PT1240524E - Proteína melhorada compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi modificada a partir de uma sequência de aminoácidos precursora por substituição ou deleção de um resíduo de aminoácido que difere de um resíduo de aminoácido correspondente numa pr - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"Celulase de T. reesei com termoestabilidade melhorada" CAMPO DO INVENTO O presente invento é dirigido para melhorar proteínas e nomeadamente enzimas, com características de estabilidade alteradas através do recrutamento de resíduos de uma proteína relacionada ou homóloga. Também se revela um método poderoso que permite o desenvolvimento de tais proteínas melhoradas com grande precisão.

ANTECEDENTES DO INVENTO Têm sido extensivamente levados à prática métodos para melhorar características funcionais de proteínas com o objectivo de aumentar a utilidade das proteínas em várias aplicações. Tais técnicas envolvem muitas vezes a utilização de engenharia de proteínas e mutagénese específica do local para isolar e seleccionar resíduos de aminoácido específicos que, com base nas propriedades do aminoácido específico e/ou na estrutura da proteína, parecem ser especialmente relevantes ou que se demonstra serem relevantes através de evidência experimental. Por exemplo, Estell et al., patente U.S. n° 4 760 025 sugerem modificações de enzimas instáveis à oxidação para conferir estabilidade aumentada por alteração de resíduos que são especialmente susceptíveis à oxidação, i.e., metionina, lisina, triptofano e cisteína, entre outros. Koths et al., patente U.S. n° 4 752 585, sugerem um método de melhorar a estabilidade à oxidação de uma proteína terapêutica através de uma substituição de aminoácido conservativa em cada resíduo metionilo susceptível à oxidação por cloramina T. Barr et al., patente U.S. n° 4 732 973, sugere substituição da metionina do sítio activo de αΐ-antitripsina humana por um aminoácido estável à oxidação.

As técnicas adicionais que têm sido sugeridas incluem modelação por homologia de proteínas com proteínas próximas do ponto de vista evolutivo para proporcionar uma base para 2 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ engenharia de proteínas. Siezen et al., Protein Engineering, vol. 4, n° 7, p. 719-737 (1991) revelam uma estratégia para melhorar as propriedades de proteases utilizadas em processos industriais por incorporação ou duplicação num alvo de características de enzimas mais estáveis. Além disso, estas técnicas necessitam que os atributos de uma proteína mais conveniente sejam atribuídos a uma proteína menos conveniente. Na prática, contudo, a proteína mais conveniente é o alvo para o qual se pretende desenvolver as características melhoradas. Assim, não é praticável alinhar tal proteína com uma proteína mais conveniente. Tal faz com que o investigador tenha que procurar técnicas para melhoramento não baseadas em conhecimento.

As estratégias de mutação não baseadas em conhecimento tornam-se necessárias quando há falta de informação sobre a proteína de interesse ou quando falham as técnicas baseadas em conhecimento. As técnicas não baseadas em conhecimento típicas compreendem métodos bem conhecidos incluindo técnicas de mutagénese aleatória, PCR sujeito a erros e troca de molde de PCR assim como desenvolvimentos mais recentes tal como a permuta descrita em Steamer et al., patente U.S. n° 5 605 793. A mutagénese aleatória tem sido utilizada há muitos anos com diferentes níveis de sucesso relatado em toda a literatura. Contudo, a mutagénese aleatória é uma estratégia de certo ou errado devido ao elevadíssimo número de mutantes potenciais. Por exemplo, uma proteína de 300 aminoácido tem um número potencial de mutantes aleatórios na ordem de 30020. É impossível preparar, expressar e rastrear um número de mutantes de tal modo elevado, mesmo utilizando as técnicas de rastreio em massa actualmente existentes. As técnicas de evolução dirigida tal como "permuta de gene" tal como descrito por Stemmer ou outras técnicas de geração molecular estão limitadas pelo conjunto de mutantes disponíveis. Contudo, o conjunto de mutantes deve ser produzido quer a partir de fontes naturais, quer utilizando mutagénese aleatória caso o conhecimento relativo à proteína seja insuficiente. Este conjunto de variantes, contudo, não consegue potencialmente 3 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ proporcionar um conjunto optimamente focado de organismos diversificados necessários para um grau de sucesso razoável.

Tem havido um esforço considerável no campo da engenharia de proteínas para produzir enzimas mais estáveis. Contudo, dado o muito elevado conteúdo de informação presente em muitas proteínas importantes, devem desenvolver-se métodos melhorados para focar de forma inteligente um conjunto de moléculas mutantes no sentido de um efeito específico para explorar completamente a gama de diversidade biológica. Tal como descrito seguidamente, os presentes inventores desenvolveram uma nova técnica de mutagénese baseada em conhecimento que proporciona excelentes probabilidades em termos da produção de novas proteínas que têm desempenho, i.e., características funcionais melhoradas. Levando à prática a presente técnica, é possível para um investigador desenvolver um conjunto focado de mutantes a partir dos quais é mais fácil a selecção de uma proteína "vencedora" conveniente.

SUMÁRIO DO INVENTO

Ao enfrentarem o problema de melhorar o desempenho de uma proteína relativamente a uma propriedade funcional específica, os investigadores são muitas vezes confrontados com barreiras significativas em termos de determinar quais as mutações apropriadas para inserir numa proteína. A falta de estruturas cristalinas para muitas proteínas e a incerteza envolvida em alinhamentos de baixa homologia relativamente a uma proteína comparativa para a qual se conhece a estrutura cristalina são impedimentos significativos para estratégias de mutação baseadas em conhecimento. Além disso, as técnicas de mutagénese aleatória ou outras estratégias não baseadas em conhecimento tal como geração molecular são muitas vezes propostas de acertar ou falhar que necessitam de rastreio de quantidades maciças de mutantes sem que haja garantia que ocorra sequer mutagénese óptima. Contudo, muitas vezes o investigador que pretenda melhorar uma proteína relativamente a determinada característica tem disponível uma família de estruturas primárias relacionadas tendo a maioria destas um 4 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ desempenho inferior comparativamente com a proteína que se procura melhorar. Tal decorre naturalmente do facto da melhor proteina ser muitas vezes seleccionada como o alvo primário. Contudo, esta "melhor proteína" tem muitas vezes falhas significativas cujo melhoramento traria grandes benefícios comerciais ou industriais. Assim o investigador tem que resolver o problema de determinar como modificar a proteína de um modo que não prejudique as propriedades convenientes da proteína alvo mas que melhore outras propriedades. Neste contexto, os cientistas determinaram aqui que por utilização de alinhamentos com proteínas menos convenientes, i.e., enzimas menos estáveis ou menos activas, é possível deduzir modificações de aminoácidos que terão uma grande probabilidade de sucesso em termos de serem aceites como "melhor proteína" sem destruir indevidamente as suas boas propriedades. De facto, dado que a natureza já determinou muitas vezes que a modificação seleccionada funcionará no processo para o qual foi planeada, a probabilidade de sucesso é muito aumentada.

Descreve-se aqui um método para obter proteínas que têm características funcionais melhoradas, incluindo, por exemplo estabilidade alcalina aumentada, estabilidade ao pH, estabilidade térmica, estabilidade aumentada à oxidação, actividade catalítica aumentada e ligação melhorada ao substrato ou ao alvo. É um objectivo do presente invento proporcionar uma proteina, por exemplo uma enzima, com estabilidade alcalina aumentada, estabilidade ao pH, estabilidade térmica, estabilidade aumentada à oxidação, actividade catalítica aumentada e ligação melhorada ao substrato ou ao alvo.

De acordo com um aspecto, o invento proporciona uma celulase melhorada compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi modificada a partir de uma sequência de aminoácidos precursora com a sequência da celulase EGIII de T. reesei apresentada na figura 11, compreendendo a referida modificação uma substituição P201C sendo a referida numeração de aminoácido tal como na figura 11; em que a celulase melhorada 5 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ tem termoestabilidade aumentada comparativamente com uma celulase com a sequência de aminoácidos precursora. O invento proporciona adicionalmente uma sequência de ADN que codifica a celulase, conjuntamente com um vector de expressão compreendendo a sequência de ADN e uma célula hospedeira compreendendo a sequência de ADN ou o vector de expressão.

