HRP20040135A2 - Osteogenic growth oligopeptides as stimulants of hematoiesis - Google Patents

Description

Područje izuma

Ovaj se izum odnosi na uporabu oligopeptida koji odgovaraju C-terminalnom dijelu od OGP-a, kao stimulatora hematopoeze. Još specifičnije, ovi oligopeptidi pospješuju usađivanje transplantata koštane srži, rekonstrukciju hematopoeze, repopulaciju koštane srži i broj cirkulirajućih matičnih stanica, posebno nakon kemoterapije ili zračenja. Izum nadalje daje postupke za korištenje ovih oligopeptida i farmaceutskih sastava od kojih se sastoje.

Stanje tehnike

Biološke i biokemijske interakcije između kosti i koštane srži daleko su od toga da budu u potpunosti shvaćene. Međutim, posljednja izučavanja potvrđuju ulogu osteogenih stanica podrijetlom iz koštane srži u podržavanju razvoja hematopoetskih stanica [Teichman, R.S., et al., Hematol. 4:421-426 (2000)].

Izučavanja transplantacije koštane srži potvrđuju dvosmjerne interakcije između ova dva sistema. Ablacija koštane srži ili oštećenje od zračenja pokreću inicijalnu lokalnu, prolaznu osteogensku reakciju [Amsel, S., et al., Anat. Rec. 164:101-111 (1969); Patt, H.M., i Maloney, M.A., Exp. Hematol. 3:135-148 (1975)]. U ovoj osteogenskoj fazi u šupljini koštane srži oblikuju se trabekule. Ove su trabekule kratkotrajne i resorbiraju se za vrijeme rekonstitucije hematopoetske srži. Štoviše, u ljudskim donorima koštane srži zabilježen je porast u serumskim markerima za stvaranje kosti: osteokalcina i alkalne fosfataze, nakon odstranjivanja značajnog dijela koštane srži iliuma. [Foldes, J., et al., J. Bone Miner. Res. 4:643-646 (1989)]. Hipoteza da ljudski osteoblasti podupiru ljudske hematopoetske ishodišne stanice je vrlo intrigantna: ove stanice proizvode faktore koji izravno stimuliraju formiranje hematopoetskih kolonija, bez dodavanja egzogenih zaliha faktora rasta. Ustvari, osteoblasti izlučuju nekoliko citokina uključujući granulocitni faktor za stimulaciju kolonija (Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF), granulocitno-makrofagni faktor za stimulaciju kolonija (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF), faktor tumorske nekroze (Tumor Necrosis Factor, TNF) i interleukin 6 (IL-6). Uz to, kultivirani osteoblasti podupiru održavanje nezrelog fenotipa u hematopoetskim matičnim stanicama [Taichman, et al., Blood 87:518-524 (1996)].

Neki od ovih faktora rasta poboljšavaju in vivo repopulaciju koštane srži i mobilizaciju perifernih matičnih stanica nakon visoke doze kemoterapije. Među njima, G-CSF, GM-CSF, IL-3 (Interleukin-3) i faktor matičnih stanica (Stem Cell Factor, SCF), bili su ekstenzivno vrednovani [Bungart, B., et al., Br. J. Haematol. 76:174 (1990)]; Lant, T., et al., Blood 85:275 (1995); Brugger, W., et al., Blood 79:1193 (1992); Molinex, G., et al., Blood 78:961 (1991)] i mnogi drugi, kao što je FLT-3, se izučavaju za kliničku upotrebu [Ashihara, E., et al., Europ. J. Haematol. 60:86 (1998)]. Unapređenja u ovom području posljednjih godina, omogućila su razumijevanje nekoliko fizioloških aspekata funkcije koštane srži. Štoviše, mogućnost da se modulira diferencijacija i proliferacija hematoloških prekursora je u samoj osnovi novijih terapija, kao što su periferna transplantacija krvnih matičnih stanica, transfekcija gena i ex vivo ekspanzija matičnih stanica. Usprkos ovom impresivnom progresu, nekoliko aspekata fiziologije matičnih stanica nije još potpuno razjašnjeno, a nekoliko faktora, kako onih topivih ili onih u vezi sa staničnom membranom, su pod sumnjom da su uključeni u fiziološku ili patološku proliferaciju/diferencijaciju stanica koštane srži. Rastući broj faktora koji pokazuju moć da reguliraju hematopoezu podupire kritično pitanje s obzirom na redundanciju ili suptilnost regulatora hematopoeze [Metcaff, D., et al., Blood 82:3515 (1993)].

Dodatno ulozi klasično definiranih faktora rasta, nekoliko bioloških faktora i tipova stanica bi mogli poboljšati ili modificirati terapeutske strategije, kako in vivo, tako i ex vivo. Ljudske endotelijalne stanice porijeklom iz koštane srži podupiru dugoročnu proliferaciju i diferencijaciju mijeloidnih i megakariocitičnih preteča [Rafii, S., et al., Blood 86:3353 (1995)]; pomoćne stanice mogu poduprijeti hematološku obnovu nakon transplantacije koštane srži [Bonnet, D., et al., Bone Marrow Transpl. 23:203 (1991)]; i još interesantnije za predmetne svrhe, osteoblasti mogu pojačati usađivanje nakon HLA-nevezane transplantacije koštane srži u miševa [El-Badri, N.S., et al., Exp. Hematol. 26:110 (1998)].

Mnoge su kemijske strukture bile istražene da bi se procijenila moguća uloga u fiziologiji koštane srži. Na primjer, učinci glikozaminoglikana bili su evaluirani, kako u staničnim linijama izvedenim iz leukemije [Volpi, N., et al., Exp.Cell Res. 215:119 (1994)], tako i u klonogenskim testovima na ljudskim matičnim stanicama porijekla iz pupčane krvi [Da Prato, I., et al., Leuk. Res. 23:1015 (1999)]. Čak su i kratki peptidi bili sintetizirani, kako bi postigli hemoregulatorne i multilinijske učinke, moguće pojačavanjem produkcije citokina od stanica strome [King, A.G., et al., Exp. Hematol. 20(4):531 (1992); Pelus, L.M., et al., Exp. Hematol. 22:239 (1994)].

Idiopatska mijelofibroza (Idiopathic Myelofibrosis, IMF) je najmanje česta i nosi najgoru prognozu među svim kroničnim mijeloproliferativnim poremećajima. Primarni patogeni proces je klonski poremećaj hematopoetskih matičnih stanica, koji rezultira anemijom, atipičnom megakariocitnom hiperplazijom, splenomegalijom, i različitim stupnjevima ekstramedularne hematopoeze. Nasuprot tome, karakteristična proliferacija strome je jedan reaktivni fenomen, koji rezultira iz neodgovarajućeg oslobađanja faktora rasta porijeklom od megakariocita/krvnih pločica, uključujući, trombocitni faktor rasta (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), transformirajućeg faktora rasta beta (Transforming Growth Factor-beta, TGF-beta), bazičnog faktora rasta fibroblasta (Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF), epidermalnog faktora rasta (Epidermal Growth Factor, EGF) i kalmodulina [Groopman, J., Ann. Intern. Med. 92:857-858 (1980); Chvapil, M., Life Sci. 16:1345-1361 (1975)]. Srednje preživljavanje pacijenata od IMF je prosječno 4 godine. Terapeutske strategije kod IMF-a ostaju pretežno podržavajuće i usmjerene prema ublažavanju simptoma i poboljšanju kvalitete života. Najčešće su transfuzije krvi, androgeni i citoreduktivni čimbenici kao što je hidroksiurea. Transplantacija koštane srži se povećano uzima u razmatranje, ali se ona još uvijek treba smatrati ekperimentalnim pristupom. Interferon-alfa (IFN-alpha) pokazao je obećavajuće rezultate u ranim hiperproliferativnim fazama IMF-a, ali nema uopće, ili ima tek vrlo mali učinak u uznapredovalim fazama bolesti.

Prethodno su neki izumitelji pokazali, da peptid osteogenskog rasta (Osteogenic Growth Peptide, OGP), kao jedan peptid od 14-aminokiselina, koji je srodan jako postojanom H4 histonu, povećava celularnost krvi i koštane srži i pojačava usađivanje transplantata koštane srži u miševa [Bab, I.A., Clin. Orthop. 313:64 (1995); Gurevitch, O., et al., Blood 88:4719 (1996) i US patent br. 5,461,034]. OGP je izoliran iz osteogenske faze post-ablacijske regeneracije koštane srži [Bab, I., et al., Endocrinology, 128(5);2638 (1991)] i fiziološki je prisutan jako obilno u krvi, uglavnom kao jedan kompleks s α2-makroglobulinom (α2-M) [Gavish, H., et al., Biochemistry, 36:14883-14888 (1997)]. Kada se daje in vivo, on pojačava formiranje kosti i povećava trabekularnu masu kosti; in vitro, on stimulira proliferaciju i aktivnost alkalne fosfataze u osteogenim staničnim linijama; uz to, on djeluje mitogeno na fibroblaste [Greenberg, Z., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1178:273 (1993)]. Dodatno, uz aktivnosti OGP-a na regeneraciju kosti, aktivaciju osteoblasta i proliferaciju fibroblasta, pokazuje se da inducira, in vivo, uravnotežen porast broja bijelih krvnih stanica (White Blood Cell, WBC counts), i cjelokupnu celularnost koštane srži u miševa koji primaju mijeloablativno zračenje i singeničke ili semialogeničke transplantate koštane srži [Gurevitch, O., et al, ibid, (1996)].

C-terminalni pentapeptid OGP-a, označen kao OGP(10-14), za koji se čini da nastaje proteolitičkim cijepanjem OGP-a pune duljine, nakon disocijacije neaktivnog kompleksa s α2-M, je prisutan u serumu sisavca i osteogenim staničnim kulturama u visokim količinama [Bab, I., et al., J. Pept. Res. 54:408 (1999)]. N-terminalni modificirani OGP zadržava učinak ovisan o dozi sličan OGP-u na proliferaciju stanica, i sugerirano je da je karboksi-terminalni pentapeptid odgovoran za vezivanje na navodni OGP receptor [Greenberg, Z., et al., ibid. (1993)]. Dodatno, izumitelji su prethodno već pokazali da u osteogenim MC3T3 E1 stanicama, mitogene doze OGP-a(10-14), ali ne OGP-a, pojačavaju aktivnost MAP kinaze na način koji je zavisan o vremenu i o dozi. Ovi pronalasci upućuju da je OGP(10-14) odgovoran za signaliziranje niz struju [Gabarin, et al., J. Cell Biol. 81:594-603 (2001)]. Nadalje je bilo pokazano da je aktivni oblik OGP-a njegov karboksi-terminalni pentapeptid OGP(10-14). Zanimljivo je, da OGP(10-14) ne formira kompleks s α2-M ili drugim, OGP-veznim proteinima (OGP-Binding Protein, OGPBP) [Bab, I., J. Peptide Res. 54:408-414 (1999)].

Zbog toga se moguća hematopoetska aktivnost sintetičkih oligopeptida, analognih C-terminalnom području prirodnog OGP-a, evaluirala u ovom izumu. Neki takvi osteogeno aktivni specifični peptidi su opisani u US patentu br. 5,814,610. sOGP(10-14) je bio opisan da ima opijatnu i analgetičku aktivnost [Kharchenko et al., Vepr. Med. Khim., 35(2) 106-109, (1989)].

Važno je, da predmetni izum pokazuje da prethodno poznati osteogeno aktivni oligopeptidi mogu djelovati kao stimulansi hemopoetskog sustava. Na primjer, sintetički pentapeptid izveden iz OGP-a, i označen OGP(10-14) ima nekoliko svojstava, kao što su povećana celularnost krvi i koštane srži u miševa, te pojačano usađivanje transplantata koštane srži. Ovaj pentapeptid pokazao je značajnu aktivnost na perifernu obnovu krvnih stanica nakon aplazije inducirane ciklofosfamidom (CFA) i na mobilizaciju matičnih stanica. Nadalje, ex vivo učinak sintetičkog OGP(10-14) u uzorcima tkiva koštane srži iz pacijenata s IMF-om je testiran i pokazao je bitan cjelokupni porast broja hematopoetskih stanica. Štoviše, veličina učinka OGP-a(10-14) je izravno povezana sa žestinom IMF-a. Ovi rezultati upućuju da OGP(10-14) može stimulirati stvaranje krvnih stanica i spašavati hematopoezu.

Zbog toga je cilj ovog izuma uporaba oligopeptida, izvedenih iz OGP-a, kao hematopoetskih faktora rasta. Ovaj i drugi ciljevi izuma bit će elaborirani nadalje u nastavku opisa.

Izlaganje biti izuma

U prvom aspektu, izum se odnosi na farmaceutski sastav, koji kao učinkoviti sastojak sadrži barem jedan oligopeptid koji ima stimulativnu aktivnost na produkciju hematopoetskih stanica. Oligopeptid koji je korišten u skladu s izumom ima molekularnu masu od 200 do 1000 Da i može biti oligopeptid koji sadrži bilo koji od redoslijeda aminokiselina tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli. Farmaceutski sastavi ovog izuma neobavezno uključuju neki farmaceutski prihvatljivi nosilac, razrjeđivač ili ekscipijent.

U jednoj preferencijalnoj izvedbi ovog aspekta, farmaceutski sastav iz izuma sadrži jedan oligopeptid koji je pentapeptid i ima formulu: tir-gli-fe-gli-gli (nazvan OGP(10-14)) i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac.

U jednoj drugoj izvedbi, farmaceutski sastav iz izuma sadrži oligopeptid koji je jedan pentapeptid i ima formulu: tir-gli-fe-his-gli.

