JP2004536876A - 造血促進物質としての骨再生組織増殖オリゴペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、有効成分として、造血細胞の産生に刺激活性を有するOGPのC-末端部分と同じかまたは同属のオリゴペプチドを含む医薬組成物に関するものである。使用するのに望ましいオリゴペプチドはTyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly or Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.である。より具体的には、これらのオリゴペプチドは、望ましくは化学療法または照射の後に、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び末梢幹細胞動員を増強する。さらに本発明は治療方法及び医薬組成物の調製にこれらのオリゴペプチドを使用する方法を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、造血促進物質として、OGPのC-末端部分に相当するオリゴペプチドを使用することに関係する。より具体的には、これらのオリゴペプチドは特に化学療法または放射線照射の後の骨髄移植の定着、造血機能の再構築、骨髄の再構成及び循環幹細胞数の増加を促進する。本発明はさらにこれらのオリゴペプチドの使用方法及びそれらを含む医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨と骨髄の生物学的及び生化学的相互作用は十分に理解されているというには程遠い。しかし、最近の研究により造血細胞発生の維持における骨再生細胞由来の骨髄の役割が確認された [Teichman, R.S., et al., Hematol. 4: 421-426 (2000)]。
【０００３】
骨髄移植の研究により、二つのシステムの間の双方向の相互作用が確認された。骨髄摘出または照射傷害は初期の局所性一過性骨再生反応を誘発する[Amsel, S., et al., Anat. Rec. 164: 101-111 (1969); Patt, H.M., and Maloney, M.A., Exp. Hematol. 3: 135-148 (1975)]。この骨再生相において、髄腔中に繊維柱が形成される。この繊維柱は一過性のものであり、造血性骨髄が再構築される間に吸収されてしまう。さらに、ヒト骨髄提供者において、腸骨骨髄のかなりの部分を採取した後に血清骨形成マーカーであるオステオカルシン及びアルカリホスファターゼの増加を記録している[Foldes,J.,et al., J. Bone Miner. Res. 4: 643-646 (1989)]。ヒト骨芽細胞はヒト造血前駆細胞を支持するという仮説は非常に興味をそそる：これらの細胞は外部から増殖因子を供給せずに造血コロニーの形成を促進する因子を生成する。事実、骨芽細胞は顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-SCF）、腫瘍壊死因子（TNF）、及びインターロイキン6（IL-6）を含む数種のサイトカインを分泌する。さらに、培養骨芽細胞は造血幹細胞の未熟表現型の維持を支持する[Taichman, et al., Blood 87: 518-524 (1996)]。
【０００４】
これらの増殖因子のいくつかは高用量化学療法後のインビボ骨髄再生及び末梢幹細胞動員を改善する。その中でも、G-CSF, GM-CSF, IL-3（インターロイキン3）及びSCF（幹細胞因子）が詳細に評価されてきた[Bungart, B., et al., Br. J. Haematol. 76: 174 (1990); Lant, T., et al., Blood 85: 275 (1995); Brugger, W., et al., Blood 79: 1193 (1992); Molinex, G., et al., Blood 78: 961 (1991)]そしてそのほかのFLT-3のような多くのものが臨床使用について研究されている[Ashihara, E., et al., Europ. J. Haematol. 60: 86 (1998)]。この数年のこの分野における進歩は骨髄機能のいくつかの生理的側面の理解を可能にした。さらに、造血前駆体の分化と増殖を調節できるようになったので、末梢血幹細胞移植、遺伝子導入及び幹細胞のエクスビボ増殖のような革新的治療の基礎となっている。このような印象的な進歩にもかかわらず、幹細胞の生理のいくつかの側面は十分に明らかにされておらず、そして可溶性及び膜結合のいくつかの因子は、骨髄細胞の増殖/分化の生理及び病理に関係するのではないかと考えられている。造血を調節できることが示された因子の数が増加するに従い、造血調節因子の過剰または細い区分に関する批判的疑問が生じている[Metcaff,D., et al., Blood 82: 3515 (1993)]。
【０００５】
古典的に定義された増殖因子の役割に加えて、いくつかの生化学物質及び細胞型はインビボ及びエクスビボの両方において治療方法の改善または変更を可能にした。ヒト骨髄由来内皮細胞は骨髄細胞及び巨核球前駆体の増殖と分化を長期間支持する[Rafii,S., et al., Blood 86: 3353 (1995)];補助細胞は骨髄移植後の血液学的回復を支持することができる[Bonnet,D., et al., Bone Marrow Transpl. 23: 203 (1991)];そして、本目的にとっても興味があるのは、骨芽細胞がマウスにおいてHLAに無関係な骨髄移植の後に移植定着を促進することができる[El-Badri,N.S., et al., Exp. Hematol. 26:110 (1998)]。
【０００６】
多数の化学構造が骨髄の生理における役割について評価するために研究されてきた。例えば、白血病由来細胞系[Volpi,N., et al., Exp.Cell Res. 215: 119 (1994)]及びヒト脊髄血由来幹細胞のクローニング試験[Da Prato, I., et al., Leuk. Res. 23: 1015 (1999)]においてグリコサミノグリカンの効果を評価している。多分ストローマ細胞によるサイトカイン生産の増強による、造血調節及び多系統効果を得るために短いペプチドでさえ合成されている[King,A.G., et al., Exp. Hematol. 20(4): 531 (1992); Pelus,L.M., et al., Exp. Hematol. 22: 239 (1994)]。
【０００７】
特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）はきわめて稀であるが、慢性骨髄肥大疾患の最悪の診断がされる。主な病理過程は、貧血、不規則な巨核球増生、脾腫及び種々の程度の髄外造血にいたる造血幹細胞クローンの異常である。これに対して、特徴的ストローマ増殖は、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子-ベータ（TGF-β）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮増殖因子（EGF）、及びカルモジュリンを含む巨核球/血小板由来増殖因子の不適切な放出による反応性の現象である[Groopman,J., Ann. Intern. Med. 92: 857-858 (1980); Chvapil,M., Life Sci. 16: 1345-1361 (1975)]。IMF患者の生存期間中央値は約4年である。IMFの治療方法は主に補助的なものであり、症状の緩和及びクオリティーオブライフの改善を指向している。一般的なものは輸血、男性ホルモン及びヒドロキシ尿素のような細胞抑制剤である。骨髄移植も徐々に考慮されているが、まだ実験段階とみなすべきである。インターフェロン-アルファ（INF-α）はIMFの初期の過剰増生段階には優れた結果を示したが、病気がより進行した段階ではまったくまたはほんのわずかしか効果がない。
【０００８】
骨再生増殖ペプチド（OGP）、14アミノ酸、高度に保存されたH4ヒストン関連ペプチド、はマウスにおいて血液及び骨髄の細胞構成を増加し、そして骨髄移植の定着を促進することが、本発明者らの一部によりすでに示されていた[Bab,I.A., Clin. Orthop. 313: 64 (1995); Gurevitch,O., et al., Blood 88: 4719 (1996)及び米国特許番号5,461,034]。OGPは切除後の骨髄再生の骨再生期に単離され[Bab,I., et al., Endocrinology, 128(5): 2638 (1991)]そして生理的に主としてα2-マクログロブリン（α2-M）との複合体として血液中に大量に存在する[Gavish,H., et al., Biochemistry, 36: 14883-14888 (1997)]。これをインビボに投与すると、骨形成を促進しそして繊維柱骨量を増加する；インビトロでは、骨再生細胞系において増殖とアルカリホスファターゼ活性を増強する；さらに、繊維芽細胞の分裂を誘発する[Greenberg,Z., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1178: 273 (1993)]。骨再生、骨芽細胞活性化及び繊維芽細胞増殖に対するOGPの作用に加えて、インビボにおいてバランスの取れた白血球（WBC）数の増加、骨髄除去照射を受けそして同系または半同種骨髄移植を受けたマウスにおける全体的骨髄細胞構成を誘導することが示されている[Gurevitch,O., et al., 前出（1996）]。
【０００９】
α2-Mとの不活性な複合体から解離する際に全長OGPのタンパク分解酵素切断により産生されると思われるOGPのC-末端ペンタペプチド、OGP(10-14)と命名、は哺乳動物血清中及び骨再生細胞培養中に高いレベルで存在する[Bab,I., et al., J. Pept. Res. 54: 408 (1999)]。N-末端修飾OGPは細胞増殖に対するOGP様用量依存的効果を維持しており、カルボキシ末端ペンタペプチドはOGP受容体候補への結合に関与することが示唆されている[Greenberg,Z., et al., 前出（1993）]。さらに、骨再生MC3T3 E1細胞において細胞分裂を発生する用量のOGP(10-14)が時間と用量に依存するMAPキナーゼ活性を増強する、しかしOGPはしない、ことを発明者らは既に示している。これらの知見は、OGP(10-14)が下流の信号伝導に関与することを示している[Gabarin, et al., J. Cell Biol. 81: 594-603 (2001)]。さらに、OGPの活性型はカルボキシ末端ペンタペプチドOGP(10-14)であることが示された。興味深いことには、OGP(10-14)はα2-MまたはそのほかのOGPBP（OGP結合タンパク）と複合体を形成しない[Bab,I., J. Peptide Res. 54: 408-414 (1999)]。
【００１０】
したがって、天然OGPのC-末端領域に類似する合成オリゴペプチドの造血活性を本発明において評価した。そのような骨再生活性特異的ペプチドの一部は米国特許番号5,814,610に記述されている。合成OGP(10-14)はオピエート及び鎮痛活性を持つことが記述されている[Kharchenko et al., Vepr. Med. Khim., 35(2) 106-109 (1989)]。
【００１１】
本発明が示す重要なことは、すでに知られている骨再生活性オリゴペプチドが造血システムの刺激物質として作用することである。例えば、OGP(10-14)と命名された合成OGP由来ペンタペプチドはマウスにおける血液及び骨髄細胞構成を増加し、骨髄移植の定着を促進する。このペンタペプチドはシクロホスファミド（CFA）誘発形成不全後の末梢血細胞回復及び幹細胞動員に対して有意な作用を示した。さらに、IMF患者からの骨髄組織中における合成OGP(10-14)のエクスビボ効果を試験して、造血細胞数の相当の増加を示した。さらに、OGP(10-14)効果の程度はIMFの重篤度に比例した。これらの結果は、OGP(10-14)が血液細胞形成を増強して、造血を救援しうることを示している。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、OGP由来オリゴペプチドを造血増殖因子として使用することである。本発明のこの目的及びその他の目的は以下の記述により詳述される。
【００１３】
発明の開示
発明の要約
最初の態様において、有効成分として造血細胞の産生に対して促進効果を持つ少なくとも一つのオリゴペプチドを含む医薬組成物に関係する。本発明にしたがって使用されるオリゴペプチドは200から1,000 Daの分子量を有し、そしてアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.のいずれかを含むオリゴペプチドでありうる。本発明の医薬組成物は任意に医薬品として受容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００１４】
本態様の望ましい態様において、本発明の医薬組成物は式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly(designated OGP(10-14))を持つペンタペプチドであるオリゴペプチド及び医薬品として受容される担体を含む。
【００１５】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物は式：Tyr-Gly-Phe-His-Gly.を持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００１６】
さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は式：Gly-Phe-Gly-Glyを持つテトラペプチドであるオリゴペプチド及び医薬品として受容しうる担体を含む。
【００１７】
そしてさらに他の態様において、本発明の医薬組成物はアミノ酸配列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、その中のメチオニン残基が望ましくはアセチル化されている、すなわち式：Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.を持つオリゴペプチド及び医薬品として受容しうる担体を含む。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強が意図されている。
【００１９】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物は、特に化学療法または照射を受けた患者における、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強が意図されている。
【００２０】
本発明の医薬組成物に使用されるオリゴペプチドは循環する多系統前駆細胞パーセンテージを増加する。この多系統前駆細胞は循環する初期前駆CD34陽性細胞である。
【００２１】
さらに、本発明の医薬組成物中に有効成分として使用されるオリゴペプチドは未熟細胞及び単球の回復及びBFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つの選択的増加を促進する。
【００２２】
したがって、本発明の医薬組成物は白血球（WBC）数、循環造血幹細胞並びに骨髄全体及び血液細胞構成の増加が意図されている。
【００２３】
特別に望ましい態様において、本発明の組成物は骨髄移植を支持することが意図されている。この効果は骨髄移植の際に造血幹細胞数の増加、造血の再構築の促進及び全体的骨髄細胞構成の増強に対するオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００２４】
そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明の医薬組成物は、血液学的異常、固形腫瘍、免疫異常及び/または再生不良性貧血罹患した患者の骨髄移植治療に使用することが意図されている。より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患であろう。特に、骨髄肥大性疾患は特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００２５】
第二の態様において、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成促進及び循環幹細胞数の増加を意図した医薬組成物の調製にアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれか一つを含むオリゴヌクレオチドを使用することに関係している。
【００２６】
特別な態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、特に照射または化学療法を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成促進及び循環幹細胞数の増加を意図した医薬組成物の調製に使用される。
【００２７】
望ましい態様によると、上記特異的オリゴペプチドは循環多系統前駆細胞数の増加のための医薬組成物の調製に使用される。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34陽性細胞である。
【００２８】
さらに、本発明の医薬組成物の調製に使用されるオリゴペプチドは未熟細胞、単球回復を促進しそしてBFU-E及びGEMMコロニー形成単位（CFU）のいずれか一つを選択的に増加する。
【００２９】
したがって、そのオリゴペプチドは白血球（WBC）数、循環造血幹細胞、及び/または総骨髄細胞構成の増加を意図した医薬組成物の調製に使用することができる。
【００３０】
より具体的には、本発明は骨髄移植を支持するための医薬組成物の調製にこれらのオリゴペプチドの使用を提供する。この効果は幹細胞数の増加、骨髄移植に際する造血再構築の促進及び骨髄細胞構成の増加に及ぼすオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００３１】
そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明は、血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常及び/または再生不良性貧血の患者の治療を意図した医薬組成物の調製に該オリゴペプチドを使用することに関係している。より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病または骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００３２】
第三の態様において、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強する方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量を投与する段階を含む。本発明のこの方法は、照射または化学療法を受けた患者において骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための望ましい態様にしたがって使用することができる。
【００３３】
この態様の特別な態様にしたがって、本発明は血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常及び/または再生不良性貧血の患者を治療する方法に関係する。本発明の方法は上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【００３４】
そのほかの特別な態様において、この方法は骨髄移植による患者の治療を支持するために使用することができる。
【００３５】
より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病または骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００３６】
望ましい態様は造血幹/前駆細胞数を増加する方法に関係する。本発明によると、この方法は上記のように造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物の有効量にこの細胞を暴露する段階を含む。
【００３７】
特に望ましい態様において、本発明の方法はCD34陽性細胞の増殖を促進することが意図されている。
【００３８】
特別に望ましい態様において、細胞は細胞培養中にあり、本方法はエクスビボまたはインビトロで使用することができる。
【００３９】
そのほかに、本発明の方法は望ましくは哺乳動物の、特にヒトの治療方法として使用することができる。
【００４０】
治療される患者は、化学療法、照射療法または骨髄移植に起因する血球の減少した、または減少を生じやすい患者である。
【００４１】
そのほかの望ましい態様において、本発明は血液検体中に存在する造血幹細胞のインビトロまたはエクスビボにおける維持及び/または増殖の方法に関係する。この方法は、血液検体から末梢血液細胞を単離し、CD34抗原を発現する血液前駆細胞を濃縮し、濃縮血液前駆細胞を適当な条件下に播種し、そして該細胞を上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物で処理することを含んでいる。
【００４２】
本発明に従うインビボ治療は、哺乳動物において血液細胞を再構成する方法に関係している。この方法は、該哺乳動物に上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物を投与する段階を含んでいる。これらの造血細胞は赤血球系、骨髄系またはリンパ系細胞でありうる。
【００４３】
発明の詳細な説明
細胞生物学及びペプチド化学の分野の多数の方法は、この中では詳述しないが、当業者には良く知られている。そのような方法にはペプチド合成及び構造分析、血球分類、細胞分別分析、コロニー形成検定などがある。そのような方法に関する教科書は、例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds), John Wiley & Sons. Inc., New York, NY and Stewart, J.M. and Young J.D., In: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, pp. 1-175 (1984).これらの出版物は引用してその全体をここに取り入れた。さらに、多数の免疫学的技術は、当業者には良く知られているので、個々の例について詳述しない。
【００４４】
以下の略語がここでは使用される：
OGP(ｓ) - 骨再生増殖ポリペプチド
OGPBP(ｓ) - 骨再生増殖ポリペプチド結合タンパク
sOGP - 合成OGP