Também se proporciona um método de produzir uma celulase melhorada de acordo com o invento, compreendendo o método: (a) modificar uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos precursora para produzir uma sequência de ADN modificada de acordo com o invento que codifica a celulase melhorada; (b) expressar a sequência de ADN modificada numa célula hospedeira; e (c) purificar a proteína celulase expressa.

Proporciona-se adicionalmente a utilização da celulase melhorada na redução de biomassa, produtos de limpeza ou composições para o tratamento de têxteis. WO 95/24471 refere-se a celulases de família 7 e variantes das celulases compreendendo um núcleo e opcionalmente uma ligação C-terminal consistindo de 10 aminoácidos no máximo. WO 99/31255 refere-se a celulases EGIII e do tipo EGIII compreendendo uma série de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste de um ou mais de: (a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/ile)-Trp-Gly (b) Glu-(Leu/Phe/lle)-Met-Ile-Trp (c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr (d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Thr/Phe); e (e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr. 6 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Também se descreve aqui um método para melhorar uma propriedade pretendida de uma primeira proteína compreendendo as etapas de: (a) determinar a sequência de aminoácidos primária de uma primeira proteína e de uma segunda proteína homóloga e alinhar as referidas sequências de aminoácidos primárias para produzir um alinhamento de sequências de aminoácidos primárias, tendo a referida segunda proteína homóloga características menos convenientes em termos da referida propriedade pretendida do que a referida primeira proteína; (b) identificar resíduos que difiram em posições correspondentes entre a referida primeira proteína e a referida segunda proteína homóloga no referido alinhamento de sequências de aminoácidos primárias; (c) preparar proteínas mutantes nas quais se introduz uma substituição, deleção ou adição na referida primeira proteína que corresponde a pelo menos um dos referidos resíduos que são diferentes, seleccionados na etapa (b) ; (d) rastrear as referidas proteínas mutantes para desempenho melhorado relativamente à referida propriedade funcional; (e) seleccionar e determinar a identidade das referidas proteínas mutantes que têm tal desempenho melhorado, em que tal proteína mutante melhorada difere em pelo menos um resíduo da referida primeira proteína e da referida segunda proteína homóloga e a referida primeira proteína melhorada tem função melhorada em termos da referida propriedade pretendida. O alinhamento da primeira proteína pode ser efectuado com mais que uma segunda proteína homóloga e podem escolher-se as substituições seleccionadas na etapa (c) a partir dos resíduos que existem numa parte significativa ou em todas as segundas proteínas homólogas na posição específica seleccionada para mutação. A proteína melhorada pode ter propriedades de estabilidade melhoradas, quer alcalinas, de pH, térmicas ou oxidativas, comparativamente com uma proteína correspondente à sequência de aminoácidos precursora. Igualmente, a proteína pode ser uma enzima, por exemplo uma α-amilase, lipase, celulase ou protease.

Também se descreve um método para a produção de uma proteína alvo com uma melhoria numa propriedade pretendida comparativamente com uma primeira proteína proporcionada 7 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ compreendendo: (a) alinhar as sequências de aminoácidos primárias de pelo menos duas proteínas comparativas, tendo uma dessas proteínas comparativas um desempenho menos conveniente do que a outra em termos da referida propriedade pretendida; (b) identificar posições nas quais os resíduos diferem entre as referidas duas enzimas comparativas e determinar os resíduos que estão presentes em tais posições identificadas na proteína comparativa que tem desempenho menos conveniente em termos da referida propriedade pretendida; (c) seleccionar um ou mais dos resíduos determinados na etapa (b); (d) modificar a referida primeira proteína numa posição correspondente à posição na referida proteína comparativa na qual se seleccionam resíduos na etapa (c) e substituir, deletar ou adicionar o referido resíduo seleccionado na referida primeira proteína; em que a referida proteína alvo melhorada difere em pelo menos um resíduo tanto da referida primeira proteína e referidas proteínas comparativas e a referida proteína alvo tem função melhorada em termos da referida propriedade pretendida. A comparação pode ser efectuada com mais que uma segunda proteína homóloga e pode recrutar-se para a primeira proteína um resíduo existente apenas em todas ou em várias das segundas proteínas homólogas menos estáveis, para produzir a proteína melhorada.

Assim descreve-se aqui uma proteína melhorada obtida de acordo com um método aqui descrito em que a referida proteína compreende uma modificação de acordo com um método descrito.

Uma vantagem dos métodos descritos é que é possível produzir proteínas com propriedades mais convenientes através de uma técnica simples que consiste em analisar as sequências alinhadas de duas proteínas homólogas que diferem em termos das referidas propriedades.

Outra vantagem é que é possível reduzir significativamente o conjunto de mutantes potenciais para um número de mutantes 8 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ mais fácil de rastrear ao contrário de métodos de mutação não baseados em conhecimento.

Ainda outra vantagem é não ser necessária informação relativa à estrutura terciária da proteína a melhorar sendo meramente necessário um alinhamento de sequência com uma proteína homóloga.

Ainda outra vantagem é ser possível melhorar adicionalmente uma proteína já melhorada, com base em informação obtida a partir de proteínas menos convenientes, aumentado assim o conjunto de informação disponível para desenvolver tais proteínas melhoradas.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS A figura 1 ilustra oligonucleótidos mutagénicos úteis durante mutagénese dirigida de Asnl88 da α-amilase de Bacillus licheniformis. Nesta e nas seguintes figuras ilustrativas de construções de oligonucleótidos, as letras a negrito indicam alterações de bases introduzidas pelo oligonucleótido e o sublinhado indica locais de endonuclease de restrição introduzidos pelo oligonucleótido. A figura 2 ilustra iniciadores de PCR utilizados para processamento de PCR de moldes de oligonucleótidos mutagénicos. A figura 3 ilustra a sequência de ADN do gene para a- amilase de Bacillus licheniformis (NCIB 8061) (SEQ ID NO:33) e a sequência de aminoácidos deduzida do produto de tradução (SEQ ID NO:41) tal como descrito por Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, p. 635-643 (1986).

A figura 4 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:34) da enzima α-amilase madura de Bacillus licheniformis. A figura 5 ilustra um alinhamento das estruturas primárias de três α-amilases de Bacillus. Descreve-se a α-amilase de 9 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Bacillus licheniformis (Am-Lich) (SEQ ID NO:35) em Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, p. 635-643 (1986); descreve-se a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (Am-Amylo) (SEQ ID NO:36) em Takkinen et al., J. Biol. Chem., vol. 258, p. 1007-1013 (1983); descreve-se a α-amilase de Bacillus stearothermophilus (Am-Stearo) (SEQ ID NO:37) em Ihara et al., J. Biochem., vol. 98, p. 95-103 (1985). A figura 6 ilustra o plasmideo pHPl3 em que CmR se refere à resistência ao cloranfenicol, EmR refere-se à resistência a eritromicina e Rep pTAl060 refere-se à origem de replicação do plasmideo pTAl060. A figura 7 ilustra o plasmideo pBLapr em que BL AA se refere ao gene de α-amilase de Bacillus licheniformis; aprE refere-se à região de codificação do promotor e do péptido de sinalização do gene aprE; AmpR refere-se ao gene de resistência à ampicilina de pBR322; CAT refere-se ao gene de resistência a cloranfenicol de pCl94. A figura 8 ilustra o plasmideo pHP.BL apresentando o gene para a α-amilase de Bacillus licheniformis. A figura 9 ilustra um esquema do método de PCR utilizado para produzir os oligonucleótidos mutantes correspondentes à α-amilase derivada de Bacillus licheniformis. A figura 10 ilustra as junções de sequência de sinalização proteina madura de α-amilase derivada de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO:38), Bacillus subtilis aprE (SEQ ID NO: 39) e Bacillus licheniformis em pBLapr (SEQ ID NO:40). A figura 11 ilustra um alinhamento de sequência de 8 enzimas endoglucanase homólogas correspondentes a determinadas celulases obtidas de Trichoerma reesei (EGIII)(SEQ. ID NO: 41), Hypocrea schweínitzii (SEQ. ID. NO: 42), Aspergillus aculeatus (SEQ. ID. NO: 43), Aspergillus kawachii (SEQ. ID. NO: 44), Humicola grisea (SEQ ID NO:45), Gliocladium roseum (1) (SEQ. ID. NO:46), Gliocladium roseum (2) (SEQ. ID. NO: 10 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ 47), Gliocladium roseum (3) (SEQ. ID. NO:48). A numeração proporcionada baseia-se na numeração em EGIII.

