ES2268708T3 - Alfa-milasa mutante. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN NUEVAS ENZIMAS DE AL} UNO O MAS RESIDUOS DE ASPARAGINA SON SUSTITUIDO POR UN AMINOACIDO DIFERENTE O ELIMINADOS. LAS ENZIMAS DE AL} ENTADAS MUESTRAN PERFILES ALTERADOS O MEJORADOS DE REALIZACION, ESTABILIDAD Y ACTIVIDAD DE HIDROLISIS DEL ALMIDON DE BAJO PH.
Description
\alpha-amilasa mutante.
La presente invención está dirigida a
\alpha-amilasas que presentan características de
prestaciones alteradas. La presente invención también está dirigida
a nuevas enzimas de \alpha-amilasa que tienen al
menos un residuo de asparagina que es sustituido por otro aminoácido
diferente o que es eliminado, en el que la
\alpha-amilasa resultante presenta unas
prestaciones de hidrólisis de almidón a pH bajo alteradas, una
estabilidad alterada y perfiles de actividad alterados.
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa,
EC 3.2.1.1) hidrolizan los enlaces internos
\alpha-1,4-glucosídicos del
almidón, principalmente de forma aleatoria, para producir
malto-dextrinas de menor peso molecular. Las
\alpha-amilasas tienen un considerable valor
comercial, siendo usadas en las etapas iniciales (licuefacción) del
procesado del almidón; en la producción de alcohol; como agentes de
limpieza en matrices detergentes; y en la industria textil para
reducir el tamaño del almidón. Las \alpha-amilasas
se producen a partir de fuentes bacterianas tales como el
Bacillus licheniformis, el Bacillus amyloliquefaciens,
el Bacillus subtilis o el Bacillus
stearothermophilus. En los últimos años, las enzimas preferidas
para uso comercial han sido las procedentes de Bacillus
licheniformis debido a su estabilidad térmica y sus
prestaciones, al menos a pH's neutros y moderadamente alcalinos.
En general, el procesado de almidón a fructosa
consiste en cuatro etapas: licuefacción de almidón granular,
sacarificación del almidón licuado para formar dextrosa,
purificación e isomerización a fructosa. El objetivo de un proceso
de licuefacción de almidón es convertir una suspensión concentrada
de gránulos de polímero de almidón en una disolución de dextrinas de
cadena más corta solubles de baja viscosidad. Esta etapa es esencial
para un manejo adecuado con equipamiento estándar, y para obtener
una conversión eficaz de glucosa en otros azúcares. Para licuar
almidón granular, es necesario gelatinizar los gránulos aumentando
la temperatura del almidón granular por encima de aproximadamente
72ºC. El proceso de calentamiento rompe instantáneamente los
gránulos de almidón insoluble para producir una disolución de
almidón soluble en agua. La disolución de almidón solubilizado se
licua a continuación mediante \alpha-amilasa (EC
3.2.1.1.).
Un proceso de licuefacción enzimática común
incluye ajustar el pH de una mezcla de almidón granular hasta entre
6,0 y 6,5, el pH óptimo para la \alpha-amilasa
procedente de Bacillus licheniformis, mediante la adición de
hidróxido cálcico, de hidróxido sódico o de carbonato sódico. La
adición de hidróxido cálcico tiene la ventaja de que también
proporciona iones calcio, conocidos por estabilizar las
\alpha-amilasas frente a la desactivación. Tras
añadir las \alpha-amilasas, la suspensión se
bombea a través de un chorro de vapor para aumentar de forma
instantánea la temperatura hasta 80-115ºC. El
almidón se gelatiniza inmediatamente y, debido a la presencia de
\alpha-amilasas, se despolimeriza por hidrólisis
aleatoria de los enlaces \alpha-(1,4)-glicosídicos
para dar lugar a una masa fluida que se bombea fácilmente.
En una segunda variante del proceso de
licuefacción, se añade la \alpha-amilasa a la
suspensión de almidón, se mantiene la suspensión a una temperatura
de 80-100ºC para hidrolizar parcialmente los
gránulos de almidón, y la suspensión de almidón parcialmente
hidrolizado se bombea a través de un chorro a temperaturas por
encima de aproximadamente 105ºC con el fin de gelatinizar por
completo cualquier estructura granular remanente. Después de enfriar
el almidón gelatinizado, se puede realizar una segunda adición de
\alpha-amilasa para hidrolizar aún más el
almidón.
Una tercera variante de este proceso se denomina
proceso de molienda en seco. En la molienda en seco, se muele el
grano entero y se combina con agua. Opcionalmente el germen se
retira mediante separación por flotación o por otras técnicas
equivalentes. La mezcla resultante, que contiene almidón, fibra,
proteína y otros componentes del grano, se licua usando
\alpha-amilasa. La práctica general en la técnica
es acometer la licuefacción enzimática a una temperatura menor
cuando se usa el proceso de molienda en seco. Generalmente, se cree
que la licuefacción a baja temperatura es menos eficaz que la
licuefacción a alta temperatura a la hora de convertir el almidón en
dextrinas solubles.
Típicamente, después de la gelatinización, la
disolución de almidón se mantiene a una temperatura elevada en
presencia de \alpha-amilasa hasta que se alcanza
una ED de 10-20, normalmente un periodo de
1-3 horas. El equivalente de dextrosa (ED) es el
patrón industrial para medir la concentración de azúcares reductoras
totales, calculado como D-glucosa en base al peso
seco. El almidón granular no hidrolizado presenta un ED virtualmente
cero, mientras que el ED de D-glucosa se define como
100.
La temperatura máxima a la que se puede mantener
la disolución de almidón que contiene
\alpha-amilasa depende de la fuente microbiana a
partir de la cual se ha obtenido la enzima y de la estructura
molecular de la molécula de \alpha-amilasa. Las
\alpha-amilasa producidas por cepas naturales de
Bacillus subtilis o de Bacillus amyloliquefaciens se
usan normalmente a temperaturas que no superan aproximadamente los
90ºC, debido a una desactivación térmica excesivamente rápida por
encima de esa temperatura, mientras que las
\alpha-amilasas producidas por cepas naturales de
Bacillus licheniformis se pueden usar a temperaturas de hasta
aproximadamente 110ºC. Se sabe que la presencia de almidón y de
iones calcio estabiliza las \alpha-amilasas frente
a la desactivación. No obstante, las
\alpha-amilasas se usan a valores de pH por encima
de 6 para protegerlas frente a una rápida desactivación. A
temperaturas más bajas, se sabe que la
\alpha-amilasa procedente de Bacillus
licheniformis presenta actividad de hidrólisis sobre el sustrato
de almidón a valores de pH de hasta 5. Sin embargo, cuando se usa la
enzima para hidrólisis de almidón a temperaturas de chorro comunes,
por ejemplo, entre 102ºC y 109ºC, se debe mantener el pH por encima
de al menos 5,7 para evitar una desactivación excesivamente rápida.
Desafortunadamente, el requerimiento de pH proporciona una estrecha
ventana de posibilidades de procesado, ya que valores de pH por
encima de 6,0 dan como resultado subproductos no deseados, por
ejemplo maltulosa. Por tanto, en realidad, el pH de licuefacción se
mantiene generalmente entre 5,9 y 6,0 para alcanzar un rendimiento
satisfactorio de almidón hidrolizado.
Otro problema en relación con el pH de
licuefacción es la necesidad de aumentar el pH de la suspensión de
almidón desde aproximadamente 4, el pH de una suspensión de almidón
de maíz tal cual llega de la etapa de molienda en húmedo, hasta
5,9-6,0. Este ajuste de pH requiere la adición
costosa de productos químicos de neutralización de ácidos, y también
requiere un refinado adicional de intercambio iónico del producto
final de conversión de almidón para eliminar el producto químico.
Además, la siguiente etapa del proceso tras la licuefacción,
típicamente la sacarificación del almidón licuado para dar glucosa
mediante glucoamilasa, requiere un pH de 4-4,5; por
tanto, el pH debe ajustarse desde 5,9-6,0 hasta
4-4,5; lo que requiere más adición de productos
químicos y etapas de refino adicionales.
Después de la licuefacción, el almidón procesado
se sacarifica para dar glucosa con glucoamilasa. En los procesos
presentes se produce un problema cuando hay almidón residual en la
mezcla de sacarificación debido a una licuefacción incompleta del
almidón, por ejemplo, una hidrólisis ineficaz de amilasa por
amilasa. El almidón residual es altamente resistente a la hidrólisis
por glucoamilasa. Supone una pérdida de rendimiento e interfiere con
la posterior filtración de los jarabes.
Adicionalmente, se sabe que muchas
\alpha-amilasas requieren la adición de iones
calcio para mejorar la estabilidad. Esto aumenta aún más el coste de
la licuefacción.
En la Patente de EE.UU. Nº 5.322.778, se logró
la licuefacción entre pH 4,0 y 6,0 añadiendo a la mezcla de
licuefacción un antioxidante tal como bisulfito o una sal del mismo,
ácido ascórbico o una sal del mismo, ácido eritórbico o
antioxidantes fenólicos tales como el hidroxianisol butilado, el
hidroxitolueno butilado o el \alpha-tocoferol. De
acuerdo con esta patente, el bisulfito sódico debe añadirse con una
concentración superior a 5 mM.
En la Patente de EE.UU. Nº 5.180.669, se logró
la licuefacción entre pH 5,0 y 6,0 mediante la adición de iones
carbonato en exceso con respecto a la cantidad necesaria para
tamponar la disolución de la mezcla de almidón molido. Debido a un
efecto de aumento del pH que se produce con la adición de iones
carbonato, generalmente se neutraliza la mezcla añadiendo una fuente
de iones hidrógeno, por ejemplo, un ácido inorgánico tal como ácido
clorhídrico o ácido sulfúrico.
En la Publicación PCT Nº WO 94/02597, se
describe una \alpha-amilasa mutante que tiene una
estabilidad oxidativa mejorada, en la que una o más metioninas son
reemplazadas con cualquier aminoácido excepto cisteína o
metionina.
