) 도달된 정상적인 수준을 가진 7일째 되는 날에 나타난 것과 동일한 경향을 보여주었다. 0.01 nmol 그룹을 제외한 모든 그룹에서 미성숙 세포 측정 수에 있어서 감소에도 불구하고, 가장 높은 값은 여전히 10 nmol 그룹에서 얻어졌다. 미성숙 세포 측정 수는 14일부터 그 이후로 모든 그룹에서 정상적으로 되었다(도 2C).

+5일째 되는 날 이중 양성 CD34+/Sca-1+의 양은 감염 매개체로만 치료된 생쥐에서 나타난 것에 비하여 OGP(10-14) 10 nmol을 이용하여 매일 치료된 화학적 제거된 동물에서 5배 높은 것으로 나타났다(도 3). OGP(10-14)dlm 효과는 G-CSF의 효과와 유사하였다. +7일째 및 +15일째 실행된 흐름 혈구 계산기 측정은 CD34+/Sca-1+ 세포의 수에 있어서 상당한 값을 나타내었다. 그러나, +15일째 되는 날, OGP(10-14) 치료된 생쥐는 감염 매개체 및 G-CSF 치료된 생쥐에 비하여 현저하게 높은 값을 보여주었다(도 3).

선친 세포 분석은 OGP(10-14)는 CFU-GEMM 및 BFU-E를 현저하게 자극하지만 CFU-GM에 대해서는 그러하지 않다는 것을 제시해 주었다. OGP의 효과는 치료의 시작이 7일째까지 화학적 제거를 선행하는 실시 예에서만 명확하게 나타났다(도 4). CFU-GM에 대한 OGP(10-14)의 효과의 부재는 혈액 과립백혈구 세포 측정 수에 대한 효과가 현저하지 않은 것과 일치한다. G-CSF는 단지 CFU-GM에 대해서만 효과를 가진다(도 4).

실시 예 4

OGP 10 -14는 개인 특이성 골수 섬유증(idiopathic myelofibrosis)을 가진 환자로부터 채취된 생채 외 샘플에서 조혈 뼈 골수 세포충실성을 회복시킨다.

물질 및 방법

인간에 대한 OGP(10-14)의 효능을 평가하기 위하여, 그것의 조혈 활성(hematopoietic activity)이 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)을 겪고 있는 환자로부터 얻어진 생체 외 뼈 골수 표본에서 연구되었다.

5명의 IMF 환자, 경피성 환자(scleroderma) 한사람과 다른 두 명의 다른 골수 형성 장애 증후군(myelodisplastic syndromes:MDS)을 가진 환자가 상세한 설명이 이루어진 동의 여부를 확인하여 연구를 위하여 등록이 되었다. IMF의 진단이 표준 임상적 및 혈액 병리학적 방법의 기초 하에 행해졌다(Barosi, G., et al., Br. J. Heamatol. 104:730-737(1999)]. 섬유증을 나타내는 뼈 골수 생체 검사가 필수적인 특징이 되었다. IMF의 진단이 다른 가능한 섬유증의 원인 및 다른 척수 증식성 장애의 존재를 배제한 후에 점진적으로 확립되었다. 특별히, 만성 척수 발생성 백혈병(chronic myelogenous leukaemia)의 진단은 Ph 크로모좀(chromosome) 및 bcr/abl 재배열(rearrangement)의 존재를 배제하는 것에 의하여 제외되었다. 다섯 명의 IMF 환자 중 세 명이 매달 10일 및 1(g 1,25(OH)2D3/day로 투여되는 낮은 투여량의 부설판(busulfan)으로 먼저 치료되었다. 환자에 대한 데이터를 표 1로 나타내었다.