WBC - （白血球）
PBL - （末梢血液）
CFA - （シクロホスファミド）
BMT - （骨髄移植）
IMF - （特発性多発性骨髄繊維増殖）
【００４５】
いくつかの細胞性または可溶性物質は骨と骨髄の間の相互作用に関与しうる。この相互作用は造血幹細胞及び前駆細胞の拘束、増殖、及び分化の調節に必須であるように思われる。
【００４６】
OGPは骨再生及び骨髄細胞構成を増加する[Greenberg,Z., et al., 前出(1993); Gurevitch,O., et al., 前出（1996）]。さらに、OGPは骨芽細胞及び繊維芽細胞及び骨髄ストローマ細胞に対して強力な細胞分裂物質である[Greenberg,Z., et al., J. Cellular Biochem, 65: 359-367 (1997); Robinson,D., et al., J. Bone Min. Res., 10: 690-696 (1995)]。
【００４７】
骨芽細胞系において、OGPは百日咳毒感受性Gタンパクを介する細胞分裂物質活性化タンパクキナーゼを活性化することが最近報告された。この作用はC-末端ペンタペプチドOGP(10-14)に限られているようであり、したがって、OGP(10-14)はOGPの生物活性型であることが示唆されている[Bab,I., et al., 前出(1999)]。OGP(10-14)は、免疫原性及び毒性がなくそしてこのペプチドの製造及び取り扱いが比較的容易であることを考慮すると、インビボ使用の可能性の点から非常に関心が持たれる。
【００４８】
正常マウスに0.1から10 nmolのOGPを2週間毎日皮下に注射したところ、このペプチドは白血球数の50％以上の増加及び総骨髄細胞構成の約40％増加を誘導することが、以前の研究により示されていた[Gurevitch,O., et al.,前出（1996）]。処置により分類細胞型の比率は変化しなかったので、造血に対して多系統的作用を持つことを示している。興味あることは、この記述した実験において、CFA（シクロホスファミド）投与により可逆性の無形成を誘発した後に、OGP(10-14)で処置したマウスはプラセボを投与されたマウスよりも早く回復し、そして使用した用量では明らかな毒性を認めていない。
【００４９】
このように、第一の態様において、本発明は、有効成分として造血細胞の産生に促進活性を持つオリゴペプチド、望ましくはそれぞれSEQ ID NO:1，2，3，及び4により規定されるアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly or Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,の少なくとも一つ、及び医薬品として受容しうる担体を含む医薬組成物に関係する。
【００５０】
骨髄に局在する細胞の分裂により赤血球及び白血球が置換される血液細胞産生の過程を造血という。造血に関する総説はDexter and Spooncer [Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 (1987)]参照。
【００５１】
多数の異なる血液細胞の型が存在し、それらは異なる細胞系統に属している。各系統にしたがって、異なる成熟段階の細胞が存在する。成熟細胞は異なる機能に特化している。例えば、赤血球はO2及びCO2の輸送に関与している；T及びBリンパ球はそれぞれ細胞及び抗体仲介免疫応答に関与している；血小板は血液凝固に必要である；そして顆粒球及びマクロファージは一般的なスカベンジャー及び補助細胞として働く。顆粒球はさらに好塩基球、好酸球、好中球及びマスト細胞に分類することができる。
【００５２】
本態様の特別に望ましい態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:1により規定される式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyを持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。このペンタペプチドは本出願を通してOGP(10-14)と命名される。
【００５３】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:2により規定される式：Tyr-Gly-Phe-His-Gly,を持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００５４】
さらに他の態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:3により規定される式：Gly-Phe-Gly-Glyを持つテトラペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００５５】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:4により規定される式：Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を持つヘキサペプチドであるオリゴペプチドを含み、その中のメチオニン残基はアセチル化することができる。
【００５６】
本発明の医薬組成物中の有効成分として使用されているペプチドは既知有機化学的な方法により合成的に製造される。その合成は、例えば、該米国特許番号5,814,610に記述されている。
【００５７】
本態様の望ましい態様にしたがうと、本発明の医薬組成物は骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環造血幹細胞数の増加が意図されている。
【００５８】
そのほかの態様にしたがうと、本発明の医薬組成物は、化学療法または照射を受けた患者の骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環造血幹細胞数の増強が意図されている。
【００５９】
全ての血液細胞系統の生涯にわたる産生を提供する造血幹細胞の能力は、幹細胞の可塑性、すなわち特別な血液細胞系統を発生させる拘束前駆細胞の産生、及び未分化段階における幹細胞複製（自己再生）、の間のバランスにより達成される。造血幹細胞の可塑性及び自己再生のインビボにおける調節機構は明らかにするのが困難であった。しかし、主な寄与因子は細胞に内在するものと環境の影響の組み合わせであることを示している[Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10302-10306 (1995)]。造血微小環境の重要性は、頻度は低いにもかかわらず、HSCを維持することができるストローマ上において造血細胞を培養する長期骨髄培養システムを使用することにより確立された[Fraser, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992); Wineman, et al., Blood 81: 365-372 (1993)]。
【００６０】
培養において造血細胞が維持できることが示されたので、候補「幹細胞」因子を同定する努力がなされるようになった。幹細胞維持における造血サイトカインの役割は、幹細胞集団のインビトロ培養に精製因子を直接加え、次いで培養細胞を移植することにより研究された[Meunch, et al., Blood 81: 3463-3473 (1993); Wineman et al., 前出（1993）; Rebel, et al., Blood 83: 128-136 (1994)]。IL-3，IL-6及びKLのような既知「初期作用」サイトカインの大部分は拘束前駆細胞の増殖を促進することが示され、他方同時に長期間多系統再構成が可能な細胞を維持することはできたが、増殖はできなかった[Williams, Blood 81(12): 3169-3172 (1993); Muller-Sieburg and Deryugina, Stem Cells, 13: 477-486 (1995)]。これらのデータは細胞可塑性及び再構成機能はサイトカイン処置により保持することはできることを示しているが、これらの多能性細胞の自己再生を促進する分子は未知のままに残されている。
【００６１】
本発明の医薬組成物に使用されたポリペプチドは循環多系統前駆細胞のパーセンテージを増加することが示された。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34 陽性細胞である。
【００６２】
ヒト及びマウスにおいて、初期成熟造血前駆細胞はCD34と呼ばれる細胞表面抗原を発現することにより規定される細胞のクラスに属することを同定することができる。これらの細胞はCD34陽性細胞と呼ばれる。マウスでは、CD34陽性造血細胞の初期サブクラスは二重陽性CD34+/Sca±細胞である。ヒトにおける同属Sca-1細胞表面抗原はFlk2である。したがって、ヒトCD34/Flk2二重陽性細胞はマウス二重陽性細胞CD34/Sca-1細胞と同じと考えられる。
【００６３】
CD34抗原及び/またはFlk2受容体を発現するヒト造血前駆細胞はここでは「初期前駆細胞」と呼ばれる。これに対して、CD34またはflk2のいずれかを発現しない造血細胞は「成熟前駆細胞」と呼ばれる。したがって、望ましい態様として、多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34/Flk2二重陽性細胞である。
【００６４】
ここに使用した「前駆細胞」とは、分化と増殖により完全に分化し、機能する子孫を作ることができる能力を持つ体細胞のことである。前駆細胞は、限定はしないが、血液、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、すい臓、甲状腺、などを含む組織または器官の前駆体を含んでいる。増殖する能力、すなわち、自己複製、の能力を持つこともあり持たないこともあり、しかし正常な生理的条件においては異なる細胞型にそれ以上分化することができない細胞として定義される「分化した細胞」とは前駆細胞は区別される。さらに、前駆細胞は、がん細胞、特に白血病細胞、これは増殖（自己複製）するが未成熟または未分化のように見えるにもかかわらず、一般的にそれ以上の分化はしない、のような異常細胞とも区別される。
【００６５】
前駆体はその子孫によって規定される、例えば、顆粒球/マクロファージコロニー形成前駆細胞（GM-CFU）は好中球またはマクロファージに分化する；初期赤芽球形成ユニット（BFU-E）は分化して赤血球コロニー形成ユニット（CFU-E）となり、これから成熟赤血球が生じる。同様に、Meg-CFU, GEMM-CFU, Eos-CFU及び Bas-CFU前駆体はそれぞれ巨核球、顆粒球、マクロファージ、好酸球及び抗塩基球に分化することができる。
【００６６】
その他種々の造血前駆体が分析されている。例えば、造血前駆細胞は、8種の異なる成熟造血細胞系統を生じる分化及び増殖のサイクルを行うことができる細胞を含んでいる。造血過程の最も初期または未分化の段階における、造血前駆細胞は造血「幹細胞」である。これはまれな細胞であり、骨髄中の細胞の10,000中に1個から100,000中に1個存在し、それぞれが全ての系統の成熟血液細胞1013個以上を作る能力を持ち、そして生物の生涯にわたる血液細胞生産の維持を担っている。それらは骨髄中に主に静止状態で存在しており、自己再生と呼ばれる過程により同一の娘細胞を作ることができる。したがって、そのような非拘束前駆細胞は「全能」と記述することができる、すなわち、全ての型の成熟血液細胞を必要にして十分に作ることができる。全ての血液細胞系統を作る能力を維持しているが、自己再生できない前駆体細胞は「多分化能」細胞と呼ばれる。一部ではあるが全てではない血液系統を作ることができ、そして自己再生できない細胞は「多能」細胞と呼ばれる。
【００６７】
本発明に使用されるオリゴペプチドは、単能前駆細胞、多分化能前駆細胞、及び/または全能前駆細胞を含むこれらの前駆細胞のいずれを保存するにも有用である。このオリゴペプチド、特にOGP(10-14)、は造血前駆細胞の保存に特に有効である。
【００６８】
そのほかの望ましい態様において、本発明の医薬組成物中の有効成分として使用されたオリゴペプチドは、未熟細胞単球回復を促進しそしてBFU−E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つを選択的に増加する。
【００６９】
下記例3には、OGP(10-14)及び対照処置マウス由来の造血コロニー形成のエクスビボ評価が記述されている。この結果は、基剤のみの対照群に比較してOGP(10-14)処置マウス由来の培養中においてGEMM-CFU及びBFU-Eの増加を示し、他方G-CSF陽性対照はGM-CFUの有意な増加を示す。OGP(10-14)処置マウス由来の培養中のコロニー形成の増加は、化学的除去の7日前に処置を開始した場合にのみ、明らかであった。OGP(10-14)により得られたインビボ及びエクスビボのいずれの結果からも、別のサイトカインに比較して全長OGPの既に報告されている多系統活性が確認された。他の増殖及び動員因子[Fleming,W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3760 (1993)]と異なり、sOGP(10-14)は骨髄幹細胞コンパートメントを減少させることなく末梢血中の造血幹細胞の数を増加する。
【００７０】
したがって、本発明の医薬組成物は白血球（WBC）、循環造血幹細胞の数、及び総骨髄細胞構成の増加を意図することができる。
【００７１】
特別に望ましい態様において、本発明の組成物は骨髄移植を支持することが意図されている。この効果は、幹細胞数の増加、骨髄移植の際の造血再構築の促進、及び骨髄の細胞構成の増加を行うオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００７２】
例1に記述されているように、本発明のオリゴペプチドは骨髄移植の定着を促進し、造血再構築を増強することが認められた。骨髄移植（BMT）は徐々にそして急速に、リンパ腫、ホジキン病及び白血病並びに固形癌、特に黒色腫及び乳癌のような血液学的悪性疾患の患者において選択される治療になりつつある。最近、IMF(特発性多発性骨髄繊維増殖)のような骨髄肥大性疾患の治療に考慮されることが多くなっている。潜在的には方法の改良もあって、BMTは重篤な病気−エイズ、再生不良性貧血及び自己免疫疾患の治療に使用することもできる。全てのBMTの目的は、化学療法、照射または病気により傷害を受けた宿主造血幹細胞、全能及び多分化能、を置換することである。これらの幹細胞は繰り返し複製しそして分化して、血液中に存在する全ての種類の細胞、つまり、赤血球、及びリンパ球、単球及び好中球を含めた白血球を作る。常在マクロファージ及び破骨細胞も造血全能幹細胞から誘導される。幹細胞は分化するので、上記の細胞の一種類のみを形成することができるようになるまで、ますます特別な系統に自身を拘束してゆく。
【００７３】
したがって、そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明の医薬組成物は、血液学的疾患、固形癌、免疫疾患または再生不良性貧血の患者の骨髄移植の処置に使用することができる。より具体的には、血液学的疾患には、リンパ腫、ホジキン病または急性白血病及び骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）が含まれる。
【００７４】
IMFにおいて骨の赤血球産生は徐々に不良となり、一方異所造血が発生しそして増加する。結合織の病的石灰化及び柱状骨の構造変化は破骨細胞分泌因子の完全なまたは相対的な欠乏によるものであろう、したがって、少なくとも部分的には骨髄機能の障害にも原因があろう。
【００７５】
例4に記述した結果は、OGP(10-14)はIMF患者からの骨片の培養において、この短い時間内に結合織を変化させずに、骨髄造血細胞密度を増加することができることを強く示唆している。細胞の増加はバランスが取れており、不規則な細胞増殖によるものではない。勿論、ペンタペプチドを含まない培養中に認められたのと同じIMF検体の骨髄構造及び細胞構成をOGP(10-14)が維持したに過ぎないのではないかということを除外することはできない。しかし、未処置検体に比較してOGP(10-14)培養検体において維持または細胞構成の増加が認められることは、このペプチドの増殖活性を示している。現在は、OGPが血液前駆体に直接働くのか、ストローマ細胞または異なる細胞集団を介して作用するかは明らかではないが、しかし、少なくとも形態学的レベルでは、その作用は微小環境の変化には関係ないようである。
【００７６】
この知見の一つの意味は、OGP(10-14)が事実インビトロにおいて3系統のヒト造血細胞の増殖を増強できるという点である。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、医薬品として受容しうる担体、賦形剤または安定化剤中に、有効成分として上記のオリゴペプチド、またはその混合物を含む。受容しうる担体、賦形剤または安定化剤は使用する用量及び濃度において毒性がないものであり、リン酸緩衝食塩液及び生理的に受容しうる緩衝液のような緩衝液、より一般的には当業者に既知の全ての適当な担体、賦形剤及び安定化剤、例えば、医薬組成物に添加する香料、着色剤、潤滑剤などの目的で使用するものが含まれる。
【００７８】
担体としては、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微結晶セルロース、キサンタンガム、などが含まれる。潤滑剤には水素化キャスター油などが含まれる。
【００７９】
望ましい緩衝剤はリン酸緩衝食塩液（PBS）であり、これはさらに浸透圧も調製される。
【００８０】
望ましい医薬製剤は担体のないものである。そのような製剤は、静脈注射をふくめて、注射による投与に使用することが望ましい。
【００８１】
医薬組成物の調製は当業者に良く知られており、多くの文献及び教科書に記述されている、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990,及び特にその中のページ1521-1712参照。
【００８２】
本発明の医薬組成物は投与単位形態に調製することができる。投与形態は持続放出装置を含むこともできる。この組成物は調剤技術分野でよく知られているいずれかの方法により調製することができる。その投与形態は、本来毒性がなくそして治療効果もない生理的に受容しうる担体を含む。そのような担体の例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク、リン酸のような緩衝性物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリンエステル混合物、水、塩、または硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような電解質、コロイド珪素、マグネシウム三珪酸、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導物質、及びPEGが含まれる。これらのポリペプチドの局所用またはゲル基剤形態のための担体としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ブロック重合体、PEG及び木蝋アルコールが含まれる。全ての投与について、通常のデポ形態が適当に使用される。そのような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び持続放出製剤が含まれる。
【００８３】
持続放出製剤の適当な例には、本発明のオリゴペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは例えば、フィルム、またはマイクロカプセルのような形になっている。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、米国特許番号3,377,919に記述されているようなポリ乳酸、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、Lupron DepotsTMのような分解性乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸-グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、及びポリ-D-(-)3-ヒドロキシブタン酸が含まれる。酢酸エチレンビニル及び乳酸-グリコール酸のような重合体は100日以上にわたって分子を放出することができるが、或るヒドロゲルは短時間にタンパクを放出する。カプセルに入れた場合には、ペプチドは体内に長時間残留するので、37℃の湿気にさらされる結果として変性または凝集して、生物活性を失いそして免疫原性も変化する可能性がある。関係する機序によって安定化に対する合理的な方法を工夫することができる。例えば、もし凝集機序がチオ-スルフィド変換による分子間S-S結合形成によることが発見されるならば、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適当な添加物を使用して水分含量の調節、及び特別な重合体マトリックス組成の開発により行うことができる。
【００８４】
持続放出オリゴペプチド、特にsOGP1-14組成物には、リポソームに封入されたオリゴペプチドも含まれる。これらのオリゴペプチドを含むリポソームは当業者既知の方法により調製される、例えば、Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030(1980); 米国特許番号4,485,045及び4,544,545に記述されている。通常は、リポソームは小さな（約200-800オングストローム）の単層型であり、その中の脂質含量は約30 mol.%以上であり、ポリペプチド治療に最適になるように比率を調整する。循環時間を改善したリポソームは米国特許番号5,013,556に開示されている。
【００８５】
このオリゴペプチドの治療用製剤は保存のために望む純度のポリペプチドと任意の生理的に受容しうる担体、賦形剤または安定化剤と混合して,凍結乾燥品または水溶液の形に調製される[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)]。受容しうる担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量及び濃度において毒性がないものであり、そしてリン酸、クエン酸、およびそのほかの有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、及びそのほかの糖類；EDTAのようなキレート剤；マンニトール及びソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのようなスラット形成カウンターイオン；及び/またはTween，PluronicsTMまたはポリエチレングリコール（PEG）のような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００８６】