U još jednoj izvedbi, farmaceutski sastav iz izuma sadrži oligopeptid koji je jedan tetrapeptid i ima formulu: gli-fe-gli-gli i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac.

I u jednoj daljnjoj izvedbi, farmaceutski sastav iz izuma sadrži jedan oligopeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina: met-tir-gli-fe-gli-gli i neki farmaceutski prihvatljiv nosilac, u kojem je metioninski ostatak preferentno aciliran, dakle da je oligopetid formule: ac-met-tir-gli-fe-gli-gli.

Farmaceutski sastav iz ovog izuma je namijenjen pojačanju usađenosti transplantata koštane srži, rekonstrukciji hematopoeze, repopulaciji koštane srži i određenom broju cirkulirajućih matičnih stanica.

U drugoj izvedbi farmaceutski sastav izuma je namijenjen povećanju usađenosti transplantata koštane srži, rekonstrukciji hematopoeze, repopulaciji koštane srži i broju cirkulirajućih matičnih stanica, posebno kod pacijenata koji primaju kemoterapiju ili zračenje.

Oligopeptid koji se koristi u farmaceutskom sastavu ovog izuma povećava postotak cirkulirajućih multilinijskih ishodišnih stanica. Ove multilinijske ishodišne stanice su cirkulirajuće rane preteče CD34 pozitivnih stanica.

Nadalje, ovaj oligopeptid korišten kao djelotvorni sastojak u farmaceutskom sastavu izuma, pojačava obnovu nezrelih stanica i monocita i selektivno povećava bilo koju od BFU-E i GEMM jedinica za oblikovanje kolonija (Colony Forming Units, CFU).

Farmaceutski sastav izuma je zbog toga namijenjen povećanju broja bijelih krvnih stanica (White Blood Cells, WBC), cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica, kao i cjelokupnoj celularnosti koštane srži i krvi.

Kod specifično pogodne izvedbe, sastav ovog izuma je namijenjen potpori transplantacije koštane srži. Ovaj se učinak pripisuje aktivnosti oligopeptida na povećanje broja hematopoetskih matičnih stanica, ubrzavanje rekonstrukcije hematopoeze nakon transplantacije koštane srži i pojačanje cjelokupne celularnosti koštane srži.

U skladu s drugom, specifično povoljnom izvedbom, farmaceutski sastav izuma je namijenjen uporabi u liječenju subjekata kojima je transplantirana koštana srž, jer pate od hematoloških poremećaja, tumora čvrstih tkiva, imunoloških poremećaja i/ili aplastičkih anemija. Još specifičnije, hematološki poremećaji mogu biti limfomi, leukemije, Hodgkin-ove bolesti i mijeloproliferativni poremećaji. Posebno, mijeloprolefirativni poremećaj može biti idiopatska mijelofibroza (Idiopathic Myelofibrosis, IMF).

U drugom aspektu, ovaj se izum odnosi na uporabu oligonukleotida koji sadrže bilo koji od redoslijeda aminokiselina tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli, i met-tir-gli-fe-gli-gli u preparaciji farmaceutskog sastava namijenjenog pojačanju usadljivosti transplantata koštane srži, rekonstrukcji hematopoeze, repopulaciji koštane srži i stimulaciji broja cirkulirajućih matičnih stanica.

U jednoj posebnoj izvedbi oligonukleotidi iz izuma se koriste u pripremi farmaceutskog sastava namijenjenog pojačanju usađenosti transplantanta koštane srži, rekonstrukciji hematopoeze, repopulaciji koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica, posebno u pacijenata koji primaju zračenje ili kemoterapiju.

U skladu s pogodnom izvedbom, gornji specifični oligopeptidi se koriste za pripremanje farmaceutskog sastava za povećanje broja cirkulirajućih multilinijskih ishodišnih stanica. Ove multilinijske ishodišne stanice su cirkulirajuće rane preteče CD34 pozitivnih stanica.

Nadalje, oligopeptidi koji se koriste u pripremi farmaceutskog sastava izuma, povećavaju nezrelu stanicu, obnovu monocita i selektivno povećavaju bilo koju od BFU-E i GEMM jedinica za formiranje kolonija (Colony Forming Units, CFU).

U skladu s tim, takvi se oligopeptidi mogu koristiti za pripremanje farmaceutskog sastava namijenjenog povećavanju broja bijelih krvnih stanica (White Blood Cells, WBC), cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica i/ili cjelokupne celularnosti koštane srži.

Specifičnije, izum omogućuje uporabu ovih oligopeptida za pripremanje farmaceutskog sastava za potporu transplantacije koštane srži. Ovaj efekt se pripisuje aktivnosti oligopeptida na povećanje broja matičnih stanica, ubrzavanje rekonstrukcije hematopoeze nakon transplantacije koštane srži i povećanje celularnosti koštane srži.

U skladu s drugom specifično povoljnom izvedbom, predmetni se izum odnosi na uporabu navedenih oligopeptida u pripremanju farmaceutskog sastava koji je namijenjen liječenju subjekata koji pate od hematoloških poremećaja, tumora čvrstih tkiva, imunoloških poremećaja i/ili aplastičke anemije. Osobito, hematološki poremećaji mogu biti limfomi, leukemije, Hodgkin-ove bolesti ili mijeloproliferativni poremećaji, posebno idiopatska mijelofibroza (Idiopathic Myelofibrosis, IMF).

U trećem aspektu, predmetni izum daje postupak za pojačanje usađenosti transplantata koštane srži, rekonstrukciju hematopoeze, repopulaciju koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica. Ovaj postupak se sastoji od koraka davanja pacijentu, kojem je to potrebno, učinkovite količine oligopeptida koji imaju stimulativnu aktivnost na proizvodnju hematopoetskih stanica, kako je opisano gore, ili sastava izuma. Ovaj postupak iz izuma se može koristiti u skladu s pogodnom izvedbom za pojačanje usađenosti transplantata koštane srži, rekonstrukciju hematopoeze, repopulaciju koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica u pacijenta koji prima zračenje ili kemoterapiju.

U skladu sa specifičnom izvedbom ovog aspekta, izum se odnosi na postupak liječenja pacijenta koji pati od hematološkog poremećaja, tumora čvrstih tkiva, imunološkog poremećaja ili aplastičke anemije. Postupak iz izuma se sastoji od davanja pacijentu jedne terapeutski učinkovite količine nekog oligopeptida koji ima stimulativni učinak na produkciju hematopoetskih stanica opisanih gore, ili nekog sastava koji sadrži iste.

U drugoj specifičnoj izvedbi, ovaj se postupak može koristiti za potporu liječenju subjekta transplantacijom koštane srži.

Specifičnije, hematološki poremećaji mogu biti limfomi, leukemije, Hodgkin-ova bolest i mijeloproliferativni poremećaji, posebno idiopatska mijelofibroza (IMF).

Jedna pogodna izvedba se odnosi na postupak za povećanje broja hematopoetskih matičnih/ishodišnih stanica. U skladu s izumom, ovaj postupak sadrži korake izlaganja ovih stanica učinkovitoj količini oligopeptida koji ima stimulatornu aktivnost na produkciju hematopoetskih stanica, kako je gore opisano, ili sastavu koji sadrži isti.

U jednoj specifično pogodnoj izvedbi, postupak iz izuma je namijenjen pojačanju proliferacije CD34 pozitivnih stanica.

U jednoj specifično pogodnoj izvedbi, stanice su u staničnoj kulturi i postupak se može koristiti ex vivo ili in vitro.

Alternativno, postupak iz izuma se može koristiti kao postupak liječenja in vivo, pogodno sisavaca, posebno ljudi.

Subjekt kojeg se liječi je onaj koji pati od, ili je osjetljiv na smanjene razine krvnih stanica, što može biti izazvano kemoterapijom, liječenjem zračenjem, ili terapijom transplantacije koštane srži.

U još jednoj pogodnoj izvedbi, izum se odnosi na postupak za in vitro ili ex vivo održavanje i/ili pojačavanje hematopoetskih matičnih stanica prisutnih u uzorku krvi. Ovaj postupak uključuje izoliranje perifernih krvnih stanica iz uzorka krvi, obogaćivanje krvnih ishodišnih stanica koje izražavaju CD34 antigen, nagomilavanje obogaćenih krvnih ishodišnih stanica pod prikladnim uvjetima, i tretiranje navedenih stanica s oligopeptidom koji ima stimulativnu aktivnost na produkciju hematopoetskih stanica kako je gore opisano, ili sa sastavom koji sadrži isto.

Tretman in vivo u skladu s izumom se odnosi na postupak za repopulaciju krvnih stanica u nekog sisavca. Ovaj postupak sadrži korake davanja navedenom sisavcu jedne terapeutski učinkovite količine oligopeptida koji ima stimulativnu aktivnost na hematopoetske stanice kako je opisano gore, ili jednog sastava koji sadrži isto. Ove hematopoetske stanice mogu biti eritroidne, mijeloidne ili limfoidne stanice.

Kratki opis slika

Slika 1 - Učinak zavisan o dozi predtretmana sa sOGP(10-14) na ukupni broj stanica femoralne srži u miševa nakon kombinirane ablativne radioterapije/BMT

OGP(10-14) u označenoj dozi dnevno se subkutano injicirao tijekom 12 dana ženkama C57 BL miševa. Osmog dana nakon početka tretiranja s OGP(10-14), miševi su podvrgnuti zračenju rendgenskim zrakama od 900 Rad, čemu je slijedilo intravenozno davanje 105 singeničkih neselektiranih stanica koštane srži. Četrnaestog dana nakon početka tretmana miševi su žrtvovani i femoralna koštana srž se isprala u fosfatom puferiranoj fiziološkoj otopini. Pripremljena je suspenzija pojedinačnih stanica protiskivanjem pripravka nekoliko puta kroz igle graduiranih šprica. Brojenje stanica provodilo se u hemocitometru. C - kontrolnim miševima dana je samo fosfatom puferirana fiziološka otopina. Podaci su iskazani kao srednja vrijednost ± SE, a dobiveni u barem sedam miševa po određenom stanju. Kratice: Fem (femoral - bedreni), Marr C (marrow cells - stanice srži), D (day - dana), mou (mouse - miš), premed (premedication - prethodna medikacija), stimu (stimulation - stimulacija) i cellu (cellularity - celularnost).

Slike 2A-C - OGP(10-14) stimulira brojeve krvnih stanica na način koji je ovisan o dozi i o vremenu u miševa podvrgnutih kemoablaciji hematopoetskih tkiva

Mužjaci ICR miševa težine 25 g svaki, podvrgnuti su kemoablaciji koristeći ciklofosfamid (CFA), 5 mg/mišu, injiciran intraperitonealno na dane 0 i 1, jednom injekcijom svakog dana. OGP(10-14) je otopljen u "sterilnoj vodi za injekcije" i 0,1 ml označenih doza ili same vode (nosilac) davalo se subkutano u šiju dnevno od dana -7 do dana -1 i od dana +2 do dana +8. Podaci su srednja vrijednost ± SD, dobiveni od 20 životinja po svakom stanju. *: značajno preko CFA+nosilac, p<0,05; **: značajno preko 1 nmol OGP(10-14) skupina, p<0,05.

Slika 2A prikazuje ukupne brojeve bijelih krvnih zrnaca.

Slika 2B prikazuje ukupne brojeve monocita.

Slika 2C prikazuje ukupne brojeve nezrelih stanica.

Kratice: cont (control, untreated - kontrolno, netretirano), veh (vehicle - nosilac), ce (cell - stanica), T (time, days - vrijeme, u danima)

Slika 3 - OGP(10-14) stimulira broj cirkulirajućih dvostruko pozitivnih CD34+/Sca-1+ stanica u miševima podvrgnutim kemoablaciji hematopoetskih tkiva

Muški ICR miševi, težine 25 g svaki, bili su podvrgnuti kemoablaciji koristeći ciklofosfamid (CFA), 5 mg/po mišu, injiciran intraperitonealno na dane 0 i 1, po jednu injekciju svakog dana. OGP(10-14) otopljen je u "sterilnoj vodi za injekcije" pri koncentraciji 100 nmol/ml i 0,1 ml ove otopine ili samo vode (nosilac) davalo se supkutano u šiju dnevno od dana -7 do dana -1 i od dana +2 do dana +8. Ciklofosfamidom (CFA) ablatirani miševi tretirani sa 106 UI/0,1 ml G-CSF od dana +2 do +8 služili su kao pozitivna referenca. Podaci su srednja vrijednost ± SD (stupci s greškama su bili premali da bi se prikazali) dobiveni na 33 životinje po stanju.

Kratice: veh (vehicle - nosilac), T (time, days - vrijeme, u danima), *: značajno iznad CFA+nosilac, p<0,01.

Slike 4A-C - Učinak režima OGP(10-14) tretmana na ex vivo jedinice koje tvore kolonije porijeklom iz koštane srži miševa podvrgnutih kemoablaciji hematopoetskih tkiva

Muški ICR miševi, težine 25 g svaki, podvrgnuti su kemoablaciji koristeći ciklofosfamid (CFA), 5 mg/po mišu, injiciran intraperitonealno na dane 0 i 1, po jednu injekciju svakog dana. OGP(10-14) otopljen je u "sterilnoj vodi za injekcije" pri koncentraciji 100 nmol/ml i 0,1 ml ove otopine ili samo vode (nosilac) davano je supkutano u šiju dnevno tijekom označenog(ih) perioda. Koštana srž se ubirala na dan 9 i analizirala na jedinice za formiranje kolonija. Podaci su srednje vrijednosti ± SD dobiveni u 10 životinja po stanju.