En la Publicación PCT Nº WO 94/18314, se
describe una \alpha-amilasa mutante que tiene una
estabilidad oxidativa mejorada, en la que uno o más residuos de
metionina, triptófano, cisteína, histidina o tirosina son
reemplazados con un aminoácido no oxidable.
En la Publicación PCT Nº WO 91/00353, las
características de prestaciones y los problemas asociados a la
licuefacción de \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis natural se abordan mediante modificación de
ingeniería genética de la \alpha-amilasa para
incluir las sustituciones específicas
Ala-111-Thr,
His-133-Tyr y/o
Thr-149-Ile.
Diversos investigadores han realizado estudios
que usan técnicas de ADN recombinante para explorar qué residuos son
importantes para la actividad catalítica de las amilasas y/o para
explorar el efecto de modificar determinados aminoácidos dentro del
centro activo de diversas amilasas y glicosilasas (Vihinen y col.,
J. Biochem., vol. 107, pág. 267-272 (1990); Hola y
col., Protein Engineering, vol. 3, pág. 181-191
(1990); Takase y col., Biochemica et Biophysica Acta, vol. 1120,
pág. 281-288 (1992); Matsui y col., Febs Letters,
vol. 310, pág. 216-218 (1992); Matsui y col.,
Biochemistry, vol. 33, pág. 451-458 (1992); Sogaard
y col., J. Biol. Chem., vol. 268, pág. 22480-22484
(1993); Sogaard y col., Carbohydrate Polymers, vol. 21, pág.
137-146 (1993); Svensson, Plant Mol. Biol., vol. 25,
pág. 141-157 (1994); Svensson y col., J. Biotech.
Vol. 29, pág. 1-37 (1993)). También se ha estudiado
qué residuos son importantes para estabilidad térmica (Suzuki y
col., J. Biol. Chem. vol. 264, pág. 18933-18938
(1989); Watanabe y col., Eur. J. Biochem. vol. 226, pág.
277-283 (1994)); y un grupo ha usado dichos métodos
para introducir mutaciones en diversos residuos de histidina de una
amilasa de Bacillus licheniformis, siendo la razón que la
amilasa de Bacillus licheniformis, relativamente termoestable
en comparación con otras amilasas de Bacillus similares,
presenta un exceso de histidinas y, por tanto, se ha sugerido que
reemplazar una histidina podría afectar a la termoestabilidad de la
enzima. Este trabajo dio como resultado la identificación de
mutaciones de estabilización en el residuo de histidina de la
posición +133 y en el residuo de alanita de la posición +209
(Declerck y col., J. Biol. Chem., vol. 265, pág.
15481-15488 (1990); FR 2 665 178-A1:
Joyel y col., Bio/Technology, vol. 10, pág.
1579-1583 (1992)).
A pesar de los avances realizados en la técnica
anterior, existe una necesidad por una
\alpha-amilasa que sea suficientemente eficaz a
valores bajos de pH para permitir la licuefacción comercial a menor
pH que el actualmente práctico. De forma similar, existe una
necesidad en la técnica de un método que permita una licuefacción
eficaz de un grano molido en seco a elevadas temperaturas. Además,
existe una necesidad en la técnica de un método que permita la
licuefacción eficaz de almidón con una menor dependencia de la
costosa adición de calcio. Adicionalmente, existe una necesidad de
una enzima más eficaz para efectuar una hidrólisis más completa del
almidón en la etapa de licuefacción, para asegurar una
sacarificación eficaz. Debido a que las amilasas disponibles
comercialmente no son aceptables en muchas condiciones debido a
problemas de estabilidad, por ejemplo, a los niveles altamente
alcalinos y oxidantes (lejía) asociados a detergentes, existe una
necesidad de una amilasa que tenga unos perfiles de prestaciones
alterados, preferiblemente superiores, en dichas condiciones. Por
tanto, serían deseables características de prestaciones alteradas
tales como una aumento de la actividad, de la termoestabilidad, de
la estabilidad frente al pH, de la estabilidad oxidativa o de la
estabilidad frente al calcio, que se pueden lograr a la vez que se
altera, se mantiene o aumenta la actividad enzimática, en
comparación con la enzima natural o precursora.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una \alpha-amilasa que presente
perfiles de prestaciones alterados, tal como la estabilidad frente
al pH, la estabilidad alcalina, la estabilidad oxidativa o la
actividad enzimática.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una \alpha-amilasa que presenta
una estabilidad aumentada en ausencia de ión calcio añadido durante
la licuefacción del almidón.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar una \alpha-amilasa que presenta una
estabilidad a pH bajo alterada para su uso en la licuefacción eficaz
a bajo pH.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una \alpha-amilasa que permite una
licuefacción eficaz de grano molido seco a elevadas
temperaturas.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una \alpha-amilasa que es útil en
entornos de pH elevado o en presencia de oxidantes o de lejía.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una \alpha-amilasa que efectúa una
hidrólisis más completa de moléculas de almidón para aumentar la
eficacia de la sacarificación.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una \alpha-amilasa que el producto de
expresión de una secuencia de ADN mutada que codifica una
\alpha-amilasa, secuencia de ADN mutada que deriva
de una \alpha-amilasa precursora mediante la
eliminación o la sustitución de uno o más residuos que tienen el
efecto de mejorar las prestaciones de los residuos de
\alpha-amilasa.
La \alpha-amilasa de la
invención comprende una sustitución que corresponde con N188S o
N188T del Bacillus licheniformis. También de forma
preferible, la \alpha-amilasa comprende además la
eliminación o la sustitución de un residuo de metionina o
triptófano, particularmente en una posición correspondiente a M15,
W138 y/o M197, o en un residuo correspondiente a V128, H133, S187
y/o A209 de Bacillus licheniformis. En una realización más
preferida, se proporciona una \alpha-amilasa que
comprende sustituciones en los residuos correspondientes a M15UN188S
o M15T/N188S de Bacillus licheniformis.
La Figura 1 ilustra oligonucleótidos mutagénicos
útiles durante la mutagénesis dirigida de Asn 188 de
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis.
En esta y en las siguientes figuras que muestran constructos de
oligonucleótidos, las letras en negrita indican cambios de bases
introducidos por el oligonucleótido, y el subrayado indica
posiciones de endonucleasa introducidas por el oligonucleótido.
La Figura 2 ilustra los prímeros PCR usados para
el procesamiento PCR de los moldes de oligonucleótidos
mutagénicos.
La Figura 3 ilustra la secuencia de ADN del gen
correspondiente a \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis (NCIB 8061) (SEQ ID NO: 33) y la secuencia de
aminoácidos deducida del producto de traducción (SEQ ID NO: 41), tal
como se describe en Gray y col., J. Bacteriology, vol. 166, pág.
635-643 (1986).
La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos
(SEQ ID NO: 34) de la enzima de \alpha-amilasa
madura de Bacillus licheniformis.
La Figura 5 ilustra un alineamiento de las
estructuras primarias de tres \alpha-amilasas de
Bacillus. La \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis (Am-Lich) (SEQ ID NO: 35) se
describe en Gray y col., J. Bacteriology, vol. 166, pág.
635-643 (1986); la \alpha-amilasa
de Bacillus amyloliquefaciens (Am-Amylo) (SEQ
ID NO: 36) se describe en Takkinen y col., J. Biol. Chem., vol. 258,
pág. 1007-1013 (1983); y la
\alpha-amilasa de Bacillus
stearothermophilus (Am-Stearo) (SEQ ID NO: 37)
se describe en Ihara y col., J. Biochem., vol. 98, pág.
95-103 (1985).
La Figura 6 ilustra el plásmido pHP13 en el que
Cm^{R} se refiere a resistencia a cloranfenicol, Em^{R} se
refiere a resistencia a eritromicina y Rep pTA1060 se refiere al
origen de la replicación del plásmido pTA1060.
La Figura 7 ilustra el plásmido pBLapr en el que
BL AA se refiere al gen de \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis; aprE se refiere al promotor y
al péptido señal que codifica la región del gen aprE; AmpR se
refiere al gen resistente a ampicilina de pBR322; y CAT se refiere
al gen de resistencia a cloranfenicol de pC194.
La Figura 8 ilustra el plásmido pHP.BL que porta
el gen de \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis.
La Figura 9 ilustra un esquema del método PCR
usado para producir los oligonucleótidos mutantes correspondientes a
\alpha-amilasa derivada de Bacillus
licheniformis.
La Figura 10 ilustra un gráfico derivado de un
análisis estadístico de enzima variante de acuerdo con la invención,
M15T/N188S, en comparación con la \alpha-amilasa
natural de Bacillus licheniformis en la licuefacción de
almidón a 107ºC, 60 ppm de calcio y pH variable.
La figura 11 ilustra un gráfico derivado de un
análisis estadístico de la actuación de una enzima variante de
acuerdo con la invención, M15T/N188S, en comparación con la
\alpha-amilasa natural de Bacillus
licheniformis en la licuefacción de almidón a 170ºC, pH 6,0, y
concentración de calcio variable.
La Figura 12 ilustra un gráfico derivado de un
análisis estadístico de la actuación de una enzima variante de
acuerdo con la invención, M15T/N188S, en comparación con la
\alpha-amilasa natural de Bacillus
licheniformis en la licuefacción de almidón a pH 6,0, 60 ppm de
calcio y temperatura variable.
La Figura 13 ilustra los cruces de proteína
madura-secuencia señal en una
\alpha-amilasa derivada Bacillus
licheniformis (SEQ ID NO: 38), Bacillus subtilis aprE
(SEQ ID NO: 39) y de Bacillus licheniformis in pBLapr (SEQ ID
NO: 40).
"\alpha-Amilasa"
significa una actividad enzimática que rompe o hidroliza el enlace
\alpha(1-4)glicosídico, por ejemplo,
en polímeros de almidón, de amilopectina o de amilasa.