オリゴペプチドはマイクロカプセル中に封入することもでき、これは例えばコアセルベーション技術によるかまたは界面重合法により（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタアクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）、コロイド状薬物輸送システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に調製される。そのような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences、前出、中に開示されている。
【００８７】
この医薬組成物は望ましくは必要とする患者に1日1回使用され、そして望ましくは約0.001から約50 nmol, より望ましくは約0.05から25 nmol,最も望ましくは約0.1から約10 nmolの活性成分の投与量を含む。
【００８８】
記述したオリゴペプチドに加えて、本発明の移植支持組成物はさらに任意に他の治療成分を含むことができる。そのような成分としては、一つかまたはそれ以上の既知サイトカイン、例えば、IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及びM-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）でありうる。そのようなほかの成分が組成物中に取り込まれた場合には、組成物の骨髄移植支持効果は相加的に増加することができる。
【００８９】
第二の態様として、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強のための医薬組成物の調製に、上記のオリゴペプチド、特にSEQ ID NO:1，2，3，及び4により規定されるTyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれかを使用することに関係する。
【００９０】
さらに、ここに記述したオリゴペプチドは、骨髄移植の定着の促進、移植幹細胞の増殖の促進、及び赤血球を含む全ての型の造血細胞の利用度を増加し、そしてこれにより数週間のうちに宿主をこれらの細胞で支援する必要性を除去；造血を支持するストローマ細胞数及び/またはストローマ細胞誘導因子の発現の増加によるストローマ造血微小環境の増強；造血を支持する因子に対する受容体の造血幹細胞発現の増強；静脈内に投与された骨髄移植物の宿主骨髄への「指向性」の増強；骨随移植後の血液細胞構成の回復の促進；少ない細胞数を使用して移植に成功することによりドナーからの骨髄採取回数を減らし、そして（1000 mlでなく）10-15 mlの少量を移植に使用することができる；ドナー末梢血液中の造血全能及び/または多分化能幹細胞の数を増加して、末梢血の幹細胞の移植の可能性を改善；移植に使用するためにインビトロにおいて長期骨髄培養において造血幹細胞数を増加し、そして白血病患者の同種移植において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法も提供；化学及び/または放射線療法の後の骨髄及び血液細胞構成の内在性回復力を促進；そしてBMT後または化学及び/または放射線療法後の常在マクロファージ集団の回復、をするための医薬組成物の調製に使用することができる。
【００９１】
オリゴペプチドまたは本発明の組成物の治療用量は、勿論、患者の群（年齢、性など）、治療する病状及び使用する個別のオリゴペプチド及び投与経路によって異なるであろう。いずれの場合にも、治療用量は主治医によって決定されるであろう。
【００９２】
いずれかの適当な投与経路を本発明のオリゴペプチドの有効用量を哺乳動物、特にヒトに供給するために使用することができる。静脈内、皮下及び経口投与が望ましい。
【００９３】
望ましい態様として、これらのオリゴペプチドは、循環多系統前駆体細胞パーセンテージを増加させるための医薬組成物の調製に使用される。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆体CD34陽性細胞、及び望ましくはCD34/Flk2二重陽性細胞である。
【００９４】
上記の「造血幹/前駆細胞」または「初期造血細胞」は、分化して、より拘束された成熟した血液細胞型を作ることができる細胞である。「造血幹細胞」または「幹細胞」は特に、致命的照射を受けた宿主の長期移植定着をすることができる細胞である。
【００９５】
「CD34+細胞集団」は造血幹細胞が濃縮されている。CD34+細胞集団は、例えば、臍帯血または骨髄から得ることができる。ヒト臍帯血CD34+細胞はMiltenyi（Calfornia）によって販売されている免疫磁気ビーズを使用して、メーカー説明書にしたがって、選別することができる。
【００９６】
さらに、本発明の医薬組成物の調製に使用されるオリゴペプチドは、未熟細胞及び単球回復を促進し、そしてBFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つの選択的増加をする。
【００９７】
したがって、そのオリゴペプチドは白血球数（WBC）、循環造血幹細胞及び総骨髄細胞構成を増加するための医薬組成物の調製のために使用される。
【００９８】
より具体的に、本発明は骨髄移植を支持するための医薬組成物の調製にこれらのオリゴペプチドの使用することを提供する。この効果は、幹細胞数の増加、骨髄移植の際の造血再構築の促進及び骨髄細胞構成の増加におけるオリゴペプチドの効果に基づいている。
【００９９】
そのほかの特に望ましい態様によると、本発明は血液学的疾患、固形腫瘍、免疫学的疾患及び再生不良性貧血に罹患している患者の治療のための医薬組成物の調製に該オリゴペプチドを使用することに関係している。より具体的に、血液学的疾患はリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【０１００】
第三の態様において、本発明は骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞の増強のための方法を提供する。この方法は、これを必要とする患者に、上記のような造血細胞に対して刺激活性を持つオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量を投与することを含む。
【０１０１】
そのほかの態様によると、本発明は、化学療法または照射を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強のための方法を提供する。
【０１０２】
さらに他の態様において、本発明のオリゴペプチドまたは組成物の有効量を、骨髄移植の定着を改善するために、または末梢血から造血前駆細胞を採取する前に哺乳動物において造血幹細胞の動員及び/または増殖を刺激するために使用することができる。
【０１０３】
この態様の特別な態様によると、本発明は、造血細胞の産生に刺激効果を持つオリゴペプチドまたはそれを含む本発明の組成物の治療有効量を投与することによる、血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常または再生不良性貧血に罹患した患者を治療する方法に関係する。
【０１０４】
そのほかの特別な態様において、この方法は骨髄移植による患者の治療を支持するために使用することができる。
【０１０５】
治療に適用するために、本発明に有用なオリゴペプチドまたは医薬組成物は、ボーラスまたは時間をかける持続注入によりヒトの静脈内に投与するような形態を含む生理的に受容しうる形態において哺乳動物、望ましくはヒト、に投与される。そのほかの投与経路としては、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口または局所の経路がある。全身的治療効果と同様に局所で作用させるために、このオリゴペプチドまたは本発明の組成物を腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、または病巣周囲に、またはリンパにも適当に投与される。
【０１０６】
インビボ投与に使用されるオリゴペプチドまたは医薬組成物は滅菌されていなければならない。これは凍結乾燥及び再溶解の前または後に滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に行うことができる。オリゴペプチドは溶液で保存することができる。治療用オリゴペプチド組成物は一般的には滅菌取り出し口のついた容器、例えば、注射針により刺し通すことができるストッパーの付いた静脈注射溶液バッグまたはバイアル、に入れられている。
【０１０７】
治療に使用されるいずれかのオリゴペプチドまたは本発明の組成物の「有効量」は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態による。したがって、最適の治療効果を得るために、必要に応じて用量を調整し、そして投与経路を変えることが必要であろう。典型的に、医師は望む効果に達する用量までオリゴペプチドを投与するであろう。全身的治療に対する典型的な1日用量は、前述の要因に応じて約0.001 nmol/Kgから50 nmol/Kg以上までの範囲であろう。
【０１０８】
そのほかの特別な態様は、エクスビボ方法が適用できる、移植を受ける患者の治療に関係する。この方法において、その移植に先立って、移植をする予定の細胞をこのオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量に暴露する。
【０１０９】
移植のための造血幹細胞の十分な量を得るために現在極く普通に行われている方法は、ドナーの骨の多くの部位から針とシリンジで1リットルかそれ以上の骨髄組織を吸引することであり、通常全身麻酔を必要とする操作である。同種BMTのドナーは通常組織型が同じ兄弟姉妹でありそして時にはHLA分類がレシピエントと適合する親族でないドナーである。HLA適合性試験を必要としない自己移植を、固形腫瘍を除去するための化学照射治療を予定している患者に使用することができる。自己幹細胞は出生時に臍帯血からも得ることができ、そして将来の輸血に備えて保存することができる。
【０１１０】
移植後そしてドナーからの骨髄が機能を発揮するまでに、BMTを受けた患者は、感染の恐れがある一過性の著しい不形成貧血を呈する。細菌及び菌の感染発生率は不形成貧血の程度と期間に相関する[Slavin, S. and Nagler, A., Transplantation (1992)]。同じ理由で、CSFは赤血球形成及び血小板形成を支持することができない。
【０１１１】
造血を支持するオリゴペプチドは他の手段においても同様に有用であることを示すことができる。ある研究者は、末梢血の幹細胞を骨髄の幹細胞に加えることにより定着率を著しく増加するが、末梢血から十分な数の幹細胞を抽出するのは複雑な操作であることを認めている。血中の幹細胞の数を増やすためにドナーにこのオリゴペプチドを投与することにより、末梢血の幹細胞を移植する可能性を改善するであろう[Golde, D.W., Sci. Am. 36 December(1991)]。
【０１１２】
造血、したがってMBTに成功する必要条件は、注入した幹細胞を循環から骨髄へ回帰させることそして造血を支持する造血微小環境を含む機能的ストローマ細胞及び組織が存在することである[Watson,J.D. and McKenna,H.J. Int. J. Cell Cloning 10: 144 (1992)]。また、ストローマ組織に由来する骨髄は骨髄のインビトロ長期間培養において幹細胞を維持する条件を提供する。現在この技術は幹細胞を生きたまま維持することができる。この培養に適当な造血オリゴペプチドを加えることによりインビトロにおいて幹細胞集団の増殖を支援することができ、これにより移植のための幹細胞数を増加する。
【０１１３】
インビトロ/インビボの組み合わせ方法は、(i)ドナー血液または骨髄から少数の幹細胞を得る、そして (ii)健康人は重篤な疾患のためにその細胞が必要となるときのために自分の幹細胞を保存し、これにより同種BMTに伴う複雑な問題を回避する、という進歩的戦略の基礎を提供することを可能にする。
【０１１４】
繊維組織、骨および骨細胞が重要な成分である造血微小環境をインビボ、エクスビボ及び/またはインビトロで増強することによりBMT後の造血再構築を促進する本出願に記述したオリゴペプチドのような小さなペプチドを使用することは治療上重要である。そのようなペプチドは、必ずしもBMTを必要としないような自然に発生する骨髄抑制における造血を支持することもできる。
【０１１５】
本出願に記述したオリゴペプチド及び望ましくはペンタペプチドOGP(10-14)は、初期造血前駆体（すなわち、造血幹/前駆細胞）のレベルに直接作用するようである。その増殖幹細胞集団は、骨髄形成、赤血球形成（例えば、脾臓赤血球形成）及びリンパ球形成の基となりうる。したがって、これらのオリゴペプチドは造血幹/前駆細胞の増殖及び/または維持を増強するために（例えば、造血疾患または異常を治療するために）使用することができる。
【０１１６】
したがって、望ましい態様は造血幹/前駆細胞の増殖を促進する方法に関係する。本発明に従うと、この方法は、造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドの有効量、またはそれを含む上記のような組成物の有効量に、これらの細胞を暴露する段階を含む。本発明によるとその暴露は該細胞の増殖を促進するのに有効である。
【０１１７】
用語「細胞の増殖を促進する」は、インビトロまたはインビボにおいて非処置細胞に比較して細胞の増殖及び/または再生の程度が増加している段階を包含する。細胞培養における細胞増殖の増加は、問題の分子に暴露する前後に細胞数を計測することにより測定することができる。増殖の程度はコンフルエンシーの程度を顕微鏡で調べることにより定量化することができる。細胞増殖はチミジンまたはBrdU取り込み検定を使用して定量化することもできる。
【０１１８】
特別に望ましい態様において、本発明の方法はCD34陽性細胞、望ましくはFlk2陽性細胞の増殖を促進することを意図している。
【０１１９】
本発明のオリゴペプチドまたは組成物は、インビボまたはインビトロにおいて造血幹/前駆細胞の数および/または増殖および/また分化および/また維持の増強、これらの細胞集団の拡大及び哺乳動物におけるその細胞及び多系統の血液細胞の再構成促進に有用である。
【０１２０】
一つの具体的な望ましい態様において、これらの細胞は細胞培養中に存在し、したがって、これはエクスビボ/インビトロの方法であろう。
【０１２１】
そのほかに、処置細胞が哺乳動物の中に存在する場合には、本発明の方法は治療のインビボ方法として使用することができる。
【０１２２】
「治療」は治療処置及び予防または防護方法の両者のことである。治療を必要とするものには、すでに疾患または異常を持っているもの並びに疾患または異常を予防すべきものが含まれる。
【０１２３】
治療の目的となる「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び養殖動物、及び動物園、スポーツ用またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、を含む哺乳動物に分類される動物のことである。望ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１２４】
特別な態様において、本発明の方法により治療される哺乳動物は、化学療法、照射療法、骨髄移植治療またはそのほかの医原性または自然の原因により罹患しているか、または罹患しやすいものである。
【０１２５】
がん患者において化学及び放射線療法は血液細胞集団の劇的な減少を生じる。米国とヨーロッパにおいて毎年少なくとも500,000人のがん患者が、さらに200,000人が日本で、化学療法及び放射線療法を受けている。再生不良性貧血、原発性免疫不全、急性白血病及び（全身照射後の）固形腫瘍に有益な骨髄移植は医療の場において広く実施されるようになっている。毎年少なくとも15,000人の米国人が骨髄移植を受けている。そのほかの病気が血液細胞系統の全てまたは一部を減少させる原因となりうる。そのような状態の例としては、（マクロサイト性及び再生不良性貧血を含む）貧血；血小板減少症;形成不全；免疫性（自己免疫性）血小板減少性紫斑病（ITP）；及びHIV誘発ITPが含まれる。
【０１２６】
これらの患者の血液細胞集団の再構築を促進することができる医薬製品が求められている。
【０１２７】
したがって、原始造血細胞の増殖及び/または分化及び/または維持を増強するための方法を提供することが本発明の目的である。該方法は造血幹細胞及び成熟血液細胞系統の再構成の促進のために有用でありうる。これは、病気、照射または化学療法の結果として造血または成熟血液細胞の病気に哺乳動物が罹患している場合には望ましい。この方法は、エクスビボにおいて該造血細胞から該幹細胞および成熟血液細胞系統の拡大した集団を作るためにも有用である。
【０１２８】
さらにそのほかの望ましい態様において、本発明は幹細胞のインビトロ/エクスビボ維持及び/または増殖する方法に関係する。この方法は、血液検体から末梢血液細胞を単離する、CD34抗原を発現する血液前駆細胞を集める、適する条件下に濃縮血液前駆細胞を播種する、そして該細胞を、本発明に従って、造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチド、または造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドを有効成分として含む組成物で処理すること、を含む。
【０１２９】
特別な態様において、本発明の方法は、さらに処置細胞をサイトカインに暴露する段階を含むであろう。限定しない例としては、該サイトカインはTPO（トロンボポエチン）、EPO（エリスロポエチン）、M-CSF（マクロファージ-コロニー刺激因子）、GM-CSF（顆粒球-マクロファージ-CSF）、G-CSF（顆粒球CSF）、IL-1（インターロイキン-1）、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF（白血病抑制因子）及びKL（キットリガンド）からなる群から選択することができる。
【０１３０】
インビボ治療の態様として、本発明は哺乳動物における血液細胞再生の方法に関係する。この方法は該哺乳動物に造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドの治療有効量、または本発明の組成物有効量を投与する段階を含む。これらの造血細胞は赤血球系、骨髄系及びリンパ系の細胞のいずれかでありうる。
【０１３１】
「リンパ系血液細胞系統」は分化してリンパ球（B-細胞またはT-細胞）を形成することができる造血前駆細胞である。同様に、「リンパ形成」はリンパ球を形成することである。
【０１３２】
「赤血球系血液細胞系統」は分化して赤血球（赤血球）を形成することができる造血前駆細胞であり、「赤血球形成」は赤血球を形成することである。
【０１３３】
句「骨髄血液細胞系統」は、ここの目的では、上に定義したリンパ系及び赤血球系血液細胞系統以外の造血前駆細胞を全て包含する、そして「骨髄形成」は（リンパ球及び赤血球以外の）血液細胞の形成を含む。
【０１３４】
開示及び記述された操作段階及び材料は若干変更することができるので、ここに開示された特別な例、操作段階、及び材料に本発明が限定されないことは理解されるべきである。また、本発明の範囲は請求項の記述によってのみ限定されるので、ここに使用した用語は特別な態様を記述する目的のためにのみ使用されていることも理解されるべきである。
【０１３５】
本明細書及び請求項に使用されている単数形「a」,「an」及び「the」は、特に明確に記述しないかぎり、複数の内容を含んでいることに注意すべきである。
【０１３６】
この明細書及び以下の請求項を通して、特記しない限り、語「含むcomprise」及びその変化形「comprises」及び「comprising」は、示した整数または整数の段階または群を包含することを意味するが、そのほかの整数または整数の段階または群を排除しないことは理解されるであろう。
【０１３７】
以下の例は本発明の態様を実施するために発明者らによって使用された技術の代表例である。これらの技術は本発明の実施のための望ましい態様の代表例であるので、当業者は本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から離れずに多くの修飾を行いうることを認識していることは、理解されるべきである。
【０１３８】
例
試薬
1．骨再生増殖ペプチドのC-末端ペンタペプチド（10-14）[sOGP(10-14)]:Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; M.W. 499.7(SEQ ID NO:1)はPolypeptides Laboratories Inc. (Torrance, California 90503, 米国 バッチNo.9712-006)から供給された。
2．CFA‐シクロホスファミド（CFA, SIGMA, 5 mg/マウス）を骨髄除去を誘発するために使用した。
3． Dexter-様培地：下記を含むMcCoy培地（Gibco-Life technologies,米国）、12.5％ウシ胎児血清（FBS, Hyclone, オランダ）、12.5％ウマ血清（HS, Sigma, St Louis, MO）、0.8％必須及び0.4％非必須アミノ酸（Gibco-Life technologies,米国）、1％グルタミン（Sigma, St Louis, MO）、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、パントテン酸D-Caを含む0.4％ビタミン（Gibco- Life technologies,米国）、1％アンホテリシンB（Fungizone, Bristol-Myers Squibb）、1％ゲンタマイシン、及び組換えヒト幹細胞因子（50 ng/mL rhSCF, Calbiochem,米国）、組換えヒト顆粒球-単球コロニー刺激因子（rhGM-SCF 10 ng/mL, Sandoz, スイス）、組換えヒトインターロイキン-3（rhIL-3 10 ng/mL, Calbiochem,米国）及び組換えヒトエリスロポエチン（rhEpo 2 units/mL, Sigma, St Louis, MO）の存在下に10-6 Mヒドロコルチゾン、これにsOGP(10-14) 10-8 M（Abiogen Pharma SpA Research Laboratories）を加えるかまたは加えない。
4．E.D.T.A緩衝液（Mielodec, Bio Optica, Milan,イタリー）
【０１３９】
動物
* ICR雄マウスをCharles River（イタリー）から購入し、特定病原排除環境の下に飼育した。
* CV57 Black雌マウスはHebrew University Medical School (Jerusalem,イスラエル)の動物飼育施設から入手した。両系統のマウスの体重は発明者の研究室到着時に25 gであった。
【０１４０】
統計解析