Slika 4A prikazuje CFU-GM.

Slika 4B prikazuje CFU-GEMM.

Slika 4C prikazuje BFU-E.

Kratice: Colo/di (colonies/dish - kolonije/po zdjelici), Veh (vehicle - nosilac).

Slike 5A-B - Mikrofotografije biopsije koštane srži

Slika 5A prikazuje fotomikrografije dvaju dijelova uzorka koštane srži iz pacijenta s idiopatskom mijelofibrozom (IMF) kultiviranog ex vivo tijekom 14 dana u odsutnosti OGP(10-14).

Slika 5B prikazuje fotomikrografije dvaju dijelova uzorka koštane srži iz pacijenta s idiopatskom mijelofibrozom (IMF) kultiviranog ex vivo tijekom 14 dana u prisutnosti 108 M OGP(10-14). Obratite pozornost na povećanu gustoću stanica u uzorku kultiviranom s OGP(10-14).

Slike 6A-B - Mikrofotografije biopsije koštane srži

Slika 6A prikazuje fotomikrografije obojenih presjeka retikuluma iz dva dijela uzorka koštane srži iz pacijenta s idiopatskom mijelofibrozom (IMF) kultiviranog ex vivo tijekom 14 dana u odsutnosti OGP(10-14).

Slika 6B prikazuje fotomikrografije obojenih presjeka retikuluma iz dva dijela uzorka koštane srži iz pacijenta s idiopatskom mijelofibrozom (IMF) kultiviranog ex vivo tijekom 14 dana u prisutnosti 108 M OGP(10-14). Obratite pozornost na normalni izgled tkiva tretiranog s OGP(10-14).

Slika 7 - Regresijska analiza u IMF

Regresijska analiza u pacijenata s idiopatskom mijelofibrozom (IMF) između razine hemoglobina i ex vivo omjera broja hematopoetskih stanica u uzorcima tretiranim s OGP(10-14) prema netretiranim uzorcima (omjer T/C), upućuje na izravnu vezu između žestine IMF i učinka OGP(10-14).

Kratice: Hem (hemoglobin), Hemato (hematopoetski), rat (ratio - omjer), cellu (cellularity - celularnost).

Detaljni opis izuma

Brojni postupci u području biologije stanica i kemije peptida nisu ovdje detaljno opisani, budući da su dobro poznati stručnjacima iz ovog područja. Takvi postupci uključuju sintezu peptida i strukturnu analizu, diferencijalne brojeve stanica, analize razvrstavanja stanica, analizu formiranja kolonija i slične. Udžbenici koji opisuju takve postupke su na pr. Current Protocols in Immunology, Coligan et al., (izdavači), John Wiley&Sons. Inc., New York, NY i Stewart, J.M. i Young J.D., u: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, stranice 1-175 (1984). Ove publikacije su ovdje inkorporirane referencom u svojoj cjelokupnosti. Nadalje, neke imunološke tehnike nisu u svakom slučaju detaljno opisane, budući da su dobro poznate stručnjacima u ovom području.

Ovdje se koriste slijedeće kratice:

OGP(s) - polipeptid(i) osteogenog rasta (osteogenic growth polypeptide(s)).

OGPBP(s) - vezni protein(i) polipeptida osteogenog rasta (osteogenic growth polypeptide binding protein(s)).

sOGP - sintetički OGP (synthetic OGP).

WBC - bijele krvne stanice (white blood cells).

PBL - periferna krv (peripheral blood).

CFA - ciklofosfamid (cyclophosphamide).

BMT - transplantacija koštane srži (bone marrow transplantation).

IMF - idiopatska mijelofibroza (idiopatic myelofibrosis).

Nekoliko bi staničnih ili topivih činilaca moglo biti odgovorno za interakciju između kosti i stanica koštane srži. Ova interakcija čini se temeljnom za regulaciju angažiranja, proliferaciju i diferencijaciju hematopoetskih matičnih i ishodišnih stanica.

OGP povećeva osteogenezu i celularnost koštane srži [Greenberg, Z., et al., ibid. (1993); Gurevitch, O., et al., ibid. (1996)]. Štoviše, OGP je potentni mitogen za osteoblastičke i fibroblastičke stanice i stromalne stanice koštane srži [Greenberg, Z., et al., J. Cellular Biochem., 65:359-367 (1997); Robinson, D., et al., J. Bone Min. Res., 10:690-696 (1995)].

U osteoblastičkoj staničnoj liniji nedavno je izviješteno da OGP aktivira mitogenom-aktiviranu protein kinazu putem G-proteina koji je osjetljiv na pertusis toksin.

Izgleda da su ove aktivnosti ograničene na C-terminalni pentapeptid OGP(10-14) i zbog toga se predlagalo da je OGP(10-14) bioaktivni oblik od OGP [Bab, I., et al., ibid. (1999)]. OGP(10-14) bi mogao biti krajnje zanimljiv u svijetlu mogućeg korištenja in vivo, uzevši u razmatranje otsutnost imunogeničnosti i toksičnosti, i relativnu jednostavnost za proizvodnju i rukovanje ovim peptidom.

Prethodna izučavanja su demonstrirala, da je nakon dnevnih s.c. injekcija od 0,1 do 10 nmol OGP tijekom 2 tjedna u normalnim miševima, peptid inducirao porast veći od 50% u broju bijelih krvnih stanica (WBC counts) i približno 40% povećanje cjelokupne celularnosti koštane srži. [Gurevitch, O., et al., ibid., (1996)]. Proporcija različitih tipova stanica nije preinačena ovim tretmanom, što sugerira multilinearnu aktivnost na hematopoezu. Zanimljivo je, da u eksperimentu koji je ovdje opisan, nakon reverzibilne aplazije inducirane davanjem CFA (ciklofosfamida), miševi tretirani s OGP(10-14) su se oporavili brže od onih kojima je injiciran placebo, i to bez ikakve značajnije toksičnosti pri korištenim dozama.

Prema tome, u prvom aspektu ovaj izum se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži jedan učinkoviti sastojak barem jednog oligopeptida koji ima stimulativnu aktivnost na proizvodnju hematopoetskih stanica, pogodno koji ima redoslijede aminokiselina

tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli ili met-tir-gli-fe-gli-gli, također označene sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3 i 4, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac.

Proces formiranja krvnih stanica, čime se crvene i bijele krvne stanice zamjenjuju putem dijeljenja stanica lociranih u koštanoj srži, naziva se hematopoeza. Za pregledni opis hematopoeze vidi Dexter i Spooncer [Ann. Rev. Cell Biol., 3:423-441 (1987)].

Postoji mnogo različitih tipova krvnih stanica, koji pripadaju određenim staničnim lozama. Duž svake loze, postoje stanice u različitim stupnjevima sazrijevanja. Zrele krvne stanice su specijalizirane za različite funkcije. Na primjer, eritrociti su uključeni u transport O2 i CO2; T i B limfociti su uključeni u imune odgovore, posredovane stanicama, odnosno antitijelima; trombociti (ili krvne pločice) su potrebni za grušanje krvi; a granulociti i makrofagi djeluju kao generalni čistači i pomoćne stanice. Granulociti se mogu dalje dijeliti u bazofile, eozinofile, neutrofile i bazofilne stanice.

U specifično pogodnoj izvedbi ovog aspekta, farmaceutski sastav izuma sadrži jedan oligopeptid, koji je pentapeptid i ima formulu: tir-gli-fe-gli-gli, koji je označen sa SEQ ID broj: 1. Ovaj pentapeptid je označen kao OGP(10-14) kroz cijelu ovu prijavu.

U drugoj izvedbi, farmaceutski sastav izuma sadrži oligopeptid, koji je pentapeptid formule: tir-gli-fe-his-gli, koji je označen sa SEQ ID broj: 2.

U još jednoj izvedbi, farmaceutski sastav izuma sadrži oligopeptid koji je tetrapeptid i ima formulu: gli-fe-gli-gli, koji je označen sa SEQ ID broj: 3.

U drugoj izvedbi, farmaceutski sastav izuma sadrži oligopeptid koji je heksapeptid i ima formulu met-tir-gli-fe-gli-gli, koji je označen sa SEQ ID broj: 4, u kojem metioninski ostatak može biti aciliran.

Peptidi, koji se koriste kao učinkoviti sastojci u farmaceutskim sastavima izuma, proizvode se sintetički, pomoću poznatih postupaka organske kemije. Takva je sinteza opisana, na primjer, u navedenom US patentu br. 5,814,610.

U skladu s pogodnom izvedbom ovog aspekta, farmaceutski sastav izuma je namijenjen povećanju ucijepljenosti transplantata koštane srži, rekonstrukcije hematopoeze, repopulacije koštane srži i broja cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica.

U skladu s drugom izvedbom, farmaceutski sastav iz izuma je namijenjen povećanju ucijepljenosti transplantata koštane srži, rekonstrukcije hematopoeze, repopulacije koštane srži i broja cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica pacijenta, koji prima kemoterapiju ili zračenje.

Kapacitet hematopoetskih matičnih stanica da podrže cjeloživotnu produkciju svih krvnih loza se postiže jednom ravnotežom između plastičnosti matičnih stanica, što je produkcija angažiranih ishodišnih stanica, koje generiraju specifične krvne loze, i replikaciju matičnih stanica u nediferenciranom stanju (self-renewal, samoobnova). Teško je bilo definirati mehanizam koji regulira plastičnost hematopoetske matične stanice i samoobnovu in vivo. Međutim, glavni pridonoseći čimbenici predstavljaju jednu kombinaciju unutarnjih staničnih i okolišnih utjecaja [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10302-10306 (1995)]. Važnost hematopoetskog mikro-okoliša bila je ustanovljena uporabom sistema dugoročne kulture koštane srži, gdje hematopoetske stanice, kultivirane na stromi omogućuju održavanje HSC-ova, premda pri niskim frekvencijama [Fraser, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992); Wineman, et al., Blood 81:365-372 (1993)].

Demonstracija održavanja hematopoetskih stanica u kulturi dovelo je do napora da se identificira kandidate faktora "matičnih stanica". Uloga hematopoetskih citokina u održavanju matičnih stanica izučavala se pomoću izravnog dodavanja pročišćenih faktora u in vitro kulturama populacija matičnih stanica, iza čega je slijedila transplantacija ovih kultiviranih stanica [Meunch, et al., Blood 81:3463-3473 (1993), Wineman et al., ibid. (1993); Rebel, et al., Blood 83:128-136 (1994)]. Većina od poznatih "rano-djelujućih" citokina, kao što su IL-3, IL-6 i KL pokazala je da stimuliraju proliferaciju više angažiranih ishodišnih stanica, dok istovremeno dozvoljavaju održavanje, ali ne i ekspanziju, stanica sposobnih za dugotrajnu multilinijsku repopulaciju [pregledno u Williams, Blood 81(12):3169-3172 (1993); Muller-Sieburg and Deryugina, Stem Cells, 13:477-486 (1995)]. Dok ovi podaci ukazuju da se plastičnost stanica i funkcija repopulacije može sačuvati citokinskim tretmanom, molekule koje promoviraju samoobnovu ovih pluripotentnih stanica ostaju nepoznatim.

Polipeptid koji se koristi u farmaceutskom sastavu ovog izuma pokazuje da povećava postotak cirkulirajućih multilinijskih ishodišnih stanica. Ove mulitilinijske ishodišne stanice jesu cirkulirajuće rane ishodišne CD34 pozitivne stanice.

U čovjeka i miša, primitivne zrele hematopoetske ishodišne stanice se mogu identificirati po pripadnosti jednoj klasi stanica, definiranih njihovom ekspresijom jednog antigena stanične površine označenog kao CD34. O ovim stanicama može se govoriti kao CD34 pozitivnim stanicama. U miša, jedna rana podklasa CD34 pozitivnih hematopoetskih stanica jesu dvostruko pozitivne CD34+/Sca±stanice. Analogni površinski stanični antigen Sca-1 u ljudi je Flk2. Zbog toga se ljudske, dvostruko pozitivne CD34/Flk2 stanice smatraju ekvivalentnim mišjim, dvostruko pozitivnim CD34/Sca-1 stanicama.

Ljudske hematopoezne ishodišne stanice koje eksprimiraju CD34 antigen i/ili receptor za Flk2 se ovdje nazivaju kao "primitivne ishodišne stanice". Nasuprot tome, hematopoetske stanice koje ne eksprimiraju bilo antigen CD34 ili receptor za Flk2 se nazivaju kao "zrele ishodišne stanice". Zbog toga, kao pogodna izvedba multilinijskih ishodišnih stanica, su cirkulirajuće rane preteče CD34/Flk2 dvostruko pozitivnih stanica.

Kako se koristi ovdje, "ishodišna pradjedovska stanica – progenitor cell" se odnosi na bilo koju somatsku stanicu, koja ima kapacitet da generira potpuno diferencirano funkcionalno potomstvo pomoću diferencijacije i proliferacije. Ishodišne stanice uključuju preteče iz bilo kojeg tkiva ili sustava organa, uključuju, ali se na njih ne ograničavaju, krv, živac, mišić, kožu, crijevo, kost, bubreg, jetra, gušteraču, timus i slično. Ishodišne stanice se razlikuju od "diferenciranih stanica", koje se definiraju kao one stanice koje mogu ili ne moraju imati kapacitet da proliferiraju, t.j. da se same repliciraju, ali koje ne mogu ostvariti daljnju diferencijaciju u neki drugačiji tip stanica pod normalnim fiziološkim uvjetima. Štoviše, ishodišne stanice se dalje razlikuju od abnormalnih stanica kao što su stanice raka, posebno stanica leukemije, koje proliferiraju (same se repliciraju), ali koje se općenito dalje ne diferenciraju, usprkos pojavnosti da su nezrele ili nediferencirane.