표 1:IMF(A-E) 및 MDS(F-G) 환자의 임상적 데이터

환자	나이	진단데이터	ECOG	HB(g/dL)	PLT(X10^-8/L)	WBC(X10^-6/L)	LDHLD(U/L) *	Spleen(cm) **	치료
A	72	5/1998	0	10.4	131	15.0	740	17	치료되지않음
B	82	9/1998	2	8.5	434	11.2	830	20	치료됨
C	78	3/2000	2	8.2	68	1.3	664	20	치료되지않음
D	79	3/1990	3	6.8	60	7.3	763	30	치료됨
E	79	6/1995	1	10.0	189	4.5	666	18	치료되지 않음
F	65	4/1997	0	14.0	24	12.0	408	30	치료됨
G	65	2/2000	2				632	11	치료되지않음
H	40	3/2000	0	15	280	10	300	10	치료되지 않음

*, 정상 값:240-480 U/L

**, Ecografic measurement

3mm 길이의 뼈 골수 표본이 후부 우세 장골 척수골(posterior superior iliac spine)로부터 얻어지고 표본의 최소한의 변형을 보장하기 위하여 트랩(a trap)이 설치된 8 게이지 생체 검사 바늘을 이용하였다(TraoSystem MDThech, USA). 이 표본은 각각 1 cm의 길이를 가지는 세 개의 부분으로 나누어졌다. 임의적으로 선택된 한 부분이 예비적인 형태학상의 평가를 위하여 사용되었다. 나머지 두 개의 단편은 35 mm 조직 배양 접시에서 배양되었고, 37℃에서 10^-8M OGP(10-14) 5% CO₂-air를 가지거나 가지지 않은 rhSCF(50 ng/mL), rhGM-CSF(10 ng/mL), rhIL-3(10 ng/mL), 및 rhEpo(2 units/mL)의 존재 하에서 1 ml의 데스트 종 유사 매개체에 의하여 완전히 덮혀졌다. 매개체의 절반이 그것의 구성 성분을 변화시키지 않고 사치토킨 및 OGP(10-14) 초기 농도를 회복하지 않고 7일 후에 변화되었다. 배지에서 추가적인 7일이 지난 후, 이 뼈 골수 표본이 조직학적으로 진행되었다. 요약하면, 샘플들은 변형된(modified) B5에서 고정되고, E.D.T.A 산 버퍼 내에서 탈염되고(demineralized) 그리고 단편(sections)들이 김자(Giemsa), 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 또는 망상 조직의 실버 주입(silver impregnation of reticulum)을 이용하여 염색되었다. 뼈 골수 세포에서의 변화가 I부터 IV 스코어(score)에서 반-양적으로 평가되었다. 스코어 IV가 정상적인 것에 비견할 만한 세포-풍부(cell-rich) 뼈 골수 표본을 위하여 사용되었다; 스코어 III은 감소된 핵 밀도(nuclear density)를 가진 감소된 세포충실성을 나타내었다; 스코어 II 표본은 퍼져 있는 열공(spread lacunae)을 나타냈다; 스코어 I 표본에 있는 조혈성 세포는 극심한 결핍을 보여주었고 그리고/또는 뼈 골수 영역은 열공 영역에 의하여 상당한 범위까지 치환되었다. 샘플당 적어도 3개의 균등 분포된 형태적 단편(equispaced histological sections)이 전체 단편 영역을 사용하여 시험되었다. 추가적으로, 세포 밀도는 Leica.QWin 소프트웨어가 설치된 Lecica 현미경의 도움을 받는 컴퓨터를 사용하여 자동으로 평가되었고, 세포 측정 수와 뼈 골수 영역 사이의 비율로 평가되었다. 각각의 환자를 위한 결과는 치료되지 않은 표본에 대한 OGP(10-14) 치료된 표본에 있어서 평균 세포 밀도의 비율(T/C 비율)로서 표현되었다.

결과

배지에서 14일이 지난 후에, OGP(10-14)로서 치료된 벼 골수 표본은 동일한 환자에 대한 OGP(10-14)가 없는 표본에 비하여 조혈 세포(hematopoietic)에 있어서 더 풍부한 것으로 나타난다(도 5, 6). 반-양적으로 이루어진 스코어는 모든 IMF 환자에 있어서 현저하게 증가되었다(p<0.05). OGP(10-14) 치료된 표본과 IMF 환자가 아닌 치료되지 않은 표본 사이에 아무런 차이점도 탐지되어 않았다. 모든 IMF의 경우에 (p<0.01) T/C 비율>1로 나타난 컴퓨터 보조 세포 충실성 평가는 세포 수는 OGP(10-14)-처리된 표본에 있어서 증가하였다는 것을 강하게 나타내고 있다. 더욱이, T/C 비율은 각각의 환자로부터 얻어진 모든 쌍의 표본에 있어서 통계적으로 현저했다(도 2). T/C 비율은 환자의 헤모글로빈 수준과 매우 높고 현저한 역상관성을 보여주었다(도 7). 감소된 헤모글로빈 수준은 IMF의 심각함을 위한 가장 중요한 혈청학상의 지표(serological indicator)가 된다. 그들의 이러한 상관성은 OGP(10-14)의 효과는 가장 심각하게 영향을 받는 환자에 있어서 가장 높다.