群間の比較は、FisherのPLSD,要因分析または繰り返し法、分散分析（ANOVA）を使用して行った。コロニー検定にはマン-ホイットニー検定を使用した。
【０１４１】
例1
骨髄移植の定着に対するOGP(10-14)の効果
材料と方法
骨髄移植の定着に対するOGP(10-14)の効果を検討するためにCV57 Black雌マウスを使用した。リン酸緩衝食塩液に溶解したOGP(10-14)を毎日皮下に12日間10μlを注射して投与した。1日用量はマウス当り0.001から10 nmolの範囲であった。対照マウスにはリン酸緩衝食塩液のみを投与した。OGP(10-14)処置開始後8日目に、60Co線源（Picker C-9, 102.5 rad/min）を使用して1回900 rad量の全身X-線照射をマウスに行った。その直後に、非選別同系骨髄細胞の105を静脈内投与した。OGP(10-14)処置開始後14日後に動物を殺処理し、両大腿骨を取り出し、その骨端を除去した。骨髄を完全にリン酸緩衝食塩液（PBS）で洗い出した。傾けた注射針を通して数回吸引することにより単細胞懸濁を調製し、ヘモサイトメーターで細胞を計数した。
【０１４２】
結果
図１は、照射後/移植後の総大腿骨骨髄細胞数に対するOGP(10-14)の刺激効果を示す。この効果は用量依存性であり、最高3用量においてPBS対照に対して統計的に有意な2倍の細胞数の増加を示している。
【０１４３】
例2
OGP(10-14)の毒性評価
上記のように、OGP(10-14)には骨髄移植の定着促進が認められた。したがって、該ペプチドの薬理活性をさらに詳細に検討する前に、該ペプチドの毒性の可能性について検討した。
【０１４４】
55匹のマウスに10 nmol/マウスの用量で15日間皮下投与してOGP(10-14)の毒性の可能性を評価し、結果を30匹のプラセボ投与対照で得られた結果と比較した。生存率、行動、体重増加及び肉眼的剖検に関して相違は認められなかった。血液学的パラメータに関して、ペプチドの報告された用量の投与では白血球（WBC）、赤血球（RBC）、血小板（PLT）またはヘモグロビン（Hb）レベルに有意な変化は生じなかった。
【０１４５】
例3
OGP(10-14)は骨髄化学除去後の造血回復を促進する
材料及び方法
この実験のセットにおいて、骨髄除去はシクロホスファミド（CFA， SIGMA, 5 mg/マウス , 150(l滅菌PBSに溶解)を2連日（「0日目」及び「1日目」と呼ぶ）に腹腔内投与することにより誘発した。このプロトコールは重篤な、可逆性の白血球減少症、L.D.＜30、を誘発することを示した[Spangrude,G.J. et al., Science, 241: 58 (1988)]。最低の骨髄細胞数は最初の注射6日後に認められた。
【０１４６】
白血球分類細胞数に対するOGP(10-14)の効果を評価し、そして今後の実験に使用するOGP(10-14)の「適量を」を決定するために、マウスを毎日0.1 mlのOGP(10-14)を含まない溶媒または図2に略記した種々のOGP(10-14)用量を含む溶媒を皮下注射した。基準対照の一群は非処置のままとし、CFAもOGP(10-14)を含んでも含まなくても滅菌水溶媒を投与しなかった（図2）。血液は-12，-4，+3，+7，+14，+17，+21及び+24日目に眼窩後方出血により採血した（図2C）。分別細胞数の計数はコールターカウンター（Sysmex Microcell Counter F-800）を使用して行った。
【０１４７】
二重陽性CD34+/Sca-1+細胞に対するOGP(10-14)の効果をG-CSFと比較して試験するために、CFA除去マウスに-7日目から+7日目まで毎日10 nmol OGP(10-14)を投与し、+5，+7及び+15日目に血液検体を採取し、フローサイトメトリーにかけた。G-CSFは+2から+8日目まで投与した。
【０１４８】
フローサイトメトリーのために、マウスの3検体を合せ、単核細胞を濃度勾配遠心分離によって集め、1×106/mlの濃度でPBSに再懸濁した。次いでその細胞を特異的モノクロナール抗体（最終希釈1:10）の存在下に30分4℃でインキュベートした。CD34+細胞を検出するために、第一層として精製ラット抗マウスモノクロナール抗体（Pharmingen， RAM34）を使用した。3回洗った後、細胞をPBSに再懸濁し、FITCポリクロナールヤギ抗ラット（Pharmingen）とインキュベートした。Sca-1+/CD34+細胞を検出するために、検体をさらにPBSで3回洗い、Caltagのラット抗マウスSca-1（Ly.6A.2）PEとインキュベートした。最初の抗体を無関係な免疫グロブリンに替えて対照とした。データ取得及び分析は、Lysis IIソフトウエアを使用するFAC-Scan(tm)（Becton Dickinson）フローサイトメトメーターにより行った（図3）。
【０１４９】
種々の投与法によるOGP(10-14)を評価するために、化学除去マウスに図4に示すようなOGP(10-14)を毎日投与した。マウスを+15日目に殺処理し、大腿骨骨髄を洗い出し、単細胞懸濁（上記のように作製）をエクスビボ前駆細胞（コロニー形成）検定にかけた。CFU-GM, CFU-GEMMおよびBFU-Eの形成に対するOGP(10-14)効果をG-CSFのそれと比較した（図4）。
【０１５０】
前駆細胞検定
全群の骨髄細胞をCFA注射後+10日目に回収した。細胞を2％ FBSを加えたIscoveの改良Dulbecco培地（IMFM）で2×106/mlに希釈し、メーカーの推奨に従ってメチルセルロース培地に加えた（MethoCult, StemCell Technologies Inc., Vancouver, カナダ）。各試験において2×104細胞を接種した。M3434（マウスGM-CFUおよびGEMM-CFUに対して）およびM3334（マウスBFU-E検定に対して）を使用した。M3434には組換えマウスインターロイキン-3（rmIL-3, 10 ng/ml）、組換えヒトインターロイキン-6（rhIL-6, 10 ng/ml）、組換えマウス幹細胞因子（rmSCF, 50 ng/ml）及び組換えヒトエリスロポエチン（rhEpo, 3 U/ml）を添加した。M3434に加えた因子はEpoのみであった。プロトコール手順に従って14日間のインキュベーションの後各マウスについて2回の試験を盲検で行った。
【０１５１】
結果
+3日目に行った総及び分類WBC数はCFA処置群の全てにおいて著しい減少を示した（図2）。7日目に、化学除去後溶媒処置群において総WBC数は約2倍に回復したが、非処置対照マウスの値に比較してまだ若干低かった。他方、OGP(10-14)投与動物は試験した全ての用量において高値を示し、10 nmol OGP(10-14)/日投与マウスにおいて最高値であった。この群の値は、非処置対照動物の値のほぼ近くに達した（図2A）。7日目に行った分類細胞計数においてもOGP(10-14)による用量依存性増加が単球及び未熟細胞数に認められた（図2B, 2C）。最高用量（10 nmol）における単球数は正常対照に比較して6倍高かった（図2B）;未熟細胞数も対照より有意に高かった（図2C）。全動物群の総WBC数は10日目以降正常となった（図2A)。しかし、単球数は7日目に同じ傾向を示し、14日目に正常レベルに達した（図2B）。未熟細胞数の減少が0.01 nmol群以外の群に認められたが、最高値は10 nmol群に認められた。未熟細胞数は14日目以降に正常になった（図2C）。
【０１５２】
+5日目の二重陽性CD34+/Sca-1+細胞数は溶媒のみで処置されたマウスに比較して毎日10 nmol OGP(10-14)で処置された化学除去動物において5倍高かった（図3）。OGP(10-14)の効果はG-CSFの効果と同じであった。+7及び+15に行ったフローサイトメトリーではほぼ同じCD34+/Sca-1+細胞数を示した。しかし、+15日目では、OGP(10-14)で処置マウスは溶媒処置及びG-CSF処置マウスよりも有意に高い細胞数を示した（図3）。
【０１５３】
前駆細胞検定により、OGP(10-14)はCFU-GEMM及びBFU-Eを有意に刺激するが、CFU-GMは刺激しないことが示された。OGPの効果は、化学除去の7日前に投与を開始した場合にのみ明らかであった（図4）。CFU-GMに対してOGP(10-14)の効果がないことは、血液中の顆粒球数に有意な効果がなかったことと一致している。G-CSFはCFU-GMのみに効果を有していた（図4）。
【０１５４】
例4
OGP(10-14)は特発性多発性骨髄繊維増殖患者のエクスビボ検体における造血骨髄細胞構成を救援する
材料と方法
ヒトにおけるOGP(10-14)の有効性を評価するために, 特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）に罹患した患者から得たエクスビボ検体における造血活性を検討した。
【０１５５】
IMF患者5例、鞏皮症1例及び脊髄形成不全症候群（MDS）の患者2例を、インフォームドコンセントにサインを得た後、試験に組み込んだ。IMFの診断は標準的臨床及び血液学的検査法に基づいて行った[Barosi, G., et al., Br. J. Haematol. 104: 730-737 (1999)]。繊維増殖を示す骨髄のバイオプシーは特徴的であった。IMFの診断は最終的に繊維増殖のほかの可能な原因及び他の骨髄肥大性疾患を除外して行った。特に、慢性骨髄性白血病は、Ph染色体及びbcr/abl転位の存在により除外した。IMF患者5例のうち3例は、低用量のブスルファン投与毎月10日、1（g 1,25(OH)2D3/日をすでに投与されていた。患者のデータを表1に要約した。
【０１５６】
標本のゆがみを最小限にするためのトラップを装着した8ゲージディスポーザブルバイオプシー針により3 mmの長さの骨髄標本を背部上腸骨突起から採取した（TraoSystem MDThech,米国）。標本を1 cmの長さに3分した。無作為に一部分を予備的形態評価に使用した。残りの2部分を35-mm組織培養皿で培養し、1 mlのDexter様培地で完全に被い、rhSCF(50 ng/mL), rhGM-CSF(10 ng/mL), rhIL-3(10 ng/mL)及びrhEpo(2 unit/mL)の存在下に10-8 M OGP(10-14)を加えてまたは加えずに37℃、5％ CO2-空気中で培養した。7日目にサイトカイン及びOGP(10-14)の初期濃度を維持して、そのほかの成分を変更せずに培地の半分を交換した。さらに7日間培養した後、骨髄標本を組織学的に処理した。簡単に記述すると、検体を修正B5中で固定し、E.D.T.A酸緩衝液で脱灰し、切片をギムザ、ヘマトキシリン-エオジンまたは細網の銀飽和で染色した。骨髄の変化をIからIVのスコアで半定量的に評価した。IVのスコアは正常に比較して細胞が密な骨髄に対して使用した；スコアIIIは核密度の減少を伴う細胞構成減少を示す；スコアII標本は間隙の拡大を示し；スコアI標本の造血細胞は極めて乏しくそして/または骨髄領域は広く間隙で置換されている。検体あたり少なくとも3枚の同面積の切片について全体を検査した。さらに、細胞密度は、細胞数および骨髄面積の比として、Leica.QWinソフトウエアを装備したコンピュータ支援Laica顕微鏡を使用して自動的に評価した。各患者の結果は非処置標本に対するOGP(10-14)処置における平均細胞密度の比として示した（T/C比）。
【０１５７】
結果
培養14日後、OGP(10-14)で処理した骨髄標本は、同じ患者のOGP(10-14)非処理標本よりも造血細胞が多かった（図5,6）。半定量的スコアは全てのIMF患者で有意に増加した（p＜0.05）。IMFでない患者では、OGP(10-14)処置標本と非処置標本の間に差は認められなかった。細胞構成のコンピュータ評価では全てのIMF患者でT/C比＞1が認められ（p＜0.01）、OGP(10-14)処置標本において細胞数が増加することを強く示した。さらに、T/C比は個々の患者から得た標本の対毎に統計的に有意であった（表2）。T/C比は患者のヘモグロビンレベルと高度に有意な逆比例関係を示した（図7）。減少したヘモグロビンレベルはIMFの重症度を示す最も重要な血液学的指標である。したがってこの相関は、より重症な患者においてOGP(10-14)の効果は最高になることを強く示唆している。
【０１５８】
赤血球系と骨髄系の細胞の比はOGP(10-14)と培養しても明らかな変化はしなかった。しかし、半定量的評価はIMF患者から得た標本中の多形核巨大細胞の数は1.5から10倍減少していることを示した。総造血細胞構成の場合には、そのような相違は非IMF患者から得た検体では認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】放射線除去処置/BMT併用後のマウスにおける大腿骨骨髄細胞の総数に対するsOGP(10-14)前処置の用量依存性効果。
示した用量のOGP(10-14)を12日間毎日雌C57BLマウスに皮下投与した。OGP(10-14)処置開始後8日目に900 Rad X線照射、次いで105同系非選別骨髄細胞の静脈内投与を行った。処置開始後14日目に殺処理し、大腿骨骨髄をリン酸緩衝食塩液中に洗い出した。傾けた注射針を通して数回吸引することにより単細胞懸濁を調製した。細胞計数はヘマトサイトメーターで行った。C - リン酸緩衝食塩液のみを与えた対照マウス。データは条件当り少なくとも7匹のマウスにおいて得られた 平均 ± 標準誤差 である。略記：Fem (大腿骨)、Marr C（骨髄細胞）、D（日）、mou（マウス）、premed（前投与）、stimu（刺激）、及びcellu（細胞構成）。
【図２Ａ−Ｃ】造血組織の化学的除去を行ったマウスにおいてOGP(10-14)は投与量及び時間に依存して血液細胞数を増加する。
雄ICRマウス、体重25 gm、それぞれに0及び1日目に1日1回シクロホスファミド（CFA）5 mg/マウスを腹腔内に投与して化学的除去を行った。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に溶解し、示した用量の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじの皮下に-７から-1日目及び+2から+8日目に毎日投与した。データは条件当り20動物において得られた 平均 ± 標準偏差 である。*：CFA＋溶媒に対して有意差あり、p＜0.05；**：1 nmol OGP(10-14)群に対して有意差あり、p＜0.05。図２Ａは全白血球数を示す。図２Ｂは全単球数を示す。図２Ｃは全未熟細胞数を示す。略記：cont（対照、非処置）、veh（溶媒）、ce（細胞）、T（時間-日）
【図３】造血組織の化学除去を行ったマウスにおいてOGP(10-14)は循環二重陽性CD34+/Sca-1＋細胞数を増加する。
雄ICRマウス、体重25 gm、それぞれに0及び1日目に1日1回シクロホスファミド（CFA）5 mg/マウスを腹腔内に投与して化学的除去を行った。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に100 nmol/mlの濃度に溶解し、この溶液の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじ皮下に-７から-1日目及び+2から+8日目に毎日投与した。陽性対照として、CFA除去マウスを+2から+8まで106 UI/0.1 ml G-CSFで処置した。データは条件当り33動物において得られた 平均 ± 標準偏差 （エラーバーは示すには非常に小さかった）である。略記：veh（溶媒）、T（時間-日）、*：CFA+溶媒に対して有意差あり、p＜0.01．
【図４Ａ−Ｃ】造血組織の化学除去を受けたマウスの骨髄由来エクスビボコロニー形成ユニットに対するOGP(10-14)処置方法の影響 雄ICRマウス、体重25 gm、にシクロフォスファミド（CFA)、5 mg/マウス、を使用して、0及び1日目に1日1回腹腔内に注射して化学除去を施した。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に100 nmol/mlの濃度に溶解し、この溶液の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじ皮下に、示した期間毎日投与した。9日目に骨髄を採取し、コロニー形成ユニットを分析した。データは条件当り10動物において得られた 平均 ± 標準偏差 である。図４ＡはCFU-GMを示す。図４ＢはCFU-GEMMを示す。図４ＣはBFU-Eを示す。略記：Colo/di（コロニー/皿）、Veh（溶媒）
【図５Ａ−Ｂ】骨髄バイオプシーの顕微鏡写真 図５ＡはOGP(10-14)を加えずに14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者の骨髄検体の2部分の顕微鏡写真を示す。
図５Ｂは10-8MのOGP(10-14)を加えて14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者の骨髄検体の2部分の顕微鏡写真を示す。OGP(10-14)とともに培養した検体中の細胞密度増加に注目。
【図６Ａ−Ｂ】骨髄バイオプシーの顕微鏡写真 図６ＡはOGP(10-14)を加えずに14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者骨髄検体の2部分の細網染色切片顕微鏡写真を示す。
図６Ｂは10-8MのOGP(10-14)を加えて14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者骨髄検体の2部分の細網染色切片顕微鏡写真を示す。OGP(10-14)処置組織の正常所見に注目。
【図７】IMFにおける回帰解析 特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者における、ヘモグロビンレベル及び造血細胞数のエクスビボOGP(10-14)処置と非処置の比（T/C比）の間の回帰解析は、IMFの重篤度とOGP(10-14)の効果の間に相関関係があることを示している。略記：Hem（ヘモグロビン）、Hemato（造血性）、rat（比）、cellu（細胞構成）
【０００１】
発明の分野
本発明は、造血促進物質として、OGPのC-末端部分に相当するオリゴペプチドを使用することに関係する。より具体的には、これらのオリゴペプチドは特に化学療法または放射線照射の後の骨髄移植の定着、造血機能の再構築、骨髄の再構成及び循環幹細胞数の増加を促進する。本発明はさらにこれらのオリゴペプチドの使用方法及びそれらを含む医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨と骨髄の生物学的及び生化学的相互作用は十分に理解されているというには程遠い。しかし、最近の研究により造血細胞発生の維持における骨再生細胞由来の骨髄の役割が確認された [Teichman, R.S., et al., Hematol. 4: 421-426 (2000)]。
【０００３】
骨髄移植の研究により、二つのシステムの間の双方向の相互作用が確認された。骨髄摘出または照射傷害は初期の局所性一過性骨再生反応を誘発する[Amsel, S., et al., Anat. Rec. 164: 101-111 (1969); Patt, H.M., and Maloney, M.A., Exp. Hematol. 3: 135-148 (1975)]。この骨再生相において、髄腔中に繊維柱が形成される。この繊維柱は一過性のものであり、造血性骨髄が再構築される間に吸収されてしまう。さらに、ヒト骨髄提供者において、腸骨骨髄のかなりの部分を採取した後に血清骨形成マーカーであるオステオカルシン及びアルカリホスファターゼの増加を記録している[Foldes,J.,et al., J. Bone Miner. Res. 4: 643-646 (1989)]。ヒト骨芽細胞はヒト造血前駆細胞を支持するという仮説は非常に興味をそそる：これらの細胞は外部から増殖因子を供給せずに造血コロニーの形成を促進する因子を生成する。事実、骨芽細胞は顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-SCF）、腫瘍壊死因子（TNF）、及びインターロイキン6（IL-6）を含む数種のサイトカインを分泌する。さらに、培養骨芽細胞は造血幹細胞の未熟表現型の維持を支持する[Taichman, et al., Blood 87: 518-524 (1996)]。
【０００４】
これらの増殖因子のいくつかは高用量化学療法後のインビボ骨髄再生及び末梢幹細胞動員を改善する。その中でも、G-CSF, GM-CSF, IL-3（インターロイキン3）及びSCF（幹細胞因子）が詳細に評価されてきた[Bungart, B., et al., Br. J. Haematol. 76: 174 (1990); Lant, T., et al., Blood 85: 275 (1995); Brugger, W., et al., Blood 79: 1193 (1992); Molinex, G., et al., Blood 78: 961 (1991)]そしてそのほかのFLT-3のような多くのものが臨床使用について研究されている[Ashihara, E., et al., Europ. J. Haematol. 60: 86 (1998)]。この数年のこの分野における進歩は骨髄機能のいくつかの生理的側面の理解を可能にした。さらに、造血前駆体の分化と増殖を調節できるようになったので、末梢血幹細胞移植、遺伝子導入及び幹細胞のエクスビボ増殖のような革新的治療の基礎となっている。このような印象的な進歩にもかかわらず、幹細胞の生理のいくつかの側面は十分に明らかにされておらず、そして可溶性及び膜結合のいくつかの因子は、骨髄細胞の増殖/分化の生理及び病理に関係するのではないかと考えられている。造血を調節できることが示された因子の数が増加するに従い、造血調節因子の過剰または細い区分に関する批判的疑問が生じている[Metcaff,D., et al., Blood 82: 3515 (1993)]。
【０００５】
古典的に定義された増殖因子の役割に加えて、いくつかの生化学物質及び細胞型はインビボ及びエクスビボの両方において治療方法の改善または変更を可能にした。ヒト骨髄由来内皮細胞は骨髄細胞及び巨核球前駆体の増殖と分化を長期間支持する[Rafii,S., et al., Blood 86: 3353 (1995)];補助細胞は骨髄移植後の血液学的回復を支持することができる[Bonnet,D., et al., Bone Marrow Transpl. 23: 203 (1991)];そして、本目的にとっても興味があるのは、骨芽細胞がマウスにおいてHLAに無関係な骨髄移植の後に移植定着を促進することができる[El-Badri,N.S., et al., Exp. Hematol. 26:110 (1998)]。
【０００６】