DESCRIÇÃO DETALHADA "Vector de expressão" significa uma construção de ADN compreendendo uma sequência de ADN que está ligada operacionalmente a uma sequência de controlo adequada capaz de efectuar a expressão do referido ADN num hospedeiro adequado. Tais sequências de controlo podem incluir um promotor para efectuar transcrição, uma sequência de operador opcional para controlar tal transcrição, uma sequência que codifica locais de ligação de mARN ao ribossoma e sequências que controlam a terminação de transcrição e tradução. Quando se pretende expressão num hospedeiro de Bacillus, o promotor aprE de Bacillus subtilis é um promotor preferido. O vector pode ser um plasmideo, uma partícula de fago ou simplesmente uma inserção genómica potencial. Uma vez transformado para um hospedeiro adequado, o vector pode replicar-se e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode, nalguns casos, integrar-se no próprio genoma. Enquanto o plasmideo e o vector são muitas vezes utilizados indiferentemente dado que o plasmideo é a forma de vector presentemente mais habitualmente utilizado, pretende-se que o invento inclua outras formas de vectores de expressão que sirvam para funções equivalentes e que são, ou que se tornem, conhecidos na especialidade. "Estirpe hospedeira" ou "célula hospedeira" significa um hospedeiro adequado para um vector de expressão compreendendo ADN que codifica uma proteina de acordo com o presente invento. As células hospedeiras úteis no presente invento são geralmente hospedeiros procarióticos ou eucarióticos, incluindo qualquer microrganismo transformável no qual se pode obter expressão de determinada proteína de acordo com o presente invento. As células hospedeiras não são o corpo humano nas diferentes etapas da sua formação e desenvolvimento. 0 perito na especialidade estará familiarizado com a maquinaria de expressão e excreção apropriada, incluindo a célula hospedeira apropriada para 11 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ utilização com uma proteína específica. Por exemplo, as estirpes hospedeiras da mesma espécie ou género do qual se deriva a proteína específica são adequadas, por exemplo com a-amilase derivada de Bacillus, uma célula hospedeira adequada seria uma estirpe de Bacillus. Neste caso, utiliza-se preferentemente uma estirpe de Bacillus α-amilase negativa (genes deletados) e/ou uma estirpe de Bacillus com α-amilase e protease deletadas (AamyE, Aapr, Anpr) . As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vectores construídos utilizando técnicas de ADN recombinante. Tais células hospedeiras transformadas são capazes de replicar vectores que codificam a proteína e as suas variantes (mutantes) ou de expressar a proteína pretendida. "Proteína recombinante" significa uma proteína na qual a sequência de ADN que codifica a proteína de ocorrência natural ou precursora é modificada para produzir uma sequência de ADN mutante que codifica a substituição, inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos na sequência de proteína comparativamente com uma proteína de ocorrência natural ou precursora. Tal como aqui utilizada, a expressão proteína (ou enzima) precursora não se refere a um precursor imediato em termos de uma reacção química, mas sim a uma proteína parental a partir da qual se faz o modelo de uma modificação. Assim, enquanto o precursor define a modificação, a alteração ou modificação efectiva terá como base uma alteração no interior do ADN que codifica o precursor, ADN esse que é então transformado e expresso e é excretado o produto de proteína que incorpora a modificação. A proteína melhorada de acordo com o presente invento compreende uma sequência de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos de uma proteína precursora (também aqui referida como a "primeira proteína"), sendo as modificações específicas na proteína precursora tal como aqui proporcionadas. A proteína precursora pode ser uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína recombinante. A sequência de aminoácidos da proteína melhorada é derivada de uma sequência de aminoácidos da proteína precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da 12 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ sequência de aminoácidos precursora. Tal modificação é geralmente da sequência de ADN precursora que codifica a sequência de aminoácidos das proteínas precursoras, preferentemente à manipulação da própria proteína precursora. Os métodos adequados para tal manipulação da sequência de ADN precursora incluem métodos aqui revelados e nas patentes U.S. n° 4 760 025 e 5 185 258 do mesmo titular, aqui incorporadas por referência. "Propriedades pretendidas" significa qualquer propriedade em relação à qual se pretende melhorar uma proteína. Tais propriedades pretendidas podem compreender propriedades funcionais tais como estabilidade térmica, ao pH, a bases, oxidativa ou química, actividade catalítica, ligação de substrato, ligação de receptor, alergenicidade, actividade antimicrobiana ou qualquer outra característica conveniente associada à proteína. "Alinhamento da sequência de aminoácidos primária" significa um alinhamento da sequência primária de pelo menos duas proteínas de modo a produzir um grau de identidade de sequência significativo. Existem algoritmos de alinhamento diferentes sob a forma de utilitários comercialmente disponíveis que são adequados e são utilizados rotineiramente pelo especialista na arte. Estes programas proporcionam a entrada de diferentes parâmetros de algoritmos que podem efectuar os resultados obtidos. Contudo, o presente invento não requer qualquer preferência por qualquer algoritmo específico de alinhamento de sequências dado que a escolha é geralmente no sentido de optimizar os parâmetros. Geralmente, os alinhamentos são considerados aproximados e assim a utilização de diferentes métodos de optimização do alinhamento deveria proporcionar de modo vantajoso conjuntos de mutantes ligeiramente diferentes que podem ser seleccionados. Contudo, porque uma vantagem do presente invento é produzir um conjunto de proteínas mutantes específicas das quais se podem seleccionar proteínas melhoradas, o presente invento deve ser igualmente aplicável independentemente do programa ou dos parâmetros utilizados para determinar o alinhamento. 13 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

De acordo com um método aqui descrito, modifica-se uma proteína como se segue para melhorar o seu desempenho em termos de uma propriedade pretendida. Alinha-se a sequência de aminoácidos primária da proteína a modificar, denominada "primeira proteína" com a sequência de aminoácidos primária de uma "segunda proteína homóloga" comparativa que tem um desempenho menos conveniente em termos de uma propriedade pretendida. A partir do alinhamento, determinam-se as posições nas quais os resíduos diferem e identificam-se os resíduos presentes na segunda sequência de proteína homóloga nessas posições. Pelo menos um dos resíduos seleccionados da etapa anterior é então incorporado na sequência de aminoácidos da primeira proteína. Tal como determinado pelos inventores, a proteína modificada produzida deste modo tem uma probabilidade significativa de apresentar desempenho melhorado em termos de uma propriedade pretendida. Assim, um conjunto de proteínas mutantes produzidas deste modo com várias combinações de substituições, deleções ou adições de resíduos identificados, compreenderá, muito provavelmente, um conjunto de proteínas melhoradas das quais se poderá então seleccionar a "vencedora".

Numa variação, é possível produzir alinhamentos de mais de duas sequências de aminoácidos primárias. Neste método, alinha-se a primeira proteína com mais de que uma sequências de aminoácidos primárias de segundas proteínas homólogas, correspondendo cada sequência de aminoácidos primária da segunda proteína homóloga a uma proteína diferente que tem actividade menos benéfica do que a primeira proteína. A partir deste alinhamento seleccionam-se resíduos que existem em uma ou mais das segundas proteínas homólogas em posições nas quais há uma diferença entre a sequência de aminoácidos primária da primeira proteína e pelo menos duas das sequências de aminoácidos primárias das segundas proteínas homólogas. Numa alternativa que expande o conjunto de mutantes disponíveis cada uma das variações entre a primeira proteína e uma segunda proteína homóloga pode ser utilizada como base para produzir um mutante. Noutra alternativa preferida que limita o número 14 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ de mutantes disponíveis aos que irão, provavelmente com maior sucesso, proporcionar características funcionais melhoradas às proteínas mutantes seleccionadas, apenas se seleccionam as diferenças nas quais cada uma das sequências da segunda proteína homóloga compreende um resíduo idêntico.