표 2 : 컴퓨터 보조 세포 밀도의 평가

환자	T/C 비율	p 값
A	2.0	p<0.05
B	3.3	p<0.01
C	5.7	p<0.003
D	8.1	p<0.0002
E	1.8	p<0.025
F	1.2	p=NS
G	0.9	p=NS
H	1.1	p=NS

적혈구 생성 및 골수 형성 세포 사이의 비율은 OGP(10-14)를 이용하여 배양된 후에 명백하게 변화되지 않았다. 그러나, 반-양적 평가는 IMF 환자로부터 얻어진 표본에 있어서 거대핵모세포(megakaryocytes)의 수는 10배 감소가 되는 것으로 나타났다. 전체적인 혈구 생성 세포충실성의 경우에 있어, 차이는 IMF 환자가 아닌 사람으로부터 얻어진 샘플에서 발견되지 않았다.

이와 같은 특징을 가지는 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이러한 올리고펩티드를 유효성분으로서 포함하는 약학적 조성물은 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 모세포의 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 증식(re-population) 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 간 세포의 증식을 증가시키고, 뼈 골수 이식의 경우 혈액학적 재구성을 가속화시키고 그리고 뼈 골수의 세포충실성을 증가시키는 것에 의하여 뼈 골수 이식을 유지하기(supporting) 위하여 사용될 수 있다.

Claims

효과적인 성분으로서 조혈 모세포(hematopoietic cell)에 대하여 자극 활성을 가지는 적어도 하나의 올리고펩티드 및 약학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함하고, 상기 올리고 펩티드는 200 내지 1,000 Da의 분자량을 가지고 그리고 아미노 산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 표현되고 서열 번호(SEQ ID NO: 1, 2, 3 및 4로 각각 표시된 것 중의 어느 하나를 포함하는 조혈 모세포의 생산을 자극하기 위한 약학적 조성물(a pharmaceutical composition).
청구항 1에 있어서,

상기 올리고 펩티드는 아미노산 서열 번호 1로 표시되어 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly의 식(formula)을 가지는 펜타펩티드 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 올리고 펩티드는 아미노산 염기 서열 번호 2로 표시되어 Tyr-Gly-Phe-His-Gly의 식을 가지는 펜타펩티드 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 올리고펩티드는 아미노산 서열 번호 3으로 표시되어 Gly-Phe-Gly-Gly의 식을가지는 테트라펩티드 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 올리고펩티드는 아미노산 서열 번호 4로 표시되어 아미노 산 서열 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly를 포함하고, 선택적으로 아실레이트화(acylated) 되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서,

상기 올리고펩티드는 Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly의 식을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 하나에 있어서,

뼈 골수 이식의 접목, 조혈 모세포의 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 증식(re-population) 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 약학적 조성물.
청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 하나에 있어서,

방사선 치료 요법 또는 화학적 치료 요법을 받는 환자에 있어서, 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 모세포의 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 증식(re-population) 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 약학적 조성물.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,

상기 올리고펩티드는 순환성 다혈통 간 세포(circulating multilineage stem cell)의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 9에 있어서,

상기 다혈통 간 세포는 초기 선구 물질 CD34 양성 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 9에 있어서,

상기 다혈통 간 세포는 순환성 초기 선구 이중 양성 CD34/Flk2 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,

상기 올리고 펩티드는 미성숙 세포 및 단핵 세포(monocyte) 회복을 향상시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,

상기 올리고펩티드는 BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유닛(colony forming units:CFU) 중의 어느 하나를 선택적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,

백혈구(WBC), 순환성 조혈모 간세포의 수 및 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 증가시키는 위한 약학적 조성물.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,