多数の化学構造が骨髄の生理における役割について評価するために研究されてきた。例えば、白血病由来細胞系[Volpi,N., et al., Exp.Cell Res. 215: 119 (1994)]及びヒト脊髄血由来幹細胞のクローニング試験[Da Prato, I., et al., Leuk. Res. 23: 1015 (1999)]においてグリコサミノグリカンの効果を評価している。多分ストローマ細胞によるサイトカイン生産の増強による、造血調節及び多系統効果を得るために短いペプチドでさえ合成されている[King,A.G., et al., Exp. Hematol. 20(4): 531 (1992); Pelus,L.M., et al., Exp. Hematol. 22: 239 (1994)]。
【０００７】
特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）はきわめて稀であるが、慢性骨髄肥大疾患の最悪の診断がされる。主な病理過程は、貧血、不規則な巨核球増生、脾腫及び種々の程度の髄外造血にいたる造血幹細胞クローンの異常である。これに対して、特徴的ストローマ増殖は、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子-ベータ（TGF-β）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮増殖因子（EGF）、及びカルモジュリンを含む巨核球/血小板由来増殖因子の不適切な放出による反応性の現象である[Groopman,J., Ann. Intern. Med. 92: 857-858 (1980); Chvapil,M., Life Sci. 16: 1345-1361 (1975)]。IMF患者の生存期間中央値は約4年である。IMFの治療方法は主に補助的なものであり、症状の緩和及びクオリティーオブライフの改善を指向している。一般的なものは輸血、男性ホルモン及びヒドロキシ尿素のような細胞抑制剤である。骨髄移植も徐々に考慮されているが、まだ実験段階とみなすべきである。インターフェロン-アルファ（INF-α）はIMFの初期の過剰増生段階には優れた結果を示したが、病気がより進行した段階ではまったくまたはほんのわずかしか効果がない。
【０００８】
骨再生増殖ペプチド（OGP）、14アミノ酸、高度に保存されたH4ヒストン関連ペプチド、はマウスにおいて血液及び骨髄の細胞構成を増加し、そして骨髄移植の定着を促進することが、本発明者らの一部によりすでに示されていた[Bab,I.A., Clin. Orthop. 313: 64 (1995); Gurevitch,O., et al., Blood 88: 4719 (1996)及び米国特許番号5,461,034]。OGPは切除後の骨髄再生の骨再生期に単離され[Bab,I., et al., Endocrinology, 128(5): 2638 (1991)]そして生理的に主としてα2-マクログロブリン（α2-M）との複合体として血液中に大量に存在する[Gavish,H., et al., Biochemistry, 36: 14883-14888 (1997)]。これをインビボに投与すると、骨形成を促進しそして繊維柱骨量を増加する；インビトロでは、骨再生細胞系において増殖とアルカリホスファターゼ活性を増強する；さらに、繊維芽細胞の分裂を誘発する[Greenberg,Z., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1178: 273 (1993)]。骨再生、骨芽細胞活性化及び繊維芽細胞増殖に対するOGPの作用に加えて、インビボにおいてバランスの取れた白血球（WBC）数の増加、骨髄除去照射を受けそして同系または半同種骨髄移植を受けたマウスにおける全体的骨髄細胞構成を誘導することが示されている[Gurevitch,O., et al., 前出（1996）]。
【０００９】
α2-Mとの不活性な複合体から解離する際に全長OGPのタンパク分解酵素切断により産生されると思われるOGPのC-末端ペンタペプチド、OGP(10-14)と命名、は哺乳動物血清中及び骨再生細胞培養中に高いレベルで存在する[Bab,I., et al., J. Pept. Res. 54: 408 (1999)]。N-末端修飾OGPは細胞増殖に対するOGP様用量依存的効果を維持しており、カルボキシ末端ペンタペプチドはOGP受容体候補への結合に関与することが示唆されている[Greenberg,Z., et al., 前出（1993）]。さらに、骨再生MC3T3 E1細胞において細胞分裂を発生する用量のOGP(10-14)が時間と用量に依存するMAPキナーゼ活性を増強する、しかしOGPはしない、ことを発明者らは既に示している。これらの知見は、OGP(10-14)が下流の信号伝導に関与することを示している[Gabarin, et al., J. Cell Biol. 81: 594-603 (2001)]。さらに、OGPの活性型はカルボキシ末端ペンタペプチドOGP(10-14)であることが示された。興味深いことには、OGP(10-14)はα2-MまたはそのほかのOGPBP（OGP結合タンパク）と複合体を形成しない[Bab,I., J. Peptide Res. 54: 408-414 (1999)]。
【００１０】
したがって、天然OGPのC-末端領域に類似する合成オリゴペプチドの造血活性を本発明において評価した。そのような骨再生活性特異的ペプチドの一部は米国特許番号5,814,610に記述されている。合成OGP(10-14)はオピエート及び鎮痛活性を持つことが記述されている[Kharchenko et al., Vepr. Med. Khim., 35(2) 106-109 (1989)]。
【００１１】
本発明が示す重要なことは、すでに知られている骨再生活性オリゴペプチドが造血システムの刺激物質として作用することである。例えば、OGP(10-14)と命名された合成OGP由来ペンタペプチドはマウスにおける血液及び骨髄細胞構成を増加し、骨髄移植の定着を促進する。このペンタペプチドはシクロホスファミド（CFA）誘発形成不全後の末梢血細胞回復及び幹細胞動員に対して有意な作用を示した。さらに、IMF患者からの骨髄組織中における合成OGP(10-14)のエクスビボ効果を試験して、造血細胞数の相当の増加を示した。さらに、OGP(10-14)効果の程度はIMFの重篤度に比例した。これらの結果は、OGP(10-14)が血液細胞形成を増強して、造血を救援しうることを示している。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、OGP由来オリゴペプチドを造血増殖因子として使用することである。本発明のこの目的及びその他の目的は以下の記述により詳述される。
【００１３】
発明の開示
発明の要約
最初の態様において、有効成分として造血細胞の産生に対して促進効果を持つ少なくとも一つのオリゴペプチドを含む医薬組成物に関係する。本発明にしたがって使用されるオリゴペプチドは200から1,000 Daの分子量を有し、そしてアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.のいずれかを含むオリゴペプチドでありうる。本発明の医薬組成物は任意に医薬品として受容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００１４】
本態様の望ましい態様において、本発明の医薬組成物は式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly(designated OGP(10-14))を持つペンタペプチドであるオリゴペプチド及び医薬品として受容される担体を含む。
【００１５】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物は式：Tyr-Gly-Phe-His-Gly.を持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００１６】
さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は式：Gly-Phe-Gly-Glyを持つテトラペプチドであるオリゴペプチド及び医薬品として受容しうる担体を含む。
【００１７】
そしてさらに他の態様において、本発明の医薬組成物はアミノ酸配列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、その中のメチオニン残基が望ましくはアセチル化されている、すなわち式：Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.を持つオリゴペプチド及び医薬品として受容しうる担体を含む。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強が意図されている。
【００１９】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物は、特に化学療法または照射を受けた患者における、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強が意図されている。
【００２０】
本発明の医薬組成物に使用されるオリゴペプチドは循環する多系統前駆細胞パーセンテージを増加する。この多系統前駆細胞は循環する初期前駆CD34陽性細胞である。
【００２１】
さらに、本発明の医薬組成物中に有効成分として使用されるオリゴペプチドは未熟細胞及び単球の回復及びBFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つの選択的増加を促進する。
【００２２】
したがって、本発明の医薬組成物は白血球（WBC）数、循環造血幹細胞並びに骨髄全体及び血液細胞構成の増加が意図されている。
【００２３】
特別に望ましい態様において、本発明の組成物は骨髄移植を支持することが意図されている。この効果は骨髄移植の際に造血幹細胞数の増加、造血の再構築の促進及び全体的骨髄細胞構成の増強に対するオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００２４】
そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明の医薬組成物は、血液学的異常、固形腫瘍、免疫異常及び/または再生不良性貧血罹患した患者の骨髄移植治療に使用することが意図されている。より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患であろう。特に、骨髄肥大性疾患は特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００２５】
第二の態様において、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成促進及び循環幹細胞数の増加を意図した医薬組成物の調製にアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれか一つを含むオリゴヌクレオチドを使用することに関係している。
【００２６】
特別な態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、特に照射または化学療法を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成促進及び循環幹細胞数の増加を意図した医薬組成物の調製に使用される。
【００２７】
望ましい態様によると、上記特異的オリゴペプチドは循環多系統前駆細胞数の増加のための医薬組成物の調製に使用される。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34陽性細胞である。
【００２８】
さらに、本発明の医薬組成物の調製に使用されるオリゴペプチドは未熟細胞、単球回復を促進しそしてBFU-E及びGEMMコロニー形成単位（CFU）のいずれか一つを選択的に増加する。
【００２９】
したがって、そのオリゴペプチドは白血球（WBC）数、循環造血幹細胞、及び/または総骨髄細胞構成の増加を意図した医薬組成物の調製に使用することができる。
【００３０】
より具体的には、本発明は骨髄移植を支持するための医薬組成物の調製にこれらのオリゴペプチドの使用を提供する。この効果は幹細胞数の増加、骨髄移植に際する造血再構築の促進及び骨髄細胞構成の増加に及ぼすオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００３１】
そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明は、血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常及び/または再生不良性貧血の患者の治療を意図した医薬組成物の調製に該オリゴペプチドを使用することに関係している。より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病または骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００３２】
第三の態様において、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強する方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量を投与する段階を含む。本発明のこの方法は、照射または化学療法を受けた患者において骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための望ましい態様にしたがって使用することができる。
【００３３】
この態様の特別な態様にしたがって、本発明は血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常及び/または再生不良性貧血の患者を治療する方法に関係する。本発明の方法は上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【００３４】
そのほかの特別な態様において、この方法は骨髄移植による患者の治療を支持するために使用することができる。
【００３５】
より具体的には、血液学的異常はリンパ腫、白血病、ホジキン病または骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【００３６】
望ましい態様は造血幹/前駆細胞数を増加する方法に関係する。本発明によると、この方法は上記のように造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物の有効量にこの細胞を暴露する段階を含む。
【００３７】
特に望ましい態様において、本発明の方法はCD34陽性細胞の増殖を促進することが意図されている。
【００３８】
特別に望ましい態様において、細胞は細胞培養中にあり、本方法はエクスビボまたはインビトロで使用することができる。
【００３９】
そのほかに、本発明の方法は望ましくは哺乳動物の、特にヒトの治療方法として使用することができる。
【００４０】
治療される患者は、化学療法、照射療法または骨髄移植に起因する血球の減少した、または減少を生じやすい患者である。
【００４１】
そのほかの望ましい態様において、本発明は血液検体中に存在する造血幹細胞のインビトロまたはエクスビボにおける維持及び/または増殖の方法に関係する。この方法は、血液検体から末梢血液細胞を単離し、CD34抗原を発現する血液前駆細胞を濃縮し、濃縮血液前駆細胞を適当な条件下に播種し、そして該細胞を上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物で処理することを含んでいる。
【００４２】
本発明に従うインビボ治療は、哺乳動物において血液細胞を再構成する方法に関係している。この方法は、該哺乳動物に上記のような造血細胞の産生に対して促進作用を持つオリゴペプチドまたはそれを含む組成物を投与する段階を含んでいる。これらの造血細胞は赤血球系、骨髄系またはリンパ系細胞でありうる。
【００４３】
発明の詳細な説明
細胞生物学及びペプチド化学の分野の多数の方法は、この中では詳述しないが、当業者には良く知られている。そのような方法にはペプチド合成及び構造分析、血球分類、細胞分別分析、コロニー形成検定などがある。そのような方法に関する教科書は、例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds), John Wiley & Sons. Inc., New York, NY and Stewart, J.M. and Young J.D., In: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, pp. 1-175 (1984).これらの出版物は引用してその全体をここに取り入れた。さらに、多数の免疫学的技術は、当業者には良く知られているので、個々の例について詳述しない。
【００４４】
以下の略語がここでは使用される：
OGP(ｓ) - 骨再生増殖ポリペプチド
OGPBP(ｓ) - 骨再生増殖ポリペプチド結合タンパク
sOGP - 合成OGP
WBC - （白血球）
PBL - （末梢血液）
CFA - （シクロホスファミド）
BMT - （骨髄移植）
IMF - （特発性多発性骨髄繊維増殖）
【００４５】
いくつかの細胞性または可溶性物質は骨と骨髄の間の相互作用に関与しうる。この相互作用は造血幹細胞及び前駆細胞の拘束、増殖、及び分化の調節に必須であるように思われる。
【００４６】
OGPは骨再生及び骨髄細胞構成を増加する[Greenberg,Z., et al., 前出(1993); Gurevitch,O., et al., 前出（1996）]。さらに、OGPは骨芽細胞及び繊維芽細胞及び骨髄ストローマ細胞に対して強力な細胞分裂物質である[Greenberg,Z., et al., J. Cellular Biochem, 65: 359-367 (1997); Robinson,D., et al., J. Bone Min. Res., 10: 690-696 (1995)]。
【００４７】
骨芽細胞系において、OGPは百日咳毒感受性Gタンパクを介する細胞分裂物質活性化タンパクキナーゼを活性化することが最近報告された。この作用はC-末端ペンタペプチドOGP(10-14)に限られているようであり、したがって、OGP(10-14)はOGPの生物活性型であることが示唆されている[Bab,I., et al., 前出(1999)]。OGP(10-14)は、免疫原性及び毒性がなくそしてこのペプチドの製造及び取り扱いが比較的容易であることを考慮すると、インビボ使用の可能性の点から非常に関心が持たれる。
【００４８】
正常マウスに0.1から10 nmolのOGPを2週間毎日皮下に注射したところ、このペプチドは白血球数の50％以上の増加及び総骨髄細胞構成の約40％増加を誘導することが、以前の研究により示されていた[Gurevitch,O., et al.,前出（1996）]。処置により分類細胞型の比率は変化しなかったので、造血に対して多系統的作用を持つことを示している。興味あることは、この記述した実験において、CFA（シクロホスファミド）投与により可逆性の無形成を誘発した後に、OGP(10-14)で処置したマウスはプラセボを投与されたマウスよりも早く回復し、そして使用した用量では明らかな毒性を認めていない。
【００４９】
このように、第一の態様において、本発明は、有効成分として造血細胞の産生に促進活性を持つオリゴペプチド、望ましくはそれぞれSEQ ID NO:1，2，3，及び4により規定されるアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly or Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,の少なくとも一つ、及び医薬品として受容しうる担体を含む医薬組成物に関係する。
【００５０】
骨髄に局在する細胞の分裂により赤血球及び白血球が置換される血液細胞産生の過程を造血という。造血に関する総説はDexter and Spooncer [Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 (1987)]参照。
【００５１】
多数の異なる血液細胞の型が存在し、それらは異なる細胞系統に属している。各系統にしたがって、異なる成熟段階の細胞が存在する。成熟細胞は異なる機能に特化している。例えば、赤血球はO2及びCO2の輸送に関与している；T及びBリンパ球はそれぞれ細胞及び抗体仲介免疫応答に関与している；血小板は血液凝固に必要である；そして顆粒球及びマクロファージは一般的なスカベンジャー及び補助細胞として働く。顆粒球はさらに好塩基球、好酸球、好中球及びマスト細胞に分類することができる。
【００５２】
本態様の特別に望ましい態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:1により規定される式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyを持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。このペンタペプチドは本出願を通してOGP(10-14)と命名される。
【００５３】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:2により規定される式：Tyr-Gly-Phe-His-Gly,を持つペンタペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００５４】
さらに他の態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:3により規定される式：Gly-Phe-Gly-Glyを持つテトラペプチドであるオリゴペプチドを含む。
【００５５】
そのほかの態様において、本発明の医薬組成物はSEQ ID NO:4により規定される式：Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を持つヘキサペプチドであるオリゴペプチドを含み、その中のメチオニン残基はアセチル化することができる。
【００５６】
本発明の医薬組成物中の有効成分として使用されているペプチドは既知有機化学的な方法により合成的に製造される。その合成は、例えば、該米国特許番号5,814,610に記述されている。
【００５７】
本態様の望ましい態様にしたがうと、本発明の医薬組成物は骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環造血幹細胞数の増加が意図されている。
【００５８】
そのほかの態様にしたがうと、本発明の医薬組成物は、化学療法または照射を受けた患者の骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環造血幹細胞数の増強が意図されている。
【００５９】