Numa variação do método anterior, prepara-se o alinhamento com duas ou mais proteínas homólogas que não são comparadas directamente com a primeira proteína. Por exemplo, alinham-se duas proteínas homólogas comparativas sendo cada uma capaz de ser alinhada com a primeira proteína para determinar onde se situam as diferenças de resíduos. O alinhamento resultante é então analisado para determinar os resíduos que existem na(s) proteína(s) comparativa(s) com desempenho menos conveniente em termos da propriedade pretendida e esse resíduo é então substituído, deletado ou adicionado à primeira proteína numa posição correspondente. Neste método, não é necessário que as proteínas comparativas sejam melhores ou piores do que a primeira proteína, é apenas necessário que o resíduo seleccionado para modificação na proteína alvo seja derivado da proteína comparativa homóloga que tem desempenho menos conveniente em termos da propriedade pretendida. Adicionalmente, é possível alinhar mais do que duas sequências de aminoácidos primárias de segundas proteínas homólogas e seleccionar entre elas com base no desempenho das diferentes segundas proteínas homólogas em termos da propriedade pretendida.

Os requerentes verificaram que se pode obter uma proteína com uma propriedade funcional melhorada por preparação de um alinhamento de duas ou mais proteínas homólogas ou relacionadas e referenciar os resíduos que existem nas diferentes localizações nas proteínas com desempenho menos conveniente em termos de uma propriedade pretendida. Por exemplo, comparando uma primeira proteína com uma segunda proteína homóloga que tem características menos convenientes em termos da propriedade funcional, identificando resíduos que são diferentes, preparando um conjunto de mutantes com base nas referidas mutações diferentes e seleccionando os mutantes 15 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ que são melhorados em termos da propriedade pretendida comparativamente com a primeira proteína, podem obter-se melhorias vantajosas nas propriedades pretendidas para uma percentagem significativa de tais modificações. Assim, uma utilização excelente dos presentes métodos é produzir um conjunto de mutantes relativamente pequeno e manipulável (comparativamente com o conjunto de mutantes aleatórios) do qual é possível seleccionar uma proteína com propriedades funcionais significativamente melhoradas comparativamente com a primeira proteína. Além disso, este resultado é possível na ausência de informação particular sobre estrutura-função. Não é necessário que as proteínas alinhadas tenham actividade e função comparáveis. Num exemplo preferido, contudo, as proteínas têm actividade comparável, i.e., actividade biológica, função e actividade catalítica semelhantes ou outros critérios do mesmo tipo tal como habitualmente utilizados para classificar uma proteína específica. Contudo, dado que os presentes métodos se baseiam na determinação das posições para as quais a natureza determinou um resíduo e que podem existir no contexto de uma proteína sem afectar significativamente o seu valor para um organismo hospedeiro, não é necessário que todas as características das proteínas comparadas sejam idênticas mas apenas que apresentem alguma homologia. "Substancialmente homólogas" significa que as proteínas têm um nível significativo de aminoácidos conservados, i.e., idênticos, de modo a que as suas sequências possam ser alinhadas de forma significativa e possam definir-se locais principais em termos estruturais, funcionais ou catalíticos. De preferência, a primeira proteína e as segundas proteínas homólogas têm uma identidade de sequência de pelo menos 30%, de preferência 50% de identidade de sequência, com maior preferência 70% de identidade de sequência e com a maior preferência 85% de identidade de sequência.

Num exemplo, a proteína compreende uma enzima. A enzima pode compreender qualquer enzima das cinco classificações de enzimas principais: hidrolase, óxido-reductase, transferase, 16 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ liase ou ligase. Os exemplos específicos que podem beneficiar dos presentes métodos incluem amilase, lipase, celulase, protease, hemicelulase, glucoamilase, esterase, lactase, poligalacturonase, β-galactosidase, linhinase, oxidase, peroxidase, glucose isomerase ou qualquer enzima para a qual existam homólogos estreitamente relacionados e perda de estabilidade.

Seguidamente ilustrar-se-á a α-amilase como exemplo dos presentes métodos e composições. Tal como aqui utilizado, "a-amilase" significa uma actividade enzimática que cliva ou hidroliza a ligação α (1-4)glicosídica, e.g., nos polímeros de amido, amilopectina ou amilose. A α-amilase inclui a-amilases de ocorrência natural, bem como α-amilases recombinantes. As α-amilases preferidas no presente invento são as derivadas de Bacíllus sp., em particular as de Bacillus licheniformis, Bacíllus amyloliquefaciens ou Bacillus stearothermophilus, bem como as α-amilases fúngicas tais como as derivadas de Aspergillus (i.e., A. oyzee e A. niger). Assim, as a-amilases de acordo com os presentes métodos são derivadas de uma a-amilase precursora. A α-amilase precursora é produzida por qualquer fonte capaz de produzir α-amilase. As fontes adequadas de α-amilases são organismos procarióticos ou eucarióticos, incluindo fungos, bactérias, plantas ou animais. De preferência, a α-amilase precursora é produzida por um Bacillus; com maior preferência por Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens ou Bacillus stearothermophilus; com a maior preferência, a α-amilase precursora é derivada de Bacillus licheniformis.

Verificaram-se homologias entre a maioria das endo-amilases sequenciadas até à data, desde as de plantas, até de mamíferos e de bactérias (Nakajima et al.; Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 23, p. 355-360 (1986); Rogers, Biochem.

Biophys. Res. Commun., vol. 128, p. 470-476 (1985); Janecek, Eur. J. Biochem., vol. 224, p. 519-524 (1994)). Existem quatro áreas com uma homologia particularmente elevada em determinadas amilases de Bacillus, tal como apresentado na figura 5, em que as secções sublinhadas indicam as áreas de 17 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ homologia elevada. Utilizaram-se também alinhamentos de sequências para mapear a relação entre endo-amilases de Bacillus (Feng et al., J. Molec. Evol., vol. 35, p. 351-360 (1987)). A homologia de sequência relativa entre amilase de Bacillus stearothermophilus e Bacillus licheniformis é de cerca de 66% e entre amilases de Bacillus licheniformis e Bacillus amyloliquefacíens é cerca de 81%, tal como determinado por Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, N° 3, p. 181-191 (1990). De modo a estabelecer a homologia com a estrutura primária, compara-se directamente a sequência de aminoácidos de uma α-amilase precursora com a sequência primária de α-amilase de Bacillus licheniformis e particularmente com um conjunto de residuos que se sabe serem invariantes em todas as α-amilases para as quais são conhecidas as sequências (consultar e.g., figura 7). Também é possivel determinar residuos equivalentes por análise da estrutura terciária das estruturas cristalinas relatadas para α-amylase porcina pancreática (Buisson et al., EMBO Journal, vol. 6, p. 3909-3916 (1987); Qlan et al., Biochemistry, vol. 33, p. 6284-6294 (1994); Larson et al., J. Mol. Biol., vol. 235, p. 1560-1584 (1994)); Taka-amilase A de Aspergillus oryzae (Matsuura et al., J. Biochem. (Tóquio), vol. 95, p. 697-702 (1984)); uma α-amilase ácida de A. niger (Boel et al., Biochemistry, vol. 29, p. 6244-6249 (1990)), sendo as duas estruturas anteriores semelhantes e para α-amilase de cevada (Vallee et al., J. Mol. Biol., vol. 236, p. 368-371 (1994); Kadzlola, J. Mol. Biol., vol. 239, p. 104-121 (1994)). Embora tenha havido alguns estudos preliminares publicados (Suzuki et al., J. Biochem., vol. 108, p. 379-381 (1990); Lee et al., Arch. Biochem. Biophys, vol. 291, p. 255-257 (1991); Chang et al., J. Mol. Biol., vol. 229, p. 235-238 (1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol., vol. 234, p. 1282-1283 (1993)), existe apenas uma estrutura publicada para α-amilase de Bacillus licheniformis (Machlus et al., J. Mol. Biol. vol. 246, p. 545-549 (1995)). No entanto, vários investigadores previram estruturas super-secundárias comuns entre glucanases (MacGregor et al., Biochem. j., vol. 259, p. 145-152 (1989)) e dentro de α-amilases e outras enzimas do metabolismo do amido (Jaspersen, j. Prot. Chem. vol. 12, p. 791-805 (1993); 18 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

MacGregor, Starke, vol. 45, p. 232-237 (1993)); similaridade de sequência entre enzimas com estruturas super-secundárias similares a α-amilases (Janecek, FEBS Letters, vol. 316, p. 23-26 (1993); Janecek et al., J. Prot. Chem., vol.12, p. 509-514 (1993)). Modelou-se uma estrutura para a enzima de Bacillus stearothermophilus de Taka-amilase A (Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, p. 181-191 (1990)). As quatro regiões altamente conservadas apresentadas na figura 7 contêm muitos resíduos que se pensa que fazem parte do local activo (Matsuura et al., J. Biochem. (Tóquio), vol. 95, p. 697-702 (1984); Buisson et al., EMBO Journal, vol. 6, p. 3909-3916 (1987); Vihinen et al., J. Biochem., vol. 107, p. 267-272 (1990)) incluindo His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 e Asp +328 no sistema de numeração de Bacillus licheniformis. Publicou-se a estrutura cristalina de uma enzima híbrida de amilase bacteriana em publicação PCT N° WO 96/23874.