\alpha-Amilasa tal como se emplea en la presente
memoria incluye tanto las \alpha-amilasas
naturales como las \alpha-amilasas recombinantes.
Las \alpha-amilasas de la presente invención son
aquellas derivadas de Bacillus licheniformis.
"\alpha-Amilasa
recombinante" significa una \alpha-amilasa en
la que la secuencia de ADN que codifica la
\alpha-amilasa natural se modifica para producir
una secuencia de ADN mutante que codifica la sustitución, inserción
o eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia de
\alpha-amilasa, en comparación con la
\alpha-amilasa natural.
"Vector de expresión" significa un
constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que está ligada
operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar
la expresión de dicho ADN en un hospedante adecuado. Dichas
secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha
transcripción, una secuencia que codifica posiciones de unión de
ribosoma de mARN adecuadas, y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y de la traducción. El promotor aprE
de Bacillus subtilis es un promotor preferido. El vector
puede ser un plásmido, una partícula fago, o simplemente un injerto
genómico potencial. Una vez transformado en un hospedante adecuado,
el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma
hospedante, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio
genoma. En la presente especificación, a veces plásmido y vector se
usan indistintamente para incluir otras formas de vectores de
expresión que actúan con funciones equivalentes, y que son, o pasan
a ser, conocidos en la técnica.
"Cepa hospedante" o "célula
hospedante" significa un hospedante adecuado para un vector de
expresión que comprende un ADN que codifica la
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención. Las células hospedantes útiles en la presente invención
generalmente son hospedantes procarióticos o eucarióticos,
incluyendo cualquier microorganismo transformable en el que se pueda
lograr la expresión de \alpha-amilasa de acuerdo
con la presente invención. Específicamente, son adecuadas las cepas
hospedantes de la misma especie, o género, de la que deriva la
\alpha-amilasa, tal como una cepa de
Bacillus. Preferiblemente, se usa una cepa de Bacillus
negativa en \alpha-amilasa (genes eliminados) y/o
una cepa de Bacillus con \alpha-amilasa y
proteasa eliminadas (\DeltaamyE, \Deltaapr,
\Deltanpr). Las células hospedantes se transforman o se
transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN
recombinante. Dichas células hospedantes transformadas son
capaces de replicar vectores que codifican \alpha-amilasa y sus variantes (mutantes) o que expresan la \alpha-amilasa deseada.
capaces de replicar vectores que codifican \alpha-amilasa y sus variantes (mutantes) o que expresan la \alpha-amilasa deseada.
"Licuefacción" o "licuar" significan
un proceso mediante el cual se convierte almidón en dextrinas de
cadena más corta y menos viscosas. Generalmente, este proceso
incluye la gelatinización de almidón simultáneamente o después de la
adición de \alpha-amilasa.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una \alpha-amilasa que es el producto
de expresión de una secuencia de ADN mutada que codifica una
\alpha-amilasa, derivando la secuencia de ADN
mutada de una \alpha-amilasa precursora por
eliminación o sustitución de uno o más residuos de asparagina.
También se proporciona una molécula de ácido nucleico (ADN) que
codifica una secuencia de aminoácido que comprende al menos una
parte de la \alpha-amilasa proporcionada por la
presente invención, sistemas de expresión que incorporan dicho ADN
que incluyen vectores y fagos, células hospedantes transformadas con
dicho ADN, y cadenas antisentido de ADN correspondientes a la
molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácido. De forma
similar, la presente invención incluye un método para producir una
\alpha-amilasa mediante la expresión de ADN
incorporado en un sistema de expresión que ha sido transformado en
una célula hospedante. La \alpha-amilasa de la
invención se puede usar en la licuefacción de almidón, como
ingrediente de detergentes, en el procesado de comida, en el
procesado de textiles o en cualquier otra aplicación en la que la
actividad de \alpha-amilasa sea útil.
Las \alpha-amilasas de acuerdo
con la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos
que deriva de la secuencia de aminoácidos de una
\alpha-amilasa precursora. Las
\alpha-amilasas precursoras incluyen
\alpha-amilasas que existen de forma natural y
\alpha-amilasas recombinantes. La secuencia de
aminoácidos de la \alpha-amilasa mutante deriva de
la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa
precursora mediante la sustitución, eliminación o inserción de uno o
más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora.
Generalmente, dicha modificación es de la secuencia de ADN
precursora que codifica la secuencia de aminoácidos de la
\alpha-amilasa precursora, más que de la
manipulación de la enzima de \alpha-amilasa
precursora per se. Los métodos adecuados para dicha
manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen métodos
descritos en la presente memoria y en las Patentes de propiedad
común de EE.UU. Nº 4.760.025 y 5.185.258.
Las \alpha-amilasas descritas
en la especificación se derivan de una amilasa precursora. La
\alpha-amilasa precursora se produce mediante
cualquier fuente capaz de producir \alpha-amilasa.
Las fuentes adecuadas de \alpha-amilasas son
organismos procarióticos o eucarióticos, incluyendo hongos,
bacterias, plantas o animales. Preferiblemente, la
\alpha-amilasa precursora es producida por un
Bacillus; más preferiblemente, por un Bacillus
licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus
stearothermophilus; aún más preferiblemente, la
\alpha-amilasa precursora deriva de Bacillus
licheniformis.
Hasta la fecha se han descubierto Homologías
variables entre casi todas las endo-amilasas
secuenciadas hasta el momento, procedentes de plantas, animales y
bacterias (Nakajima y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 23,
pág. 355-360 (1986): Rogers, Biochem. Biophys. Res.
Commun., vol. 128, pág. 470-476 (1985); Janecek,
Eur. J. Biochem., vol. 224, pág. 519-524 (1994)).
Existen cuatro áreas de homología particularmente alta en
determinadas amilasas de Bacillus, como se muestra en la
Figura 5, en la que las secciones subrayadas designan áreas de alta
homología. También se han usado alineamientos de secuencia para
mapear la relación entre las endo-amilasas de
Bacillus (Feng y col., J. Molec. Evol., vol. 35, pág.
351-360 (1987)). La homología relativa de secuencia
entre la amilasa de Bacillus stearothermophilus y la de
Bacillus licheniformis es aproximadamente del 66%, y entre
las amilasas de Bacillus licheniformis y de Bacillus
amyloliquefaciens es de aproximadamente el 81%, determinado por
Holm y col., Protein Engineering, vol. 3, Nº 3, pág.
181-191 (1990). Aunque la homología de secuencia es
importante, generalmente se reconoce que la homología estructural
también es importante al comparar amilasas u otras enzimas. Por
ejemplo, se ha sugerido una homología estructural entre amilasas de
hongos y de bacterias y, por tanto, las amilasas de hongos quedan
abarcadas por la presente invención.
Entre otros, los residuos correspondientes a
residuos de asparagina en la \alpha-amilasa se
identifican en la presente memoria para eliminación o sustitución.
Por tanto, residuos específicos tales como N188 se refieren a un
número de posición de aminoácido (es decir, +188) que hace
referencia al número asignado en la secuencia de
\alpha-amilasa madura de Bacillus
licheniformis ilustrada en la Figura 4. Un residuo de una
\alpha-amilasa precursora es equivalente a un
residuo de \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis si es homóloga (es decir, se corresponde en
posición con la estructura primaria o con la terciaria) o análoga a
un residuo específico o porción de dicho residuo de la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
(es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para
combinarse, reaccionar o interaccionar química o
estructuralmente).
Con el fin de establecer la homología con la
estructura primaria, se compara directamente la secuencia de
aminoácidos de una \alpha-amilasa precursora con
la secuencia primaria de \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis, y particularmente con un conjunto de
residuos que son invariantes en todas las
\alpha-amilasas de las que se conocen las
secuencias (véase, por ejemplo, la Figura 7). También es posible
determinar los residuos equivalentes mediante análisis de la
estructura terciaria de las estructuras cristalinas presentadas para
la \alpha-amilasa pancreática porcina (Buisson y
col., EMBO Journal, vol. 6, pág. 3909-3916 (1987);
Qian y col., Biochemistry, vol. 33, pág. 6284-6294
(1994); Larson y col., J. Mol. Biol., vol. 235, pág.
1560-1584 (1994)); para la
Taka-amilasa A de Aspergillus oryzae
(Matsuura y col., J. Eiochem. (Tokio), vol. 95, pág.
697-702 (1984)); y para una
\alpha-amilasa ácida de A. niger (Boel y col.,
Biochemistry, vol. 29, pág. 6244-6249 (1990)),
siendo las dos estructuras anteriores similares, y para la
\alpha-amilasa de cebada (Vallee y col., J. Mol.
Biol., vol. 236, pág. 368-371 (1994); Kadziola, J.
Mol. Biol., vol. 239, pág. 104-121 (1994)). Aunque
se han publicado algunos estudios preliminares (Suzuki y col., J.
Biochem., vol. 108, pág. 379-381 (1990); Lee y col.,
Arch. Biochem. Biophys., vol. 291, pág. 255-257
(1991); Chang y col., J. Mol. Biol., vol. 229, pág.
235-238 (1993); Mizuno y col., J. Mol. Biol., vol.
234, pág. 1282-1263 (1993)), sólo existe una
estructura publicada para la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis (Machius y col., J. Mol. Biol., vol.
246, pág. 545-549 (1995)). Sin embargo, varios
investigadores han predicho estructuras
super-secundarias comunes entre las glucanasas
(MacGregor y col., Biochem. J., vol. 259, pág.
145-152 (1989)) y dentro de las
\alpha-amilasas y otras enzimas metabolizadoras de
almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem., vol. 12, pág.
791-805 (1993); MacGregor, Starke, vol. 45, pág.
232-237 (1993)); y las similitudes de secuencia
entre enzimas con estructuras super-secundarias
similares a las de las \alpha-amilasas (Janecek,
FEBS Letters, vol. 316, pág. 23-26 (1993); Janecek y
col., J. Prot. Chem., vol. 12, pág. 509-514 (1993)).
