JPH11506941A - 変異体αアミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １またはそれより多くのアスパラギン残基が異なったアミノ酸で置換されているかまたは欠失されている新規αアミラーゼ酵素が開示されている。開示されているαアミラーゼは酵素は変更されたかまたは改善された低ｐＨ加水分解性能、安定性および活性特性を示した。

Description

【発明の詳細な説明】 変異体αアミラーゼ 発明の分野 本発明は変更された性能特性を有するαアミラーゼに向けられたものである。 本発明はまた、異なったアミノ酸で置換されるかまたは欠失された少なくとも１ つのアスパラギン残基を有する新規変異体αアミラーゼ酵素であって、そこにお いてその結果得られるαアミラーゼが、改変された低ｐＨデンプン加水分解性能 、改変された安定性および改変された活性特性を示すものに向けられている。発明の背景 αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３． ２．１．１）は、デンプン中の内部１，４グルコシド結合を、大まかにランダム に加水分解し、低分子量マルトデキストリンを生成する。αアミラーゼは、かな りの商業的価値があるものであり、デンプンの処理の最初の段階（液化）；アル コール生産；洗剤マトリックス中での洗浄剤；およびデンプンのり抜きのために 織物産業において用いられている。αアミラーゼは、バシルスおよびアスペルギ ルスを含む幅広く多様な微生物によって生産され、最も商業的なアミラーゼはバ シルス リケニフォルミス、バシルス アミロリケファシエンス、バシルス ス ブチリス、またはバシルス ステアロサーモフィラスなどの細菌給源から生産さ れる。近年、商業的用途において好ましい酵素はバシルス リケニフォルミスと なっているが、それはその熱安定性と、少なくとも中性および弱アルカリでの性 能のためである。 一般に、デンプンからフルクトースへの処理は、４つの段階を含む：微粒子デ ンプンの液化、液化デンプンのデキストロースへの糖化、精製、フルクトースへ の異性化である。デンプンの液化工程の目的は、デンプンポリマー微粒子の濃縮 懸濁液を低粘度の可溶性短鎖長デキストリンに変換することである。この段階は 、標準的な装置の簡便な取り扱いのため、およびグルコースまたは他の糖への十 分な変換のために必要不可欠である。微粒子デンプンを液化するために、微粒子 デ ンプンの温度を約７２℃より上に上げることにより微粒子をゼラチン化すること が必要である。加熱工程は、不溶性デンプン微粒子を瞬時に破壊し水溶性デンプ ン溶液を生成する。可溶化デンプン溶液は続いてαアミラーゼ（ＥＣ．３．２． １．１）により液化される。 通常の酵素的液化工程は、微粒子デンプンスラリーのｐＨを、バシルス リケ ニフォルミスから派生されたαアミラーゼの至適ｐＨである６．０から６．５の 間に、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムの添加により調整 することに関している。水酸化カルシウムの添加はαアミラーゼを不活性化に対 して安定化することが知られているカルシウムイオンを提供する利点を有してい る。αアミラーゼの添加の際に、懸濁液は、瞬時に温度を８０℃から１１５℃へ 上げるためにスチームジェット（ｓｔｅａｍ ｊｅｔ）を通して吹き込まれる。 デンプンは即座にゼラチン化され、αアミラーゼの存在により、α（１、４）グ リコシド結合のαアミラーゼによるランダムな加水分解を通して、容易に吹き込 まれる液体マスへと脱ポリマー化される。 第２の液化工程のバリエーションにおいては、αアミラーゼは、デンプン懸濁 液に添加され、懸濁液を８０−１００℃の温度に保持しデンプン微粒子を部分的 に分解し、部分的に分解されたデンプン懸濁液は約１０５℃を超える温度でジェ ットに吹き込まれ、何れの残存微粒子構造をも完全にゼラチン化する。ゼラチン 化されたデンプンを冷却した後、さらにデンプンを加水分解するために第２のα アミラーゼ添加が行われても良い。 第３のこの工程のバリエーションはドライミリング工程と呼ばれるものである 。ドライミリングにおいては、全体の穀物が粉砕され水と組み合わされる。ジャ ームは付加的に浮遊分離またはそれに相当する技術によって除去される。その結 果得られる混合物であって、デンプン、繊維、タンパク質およびその他の穀物の 成分を含むものが、αアミラーゼを用いて液化される。この技術での一般的な実 務は、ドライミリング工程を用いた場合に、より低い温度での酵素的液化を保証 することである。一般に、低温液化はデンプンの可溶性デキストリンへの変換に おいて高温液化と比較して効率的ではないと信じられている。 典型的には、ゼラチン化の後、デンプン溶液はαアミラーゼの存在下で１０− ２０のＤＥが達成されるまで上昇された温度で保持されるが、通常１−３時間で ある。デキストロース相当（ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：ＤＥ） は還元糖全体の濃度を測定するための産業上の規準であり、乾燥重量ベースでＤ −グルコースとして計算される。加水分解されていない微粒子デンプンは事実上 ゼロのＤＥを有するが、一方でＤ−グルコースのＤＥは１００と定義されている 。 αアミラーゼを含むデンプン溶液が保持され得る最大温度は、酵素が得られた 微生物給源およびαアミラーゼ分子の分子構造に依存する。Ｂ．スブチリスまた はＢ．アミロリケファシエンスの野生型株によって生産されたαアミラーゼは、 典型的には、それ以上の温度での過度に急速な熱不活性化のため約９０℃より高 くない温度で用いられるが、一方でＢ．リケニフォルミスの野生型株によって生 産されたαアミラーゼは、約１１０℃までの温度で用いられても良い。デンプン およびカルシウムの存在は、αアミラーゼを不活性化に対して安定化されること が知られている。にもかかわらず、αアミラーゼは急速な失活を防ぐために約６ より上のｐＨ値で用いられる。低温では、バシルス リケニフォルミス由来のα アミラーゼはデンプン基質に対して５という低いｐＨ値で加水分解活性を示すこ とが知られている。しかしながら、この酵素が通常のジェット温度、例えば１０ ２℃から１０５℃でデンプン液化に用いられた場合は、急速すぎる失活を防止す るためにｐＨは少なくともｐＨ５．７以上に維持されていなくてはならない。こ のｐＨ制限は、不幸なことに、処理の機会の狭い窓を提供しているが、それは６ ．０より上のｐＨ値は、マルチュロース等の好ましくない副産物という結果とな るからである。故に、現実に、加水分解されたデンプンの良好な収量を成すため に、液化ｐＨは５．９から６．０に維持されていなければならない。 液化ｐＨに関する別の問題点は、デンプン懸濁液のｐＨを、ウエットミリング 工程から得られたコーンスターチ懸濁液のｐＨである約４から５．９−６．０に 引き上げる必要があることである。このｐＨ調整は高価な酸中和物質の添加を要 求し、さらに物質を除去するために最終デンプン変換生産物の付加的なイオン交 換再生を要求する。さらに、液化の後の次の段階で、典型的には液化デンプンの グルコースへの糖化は４−４．５のｐＨを要求し、それ故、ｐＨは５．９−６． ０から４−４．５へと下方に調整されねばならず、付加的な物質添加と再生段階 が要求される。 液化に続いて、処理されたデンプンはグルコアミラーゼによってグルコースに 糖化される。現在の工程の問題点は、不完全なデンプンの液化、例えばアミラー ゼによるアミロースの不完全な加水分解等により、残存デンプンが糖化混合物中 に存在する場合に生じる。残存デンプンはグルコアミラーゼ加水分解に対して非 常に抵抗性である。それは収量ロスを示し、シロップの下流での濾過を妨害する 。 付加的には、多くのαアミラーゼが、安定性のためにカルシウムの添加を要求 することが知られている。このことはさらに液化のコストを増加させている。 米国特許第５３２２７７８号においては、ｐＨ４．０から６．０の間での液化 を、硫酸水素またはその塩、アスコルビン酸またはその塩、エリトルビン酸（ｅ ｒｙｔｈｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）等の抗酸化剤、またはブチル化ヒドロキシアニ ソール、ブチル化ヒドロキシトルエンまたはαトコフェロール等のフェノール系 抗酸化剤を液化スラリーに添加することにより達成している。この特許に従って は、抗酸化剤は５ｍＭより高い濃度で添加されなければならない。 米国特許第５１８０６６９号においては、ｐＨ５．０から６．０の間での液化 を、溶液を緩衝するために必要な量を超えて炭酸イオンを破砕されたデンプンス ラリーに添加することにより達成している。炭酸イオンの添加により生じるｐＨ 効果の増加により、スラリーは一般に、水素イオン給源、例えば塩酸または硫酸 等の無機酸の添加によって中和される。 ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／０２５９７号においては、改善された酸化安定性を有 する変異体αアミラーゼが記載されており、そこにおいては１以上のメチオニン が、システインまたはメチオニンを除くアミノ酸によって置換されている。 ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／１８３１４号においては、改善された酸化安定性を有 する変異体αアミラーゼが記載されており、そこにおいては１以上のメチオニン 、トリプトファン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン残基が、酸化可能で はないアミノ酸によって置換されている。 ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／００３５３号においてはバシルス リケニフォルミス αアミラーゼについての、性能特性および液化に関連した問題は、αアミラーゼ を特異的変異Ａｌａ−１１１−Ｔｈｒ、Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒおよび／または Ｔｈｒ−１４９−Ｉｌｅを有するように遺伝子操作することによってアプローチ されている。 組換えＤＮＡ技術を用いた、どの残基がアミラーゼの触媒活性にとって重要な のかを探求するための、および／または、多様なアミラーゼまたはグリコシラー ゼの活性中心内部の特定の残基を改変した場合の効果の探求のための研究は、数 多くの研究者によって実行されてきた（Ｖｉｈｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．２６７−２７２（１９９０）；Ｈｏｌ ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．３，ｐ ｐ．