全ての血液細胞系統の生涯にわたる産生を提供する造血幹細胞の能力は、幹細胞の可塑性、すなわち特別な血液細胞系統を発生させる拘束前駆細胞の産生、及び未分化段階における幹細胞複製（自己再生）、の間のバランスにより達成される。造血幹細胞の可塑性及び自己再生のインビボにおける調節機構は明らかにするのが困難であった。しかし、主な寄与因子は細胞に内在するものと環境の影響の組み合わせであることを示している[Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10302-10306 (1995)]。造血微小環境の重要性は、頻度は低いにもかかわらず、HSCを維持することができるストローマ上において造血細胞を培養する長期骨髄培養システムを使用することにより確立された[Fraser, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992); Wineman, et al., Blood 81: 365-372 (1993)]。
【００６０】
培養において造血細胞が維持できることが示されたので、候補「幹細胞」因子を同定する努力がなされるようになった。幹細胞維持における造血サイトカインの役割は、幹細胞集団のインビトロ培養に精製因子を直接加え、次いで培養細胞を移植することにより研究された[Meunch, et al., Blood 81: 3463-3473 (1993); Wineman et al., 前出（1993）; Rebel, et al., Blood 83: 128-136 (1994)]。IL-3，IL-6及びKLのような既知「初期作用」サイトカインの大部分は拘束前駆細胞の増殖を促進することが示され、他方同時に長期間多系統再構成が可能な細胞を維持することはできたが、増殖はできなかった[Williams, Blood 81(12): 3169-3172 (1993); Muller-Sieburg and Deryugina, Stem Cells, 13: 477-486 (1995)]。これらのデータは細胞可塑性及び再構成機能はサイトカイン処置により保持することはできることを示しているが、これらの多能性細胞の自己再生を促進する分子は未知のままに残されている。
【００６１】
本発明の医薬組成物に使用されたポリペプチドは循環多系統前駆細胞のパーセンテージを増加することが示された。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34 陽性細胞である。
【００６２】
ヒト及びマウスにおいて、初期成熟造血前駆細胞はCD34と呼ばれる細胞表面抗原を発現することにより規定される細胞のクラスに属することを同定することができる。これらの細胞はCD34陽性細胞と呼ばれる。マウスでは、CD34陽性造血細胞の初期サブクラスは二重陽性CD34+/Sca±細胞である。ヒトにおける同属Sca-1細胞表面抗原はFlk2である。したがって、ヒトCD34/Flk2二重陽性細胞はマウス二重陽性細胞CD34/Sca-1細胞と同じと考えられる。
【００６３】
CD34抗原及び/またはFlk2受容体を発現するヒト造血前駆細胞はここでは「初期前駆細胞」と呼ばれる。これに対して、CD34またはflk2のいずれかを発現しない造血細胞は「成熟前駆細胞」と呼ばれる。したがって、望ましい態様として、多系統前駆細胞は循環初期前駆CD34/Flk2二重陽性細胞である。
【００６４】
ここに使用した「前駆細胞」とは、分化と増殖により完全に分化し、機能する子孫を作ることができる能力を持つ体細胞のことである。前駆細胞は、限定はしないが、血液、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、すい臓、甲状腺、などを含む組織または器官の前駆体を含んでいる。増殖する能力、すなわち、自己複製、の能力を持つこともあり持たないこともあり、しかし正常な生理的条件においては異なる細胞型にそれ以上分化することができない細胞として定義される「分化した細胞」とは前駆細胞は区別される。さらに、前駆細胞は、がん細胞、特に白血病細胞、これは増殖（自己複製）するが未成熟または未分化のように見えるにもかかわらず、一般的にそれ以上の分化はしない、のような異常細胞とも区別される。
【００６５】
前駆体はその子孫によって規定される、例えば、顆粒球/マクロファージコロニー形成前駆細胞（GM-CFU）は好中球またはマクロファージに分化する；初期赤芽球形成ユニット（BFU-E）は分化して赤血球コロニー形成ユニット（CFU-E）となり、これから成熟赤血球が生じる。同様に、Meg-CFU, GEMM-CFU, Eos-CFU及び Bas-CFU前駆体はそれぞれ巨核球、顆粒球、マクロファージ、好酸球及び抗塩基球に分化することができる。
【００６６】
その他種々の造血前駆体が分析されている。例えば、造血前駆細胞は、8種の異なる成熟造血細胞系統を生じる分化及び増殖のサイクルを行うことができる細胞を含んでいる。造血過程の最も初期または未分化の段階における、造血前駆細胞は造血「幹細胞」である。これはまれな細胞であり、骨髄中の細胞の10,000中に1個から100,000中に1個存在し、それぞれが全ての系統の成熟血液細胞1013個以上を作る能力を持ち、そして生物の生涯にわたる血液細胞生産の維持を担っている。それらは骨髄中に主に静止状態で存在しており、自己再生と呼ばれる過程により同一の娘細胞を作ることができる。したがって、そのような非拘束前駆細胞は「全能」と記述することができる、すなわち、全ての型の成熟血液細胞を必要にして十分に作ることができる。全ての血液細胞系統を作る能力を維持しているが、自己再生できない前駆体細胞は「多分化能」細胞と呼ばれる。一部ではあるが全てではない血液系統を作ることができ、そして自己再生できない細胞は「多能」細胞と呼ばれる。
【００６７】
本発明に使用されるオリゴペプチドは、単能前駆細胞、多分化能前駆細胞、及び/または全能前駆細胞を含むこれらの前駆細胞のいずれを保存するにも有用である。このオリゴペプチド、特にOGP(10-14)、は造血前駆細胞の保存に特に有効である。
【００６８】
そのほかの望ましい態様において、本発明の医薬組成物中の有効成分として使用されたオリゴペプチドは、未熟細胞単球回復を促進しそしてBFU−E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つを選択的に増加する。
【００６９】
下記例3には、OGP(10-14)及び対照処置マウス由来の造血コロニー形成のエクスビボ評価が記述されている。この結果は、基剤のみの対照群に比較してOGP(10-14)処置マウス由来の培養中においてGEMM-CFU及びBFU-Eの増加を示し、他方G-CSF陽性対照はGM-CFUの有意な増加を示す。OGP(10-14)処置マウス由来の培養中のコロニー形成の増加は、化学的除去の7日前に処置を開始した場合にのみ、明らかであった。OGP(10-14)により得られたインビボ及びエクスビボのいずれの結果からも、別のサイトカインに比較して全長OGPの既に報告されている多系統活性が確認された。他の増殖及び動員因子[Fleming,W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3760 (1993)]と異なり、sOGP(10-14)は骨髄幹細胞コンパートメントを減少させることなく末梢血中の造血幹細胞の数を増加する。
【００７０】
したがって、本発明の医薬組成物は白血球（WBC）、循環造血幹細胞の数、及び総骨髄細胞構成の増加を意図することができる。
【００７１】
特別に望ましい態様において、本発明の組成物は骨髄移植を支持することが意図されている。この効果は、幹細胞数の増加、骨髄移植の際の造血再構築の促進、及び骨髄の細胞構成の増加を行うオリゴペプチドの活性に基づいている。
【００７２】
例1に記述されているように、本発明のオリゴペプチドは骨髄移植の定着を促進し、造血再構築を増強することが認められた。骨髄移植（BMT）は徐々にそして急速に、リンパ腫、ホジキン病及び白血病並びに固形癌、特に黒色腫及び乳癌のような血液学的悪性疾患の患者において選択される治療になりつつある。最近、IMF(特発性多発性骨髄繊維増殖)のような骨髄肥大性疾患の治療に考慮されることが多くなっている。潜在的には方法の改良もあって、BMTは重篤な病気−エイズ、再生不良性貧血及び自己免疫疾患の治療に使用することもできる。全てのBMTの目的は、化学療法、照射または病気により傷害を受けた宿主造血幹細胞、全能及び多分化能、を置換することである。これらの幹細胞は繰り返し複製しそして分化して、血液中に存在する全ての種類の細胞、つまり、赤血球、及びリンパ球、単球及び好中球を含めた白血球を作る。常在マクロファージ及び破骨細胞も造血全能幹細胞から誘導される。幹細胞は分化するので、上記の細胞の一種類のみを形成することができるようになるまで、ますます特別な系統に自身を拘束してゆく。
【００７３】
したがって、そのほかの特別に望ましい態様によると、本発明の医薬組成物は、血液学的疾患、固形癌、免疫疾患または再生不良性貧血の患者の骨髄移植の処置に使用することができる。より具体的には、血液学的疾患には、リンパ腫、ホジキン病または急性白血病及び骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）が含まれる。
【００７４】
IMFにおいて骨の赤血球産生は徐々に不良となり、一方異所造血が発生しそして増加する。結合織の病的石灰化及び柱状骨の構造変化は破骨細胞分泌因子の完全なまたは相対的な欠乏によるものであろう、したがって、少なくとも部分的には骨髄機能の障害にも原因があろう。
【００７５】
例4に記述した結果は、OGP(10-14)はIMF患者からの骨片の培養において、この短い時間内に結合織を変化させずに、骨髄造血細胞密度を増加することができることを強く示唆している。細胞の増加はバランスが取れており、不規則な細胞増殖によるものではない。勿論、ペンタペプチドを含まない培養中に認められたのと同じIMF検体の骨髄構造及び細胞構成をOGP(10-14)が維持したに過ぎないのではないかということを除外することはできない。しかし、未処置検体に比較してOGP(10-14)培養検体において維持または細胞構成の増加が認められることは、このペプチドの増殖活性を示している。現在は、OGPが血液前駆体に直接働くのか、ストローマ細胞または異なる細胞集団を介して作用するかは明らかではないが、しかし、少なくとも形態学的レベルでは、その作用は微小環境の変化には関係ないようである。
【００７６】
この知見の一つの意味は、OGP(10-14)が事実インビトロにおいて3系統のヒト造血細胞の増殖を増強できるという点である。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、医薬品として受容しうる担体、賦形剤または安定化剤中に、有効成分として上記のオリゴペプチド、またはその混合物を含む。受容しうる担体、賦形剤または安定化剤は使用する用量及び濃度において毒性がないものであり、リン酸緩衝食塩液及び生理的に受容しうる緩衝液のような緩衝液、より一般的には当業者に既知の全ての適当な担体、賦形剤及び安定化剤、例えば、医薬組成物に添加する香料、着色剤、潤滑剤などの目的で使用するものが含まれる。
【００７８】
担体としては、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微結晶セルロース、キサンタンガム、などが含まれる。潤滑剤には水素化キャスター油などが含まれる。
【００７９】
望ましい緩衝剤はリン酸緩衝食塩液（PBS）であり、これはさらに浸透圧も調製される。
【００８０】
望ましい医薬製剤は担体のないものである。そのような製剤は、静脈注射をふくめて、注射による投与に使用することが望ましい。
【００８１】
医薬組成物の調製は当業者に良く知られており、多くの文献及び教科書に記述されている、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990,及び特にその中のページ1521-1712参照。
【００８２】
本発明の医薬組成物は投与単位形態に調製することができる。投与形態は持続放出装置を含むこともできる。この組成物は調剤技術分野でよく知られているいずれかの方法により調製することができる。その投与形態は、本来毒性がなくそして治療効果もない生理的に受容しうる担体を含む。そのような担体の例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク、リン酸のような緩衝性物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリンエステル混合物、水、塩、または硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような電解質、コロイド珪素、マグネシウム三珪酸、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導物質、及びPEGが含まれる。これらのポリペプチドの局所用またはゲル基剤形態のための担体としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ブロック重合体、PEG及び木蝋アルコールが含まれる。全ての投与について、通常のデポ形態が適当に使用される。そのような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び持続放出製剤が含まれる。
【００８３】
持続放出製剤の適当な例には、本発明のオリゴペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは例えば、フィルム、またはマイクロカプセルのような形になっている。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、米国特許番号3,377,919に記述されているようなポリ乳酸、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、Lupron DepotsTMのような分解性乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸-グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、及びポリ-D-(-)3-ヒドロキシブタン酸が含まれる。酢酸エチレンビニル及び乳酸-グリコール酸のような重合体は100日以上にわたって分子を放出することができるが、或るヒドロゲルは短時間にタンパクを放出する。カプセルに入れた場合には、ペプチドは体内に長時間残留するので、37℃の湿気にさらされる結果として変性または凝集して、生物活性を失いそして免疫原性も変化する可能性がある。関係する機序によって安定化に対する合理的な方法を工夫することができる。例えば、もし凝集機序がチオ-スルフィド変換による分子間S-S結合形成によることが発見されるならば、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適当な添加物を使用して水分含量の調節、及び特別な重合体マトリックス組成の開発により行うことができる。
【００８４】
持続放出オリゴペプチド、特にsOGP1-14組成物には、リポソームに封入されたオリゴペプチドも含まれる。これらのオリゴペプチドを含むリポソームは当業者既知の方法により調製される、例えば、Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030(1980); 米国特許番号4,485,045及び4,544,545に記述されている。通常は、リポソームは小さな（約200-800オングストローム）の単層型であり、その中の脂質含量は約30 mol.%以上であり、ポリペプチド治療に最適になるように比率を調整する。循環時間を改善したリポソームは米国特許番号5,013,556に開示されている。
【００８５】
このオリゴペプチドの治療用製剤は保存のために望む純度のポリペプチドと任意の生理的に受容しうる担体、賦形剤または安定化剤と混合して,凍結乾燥品または水溶液の形に調製される[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)]。受容しうる担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量及び濃度において毒性がないものであり、そしてリン酸、クエン酸、およびそのほかの有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、及びそのほかの糖類；EDTAのようなキレート剤；マンニトール及びソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのようなスラット形成カウンターイオン；及び/またはTween，PluronicsTMまたはポリエチレングリコール（PEG）のような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００８６】
オリゴペプチドはマイクロカプセル中に封入することもでき、これは例えばコアセルベーション技術によるかまたは界面重合法により（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタアクリレート）マイクロカプセル、それぞれ）、コロイド状薬物輸送システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に調製される。そのような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences、前出、中に開示されている。
【００８７】
この医薬組成物は望ましくは必要とする患者に1日1回使用され、そして望ましくは約0.001から約50 nmol, より望ましくは約0.05から25 nmol,最も望ましくは約0.1から約10 nmolの活性成分の投与量を含む。
【００８８】
記述したオリゴペプチドに加えて、本発明の移植支持組成物はさらに任意に他の治療成分を含むことができる。そのような成分としては、一つかまたはそれ以上の既知サイトカイン、例えば、IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及びM-CSF（マクロファージコロニー刺激因子）でありうる。そのようなほかの成分が組成物中に取り込まれた場合には、組成物の骨髄移植支持効果は相加的に増加することができる。
【００８９】
第二の態様として、本発明は、骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強のための医薬組成物の調製に、上記のオリゴペプチド、特にSEQ ID NO:1，2，3，及び4により規定されるTyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれかを使用することに関係する。
【００９０】
さらに、ここに記述したオリゴペプチドは、骨髄移植の定着の促進、移植幹細胞の増殖の促進、及び赤血球を含む全ての型の造血細胞の利用度を増加し、そしてこれにより数週間のうちに宿主をこれらの細胞で支援する必要性を除去；造血を支持するストローマ細胞数及び/またはストローマ細胞誘導因子の発現の増加によるストローマ造血微小環境の増強；造血を支持する因子に対する受容体の造血幹細胞発現の増強；静脈内に投与された骨髄移植物の宿主骨髄への「指向性」の増強；骨随移植後の血液細胞構成の回復の促進；少ない細胞数を使用して移植に成功することによりドナーからの骨髄採取回数を減らし、そして（1000 mlでなく）10-15 mlの少量を移植に使用することができる；ドナー末梢血液中の造血全能及び/または多分化能幹細胞の数を増加して、末梢血の幹細胞の移植の可能性を改善；移植に使用するためにインビトロにおいて長期骨髄培養において造血幹細胞数を増加し、そして白血病患者の同種移植において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法も提供；化学及び/または放射線療法の後の骨髄及び血液細胞構成の内在性回復力を促進；そしてBMT後または化学及び/または放射線療法後の常在マクロファージ集団の回復、をするための医薬組成物の調製に使用することができる。
【００９１】
オリゴペプチドまたは本発明の組成物の治療用量は、勿論、患者の群（年齢、性など）、治療する病状及び使用する個別のオリゴペプチド及び投与経路によって異なるであろう。いずれの場合にも、治療用量は主治医によって決定されるであろう。
【００９２】
いずれかの適当な投与経路を本発明のオリゴペプチドの有効用量を哺乳動物、特にヒトに供給するために使用することができる。静脈内、皮下及び経口投与が望ましい。
【００９３】
望ましい態様として、これらのオリゴペプチドは、循環多系統前駆体細胞パーセンテージを増加させるための医薬組成物の調製に使用される。これらの多系統前駆細胞は循環初期前駆体CD34陽性細胞、及び望ましくはCD34/Flk2二重陽性細胞である。
【００９４】
上記の「造血幹/前駆細胞」または「初期造血細胞」は、分化して、より拘束された成熟した血液細胞型を作ることができる細胞である。「造血幹細胞」または「幹細胞」は特に、致命的照射を受けた宿主の長期移植定着をすることができる細胞である。
【００９５】
「CD34+細胞集団」は造血幹細胞が濃縮されている。CD34+細胞集団は、例えば、臍帯血または骨髄から得ることができる。ヒト臍帯血CD34+細胞はMiltenyi（Calfornia）によって販売されている免疫磁気ビーズを使用して、メーカー説明書にしたがって、選別することができる。
【００９６】
さらに、本発明の医薬組成物の調製に使用されるオリゴペプチドは、未熟細胞及び単球回復を促進し、そしてBFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つの選択的増加をする。
【００９７】
したがって、そのオリゴペプチドは白血球数（WBC）、循環造血幹細胞及び総骨髄細胞構成を増加するための医薬組成物の調製のために使用される。
【００９８】
より具体的に、本発明は骨髄移植を支持するための医薬組成物の調製にこれらのオリゴペプチドの使用することを提供する。この効果は、幹細胞数の増加、骨髄移植の際の造血再構築の促進及び骨髄細胞構成の増加におけるオリゴペプチドの効果に基づいている。
【００９９】
そのほかの特に望ましい態様によると、本発明は血液学的疾患、固形腫瘍、免疫学的疾患及び再生不良性貧血に罹患している患者の治療のための医薬組成物の調製に該オリゴペプチドを使用することに関係している。より具体的に、血液学的疾患はリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患、特に特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）であろう。
【０１００】
第三の態様において、本発明は骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞の増強のための方法を提供する。この方法は、これを必要とする患者に、上記のような造血細胞に対して刺激活性を持つオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量を投与することを含む。
【０１０１】
そのほかの態様によると、本発明は、化学療法または照射を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数の増強のための方法を提供する。
【０１０２】