Se ha modelado una estructura para la enzima de Bacillus stear of
thermophilus sobre la de la Taka-amilasa A (Holm
y col., Protein Engineering, vol. 3, pág. 181-191
(1990)). Las cuatro regiones altamente conservadas mostradas en la
Figura 7 contienen muchos residuos que se cree forman parte del
centro activo (Matsuura y col., J. Biochem. (Tokio), vol. 95, pág.
697-702 (1984); Buisson y col., EMBO Journal, vol.
6, pág. 3909-3916 (1987); Vihinen y col., J.
Biochem., vol. 107, pág. 267-272 (1990)), incluyendo
His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 y Asp +328, según
el sistema de numeración del Bacillus licheniformis.
La \alpha-amilasa de la
invención comprende una sustitución que se corresponde con N1885 o
N188T de Bacillus licheniformis. También de forma preferible,
la \alpha-amilasa comprende además la eliminación
o la sustitución de un residuo de metionina o de triptófano.
Las \alpha-amilasas de acuerdo
con la presente invención presentan unas características de
prestaciones alteradas, que proporcionan unos resultados deseables e
inesperados que son útiles en las diversas aplicaciones para las que
se usan habitualmente las \alpha-amilasas. Por
ejemplo, las \alpha-amilasas de acuerdo con la
presente invención que presentan unas características de
prestaciones alteradas a bajo pH, incluyendo una estabilidad térmica
mejorada, una estabilidad con el pH mejorada y/o una estabilidad
oxidativa mejorada, son útiles en la licuefacción del almidón a pH
bajo. La estabilidad térmica mejorada será útil para aumentar la
vida media de los productos que las incorporan. La estabilidad
oxidativa mejorada o las prestaciones mejoradas son particularmente
deseables en los productos de limpieza, y para aumentar la vida
media de la \alpha-amilasa en presencia de lejía,
perborato, percarbonato o perácidos, usados en dichos productos de
limpieza. Por el contrario, una estabilidad térmica reducida o una
estabilidad oxidativa reducida pueden ser útiles en procesos
industriales que requieran una parada rápida y eficaz de la
actividad amilolítica.
La \alpha-amilasa de la
presente invención es especialmente útil en el procesado de almidón
y particularmente en la licuefacción de almidón. Las condiciones
presentes durante la licuefacción comercialmente deseable
característicamente incluyen un pH bajo, una temperatura elevada y
unas condiciones potencialmente oxidantes que requieren
\alpha-amilasas que presenten unas prestaciones
mejoradas a pH bajo, una estabilidad térmica mejorada y una
estabilidad oxidativa mejorada. Del mismo modo, las
\alpha-amilasas de acuerdo con la presente
invención que son particularmente útiles en la licuefacción exhiben
unas prestaciones mejoradas a pH por debajo de aproximadamente 6,
preferiblemente por debajo de aproximadamente 5,5, y más
preferiblemente entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 5,5.
Adicionalmente, serán especialmente útiles las
\alpha-amilasas de acuerdo con la presente
invención que exhiben una estabilidad térmica aumentada a
temperaturas de entre 80 y 120ºC, y preferiblemente de entre
aproximadamente 100 y 110ºC, y una estabilidad mejorada en presencia
de oxidantes. Preferiblemente, la \alpha-amilasa
usada en licuefacción de acuerdo con la presente invención, además
de la sustitución de la asparagina, comprende una eliminación o una
sustitución en uno o más residuos correspondientes a M15, V128,
H133, W138, S187, M197 y/o A209 del Bacillus licheniformis.
La \alpha-amilasa usada en la licuefacción de
almidón de acuerdo con la presente invención comprende una
sustitución correspondiente a M188S o N188T. Más preferiblemente, la
amilasa comprende una sustitución correspondiente a M15T/N188S,
M15L/N188S, M15T/H133Y/N188S, M15T/H133Y/N18BS/A209V,
M15T/N188S/A209V, M15T/V128E/ H133Y/N188S ó M15T/S187D/N188S, de
Bacillus licheniformis.
Se pueden añadir otros componentes adicionales
conocidos por los especialistas de la técnica que son útiles en la
licuefacción, incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, calcio, iones,
sales u otras enzimas tales como endoglicosidasas, celulasas,
proteasas, lipasas u otras enzimas de amilasa, dependiendo de las
condiciones de reacción pretendidas. Por ejemplo, las combinaciones
de las enzimas de \alpha-amilasa de acuerdo con la
presente invención con \alpha-amilasas procedentes
de otras fuentes, pueden proporcionar unos perfiles de acción únicos
que presenten uso concreto en condiciones de licuefacción
específicas. En concreto, se contempla que la combinación de una
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención con una \alpha-amilasa derivada de
Bacillus stearothermophilus proporcionará una licuefacción
potenciada a valores de pH por debajo de 5,5 debido a patrones de
acción complementarios. Una realización preferida, en la que el
proceso implica la licuefacción de almidón seco molido para la
producción de etanol, comprende \alpha-amilasa
derivada de Bacillus stearothermophilus y
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención que tiene una sustitución correspondiente a M15T/N18BS o a
M15L/N1SBS de Bacillus licheniformis.
Durante la licuefacción, el almidón,
especialmente las mezclas de almidón granular procedentes de un
proceso de molienda en húmedo o en seco, se trata con una
\alpha-amilasa de la presente invención de acuerdo
con técnicas de licuefacción conocidas. Generalmente, en la primera
etapa del proceso de degradación de almidón, la mezcla de almidón se
gelatiniza mediante calefacción a una temperatura relativamente
elevada (entre aproximadamente 80ºC y aproximadamente 110ºC).
Después de que la mezcla de almidón se gelatiniza, se licua usando
una \alpha-amilasa.
En otra realización de la presente invención, se
proporcionan composiciones detergentes en forma líquida, del gel o
granular, que comprenden la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención. Dichas composiciones detergentes
se beneficiarán particularmente de la adición de una
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención que haya aumentado la estabilidad térmica para mejorar la
vida media, o que haya incrementado la estabilidad oxidativa de tal
modo que la \alpha-amilasa haya mejorado la
resistencia frente a compuestos de lejía o perecidos, comúnmente
presentes en los detergentes. Por tanto, la
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención puede formularse de forma ventajosa en detergentes
conocidos en polvo, líquido o gel, que tengan un pH de entre
aproximadamente 6,5 y aproximadamente 12,0. Una realización
preferida de la presente invención comprende además la eliminación o
la sustitución de un residuo de metionina o de un residuo de
triptófano, por ejemplo M15, M197 o W138, tal como se describe en
las Solicitudes de Patente asignadas en común de EE.UU. con Nº de
Serie 08/289.351 y 08/409.771, la sustitución en M133Y tal como se
describe en la Publicación PCT Nº WO 91/00353; o la sustitución en
A209 tal como se describe en DeClerck, y col., J. Biol. Chem., vol.
265, pág. 15481-15488 (1990). Asimismo, una
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención usada en composiciones detergentes comprende la
sustitución correspondiente a N188S o a N188T de Bacillus
licheniformis. Las composiciones detergentes que comprenden la
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención pueden incluir además otras enzimas tales como las
endoglicosidasas, las celulasas, las proteasas, las lipasas u otras
enzimas de amilasa, particularmente \alpha-amilasa
derivada de Bacillus stearothermophilus, así como
ingredientes adicionales conocidos de forma general en la
técnica.
Las realizaciones de la presente invención que
comprenden una combinación de la \alpha-amilasa de
acuerdo con la presente invención con enzimas de proteasa
preferiblemente incluyen proteasas oxidativamente estables tales
como las descritas en el documento de EE.UU. Re. 34.606, incorporado
en la presente memoria a modo de referencia, así como enzimas
comercialmente disponibles tales como DURAZYM (Novo Nordisk),
MAXAPEM (Gist-brocades) y PURAFECT® OxP (Genencor
Internacional, Inc.). En el documento de EE.UU. Re. 34.606 se
describen los métodos para fabricar dichos mutantes de proteasa
(proteasas oxidativamente estables), y particularmente los mutantes
que tengan una sustitución para la metionina de la posición
equivalente a M222 de Bacillus amyloliquefaciens.
Una realización adicional de la presente
invención comprende ADN que codifica una
\alpha-amilasa de acuerdo con la presente
invención y vectores de expresión que comprenden dicho ADN. Las
secuencias de ADN se pueden expresar ligándolos operativamente a una
secuencia de control de expresión en un vector de expresión
apropiado, y empleando dicho vector de expresión para transformar un
hospedante adecuado siguiendo técnicas bien conocidas. Se puede
emplear una amplia variedad de combinaciones hospedante/vector de
expresión para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los
vectores de expresión útiles, por ejemplo, incluyen segmentos de
secuencias de ADN sintéticas y no cromosomales, tales como los
diversos plásmidos y fagos que se saben son útiles para este
propósito. Adicionalmente, en estos vectores generalmente se usa
cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de
expresión. Por ejemplo, los Solicitantes han descubierto que una
secuencia de control de expresión preferida para transformantes de
Bacillus es el péptido señal aprE derivado de
Bacillus subtilis.
También son útiles una amplia variedad de
células hospedantes en la expresión de secuencias de ADN de esta
invención. Estos hospedantes pueden incluir hospedantes eucarióticos
y procarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, diversos hongos, levaduras
y células animales. Preferiblemente, el hospedante expresa la
\alpha-amilasa de la presente invención
extracelularmente para facilitar la purificación y el procesado
posterior. La expresión y la purificación de la
\alpha-amilasa mutante de la invención se pueden
efectuar con medios reconocidos en la técnica para llevar a cabo
dichos procesos.