Tal como descrito anteriormente, as α-amilases de Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefadens e Bacillus subtilis têm todas um grau de homologia significativo. No entanto, sabe-se que nas condições de liquefacção de amido industriais, e.g., temperatura elevada (superior a 90 °C), pH baixo (pH 4-6) e baixo cálcio, a a-amilase derivada de Bacillus licheniformis proporciona o desempenho mais aceitável. No entanto, mesma a α-amilase de Bacillus licheniformis é susceptível a instabilidade indesejável em condições de liquefacção, o que torna conveniente uma alternativa mais estável. Assim, efectuou-se muito trabalho na molécula derivada de Bacillus licheniformis com o objectivo de introduzir nesta enzima propriedades que são convenientes relativamente à sua utilização em processos de liquefacção. Através do alinhamento de sequência de a-amilase de Bacillus licheniformis com a de α-amilase de Bacillus stearothermophilus ou de Bacillus amyloliquefaciens é possível identificar resíduos que diferem entre os homólogos. De acordo com os presentes métodos, seguidamente seleccionam-se as posições nas quais os resíduos diferem na α-amilase de B. stearothermophilus ou B. amyloliquefaciens comparativamente 19 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ à α-amilase de Β. licheniformis para substituição na a-amilase de B. licheniformis. O resíduo substituído pode ser na realidade um resíduo idêntico ao existente na α-amilase de B. stearothermophilus ou B. amyloliquefaciens. O resíduo substituído pode corresponder a uma posição na qual o mesmo resíduo existe em ambas as α-amilases de B. stearothermophilus e B. amyloliquefaciens.

Os resíduos que são aqui identificados especificamente para substituição em Bacillus licheniformis são os que são diferentes dos resíduos nas posições correspondentes em Bacillus amyloliquefaciens e/ou Bacillus stearothermophilus e especificamente A33, A52, S85, N98, H133, S148, A209, A269, A379 e A435. Seleccionam-se substituições específicas preferidas para estes resíduos de entre os presentes tanto em Bacillus amyloliquefaciens, como em Bacillus stearothermophilus e correspondentes a A33S, A52S, N96Q, H133Y, S148N, A209V, A269K, A379S e/ou A435S, em que todos parecem contribuir para um benefício em termos de estabilidade. Também se verificou que a mutação A85D, que é recrutada apenas de Bacillus amyloliquefaciens também proporciona um benefício de estabilidade. Os resíduos anteriores podem ser alterados em combinação com outras modificações que proporcionem um benefício no desempenho.

As proteínas melhoradas de acordo com os presentes métodos apresentam características de desempenho melhoradas, o que torna estas proteínas particularmente úteis em várias aplicações para as quais as proteínas são vulgarmente utilizadas e para as quais se pretende uma estabilidade melhorada. Por exemplo, as enzimas, incluindo as a-amilases, apresentarão termoestabilidade melhorada, estabilidade ao pH melhorada e/ou estabilidada à oxidação melhorada. A termoestabilidade melhorada será útil para aumentar o prazo de validade dos produtos que a incorporam e em aplicações a temperaturas elevadas. A estabilidade à oxidação melhorada ou desempenho melhorado é particularmente conveniente em produtos de limpeza e para aumentar o prazo de validade da enzima na presença de lixívia, perborato, percarbonato ou perácidos 20 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ utilizados em tais produtos de limpeza. Descreve-se aqui uma α-amilase que é especialmente útil no processamento de amido e especificamente na liquefacção de amido, em que a estabilidade à oxidação e térmica são particularmente importantes. Também se revelam aqui celulases com benefícios de estabilidade melhorada e são particularmente úteis, por exemplo, em redução de biomassa, produtos de limpeza e composições para tratamento de têxteis.

Uma concretização adicional do presente invento compreende ADN que codifica uma proteína de acordo com o presente invento e vectores de expressão compreendendo tal ADN. As sequências de ADN podem ser expressas pela sua ligação operacional a uma sequência de controlo de expressão, num vector de expressão adequado, e utilizando esse vector de expressão para transformar um hospedeiro adequado de acordo com técnicas bem conhecidas. Pode ser utilizada uma vasta variedade de combinações hospedeiro/vector de expressão na expressão de sequências de ADN deste invento. Os vectores de expressão úteis, por exemplo, incluem sequências de ADN cromossómico, não cromossómico e sintético, tais como as de vários plasmídeos e fagos conhecidos para este objectivo. Além disso, são utilizadas geralmente qualquer uma de uma vasta variedade de sequências de controlo de expressão nestes vectores. Por exemplo, com a α-amilase derivada de Bacillus, os requerentes verificaram que uma sequência de controlo preferida para produtos de transformação de Bacillus é o péptido de sinalização aprE derivado de Bacillus subtilis. É também útil uma vasta variedade de células hospedeiras para expressar as sequências de ADN deste invento. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como estirpes de E. colí, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, vários fungos, leveduras e células de animais. De preferência, o hospedeiro expressa a proteína do presente invento extracelularmente para facilitar a purificação e processamento a jusante. A expressão e purificação da proteína melhorada do invento podem ser 21 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ efectuadas através de meios reconhecidos na especialidade para efectuar tais processos. A seguinte parte é apresentada a titulo exemplificativo e não deve ser entendida como limitativa do âmbito das reivindicações. As abreviaturas aqui utilizadas, em particular a notação de três letras ou de uma letra para os aminoácidos descrevem-se em Dale, J.W., Molecular Genetics of Bactéria, John Wiley & Sons, (1989) Apêndice B.

EXEMPLOS

Referência EXEMPLO 1

Construção do plasmídeo pHP.BL O gene da α-amilase apresentado na figura 3 foi clonado a partir de Bacillus licheniformis NCÍB8061 (Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, p. 635-643 (1986)). O fragmento 1.72kb.Psti-Ssti, que codifica os últimos três resíduos da sequência de sinalização, a proteína madura completa e a região de terminação, foi subclonado para M13mpl8. Adicionou-se um terminador sintético entre os locais Bell e SstI utilizando uma cassete de oligonucleótido sintética com a forma:

Bell SstI 5'-GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT-3' (SEQ ID NO:1) 3' TTTTGTATTTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC 5' (SEQ ID NO:2) concebida para conter o terminador de transcrição de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (Wells et al., Nucleic Acid Research, vol. 11, p. 7911-7925 (1983)). O plasmídeo pBLapr foi construído contendo o gene para a-amilase de Bacillus licheniformis. Tal como ilustrado na figura 7, pBLapr compreende um plasmídeo de 6,1 kb incluindo o gene de resistência a ampicilina de pBR322 e o gene de resistência a cloranfenicol de pCl94, o promotor aprE e o gene 22 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ que codifica α-amilase de Bacillus licheniformis (BL AA"). O promotor aprE foi construído a partir de um fragmento de 660 pb HindIII-PstI que codifica o promotor e uma sequência de sinalização da protease alcalina de Bacillus subtilis. Removeu-se o local Pstl e adicionou-se um local Sfll perto da junção aprE/BL AA. O gene BL AA compreende o fragmento de 1720 pb Pstl-Ssti descrito anteriormente. No trabalho aqui descrito, construiu-se pBLapr com um local Sfil adjacente à extremidade 5' do início da sequência de codificação do gene da amilase madura. Especificamente, a extremidade 5' da construção pBLapr foi subclonada para um fragmento EcoRI-SstII de pBLapr para M13BM20 (Boehringer Mannheim) para obter um molde de cadeia de codificação para o seguinte oligonucleótido mutagénico: 5'- CCC ATT AAG ATT GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG - 3' (SEQ ID NO:3)