１８１−１９１（１９９０）；Ｔａｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｋａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１２０，ｐｐ．２８１− ２８８（１９９２）；Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ，ｖｏｌ．３１０，ｐｐ．２１６−２１８（１９９２）；Ｍａｔｕｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４５１−４５８（１ ９９２）；Ｓｏｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ． ２６８，ｐｐ．２２４８０−２２４８４（１９９３）；Ｓｏｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｖｏｌ．２１、ｐｐ． １３７−１４６（１９９３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１４１−１５７（１９９４）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅ ｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｖｏｌ．２９，ｐｐ．１−３７（１９９３）） 。研究者はまたどの残基が熱安定性のために重要であるかを研究してきており（ Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６４，ｐｐ ．１８９３３−１８９３８（１９８９）；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅ ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２２６，ｐｐ．２７７−２８３（１９９４ ））；そして１つのグループは、このような方法をバシルス リケニフォルミス のアミラーゼにおいて様々なヒスチジン残基に変異を導入するために利用し、そ の根拠は、他の同様のバシルスアミラーゼと比較して熱安定性であることが知ら れているバシルス リケニフォルミスアミラーゼは過剰のヒスチジンを有してお り、そして、それ故、ヒスチジンの置換は酵素の熱安定性に影響しうることが提 唱されているからである。この研究は、＋１３３位置でのヒスチジン残基および 位置 ＋２０９のアラニン残基での安定化変異の同定という結果となった（Ｄｅｃｌｅ ｒｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１ ５４８１−１５４８８（１９９０）；ＦＲ２ ６６５ １７８−Ａ１；Ｊｏｙｅ ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１５ ７９−１５８３（１９９２））。 従来技術において成された進歩にもかかわらず、現在の実状より低いｐＨでの 商業的液化を可能とする低ｐＨ値において十分効果的であるαアミラーゼに対す る需要が存在する。同様に、この分野では、ドライミルされた穀物の高温での液 化を可能とする方法に対する需要が存在する。さらに、この分野では、高価なカ ルシウムの添加に対する依存度が減少された、効果的なデンプン液化を可能とす る方法に対する需要が存在する。付加的には、効果的な糖化を確実とするため、 液化段階でのより完全なデンプンの加水分解を達成するためのより効果的な酵素 に対する需要が存在する。市販の酵素は多くの状況下で安定性の問題、例えば、 高アルカリ性および洗剤に関連した酸化剤（漂白剤）レベル等により受け入れ難 いので、そのような条件下での改変された、好ましくは増加された性能特性を有 するアミラーゼに対する需要がある。このように、増加された活性、熱安定性、 ｐＨ安定性、酸化安定性またはカルシウム安定性等の、野生型またはプレカーサ ー酵素と比較した酵素活性の改変、維持、または増加とともに成されうる改変さ れた性能特性が、好ましい。発明の概要 本発明の目的は、改変された性能特性、例えばｐＨ安定性、アルカリ安定性、 酸化安定性または酵素活性等を有するαアミラーゼを提供することである。 本発明のさらなる目的は、デンプン液化の間に、添加されたカルシウムイオン の不在下で増加された安定性を有するαアミラーゼを提供することである。 本発明のさらなる目的は、効率的な低ｐＨ液化において用いるための改変され たｐＨ安定性を有するαアミラーゼを提供することである。 本発明のまたさらなる目的は、ドライミルされた穀物の高温での効果的な液化 を可能とするαアミラーゼを提供することである。 本発明のなおもさらなる目的は、高ｐＨ環境または酸化剤または漂白剤の存在 下で有用であるαアミラーゼを提供することである。 本発明のなおもさらなる目的は、糖化の効率を増加させるための、デンプン分 子のより完全な加水分解を達成するαアミラーゼを提供することである。 本発明に従って、αアミラーゼをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物で あるαアミラーゼが提供され、そこにおいてその変異ＤＮＡ配列は、１またはそ れより多くの、αアミラーゼ残基の性能を改善する効果を有する残基の欠失また は置換によってプレカーサーαアミラーゼから派生されている。 好ましくは、欠失または置換された残基はアスパラギン残基であり、最も好ま しくは、バシルス リケニフォルミスにおけるＮ１８８に相当する位置のもので ある。αアミラーゼの熱安定性の改変が望まれている場合は、アスパラギンの置 換は、２０の天然に生じるアミノ酸の何れをも含む、他の何れのアミノ酸であっ てもよい。好ましくは、置換はバシルス リケニフォルミスにおけるＮ１８８Ｓ およびＮ１８８Ｔに相当する。また好ましくは、αアミラーゼはさらにメチオニ ンまたはトリプトファン残基の欠失または置換、特に、バシルス リケニフォル ミスにおけるＭ１５、Ｗ１３８、および／またはＭ１９７に相当する位置または Ｖ１２８、Ｈ１３３、Ｓ１８７および／またはＡ２０９に相当する残基での欠失 または置換を含んでいる。最も好ましい実施態様においては、αアミラーゼはバ シルス リケニフォルミスにおけるＭ１５Ｌ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｔ／Ｎ１ ８８Ｓに相当する残基での置換を含んで提供される。図面の簡単な説明 図１は、バシルス リケニフォルミスαアミラーゼ由来の、Ａｓｎ１８８の特 異的変異の際に有用な変異オリゴヌクレオチドをしめす。この、および続いての オリゴヌクレオチド構築物を示す図においては、太字はオリゴヌクレオチドによ って導入される塩基の変化を示し、下線はオリゴヌクレオチドによって導入され た制限エンドヌクレアーゼサイトを示す。 図２は、変異オリゴヌクレオチドテンプレートのＰＣＲ処理に用いられたＰＣ Ｒプライマーを示す。 図３は、バシルス リケニフォルミス（ＮＣＩＢ８０６１）由来のαアミラー ゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３３）および推定される翻訳産物のアミノ酸配 列（配列番号４１）をＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．６３５−６４３（１９８６）に記載されたように示し ている。 図４は、バシルス リケニフォルミス由来の成熟αアミラーゼ酵素のアミノ酸 配列（配列番号３４）を示す。 図５は、３つのバシルスαアミラーゼの１次構造のアライメントを示す。バシ ルス リケニフォルミスαアミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）（配列番号３５）はＧ ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ ．６３５−６４３（１９８６）によって記載されている；バシルス アミロリケ ファシエンスのαアミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）（配列番号３６）は、Ｔａｋ ｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５８，ｐｐ ．１００７−１０１３（１９８３）によって記載されている；そしてバシルス ステアロサーモフィラスαアミラーゼ（Ａｍ−Ｓｔｅａｒｏ）（配列番号３７） はＩｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．９８，ｐｐ．９５ −１０３（１９８５）によって記載されている。 図６はプラスミドｐＨＰ１３を示しているが、そこにおいてＣｍ^Rとはクロラ ムフェニコール耐性を意味し、Ｅｍ^Rとはエリスロマイシン耐性を意味し、Ｒｅ ｐ ｐＴＡ１０６０とはプラスミドｐＴＡ１０６０からの複製開始点を意味する 。 図７はｐＢＬａｐｒプラスミドを示すが、そこにおいてＢＬＡＡとはバシルス リケニフォルミスαアミラーゼ遺伝子を意味し、ａｐｒＥとはａｐｒＥ遺伝子 のプロモーターおよびシグナルペプチドをコードしている領域を意味し、Ａｍｐ ＲとはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を意味し、ＣＡＴとはｐＣ１ ９４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を意味する。 図８はバシルス リケニフォルミスαアミラーゼの遺伝子を担持するｐＨＰ ．ＢＬプラスミドを示す。 図９はバシルス リケニフォルミスから派生されたαアミラーゼに対応する変 異オリゴヌクレオチドを生産するために用いられたＰＣＲ法の図を示す。 図１０は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、１０７℃、６ ０ｐｐｍカルシウム、ｐＨを変化させたデンプン液化において野生型バシルス リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフを 示す。 図１１は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、１０７℃、ｐ Ｈ６．０、カルシウム濃度を変化させたデンプン液化において野生型バシルス リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフを 示す。 図１２は、本発明に従った変異体酵素Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを、ｐＨ６．０、 ６０ｐｐｍカルシウム、温度を変化させたデンプン液化において野生型バシルス リケニフォルミスαアミラーゼと比較した静力学的研究から派生されたグラフ を示す。 