Las \alpha-amilasas mejoradas
de acuerdo con la presente invención proporcionan varias ventajas
importantes en comparación con las \alpha-amilasas
naturales de Bacillus. Por ejemplo, una ventaja es el aumento
de actividad observado al pH bajo y a las altas temperaturas típicas
de los métodos comunes de licuefacción de almidón. Otra ventaja es
la mejora en la estabilidad oxidativa y a pH alto que facilita su
uso en detergentes. Otra ventaja es que se logra una hidrólisis más
completa de las moléculas de almidón, lo que reduce el almidón
residual en la corriente de proceso. Otra ventaja más es el aumento
de estabilidad en ausencia de ión calcio. Otra ventaja adicional es
que la adición de dosis iguales de proteínas de
\alpha-amilasa de acuerdo con la invención
proporciona unas prestaciones superiores en comparación con la
\alpha-amilasa natural de Bacillus
licheniformis debido a mejoras tanto en la actividad específica
como en la estabilidad en condiciones severas. En otras palabras,
debido al aumento general de la estabilidad de las amilasas de
acuerdo con la presente invención, el aumento de la actividad
específica sobre almidón de las amilasas de la invención se traduce
en beneficios de prestaciones potenciales incluso superiores en esta
variante. En condiciones en las que la enzima natural se desactiva,
no sólo sobrevive más cantidad de la amilasa de la invención debido
a su estabilidad mejorada, sino que también la que sobrevive expresa
proporcionalmente más actividad debido a su actividad
específica
mejorada.
mejorada.
Las siguientes descripciones se presentan a modo
de ejemplo y no pretenden constituir limitación alguna al alcance de
las reivindicaciones. Las abreviaciones usadas en la presente
memoria, particularmente las anotaciones de tres letras o de una
letra para los aminoácidos, se describen en Dale, J. W., Molecular
Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, (1989) Apéndice B.
Ejemplo
1
El gen de \alpha-amilasa
mostrado en la Figura 3 fue clonado a partir de NCIB8061 de
Bacillus licheniformis (Gray y col., J. Bacteriology, vol.
166, pág. 635-643 (1986)). El fragmento
PstI-SstI de 1,72 kb, que codifica los últimos tres
residuos de la secuencia señal, la proteína madura completa y la
región de terminación, fue subclonado en M13mp18. Se añadió un
terminador sintético entre las posiciones BclI y SstI usando una
casete de oligonucleótidos sintéticos de la forma:
designada para contener el
terminador transcripcional de subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens (Wells y col., Nucleic Acid Research, vol. 11,
pág. 7911-7925
(1983)).
El plásmido pBLapr se construyó portando el gen
de la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis. Como se muestra en la Figura 7, el pBLapr
comprende un plásmido de 6,1 kb que incluye el gen de resistencia a
ampicilina del pBR322 y el gen de resistencia a cloranfenicol del
pC194, el promotor aprE y el gen que codifica la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
("BL AA"). El promotor aprE se construyó a partir de un
fragmento HindIII-PstI de 660 pb que codifica el
promotor y la secuencia señal de la proteasa alcalina de Bacillus
subtilis. La posición PstI se eliminó, y se añadió una posición
SfiI cerca del cruce aprEI BL AA. El gen BL AA comprende el
fragmento PstI-SstI de 1720 pb descrito
anteriormente. En el trabajo descrito en la presente memoria, el
pBLapr se construyó con una posición SfiI adyacente al extremo 5'
del inicio de la secuencia de codificación del gen de amilasa
maduro. Específicamente, el extremo 5' de la construcción pBLapr fue
subclonado sobre un fragmento EcoRI-SstII procedente
de pBLapr en M138M20 (Boehringer Mannheim) para obtener un molde de
cadena codificadora para el oligonucleótido mutagénico
siguiente:
5'-CCC ATT AAG ATT GGC CGC
CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3'
Este prímero introdujo una posición SfiI
(indicada por el subrayado) que permitió la monitorización de formas
correctas a través de la presencia de esta posición de restricción
única. La subclonación del fragmento EcoRI-SstII de
vuelta al vector pBLapr proporcionó una versión del plásmido que
contenía una posición SfiI.
El plásmido pHP13 (Haima y col., Mol. Gen.
Genet., vol. 209, pág. 335-342 (1987)) (Figura 6)
fue digerido con enzimas de restricción EcoRI y HindIII, y el vector
resultante fue purificado sobre gel de poliacrilamida y a
continuación fue eluido. Se digirió el plásmido pBLapr con HindIII,
Asp718 y en una incubación aparte con Asp718, EcoRI y purificado con
gel. Se purificaron con gel dos bandas,
HindIII-Asp718 (1203 pb) y
Asp718-EcoRI (1253 pb), fueron eluidas del gel y
ligadas al vector mediante una unión de 3 vías, para dar lugar al
plásmido pHP.BL, el plásmido usado en la expresión de la
\alpha-amilasa (Figura 8).
Ejemplo
2
Se sintetizó una serie de prímeros mutagénicos
que codifican las sustituciones correspondientes a Asn 188
("N188") con cada uno de los aminoácidos naturales, y se
muestra en la Figura 1 (SEQ ID NOS: 4-22).
Etapa (1): Se usaron como moldes los prímeros
mutagénicos para los prímeros PCR A+ y PCR B-, dando como resultado
un ADN de cadena doble alargado (61 pb). Cada uno contenía un cambio
de aminoácidos diferente en la posición 188, y todos excepto el
N188M contenían una posición de restricción diferente. Inicialmente
se maduraron los prímeros PCR a 35ºC durante cinco minutos, seguido
de una extensión de ADN de un minuto con polimerasa taq a 75ºC. A
continuación el ADN de doble cadena fue fundido a 95ºC durante un
minuto, seguido de las etapas de maduración y extensión. Se continuó
con la fusión, la maduración y la extensión por un total de 30
ciclos.
Etapa (2): El ADN por encima y por debajo de la
posición 188 se fabricó en reacciones PCR separadas. El molde fue
pBLapr, y los prímeros PCR fueron LAAfs5 (SEQ ID NO: 27) y PCR A-
(SEQ ID NO: 24) para la parte por encima; y PCR B+ (SEQ ID NO: 25) y
PCR Cla-SalI (SEQ ID NO: 28) para el ADN por debajo.
Se fundió el ADN a 95ºC durante un minuto, se maduró a 45ºC durante
tres minutos y se alargó a 68ºC durante 3 minutos. La porción por
encima es de 290 pb y la de por debajo es de 498 pb. Se repitió este
procedimiento durante 18 ciclos usando polimerasa pfu. Se usó el
mismo procedimiento PCR en las Etapas (3) y (4).
Etapa (3): La porción por encima de ADN descrita
en la Etapa (2) se unió a los prímeros mutagénicos de doble cadena
descritos en la etapa (1). Se usaron los prímeros LAAfs5 (SEQ ID NO:
27) y PCR B- (SEQ ID NO: 26). Como resultado del diseño de prímeros
se produce un solapamiento de 24 pb entre estos moldes, lo que
permite la unión de las dos piezas de ADN.
Etapa (4): Las porciones por debajo de ADN
descritas en la Etapa (2) y el producto de la Etapa (3) se unieron
para formar el producto final. Un solapamiento de 24 pb entre los
dos productos PCR permite la unión. Los prímeros usados fueron
LAAfs5 (SEQ ID NO: 27) y PCR ClaI-SalI (SEQ ID NO:
28).
Etapa (5): Existen posiciones de restricción
únicas, Asp718 y BssHII, ubicadas por encima y por debajo,
respectivamente, de la posición 188. El producto PCR final se
digiere con Asp718 y BssHII, se aísla el fragmento de 333 pb
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se subclona en el
vector pHP.BL para obtener pHP.N188X.
Las mutaciones fueron confirmadas mediante
secuenciamiento didesoxi (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., vol. 74, pág. 5463-5467 (1977)).
En referencia a la secuencia de ADN y al sistema
de numeración usado en la Figura 3, el codón que codifica la
posición de aminoácido + 188 se encuentra en los pares base
812-814. Los prímeros PCR A+ y A- se corresponden
con los pares base 784-807. Los prímeros PCR B+ y B-
se corresponden con los pares base 821-844. El
extremo 5' del prímero PCR LAAfs5 se corresponde con el par base
518. El extremo 5' del prímero PCR denominado PCR
ClaI-SalI se corresponde con el par base 1317. La
posición Asp718 se corresponde con el par base 724. La posición
BssHII se corresponde con el par base 1053.
Ejemplo
3
Se construyó un plásmido pBLapr que tiene
treonina sustituida por metionina en el aminoácido 15 de acuerdo con
la Solicitud de Patente de EE.UU. con Nº de Serie 08/194.664
(Publicación PCT Nº WO 94/18314). Este plásmido (pBLaprM15T) fue
digerido con SfiI y Asp718, y el fragmento de 477 pares base fue
subclonado en pHP.BL para crear pHP.M15T. De un modo análogo al
descrito anteriormente, en el Ejemplo 1, se digirió el pHP.M15T con
Asp718 y BssHII, fue purificado con gel y eluido del gel. El
fragmento de 333 pares base que comprendía de Asp718 a BssHII y el
fragmento de pHP.N188S fueron subclonados a continuación en pHP.M15T
para proporcionar el plásmido pHP.M15T/N188S. De un modo análogo, se
construyó el plásmido pHP.M15L/N188Y partiendo de los plásmidos
pBLaprM15L y pHP.N188Y.
Ejemplo
4
Se expresó \alpha-amilasa en
Bacillus subtilis tras transformación con los plásmidos
descritos en los Ejemplos 1-3. El pHP13 es un
plásmido capaz de replicarse en E. coli y en Bacillus
subtilis. Se construyeron plásmidos que contenían diferentes
variantes usando la cepa MM294 de E. coli, los plásmidos se
aislaron y a continuación se transformaron en Bacillus
subtilis tal como se describe en Anagnostopoulos y col., J.
Bacter., vol. 81, pág. 741-746 (1961). La cepa de
Bacillus había sido eliminada para dos proteasas (\Deltaapr,
\Deltanpr) (véase, por ejemplo, Ferrari y col., Patente de EE.UU.