Este iniciador introduziu um local Sfil (indicado a sublinhado) que permite o rastreio das formas correctas para a presença deste local de restrição único. A subclonagem do fragmento EcoRI-SstII de novo para o vector pBLapr proporcionou uma versão do plasmídeo contendo um local Sfil. O plasmídeo pHPl3 (Haima et al., Mol. Gen. Genet., vol. 209, p. 335-342 (1987)) (figura 6) foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e o vector resultante foi purificado num gel de poliacrilamida e seguidamente eluído. O plasmídeo pBLapr foi digerido com HindIII, Asp718 e numa incubação separada com Asp718, EcoRI e purificou-se em gel. Purificaram-se em gel duas bandas, Hindlll-Asp718 (1203 pb) e Asp718-EcoRI (1253 pb), eluíram-se do gel e ligaram-se ao vector através de uma ligação de 3 vias, para obter o plasmídeo pHP.BL, o plasmídeo utilizado na expressão da a-amilase (figura 8). 23 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Referência EXEMPLO 2

Construção do plasmídeo que codifica g-amilase compreendendo substituições de asparagina 188

Sintetizou-se uma série de iniciadores mutagénicos que codificam substituições de Asnl88 ("N188") por cada um dos aminoácidos de ocorrência natural e apresentam-se na figura 1 (SEQ ID NOS:4-22). As mutações do gene de α-amilase que codificam estas alterações foram preparadas por PCR, de acordo com o procedimento sumarizado na figura 9, utilizando os iniciadores de PCR apresentados na figura 2 (SEQ ID NOS:23-32) .

Etapa (1) : Utilizaram-se os iniciadores mutagénicos como moldes para os iniciadores de PCR, PCR A+ e PCR B- resultando num ADN em cadeia dupla com maior comprimento (61 pb). Cada um continha uma substituição por um aminoácido diferente na posição 188 e todos, excepto N188M, continham um local de restrição diferente. Inicialmente, hibridaram-se os iniciadores de PCR a 35 °C durante cinco minutos, seguido por um minuto de extensão de ADN com taq polimerase a 75 °C. O ADN em cadeia dupla foi então fundido a 95 °C durante um minuto, seguido pelas etapas de hibridação e extensão. Continuaram-se as etapas de fusão, hibridação e extensão durante um total de 30 ciclos.

Etapa (2): Preparou-se ADN a montante e a jusante da posição 188 em reacções de PCR separadas. O molde foi pBLapr, e os iniciadores de PCR foram LAAfs5 (SEQ ID NO:27) e PCR A-(SEQ ID NO: 24) para ADN a montante; PCR B+ (SEQ ID NO:25) e PCR Cla-Sali (SEQ ID NO:28) para ADN a jusante. Fundiu-se o ADN a 95 °C durante um minuto, hibridou-se a 45 °C durante três minutos e estendeu-se a 68 °C durante 3 minutos. A parte a montante tem 290 pb e a parte a jusante tem 498 pb. Repetiu-se este procedimento durante 18 ciclos utilizando pfu polimerase. Utilizou-se o mesmo procedimento de PCR nas etapas (3) e (4) . 24 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Etapa (3): A parte de ADN a montante descrita na etapa (2) foi ligada aos iniciadores mutagénicos em cadeia dupla descritos na etapa (1). Utilizaram-se os iniciadores LAAfsõ (SEQ ID NO:27) e PCR B- (SEQ ID NO:26). Em consequência da concepção do iniciador há uma sobreposição de 24 pb entre estes moldes, o que permite a ligação das duas partes de ADN.

Etapa (4): Ligaram-se as partes de ADN a jusante descritas na etapa (2) e o produto da etapa (3) para obter o produto final. A existência de uma sobreposição de 24 pb entre os dois produtos de PCR permite a sua ligação. Os iniciadores utilizados foram LAAfs5 (SEQ ID NO:27) e PCR Clal-Sall (SEQ ID NO:28).

Etapa (5): Os locais de restrição únicos, Asp718 e BssHII, localizam-se a montante e a jusante, respectivamente, do local 188. O produto de PCR final foi digerido com Asp718 e BssHII, isolou-se o fragmento de 333 pb por electroforese em gel de poliacrilamida e subclonou-se para o vector pHP.BL para obter pHP.N188X.

Confirmaram-se as mutações por sequenciação didesóxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., vol. 74, p. 5463-5487 (1977)).

Com referência à sequência de ADN e ao sistema de numeração utilizado na figura 3, o codão que codifica a posição de aminoácido +188 está nos pares de bases 812-814. Os iniciadores de PCR A+ e A- correspondem aos pares de bases 784-807. Os iniciadores de PCR B+ e B- correspondem aos pares de bases 821-844. A extremidade 5' do iniciador de PCR LAAfs5 corresponde ao par de bases 518. A extremidade 5' do iniciador de PCR, PCR Clal-Seli corresponde ao par de bases 1317. O local Asp718 corresponde ao par de bases 724. O local BssHII corresponde ao par de bases 1053. 25 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Referência EXEMPLO 3

Construção de plasmídeo que codifica mutações em Ml5 e N188

Construiu-se um plasmídeo pBLapr com treonina substituída por metionina no aminoácido 15, de acordo com o pedido de patente U.S. série N° 08/194 664 (publicação PCT N° WO 94/18314) . Este plasmídeo (pBLaprM15T) foi digerido com Sfil e Asp718 e subclonou-se o fragmento do par de bases 477 para pHP.BL para criar pHP.Ml5T. De uma forma análoga à descrita anteriormente, exemplo 1, digeriu-se pHP.MlST com Asp718 e BssHll, purificou-se em gel e eluiu-se do gel. Subclonou-se o fragmento do par de bases 333 compreendendo Asp718 até BssHII e o fragmento desde pHP.Nl88S para pHP.M15T para obter o plasmídeo pHP.M15T/N188S. Construiu-se o plasmídeo pHP.M15L/N188Y de forma análoga, iniciando com os plasmídeos pBL aprMl5L e pHP.Nl88Y.

Referência EXEMPLO 4

Transformação de plasmídeos para Bacillus subtilis. Expressão e Purificação de g-amilase mutante

Expressou-se α-amilase em Bacillus subtilis após transformação com os plasmídeos descritos nos exemplos 1-3. pHl3 é um plasmídeo capaz de replicar em E. coli e em Bacillus subtilis. Construíram-se plasmídeos contendo diferentes variantes utilizando E. coli estirpe MM294, isolaram-se os plasmídeos e seguidamente transformaram-se para Bacillus subtilis, tal como descrito em Anagnostopoulos et al., J. Bacter., vol. 81, p. 741-746 (1961). Tinham sido deletadas duas proteases (Aepr, Anpr) (consultar e.g., Ferrari et al., patente U.S. N° 5 264 366) e amilase (AamyE) (consultar e.g., Stahl et al., J. Bacter., vol. 158, p. 411-418 (1984)) na estirpe de Bacillus. Verificou-se que a estirpe de Bacillus que expressa M15UN188Y forma zonas límpidas maiores do que a estirpe que expressa M15L em placas de ágar-ágar contendo amido insolúvel a 1%, indicando actividade amiolítica aumentada. Após transformação, introduziu-se a mutação sacU(Hy) (Henner et al., J. Bacter., vol. 170, p. 296-300 26 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ (1988)) através de transdução mediada por PBS-1 (Hoch, J. Bact., vol. 154, p. 1513-1515 (1983)).

As amilases excretadas foram recuperadas rotineiramente das culturas de Bacillus subtilis da seguinte forma: Ajustou-se o sobrenadante de cultura com sulfato de amónio saturado a 20% e agitou-se durante uma hora a 4 °C. Após centrifugação, ajustou-se o sobrenadante resultante com sulfato de amónio saturado a 70% e agitou-se durante uma hora a 4 °C. Após centrifugação do sobrenadante, redissolveu-se o residuo resultante em acetato de sódio 50 mM, pH 6,0, cloreto de cálcio 5 mM e esterilizou-se por filtração.