図１３は、バシルス リケニフォルミス（配列番号３８）、バシルス スブチ リスａｐｒＥ（配列番号３９）およびｐＢＬａｐｒ中のバシルス リケニフォル ミス（配列番号４０）から派生されたαアミラーゼ中のシグナル配列−成熟タン パク質結合点を示す。詳細な説明 「αアミラーゼ」とは、α（１、４）グリコシド結合で、例えばデンプン、ア ミロペクチンまたはアミロースポリマー中のものを分解すなわち加水分解する酵 素的活性を意味する。ここで用いられるαアミラーゼには、天然に生産されるα アミラーゼ並びに組換体または変異体アミラーゼが含まれる。本発明において好 ましいアミラーゼは、バシルス、特にバシルス リケニフォルミス、バシルス アミロリケファシエンス、またはバシルス ステアロサーモフィラスから派生さ れたもの、およびアスペルギルス（すなわちＡ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｎｉｇ ｅｒ）等から派生された菌類αアミラーゼである。 「組換えαアミラーゼ」とは、αアミラーゼであって、そこにおいて天然αア ミラーゼをコードしているＤＮＡ配列が、αアミラーゼ配列中に天然αアミラー ゼと比較しての１またはそれより多くの置換、挿入、欠失をコードしている変異 体ＤＮＡ配列を生産するために改変されているものを意味する。 「発現ベクター」とは、ＤＮＡ構築物であって、適当な宿主中での前記ＤＮＡ の発現を実行することができる適当な制御配列に連結されたＤＮＡ配列を有する ものである。このような制御配列には、転写を行うためのプロモーター、そのよ うな転写を制御するための付加的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソー ム結合サイトをコードしている配列および転写および翻訳の終結を制御する配列 が含まれてもよい。好ましいプロモーターはバシルス スブチリスａｐｒＥプロ モーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノ ムインサートである。一旦適当な宿主に形質転換されると、ベクターは複製され 宿主のゲノムと独立に機能しても良く、また、いくつかの場合には、ゲノムそれ 自体の中に組み込まれても良い。本明細書では、プラスミドおよびベクターはし ばしば相互交換可能に用いられるが、それはプラスミドは現在最も良く用いられ ているベクターの型であるからである。しかしながら、本発明は、相当の機能を 果たし当業者に知られているような他の発現ベクターの型を含むように意図され ている。 「宿主菌株」または「宿主細胞」とは、本発明に従ったαアミラーゼをコード しているＤＮＡを含む発現ベクターの好適な宿主を意味する。本発明において有 用な宿主細胞は、一般に原核または真核宿主であり、本発明に従ったαアミラー ゼの発現がそこにおいて成されうる何れの形質転換可能な細胞をも含む。特に、 αアミラーゼが派生された種または属と同じ宿主菌株、例えばバシルス株が適切 である。好ましくは、αアミラーゼ陰性バシルス株（遺伝子欠失）および／また はαアミラーゼおよびプロテアーゼ欠失バシルス株（ΔａｍｙＥ、Δａｐｒ、Δ ｎｐｒ）が用いられる。宿主細胞は、組換え遺伝子技術を用いて構築されたベク ターで形質転換または移入される。そのような形質転換された宿主細胞は、αア ミラーゼまたはその派生体（変異体）をコードしているベクターを複製すること 、または所望のαアミラーゼの発現させることができる。 「液化」または「液化する」とは、それによりデンプンが短鎖長でより低粘度 のデキストリンに変換される工程を意味する。一般にこの工程はαアミラーゼの 添加と同時かまたはそれに続いてαアミラーゼの添加を行う、デンプンのゼラチ ン化に関する。 本発明に従っては、αアミラーゼが提供されているが、それはαアミラーゼを コードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物であり、変異ＤＮＡ配列はプレカーサ ーαアミラーゼから１またはそれより多くのアスパラギン残基の欠失または置換 によって派生されたものである。また提供されているのは、本発明により提供さ れたαアミラーゼの少なくとも１部を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分 子（ＤＮＡ）、ファージやベクターを含むそのようなＤＮＡを取り込んだ発現シ ステム、そのようなＤＮＡで形質転換された宿主細胞、およびアミノ酸配列をコ ードしているＤＮＡ分子に対応しているＤＮＡのアンチセンス鎖である。同様に 、本発明には、宿主細胞中に形質転換された発現システム中に取り込まれている ＤＮＡを発現させることによるαアミラーゼの生産のための方法が含まれる。本 発明のαアミラーゼはデンプンの液化において、洗剤の成分として、食品加工に おいて、織物処理において、またはαアミラーゼ活性が有用である何れの他の用 途において用いられても良い。 本発明に従ったαアミラーゼはプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列から 派生されたアミノ酸配列を含む。プレカーサーαアミラーゼには、天然αアミラ ーゼおよび組換えαアミラーゼが含まれる。αアミラーゼ変異体のアミノ酸配列 は、プレカーサーαアミラーゼアミノ酸配列から、プレカーサーアミノ酸配列の １またはそれより多くのアミノ酸を置換、欠失または挿入することにより派生さ れている。このような改変は一般に、プレカーサーαアミラーゼ酵素それ自身の 操作というよりはむしろ、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列をコードし ているプレカーサーＤＮＡ配列のものである。そのようなプレカーサーＤＮＡ配 列の操作のために好適な方法には、ここにおいて、またここに参考文献として取 り込まれている共通して所有されている米国特許第４７６００２５号、第５１８ ５２５８号に開示されている方法が含まれる。 本発明に従ったαアミラーゼは、プレカーサーアミラーゼから派生される。プ レカーサーαアミラーゼは、αアミラーゼを生産可能な何れの給源によって生産 されても良い。好適なαアミラーゼの給源は、原核または真核生物であり、菌類 、細菌、植物または動物を含む。好ましくは、プレカーサーαアミラーゼはバシ ルスによって；より好ましくはバシルス リケニフォルミス、バシルス アミロ リケファシエンスまたはバシルス ステアロサーモフィラスによって生産されて おり；最も好ましくは、プレカーサーαアミラーゼはバシルス リケニフォルミ ス から派生されている。 これまでに配列決定されたほとんど全ての、植物、哺乳類および細菌の範囲に あるエンドアミラーゼの間においてホモロジーが発見されている（Ｎａｋａｊｉ ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３５５−３６０（１９８６）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．１２８，ｐｐ．４７ ０−４７６（１９８５）；Ｊａｎｅｃｅｋ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏ ｌ．２２４，ｐｐ．５１９−５２４（１９９４））。あるバシルスアミラーゼに は、図５に示されるように、特に高いホモロジーを有する４つの領域が存在する が、そこにおいて下線が引かれた部分が高ホモロジー領域を示している。配列ア ライメントもまた、バシルス エンドアミラーゼの間の関係をマップするために 用いられた（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ．，ｖｏｌ． ３５，ｐｐ．３５１−３６０（１９８７））。バシルス ステアロサーモフィラ スとバシルス リケニフォルミスのアミラーゼの間の相対的配列ホモロジーは約 ６６％であり、バシルス リケニフォルミスとバシルス アミロリケファシエン スのアミラーゼの間では約８１％であると、Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ ｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐｐ．１８１−１９ １（１９９０）によって決定された。配列ホモロジーも重要である一方、アミラ ーゼまたは他の酵素を比較することにおいて、構造的ホモロジーが重要であるこ とが一般に認識されている。例えば、菌類アミラーゼと細菌アミラーゼとの間の 構造的ホモロジーが示唆され、そしてそれ故に、菌類アミラーゼが本発明の範囲 に含められている。 中でも、αアミラーゼ中のアスパラギン残基に相当する残基がここにおいて欠 失または置換のために同定されている。このように、Ｎ１８８等の特定の残基が アミノ酸位置の番号（すなわち＋１８８）を意味しているが、それは図４に示さ れている成熟バシルス リケニフォルミスαアミラーゼ配列に割り当てられた番 号を参照している。しかしながら、本発明は、バシルス リケニフォルミスの特 定の成熟αアミラーゼの変異に限定されるものではなく、バシルス リケニフォ ルミス αアミラーゼにおいて特に同定された残基に相当する位置のアミノ酸残 基を含むプレカーサーαアミラーゼにも拡張している。プレカーサーαアミラー ゼの残基は、もしそれがバシルス リケニフォルミスαアミラーゼの特定の残基 またはその残基の部分に相同（すなわち１次または３次構造の何れかで相当する 位置にある）または類似（すなわち化学的または構造的に結合、反応または相互 作用するための同じまたは同様の能力を有している）である場合には、バシルス リケニフォルミス αアミラーゼの残基に相当するものである。 １次構造においてホモロジーを達成するために、プレカーサーαアミラーゼの アミノ酸配列は直接、バシルス リケニフォルミスαアミラーゼの１次構造、お よび配列の知られている全てのαアミラーゼにおいて不変であることが知られて いる特定の残基のセットと比較される（例えば図７を参照されたい）。ブタ膵臓 αアミラーゼについて報告されている結晶構造の３次分析により相当する残基を 決定することもまた可能である（Ｂｕｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．３９０９−３９１６（１９８７）；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．６２８４− ６２９４（１９９４）；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ．２３５，ｐｐ．１５６０−１５８４（１９９４）；アスペルギルス オ リゼ由来のタカアミラーゼＡ（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６９７−７０２（１９８４））お よびＡ．