Nº 5.264.366) y para amilasa (\DeltaamyE) (véase, por
ejemplo, Stahl y col., J. Bacter., vol. 158, pág.
411-418 (1984)). Se observó que la cepa de bacillus
que expresa M15L/N188Y forma zonas más grandes de eliminación que la
cepa que expresa M15L en placas de agar que contienen un 1% de
almidón insoluble, lo que indica un aumento en el actividad
amilolítica. Tras la transformación, se introdujo la mutación
sacU(Hy) (Henner y col., J. Bacter., vol. 170, pág.
296-300 (1988)) mediante transducción mediada por
PBS-1 (Hoch, J. Bact., vol. 154, pág.
1513-1515
(1983)).
(1983)).
Las amilasas segregadas fueron recuperadas de
forma rutinaria de cultivos de Bacillus subtilis como se indica a
continuación: el sobrenadante del cultivo se ajustó a 20% de sulfato
de amonio saturado y se agitó durante una hora a 4ºC. Tras
centrifugar, el sobrenadante resultante fue ajustado al 70% de
sulfato amonio saturado y se agitó durante una hora a 4ºC. Tras
centrifugación del sobrenadante, la partícula resultante fue
redisuelta en acetato sódico 50 mM, pH 6,0, cloruro cálcico 5 mM, y
fue filtrado en condiciones de esterilidad.
Ejemplo
5
Ensayo de Sustrato Soluble: se desarrolló
un ensayo cinético basado en un kit de ensayo de punto final
suministrado por Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. Se disolvió un vial de
sustrato (maltoheptaósido dep-nitrofenilo, BPNPG7)
en 10 mL de agua esterilizada seguido de una dilución 1:4 en tampón
de ensayo (tampón de maleato 50 mM, pH 6,7, cloruro cálcico 5 mM,
Tween20 al 0,002%). Los ensayos se realizaron mediante la adición de
10 \muL de amilasa a 790 \muL del sustrato en una cubeta a 25ºC.
Se midieron las velocidades de hidrólisis como la velocidad de
cambio de la absorbancia a 410 nm, tras un retraso de 75 segundos.
El ensayo fue lineal hasta velocidades de 0,2 unidades de
absorción/min.
La concentración de proteína de
\alpha-amilasa se midió usando el Ensayo
Bio-Rad estándar (Bio-Rad
Laboratorios), basado en el método de Bradford, Anal. Biochem., vol.
72, pág. 248 (1976), usando patrones de albúmina de suero
bovino.
Ensayo de Hidrólisis de Almidón: se
determinó la actividad de \alpha-amilasa sobre
almidón mediante un ensayo que depende de la capacidad del almidón
para formar un complejo de color azul con yodo, y de la desaparición
de dicho color cuando el almidón se hidroliza para dar moléculas de
dextrina más cortas. La actividad de
\alpha-amilasa se definió en términos del tiempo
de digestión requerido para producir un cambio de color que denote
un estado definitivo de la dextrinación del almidón.
Los reactivos usados fueron los que se indican a
continuación:
Tampón de fosfato: se disolvió
dihidrogenofosfato potásico (340 g) e hidróxido sódico (25,3 g) en
agua y se diluyó hasta dos litros. Se enfrió el tampón hasta
temperatura ambiente y se ajustó el pH a 6,2 \pm 0,1. Se diluyó el
tampón hasta dos litros en un matraz volumétrico.
Sustrato de almidón: se suspendieron diez
gramos (sustancia seca) de almidón lintner en 50 mL de agua y fueron
lavados en 300 mL de agua hirviendo. Se llevó de nuevo la disolución
a ebullición y se hirvió durante cinco minutos manteniendo una
agitación constante. Se enfrió la disolución de almidón con
agitación constante hasta temperatura ambiente y se añadieron 125 mL
de tampón de fosfato. La disolución se diluyó hasta 500 mL con agua.
El sustrato de almidón se renovó diariamente.
Disolución de yodo de reserva: Se
disolvieron cristales de yodo (5,5 g) y yoduro potásico (11,0 g) en
agua y se diluyeron volumétricamente hasta 250 mL. La disolución se
mantuvo apartada de la luz.
Disolución de yodo diluida: se disolvió
yoduro potásico (20 g) y dos mL de disolución de yodo de reserva en
agua y se diluyó hasta 500 mL. La disolución se renovó a diario.
Disolución de dilución de enzima: se
disolvió cloruro cálcico (1,1 g) en cuatro litros de agua. El agua
utilizada para todos los reactivos era destilada o desionizada.
Se diluyó una muestra de
\alpha-amilasa hasta 10-15 UL/mL
(tal como se definen más adelante) con disolución de dilución de
enzima. Para muchas preparaciones comerciales de
\alpha-amilasa se descubrió que una relación de
dilución adecuada era de 2000 a 1. Se dispensaron alícuotas de cinco
mililitros de disolución de yoduro diluida en tubos de ensayo de 13
x 100 mm, y se colocaron 10 mL de sustrato de almidón en un tubo de
ensayo de 23 x 200 mm. Todos los tubos fueron llevados al baño de
agua a 30ºC. Se usó un comparador Hellige equipado con un disco de
color de \alpha-amilasa especial (número de
catálogo 620-s5) para realizar las lecturas. Se
mezclaron cinco mililitros de enzima diluida (también a 30ºC) con el
sustrato de almidón y se comenzó con la medida del tiempo. A
intervalos de tiempo apropiados, por ejemplo intervalos de un minuto
al principio de la reacción y a intervalos de 15 segundos al final,
se transfirieron alícuotas de un mililitro de la mezcla
enzima-sustrato a un tubo que contenía la disolución
de yoduro diluida. La disolución de yoduro de almidón se mezcló y se
transfirió a un tubo cuadrado de precisión de 13 mm, y se comparó el
color con el disco de color de \alpha-amilasa
patrón del comparador Hellige. Cuando se alcanzó el punto final, se
extrajeron las muestras a intervalos de 0,25 minutos.
Se registró el tiempo requerido para que los
colores de las muestras y el del disco de color coincidieran, y se
calculó la actividad (en unidades de licuefacción por gramo o por
mL) de acuerdo con la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
UL/mL \ ó \
UL/g = \left\{\frac{570}{Vxt}\right\} x
D
donde:
UL = unidad de licuefacción.
V = volumen de enzima (5 mL o 5 gramos).
t = tiempo de dextrinización (minutos).
D = factor de dilución: volumen de dilución
dividido por los mL o por los g de enzima diluida.
Las \alpha-amilasas mutantes
de acuerdo con la invención preparadas según los Ejemplos
1-4 fueron evaluadas para determinar su actividad
específica sobre almidón y sustrato soluble. Los resultados,
mostrados en la Tabla 1, muestran que la amilasa mutante de acuerdo
con la invención proporciona un perfil de actividad superior con
ambos sustratos, en comparación con la
\alpha-amilasa natural AA20.
\vskip1.000000\baselineskip
| Actividad Específica de Determinadas \alpha-Amilasas sobre Sustrato Soluble y | ||
| Almidón en Porcentaje de Actividad Natural | ||
| \alpha-Amilasa | Ensayo de Sustrato Soluble | Ensayo de Hidrólisis de Almidón |
| Spezyme® AA20 | 100 | 100 |
| M15T/N188S | 212 | 166 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La licuefacción de almidón se llevó a cabo
usando un reactor compuesto por 15,26 m de tubo de acero inoxidable
de 0,6096 cm de diámetro (0,5334 cm de diámetro interno) enrollado
en una bobina de aproximadamente 25,4 cm de diámetro y 13,97 cm de
alto. Se equipó la bobina con un mezclador en línea estático de 29,1
cm (Cole-Palmer
nºG-04669-60) montado a 1,22 m del
extremo anterior. El extremo posterior de la bobina fue equipado con
una válvula de alivio de presión ajustable en línea Swagelok (nº
SS-4CA-3) fijada en un presión de
rotura de aproximadamente 1,37 bar. Se alimentó la mezcla de almidón
a la bobina con un caudal de 70 mL/minuto con una bomba de pistón.
Se mantuvo la temperatura del reactor de bobina a 105,5ºC
sumergiéndolo en un baño de glicero-agua. Se mantuvo
la temperatura del baño usando un controlador de
temperatura/calefactor de recirculación (Fisher Scientific modelo
7305).
Normalmente la licuefacción de almidón a escala
de planta piloto se llevó a cabo usando un propulsor de vapor M
103-M equipado con una bobina de retraso de 2,5
litros detrás de la cámara de mezcla y con una válvula de presión
trasera terminal. Se alimentó almidón al propulsor mediante una
bomba Moyno y se suministró vapor mediante una línea a 10,27 bar,
reducida hasta 6,16-6,84 bar. Se instalaron sondas
de temperatura justo después del chorro hidrocalefactor y justo
antes de la válvula de presión trasera. Se introdujo almidón al
propulsor con un caudal de aproximadamente 350 mL/min. Se mantuvo la
temperatura del chorro en 105-107ºC. Se
transfirieron muestras de almidón desde el horno del chorro hasta
una segunda etapa de licuefacción a 95ºC y se mantuvieron durante 90
minutos.