さらに他の態様において、本発明のオリゴペプチドまたは組成物の有効量を、骨髄移植の定着を改善するために、または末梢血から造血前駆細胞を採取する前に哺乳動物において造血幹細胞の動員及び/または増殖を刺激するために使用することができる。
【０１０３】
この態様の特別な態様によると、本発明は、造血細胞の産生に刺激効果を持つオリゴペプチドまたはそれを含む本発明の組成物の治療有効量を投与することによる、血液学的異常、固形腫瘍、免疫学的異常または再生不良性貧血に罹患した患者を治療する方法に関係する。
【０１０４】
そのほかの特別な態様において、この方法は骨髄移植による患者の治療を支持するために使用することができる。
【０１０５】
治療に適用するために、本発明に有用なオリゴペプチドまたは医薬組成物は、ボーラスまたは時間をかける持続注入によりヒトの静脈内に投与するような形態を含む生理的に受容しうる形態において哺乳動物、望ましくはヒト、に投与される。そのほかの投与経路としては、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、鞘内、経口または局所の経路がある。全身的治療効果と同様に局所で作用させるために、このオリゴペプチドまたは本発明の組成物を腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、または病巣周囲に、またはリンパにも適当に投与される。
【０１０６】
インビボ投与に使用されるオリゴペプチドまたは医薬組成物は滅菌されていなければならない。これは凍結乾燥及び再溶解の前または後に滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に行うことができる。オリゴペプチドは溶液で保存することができる。治療用オリゴペプチド組成物は一般的には滅菌取り出し口のついた容器、例えば、注射針により刺し通すことができるストッパーの付いた静脈注射溶液バッグまたはバイアル、に入れられている。
【０１０７】
治療に使用されるいずれかのオリゴペプチドまたは本発明の組成物の「有効量」は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態による。したがって、最適の治療効果を得るために、必要に応じて用量を調整し、そして投与経路を変えることが必要であろう。典型的に、医師は望む効果に達する用量までオリゴペプチドを投与するであろう。全身的治療に対する典型的な1日用量は、前述の要因に応じて約0.001 nmol/Kgから50 nmol/Kg以上までの範囲であろう。
【０１０８】
そのほかの特別な態様は、エクスビボ方法が適用できる、移植を受ける患者の治療に関係する。この方法において、その移植に先立って、移植をする予定の細胞をこのオリゴペプチドまたは本発明の組成物の有効量に暴露する。
【０１０９】
移植のための造血幹細胞の十分な量を得るために現在極く普通に行われている方法は、ドナーの骨の多くの部位から針とシリンジで1リットルかそれ以上の骨髄組織を吸引することであり、通常全身麻酔を必要とする操作である。同種BMTのドナーは通常組織型が同じ兄弟姉妹でありそして時にはHLA分類がレシピエントと適合する親族でないドナーである。HLA適合性試験を必要としない自己移植を、固形腫瘍を除去するための化学照射治療を予定している患者に使用することができる。自己幹細胞は出生時に臍帯血からも得ることができ、そして将来の輸血に備えて保存することができる。
【０１１０】
移植後そしてドナーからの骨髄が機能を発揮するまでに、BMTを受けた患者は、感染の恐れがある一過性の著しい不形成貧血を呈する。細菌及び菌の感染発生率は不形成貧血の程度と期間に相関する[Slavin, S. and Nagler, A., Transplantation (1992)]。同じ理由で、CSFは赤血球形成及び血小板形成を支持することができない。
【０１１１】
造血を支持するオリゴペプチドは他の手段においても同様に有用であることを示すことができる。ある研究者は、末梢血の幹細胞を骨髄の幹細胞に加えることにより定着率を著しく増加するが、末梢血から十分な数の幹細胞を抽出するのは複雑な操作であることを認めている。血中の幹細胞の数を増やすためにドナーにこのオリゴペプチドを投与することにより、末梢血の幹細胞を移植する可能性を改善するであろう[Golde, D.W., Sci. Am. 36 December(1991)]。
【０１１２】
造血、したがってMBTに成功する必要条件は、注入した幹細胞を循環から骨髄へ回帰させることそして造血を支持する造血微小環境を含む機能的ストローマ細胞及び組織が存在することである[Watson,J.D. and McKenna,H.J. Int. J. Cell Cloning 10: 144 (1992)]。また、ストローマ組織に由来する骨髄は骨髄のインビトロ長期間培養において幹細胞を維持する条件を提供する。現在この技術は幹細胞を生きたまま維持することができる。この培養に適当な造血オリゴペプチドを加えることによりインビトロにおいて幹細胞集団の増殖を支援することができ、これにより移植のための幹細胞数を増加する。
【０１１３】
インビトロ/インビボの組み合わせ方法は、(i)ドナー血液または骨髄から少数の幹細胞を得る、そして (ii)健康人は重篤な疾患のためにその細胞が必要となるときのために自分の幹細胞を保存し、これにより同種BMTに伴う複雑な問題を回避する、という進歩的戦略の基礎を提供することを可能にする。
【０１１４】
繊維組織、骨および骨細胞が重要な成分である造血微小環境をインビボ、エクスビボ及び/またはインビトロで増強することによりBMT後の造血再構築を促進する本出願に記述したオリゴペプチドのような小さなペプチドを使用することは治療上重要である。そのようなペプチドは、必ずしもBMTを必要としないような自然に発生する骨髄抑制における造血を支持することもできる。
【０１１５】
本出願に記述したオリゴペプチド及び望ましくはペンタペプチドOGP(10-14)は、初期造血前駆体（すなわち、造血幹/前駆細胞）のレベルに直接作用するようである。その増殖幹細胞集団は、骨髄形成、赤血球形成（例えば、脾臓赤血球形成）及びリンパ球形成の基となりうる。したがって、これらのオリゴペプチドは造血幹/前駆細胞の増殖及び/または維持を増強するために（例えば、造血疾患または異常を治療するために）使用することができる。
【０１１６】
したがって、望ましい態様は造血幹/前駆細胞の増殖を促進する方法に関係する。本発明に従うと、この方法は、造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドの有効量、またはそれを含む上記のような組成物の有効量に、これらの細胞を暴露する段階を含む。本発明によるとその暴露は該細胞の増殖を促進するのに有効である。
【０１１７】
用語「細胞の増殖を促進する」は、インビトロまたはインビボにおいて非処置細胞に比較して細胞の増殖及び/または再生の程度が増加している段階を包含する。細胞培養における細胞増殖の増加は、問題の分子に暴露する前後に細胞数を計測することにより測定することができる。増殖の程度はコンフルエンシーの程度を顕微鏡で調べることにより定量化することができる。細胞増殖はチミジンまたはBrdU取り込み検定を使用して定量化することもできる。
【０１１８】
特別に望ましい態様において、本発明の方法はCD34陽性細胞、望ましくはFlk2陽性細胞の増殖を促進することを意図している。
【０１１９】
本発明のオリゴペプチドまたは組成物は、インビボまたはインビトロにおいて造血幹/前駆細胞の数および/または増殖および/また分化および/また維持の増強、これらの細胞集団の拡大及び哺乳動物におけるその細胞及び多系統の血液細胞の再構成促進に有用である。
【０１２０】
一つの具体的な望ましい態様において、これらの細胞は細胞培養中に存在し、したがって、これはエクスビボ/インビトロの方法であろう。
【０１２１】
そのほかに、処置細胞が哺乳動物の中に存在する場合には、本発明の方法は治療のインビボ方法として使用することができる。
【０１２２】
「治療」は治療処置及び予防または防護方法の両者のことである。治療を必要とするものには、すでに疾患または異常を持っているもの並びに疾患または異常を予防すべきものが含まれる。
【０１２３】
治療の目的となる「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び養殖動物、及び動物園、スポーツ用またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、を含む哺乳動物に分類される動物のことである。望ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１２４】
特別な態様において、本発明の方法により治療される哺乳動物は、化学療法、照射療法、骨髄移植治療またはそのほかの医原性または自然の原因により罹患しているか、または罹患しやすいものである。
【０１２５】
がん患者において化学及び放射線療法は血液細胞集団の劇的な減少を生じる。米国とヨーロッパにおいて毎年少なくとも500,000人のがん患者が、さらに200,000人が日本で、化学療法及び放射線療法を受けている。再生不良性貧血、原発性免疫不全、急性白血病及び（全身照射後の）固形腫瘍に有益な骨髄移植は医療の場において広く実施されるようになっている。毎年少なくとも15,000人の米国人が骨髄移植を受けている。そのほかの病気が血液細胞系統の全てまたは一部を減少させる原因となりうる。そのような状態の例としては、（マクロサイト性及び再生不良性貧血を含む）貧血；血小板減少症;形成不全；免疫性（自己免疫性）血小板減少性紫斑病（ITP）；及びHIV誘発ITPが含まれる。
【０１２６】
これらの患者の血液細胞集団の再構築を促進することができる医薬製品が求められている。
【０１２７】
したがって、原始造血細胞の増殖及び/または分化及び/または維持を増強するための方法を提供することが本発明の目的である。該方法は造血幹細胞及び成熟血液細胞系統の再構成の促進のために有用でありうる。これは、病気、照射または化学療法の結果として造血または成熟血液細胞の病気に哺乳動物が罹患している場合には望ましい。この方法は、エクスビボにおいて該造血細胞から該幹細胞および成熟血液細胞系統の拡大した集団を作るためにも有用である。
【０１２８】
さらにそのほかの望ましい態様において、本発明は幹細胞のインビトロ/エクスビボ維持及び/または増殖する方法に関係する。この方法は、血液検体から末梢血液細胞を単離する、CD34抗原を発現する血液前駆細胞を集める、適する条件下に濃縮血液前駆細胞を播種する、そして該細胞を、本発明に従って、造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチド、または造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドを有効成分として含む組成物で処理すること、を含む。
【０１２９】
特別な態様において、本発明の方法は、さらに処置細胞をサイトカインに暴露する段階を含むであろう。限定しない例としては、該サイトカインはTPO（トロンボポエチン）、EPO（エリスロポエチン）、M-CSF（マクロファージ-コロニー刺激因子）、GM-CSF（顆粒球-マクロファージ-CSF）、G-CSF（顆粒球CSF）、IL-1（インターロイキン-1）、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF（白血病抑制因子）及びKL（キットリガンド）からなる群から選択することができる。
【０１３０】
インビボ治療の態様として、本発明は哺乳動物における血液細胞再生の方法に関係する。この方法は該哺乳動物に造血細胞に対して刺激作用を持つオリゴペプチドの治療有効量、または本発明の組成物有効量を投与する段階を含む。これらの造血細胞は赤血球系、骨髄系及びリンパ系の細胞のいずれかでありうる。
【０１３１】
「リンパ系血液細胞系統」は分化してリンパ球（B-細胞またはT-細胞）を形成することができる造血前駆細胞である。同様に、「リンパ形成」はリンパ球を形成することである。
【０１３２】
「赤血球系血液細胞系統」は分化して赤血球（赤血球）を形成することができる造血前駆細胞であり、「赤血球形成」は赤血球を形成することである。
【０１３３】
句「骨髄血液細胞系統」は、ここの目的では、上に定義したリンパ系及び赤血球系血液細胞系統以外の造血前駆細胞を全て包含する、そして「骨髄形成」は（リンパ球及び赤血球以外の）血液細胞の形成を含む。
【０１３４】
開示及び記述された操作段階及び材料は若干変更することができるので、ここに開示された特別な例、操作段階、及び材料に本発明が限定されないことは理解されるべきである。また、本発明の範囲は請求項の記述によってのみ限定されるので、ここに使用した用語は特別な態様を記述する目的のためにのみ使用されていることも理解されるべきである。
【０１３５】
本明細書及び請求項に使用されている単数形「a」,「an」及び「the」は、特に明確に記述しないかぎり、複数の内容を含んでいることに注意すべきである。
【０１３６】
この明細書及び以下の請求項を通して、特記しない限り、語「含むcomprise」及びその変化形「comprises」及び「comprising」は、示した整数または整数の段階または群を包含することを意味するが、そのほかの整数または整数の段階または群を排除しないことは理解されるであろう。
【０１３７】
以下の例は本発明の態様を実施するために発明者らによって使用された技術の代表例である。これらの技術は本発明の実施のための望ましい態様の代表例であるので、当業者は本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から離れずに多くの修飾を行いうることを認識していることは、理解されるべきである。
【０１３８】
例
試薬
1．骨再生増殖ペプチドのC-末端ペンタペプチド（10-14）[sOGP(10-14)]:Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly; M.W. 499.7(SEQ ID NO:1)はPolypeptides Laboratories Inc. (Torrance, California 90503, 米国 バッチNo.9712-006)から供給された。
2．CFA‐シクロホスファミド（CFA, SIGMA, 5 mg/マウス）を骨髄除去を誘発するために使用した。
3． Dexter-様培地：下記を含むMcCoy培地（Gibco-Life technologies,米国）、12.5％ウシ胎児血清（FBS, Hyclone, オランダ）、12.5％ウマ血清（HS, Sigma, St Louis, MO）、0.8％必須及び0.4％非必須アミノ酸（Gibco-Life technologies,米国）、1％グルタミン（Sigma, St Louis, MO）、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、パントテン酸D-Caを含む0.4％ビタミン（Gibco- Life technologies,米国）、1％アンホテリシンB（Fungizone, Bristol-Myers Squibb）、1％ゲンタマイシン、及び組換えヒト幹細胞因子（50 ng/mL rhSCF, Calbiochem,米国）、組換えヒト顆粒球-単球コロニー刺激因子（rhGM-SCF 10 ng/mL, Sandoz, スイス）、組換えヒトインターロイキン-3（rhIL-3 10 ng/mL, Calbiochem,米国）及び組換えヒトエリスロポエチン（rhEpo 2 units/mL, Sigma, St Louis, MO）の存在下に10-6 Mヒドロコルチゾン、これにsOGP(10-14) 10-8 M（Abiogen Pharma SpA Research Laboratories）を加えるかまたは加えない。
4．E.D.T.A緩衝液（Mielodec, Bio Optica, Milan,イタリー）
【０１３９】
動物
* ICR雄マウスをCharles River（イタリー）から購入し、特定病原排除環境の下に飼育した。
* CV57 Black雌マウスはHebrew University Medical School (Jerusalem,イスラエル)の動物飼育施設から入手した。両系統のマウスの体重は発明者の研究室到着時に25 gであった。
【０１４０】
統計解析
群間の比較は、FisherのPLSD,要因分析または繰り返し法、分散分析（ANOVA）を使用して行った。コロニー検定にはマン-ホイットニー検定を使用した。
【０１４１】
例1
骨髄移植の定着に対するOGP(10-14)の効果
材料と方法
骨髄移植の定着に対するOGP(10-14)の効果を検討するためにCV57 Black雌マウスを使用した。リン酸緩衝食塩液に溶解したOGP(10-14)を毎日皮下に12日間10μlを注射して投与した。1日用量はマウス当り0.001から10 nmolの範囲であった。対照マウスにはリン酸緩衝食塩液のみを投与した。OGP(10-14)処置開始後8日目に、60Co線源（Picker C-9, 102.5 rad/min）を使用して1回900 rad量の全身X-線照射をマウスに行った。その直後に、非選別同系骨髄細胞の105を静脈内投与した。OGP(10-14)処置開始後14日後に動物を殺処理し、両大腿骨を取り出し、その骨端を除去した。骨髄を完全にリン酸緩衝食塩液（PBS）で洗い出した。傾けた注射針を通して数回吸引することにより単細胞懸濁を調製し、ヘモサイトメーターで細胞を計数した。
【０１４２】
結果
図１は、照射後/移植後の総大腿骨骨髄細胞数に対するOGP(10-14)の刺激効果を示す。この効果は用量依存性であり、最高3用量においてPBS対照に対して統計的に有意な2倍の細胞数の増加を示している。
【０１４３】
例2
OGP(10-14)の毒性評価
上記のように、OGP(10-14)には骨髄移植の定着促進が認められた。したがって、該ペプチドの薬理活性をさらに詳細に検討する前に、該ペプチドの毒性の可能性について検討した。
【０１４４】
55匹のマウスに10 nmol/マウスの用量で15日間皮下投与してOGP(10-14)の毒性の可能性を評価し、結果を30匹のプラセボ投与対照で得られた結果と比較した。生存率、行動、体重増加及び肉眼的剖検に関して相違は認められなかった。血液学的パラメータに関して、ペプチドの報告された用量の投与では白血球（WBC）、赤血球（RBC）、血小板（PLT）またはヘモグロビン（Hb）レベルに有意な変化は生じなかった。
【０１４５】
例3
OGP(10-14)は骨髄化学除去後の造血回復を促進する
材料及び方法
この実験のセットにおいて、骨髄除去はシクロホスファミド（CFA， SIGMA, 5 mg/マウス , 150(l滅菌PBSに溶解)を2連日（「0日目」及び「1日目」と呼ぶ）に腹腔内投与することにより誘発した。このプロトコールは重篤な、可逆性の白血球減少症、L.D.＜30、を誘発することを示した[Spangrude,G.J. et al., Science, 241: 58 (1988)]。最低の骨髄細胞数は最初の注射6日後に認められた。
【０１４６】
白血球分類細胞数に対するOGP(10-14)の効果を評価し、そして今後の実験に使用するOGP(10-14)の「適量を」を決定するために、マウスを毎日0.1 mlのOGP(10-14)を含まない溶媒または図2に略記した種々のOGP(10-14)用量を含む溶媒を皮下注射した。基準対照の一群は非処置のままとし、CFAもOGP(10-14)を含んでも含まなくても滅菌水溶媒を投与しなかった（図2）。血液は-12，-4，+3，+7，+14，+17，+21及び+24日目に眼窩後方出血により採血した（図2C）。分別細胞数の計数はコールターカウンター（Sysmex Microcell Counter F-800）を使用して行った。
【０１４７】
二重陽性CD34+/Sca-1+細胞に対するOGP(10-14)の効果をG-CSFと比較して試験するために、CFA除去マウスに-7日目から+7日目まで毎日10 nmol OGP(10-14)を投与し、+5，+7及び+15日目に血液検体を採取し、フローサイトメトリーにかけた。G-CSFは+2から+8日目まで投与した。
【０１４８】
フローサイトメトリーのために、マウスの3検体を合せ、単核細胞を濃度勾配遠心分離によって集め、1×106/mlの濃度でPBSに再懸濁した。次いでその細胞を特異的モノクロナール抗体（最終希釈1:10）の存在下に30分4℃でインキュベートした。CD34+細胞を検出するために、第一層として精製ラット抗マウスモノクロナール抗体（Pharmingen， RAM34）を使用した。3回洗った後、細胞をPBSに再懸濁し、FITCポリクロナールヤギ抗ラット（Pharmingen）とインキュベートした。Sca-1+/CD34+細胞を検出するために、検体をさらにPBSで3回洗い、Caltagのラット抗マウスSca-1（Ly.6A.2）PEとインキュベートした。最初の抗体を無関係な免疫グロブリンに替えて対照とした。データ取得及び分析は、Lysis IIソフトウエアを使用するFAC-Scan(tm)（Becton Dickinson）フローサイトメトメーターにより行った（図3）。
【０１４９】
種々の投与法によるOGP(10-14)を評価するために、化学除去マウスに図4に示すようなOGP(10-14)を毎日投与した。マウスを+15日目に殺処理し、大腿骨骨髄を洗い出し、単細胞懸濁（上記のように作製）をエクスビボ前駆細胞（コロニー形成）検定にかけた。CFU-GM, CFU-GEMMおよびBFU-Eの形成に対するOGP(10-14)効果をG-CSFのそれと比較した（図4）。
【０１５０】
前駆細胞検定
全群の骨髄細胞をCFA注射後+10日目に回収した。細胞を2％ FBSを加えたIscoveの改良Dulbecco培地（IMFM）で2×106/mlに希釈し、メーカーの推奨に従ってメチルセルロース培地に加えた（MethoCult, StemCell Technologies Inc., Vancouver, カナダ）。各試験において2×104細胞を接種した。M3434（マウスGM-CFUおよびGEMM-CFUに対して）およびM3334（マウスBFU-E検定に対して）を使用した。M3434には組換えマウスインターロイキン-3（rmIL-3, 10 ng/ml）、組換えヒトインターロイキン-6（rhIL-6, 10 ng/ml）、組換えマウス幹細胞因子（rmSCF, 50 ng/ml）及び組換えヒトエリスロポエチン（rhEpo, 3 U/ml）を添加した。M3434に加えた因子はEpoのみであった。プロトコール手順に従って14日間のインキュベーションの後各マウスについて2回の試験を盲検で行った。
【０１５１】
結果
+3日目に行った総及び分類WBC数はCFA処置群の全てにおいて著しい減少を示した（図2）。7日目に、化学除去後溶媒処置群において総WBC数は約2倍に回復したが、非処置対照マウスの値に比較してまだ若干低かった。他方、OGP(10-14)投与動物は試験した全ての用量において高値を示し、10 nmol OGP(10-14)/日投与マウスにおいて最高値であった。この群の値は、非処置対照動物の値のほぼ近くに達した（図2A）。7日目に行った分類細胞計数においてもOGP(10-14)による用量依存性増加が単球及び未熟細胞数に認められた（図2B, 2C）。最高用量（10 nmol）における単球数は正常対照に比較して6倍高かった（図2B）;未熟細胞数も対照より有意に高かった（図2C）。全動物群の総WBC数は10日目以降正常となった（図2A)。しかし、単球数は7日目に同じ傾向を示し、14日目に正常レベルに達した（図2B）。未熟細胞数の減少が0.01 nmol群以外の群に認められたが、最高値は10 nmol群に認められた。未熟細胞数は14日目以降に正常になった（図2C）。