ニガー由来の酸性αアミラーゼ（Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２９，ｐｐ．６２４４−６２４９（１９９０））は、 前の２つの構造が類似であり、大麦αアミラーゼに関連している（Ｖａｌｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２３６，ｐｐ．３６８−３７ １（１９９４）；Ｋａｄｚｉｏｌａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２３９， ｐｐ．１０４−１２１（１９９４））。刊行された予備的な研究があるが（Ｓｕ ｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．３７ ９−３８１（１９９０）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｖｏｌ．２９１，ｐｐ．２５５−２５７（１９９１）；Ｃｈａ ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２９，ｐｐ．２３５ −２３８（１９９３）；Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ， ｖｏｌ．２３４，ｐｐ．１２８２−１２８３（１９９３））、バシルス リケニ フォルミスαアミラーゼについては１つの刊行された構造があるのみである（Ｍ ａｃｈｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２４６，ｐｐ ．５４５−５４９（１９９５））。しかしながら、数人の研究者が、グルカナー ゼの間（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖｏｌ． ２５９，ｐｐ，１４５−１５２（１９８９））およびαアミラーゼおよび他のデ ンプン代謝酵素の内で（Ｊａｓｐｅｒｓｅｎ．Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ ．１２，ｐｐ．７９１−８０５（１９９３）；ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｓｔａｒｋ ｅ，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２３２−２３７（１９９３））共通の超２次構造、お よび酵素の間のαアミラーゼに類似の超２次構造とともに配列の類似性を予言し ている（Ｊａｎｅｃｋ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３１６，ｐｐ．２ ３ー２６（１９９３）；Ｊａｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．５０９ー５１４（１９９３））。バシルス ステアロ サーモフィラスの酵素の構造は、タカアミラーゼＡのそれをモデルとしている（ Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ． ３，ｐｐ．１８１−１９１（１９９０））。図７に示された４つの高度に保存さ れた領域は活性中心の部分と考えられている多くの残基を含んでおり（Ｍａｔｓ ｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），ｖｏｌ．９５ ，ｐｐ．６９７−７０２（１９８４）；Ｂｕｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢ Ｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．３９０９−３９１６（１９８７）；Ｖ ｉｈｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．２ ６７−２７２（１９９０））、それにはバシルス リケニフォルミスシステムの 下でのＨｉｓ＋１０５、Ａｒｇ＋２２９、Ａｓｐ＋２３１、Ｈｉｓ＋２３５、Ｇ ｌｕ＋２６１およびＡｓｐ＋３２８が含まれている。 好ましくは、欠失または置換されるアスパラギン残基はバシルス リケニフォ ルミスにおけるＮ１８８に相当する位置にある。αアミラーゼの熱安定性の改変 が望まれている場合は、アスパラギン置換は、２０の天然アミノ酸の何れをも含 む他の何れのアミノ酸でも良い。好ましくは、欠失または置換は、バシルス リ ケニフォルミスにおけるＮ１８８ＴまたはＮ１８８Ｓに相当する。また好ましく は、αアミラーゼはさらにメチオニンまたはトリプトファン残基の欠失または置 換を含んでいる。 本発明に従ったαアミラーゼは、αアミラーゼが通常用いられている用途での 使用において有用である改変された性能特性を提供する望ましく予想外の結果を 示した。例えば、本発明に従った、低ｐＨで改変された性能特性を示し、改善さ れた熱安定性、改善されたｐＨ安定性、および／または改善された酸化剤安定性 を含むαアミラーゼは、低ｐＨデンプン液化において有用である。促進された熱 安定性は、それらを取り込んだ製品の貯蔵寿命の延長に有用である。促進された 酸化安定性または改善された性能は洗浄製品において、特に、漂白剤、過ホウ酸 、過炭酸、またはそのような洗浄製品において用いられている過酸の存在下での αアミラーゼの貯蔵寿命を延長するために望ましい。これに対して、減少された 熱安定性または酸化剤安定性は、アミロース分解活性の迅速で完全な消失が要求 される産業工程において有用であろう。 本発明のαアミラーゼは、特にデンプン処理、および特にデンプン液化におい て有用である。商業的に好ましい液化工程の間に存在する条件は、特徴的に、α アミラーゼに改善された低ｐＨ性能、改善された熱安定性、および改善された酸 化剤安定性を示すことを要求する、低ｐＨおよび高温および潜在的酸化条件を含 んでいる。従って、本発明に従った、液化において特に有用であるαアミラーゼ は、約６未満、好ましくは約５．５未満、最も好ましくは約５．０と５．５との 間でのｐＨで改善された性能を示す。付加的には、本発明に従ったαアミラーゼ は、約８０−１２０℃、好ましくは約１００−１１０℃の間の温度での増加され た熱安定性、および酸化剤の存在下での増加された安定性を示すもので特に有用 である。好ましくは、液化において用いられる本発明に従ったαアミラーゼは、 アスパラギンの欠失または置換に加えて、さらに、バシルス リケニフォルミス においてのＭ１５、Ｖ１２８、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｓ１８７、Ｍ１９７および ／またはＡ２０９に相当する１またはそれより多くの残基の欠失または置換を含 む。より好ましい実施態様においては、デンプン液化において用いられる本発明 のαアミラーゼは、位置Ｎ１８８に相当する欠失または置換を有する。最も好ま しくは、アミラーゼはバシルス リケニフォルミスにおいてのＭ１５Ｔ／Ｎ１８ ８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／ Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ １５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８ ８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３ＹまたはＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖに相当す る置換を有している。 液化において有用であることが当業者に知られている、例えば、抗酸化剤、カ ルシウム、イオン、塩、またはエンドグリコシダーゼ、セルラーゼ、プロテアー ゼ、リパーゼまたは他のアミラーゼ酵素等その他の酵素を含む付加的な成分が、 意図されている反応条件に応じて加えられても良い。例えば、本発明に従ったα アミラーゼと別の給源からのαアミラーゼを組み合わせることにより、特定の液 化条件下での特定の利用を見いだした独特の作用特性を提供しうる。特に、本発 明のαアミラーゼとバシルス ステアロサーモフィラス由来のαアミラーゼの組 合せは、５．５より下のｐＨ値で、相補的な作用パターンによる促進された液化 を提供するであろうことが熟慮された。工程がドライミルされたデンプンのエタ ノール製品への液化に関与しているところの好ましい実施態様においては、バシ ルス ステアロサーモフィラス由来のαアミラーゼと、バシルス リケニフォル ミスにおいてのＭ１５Ｔ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓに相当する置 換を有する本発明に従ったαアミラーゼを含む。 液化の間、デンプン、特にウェットミルまたはドライミルの何れかの工程由来 の微粒子デンプンスラリーは本発明のαアミラーゼによって公知の液化技術に従 って処理される。一般に、デンプン分解工程の第１の段階において、デンプンス ラリーは比較的高い温度（約８０℃から約１１０℃の間）で加熱されることによ りゼラチン化される。デンプンスラリーがゼラチン化された後、αアミラーゼを 用いて液化される。 本発明の別の態様においては、液体、ゲル、または粒状の型で本発明に従った αアミラーゼを含む洗剤組成物が提供されている。そのような洗剤組成物は、貯 蔵寿命を改善するための増加された熱安定性、または、αアミラーゼが洗剤中に 通常存在する漂白剤または過酸化合物に対する改善された耐性を有するような増 加された酸化剤安定を有するところの本発明に従ったαアミラーゼの添加により 、 特に利益があるであろう。このように、本発明に従ったαアミラーゼは、公知の 粉末化、液体またはゲル洗剤で約６．５から約１２．０の間のｐＨを有するもの に有効に配合されうる。本発明の好ましい実施態様はさらに、例えばＭ１５、Ｍ １９７またはＷ１３８等の、それらの開示が参考文献として取り込まれている、 共通して割り当てられている米国特許出願番号第０８／２８９３５１号および第 ０８／４０９７７１号に記載されているメチオニン残基またはトリプトファン残 基の欠失または置換；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／００３５３に記載されているような Ｍ１３３Ｙでの置換；またはＤｅＣｌｅｒｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１５４８１−１５４８８（１９９０）に記載 されているＡ２０９での置換を含む。また好ましくは、洗剤組成物中で用いられ る本発明に従ったαアミラーゼは、位置Ｎ１８８での欠失または置換を有してい る。