Se obtuvo almidón granular con un molino de maíz
en húmedo y se usó en los dos días siguientes a su obtención. Se
diluyó el almidón hasta un nivel de sólidos deseado de
aproximadamente 30-35% en sólido seco con agua
desionizada, y se ajustó el pH con NaOH al 2,5% o con HCl al 6%,
según se requiriese. Se añadió calcio en forma de
CaCl_{2}·2H_{2}O. Las condiciones de licuefacción típicas
fueron:
| Almidón | 30%-35% en sólidos |
| Calcio | 40-60 ppm (30 ppm añadidas) |
| pH | 5,0-6,0 |
| \alpha-amilasa | 12-14 UL/g de carbohidrato (en base seca) |
Las muestras de almidón fueron transferidas
desde el reactor hasta una segunda etapa de baño de licuefacción a
95ºC y se mantuvieron durante 90 minutos. Se midió el grado de
licuefacción de almidón inmediatamente después de la segunda etapa
de licuefacción determinando el equivalente de dextrosa (ED) de la
muestra de acuerdo con el método descrito en Standard Analytical
Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association,
Inc., sexta edición, Analytical Procedure Committee (1980).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se comparó \alpha-amilasa que
comprende la sustitución M15T/N188S hecha como se indica en los
Ejemplos 1-4 con \alpha-amilasa
natural derivada de Bacillus licheniformis (Spezyme® AA20,
disponible comercialmente en Genencor Internationl, Inc.) en la
licuefacción a 105,5ºC. Tal como se muestra en la Tabla 2, las
enzimas mutantes proporcionaron unas prestaciones significativamente
mejoradas en la licuefacción en chorro de almidón, especialmente a
pH bajo. La licuefacción a escala de planta piloto se llevó a cabo
con una primera etapa de licuefacción a 105,5ºC y una segunda etapa
de licuefacción a 95ºC. Se añadió amilasa a 12 UL/g de carbohidrato
(base seca).
\vskip1.000000\baselineskip
| Comparativa de Prestaciones de Licuefacción de \alpha-Amilasas a 105,5ºC | ||
| Amilasa | pH | ED |
| Spezyme® AA20 (Media de Dos Experimentos) | 6,0 | 9,85 |
| G11 (Media de Cuatro Experimentos) | 6,0 | 12,2 |
| Spezyme® AA20 | 5,5 | 5,4 |
| G11 (Media de Dos Experimentos) | 5,5 | 8,7 |
| Spezyme® AA20 | 5,2 | 1,8 |
| G11 | 5,2 | 3,0 |
\newpage
Ejemplo
8
Se comparó \alpha-amilasa que
comprende la sustitución M15T/N188S hecha como se indica en los
Ejemplos 1-4 con \alpha-amilasa
natural derivada de Bacillus licheniformis (Spezyme® AA20,
disponible comercialmente en Genencor Internationl, Inc.) en la
licuefacción a 107ºC. Tal como se muestra en la Tabla 3, las enzimas
mutantes proporcionaron unas prestaciones significativamente
mejoradas en la licuefacción en chorro de almidón, especialmente a
pH bajo, tal como demuestra el valor de ED, durante el proceso de
licuefacción. La licuefacción a escala de planta piloto se llevó a
cabo con una primera etapa de licuefacción a 107ºC y una segunda
etapa de licuefacción a 95ºC. Se añadió amilasa a 12 UL/g de
carbohidrato (base seca).
\vskip1.000000\baselineskip
| Comparativa de Prestaciones de Licuefacción de \alpha-Amilasas a 107ºC | ||
| Variante | pH | ED |
| AA20 | 6,0 | 7,4 |
| G11 | 6,0 | 11,6 |
| AA20 | 5,5 | 3,5 |
| G11 | 5,5 | 6,0 |
| AA20 | 5,2 | 0 |
| G11 | 5,2 | 1,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se investigó intensivamente las prestaciones de
licuefacción relativas del Spezyme® AA20 y de la variante
M15T/
N188S con un diseño de experimentos estadístico. Usando el programa "X-STAT", Versión 2.0 (Copyright, Wiley Scientific and Technical Software, John Wiley & Sons, Nueva Cork, (1992)), se diseñó un experimento factorial Box-Behnken; variando la temperatura de licuefacción primaria entre 106ºC y 110ºC, el pH de licuefacción entre pH 5,3 y pH 6,0, y el nivel de calcio total del sustrato de almidón entre 30 ppm y 90 ppm. Los datos de las Tablas 4 y 5, que forman la base de este experimento, se generaron con 15 licuefacciones de escala planta piloto, usando 12 UL/gramo de sustrato sólido seco de Spezyme® AA20 y M15T/N188S. A continuación los datos se ajustaron a modelos cuadráticos. Para la variante M15T/N188S, los datos se ajustaron a la ecuación ED = 842,41 + 28,374 x pH - 17,557 x Temperatura + 1,5005 x Concentración de Calcio + 1,6243 (pH x Temperatura) - 0,081506 (pH x Concentración de Calcio) - 0,0092099 (Temperatura x Concentración de Calcio) - 16,841 (pH)^{2} + 0,038379 (Temperatura)^{2} - 0,000124 (Concentración de Calcio)^{2}, con un error estándar sobre la regresión de 1,313 y con una variación explicada sobre la media (R)^{2} de 93,99%. Para el Spezyme® AA20, los datos se ajustaron a la ecuación ED = -652,0 + (132,35 x pH) - (4,716 x Temperatura) + (1,3989 x Concentración de Calcio) - 0,050515 (pH x Temperatura) - 0,019603 (pH x Concentración de Calcio) - 0,011118 (Temperatura x Concentración de Calcio) - 10,206 (pH)^{2} + 0,02104 (Temperatura)^{2} - 0,000522 (Concentración de Calcio)^{2}. Con un error estándar sobre la regresión de 0,5772 y con una variación explicada sobre la media (R)^{2} de 98,69%, estas ecuaciones se usaron para preparar figuras de ED frente al pH, frente a la Concentración de Calcio y frente a la Temperatura. Las representaciones bidimensionales de los datos a 107ºC y a 60 ppm de Ca+ se presentan en las Figura 10-12, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 10-12, la amilasa mutante supera a la amilasa natural permitiendo una licuefacción más eficaz del almidón a pH bajo, bajos niveles de calcio y alta temperatura.
N188S con un diseño de experimentos estadístico. Usando el programa "X-STAT", Versión 2.0 (Copyright, Wiley Scientific and Technical Software, John Wiley & Sons, Nueva Cork, (1992)), se diseñó un experimento factorial Box-Behnken; variando la temperatura de licuefacción primaria entre 106ºC y 110ºC, el pH de licuefacción entre pH 5,3 y pH 6,0, y el nivel de calcio total del sustrato de almidón entre 30 ppm y 90 ppm. Los datos de las Tablas 4 y 5, que forman la base de este experimento, se generaron con 15 licuefacciones de escala planta piloto, usando 12 UL/gramo de sustrato sólido seco de Spezyme® AA20 y M15T/N188S. A continuación los datos se ajustaron a modelos cuadráticos. Para la variante M15T/N188S, los datos se ajustaron a la ecuación ED = 842,41 + 28,374 x pH - 17,557 x Temperatura + 1,5005 x Concentración de Calcio + 1,6243 (pH x Temperatura) - 0,081506 (pH x Concentración de Calcio) - 0,0092099 (Temperatura x Concentración de Calcio) - 16,841 (pH)^{2} + 0,038379 (Temperatura)^{2} - 0,000124 (Concentración de Calcio)^{2}, con un error estándar sobre la regresión de 1,313 y con una variación explicada sobre la media (R)^{2} de 93,99%. Para el Spezyme® AA20, los datos se ajustaron a la ecuación ED = -652,0 + (132,35 x pH) - (4,716 x Temperatura) + (1,3989 x Concentración de Calcio) - 0,050515 (pH x Temperatura) - 0,019603 (pH x Concentración de Calcio) - 0,011118 (Temperatura x Concentración de Calcio) - 10,206 (pH)^{2} + 0,02104 (Temperatura)^{2} - 0,000522 (Concentración de Calcio)^{2}. Con un error estándar sobre la regresión de 0,5772 y con una variación explicada sobre la media (R)^{2} de 98,69%, estas ecuaciones se usaron para preparar figuras de ED frente al pH, frente a la Concentración de Calcio y frente a la Temperatura. Las representaciones bidimensionales de los datos a 107ºC y a 60 ppm de Ca+ se presentan en las Figura 10-12, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 10-12, la amilasa mutante supera a la amilasa natural permitiendo una licuefacción más eficaz del almidón a pH bajo, bajos niveles de calcio y alta temperatura.
| pH | Temperatura (ºC) | Calcio (ppm) | Equivalentes de Dextrosa Observados (M15T/N188S) |
| 6,00 | 110,2 | 60,0 | 9,8 |
| 6,00 | 105,9 | 60,0 | 11,7 |
| 5,30 | 110,2 | 60,0 | 2,1 |
| 5,30 | 106,5 | 60,0 | 8,1 |
| 6,00 | 108,0 | 90,0 | 11,3 |
| 6,00 | 107,6 | 30,0 | 10,3 |
| 5,30 | 108,4 | 90,0 | 5,9 |
| 5,30 | 108,5 | 30,0 | 1,7 |
| 5,65 | 110,2 | 90,0 | 9,5 |
| 5,65 | 109,8 | 30,0 | 9,9 |
| 5,65 | 106,0 | 90,0 | 11,9 |
| 5,65 | 105,5 | 30,0 | 9,9 |
| 5,65 | 107,8 | 60,0 | 9,5 |
| 5,65 | 108,1 | 60,0 | 9,6 |
| 6,00 | 108,3 | 60,0 | 11,6 |
| pH | Temperatura (ºC) | Calcio (ppm) | Equivalentes de Dextrosa Observados (Spezyme® AA20) |
| 6,00 | 110,0 | 60 | 7,4 |
| 6,00 | 106,2 | 60 | 9,9 |
| 5,30 | 109,7 | 60 | 0,6 |
| 5,30 | 105,8 | 60 | 2,9 |
| 6,00 | 108,3 | 90 | 8,5 |
| 6,00 | 108,4 | 30 | 7,8 |
| 5,30 | 108,6 | 90 | 1,2 |
| 5,30 | 107,5 | 30 | 0,4 |
| 5,65 | 110,0 | 90 | 4,1 |
| 5,65 | 109,5 | 30 | 4,0 |
| 5,65 | 106,8 | 90 | 8,6 |
| 5,65 | 106,0 | 30 | 6,4 |
| 5,65 | 107,8 | 60 | 6,1 |
| 5,65 | 109,0 | 60 | 5,9 |
| 5,65 | 109,0 | 60 | 5,9 |
Aunque la invención se ha descrito en términos
de diversas realizaciones preferidas, el especialista en la técnica
apreciará que se pueden realizar diversas modificaciones,
sustituciones, omisiones y cambios sin alejarse del espíritu y del
alcance la misma. Del mismo modo, se pretende que el alcance de la
presente invención esté limitado únicamente por el alcance de las
reivindicaciones mostradas más adelante, incluyendo aspectos
equivalentes de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se prepararon alfa-amilasas
mutantes que presentaban sustituciones en una o más posiciones
V128E, H133Y, S187D y/o A209V, generalmente de acuerdo con los
procedimientos proporcionados en los Ejemplos 1-4,
excepto que se proporcionaron los prímeros PCR apropiados para
efectuar las mutaciones deseadas. Se purificaron las amilasas hasta
un punto en el que la \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis natural mostró una actividad
específica de 1087 UL/mg de proteína. La concentración de proteína
se determinó mediante absorción a 278 nm, usando un coeficiente de
Extinción Molar de enzima natural de 143.255 M^{-1} cm^{-1}.