【０１５２】
+5日目の二重陽性CD34+/Sca-1+細胞数は溶媒のみで処置されたマウスに比較して毎日10 nmol OGP(10-14)で処置された化学除去動物において5倍高かった（図3）。OGP(10-14)の効果はG-CSFの効果と同じであった。+7及び+15に行ったフローサイトメトリーではほぼ同じCD34+/Sca-1+細胞数を示した。しかし、+15日目では、OGP(10-14)で処置マウスは溶媒処置及びG-CSF処置マウスよりも有意に高い細胞数を示した（図3）。
【０１５３】
前駆細胞検定により、OGP(10-14)はCFU-GEMM及びBFU-Eを有意に刺激するが、CFU-GMは刺激しないことが示された。OGPの効果は、化学除去の7日前に投与を開始した場合にのみ明らかであった（図4）。CFU-GMに対してOGP(10-14)の効果がないことは、血液中の顆粒球数に有意な効果がなかったことと一致している。G-CSFはCFU-GMのみに効果を有していた（図4）。
【０１５４】
例4
OGP(10-14)は特発性多発性骨髄繊維増殖患者のエクスビボ検体における造血骨髄細胞構成を救援する
材料と方法
ヒトにおけるOGP(10-14)の有効性を評価するために, 特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）に罹患した患者から得たエクスビボ検体における造血活性を検討した。
【０１５５】
IMF患者5例、鞏皮症1例及び脊髄形成不全症候群（MDS）の患者2例を、インフォームドコンセントにサインを得た後、試験に組み込んだ。IMFの診断は標準的臨床及び血液学的検査法に基づいて行った[Barosi, G., et al., Br. J. Haematol. 104: 730-737 (1999)]。繊維増殖を示す骨髄のバイオプシーは特徴的であった。IMFの診断は最終的に繊維増殖のほかの可能な原因及び他の骨髄肥大性疾患を除外して行った。特に、慢性骨髄性白血病は、Ph染色体及びbcr/abl転位の存在により除外した。IMF患者5例のうち3例は、低用量のブスルファン投与毎月10日、1（g 1,25(OH)2D3/日をすでに投与されていた。患者のデータを表1に要約した。
標本のゆがみを最小限にするためのトラップを装着した8ゲージディスポーザブルバイオプシー針により3 mmの長さの骨髄標本を背部上腸骨突起から採取した（TraoSystem MDThech,米国）。標本を1 cmの長さに3分した。無作為に一部分を予備的形態評価に使用した。残りの2部分を35-mm組織培養皿で培養し、1 mlのDexter様培地で完全に被い、rhSCF(50 ng/mL), rhGM-CSF(10 ng/mL), rhIL-3(10 ng/mL)及びrhEpo(2 unit/mL)の存在下に10-8 M OGP(10-14)を加えてまたは加えずに37℃、5％ CO2-空気中で培養した。7日目にサイトカイン及びOGP(10-14)の初期濃度を維持して、そのほかの成分を変更せずに培地の半分を交換した。さらに7日間培養した後、骨髄標本を組織学的に処理した。簡単に記述すると、検体を修正B5中で固定し、E.D.T.A酸緩衝液で脱灰し、切片をギムザ、ヘマトキシリン-エオジンまたは細網の銀飽和で染色した。骨髄の変化をIからIVのスコアで半定量的に評価した。IVのスコアは正常に比較して細胞が密な骨髄に対して使用した；スコアIIIは核密度の減少を伴う細胞構成減少を示す；スコアII標本は間隙の拡大を示し；スコアI標本の造血細胞は極めて乏しくそして/または骨髄領域は広く間隙で置換されている。検体あたり少なくとも3枚の同面積の切片について全体を検査した。さらに、細胞密度は、細胞数および骨髄面積の比として、Leica.QWinソフトウエアを装備したコンピュータ支援Laica顕微鏡を使用して自動的に評価した。各患者の結果は非処置標本に対するOGP(10-14)処置における平均細胞密度の比として示した（T/C比）。
【０１５７】
結果
培養14日後、OGP(10-14)で処理した骨髄標本は、同じ患者のOGP(10-14)非処理標本よりも造血細胞が多かった（図5,6）。半定量的スコアは全てのIMF患者で有意に増加した（p＜0.05）。IMFでない患者では、OGP(10-14)処置標本と非処置標本の間に差は認められなかった。細胞構成のコンピュータ評価では全てのIMF患者でT/C比＞1が認められ（p＜0.01）、OGP(10-14)処置標本において細胞数が増加することを強く示した。さらに、T/C比は個々の患者から得た標本の対毎に統計的に有意であった（表2）。T/C比は患者のヘモグロビンレベルと高度に有意な逆比例関係を示した（図7）。減少したヘモグロビンレベルはIMFの重症度を示す最も重要な血液学的指標である。したがってこの相関は、より重症な患者においてOGP(10-14)の効果は最高になることを強く示唆している。
赤血球系と骨髄系の細胞の比はOGP(10-14)と培養しても明らかな変化はしなかった。しかし、半定量的評価はIMF患者から得た標本中の多形核巨大細胞の数は1.5から10倍減少していることを示した。総造血細胞構成の場合には、そのような相違は非IMF患者から得た検体では認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】放射線除去処置/BMT併用後のマウスにおける大腿骨骨髄細胞の総数に対するsOGP(10-14)前処置の用量依存性効果。
示した用量のOGP(10-14)を12日間毎日雌C57BLマウスに皮下投与した。OGP(10-14)処置開始後8日目に900 Rad X線照射、次いで105同系非選別骨髄細胞の静脈内投与を行った。処置開始後14日目に殺処理し、大腿骨骨髄をリン酸緩衝食塩液中に洗い出した。傾けた注射針を通して数回吸引することにより単細胞懸濁を調製した。細胞計数はヘマトサイトメーターで行った。C - リン酸緩衝食塩液のみを与えた対照マウス。データは条件当り少なくとも7匹のマウスにおいて得られた 平均 ± 標準誤差 である。略記：Fem (大腿骨)、Marr C（骨髄細胞）、D（日）、mou（マウス）、premed（前投与）、stimu（刺激）、及びcellu（細胞構成）。
【図２Ａ−Ｃ】造血組織の化学的除去を行ったマウスにおいてOGP(10-14)は投与量及び時間に依存して血液細胞数を増加する。
雄ICRマウス、体重25 gm、それぞれに0及び1日目に1日1回シクロホスファミド（CFA）5 mg/マウスを腹腔内に投与して化学的除去を行った。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に溶解し、示した用量の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじの皮下に-７から-1日目及び+2から+8日目に毎日投与した。データは条件当り20動物において得られた 平均 ± 標準偏差 である。*：CFA＋溶媒に対して有意差あり、p＜0.05；**：1 nmol OGP(10-14)群に対して有意差あり、p＜0.05。図２Ａは全白血球数を示す。図２Ｂは全単球数を示す。図２Ｃは全未熟細胞数を示す。略記：cont（対照、非処置）、veh（溶媒）、ce（細胞）、T（時間-日）
【図３】造血組織の化学除去を行ったマウスにおいてOGP(10-14)は循環二重陽性CD34+/Sca-1＋細胞数を増加する。
雄ICRマウス、体重25 gm、それぞれに0及び1日目に1日1回シクロホスファミド（CFA）5 mg/マウスを腹腔内に投与して化学的除去を行った。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に100 nmol/mlの濃度に溶解し、この溶液の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじ皮下に-７から-1日目及び+2から+8日目に毎日投与した。陽性対照として、CFA除去マウスを+2から+8まで106 UI/0.1 ml G-CSFで処置した。データは条件当り33動物において得られた 平均 ± 標準偏差 （エラーバーは示すには非常に小さかった）である。略記：veh（溶媒）、T（時間-日）、*：CFA+溶媒に対して有意差あり、p＜0.01．
【図４Ａ−Ｃ】造血組織の化学除去を受けたマウスの骨髄由来エクスビボコロニー形成ユニットに対するOGP(10-14)処置方法の影響 雄ICRマウス、体重25 gm、にシクロフォスファミド（CFA)、5 mg/マウス、を使用して、0及び1日目に1日1回腹腔内に注射して化学除去を施した。OGP(10-14)を「注射用滅菌水」に100 nmol/mlの濃度に溶解し、この溶液の0.1 mlまたは水のみ（溶媒）を首すじ皮下に、示した期間毎日投与した。9日目に骨髄を採取し、コロニー形成ユニットを分析した。データは条件当り10動物において得られた 平均 ± 標準偏差 である。図４ＡはCFU-GMを示す。図４ＢはCFU-GEMMを示す。図４ＣはBFU-Eを示す。略記：Colo/di（コロニー/皿）、Veh（溶媒）
【図５Ａ−Ｂ】骨髄バイオプシーの顕微鏡写真 図５ＡはOGP(10-14)を加えずに14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者の骨髄検体の2部分の顕微鏡写真を示す。
図５Ｂは10-8MのOGP(10-14)を加えて14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者の骨髄検体の2部分の顕微鏡写真を示す。OGP(10-14)とともに培養した検体中の細胞密度増加に注目。
【図６Ａ−Ｂ】骨髄バイオプシーの顕微鏡写真 図６ＡはOGP(10-14)を加えずに14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者骨髄検体の2部分の細網染色切片顕微鏡写真を示す。
図６Ｂは10-8MのOGP(10-14)を加えて14日間エクスビボで培養した特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者骨髄検体の2部分の細網染色切片顕微鏡写真を示す。OGP(10-14)処置組織の正常所見に注目。
【図７】IMFにおける回帰解析 特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）患者における、ヘモグロビンレベル及び造血細胞数のエクスビボOGP(10-14)処置と非処置の比（T/C比）の間の回帰解析は、IMFの重篤度とOGP(10-14)の効果の間に相関関係があることを示している。略記：Hem（ヘモグロビン）、Hemato（造血性）、rat（比）、cellu（細胞構成）
Claims (54)
- 該オリゴペプチドが200から1,000 Daの分子量を有しそしてそれぞれSEQ ID NO:1，2，3及び4で規定されるアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれか一つを有しており、有効成分として造血細胞に対して刺激活性を有する少なくとも一つのオリゴペプチド及び医薬品として受容しうる担体を含む造血細胞の産生を刺激するための医薬組成物。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸配列により規定される式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を有するペンタペプチドである請求項１に記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列により規定される式Tyr-Gly-Phe-His-Gly,を有するペンタペプチドである請求項１に記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列により規定される式：Gly-Phe-Gly-Gly,を有するテトラペプチドである請求項１に記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:4で規定され、任意にアセチル化されている、アミノ酸配列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を含む請求項１に記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドが式：Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly.を有する請求項５に記載の医薬組成物。
- 骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための上記の請求項のいずれかに記載の医薬組成物。
- 照射または化学療法を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための上記の請求項のいずれかに記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドが循環多系統幹細胞数を増加させる請求項７及び８のいずれかに記載の医薬組成物。
- 該多系統幹細胞が循環初期前駆CD34陽性細胞である請求項９に記載の医薬組成物。
- 該多系統幹細胞が循環初期前駆二重陽性CD34/Flk2細胞である請求項９に記載の医薬組成物。
- オリゴペプチドが未熟細胞及び単球回復を促進する請求項７及び８のいずれかに記載の医薬組成物。
- 該オリゴペプチドがBFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つを選択的に増加する請求項７及び８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
- 白血球（WBC）、循環造血幹細胞及び総骨髄細胞構成を増加するための請求項７および８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
- 幹細胞の増加により骨髄移植を支持し、骨髄移植の際の造血再構築を促進しそして骨髄の細胞構成を増加するための請求項７及び８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
- 血液疾患、固形腫瘍、免疫疾患及び再生不良性貧血のいずれか一つに罹患している患者の骨髄移植治療に使用するための請求項１５に記載の医薬組成物。
- 該血液疾患がリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患からなる群から選択される請求項１６に記載の医薬組成物。
- 該骨髄肥大性疾患が特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）である請求項１６に記載の医薬組成物。
- 骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための医薬組成物の調製におけるそれぞれSEQ ID NO:1，2，3及び4で規定されるアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれか一つを含むオリゴペプチドのいずれか一つの使用。
- 照射または化学療法を受けた患者における骨髄移植の定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための医薬組成物の調製におけるそれぞれSEQ ID NO:1，2，3及び4で規定されるアミノ酸配列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,Tyr-Gly-Phe-His-Gly,Gly-Phe-Gly-Gly and Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyのいずれか一つを含むオリゴペプチドのいずれか一つの使用。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸配列で規定される式：Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を有するペンタペプチドである請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列で規定される式：Tyr-Gly-Phe-His-Gly,を有するペンタペプチドである請求項１９及び２０に記載の使用。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列で規定される式：Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,を有するヘキサペプチドである請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 該オリゴペプチドがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列で規定される式：Gly-Phe-Gly-Gly,を有するテトラペプチドである請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 循環多系統幹細胞数を増加するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つの使用。
- 循環多系統幹細胞が循環初期CD34陽性細胞である請求項２５に記載の使用。
- 該多系統幹細胞が二重陽性CD34/Flk2細胞である請求項２５に記載の使用。
- 未熟細胞及び単球回復を促進するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- BFU-E及びGEMMコロニー形成ユニット（CFU）のいずれか一つを選択的に増加するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 白血球、循環造血幹細胞及び総骨髄細胞構成を増加するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 幹細胞の増加により骨髄移植を支持し、骨髄移植の際の造血再構築を促進しそして骨髄の細胞構成を増加するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 血液疾患、固形腫瘍、免疫疾患及び再生不良性貧血のいずれか一つに罹患している患者の骨髄移植治療に使用するための医薬組成物の調製における請求項１９及び２０のいずれか一つに記載の使用。
- 該血液疾患が白血病、リンパ腫、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患のいずれか一つである請求項３２に記載の使用。
- 該骨髄肥大性疾患が特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）である請求項３３に記載の使用。
- 該方法が請求項１から７のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする細胞または患者のいずれかに投与する段階を含む、骨髄移植定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための方法。
- 該方法が請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする細胞または患者のいずれかに投与する段階を含む、化学療法または照射を受けた患者における骨髄移植定着、造血再構築、骨髄再構成及び循環幹細胞数を増強するための方法。
- 請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の治療有効量を投与することを含む、血液疾患、固形腫瘍、免疫疾患及び再生不良性貧血のいずれか一つに罹患している患者の治療方法。
- 骨髄移植により患者の治療を支持するために、請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の治療有効量を投与することを含む、血液疾患、固形腫瘍、免疫疾患及び再生不良性貧血のいずれか一つに罹患している患者の治療方法。
- 該血液疾患がリンパ腫、白血病、ホジキン病及び骨髄肥大性疾患のいずれか一つである請求項３７及び３８のいずれか一つに記載の方法。
- 該骨髄肥大性疾患が特発性多発性骨髄繊維増殖（IMF）である請求項３９に記載の方法。
- 請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の有効量を該患者に投与することを含む移植患者における急性移植拒絶を減少する方法。
- 請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の有効量に該細胞を暴露することを含む造血幹細胞の増殖を促進する方法。
- 該細胞がCD34陽性細胞である請求項４２に記載の方法。
- 該CD34陽性細胞がFlk2陽性細胞である請求項４３に記載の方法。
- 該血液検体から末梢血液細胞を単離し、CD34抗原を発現する前駆細胞を濃縮し、濃縮した血液前駆細胞を適当な条件下に播種し、請求項１から８のいずれか一つに規定した造血細胞の産生に対して刺激活性を有するオリゴペプチドで該細胞を処理することを含むインビトロ及び/またはエクスビボにおいて幹細胞集団を維持及び/または拡大する方法。
- 該細胞をさらに少なくとも一つのサイトカインに暴露することを含む請求項３５から４５のいずれか一つに記載の方法。
- 該サイトカインがTPO（トロンボポエチン）、EPO（エリスロポエチン）、M-CSF（マクロファージ-コロニー刺激因子）、GM-CSF（顆粒球-マクロファージ-CSF）、G-CSF（顆粒球-CSF）、IL-1（インターロイキン-1）、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF（白血病増殖阻止因子）及びKL（キットリガンド）からなる群から選択される請求項４６に記載の方法。
- 該細胞が細胞培養中に存在する請求項４１に記載の方法。
- 該血液検体が哺乳動物血液検体である請求項４２に記載の方法。
- 該血液検体がヒト血液検体である請求項４９に記載の方法。
- 血液細胞レベルが低下しているまたは低下しやすい哺乳動物に該血液検体が由来する請求項５０に記載の方法。
- 該血液レベルの減少が化学療法、照射、または骨髄移植治療に原因がある請求項５１に記載の方法。
- 請求項１から８のいずれか一つに規定されている造血細胞に対して刺激活性を有するオリゴペプチドまたは該オリゴペプチドを有効成分として含む組成物の治療有効量を投与することを含む哺乳動物における血液細胞再構成の方法。
- 該血液細胞が赤血球系、骨髄系及びリンパ系細胞のいずれか一つである請求項５３に記載の方法。
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