本発明に従ったαアミラーゼを含む洗剤組成物はさらに、例えばエンドグリ コシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、またはその他の酵素、特に バシルス ステアロサーモフィラスから派生されたαアミラーゼ等の他の酵素を 、分野で一般に知られている付加的な成分と同様に含んでいても良い。 本発明のαアミラーゼとプロテアーゼ酵素との組合せを含む本発明の実施態様 は、好ましくは、ここに参考文献として取り込まれている米国Ｒｅ．３４６０６ に記載されている酸化安定性プロテアーゼを、ＤＵＲＡＺＹＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏ ｒｄｉｓｋ）、ＭＡＸＡＰＥＭ（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ）およびＰＵＲＡ ＦＥＣＴ（登録商標）ＯｘＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ，Ｉｎｃ．）と同様に含んでいる。そのようなプロテアーゼ変異体（酸化安定性 プロテアーゼ）、および、特にバシルス アミロリケニフォルミス中のＭ２２２ に相当する位置のメチオニンの置換を有するような変異体の生産方法は、米国Ｒ ｅ．３４６０６に記載されている。 本発明の付加的な実施態様は、本発明に従ったαアミラーゼをコードしている ＤＮＡおよびそのようなＤＮＡを含む発現ベクターを含む。ＤＮＡ配列は、それ らを、操作可能であるように発現ベクター中の発現制御配列に連結し、その発現 ベクターを公知の技術に従って適当な宿主を形質転換するために用いることによ り発現されてもよい。幅広く多様な宿主／発現ベクターの組合せが、本発明のＤ ＮＡ配列の発現において用いられる。有用な発現ベクターには、例えば、染色体 、非染色体、および合成ＤＮＡ配列の部分、例えばこの目的のために有用なたく さんの公知のプラスミドおよびファージ等が含まれる。さらに、多様な発現制御 配列の何れもが、一般にこれらのベクター中で用いられる。例えば、出願人はバ シルス形質転換体のために好適な発現制御配列は、バシルス スブチリスから派 生されたａｐｒＥシグナルペプチドであることを見いだした。 多様な宿主細胞がまた、本発明のＤＮＡ配列の発現において有用である。これ らの宿主には、良く知られた真核および原核宿主、例えばＥ．コリの株、シュー ドモナス、バシルス、ストレプトコッカス、多様な菌類、酵母および動物細胞等 が含まれ得る。好ましくは宿主は、本発明のαアミラーゼを細胞外に発現し、精 製および下流工程を達成する。本発明のαアミラーゼの発現および精製は、その ような工程を実行するための分野で認識された手段を通して実施される。 本発明に従った改善されたαアミラーゼは、野生型バシルスαアミラーゼと比 較された場合にいくつかの重要な利点を提供する。例えば、１つの利点は、通常 のデンプン液化方法に典型的である低ｐＨおよび高温度で見られた増加された活 性である。別の利点は増加されたｐＨおよび酸化安定性でそれらを洗剤中で使用 可能とするものである。別の利点はより完全なデンプン分子の加水分解がなされ 、それにより工程の流れにおいて残存デンプンを減少させることである。さらに 別の利点は、カルシウムイオンの不在下でのそれらの改善された安定性である。 さらに別の利点は、本発明のαアミラーゼの同じタンパク質量の添加が、野生型 バシルス リケニフォルミスαアミラーゼと比較して、比活性および過酷な条件 下での安定性の両方の改善により、よりすぐれた性能を提供することである。換 言すると、本発明に従ったアミラーゼの一般に改善された安定性のため、本発明 の酵素の増加されたデンプンに対する比活性は、この変異体のより多くの潜在的 性能の利益とさえ解釈される。野生型酵素が不活性化される条件下において、本 発明の酵素のより多くはその増加された安定性により生き残るだけでなく、生き 残ったものはその増加された比活性により、比例してより多くの活性を示す。 以下は、例として示されており、クレームの範囲の限定として解釈されるもの ではない。ここで用いられている略語、特に３文字または１文字のアミノ酸表記 はＤａｌｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔ ｅｒｉａ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９８９），Ａｐｐｅｎ ｄｉｘ Ｂに記載されている。実施例 実施例１ プラスミドｐＨＰ．ＢＬの構築 図３に示されているαアミラーゼ遺伝子はバシルス リケニフォルミスＮＣＩ Ｂ８０６１ｌからクローン化された（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．６３５−６４３（１９８６））。１． ７２ｋｂの、シグナル配列の最後の３つの残基、成熟タンパク質の全体およびタ ーミネーター領域をコードしているＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ１８ 中にサブクローン化した。以下の型で、バシルス アミロリケファシエンス ス ブチリシン転写ターミネーターを含むように設計された合成オリゴヌクレオチド カセットを用いてＢｃｌＩおよびＳｓｔＩサイトの間に合成ターミネーターを付 加した（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．７９１１−７９２５（１９８３））。 ｐＢＬａｐｒプラスミドは、バシルス リケニフォルミスαアミラーゼを担持 して構築された。図７に示されている通り、ｐＢＬａｐｒは、約６．１ｋｂのプ ラスミドで、ｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子およびｐＣ１９４から のクロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｐｒＥプロモーターおよびバシルス リ ケニフォルミスαアミラーゼ（「ＢＬＡＡ」）をコードしている遺伝子を含んで いる。ａｐｒＥプロモーターは、バシルス スブチリスのアルカリプロテアーゼ のプロモーターおよびシグナル配列をコードしている６６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩ Ｉ−ＰｓｔＩ断片から構築された。ＰｓｔＩサイトは除去され、ＳｆｉＩサイト をａｐｒ／ＢＬ接合部付近に付加した。ＢＬＡＡ遺伝子は、上記のように、１７ ２０ｂｐのＰＳｔＩ−ＳｓｔＩ断片から成る。ここに記載された仕事において、 ｐＢＬａｐｒは、成熟アミラーゼ遺伝子のコード配列の開始部分の５’末端に隣 接したＳｆｉＩサイトとともに構築された。特に、ｐＢＬａｐｒ構築物の５’末 端は、ｐＢＬａｐｒからＭ１３ＢＭ２０（Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）中に、ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片上にサブクローン化され、以下の変 異性オリゴヌクレオチドのためのコード鎖テンプレートが得られた。 このプライマーは、この唯一の制限サイトの存在によって正しい型が検索され ることを可能とする１つのＳｆｉＩサイト（下線によって表示）を導入した。Ｅ ｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片をｐＢＬａｐｒベクターに逆にサブクローン化するこ とにより、ＳｆｉＩサイトを有するプラスミドのバーションが得られた。 プラスミドｐＨＰ１３（Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ ｅｔ．，ｖｏｌ．２０９，ｐｐ．３３５−３４２（１９８７））（図６）を制限 酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しその結果得られたベクターをポリ アクリルアミドゲル上で精製し、続いて溶出した。プラスミドｐＢＬａｐｒはＨ ｉｎｄＩＩＩ、Ａｓｐ７１８で消化され、別のＡｓｐ７１８、ＥｃｏＲＩとの保 温において、ゲル精製された。２つのバンド、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８（ １２０３ｂｐ）およびＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ（１２５３ｂｐ）がゲル精製さ れ、ゲルから溶出させ、３通りのライゲーションによりベクター中に連結され、 プラスミドｐＨＰ．ＢＬを得たが、このプラスミドはαアミラーゼの発現におい て用いられた（図８）。実施例２ アスパラギン１８８の置換を有しているαアミラーゼをコードしているプラスミ ドの構築 一連のＡｓｎ１８８（「Ｎ１８８」）の天然アミノ酸のそれぞれでの置換をコ ードしている変異性プライマーが合成され、図１に示されている（配列番号４− ２２）。これらの変化を有するαアミラーゼ遺伝子はＰＣＲにより、図９にまと められた手順に従って図２に示されたＰＣＲプライマー（配列番号２３−３２） を用いて生成された。 段階（１）： 変異性プライマーはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ Ａ＋およびＰ ＣＲ Ｂ−のテンプレートとして用いられ、延長された（６１ｐｂ）二本鎖ＤＮ Ａが得られた。各々は異なった位置１８８でのアミノ酸置換を有しており、Ｎ１ ８８Ｍ以外の全ては異なった制限サイトを含んでいた。最初にＰＣＲプライマー は３５℃で５分間アニーリングされ、続いて１分間のｔａｃポリメラーゼによる ７５℃でのＤＮＡ伸長を行った。二本鎖ＤＮＡは続いて９５℃で１分間融解され 、アニーリングと伸長段階を続いて行った。融解、アニーリングおよび伸長は全 体で３０サイクル続けられた。 段階（２）： 位置１８８の上流および下流のＤＮＡが別のＰＣＲ反応で作成 された。テンプレートはｐＢＬａｐｒであり、ＰＣＲプライマーは、ＬＡＡｆｓ ５（配列番号２７）およびＰＣＲ Ａ−（配列番号２４）が上流用；およびＰＣ Ｒ Ｂ＋（配列番号２５）およびＰＣＲ Ｃｌａ−ＳａｌＩ（配列番号２８）が 下流ＤＮＡ用であった。ＤＮＡは９５℃で１分間融解され、４５℃で３分間アニ ーリングされ、６８℃で３分間伸長された。上流部分は２９０ｂｐで、下流部分 は４９８ｂｐであった。この手順はｐｆｕポリメラーゼを用いて１８サイクル繰 り返された。同じＰＣＲ手順が段階（３）および（４）において用いられた。 段階（３）： 段階（２）で記載されている上流部分のＤＮＡを段階（１）で 記載された二本鎖変異性プライマーに取り付けた。プライマーＬＡＡｆｓ５（配 列番号２７）およびＰＣＲ Ｂ−（配列番号２６）が用いられた。