Referência EXEMPLO 5

Ensaio para determinar a actividade de g-amilase

Ensaio de substrato solúvel: Desenvolveu-se um ensaio de velocidade com base num kit de ensaio de ponto final fornecido por Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. Dissolveu-se um frasquinho de substrato (p-nitrofenilmalto-heptósido, BPNPG7) em 10 ml de água estéril seguido por uma diluição 1:4 em tampão de ensaio (tampão de maleato 50 mM, pH 6,7, cloreto de cálcio 5 mM, Tween20 a 0,002%). Os ensaios efectuaram-se por adição de 10 μΐ de amilase a 790 μΐ do substrato numa cuvete a 25 °C. Mediram-se as velocidades de hidrólise como a velocidade de variação de absorvância a 410 nm, após um intervalo de 75 segundos. O ensaio foi linear até velocidades de 0,2 unidades de absorção/min.

Mediu-se a concentração de proteína α-amilase utilizando o ensaio Bio-Rad padrão (Bio-Rad Laboratories) com base no método de Bradford, Anal. Biochem., vol. 72, p. 248 (1976) utilizando padrões de albumina do soro bovina.

Ensaio de hidrólise de amido: Determinou-se a actividade de α-amilase no amido através de um ensaio que depende da capacidade do amido formar um complexo de cor azul com iodo e o desaparecimento dessa cor, quando o amido é hidrolisado a moléculas de dextrina mais pequenas. Definiu-se a actividade 27 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ de α-amilase em termos do tempo de digestão necessário para provocar uma mudança de cor indicativa de um estado definido de dextrinação do amido.

Os reagentes utilizados foram os seguintes:

Tampão fosfato - Dissolveu-se di-hidrogenofosfato de potássio (340 g) e hidróxido de sódio (25,3 g) em água e diluiu-se a dois litros. Arrefeceu-se o tampão à temperatura ambiente e ajustou-se o pH a 6,2±0,1. Diluiu-se o tampão a dois litros num balão volumétrico.

Substrato de amido - Suspendeu-se dez gramas (substância seca) de cozimento de amido solúvel em 50 ml de água e lavou-se para -300 ml de água a ferver. Levou-se novamente a suspensão à ebulição e ferveu-se durante cinco minutos com agitação constante. Arrefeceu-se a solução de amido com agitação constante até à temperatura ambiente e adicionou-se 125 ml de tampão fosfato. Diluiu-se a solução a 500 ml com água. 0 substrato de amido foi preparado de novo diariamente.

Solução mãe de iodo - Dissolveram-se cristais de iodo (5,5 g) e iodeto de potássio (11,0 g) em água e diluiu-se volumetricamente a 250 ml. Manteve-se a solução ao abrigo da luz.

Solução de iodo diluída - Dissolveu-se iodeto de potássio (20 g) e dois ml de solução mãe de iodo em água e diluiu-se volumetricamente a 500 ml. Preparou-se a solução de novo diariamente.

Solução de diluição de enzima - Dissolveu-se cloreto de cálcio (11,1 g) em quatro litros de água. A água utilizada para todos os reagentes foi destilada ou desionizada.

Diluiu-se uma amostra de α-amilase entre 10-15 LU/ml (tal como definido seguidamente) com solução de diluição de enzima. Para muitas das preparações de α-amilase comerciais verificou-se que 2000 vezes era uma diluição adequada. Colocaram-se 28 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ alíquotas de cinco mililitros de solução diluída de iodo em tubos de ensaio de 13 x 100 mm e colocou-se 10 ml de substrato de amido num tubo de ensaio de 23 x 200 mm. Colocaram-se todos os tubos num banho de água a 30 °C. Utilizou-se um comparador Hellige equipado com um disco colorido especial de a-amilase (número de catálogo 620-s5) para efectuar as leituras. Misturou-se cinco mililitros de enzima diluída (também a 30 °C) com o substrato de amido e iniciou-se a contagem de tempo. A intervalos de tempo adequados, por exemplo intervalos de um minuto no início da reacção e de 15 segundos posteriormente, transferiram-se alíquotas de um ml da mistura de enzima-substrato para um tubo contendo a solução diluída de iodo. Misturou-se a solução de amido e iodo e transferiu-se para um tubo quadrado de precisão de 13 mm e comparou-se a cor com o disco colorido de α-amilase padrão no comparador de Heilige. Quando se aproximou o tempo do ponto final, retiraram-se amostras a intervalos de 0,25 minutos.

Registou-se o tempo necessário para que as cores das amostras e a cor do disco coincidissem e calculou-se a actividade (em liquefões por grama ou ml) de acordo com a fórmula: LU/ml ou LU/g = em que: LU = unidade de liquefão V = volume de enzima (5 ml ou grama) t = tempo de dextrinização (minutos) D = factor de diluição: volume de diluição dividido por ml ou g de enzima diluída. 29 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ

Referência Exemplo 6

Preparação e ensaio de alfa-amilases mutantes adicionais para estabilidade térmica

Bacillus stearothermophilus e Bacillus amyloliquefaciens produzem uma α-amilase que tem pior estabilidade do que a a-amilase produzida por Bacillus licheniformis. A partir de um alinhamento destas amilases, identificaram-se os resíduos que diferem em B. stearothermophilus ou B. amyloliquefaciens comparativamente a B. licheniformis. A partir desta análise, prepararam-se α-amilases mutantes com base na sequência de B. licheniformis com substituições em uma ou mais de cinco posições para as quais os resíduos correspondentes em Bacillus stearothermophilus e Bacillus amyloliquefaciens eram idênticos mas diferentes dos de B. licheniformis: A33S, A52S, N96Q S148N, A379S em combinação com M15T/H133Y/N1885/A209V e comparativamente com um mutante compreendendo apenas substituições M15T/H133Y/N1885/A209V. Adicionalmente, incorporou-se a mutação S85D que representa apenas um recrutamento da α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens. Prepararam-se as mutações de acordo com os procedimentos apresentados nos exemplos 1-4, excepto pelo facto de se terem proporcionado iniciadores de PCR adequados para efectuar as mutações pretendidas.

Mediram-se as velocidades de inactivação térmica para os vários mutantes de acordo com o seguinte procedimento. Dialisaram-se extensamente soluções mãe de amilase com acetato de amónio 20 mM, CaCl2 4 mM, pH 6,5. Para medição da estabilidade, diluiu-se esta solução mãe >50 vezes para uma solução concebida para induzir inactivação rápida de amilase de tipo selvagem: acetato de amónio 50 mM, CaCl2 5 mM, para Tween 20 e um pH de 4,9 ou 4,8 para uma concentração final entre 30 e 50 pg/ml. Colocaram-se seis alíquotas de 100 μΐ em tubos Eppendorf e colocaram-se num banho de água a 82 °C ou 83 °C. Removeram-se os tubos Eppendorf a intervalos regulares e medidos entre 30 segundos e 5 minutos e colocaram-se em gelo para parar a inactivação. Ensaiou-se a actividade residual 30 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ utilizando um substrato solúvel, tal como descrito no exemplo 5. Representou-se graficamente o logaritmo neperiano da actividade em função do tempo de incubação e obteve-se a constante de velocidade para inactivação a partir do declive da linha recta. Calculou-se o tempo de semivida como ln(2) a dividir pela constante de velocidade. Apresentam-se os resultados para vários mutantes nas tabelas 1-4. TABELA 1 pH 4,9, 83 °C Variante Constante de velocidade de inactivação (min-1) ti/2 (min) M15T/H133Y/N188S/A209V 0,171 4,05 M15T/D28N/A33S/H133Y/N188S/A209V 0,137 5, 06 M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V/L230F 0,144 4, 81 M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V/I479T 0,162 4, 27 M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/G433D 0,121 5, 73 M15T/H133Y/N188S/A209V/A379S 0,145 4,78 TABELA 2 pH 4,85, 83 °C Variante Constante de velocidade de activação (min-1) 11/2 (min) M15T/H133Y/N188S/A209V 0,252 2, 75 M15T/H133Y/N188S/A209V 0,235 2, 95 M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S 0,114 6, 05 31 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ TABELA 3 pH 4,85, 82 °C Variante Constante de velocidade de inactivação (min-1) tl/2 (min) M15T/H133Y/N188S/A209V 0,203 3, 41 M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S 0,106 6,54 M15T/H133Y/N188S/A209V/A210ST322A/A379S 0,141 4,89 M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V 0,122 5,65 TABELA 4 pH 4,85, 82 °C Variante Constante de velocidade de inactivação (min-1) 11/2 (min) Tipo selvagem >2,0 <0,35 M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S >1, 9 <0,36 M15T/H133Y/N188S/A209V 0,267 2, 59 M15T/S85D/H 133Y/N188S/A209V 0,236 2,93 EXEMPLO 7