간 세포의 증식을 증가시키고, 뼈 골수 이식의 경우 혈액학적 재구성을 가속화시키고 그리고 뼈 골수의 세포충실성을 증가시키는 것에 의하여 뼈 골수 이식을 유지하기(supporting) 위한 약학적 조성물.
청구항 15에 있어서,

혈액학적 장애, 충실성 종양, 면역성 장애 및 형성 부전의 빈혈(aplastic anemia)을 겪고 있는 뼈 골수 이식된 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물.
청구항 16에 있어서,

상기 혈액학적 장애는 임파종, 백혈병, 홉킨스 병 및 척수 증식성 장애로 구성되는 그룹으로부터 선택된 장애인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 16에 있어서,

상기 척수 증식성 장애는 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
뼈 골수 이식의 접목, 조혈 형성의 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어, 각각 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 표시되고 아미노산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 나타나는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드 중의 어느 하나의 사용.
방사선 치료 요법 또는 화학적 치료를 받는 환자에 대하여 뼈 골수 이식의 접목, 조혈 형성의 재구성(hematopoietic reconstruction), 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어, 각각 서열 번호 1, 2, 3 및 4로 표시되고 아미노산 서열 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly 및 Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly로 나타나는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드 중의 어느 하나의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

상기 올리고 펩티드는 상기 올리고 펩티드는 아미노산 서열 번호 1로 표시되어 Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly의 식(formula)을 가지는 펜타펩티드 인 것을 특징으로 올리고펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

상기 올리고 펩티드는 아미노산 염기 서열 번호 2로 표시되어 Tyr-Gly-Phe-His-Gly의 식을 가지는 펜타펩티드 인 것을 특징으로 하는 올리고펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

상기 올리고펩티드는 아미노 산 서열 번호 4로 표시되어 Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly의 식으로 가지는 헥사펩티드 인 것을 특징으로 하는 올리고펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

상기 올리고펩티드는 아미노산 서열 번호 3으로 표시되어 Gly-Phe-Gly-Gly의 식을 가지는 테트라펩티드 인 것을 특징으로 하는 올리고펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

순한성 다혈통 간 세포의 수를 증가시키기 위한 약학적 조성물의 제조인 것을 특징으로 하는 올리고 펩티드의 사용.
청구항 25에 있어서,

상기 순환성 다혈통 간 세포는 초기 선구 물질 CD34 양성 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 25에 있어서,

상기 다혈통 간 세포는 순환성 초기 선구 이중 양성 CD34/Flk2 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

미성숙 세포 및 단핵 세포(monocyte) 회복을 향상시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

BFU-E 및 GEMM 콜로니 형성 유닛(colony forming units:CFU) 중의 어느 하나를 선택적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

백혈구(WBC), 순환성 조혈모 간세포의 수 및 전체적인 뼈 골수 세포충실성을 증가시키는 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

간 세포의 증식을 증가시키고, 뼈 골수 이식의 경우 혈액학적 재구성을 가속화시키고 그리고 뼈 골수의 세포충실성을 증가시키는 것에 의하여 뼈 골수 이식을 유지하기(supporting) 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,

혈액학적 장애, 충실성 종양, 면역성 장애 및 형성 부전의 빈혈(aplastic anemia)을 겪고 있는 뼈 골수 이식된 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 32에 있어서,

상기 혈액학적 장애는 임파종, 백혈병, 홉킨스 병 및 척수 증식성 장애로 구성되는 그룹으로부터 선택된 장애인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
청구항 33에 있어서,

상기 척수 증식성 장애는 개인 특이성 골수 섬유증(IMF)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조에 있어서 올리고 펩티드의 사용.
뼈 골수 이식의 접목, 조혈의 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 방법에 있어서,

뼈 골수 이식의 접목, 조혈의 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시킬 필요가 있는 세포 또는 환자 중의 어느 하나에 대하여 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 하나의 항에서 규정된 것과 같은 조혈 형성 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고 펩티드를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
화학적 치료요법 또는 방사선 치료요법을 받는 환자에 대하여 뼈 골수 이식의 접목, 조혈의 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시키기 위한 방법에 있어서,

뼈 골수 이식의 접목, 조혈의 재구성, 뼈 골수 증식 및 순환성 간 세포의 수를 향상시킬 필요가 있는 세포 또는 환자 중의 어느 하나에 대하여 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나의 항에서 규정된 것과 같은 조혈 형성 세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고 펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고 펩티드를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
혈액학상의 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및 형성 부전 빈혈증을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법에 있어서,