プライマー設 計の結果として、ＤＮＡの２つの断片の取り付けを可能とする、これらの配列の 間の２４ｂｐのオーバーラップがある。 段階（４）： 段階（２）で記載された下流部分のＤＮＡおよび段階（３）の 生成物が取り付けられ、最終生成物を得た。２つのＰＣＲ生産物の間の２４ｂｐ のオーバーラップが取り付けを可能としている。用いられたプライマーはＬＡＡ ｆｓ５（配列番号２７）およびＰＣＲ ＣｌａＩ−ＳａｌＩ（配列番号２８）。 段階（５）： １８８サイトの上流および下流に固有の制限サイトＡｓｐ７１ ８およびＢｓｓＨＩＩがそれぞれ位置している。最終ＰＣＲ産物はＡｓｐ７１８ およびＢｓｓＨＩＩで消化され、３３３ｂｐ断片をポリアクリルアミドゲル電気 泳動により単離し、ｐＨＰ．ＢＬベクター中にサブクローン化し、ｐＨＰ．Ｎ１ ８８Ｘを得た。 変異はジデオキシ配列決定により確認した（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．７４，ｐｐ．５ ４６３−５４６７（１９７７））。 図３で用いられたＤＮＡ配列およびナンバリングシステムを参照すると、＋１ ８８のアミノ酸位置をコードしているコドンは塩基対８１２−８１４である。Ｐ ＣＲプライマーＡ＋およびＡ−は塩基対７８４−８０７に相当する。ＰＣＲプラ イマーＢ＋およびＢ−は、塩基対８２１−８４４に相当する。ＰＣＲプライマー ＬＡＡｆｓ５の５’末端は塩基対５１８に相当する。ＰＣＲプライマーＰＣＲＣ ｌａＩ−ＳａｌＩの５’末端は塩基対１３１７に相当する。Ａｓｐ７１８サイト は塩基対７２４に相当する。ＢｓｓＨＩＩサイトは塩基対１０５３に相当する。実施例３ Ｍ１５およびＮ１８８での変異をコードしているプラスミドの構築 アミノ酸１５のメチオニンを置換したスレオニンを有するｐＢＬａｐｒプラス ミドを、米国特許出願第０８／１９４６６４号（ＰＣＴ公報第９４／１８３１４ 号）に従って構築した。このプラスミド（ｐＢＬａｐｒＭ１５Ｔ）をＳｆｉＩお よびＡｓｐ７１８で消化し、４７７塩基対の断片をｐＨＰ．ＢＬ中にサブクロー ン化し、ｐＨＰ．Ｍ１５Ｔを作成した。上記の実施例１と類似した方法により、 ｐＨＰ．Ｍ１５ＴをＡｓｐ７１８およびＢｓｓＨＩＩにより消化しゲル精製し、 ゲルから溶出させた。Ａｓｐ７１８からＢｓｓＨＩＩＮおよびｐＨＰ．Ｎ１８８ Ｓ由来の断片を含む３３３塩基対の断片をｐＨＰ．Ｍ１５Ｔ中にサブクローン化 し、プラスミドｐＨＰ．Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓを得た。同様の方法により、プラ スミドｐＢＬａｐｒＭ１５ＬおよびｐＨＰ．Ｎ１８８Ｙから始め、プラスミドｐ ＨＰ．Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙが構築された。実施例４ バシルス スブチリスの形質転換、変異体αアミラーゼの発現および精製 αアミラーゼは、バシルス スブチリス中で、実施例１−３に記載されたプラ スミドにより形質転換された後に発現された。ｐＨＰ１３は、Ｅ．コリ中および バシルス スブチリス中で複製されうるプラスミドである。異なった変異体を含 むプラスミドがＥ．コリＭＭ１８４株を用いて構築され、プラスミドを単離し、 Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｉ ．８１，ｐｐ．７４１−７４６（１９６１）に記載されているようにバシルス スブチリス中に形質転換した。バシルス株は２つのプロテアーゼ（Δａｐｒ、Δ ｎｐｒ）（例えばＦｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５２６４３６６号 を参照）および１つのアミラーゼ（ΔａｍｙＥ）（例えばＳｔａｈｌ ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．，ｖｏｌ．１５８，ｐｐ．４１１−４１８（１９８４ ）を参照）が欠失されている。Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｙを発現するバシルス株は、 １％不溶性デンプンを含む寒天プレート上で、Ｍ１５Ｌを発現する株よりも大き なクリアーゾーン形成を示し、増加されたデンプン加水分解活性を示唆していた 。形質転換後、ｓａｃＵ（Ｈｙ）変異（Ｈｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａ ｃｔｅｒ．，ｖｏｌ．１７０，ｐｐ．２９６−３００（１９８８））がＰＢＳ− １を介した移入（Ｈｏｃｈ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．１５１３ −１５１５（１９８３））により導入された。 分泌されたアミラーゼは所定の手順でバシルス スブチリスの培養から以下の ように回収された：培養上清は、硫酸アンモニウムで２０％飽和に調整し、４℃ で１時間撹拌した。遠心分離の後、その結果得られた上清を硫酸アンモニウムで ７０％飽和に調整し、４℃で１時間撹拌した。上清の遠心分離の後、その結果得 られた沈殿を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５ｍＭ塩化カルシウムに再 懸濁し、滅菌濾過した。実施例５ αアミラーゼ活性の決定のためのアッセイ 可溶性基質アッセイ：比率アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ａｕｓｔ．）Ｐｔ ｙ．Ｌｔｄ．によって供給されている終点アッセイキットを基にして発展させた 。基質のバイアル（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、ＢＰＮＰＧ７）を １０ｍｌの滅菌水に溶解させ、続いてアッセイバッファー（５０ｍＭリンゴ酸バ ッファー、ｐＨ６．７、５ｍＭ塩化カルシウム、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０） 中で１：４に希釈した。アッセイは、１０μｌのアミラーゼを７９０μｌのキュ ベット中の基質に２５℃で添加することにより行った。加水分解の比率は７５秒 後の４１０ｎｍの吸光度の変化の比率として測定された。アッセイは０．２吸光 単 位／分まで直線的であった。 αアミラーゼタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，ｖｏｌ．７２，ｐ．２４８（１９７６）に基づきウシ血清アルブミン標準 を用いる標準的なＢｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）により測定した。 デンプン加水分解アッセイ：デンプンに対するαアミラーゼ活性は、デンプン か沃素と青色の複合体を形成する能力、およびデンプンが短鎖長デキストリン分 子に加水分解された場合にこの色が消失することに基づいたアッセイを通して決 定した。αアミラーゼの活性は、デンプンの完全なデキストリン化を表す色変化 を生じさせるために要した消化時間の観点から定義された。 使用された試薬は以下の通りである： リン酸バッファー−リン酸二水素カリウム（３４０ｇ）および水酸化ナトリウ ム（２５．３ｇ）を水に溶解させ２ｌまで希釈した。バッファーを続いて室温ま で冷却しｐＨを６．２±０．１に調整した。バッファーは２ｌまで定量フラスコ 中で希釈した。 デンプン基質−１０グラム（乾燥基質）の可溶性リントナー（ｌｉｎｔｎｅｒ ）デンプンを５０ｍｌの水に懸濁し、〜３００ｍｌの沸騰水中で洗浄した。懸濁 液を再び沸点にし、恒常的に撹拌しながら５分間沸騰させた。デンプン溶液を恒 常的に撹拌しながら室温まで冷却し、１２５ｍｌのリン酸バッファーを添加した 。溶液は５００ｍｌまで水で希釈された。デンプン基質は毎日新鮮なものを調製 した。 ストック沃素溶液−沃素結晶（５．５ｇ）および沃化カリウム（１１．０ｇ） を水中に溶解させ、定量的に２５０ｍｌまで希釈した。溶液は光をさけて保存さ れた。 希釈沃素溶液−沃化カリウム（２０ｇ）および２ｍｌのストック沃素溶液を水 中に溶解させ、定量的に５００ｍｌまで希釈した。この溶液は毎日新鮮に調製さ れた。 酵素希釈溶液−塩化カルシウム（１１．１ｇ）を４ｌの水に溶解させた。全て の試薬に用いられた水は蒸留または脱塩されていた。 活性が決定されるべきαアミラーゼ試料は、酵素希釈溶液により１０−１５Ｌ Ｕ／ｍｌ（後に定義）の間に希釈された。多くの商業用αアミラーゼ調製物につ いて、好ましい希釈は２０００倍と見いだされた。５ｍｌの希釈沃素溶液のアリ コートを、１３ｘ１００ｍｍ試験管に調合し、１０ｍｌのデンプン基質を２３ｘ ２００ｍｍ試験管に置いた。全ての試験管は３０℃のウォーターバス中に置いた 。特別のαアミラーゼ色ディスク（カタログ番号６２０−ｓ５）を装備したＨｅ ｌｌｉｇｅ比較器が、リーディングを行うために用いられた。５ｍｌの希釈酵素 （同様に３０℃）がデンプン基質と混合され、計時が開始された。適当な時間間 隔、例えば反応の初期には１分間隔で、反応の後期には１５秒間隔で、１ｍｌの 酵素−基質混合物のアリコートを、温度調節された希釈沃素溶液を含む試験管に 移した。デンプン−沃素溶液は混合され、１３ｍｍの精密正方形チューブに移さ れ、Ｈｅｌｌｉｇｅ比較器において標準αアミラーゼ色ディスクと色を比較され た。終了点が近づいた時には、試料は０．２５分の間隔で採取された。 試料の色とディスクの色が一致するまでに要した時間は記録され、活性（ｇま たはｍｌあたりのリケフォン（ｌｉｑｕｅｆｏｎ））が以下の式によって計算さ れた： ここにおいて、ＬＵ＝リケフォンユニット、 Ｖ＝酵素の容量（５ｍｌ） ｔ＝デキストリン化時間（分） Ｄ＝希釈ファクター：希釈酵素のｍｌまたはｇで割った希釈容 積 実施例１−４のように調製された本発明に従った変異体αアミラーゼを、それ らのデンプンおよび可溶性基質に対する比活性について試験した。その結果は、 表１に示されている通り、本発明に従った変異体αアミラーゼは、両方の基質に 対してＡＡ２０野生型αアミラーゼと比較してより優れた活性特性を提供するこ とを示している。 実施例６ デンプン液化条件−−液化されたデンプンのＤＥ（デキストロース相当）の決定 デンプン液化は、５０フィート、直径０．２４インチ（０．２１インチｉ．ｄ ．）で、おおよそ直径１０インチのコイル−高さ５．５インチに屈曲されたステ ンレススチール管からなる反応器を用いて行った。コイルには、１１．５インチ の、前面端部から４フィートに位置されたインライン静的ミキサー（Ｃｏｌｅ− Ｐａｒｍｅｒ ＃Ｇ−０４６６９−６０）が装備されていた。コイルの後面端部 には、約２０ｐｓｉの破壊圧力に設定されたＳｗａｇｅｌｏｋインライン調整可 能圧力解放バリュー（ｖａｌｕｅ）（＃ＳＳ−４ＣＡ−３）が装備されている。 デンプンスラリーはコイルに〜７０ｍｌ／分の比率でピストン計量ポンプで供給 される。