Pradjedovske ishodišne stanice su definirane svojim potomstvom, na pr. ishodišne stanice koje formiraju granulocitne/makrofagne kolonije (granulocyte/macrophage colony progenitor cells, GM-CFU) diferenciraju se u neutrofile ili makrofage; primitivne eritroidne blast-formirajuće jedinice (primitive erythroid blast-forming units, BFU-E) diferenciraju se u jedinice formiranja eritroidnih kolonija (erythroid colony-forming units, CFU-E), koje sada potiču stvaranje zrelih eritrocita. Slično tome, pradjedovske ishodišne stanice Meg-CFU, GEMM-CFU, Eos-CFU i Bas-CFU su sposobne diferencirati se u odgovarajuće megakariocite, granulocite, makrofage eozinofile, odnosno bazofile.

Karakterizirani su različiti drugi hematopoetski preteče. Na primjer, hematopoetske ishodišne stanice uključuju one stanice, koje su sposobne za sukcesivne cikluse diferencijacije i proliferacije da se dobije čak do osam različitih zrelih hematopoetskih staničnih loza. Na najprimitvnijem ili najnediferenciranijem kraju hematopoetskog spektra, hematopoetske ishodišne stanice uključuju hematopoetske "matične stanice". Ove rijetke stanice, koje predstavljaju 1 od 10.000, čak do 1 od 100.000 stanica u koštanoj srži, svaka ima kapacitet da generira > 1013 zrelih krvnih stanica svih loza i odgovorne su za održivu proizvodnju krvnih stanica tijekom cijelog života nekog organizma. One obitavaju u koštanoj srži, prvenstveno u nekom stanju mirovanja i mogu davati identične stanice kćeri u jednom procesu koji se naziva samoobnovom. U skladu s tim, takva neangažirana pradjedovska ishodišna stanica može se opisati kao da je "omnipotentna", t.j. ona je i nužna i dovoljna za stvaranje svih tipova zrelih krvnih stanica. Pradjedovske ishodišne stanice koje zadržavaju kapacitet za generiranje svih loza krvnih stanica, ali koje se ne mogu samoobnavljati, nazvane su "pluripotentnim". Stanice koje mogu producirati neke, ali ne i sve stanične loze u krvi i ne mogu se samoobnavljati, nazivaju se "multipotentnim".

Oligopeptidi, koji se koriste u izumu, su korisni u podržavanju bilo kojih od ovih ishodišnih stanica, uključujući unipotentne ishodišne stanice, pluripotentne ishodišne stanice i/ili omnipotentne ishodišne stanice. Ovi oligopeptidi, a posebno OGP(10-14), pokazuju posebnu učinkovitost u podržavanju hematopoetskih ishodišnih stanica.

U daljnjoj pogodnoj izvedbi, ovaj oligopeptid koji se koristi kao djelotvorni sastojak u farmaceutskom sastavu izuma, pojačava obnovu nezrelih stanica monocita i selektivno povećava bilo koju od BFU-E i GEMM jedinica za formiranje kolonija (Colony Forming Units, CFU).

Primjer 3 dolje opisuje ex vivo procjenu formiranja hematopoetske kolonije porijeklom iz OGP(10-14) i iz kontrolno tretiranih miševa. Rezultati pokazuju porast GEMM-CFU i BFU-E u kulturama porijeklom iz miševa tretiranih s OGP(10-14) u usporedbi s kontrolnom skupinom, koja je bila tretirana samo nosiocem, dok naprotiv, pozitivna G-CSF kontrola inducira značajan porast GM-CFU. Porasti formiranja kolonija u kulturama porijeklom iz miševa tretiranih s OGP(10-14) bili su vidljivi samo kada je tretman započet sedam dana prije kemoablacije. Oba rezultata i in vivo i ex vivo postignuti s OGP(10-14) potvrđuju prethodno objavljenu multilinijsku aktivnost pune dužine OGP u usporedbi s različitim citokinima. Različito od drugih faktora rasta i mobilizirajućih čimbenika [Fleming, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3760 (1993)], sOGP(10-14) povećava broj hematopoetskih matičnih stanica u perifernoj krvi bez smanjivanja matičnih stanica u odjeljku koštane srži.

Farmaceutski sastav izuma može zbog toga biti namijenjen povećanju broja bijelih krvnih stanica (WBC), cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica, i cjelokupne celularnosti koštane srži.

U posebno pogodnoj izvedbi, sastav izuma je namijenjen za potporu transplantaciji koštane srži. Ovaj učinak je zbog aktivnosti ovih oligopeptida, koja povećava broj matičnih stanica, ubrzava rekonstrukciju hematopoeze nakon transplantacije koštane srži i povećava celularnost koštane srži.

Kako je opisano u Primjeru 1, za oligopeptide iz izuma je pronađeno da povećavaju ucijepljenost transplantata koštane srži i da stimuliraju rekonstrukciju hematopoeze. Transplantacija koštane srži (Bone Marrow Transplantation, BMT) progresivno i brzo postaje tretman izbora u slučajevima hematoloških zloćudnih bolesti kao što su limfomi, Hodgkin-ove bolesti i akutna leukemija kao i solidnih malignoma, posebno melanoma i karcinoma pluća. Odnedavno, BMT se povećano uzima u razmatranje u liječenju mijeloproliferativnih poremećaja kao što je IMF (idiopatska mijelofibroza). Potencijalno, s poboljšanim metodama, BMT se može također koristiti za liječenje drugih katastrofičkih bolesti - AIDS, aplastičke anemije i autoimunih poremećaja. Cilj je svih BMT da zamijene hematopoetske matične stanice domaćina, omnipotentne i pluripotentne, oštećene kemoterapijom, zračenjem ili bolešću. Ove se matične stanice mogu opetovano replicirati i diferencirati da omoguće cjelokupnu raznolikost stanica prisutnih u krvi, posebno ertrocita, trombocita i bijelih krvnih stanica (WBC), koje uključuju limfocite, monocite i neutrofile. Obitavajući makrofagi i osteoklasti također su porijeklom iz hemopoetskih omnipotentnih matičnih stanica. Kako se matične stanice diferenciraju, one obvezuju same sebe sve više i više u neku određenu lozu, dok one ne budu mogle formirati samo jednu vrstu među gornjim stanicama.

Zbog toga, u skladu s drugom specifično pogodnom izvedbom, farmaceutski sastav izuma može se koristiti u liječenju subjekata s transplantiranom koštanom srži, koji pate od nekog hematološkog poremećaja, solidnog tumora, imunološkog poremećaja ili aplastičke anemije. Osobito, hematološki poremećaj može biti limfom, Hodgkin-ova bolest ili akutna leukemija i mijeloproliferativni poremećaj, posebno idiopatska mijelofibroza (IMF).

U IMF-u, koštana eritropoeza razvija se u progresivno propadanje, dok se naprotiv ektopična hemopoeza razvija i povećava. Patološka kalcifikacija fibroze i strukturne promjene trabekularne kosti može biti odgovorna za jedan apsolutni ili relativni deficit faktora izlučivanih iz osteoblasta i stoga, barem djelomično odgovorna za oštećenu funkciju koštane srži.

Rezultati koji su opisani u Primjeru 4, jako ukazuju da OGP(10-14) može povećati gustoću hematopoetskih stanica koštane srži u kultiviranim fragmentima kosti iz pacijenata s IMF, bez da modificiraju fibrozu u tako kratkom vremenu. Izgleda da je porast stanica uravnotežen i da on ne tumači ekspanziju atipičnih stanica. Ne može se isključiti, dakako, da OGP(10-14) u kulturi jednostavno sačuva strukturu koštane srži i celularnost IMF uzoraka u usporedbi s onima nađenim u uzorcima kultiviranim bez ovog pentapeptida. Međutim, sačuvana ili čak povećana celularnost u nekim uzorcima kultiviranim s OGP(10-14), u usporedbi s onom nađenom u prirodnim uzorcima, sugerira jednu proliferativnu aktivnost ovog peptida. Nije jasno do danas, da li OGP djeluje na krvne preteče izravno ili putem stromalnih stanica ili različitih staničnih populacija, ali barem na morfološkoj razini, njegova se aktivnost pojavljuje nezavisno od jednog značajnijeg remodeliranja mikrookoliša.

Jedna implikacija ovih opažanja je da OGP(10-14) u stvari može pojačati in vitro tri linijske ekspanzije ljudskih hematopoetskih stanica.

Farmaceutski sastavi ovog izuma sadrže kao aktivni sastojak jedan oligopeptid kako je gore opisano, ili jednu smjesu takvih oligopeptida u farmaceutski prihvatljivom nosiocu, ekscipijentu ili stabilizatoru, i po izboru drugih terapeutskih sastavnih dijelova. Prihvatljivi nosioci, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primatelja pri upotrebljenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere, kao što je fosfatom puferirana fiziološka otopina i slični fiziološki prihvatljivi puferi, i općenitije sve prikladne nosioce, ekscipijente i stabilizatore poznate u struci, na pr. u svrhe dodavanja okusa, boja, podmazivanja ili sličnog u dati farmaceutski sastav.

Nosioci mogu uključivati škrob ili njegove derivate, celulozu i njene derivate, na pr. mikrokristalnu celulozu, ksantansku gumu i slično. Lubrikanti mogu uključivati hidrogenirano ricinusovo ulje i slično.

Pogodan je puferski čimbenik fosfatom puferirana fiziološka otopina (Phosphate-Buffered Saline solution, PBS), čija se otopina također prilagođava na osmolarnost.

Pogodna farmaceutska formulacija je ona koja nema nosioca. Takve formulacije se pogodno koriste za davanje injiciranjem, uključujući intravenoznu injekciju.

Pripravljanje farmaceutskih sastava je dobro poznato u struci i opisano je u mnogim člancima i udžbenicima, vidi na pr. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A.R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990, a posebno stranice 1521-1712 u njemu.

Farmaceutski sastavi izuma mogu se pripremati u oblicima jedinica za doziranje. Jedinice doziranja mogu također uključivati uređaje za održivo oslobađanje. Sastavi se mogu pripremati pomoću bilo kojih od postupaka, dobro poznatih u farmaceutskoj struci. Takvi oblici doziranja obuhvaćaju fiziološki prihvatljive nosioce, koji su po sebi netoksični i neterapijski. Primjeri takvih nosioca uključuju ionske izmjenjivače, aluminijev (tri)oksid, aluminijev stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je ljudski serumski albumin, puferske tvari kakvi su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijev sorbat, djelomične gliceridne smjese zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, soli ili elektrolite kakav je protamin sulfat, dinatrijev hidrogen fosfat, kalijev hidrogen fosfat, natrijev klorid, cinkove soli, koloidni silicijev dioksid, magnezijev trisilikat, polivinil pirolidon, tvari na bazi celuloze i PEG. Nosioci za aktualne ili uz gel vezane oblike ovih polipeptida uključuju polisaharide kao što je natrijeva karboksimetilceluloza ili metilceluloza, polivinilpirolidon, poliakrilate, polietilenske blok polimere, PEG i drvne alkohole. Za sva se davanja prikladno koriste uobičajeni depo oblici. Takvi oblici uključuju na primjer, mikrokapsule, nanokapsule, liposome, flastere, inhalacijske oblike, sprejeve za nos, tablete koje se stavljaju pod jezik i pripravke s održivim oslobađanjem.

Prikladni primjeri pripravaka s održivim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice od krutih hidrofobnih polimera, koje sadrže oligopeptide u skladu s izumom, koje matrice su u obliku oblikovanih artikala, na pr. filmova ili mikrokapsula. Primjeri matrica za održivo oslobađanje uključuju poliestere, hidrogelove, polilaktide kako je opisano u (U.S. Pat. br. 3,377,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ-etil-1-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mliječne kiseline-glikolne kiseline i kopolimere kao što je Lupron Depots[image] (injektibilne mikrokuglice sastavljene od kopolimera mliječne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)3-hidroksimaslačne kiseline. Dok polimeri kao što je etilenvinil acetat i mliječna kiselina-glikolna kiselina omogućuju oslobađanje molekula tijekom više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim razdobljima. Kad su enkapsulirani, peptidi ostaju u tijelu za dugo vrijeme, oni se mogu denaturirati ili agregirati kao rezultat izlaganja vlazi na 370C, što rezultira gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promjenama u imunogeničnosti. Mogu se smisliti razumne strategije za stabilizaciju koje ovise o uključenom mehanizmu. Na primjer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije intermolekularna formacija S-S veza preko tio-disulfidne međusobne zamjene, stabilizacija se može postići modificiranjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih otopina, kontrolom sadržaja vlage, korištenjem odgovarajućih aditiva i razvijanjem specifičnih sastava polimerne matrice.

Oligopeptidi održivog oslobađanja, a posebno sastavi sOGP(1-14), također uključuju liposomalno u klopku uhvaćene polipetide. Liposomi koji sadrže ove polipeptide pripremaju se postupcima poznatim u struci, kako je opisano u Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); US patentima br. 4,485,045 i 4,544,545. Uobičajeno, liposomi su mali (oko 200-800 angstrema) unilamelarnog tipa u kojima je sadržaj lipida veći od 30 mol% kolesterola, odabrana se proporcija namješta za optimalnu terapiju polipetidima. Liposomi s povećanim vremenom cirkulacije su otkriveni u US patentu br. 5,013,556.