청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나에서 규정된 것과 같은 조혈모세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 치료를 위한 유효향으로서 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈액학상의 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및 형성 부전의 빈혈증을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법.
혈액학상의 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및 형성 부전 빈혈증을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법에 있어서,

뼈 골수 이식으로 인한 환자의 치료를 유지하는 데 있어 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나에서 규정된 것과 같은 조혈모세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 치료를 위한 유효향으로서 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈액학상의 장애, 충실성 종양, 면역 장애 및 형성 부전의 빈혈증을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법.
청구항 37 또는 청구항 38에 있어서,

상기 혈액학상의 장애는 임파종, 백혈병, 홉킨스 병 및 척수 증식성 장애 중의 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 환자를 치료하는 방법.
청구항 39에 있어서,

상기 척수 증식성 장애는 개인 특이성 골수 섬유증(IMF) 인 것을 특징으로 하는 환자를 치료하는 방법.
이식 환자의 경우 격심환 이식 거부(rejectoion)을 감소시키기 위한 방법에 있어서,

청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나에서 규정된 조혈모세포에 대한 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 상기 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 이식 거부를 감소시키기 위한 방법.
청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나에서 규정된 조혈모세포의 형성에 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고펩티드를 포함하는 조성물을 유효량으로서 상기 세포에게 노출시키는 방법을 포함하는 조혈 형성 간 세포의 증식을 향상시키기 위한 방법.
청구항 42에 있어서,

상기 세포는 CD34 양성 세포 인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 43에 있어서,

상기 CD34 양성 세포는 Flk2 양성 세포 인 것을 특징으로 하는 방법.
혈액 샘플 내에서 시험관 내 및/또는 생체 외의 방법으로 간 세포 군집(stem cell population)을 유지하기 위한 및/또는 증식시키기 위한 방법에 있어서,

상기 혈액 샘프로부터 말초 혈액 세포를 분리시키고, CD34 안티겐을 발현시키는 혈액 선친 세포(blood progenitor cells)를 풍부하게 하고, 적당한 조건 아래에서 풍부화된 혈액 선친 세포를 분산시키고(cluttering), 청구항 1 또는 청구항 8 중의어느 하나에서 규정된 조혈모세포의 생산에 자극활성을 가지는 올리고펩티드를 이용하여 상기 세포를 치료하는 것을 포함하는 방법.
청구항 35 내지 청구항 45 중의 어느 하나에 있어서,

상기 세포를 적어도 하나의 사이토킨에게 노출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
청구항 46에 있어서,

상기 사이토킨은 TPO(트롬보포이에틴:Thrombopoietin), EPO(에리스로포이에틴:Erythropoietin), M-CSF(매크로파지-콜로니 자극 인자:Macrophage-colony stimulating factor), GM-CSF(과립백혈구-매크로파지-CSF), G-CSF(과립백혈구(Granulocyte) CSF), IL-1(인터류킨-1:Interleukin-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF(백혈병 억제 인자:Leukemia inhibitory factor) 및 KL(키트 리간드:Kit ligand) 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 41에 있어서,

상기 세포는 세포 배지(cell culture)에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 42에 있어서,

상기 혈액 샘플은 포유 동물 혈액 세포 인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 49에 있어서,

상기 혈액 샘플은 인간 혈액 샘플 인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 50에 있어서,

상기 혈액 샘플은 감소된 혈액 수준을 겪고 있거나 또는 감소된 혈액 수준에 민감하게 반응하는 포유 동물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 51에 있어서,

상기 감소된 혈액 수준은 화학적 치료 요법, 방사선 치료 또는 뼈 골수 이식 치료에 의하여 발생한 것을 특징으로 하는 방법.
포유 동물 내의 혈액 세포를 증식시키는 방법에 있어서,

청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 하나에서 규정된 조혈모세포에 대하여 자극 활성을 가지는 올리고펩티드 또는 유효 성분으로서 상기 올리고펩티드를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
청구항 53에 있어서,

상기 혈액 세포는 적혈구 생성, 골수 형성 및 임파절상 조직 세포 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.