コイルは１０５．５℃に加熱されたグリセロールウォーターバス中に浸 されて加熱される。バスの温度は循環ヒーター／温度制御器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｍｏｄｅｌ ７３０５）を用いて維持される。 パイロットスケールのデンプン液化は、典型的には、混合チャンバーの後ろの ２．５１遅延コイルおよびターミナルバック圧力バルブを備えたハイドロヒータ −Ｍ１０３−Ｍスチームジェット（Ｈｙｄｒｏ−Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｒｐ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，，ＷＩ）を用いて行われた。デンプンはＭｙｏｎｏポンプ によってジェットに供給され、スチームは、９０−１００ｐｓｉに減少された１ ５０ｐｓｉスチームラインによって供給された。温度プローブは、ハイドロヒー タージェットの約１０ｃｍ後でバック圧力バルブの約５ｃｍ前に設置されている 。デンプンはジェットに約３５０ｍｌ／ｍｉｎで導入された。ジェット温度は１ ０５℃−１０７℃に保持された。デンプン試料は続いて、ジェットクッカーから ９５℃の第２の段階の液化に移され、９０分間維持された。 微粒子デンプンはコーンウエットミラーにより得られ、２日間以内に使用され た。デンプンは約３０−３５％乾燥固体の所望の固体レベルに脱塩水で希釈され 、ｐＨは２．５％ＮａＯＨまたは６％ＨＣｌで必要に応じて調整された。ＣａＣ ｌ₂・２Ｈ₂Ｏの形のカルシウムを添加した。典型的な液化条件は： デンプン ３２％−３５％固体 カルシウム ４０−６０ｐｐｍ（３０ｐｐｍ添加） ｐＨ ５．０−６．０ αアミラーゼ １２−１４ＬＵ／ｇの炭水化物（乾燥ベース） デンプンの試料は反応器から９５℃の第２段階液化バスに移され９０分間保持 された。デンプン液化の程度は、第２段階の液化の直後に、試料のデキストロー ス相当（ＤＥ）をＳｔａｎｄａｒｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏ ｆ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｅｒ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｒｎ Ｒ ｅｆｉｎｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，第６版、Ａｎａｌｙｔｉ ｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（１９８０）に記載された方 法に従って測定された。実施例７ Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓと野生型αアミラーゼの１０５．５℃での液化での比較 実施例１−４に示された通りに作成されたＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの置換を有し ているαアミラーゼをバシルス リケニフォルミスから派生された野生型αアミ ラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されている）と１０５．５℃での液化にお いて比較した。表２に示されている通り、変異体酵素はデンプンのジェット液化 において、特に低いｐＨにおいて、顕著に増加された性能を提供した。パイロッ トスケールでの、１０５．５℃での第１の段階の液化、および９５℃での第２の 段階の液化を行った。アミラーゼは１２ＬＵ／炭水化物ｇ（乾燥ベース）で添加 した。 実施例８ Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓと野生型αアミラーゼの１０７℃での液化での比較 実施例１−４に示された通りに作成されたＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの置換を有し ているαアミラーゼをバシルス リケニフォルミスから派生された野生型αアミ ラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されている）と１０７℃での液化において 比較した。表３に示されている通り、変異体酵素はデンプンのジェット液化にお いて、特に低いｐＨにおいて、ＤＥ値で示されているように、液化工程の間に顕 著に増加された性能を提供した。パイロットスケールでの、１０７℃での第１の 段階の液化、および９５℃での第２の段階の液化を行った。アミラーゼは１２Ｌ Ｕ／炭水化物ｇ（乾燥ベース）で添加した。 実施例９ 変異体および野生型αアミラーゼについての液化の結果の静力学的分析 Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０とＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体の相対的 な液化性能を、静力学的設計の実験において幅広く探索した。”Ｘ−ＳＴＡＴ” プログラム、バージョン２．０（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ，Ｗｉｌｅｙ Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９２））を用いて、Ｂｏｘ− Ｂｅｈｎｋｅｎ階乗実験が設計された：第１の液化温度を１０６℃から１１０℃ 、液化ｐＨをｐＨ５．３からｐＨ６．０およびデンプン基質中の全体のカルシウ ムのレベルを３０ｐｐｍから９０ｐｐｍで変化させた。この実験に基づいて作成 された表４および表５中のデータは、１５のパイロットスケール液化において、 １２ＬＵ／ｇ乾燥固体基質のＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０またはＭ１５ Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体をそれぞれ用いて作成されたものである。データは続いて ２次関数モデルに適合された。Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ変異体に関しては、データ は、等式ＤＥ＝８４２．４１＋２８．３７４ｘｐＨ−１７．５５７ｘ温度＋１． ５００５ｘカルシウム濃度＋１．６２４３（ｐＨｘ温度）−０．０８１５０６（ ｐＨｘカルシウム濃度）−０．００９２０９９（温度ｘカルシウム濃度）−１６ ．８４１（ｐＨ）²＋０．０３８３７９（温度）²−０．０００１２４（カルシウ ム濃度）²に適合され、回帰についての標準誤差約１．３１３および平均（Ｒ）² についての説明された変化（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は９３ ．９９％であった。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０に関しては、データは 、等式ＤＥ＝−６５２．０＋（１３２．３５ｘｐＨ）＋（４．７１６ｘ温度）＋ （１．３９８９ｘカルシウム濃度）−０．０５０５１５（ｐＨｘ温度）−０．０ １９６０３（ｐＨｘカルシウム濃度）−０．０１１１１８（温度ｘカルシウム濃 度）−１０．２０６（ｐＨ）²＋０．０２１０４（温度）²−０．０００５２２（ カルシウム濃度）²に適合された。回帰についての標準誤差０．５７７２および 平均（Ｒ）²についての説明された変化（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｖａｒｉａｔｉ ｏｎ）は９８．６９％であり、これらの等式は計算されたＤＥ対ｐＨ、対カルシ ウム濃度、対温度をプロットする曲線を作るために用いられた。１０７℃およ び６０ｐｐｍＣａ＋でのこのデータの２次元での表示は図１０−１２にそれぞれ 示されている。図１０−１２に示されている通り、変異体アミラーゼは低ｐＨ、 低カルシウムレベルおよびより高い温度でのより効率的なデンプン液化を可能と することにより野生型アミラーゼを凌いでいる。 本発明は多様な好ましい実施態様の見地から記述されているが、当業者は、多 様な変更、代用、省略および変化がその精神および範囲から離れることなく成さ れうるであろうことを理解するであろう。従って、本発明の範囲は以下のクレー ムの範囲のみによって、その相当するものを含めて限定されることが意図されて いる。実施例１０ 熱安定性についての付加的な変異体αアミラーゼの調製および試験 １またはそれより多くの位置Ｖ１２８Ｅ、Ｈ１３３Ｙ、Ｓ１８７Ｄおよび／ま たはＡ２０９Ｖでの置換を有する変異体αアミラーゼを、所望の変異を成すため に適当なＰＣＲプライマーが提供されたことを除いて、およそ実施例１−４で提 供されているように手順に従って調製された。アミラーゼは、野生型バシルス リケニフォルミスαアミラーゼが１０８７ＬＵ／ｍｇタンパク質の比活性を示し た点まで精製された。タンパク質濃度は、野生型酵素のモル吸光係数１４３．２ ５５Ｍ^-1ｃｍ^-1を用いて、２７８ｎｍでの吸収により決定された。 多様な変異体の熱失活率は以下の手順に従って測定された。アミラーゼストッ ク溶液は２０ｍＭ酢酸アンモニウム、４ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ６．５中に幅広 く透析された。安定性の測定のために、このストックは＞５０倍で、５０ｍＭ酢 酸アンモニウム、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．０ 中に、最終濃度は３０から５０μｇ／ｍｌとして希釈した。６つの１００μｌの アリコートをエッペンドルフチューブに入れ、８３℃のウォーターバス中に位置 させた。エッペンドルフチューブは規則的で測定された３０秒から５分の間の間 隔で除去され、不活性化を止めるために氷上に置かれた。水溶性基質を用いて、 実施例５のように残存活性をアッセイした。活性の自然対数を保温時間に対して プロットし、直線の傾きから不活性化比率定数が得られた。多様な変異体の結果 は表６に提供されている。 実施例１１ 変異体アミラーゼの低ｐＨ液化性能 Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓの置換を含む αアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、実施例６に従って液 化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で９５℃で９０分の第２の保温 とともに、９４ｐｐｍのＳＯ₂を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラ ーゼとともに含んだ条件下で行った。