Terapeutske formulacije ovih oligopeptida pripremaju se za spremanje pomoću miješanja ovih polipetida koji imaju željeni stupanj čistoće s odabranim fiziološki prihvatljivim nosiocima, ekscipijentima ili stabilizatorima [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol, A., Ed., (1980)], u obliku liofiliziranog kolačića ili vodenih otopina. Prihvatljivi nosioci, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primatelje pri upotrebljenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu;

polipeptide niske molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serumski albumin, želatina ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljikohidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; kelirajuće agense kao što je EDTA; šećerne alkohole kao manitol i sorbitol; protu-ione poput natrija koji oblikuje rebrenice; i/ili ne-ionske površinski aktivne agense kao Tween, Pluronics[image] ili polietilenglikol (PEG).

Oligopeptidi se mogu također uloviti u klopku u pripremljene mikrokapsule, na primjer, pomoću tehnika koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom (na primjer odgovarajuće hidroksimetilcelulozne ili želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsule), u sustavima za oslobađanje koloidnih ljekova (na primjer liposomi, albuminske mikrokuglice, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama. Takve su tehnike otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences, ibid.

Farmaceutski sastav se pogodno daje pacijentu kojem je to potrebno, jednom dnevno, i pogodno sadrži dozu aktivnog sastojka od oko 0,001 do oko 50 nmol, pogodnije oko 0,05 do 25 nmol, najpogodnije oko 0,1 do oko 10 nmol.

Treba se uvažavati da dodatno opisanim oligopeptidima, ovaj sastav predmetnog izuma za potporu transplantacije može nadalje neobavezno sadržavati i druge terapeutske konstituente. Takve sastavnice mogu biti jedan ili više poznatih citokina, na primjer IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF (faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija) i M-CSF (faktor stimulacije kolonija makrofaga). Kada je takva dodatna komponenta inkorporirana u ovaj sastav, učinak ovog sastava u potpori transplantacije koštane srži može se sinergistički povećati.

Kao jedan drugi aspekt, predmetni se izum odnosi na uporabu bilo kojeg od gore opisanih oligopeptida, osobito tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima 1, 2, 3, odnosno 4 u pripremanju jednog farmaceutskog sastava za pojačavanje usađenosti transplatata koštane srži, rekonstrukcije hematopoeze, repopulacije koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica.

Uz to, ovdje opisani oligopeptidi mogu se koristiti u pripremanju farmaceutskih sastava za ubrzavanje usađenosti transplantata koštane srži, pojačavanje proliferacije transplantiranih matičnih stanica i na taj način povećavanje raspoloživosti svih tipova hematopoetskih stanica uključujući eritrocite i tako predusresti potrebu za potporom domaćinu ovim stanicama za barem nekoliko tjedana; za pojačavanje stromalnog hematopoetskog mikrookoliša povećanjem broja stromalnih stanica i/ili izražavanjem faktora porijeklom iz stromalnih stanica koji podupiru hematopoezu; za pojačavanje u hematopoetskim matičnim stanicama ekspresiju receptora za faktore koji podupiru hematopoezu; za pojačavanje "udomljavanja" intravenozno davanih transplantata koštane srži u koštanu srž domaćina; za pojačavanje obnove krvne celularnosti nakon BMT; za omogućavanje uspješne transplantacije koristeći smanjeni broj stanica, tako smanjujući broj (multiplih) ekstrakcija srži iz davaoca i omogućujući uporabu transplantata čak tako malih kao 10-15 ml (umjesto 1000 ml); za povećavanje broja hematopoetskih omnipotentnih i/ili pluripotentnih matičnih stanica u perifernoj krvi donora, na taj način poboljšavajući izvedivost transplantiranja matičnih stanica iz periferne krvi; za povećavanje broja hematopoetskih matičnih stanica in vitro u dugoročnim kulturama koštane srži za uporabu kao transplantata i također omogućujući jednu metodu za inhibiciju rasta tumorskih stanica u alograftima iz pacijenta s leukemijom; za pojačavanje endogene obnove celularnosti srži i krvi nakon kemoterapije i/ili radijacijske terapije; i za pojačavanje obnove populacije rezidentnih makrofaga nakon BMT ili nakon kemoterapije i/ili radioterapije.

Veličina neke terapeutske doze oligopeptida ili sastava izuma će dakako varirati sa skupinom pacijenata (dob, spol, i t.d.), prirodom stanja koje se liječi i s osobitim oligopetidom koji se koristi, kao i s njegovim načinom davanja. U svakom slučaju terapeutsku će dozu odrediti prisutni liječnik.

Za davanje sisavcu, posebno čovjeku, može se koristiti bilo koji pogodni način davanja, jedne učinkovite doze polipetpida iz ovog izuma. Može se preferirati intravenozno, supkutano i oralno davanje.

Kao pogodna izvedba, ovi se oligopeptidi koriste za pripremanje jednog farmaceutskog sastava za povećavanje postotka cirkulirajućih multilinijskih ishodišnih stanica. Ove multilinijske ishodišne stanice su cirkulirajuće rane preteče CD34 pozitivnih stanica i pogodno, dvostruko pozitivnih CD34/Flk2 stanica.

Neka "hematopoetska matična/ishodišna stanica" ili "primitivna hematopoetska stanica" kako je gore opisana, je neka stanica koja se može diferencirati da tvori jednu više obvezanu stanicu ili zreli tip krvne stanice. Jedna "hematopoetska matična stanica" ili "matična stanica" je ona, koja je specifično sposobna za dugoročnu usađenost u letalno ozračenom domaćinu.

Jedna "populacija CD34+ stanica" je obogaćena za hematopoetske matične stanice. Neka populacija CD34+ stanica može se dobiti na primjer iz pupčane krvi ili iz koštane srži. Ljudske CD34+ stanice krvi iz pupčane vrpce mogu se odabrati za uporabu imunomagnetskih zrnaca koje prodaje Miltenyi (Kalifornija) slijedeći upute proizvođača.

Nadalje, ovi oligopeptidi koji se koriste za pripremanje farmaceutskog sastava izuma pojačavaju obnovu nezrelih stanica i monocita i selektivno povećavaju bilo koju od BFU-E ili GEMM jedinica za formiranje kolonija (CFU).

U skladu s tim, takvi oligopeptidi se koriste u pripremanju farmaceutskog sastava za povećavanje broja bijelih krvnih stanica (WBC), cirkulirajućih hematopoetskih matičnih stanica, i cjelokupne celularnosti koštane srži.

Specifičnije, izum omogućuje uporabu ovih polipeptida u pripremanju farmaceutskog sastava za potporu transplantacije koštane srži. Ovaj se učinak pripisuje aktivnosti ovih oligopeptida u povećavanju broja matičnih stanica, ubrzavanju hematološke rekonstrukcije nakon transplantacije koštane srži i povećavanju celularnosti koštane srži.

U skladu s drugom specifično pogodnom izvedbom, predmetni izum se odnosi na uporabu navedenih oligopeptida u pripremanju farmaceutskog sastava za liječenje nekog subjekta koji pati od hematoloških poremećaja, solidnih tumora, imunoloških poremećaja i aplastičke anemije. Specifičnije, hematološki poremećaj može biti limfom, leukemije, Hodgkin-ova bolest i mijeloproliferativni poremećaji, naročito idiopatska mijelofibroza (IMF).

U trećem aspektu, predmetni izum daje jednu metodu za pojačavanje usađenosti transplantata koštane srži, hematopoetsku rekonstrukciju, repopulaciju koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica. Ova metoda se sastoji u davanju nekom subjektu, kojem je to potrebno, učinkovite količine nekog oligopeptida koji ima stimulativnu aktivnost na hematopoetske stanice kako je gore opisano, ili nekog sastava iz izuma.

U skladu s drugom izvedbom, izum daje jednu metodu za pojačanje usađenosti transplantata koštane srži, hematopoetsku rekonstrukciju, repopulaciju koštane srži i broja cirkulirajućih matičnih stanica u pacijentima koji primaju kemoterapiju ili zračenje.

U još jednoj izvedbi, učinkovita količina oligopeptida ili sastava izuma može se koristiti za poboljšanje usađenosti pri transplantaciji koštane srži ili za stimuliranje mobilizacije i/ili ekspanzije hematopoetskih matičnih stanica u sisavca prije prikupljanja hematopoetskih preteča iz njihove periferne krvi.

U skladu s jednom specifičnom izvedbom ovog aspekta, izum se odnosi na postupak liječenja nekog subjekta koji pati od nekog hematološkog poremećaja, solidnog tumora, imunološkog poremećaja ili aplastičke anemije, davanjem tom subjektu neke terapeutski učinkovite količine nekog oligopeptida koji ima stimulacijsko djelovanje na produkciju hematopoetskih stanica, ili nekog sastava koji sadrži isto u skladu s izumom.

U drugoj specifičnoj izvedbi, ovaj se postupak može koristiti u potpori liječenju nekog subjekta transplantacijom koštane srži.

Za terapeutske primjene, ovi oligopeptidi ili korisni farmaceutski sastav u skladu s izumom se daju sisavcu, pogodno čovjeku, u nekom fiziološki prihvatljivom obliku doziranja, uključujući one koji se mogu davati čovjeku intravenozno kao bolus ili kao kontinuirana infuzija tijekom nekog vremenskog perioda. Alternativni putevi davanja uključuju intramuskularni, intraperitonealni, intra-cerebrospinalni, supkutani, intra-artikularni, intrasinovijalni, intratekalni, oralni ili lokalni put. Oligopeptidi ili sastavi izuma se također prikladno daju intratumoralnim, peritumoralnim, intralezijskim ili perilezijskim putevima ili u limfu, da bi se primijenili kako lokalni tako i sistemski terapeutski učinci.

Oligopeptidi ili farmaceutski sastavi koji se koriste za davanje in vivo moraju biti sterilni. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracijske membrane, prije ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Oligopeptidi se mogu spremati u otopini. Terapeutski oligopeptidski sastavi se općenito stavljaju u neki spremnik, koji ima jedan ulaz za sterilni pristup, na primjer, jednu vrećicu za intravenoznu otopinu ili bočicu koja ima čep, kojeg se može probiti jednom hipodermičkom injekcijskom iglom.

"Učinkovita količina" bilo kojeg među oligopeptidima ili smjesa iz izuma za terapeutsko korištenje ovisit će, na primjer, o terapeutskim ciljevima, o načinu davanja i o stanju pacijenta. U skladu s tim, biti će nužno da davalac terapije istitrira dozu i modificira način davanja prema potrebi da bi se postigao optimalni terapeutski učinak. Tipično, kliničar će davati oligopeptid sve dok se ne dostigne razina doziranja kojom se postiže željeni učinak. Tipično dnevno doziranje za sistemsko liječenje može biti u rasponu od oko 0,001 nmol/kg čak do 50 nmol/kg ili više, zavisno o gore navedenim faktorima.

Druga specifična izvedba odnosi se na liječenje nekog subjekta koji nosi transplantat, gdje se može usvojiti neki postupak ex vivo. U ovom postupku, stanice koje se namjeravaju transplantirati izlažu se učinkovitoj količini ovih oligopeptida ili sastava iz izuma, prije njihove transplantacije.

Najuobičajeniji način koji je danas raspoloživ za dobivanje dovoljne količine hematopoetskih matičnih stanica za transplantaciju je ekstrahiranje 1 litre ili više tkiva koštane srži iz multiplih mjesta u kostima donatora pomoću igle i šprice, kao jedan zamršen proces koji obično zahtijeva opću anesteziju. Donatori alogeničke BMT su obično braća ili sestre, čiji su tipovi tkiva kompatibilni, a katkada i nesrodni donatori, koji se odabiru na temelju podudarnosti s primateljem pomoću HLA tipiziranja. Autologni transplantati, koji eliminiraju potrebu za HLA usklađivanjem mogu se koristiti u pacijentima podvrgnutim ablativnoj kemoradioterapiji za iskorjenjivanje solidnih tumora. Autologne matične stanice mogu se također dobiti iz krvi pupčane vrpce pri porodu i spremiti za buduće davanje.

Nakon transplantacije, a prije uspostavljanja funkcionalne koštane srži s porijeklom od donatora, pacijenti primatelji BMT-a pokazuju jednu prolaznu izrazitu pancitopeniju, koja ih izlaže infekcijama. Nastupanje bakterijskih i gljivičnih infekcija u korelaciji je kako sa žestinom, tako i s trajanjem pancitopenije [Slavin, S., i Nagler, A., Transplantation (1992)]. Zbog sličnog razloga, CSF ne uspijeva potaknuti eritropoezu i stvaranje krvnih pločica (trombocita).

Oligopeptidi koji podupiru hematopoezu mogli bi se dokazati korisnim također i na druge načine. Neki su istraživači pronašli da se dodavanjem matičnih stanica iz periferne krvi onima iz koštane srži značajno povećava brzina usađivanja, ali ekstrahiranje dovoljnih brojeva matičnih stanica iz periferne krvi je jedan komplicirani postupak. Davanjem takvih oligopeptida donatorima, da bi se povećao broj matičnih stanica u krvi, poboljšat će izvedivost transplantiranja matičnih stanica iz periferne krvi [Golde, D.W., Sci. Am. 36 prosinac (1991)].