Recrutamento de resíduos de celulases menos estáveis para celulases mais estáveis para melhoria da estabilidade das celulases mais estáveis

Obtiveram-se homólogos de celulase de Trichoderma reesei EGIII de várias espécies e ensaiaram-se para estabilidade térmica. As celulases foram obtidas de (A) Hypocrea schweinitzii, (B) Aspergillus aculeatus, (C) Aspergillus kawachii, (D) Gliocladium roseum (1), (E) Gliocladium roseum (2), (F) Gliocladium roseum (3) e (G) Humicola grisea. De entre as anteriores, as celulases (a) a (f) são menos estáveis termicamente do que EGIII nas condições do ensaio. A celulase (g) é mais estável do que EGIII. Assim, a partir das sequências alinhadas destas celulases (tal como apresentado na 32 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ figura 11), é possível seleccionar os resíduos que existem na celulase menos estável comparativamente à celulase mais estável. Para simplificar a leitura da tabela, as posições marcadas para mutação estão realçadas a negrito. Prepararam-se então mutantes de EGIII com base nesta informação. Além disso, preparou-se a celulase mutante (g) com base nos recrutamentos de egiii.

Efectuaram-se experiências de dicroismo circular de equilíbrio num espectrofotómetro Aviv 62DS ou 62ADS, equipado com um suporte de célula termoeléctrico de 5 posições fornecido por Aviv. As condições de tampão foram bis-trispropano 50 mM e acetato de amónio 50 mM ajustado a pH 8,0 com ácido acético. A concentração final de proteína para cada experiência foi na gama de 5-30 μΜ. Recolheram-se os dados numa célula de passo óptico de 0,1 cm.

Obtiveram-se espectros de 265—10 nm. Efectuaram-se desnaturações térmicas a 217 nm de 30 a 90 °C com obtenção de dados de dois em dois graus. O tempo de equilíbrio a cada temperatura foi de 0,1 minutos e recolheram-se dados durante 4 segundos por amostra. A restante amostra a pH 8,0 foi dividida em alíquotas de 5 x 400 uL. Ajustou-se o pH de duas amostras a 5 e 7 com ácido acético e o pH de outras duas amostras foi ajustado a 9 e 10 com hidróxido de sódio. As desnaturações térmicas de todas as amostras foram efectuadas simultaneamente tal como descrito anteriormente. A tabela 5 ilustra 24 mutantes que foram preparados com base nos recrutamentos de celulases menos estáveis para EGIII e 3 mutantes que foram preparados com base nos recrutamentos de EGIII para um homólogo isolado de Humicola grisea (note que a numeração na tabela 5 para H. grisea se baseia na numeração de EGIII na figura 11) . Um número significativo, de entre estes, apresentou estabilidade melhorada relativamente à molécula de tipo selvagem (EGIII ou celulase (g)) tal como apresentado a negrito na tabela 5. 33 ΕΡ 1 240 524/ΡΤ TABELA 5

Mutação ATm Tm (SC) Erro do ajuste PR Produto 54,10 0, 09 0 WT EG3 54,60 0, 18 1 W7Y -1,03 53, 40 0, 24 2 T11S/T16I 1,07 55,50 0, 13 3 A35S -4,03 50, 40 0, 14 4 S39N 0,47 54, 90 0, 17 5 G41A 2,47 56,90 0, 11 6 S63V -0,83 53,60 0, 11 7 A66N 0,07 54,50 0, 10 8 S77G 0,07 54,50 0, 09 9 N91D 0,47 54, 90 0, 17 10 S143T 0,47 54, 90 0, 12 11 T163S 0,27 54, 70 0, 07 12 N167S 0,17 54,60 0, 10 13 A188G 0,47 54, 90 0, 17 14 G31Q -14,03 40, 40 0, 15 15 Q162P 0,07 54,50 0, 19 16 Y168F -0,03 54, 40 0, 12 17 N174D 1,17 55,60 0, 44 18 V192L -0,23 54,20 0, 13 19 N164D -2,33 52,10 0, 33 20 P201C 3,9/17,4 58,3/71,8 0,15/0,23 21 V210C 0,47 70,60 70, 80 22 Q162P/T166P (17a* R2-2) -1, 43 53, 00 0, 29 23 M79I -7,13 47,30 0, 27 24 T145E/Y147W (25a4) 0,77 55,20 0, 05 GO WT H. greisii 0, 00 68,5 0, 11 Gl C210V 1,50 70 0,2 G2 C170G 2,10 70, 6 0, 23

Lisboa, 2011-01-26

Claims (6)

1. ΕΡ 1 240 524/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Celulase melhorada compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi modificada a partir de uma sequência de aminoácidos precursora com a sequência da celulase de T. reesei EGIII apresentada na figura 11, em que a referida modificação compreende uma substituição P201C, em que a referida numeração de aminoácidos é como na figura 11; em que a celulase melhorada tem uma estabilidade térmica aumentada comparativamente a uma celulase com a sequência de aminoácidos precursora.
2. 2. Sequência de ADN que codifica uma celulase de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Vector de expressão compreendendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Célula hospedeira compreendendo uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 2 ou um vector de expressão de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Método de produção de uma celulase de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: a) modificar uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos precursora para produzir uma sequência de ADN modificada tal como definida na reivindicação 2 que codifica a celulase melhorada; b) expressar a sequência de ADN modificada numa célula hospedeira; e c) purificar a proteína celulase expressa. ΕΡ 1 240 524/ΡΤ 2/2
6. 6. Utilização de uma celulase de acordo com a reivindicação 1 em redução de biomassa, produtos de limpeza ou composições para o tratamento de têxteis. Lisboa, 2011-01-26 EP 1 240 524/PT 1/16 Ν188Τ 5 * -G GAT TGG GAA GTG TCG ACT GAA AAC GGC AAC TAT GAT-31 (SEQ ID N0:4) nJ 03 tn Õ Z Q O LU 03 to õ σ Uico K õz q O UJ 03 « õ O Ό UJ 03 σ» O Q O UJ 03 O Z o σ UJ 03 CM ô Zg 5 UJ 03 λ Ò z D σ UJ 03 0 U u |t Et Et 0 t O 0 g |t Et 4 0 0 J tn n. 00 oo Et £§ Et Í5 I ϋ O Oo is O rií Etí O O O n is 0 E· 4 E< 5 U o 0 ϋ co 1 Ei 4 01% υ 0 O 5s 0 o JZ χ- .g?„, to UJ O 0 03 -tu- cn m -nr- O) x 9 ω À 0δ U O |hi Et Et 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Et Et Et Et Et E« Et Et Et Et Et Et Et Et Et Et 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O I I 1 t 1 1 1 1 1Λ tn in tn tn tn tn ΙΛ tr < 0 > 3«; σ x 00 00 co 00 00 oo oo co 00 oo 00 co co 00 co co T* T“ 1**“ T* T— T— Z Z z Z Z z z Z FIG—1A ΕΡ 1 240 524/ΡΤ 2/16 G Ιο Ν 00 σΓ Ο **"κ τ· λΓ τ- 1— r* Τ“ Τ 0J OJ 01 6 Õ Ο Ο Õ Ο ο Ο Ο ζ ζ ζ ζ ζ Ζ ζ ζ Ζ Q ο 9 9 9 ο ο Q 9 σ σ σ σ σ σ σ σ σ UJ m LU UJ UJ LU UU LU UJ ω (0 C0 ω CO Í0 C0 C0 £0 m t S ϋ (Ό Β η ι 3 Β Μί Β η ι Β < Β S S rt Β ϋ 0 <*«ΕΙ U U 0 0 r> Β < Ο ri! Β3 υ 0 O m ι <ω δ υ m ιS Οa ί η á ϋ β 0 S Ο Β < Β «á Λ I Η Ο ΗES ο ϊ Ό 0 CD ϋ 0 0 υ

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