結果は以下の表７において提供されている 。 実施例１２ 変化しているカルシウムレベルでのＭ１５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８ ８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８ＳおよびＭ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓの低ｐＨ 液化性能 多様な置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、 実施例６に従って液化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で、ｐＨ５ ．５０、９５ｐｐｍのＳＯ₂を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラー ゼとともに含んだ条件下で行った。結果は以下の表８において提供されている。 実施例１３ 変化しているｐＨレベルでのＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ａ ２０９Ｖの低ｐＨ液化性能 多様な置換を含むαアミラーゼを、実施例１−４および１０に従って作成し、 実施例６に従って液化の研究において比較した。液化は１０５．５℃で、９８ｐ ｐｍのＳＯ₂を１６ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）のアミラーゼとともに含ん だ条件下で行った。乾燥コーンスターチ（Ｃｌｉｎｔｏｎ Ｂｒａｎｄ １０６ −Ｂ Ｐｅａｒｌ ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ、ＡＤＭ Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｇ，Ｃｌｉｎｔｏｎ，Ｉｏｗａ）は脱塩水でスラリー化させ（〜２３ｋｇ、 〜５０１）、１６時間の水和が可能となった。結果は以下の表９において提供さ れている。 実施例１４ 野生型と比較して改善された変異体αアミラーゼの液化性能 Ｍ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ／Ｎ１８８Ｓでの置換を含むαアミラーゼを、実施例１ −４および１０に従って作成し、実施例６に従って液化の研究において野生型と 比較した。乾燥コーンスターチ（Ｃｌｉｎｔｏｎ Ｂｒａｎｄ １０６−Ｂ Ｐ ｅａｒｌ ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ、ＡＤＭ Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， Ｃｌｉｎｔｏｎ，Ｉｏｗａ）は脱塩水でスラリー化させ（〜２３ｋｇ、〜５０１ ）、１６時間の水和が可能となった。液化は１０５．６℃で、等しいアミラーゼ のタンパク質レベル、９．０μｇアミラーゼ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）（３． １ｍｇのアミラーゼ／１ｌの３５％乾燥固体デンプンスラリー）で行った。変異 体αアミラーゼから得られる比活性の利益により、アミラーゼの活性は、野生型 は１１ＬＵ／ｇ炭水化物（乾燥ベース）で、変異体は２４ＬＵ／ｇ炭水化物であ った。測定された活性は、変異体アミラーゼがヘプタマルトースに対しては野生 型の４１０％の、デンプンに対しては野生型の２１０％の活性の増加有している ことを示していた。液化の結果は以下の表１０において提供されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リクアド，キャロル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド内 (72)発明者 ロップ，トレイシ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド内 (72)発明者 ソルヘイム，リーフ ピー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド内 (72)発明者 リンガー，クリストファー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド内 (72)発明者 デイ，アンソニー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロアルト ペイジ ミル ロード 925 ジェネンコア インター ナショナル インコーポレーテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．αアミラーセをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物であるαアミラー ゼであって、前記変異ＤＮＡ配列が少なくとも１またはそれ以上のアスパラギン 残基の欠失または置換によりプレカーサーαアミラーゼから派生されていること を特徴とするαアミラーゼ。 ２．前記αアミラーゼがバシルス リケニフォルミスにおいてのＮ１８８に相当 する位置の置換または欠失を有していることを特徴とする請求の範囲第１項記載 のαアミラーゼ。 ３．前記αアミラーゼがバシルス リケニフォルミスにおいてのＮ１８８Ｓまた はＮ１８８Ｔに相当する置換を有していることを特徴とする請求の範囲第２項記 載のαアミラーゼ。 ４．前記欠失または置換がさらにメチオニンまたはトリプトファン残基の欠失ま たは置換を含んでいることを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。 ５．前記メチオニンまたはトリプトファン残基の前記欠失または置換が、バシル ス リケニフォルミスにおいてのＭ１５、Ｗ１３８またはＭ１９７に相当する置 換または欠失を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載のαアミラーゼ。 ６．前記欠失または置換が、バシルス リケニフォルミスにおいてのＶ１２９、 Ｈ１３３、Ｓ１８７またはＡ２０９に相当する残基の欠失または置換をさらに含 んでいることを特徴とする請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。 ７．αアミラーゼをコードしている変異ＤＮＡの発現産物であるαアミラーゼで あって、前記変異ＤＮＡ配列がバシルス リケニフォルミスにおいてのＭ１５Ｔ ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｌ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ １５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｎ１８８Ｓ／Ａ２０ ９Ｖ、Ｍ１５Ｔ／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ、Ｍ１５Ｔ／Ｓ１８７Ｄ ／Ｎ１８８ＳまたはＭ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙに相当する置換によってプレカーサー αアミラーゼから派生されたものであることを特徴とするαアミラーゼ。 ８．前記メチオニン残基の前記置換が、バシルス リケニフォルミスにおいての Ｍ１５Ｔ、Ｗ１３８ＹまたはＭ１９７Ｔに相当する置換を含むことを特徴とする 請求の範囲第５項記載のαアミラーゼ。 ９．前記プレカーサーαアミラーゼがバシルスから派生されたことを特徴とする 請求の範囲第１項記載のαアミラーゼ。 10．前記プレカーサーαアミラーゼがバシルス リケニフォルミスから派生され たことを特徴とする請求の範囲第９項記載のαアミラーゼ。 11．前記αアミラーゼが位置Ｎ１８８での欠失または置換を有していることを特 徴とする請求の範囲第１０項記載のαアミラーゼ。 12．前記αアミラーゼがＮ１８８Ｓの置換を有していることを特徴とする請求の 範囲第１１項記載のαアミラーゼ。 13．請求の範囲第１項記載のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ。 14．請求の範囲第２項記載のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ。 15．請求の範囲第５項記載のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ。 16．請求の範囲第６項記載のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ。 17．請求の範囲第７項記載のαアミラーゼをコードしているＤＮＡ。 18．請求の範囲第１３項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。 19．請求の範囲第１４項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。 20．請求の範囲第１５項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。 21．請求の範囲第１６項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。 22．請求の範囲第１７項記載のＤＮＡを含む発現ベクター。 23．請求の範囲第１８項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 24．請求の範囲第１９項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 25．請求の範囲第２０項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 26．請求の範囲第２１項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 27．請求の範囲第２２項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 28．促進された低ｐＨ性能を有することを特徴とする請求の範囲第１、６または ７項記載のαアミラーゼ。 29．請求の範囲第１、６または７項記載のαアミラーゼを含むことを特徴とする 洗剤組成物。 30．前記洗剤が汚された織物の洗濯において有用であることを特徴とする請求の 範囲第２９項記載の洗剤組成物。 31．前記洗剤が汚された皿の洗浄において有用であることを特徴とする請求の範 囲第２９項記載の洗剤組成物。