Preduvjet za hematopoezu i stoga uspješnu MBT je prisutnost funkcionalnih stromalnih stanica i tkiva koja kompromitira hematopoetski mikrookoliš, određuje udomljavanje uštrcanih matičnih stanica iz cirkulacije u koštanu srž i podupire hematopoezu [Watson, J.D. i McKenna, H. J. Int. J. Cell Cloning 10:144 (1992)]. Stromalno tkivo porijekla iz koštane srži također daje uvjete za održavanje matičnih stanica u dugoročnim in vitro kulturama koštane srži. Za sada je ova tehnologija dovoljna da matične stanice održi živima. Dodavanje primjerenih hemopoetskih oligopeptida ovim kulturama može pomoći ekspanziji populacije matičnih stanica in vitro, s time da ovo daje povećane brojeve ovih stanica za transplantaciju.

Jedan kombinirani in vitro/in vivo pristup mogao bi pružiti osnovu dalekovidne strategije za: (i) dobivanje malih preparacija matičnih stanica iz krvi ili koštane srži donatora i (ii) da bi zdravi pojedinci mogli imati svoje matične stanice spremljene za neko vrijeme kada bi te stanice mogle zatrebati za liječenje neke ozbiljne bolesti, i tako mimoići složenost povezanu s uporabom alogeničke BMT.

Bilo bi zbog toga od terapeutske važnosti upotrebljavati male peptide kao što su oligopeptidi opisani u predmetnoj prijavi, koji stimuliraju post-BMT hematopoetsku rekonstrukciju ojačavanjem in vivo, ex vivo i/ili in vitro hematopoetskog mikrookoliša od kojeg su fibrozno tkivo, kost i koštane stanice važne sastavnice. Takvi peptidi mogu također poduprijeti hematopoezu u spontano pojavljenom ili induciranom mijelosupresijskom stanju koje nužno ne uključuje BMT.

Čini se, da oligopeptidi opisani u predmetnoj prijavi i pogodno pentapeptid OGP(10-14), djeluju izravno na razini ranog hematopoetskog preteče (t.j. hematopoetskih matičnih/ishodišnih stanica). Takva jedna ekspandirana populacija matičnih stanica može poslužiti kao izvor stanica za mijelopoezu, eritropoezu (na pr. slezensku eritropoezu) i limfopoezu. U skladu s tim, ovi se oligopeptidi mogu koristiti da stimuliraju proliferaciju i/ili održavanje hematopoetskih matičnih/ishodišnih stanica bilo in vitro ili in vivo (t.j. za liječenje hematopoetskih bolesti ili poremećaja).

Zbog toga se pogodna izvedba odnosi na postupak za pojačavanje proliferacije hematopoetskih matičnih/ishodišnih stanica. U skladu s izumom, ovaj se postupak sastoji od koraka izlaganja ovih stanica učinkovitoj količini nekog oligopeptida, koji ima stimulacijsko djelovanje na hematopoetske stanice, ili učinkovitoj količini nekog sastava koji sadrži isti, kako je gore opisano. U skladu s izumom takvo izlaganje je učinkovito u pojačavanju proliferacije navedenih stanica.

Izraz "pojačavanje proliferacije neke stanice" obuhvaća korak povećanja opsega rasta i/ili reprodukcije te stanice u odnosu na neku netretiranu stanicu bilo in vitro ili in vivo. Povećanje proliferacije stanica u staničnoj kulturi može se detektirati brojenjem broja stanica prije i nakon izlaganja nekoj molekuli od interesa. Opseg proliferacije može se kvantificirati mikroskopskim utvrđivanjem stupnja konfluentnosti. Proliferacija stanica može se također kvantificirati koristeći pokus inkorporacije timidina ili BrdU.

U specifično pogodnoj izvedbi, postupak izuma je namijenjen pojačavanju proliferacije CD34 pozitivnih stanica, još bolje Flk2 pozitivnih stanica.

Ovi oligopeptidi ili sastavi ovog izuma korisni su u in vivo ili ex vivo povećavanju broja i/ili proliferacije i/ili diferencijacije i/ili održavanja hematopoetskih matičnih/ishodišnih stanica, ekspandiraju populaciju ovih stanica i pojačavaju repopulaciju takvih stanica i krvnih stanica multiplih loza u nekom sisavcu.

U jednoj specifično pogodnoj izvedbi, ove stanice su u staničnoj kulturi i zbog toga, ovo bi bio jedan ex-vivo/in vitro postupak.

Alternativno, postupak izuma se može koristiti kao jedan in vivo postupak tretmana, u slučaju da su tretirane stanice prisutne u sisavcu.

"Tretman" se odnosi i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mjere. Onima kojima je potreban tretman uključuje one, koji već imaju bolest ili poremećaj, kao i one, u kojima se bolest ili poremećaj treba spriječiti.

"Sisavac" za svrhe tretmana se odnosi na bilo koju životinju svrstanu u sisavce, uključujući čovjeka, domaće i gospodarske životinje, životinje zoološkog vrta, sporta ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave i t.d. Još bolje, sisavac je čovjek.

U jednoj specifičnoj izvedbi, sisavac tretiran postupkom ovog izuma pati od, ili je osjetljiv na smanjenu razinu krvnih stanica, koja može biti uzrokovana kemoterapijom, terapijom zračenja, transplantacijom koštane srži ili bilo kojim drugim jatrogenim ili prirodnim uzrokom.

Kemoterapija i radijacijska terapija uzrokuju dramatična smanjenja populacije krvnih stanica u pacijenata s rakom. Barem 500.000 pacijenata s rakom podvrgava se kemoterapiji i radijacijskoj terapiji u SAD i Europi svake godine i drugih 200.000 u Japanu. Transplantacija koštane srži kao terapija od vrijednosti u aplastičkoj anemiji, primarnoj imunodeficijenciji, akutnoj leukemiji i solidnim tumorima (nakon zračenja cijelog tijela) postaje sve šira praksa u medicinskoj zajednici. Barem 15.000 Amerikanaca imaju transplantaciju koštane srži svake godine. Druge bolesti mogu uzrokovati smanjenje u sveukupnim ili selektivnim krvnim staničnim lozama. Primjeri ovih stanja uključuju anemiju (uključivo makrocitnu i aplastičku anemiju); trombocitopeniju; hipoplaziju; imunu (autoimunu) trombocitopeničnu purpuru (ITP); i HIV-om induciranu ITP.

Postoji potreba za farmaceutskim produktima koji mogu pojačati rekonstituciju populacija krvnih stanica ovih pacijenata.

U skladu s tim, cilj je predmetnog izuma da pruži postupak za pojačavanje proliferacije i/ili diferencijacije i/ili održavanja primitivnih hematopoetskih stanica. Takav postupak može biti koristan za pojačavanje repopulacije hematopoetskih matičnih stanica i na taj način staničnih loza zrelih krvnih stanica. To je poželjno kada sisavac pati od smanjenja hematopoetskih ili zrelih krvnih stanica kao posljedice bolesti, zračenja ili kemoterapije. Ovaj je postupak također koristan za generiranje ekspandiranih populacija takvih matičnih stanica i loza zrelih krvnih stanica iz takvih hematopoetskih stanica ex vivo.

U još jednoj pogodnoj izvedbi, izum se odnosi na postupak za in vitro/ex-vivo održavanje i/ili ekspanziju matičnih stanica. Ovaj postupak uključuje izoliranje perifernih krvnih stanica iz jednog uzorka krvi, obogaćivanje krvnih ishodišnih stanica koje iskazuju antigen CD34, nagomilavanje obogaćenih krvnih ishodišnih stanica pod prikladnim uvjetima, i tretiranje navedenih stanica s nekim oligopeptidom koji ima stimulativno djelovanje na hematopoetske stanice, ili sa sastavom koji sadrži kao učinkovit sastojak neki oligopeptid koji ima stimulativno djelovanje na hematopoetske stanice, u skladu s izumom.

U jednoj specifičnoj izvedbi, postupak izuma može uključivati, kao jedan daljnji korak, izlaganje tretiranih stanica nekom citokinu. Kao neograničavajući primjer, takav se citokin može odabrati iz skupine koja se sastoji od TPO (trombopoietin), EPO (eritropoietin), M-CSF (stimulativni faktor makrofagnih kolonija - Macrophage-colony stimulating factor), GM-CSF (granulocitni-makrofagni-CSF), G-CSF (granulocitni CSF), IL-1 (Interleukin-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF (faktor inhibiranja leukemije - Leukemia Inhibitory Factor) i KL (Kit Ligand).

Kao jedna izvedba za neki tretman in vivo, izum se odnosi na postupak za repopulaciju krvnih stanica u sisavcu. Ovaj se postupak sastoji od koraka davanja navedenom sisavcu, terapeutski učinkovite količine oligopeptida koji ima stimulativno djelovanje na hematopoetske stanice, ili jedne učinkovite količine sastava ovog izuma. Ove hematopoetske stanice mogu biti bilo koje od eritroidnih, mijeloidnih i limfoidnih stanica.

"Loze limfoidnih krvnih stanica" su one hematopoetske stanice preteče koje se mogu diferencirati da oblikuju limfocite (B-stanice ili T-stanice). Isto tako, "limfopoeza" je formiranje limfocita.

"Loze eritroidnih krvnih stanica" su one hematopoetske stanice preteče koje se mogu diferencirati da oblikuju eritrocite (crvene krvne stanice) i "eritropoeza" je formiranje eritrocita.

Fraza "Loze mijeloidnih krvnih stanica" za ovu svrhu, obuhvaća sve hematopoetske stanice preteče, koje nisu loze limfoidnih i eritroidnih krvnih stanica, kako su definirane gore, a "mijelopoeza" uključuje stvaranje krvnih stanica (drugih osim limfocita i eritrocita).

Za otkriveno i opisano treba razumjeti, da ovaj izum nije ograničen na pojedine primjere, korake procesa i materijale koji su ovdje otkriveni, budući da takvi koraci procesa i materijali mogu ponešto varirati. Treba također razumjeti, da se ovdje upotrebljena terminologija koristi samo u svrhu opisivanja pojedinih izvedbi i nije namijenjeno da bude ograničavajuća, budući da će opseg predmetnog izuma biti ograničen samo pridodanim patentnim zahtjevima i njihovim ekvivalentima.

Treba zapaziti, da kako se koriste u ovoj specifikaciji i pridodanim patentnim zahtjevima, oblici jednine uključuju reference množine, osim ako sadržaj jasno ne određuje drukčije.

Kroz cijelu ovu specifikaciju i patentne zahtjeve koji joj slijede, osim ako kontekst ne zahtijeva drugačije, riječi "sadržavati" i varijacije kao na primjer "sadrži" i "sadržavajući", treba razumjeti da podrazumijevaju uključivanje navedene cjeline ili koraka ili skupine cjelina ili koraka, ali ne i isključivanje bilo koje druge cjeline ili koraka ili skupine cjelina ili koraka.

Slijedeći primjeri predstavljaju tehnike koje su upotrijebili izumitelji u izvođenju aspekata predmetnog izuma. Treba zamijetiti da, dok su ove tehnike egzemplarne za pogodne izvedbe za provođenje izuma, oni koji su stručnjaci u ovom području, će u svijetlu predmetnog otkrića prepoznati, da se mogu izvršiti brojne modifikacije, bez odstupanja od duha i namjeravanog opsega izuma.

Primjeri

Reagensi

1. C-terminalni pentapeptid od peptida osteogenog rasta(10-14) [sOGP(10-14)]: tir-gli-fe-gli-gli; M.t. 499,7 (SEQ ID br.1) nabavljen je od Polypeptides Laboratories Inc. (Torrance, California 90503, USA, Šarža br. 9712-006).

2. CFA - ciklofosfamid (CFA, SIGMA, 5mg/po mišu) upotrebljen je za indukciju ablacije koštane srži.

3. Dexteru-sličan medij: McCoy-ev medij (Gibco-Life technologies, USA) s 12,5% fetalnim goveđim serumom (FBS, Hyclone, Holland), 12,5% konjskim serumom (HS, Sigma, St Louis, MO), 0.8% esencijalnih aminokiselina i 0,4% ne-esencijalnih aminokiselina (Gibco-Life technologies, USA), 1% glutamina (Sigma, St Louis, MO), 0,4% vitamina uključujući kolin, folnu kiselinu, inozitol, nikotinamid, piridoksal HCl, riboflavin, tiamin HCl, DCa pantotenat (Gibco-Life technologies, USA), 1% amfotericin B (Fungizone, Bristol-Myers Squibb), 1% gentamicin i 10-6 M hidrokortizon u prisustvu rekombinantnog ljudskog faktora matičnih stanica (50 ng/ml rhSCF, Calbiochem, USA), rekombinantnog ljudskog granulocitno-monocitnog faktora za stimulaciju kolonija (rhGM-CSF 10 ng/ml, Sandoz, Švicarska), rekombinantnog humanog interleukina-3 (rhIL-3 10 ng/ml, Calbiochem, USA) i rekombinantnog humanog eritropoietina (rhEpo 2 jedinice/ml, Sigma, St Louis, MO) sa ili bez sOGP(10-14) 10-8 M (Abiogen Pharma, SpA Research Laboratories).

4. E.D.T.A kiseli pufer (Mielodec, Bio Optica, Milano, Italija).

Životinje

* ICR muški miševi kupljeni su od Charles River's (Italija) i održavani pod specifičnim uvjetima bez prisustva patogena.

* CV57 Black ženke miševa su iz životinjskog uzgoja na Hebrew University Medical School (Jeruzalem, Izrael). Miševi oba soja težili su 25 g po njihovom dolasku u laboratorij izumitelja.

Statistička analiza

Usporedbe između skupina su izvršene koristeći Fisherovu PLSD, faktorijelnu ili za opetovana mjerenja, analizu varijance (ANOVA). Za analize kolonija koristio se Mann-Whitney test.