Se midieron las velocidades de desactivación
térmica correspondientes a los diversos mutantes de acuerdo con el
siguiente procedimiento. Se sometió a diálisis disoluciones de
reserva de amilasa de forma intensiva en acetato de amonio 20 mM,
CaCl_{2} 4 mM, pH 6,5. Para medir la estabilidad, esta reserva se
diluyó en >50 veces en acetato de amonio 50 mM, CaCl_{2} 5 mM,
Tween 20 al 0,02%, pH 5,0, hasta una concentración final de entre 30
y 50 \mug/mL. Se colocaron seis alícuotas de 100 \muL en tubos
eppendorf y se llevaron a un baño de agua a 83ºC. Los tubos
eppendorf se retiraron a intervalos de tiempo medidos regulares de
entre 30 segundos y 5 minutos, y se colocaron en hielo para detener
la desactivación. Se determinó la actividad residual usando un
sustrato soluble tal como se describe en el Ejemplo 5. Se representó
el logaritmo natural de la actividad frente al tiempo de incubación,
y se obtuvo la constante cinética de la desactivación a partir de la
pendiente de la línea recta. En la Tabla 6 se proporcionan los
resultados correspondientes a varios mutantes.
\vskip1.000000\baselineskip
| Amilasa | Constante de Desactivación, | Vida Media | Mejora sobre la |
| k (min^{-1}) | (ln2/k) (min) | variante natural | |
| Natural | 1,2 | 0,56 | 1,0 |
| M15T/N188S | 0,81 | 0,86 | 1,5 |
| M15L/N188S | 0,76 | 0,91 | 1,6 |
| M15T/H133Y | 0,39 | 1,8 | 3,2 |
| M15T/H133Y/N188S | 0,31 | 2,2 | 4,0 |
| M15T/N188S/A209V | 0,27 | 2,5 | 4,5 |
| M15T/H133Y/N188S/A209V | 0,054 | 13 | 23 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se prepararon \alpha-amilasas
que comprenden las sustituciones M15T/N188S ó M15T/H133Y/N188S como
se indica en los Ejemplos 1-4 y 10, y se compararon
en estudios de licuefacción como en el Ejemplo 6. La licuefacción se
llevó a cabo a 105,5ºC con una etapa secundaria de 90 minutos a 95ºC
en condiciones que incluyen 94 ppm de SO_{2} con amilasa en una
concentración de 16 UL/g de carbohidrato (en base seca). Los
resultados se presentan en la Tabla 7, mostrada a continuación.
| Amilasa | pH | ED |
| M15T/N188S | 5,50 | 11,6 |
| M15T/H133Y/N188S | 5,50 | 13,9 |
| M15T/N188S | 5,35 | 7,8 |
| M15T/H133Y/N188S | 5,35 | 10,0 |
| M15T/N188S | 5,20 | 3,2 |
| M15T/H133Y/N188S | 5,20 | 5,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se prepararon \alpha-amilasas
que comprenden diversas sustituciones como se indica en los Ejemplos
1-4 y 10, y se compararon en estudios de
licuefacción como en el Ejemplo 6. La licuefacción se llevó a cabo a
105,5ºC en condiciones que incluyen un pH de 5,50, 95 ppm de
SO_{2} con amilasa en una concentración de 12 UL/g de carbohidrato
(en base seca). Los resultados se presentan en la Tabla 8, mostrada
a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Amilasa | Calcio Añadido | ED |
| M15T/V128E/H133Y/N188S | 44 | 11,8 |
| M15T/H133Y/N188S | 44 | 12,4 |
| M15T/N188S | 44 | 9,9 |
| M15T/V128E/H133Y/N188S | 0 | 8,9 |
| M15T/H133Y/N188S | 0 | 7,6 |
| M15T/N188S | 0 | 4,9 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se prepararon \alpha-amilasas
que comprenden diversas sustituciones como se indica en los Ejemplos
1-4 y 10, y se compararon en estudios de
licuefacción como en el Ejemplo 6. La licuefacción se llevó a cabo a
105,5ºC en condiciones que incluyen 98 ppm de SO_{2} con amilasa
en una concentración de 19 UL/g de carbohidrato (en base seca). Se
mezcló almidón de maíz secado (almidón de maíz Clinton Brand
106-B Pearl, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) con
agua desionizada (aproximadamente 23 Kg en aproximadamente 50
litros), y se dejó hidratar durante 16 horas. Los resultados se
presentan en la Tabla 9, mostrada a continuación.
| Amilasa | pH | ED |
| M15T/H133Y/N188S | 5,00 | 6,8 |
| M15T/H133Y/N188S/A209V | 5,00 | 10,0 |
| M15T/H133Y/N188S | 5,25 | 11,6 |
| M15T/H133Y/N188S/A209V | 5,25 | 13,2 |
| M15T/H133Y/N188S | 5,50 | 14,3 |
| M15T/H133Y/N188S/A209V | 5,50 | 15,9 |
Ejemplo
14
Se prepararon \alpha-amilasas
que comprenden la sustitución en M15T/S187D/ N188S como se indica en
los Ejemplos 1-4 y 10, y se compararon en estudios
de licuefacción como en el Ejemplo 6. Se mezcló almidón de maíz
secado (almidón de maíz Clinton Brand 106-B Pearl,
ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) con agua desionizada
(aproximadamente 23 Kg en aproximadamente 50 litros), y se dejó
hidratar durante 16 horas. La licuefacción se llevó a cabo a 105,6ºC
con niveles iguales de proteína de amilasa a 9,0 \mug de amilasa/g
de carbohidrato (en base seca) (3,1 mg de amilasa/litro de mezcla de
almidón al 35% en sólidos). Debido al beneficio en la actividad
específica derivado de la alfa amilasa mutante, la actividad de las
amilasas fue de 11 UL/g de carbohidrato (en base seca) para la
amilasa natural y de 24 UL/g de carbohidrato para la mutante. Las
actividades medidas demostraron que la amilasa mutante presentaba un
aumento en la actividad del 410% sobre heptamaltosa respecto a la
natural, y del 219% sobre almidón respecto a la natural. Los
resultados se presentan en la Tabla 10, mostrada a continuación.
| Amilasa | pH | ED |
| Natural | 6,00 | 8,9 |
| M15T/S187D/N188S | 6,00 | 11,2 |
Claims (15)
1. Una \alpha-amilasa que es
el producto de expresión de una secuencia de ADN mutada que codifica
\alpha-amilasa, derivando la secuencia de ADN
mutada de una \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis que presenta una eliminación o una sustitución de
al menos uno o más residuos de asparagina, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende una sustitución N188T ó
N188S.
2. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende una sustitución
N188T.
3. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende una sustitución
N188S.
4. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende además la eliminación o
la sustitución de un residuo de metionina o de triptófano.
5. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha eliminación o
sustitución de dicho residuo de metionina o de triptófano comprende
una sustitución o una eliminación de M15, W138 ó M197.
6. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende además la eliminación o
la sustitución de V128, H133, S187 ó A209.
7. Una \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha
\alpha-amilasa comprende una sustitución
M15T/N188S, M15L/N188S, M15T/H133Y/N188S, M15T/H133Y/N188S/A209V,
M15T/N188S/A209V, M15T/
V128E/H133Y/N188S, o M15T/S187D/N188S.
V128E/H133Y/N188S, o M15T/S187D/N188S.
8. La \alpha-amilasa de
acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha sustitución de
dichos residuos de metionina o de triptófano comprende una
sustitución M15T, W138Y o M197T.
9. Un ADN que codifica la
\alpha-amilasa de acuerdo con las reivindicaciones
1, 2, 5, 6 ó 7.
10. Un vector de expresión que comprende el ADN
de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedante transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 10.
12. Una \alpha-amilasa de
acuerdo con las reivindicaciones 1, 6 ó 7, que presenta unas
prestaciones mejoradas a bajo pH.
13. Una composición detergente que comprende la
\alpha-amilasa de acuerdo con las reivindicaciones
1, 6 ó 7.
14. La composición detergente de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que dicho detergente es útil para la
limpieza de telas sucias, o para lavar platos sucios.
15. Un método para producir una
\alpha-amilasa mutada a partir de una
\alpha-amilasa precursora, en el que dicha
\alpha-amilasa mutada comprende una sustitución
correspondiente a N188S o a N188T de Bacillus Licheniformis,
que comprende las etapas de:
- a.
- Seleccionar una secuencia de ADN de la \alpha-amilasa precursora;
- b.
- Mutar la secuencia de ADN de la \alpha-amilasa precursora de tal modo que codifique una \alpha-amilasa que comprenda una sustitución correspondiente a N188S o a N188T de Bacillus Licheniformis;
- c.
- Insertar la secuencia de ADN de la \alpha-amilasa mutada en un vector de expresión;
- d.
- Transformar una célula hospedante con el vector de expresión; y
- e.
- Expresar la \alpha-amilasa mutada.
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