Primjer 1

Učinak OGP(10-14) na usađenost transplantata koštane srži

Materijali i postupci

Za istraživanje mogućeg učinka OGP(10-14) na usađenost transplantata koštane srži koristile su se ženke miševa CV57 Black. OGP(10-14) u fosfatom puferiranoj fiziološkoj otopini davao se dnevno supkutano, 10 μl injekcije tijekom 12 dana. Dnevna doza bila je u rasponu od 0,001 do 10 nmol po mišu. Kontrolni su miševi primali samo fosfatom puferiranu fiziološku otopinu. Na dan 8 nakon početka tretmana s OGP(10-14) miševi su podvrgnuti radijaciji cijelog tijela rendgenskim zrakama, koja se sastojala od pojedinačne doze od 900 rada, koristeći izvor 60Co (Picker C-9, 102,5 rad/min). Ovome je odmah slijedila intravenozna injekcija s 105 neselektiranih singeničkih stanica koštane srži. Životinje su bile žrtvovane 14 dana nakon početka tretmana s OGP(10-14), oba su femura sekcijom izvađena i njihovi epifizni krajevi odstranjeni. Koštana srž je potpuno isprana u fosfatom puferiranu fiziološku otopinu (PBS). Koštana srž je potpuno isprana u fiziološkoj otopini koja je puferirana fosfatom. Jednostanična suspenzija je pripremljena uvlačenjem ove preparacije nekoliko puta kroz graduirane injekcijske igle i stanice su izbrojene u hemocitometru.

Rezultati

Slika 1 prikazuje stimulativni učinak OGP(10-14) na ukupni broj stanica femoralne koštane srži nakon zračenja/nakon transplantacije. Ovaj je učinak bio zavisan o dozi i prikazuje u tri najviše doze statistički značajan, 2-struki porast broja stanica prema PBS kontrolama.

Primjer 2

Evaluacija toksičnosti OGP(10-14)

Kako je gore prikazano, za OGP(10-14) je pronađeno da pojačava usađivanje transplantata koštane srži. Zbog toga, prije daljnjih, detaljnih analiza farmakološkog djelovanja navedenog peptida, moguća toksičnost navedenog peptida se zatim evaluirala.

Pedesetpet miševa se evaluiralo na moguću toksičnost, povezanu s OGP(10-14) nakon 15 dana supkutanog davanja, pri dozi od 10 nmol/po mišu i rezultati su uspoređeni s onima koji su dobiveni u 30 placebo kontrolnih tretmana. Nisu pronađene nikakve razlike koje se tiču preživljavanja, ponašanja, dobivanja tjelesne težine i općeg pregleda. Što se tiče hematoloških parametara, davanje spomenutih doza peptida nije induciralo ikakve značajnije promjene u broju bijelih krvnih stanica (WBC), crvenih krvnih stanica (RBC), krvnih pločica (PLT) ili u razini hemoglobina (Hb).

Primjer 3

OGP(10-14) stimulira hematopoetsku obnovu nakon kemoablacije koštane srži

Materijali i postupci

U ovom skupu eksperimenata, ablacija koštane srži je inducirana intraperitonealnom injekcijom ciklofosfamida (CFA, SIGMA, 5 mg/po mišu u 150 μ1 sterilne PBS) tijekom dva dana za redom (označeni kao "dan 0" i "dan 1"). Za ovaj protokol je već demonstrirano da inducira žestoku, reverzibilnu leukopeniju s L.D. <30 [Spangrude, G.J. et al.,Science, 241:58 (1988)]. Najniži zbrojevi stanica koštane srži zabilježeni su šest dana nakon prve injekcije.

Da bi se evaluirao učinak OGP(10-14) na diferencijalne zbrojeve WBC stanica i odredila takozvana OGP(10-14)-ova "doza izbora" za uporabu u daljnjim eksperimentima, miševi su tretirani dnevnim supkutanim injekcijama od 0,1 ml nosioca bez OGP(10-14) ili s nosiocem koji sadrži različite doze OGP(10-14), kako je prikazano na Slici 2. Jedna skupina referentnih kontrola polazne linije ostavljena je netretiranom i nije primila niti CFA niti sterilnu vodu kao nosilac sa ili bez OGP(10-14) (Slika 2). Krv je skupljena retroorbitalnim krvarenjem na dane -12, -4, +3, +7, +14, +17, +21 i +24 (Slika 2C). Diferencijalni zbrojevi stanica izvedeni su koristeći Coulter Counter (Sysmex Microcell Counter F-800).

Da bi se testiralo učinak OGP(10-14) na dvostruko pozitivne CD34+/Sca-1+ stanice u krvi, usporedno s onim od G-CSF, CFA, miševi s ablacijom tretirani su dnevno s 10 nmol OGP(10-14) od dana -7 do dana +7 i uzorci krvi dobiveni na dane +5, +7 i +15 podvrgnuti su protočnoj citometriji. G-CSF se davao na dane +2 do +8.

Za protočnu citometriju, skupine od tri krvna uzorka miševa su bile skupljene, i mononuklearne stanice su dobivene pomoću centrifugiranja u gradijentu i bile su resuspendirane u PBS u koncentraciji 1 x 106/ml. Stanice su zatim inkubirane u prisustvu specifičnih monoklonskih antitijela (završno razrjeđenje 1:10) tijekom 30 minuta pri 40C. Za detekciju CD34+ stanica, koristilo se pročišćeno štakorsko anti-mišje monoklonsko antitijelo (Pharmingen, RAM34) kao prvi sloj. Nakon tri ispiranja, stanice su resuspendirane u PBS i inkubirane s poliklonskim kozjim anti-štakorskim FITC (Pharmingen). Da bi se detektiralo stanice Sca-1+/CD34+, uzorci su dalje ispirani tri puta u PBS i inkubirani sa štakorskim anti-mišjim Sca-1 (Ly.6A.2) PE od Caltag-a. Supstituirajući primarno antitijelo s irelevantnim imunoglobulinom izvršena je specifična kontrola. Dobivanje podataka i analiza su procijenjeni pomoću FAC-Scan(tm) protočnog citometra (Becton Dickinson) koristeći programsku podršku Lysis II (Slika 3).

Da bi se evaluiralo različite režime doziranja OGP(10-14), miševi oštećeni kemoablacijom podvrgnuti su dnevnom tretmanu s OGP(10-14), kako je ocrtano na Slici 4. Miševi su žrtvovani na dan +15, femoralna koštana srž je isprana, i jednostanične suspenzije (pripravljene kao gore) su bile podvrgnute ex vivo analizama za ishodišne stanice (koje oblikuju kolonije). Učinak OGP(10-14) na formiranje CFU-GM, CFU-GEMM i BFU-E bio je uspoređen s onim od G-CSF (Slika 4).

Analize ishodišnih stanica

Stanice koštane srži ponovno su prikupljene na dan +10 nakon injekcije CFA iz svih skupina. Stanice su razrijeđene do 2 x 106/ml u Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMFM) s 2% FBS i dodane metilceluloznom mediju u skladu s preporukama proizvođača (MethoCult, Stem Cell Technologies Inc. Vancouver, Kanada). 2 x 104 stanica bilo je nasađeno u svakom testu. Korišteni su i M3434 (za mišju GM-CFU, i GEMM-CFU) i M3334 (za mišju BFU-E analizu). M3434 je suplementiran rekombinantnim mišjim interleukinom-3 (rmIL-3, 10 ng/ml), rekombinantnim ljudskim interleukinom-6 (rhIL-6, 10 ng/ml), rekombinantnim mišjim faktorom matičnih stanica (rmSCF, 50 ng/ml) i rekombinantnim ljudskim eritropoietinom (rhEpo, 3 U/ml). U M3434 jedini uključen faktor je bio Epo. Dvostruki testovi za svakog miša bili su na slijepo ispitani nakon 14 dana od inkubacije u skladu s protokolom procedura.

Rezultati

Ukupni i diferencijalni zbrojevi WBC izvedeni na dan +3 pokazali su izrazito smanjenje u svim skupinama tretiranim s CFA (Slika 2). Na dan 7, postojala je približno 2-struka obnova ukupnih WBC zbrojeva u samo nociocem tretiranih kemijski oštećenih miševa, koji su bili još značajno niži od vrijednosti zabilježenih u netretiranim referentnim miševima. S druge strane, životinje s OGP(10-14) pokazale su više vrijednosti pri svim testiranim dozama, s vršnim izmjerenim zbrojevima u miševa koji su primali 10 nmol OGP(10-14)/na dan. Zbrojevi u ovoj skupini tijesno su se približavali onima, opaženim u netretiranoj referentnoj skupini (Slika 2A). Diferencijalni zbrojevi stanica izvedeni na dan 7 su također demonstrirali jedan s OGP(10-14) inducirani, o dozi zavisan porast u zbrojevima monocita i nezrelih stanica (Slike 2B, 2C). Monocitni zbrojevi pri maksimalnoj dozi (10 nmol) su bili 6-struko viši u usporedbi s normalnom referencom (Slika 2B); oni od nezrelih stanica su bili također značajno viši od reference (Slika 2C). Ukupni zbrojevi WBC u svim skupinama životinja su bili normalni od dana 10 i nadalje (Slika 2A). Međutim, zbrojevi monocita još su pokazivali isti trend viđen na dan 7, uz dostizanje normalnih razina na dan 14 (Slika 2B). Usprkos smanjenju u zbrojevima nezrelih stanica u svima, osim u skupini s 0,01 nmol, najviše vrijednosti su još dobivane u skupini s 10 nmol. Zbrojevi nezrelih stanica su bili normalni u svim skupinama od dana 14 i nadalje (Slika 2C).

Količina dvostruko pozitivnih CD34+/Sca-1+ stanica na dan +5 je bilo 5-struko viša u kemijski oštećenim životinjama koje su tretirane dnevno s 10 nmol OGP(10-14), nego u miševa tretiranih samo s nosiocem (Slika 3). Učinak OGP(10-14) je bio sličan onome od G-CSF. Mjerenja protočne citometrije, izvedena na dane +7 i + 15, pokazala su usporedive brojeve sa CD34+/Sca-1+ stanicama. Međutim, na dan +15, miševi tretirani s OGP(10-14) pokazali su značajno viši zbroj, nego miševi tretirani s nosiocem ili s G-CSF (Slika 3).

Analize ishodišnih stanica pokazale su, da OGP(10-14) značajno stimulira CFU-GEMM i BFU-E, ali ne CFU-GM. Učinak OGP je bio jasan samo u slučajevima gdje je nastup tretmana prethodio kemoablaciji za 7 dana (Slika 4). Odsustvo učinka OGP(10-14) na CFU-GM je konzistentno s njegovim beznačajnim učinkom na zbrojeve krvnih granulocitnih stanica. G-CSF je imao učinak samo na CFU-GM (Slika 4).

Primjer 4

OGP(10-14) pomaže hematopoetskoj celularnosti koštane srži u ex vivo uzorcima iz pacijenata s idiopatskom mijelofibrozom

Materijali i postupci

Da bi se procijenila učinkovitost OGP(10-14) u ljudima, njegova se hematopoetska aktivnost proučavala u ex vivo uzorcima koštane srži dobivenim iz pacijenata koji pate od idiopatske mijelofibroze (IMF).

Pet pacijenata s IMF, jedan pacijent sa sklerodermom i dva pacijenta s drugim mijelodisplastičnim sindromima (Myelodisplastic syndromes, MDS) bilo je uvršteno u proučavanje nakon potpisivanja informiranog pristanka. Dijagnoza IMF je postavljena na bazi standardnih kliničkih i hematoloških postupaka [Barosi, G., et al., Br. J. Haematol. 104:730-737 (1999)]. Biopsija koštane srži pokazala je fibrozu kao jednu osnovnu značajku. Dijagnoza IMF se konačno ustanovila nakon isključivanja drugih mogućih uzroka fibroze i prisustva različitih mijeloproliferativnih poremećaja. Posebno je isključena dijagnoza kronične mijelogene leukemije putem isključivanja prisutnosti Ph kromosoma i rearanžmana bcr/abl. Tri od pet pacijenata s IMF prethodno se tretiralo niskim dozama busulfana, koji se davao deset dana svakog mjeseca i 1 (g 1,25(OH)2D3/na dan. Podaci o pacijentima sažeti su u Tablici 1.

Tablica 1: Klinički podaci o IMF pacijentima (A-E) i o MDS pacijentima (F-G)

[image] *, normalne vrijednosti: 240-480 U/l

**, Ekografsko mjerenje

Tri mm dugi uzorci koštane srži uzeti su iz posteriorne gornje iliakalne kralježnice pomoću odbacive igle za biopsiju veličine 8, opremljene jednim spremnikom da bi se osigurala minimalna distorzija uzorka (TraoSystem MDThech, USA). Uzorci su podijeljeni u tri dijela, duljine 1 cm. Jedan nasumce odabran dio koristio se za preliminarnu morfološku procjenu. Dva preostala fragmenta kultivirana su u 35-mm posudama za kulturu tkiva i potpuno prekrivena s 1 ml Dexteru-nalik medija, u prisustvu rhSCF (50 ng/ml), rhGM-SCF (10 ng/ml), rhIL-3 (10 ng/ml) i rhEpo (2 jedinice/ml) sa ili bez 10-8M OGP(10-14), pri 370C, 5% CO2 u zraku. Polovica medija jednom se promijenila nakon 7 dana, bez preinačavanja njegovog sastava, osim ponovnog uspostavljanja inicijalne koncentracije citokina i OGP(10-14). Nakon dodatnih sedam dana u kulturi, uzorci koštane srži bili su histološki obrađeni. Ukratko, uzorci su bili fiksirani u modificiranom B5, demineralizirani u E.D.T.A kiselom puferu i presjeci su bojeni sa Giemsa, hematoksilin-eozinom ili srebrnom impregnacijom retikuluma. Promjene u koštanoj srži su procjenjivane polukvantitativno ocjenama od I do IV. Ocjena IV se koristila za uzorke koštane srži bogate stanicama u usporedbi s normalnim; ocjena III je predstavljala smanjenu celularnost sa smanjenom gustoćom jezgara; uzorci s ocjenom II pokazivali su proširene praznine; a hematopoetske stanice u uzorcima s ocjenom I su bile krajnje oskudne i/ili je područje koštane srži bilo općenito zamijenjeno praznim područjima. Barem 3 jednako razmaknuta histološka presjeka po uzorku bili su ispitivani koristeći cjelokupnu površinu presjeka. Uz to, gustoća stanica je automatski procjenjivana koristeći računski potpomognuti mikroskop Leica, opremljen programskom podrškom Leica.QWin, kao omjer između zbroja stanica i površine koštane srži. Rezultati za svakog pacijenta su izraženi kao omjer srednje vrijednosti gustoće stanica u uzorcima iz tretiranih s OGP(10-14), prema netretiranim uzorcima (omjer T/C).

Rezultati

Nakon 14 dana u kulturi, uzorci koštane srži tretirani s OGP(10-14) pokazali su se bogatijim u hematopoetskim stanicama, nego uzorci bez OGP(10-14) iz istih pacijenata (Slike 5, 6). Polukvantitativna ocjena se značajno povećala u svim pacijentima s IMF (p<0,05). Nisu detektirane nikakve razlike između uzoraka tretiranih s OGP(10-14) i onih netretiranih u pacijenata bez IMF. Evaluacija celularnosti, potpomognuta računalom, pokazala je omjer T/C > 1 u svim slučajevima s IMF (p<0,01), jako indicirajući da se povećao broj stanica u uzorcima tretiranim s OGP(10-14). Štoviše, omjer T/C bio je statistički značajan u svakom paru uzoraka dobivenom iz pojedinih pacijenata (Tablica 2). Omjer T/C je pokazao vrlo visoku i inverznu korelaciju s razinom hemoglobina u tih pacijenata (Slika 7). Snižene razine hemoglobina su najvažniji serološki pokazatelj za žestinu IMF. Ova korelacija stoga jako sugerira da je učinak OGP(10-14) najviši u najžešće pogođenih pacijenata.

Tablica 2: Evaluacija gustoće stanica potpomognuta računalom.

[image]

Omjer između eritroidnih i mijeloidnih stanica bio je očito nepromijenjen nakon kultiviranja s OGP(10-14). Međutim, polukvantitativna procjena sugerirala je 1,5 do 10-struko smanjenje broja megakariocita u uzorcima dobivenim iz pacijenata s IMF. Kao i u slučaju cjelokupne hematopoetske celularnosti, takve razlike nisu bile pronađene u uzorcima dobivenim iz pacijenata bez IMF-a.

POPIS SEKVENCI

<110> YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW

<120> OGP ugljikovi terminalni sintetički peptidi koji imaju hematološko djelovanje

<130> 13361wo

<140>

<141>

<160> 4

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Umjetna sekvenca

<220>

<223> Opis umjetne sekvence: Sekvenca sintetičkog peptida

<400> 1

tir gli fe gli gli

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Umjetna sekvenca

<220>

<223> Opis umjetne sekvence: Sekvenca sintetičkog peptida

<400> 2

tir gli fe his gli

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Umjetna sekvenca

<220>

<223> Opis umjetne sekvence: Sekvenca sintetičkog peptida

<400> 3

gli fe gli gli

1

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Umjetna sekvenca

<220>

<223> Opis umjetne sekvence: Sekvenca sintetičkog peptida

<400> 4

met tir gli fe gli gli

1 5

Claims (46)

1. Uporaba oligopeptida, koji ima molekularnu masu od 200 do 1.000 Da, i koji sadrži redoslijed aminokiselina bilo kojeg od peptida, odabranih iz skupine koja se sastoji od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za pojačavanje mobilizacije multilinijskih hematopoetskih matičnih stanica u perifernoj krvi.

2. Uporaba oligopeptida, koji ima molekularnu masu od 200 do 1.000 Da i sadrži redoslijed aminokiselina bilo kojeg od peptida odabranih iz skupine koja se sastoji od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za pojačavanje mobilizacije multilinijskih ranih CD34 pozitivnih hematopoetskih matičnih stanica u perifernoj krvi.

3. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 i 2, naznačena time, da pojačavanje mobilizacije u perifernoj krvi dovodi do porasta u broju cirkulirajućih multilinijskih ranih CD34 pozitivnih hematopoetskih matičnih stanica.

4. Uporaba oligopeptida, koji ima molekularnu masu od 200 do 1.000 Da i sadrži redoslijed aminokiselina bilo kojeg od peptida odabranih iz skupine koja se sastoji od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za pripremanje presadka matičnih stanica periferne krvi za liječenje nekog subjekta kojem je to potrebno.

5. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 4, naznačena time, da navedeni oligopeptid pojačava mobilizaciju multilinijskih hematopoetskih matičnih stanica u perifernoj krvi.

6. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 5, naznačena time, da su navedene hematopoetske matične stanice, CD34 pozitivne stanice.

7. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 2, 3 i 4, naznačena time, da su navedene cirkulirajuće multilinijske matične stanice, dvostruko pozitivne CD34/Flk2 stanice.

8. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da je navedeni oligopetid jedan pentapeptid formule: tir-gli-fe-gli-gli, kako je označeno redoslijedom aminokiselina SEQ ID broj: 1.

9. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevima 1 do 4, naznačena time, da je navedeni oligopetid jedan pentapeptid formule: tir-gli-fe-his-gli, kako je označeno redoslijedom aminokiselina SEQ ID broj: 2.

10. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da je navedeni oligopetid jedan heksapeptid formule: ac-met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je označeno redoslijedom aminokiselina SEQ ID broj: 4.

11. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da je navedeni oligopetid jedan tetrapeptid formule: gli-fe-gli-gli, kako je označeno redoslijedom aminokiselina SEQ ID broj: 3.

12. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 3, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za pojačavanje obnove nezrelih stanica i monocita.

13. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 4, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za selektivno povećavanje bilo kojih od BFU-E i GEMM jedinica za formiranje kolonija (CFU).

14. Uporaba oligopeptida, koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za pojačavanje selektivne proliferacije CD34 pozitivnih hematopoetskih matičnih stanica u nekog subjekta, kojem je to potrebno.

15. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 14, naznačena time, da su navedene CD34 pozitivne stanice ujedno i dvostruko pozitivne CD34/Flk2 stanice.

16. Uporaba oligopeptida, koji ima redoslijed aminokiselina bilo kojeg između tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za pripremanje farmaceutskog sastava za liječenje subjekata koji pate od mijeloproliferativnog poremećaja.

17. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 16, naznačena time, da navedeni mijeloproliferativni poremećaj jest idiopatska mijelofibroza (IMF).

18. Uporaba u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 16 i 17, naznačena time, da navedeni farmaceutski sastav povećava broj cjelokupne celularnosti koštane srži u nekog subjekta koji pati od IMF.

19. Uporaba oligopeptida, koji ima redoslijed aminokiselina bilo kojeg od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, naznačena time, da je za in vitro i/ili ex vivo selektivno održavanje i/ili ekspanziju populacije CD34 pozitivnih matičnih stanica u nekom uzorku krvi.

20. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 19, naznačena time, da navedeni uzorak krvi jest uzorak krvi sisavca.

21. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 20, naznačena time, da navedeni uzorak krvi jest uzorak ljudske krvi.

22. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 20, naznačena time, da navedeni uzorak krvi potječe iz nekog sisavca koji pati od smanjenog broja krvnih stanica ili je prijemčiv na smanjenje broja krvnih stanica.

23. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 22, naznačena time, da su navedeni smanjeni krvni brojevi izazvani kemoterapijom, terapijom zračenjem, ili terapijom transplantacije koštane srži.

24. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 23, naznačena time, da navedeni sastav nadalje sadrži barem jedan citokin.

25. Uporaba u skladu s patentnim zahtjevom 24, naznačena time, da je navedeni citokin odabran iz skupine sastavljene od TPO (Trombopoietin), EPO (Eritropoietin), M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor, faktor stimulacije makrofagnih kolonija), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage-CSF, faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija), G-CSF (Granulocyte CSF, faktor stimulacije granulocitnih kolonija), IL-1 (Interleukin-1) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF (Leukemia Inhibitory Factor, faktor inhibicije leukemije) i KL (Kit Ligand).

26. Postupak za pojačanje mobilizacije multilinijskih hematopoetskih matičnih stanica do periferne krvi, naznačen time, da se sastoji od koraka davanja potrebitom subjektu, učinkovite količine oligopeptida, koji ima redoslijed aminokiselina od bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili farmaceutskog sastava koji sadrži iste.

27. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 26, naznačen time, da navedene matične stanice jesu multilinijske rane CD34 pozitivne matične stanice.

28. Postupak za pojačanje broja cirkulirajućih multilinijskih ranih CD34 pozitivnih matičnih stanica, naznačen time, da se sastoji od koraka davanja nekom potrebitom subjektu učinkovite količine oligopetpida koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili farmaceutskog sastava koji sadrži iste.

29. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 28, naznačen time, da navedeni potrebiti subjekt jest pacijent koji prima zračenje ili kemoterapiju.

30. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 28, naznačen time, da navedeni subjekt pati od bilo kojeg od hematoloških poremećaja, solidnih tumora, imunoloških poremećaja i aplastičke anemije.

31. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 30, naznačen time, da je navedeni hematološki poremećaj odabran iz skupine koja se sastoji od limfoma, leukemija, Hodgkin-ovih bolesti i mijeloproliferativnih poremećaja.

32. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 28, naznačen time, da su navedene cirkulirajuće matične stanice dvostruko CD34/Flk2 pozitivne stanice.

33. Postupak selektivnog povećanja broja bilo koje od BFU-E i GEMM jedinica za formiranje kolonija (Colony Forming Units, CFU), naznačen time, da se sastoji od koraka davanja potrebitom subjektu učinkovite količine oligopetpida koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili farmaceutskog sastava koji sadrži iste.

34. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 33, naznačen time, da navedeni potrebiti subjekt jest pacijent koji prima zračenje ili kemoterapiju.

35. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 33, naznačen time, da navedeni subjekt pati od bilo kojeg od hematoloških poremećaja, solidnih tumora, imunoloških poremećaja i aplastičke anemije.

36. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 35, naznačen time, da je navedeni hematološki poremećaj odabran iz skupine koja se sastoji od limfoma, leukemija, Hodgkin-ovih bolesti i mijeloproliferativnih poremećaja.

37. Postupak za povećanje broja bilo koje od BFU-E i GEMM jedinica za formiranje kolonija (Colony Forming Units, CFU), naznačen time, da uključuje izlaganje navedenih stanica jednoj učinkovitoj količini oligopetpida koji sadrži redoslijed aminokiselina tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili sastavu koji sadrži navedeni oligopeptid kao učinkoviti sastojak.

38. Postupak liječenja subjekta koji pati od mijeloproliferativnog poremećaja, naznačen time, da uključuje davanje navedenom subjektu terapeutski učinkovite količine oligopeptida koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili sastava koji sadrži navedeni oligopeptid kao učinkoviti sastojak.

39. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 35, naznačen time, da navedeni mijeloproliferativni poremećaj jest idiopatska mijelofibroza (IMF).

40. Postupak za pojačanje proliferacije hematopoetskih CD34 pozitivnih matičnih stanica, naznačen time, da uključuje izlaganje navedenih stanica učinkovitoj količini oligopeptida koji sadrži redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili sastavu koji sadrži navedeni oligopeptid kao učinkoviti sastojak.

41. Postupak za selektivno povećanje broja hematopoetskih CD34 pozitivnih matičnih stanica, naznačen time, da uključuje korak davanja potrebitom subjektu učinkovite količine oligopetpida koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili farmaceutskog sastava koji sadrži iste.

42. Postupak u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 40 i 41, naznačen time, da navedena CD34 pozitivna stanica jest dvostruko pozitivna CD34/Flk2 stanica.

43. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 41, naznačen time, da navedeni subjekt jest pacijent koji prima zračenje ili kemoterapiju.

44. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 41, naznačen time, da navedeni subjekt pati od bilo kojeg od hematoloških poremećaja, solidnih tumora, imunoloških poremećaja i aplastičke anemije.

45. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 44, naznačen time, da je navedeni hematološki poremećaj odabran iz skupine koja uključuje limfome, leukemije, Hodgkin-ove bolesti i mijeloproliferativne poremećaje.

46. Postupak za in vitro i/ili ex vivo održavanje i/ili ekspanziju populacije matičnih stanica u uzorku krvi, naznačen time, da uključuje izoliranje perifernih krvnih stanica iz navedenog uzorka krvi, obogaćivanje krvnih ishodišnih stanica koje izražavaju antigen CD34, nagomilavanje obogaćenih ishodišnih krvnih stanica pod prikladnim uvjetima, tretiranje navedenih stanica s oligopeptidom koji ima redoslijed aminokiselina bilo koje od tir-gli-fe-gli-gli, tir-gli-fe-his-gli, gli-fe-gli-gli i met-tir-gli-fe-gli-gli, kako je odgovarajuće označeno sa SEQ ID brojevima: 1, 2, 3, odnosno 4, ili sa sastavom koji sadrži navedeni oligopeptid kao učinkoviti sastojak.