ES2354866T3 - Celulasa de t. reesei con termoestabilidad mejorada. - Google Patents

Abstract

Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiera a proteínas mejoradas, y particularmente enzimas, que tienen características de estabilidad alteradas a través del reclutamiento de restos de una proteína homóloga o relacionada. También se describe un potente procedimiento que permite el desarrollo de 5 dichas proteínas mejoradas con gran precisión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Se han practicado de forma extensa procedimientos para mejorar las características funcionales de las proteínas con el fin de mejorar la utilidad de las proteínas en diversas solicitudes. A menudo, dichas técnicas implican el uso de la ingeniería de proteínas y la mutagénesis específica de 10 sitio para aislar y seleccionar restos de aminoácidos específicos que, en base a las propiedades de de los aminoácidos específicos y/o la estructura de la proteína, parecen ser especialmente relevantes o se demuestra que son relevantes a través de evidencias experimentales. Por ejemplo, Estell y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.760.025, sugieren la modificación de enzimas oxidativamente inestables que confieren estabilidad aumentada alterando los restos que son particularmente susceptibles a oxidación, 15 es decir, metionina, lisina, triptófano y cisteína, entre otros. Koths y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.752.585, sugieren un método para mejorar la estabilidad de oxidación de una proteína terapéutica haciendo una sustitución aminoacídica conservativa para cada resto de metionilo susceptible a oxidación con cloramina T. Barr y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.732.973, sugieren sustituir la metionina del sitio activo de 1-antitripsina con un aminoácido oxidativamente estable. 20

[0003] Las técnicas adicionales que se han sugerido incluyen modelación por homología de proteínas frente a proteínas evolutivamente cerradas para proporcionar una base para la ingeniería de proteínas. Siezen y col., Protein Engineering, vol. 4, Nº 7, págs. 719-737 (1991) describen una estrategia para mejorar las propiedades de las proteasas usadas en procedimientos industriales incorporando o duplicando características de enzimas más estables en una diana. Además, estas técnicas requieren 25 que se imparta una propiedad de una proteína más deseable a una proteína menos deseable. Sin embargo, en la práctica, la proteína más deseable es la diana para la que se desea desarrollar las características mejoradas. Por lo tanto, no es posible alinear una proteína de este tipo con una más deseable. Esto da pie a los investigadores a buscar técnicas no basadas en el conocimiento para obtener una mejora. 30

[0004] Las estrategias de mutación no basadas en el conocimiento se vuelven necesarias cuando hay un falta de información sobre la proteína de interés o cuando fallan las técnicas basadas en el conocimiento. Las técnicas no basadas en el conocimiento típicas comprenden métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis aleatoria, PCR propenso a error y técnicas de transposición en el patrón de PCR, así como desarrollos más recientes, tales como la transposición descrita en Steamer y col., 35 Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793. La mutagénesis aleatoria se ha usado durante muchos años con diversos niveles de éxito divulgados a lo largo de la bibliografía. Sin embargo, la mutagénesis aleatoria es una estrategia de acierto o fallo debido al gran número de mutantes posibles. Por ejemplo, una proteína de 300 aminoácidos tiene un número posible de mutantes aleatorios del orden de 30020. Preparar, expresar y detectar un gran número de mutantes de este tipo, incluso usando las técnicas de 40 detección actuales, es imposible. Las técnicas de evolución dirigida, tales como "transposición génica" como se describe por Stemmer u otras técnicas de desarrollo molecular se limitan por las combinaciones de mutantes disponibles. Sin embargo, las combinaciones de mutantes deben producirse de forma natural o usando mutagénesis aleatoria si el conocimiento sobre la proteína es insuficiente. Sin embargo, esta combinación de variantes se incluye potencialmente para proporcionar una combinación 45 centrada de forma óptima de diversos organismos necesarios para un grado de éxito razonable.

[0005] Ha habido un esfuerzo considerable en el campo de la ingeniería de proteínas para producir enzimas más estables. No obstante, dado el inmenso contenido de información presente en muchas proteínas importantes, deben desarrollarse procedimientos mejorados para enfocar de forma inteligente un conjunto de moléculas mutantes hacia un efecto específico para aprovechar al máximo la 50 gama de diversidad biológica. Según se describe a continuación, los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva técnica de mutagénesis basada en el conocimiento que prevé excelentes probabilidades con relación a la producción de nuevas proteínas que tienen un rendimiento mejorado, es

decir, características funcionales. Gracias a la práctica de la técnica de la presente invención, es posible para un investigador desarrollar un conjunto centrado de mutantes a partir de los cuales se facilita la selección de una proteína "ganadora" deseable.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0006] Al hacer frente el problema de mejorar el rendimiento de las proteínas con respecto a una 5 propiedad funcional específica, los investigadores a menudo se enfrentan a obstáculos significativos en cuanto a la determinación de las mutaciones apropiadas para hacer en una proteína. La falta de estructuras cristalinas de muchas proteínas y la incertidumbre involucrada en alineamientos de baja homología con respecto a una proteína comparativa para la que las estructuras cristalinas se conocen, son impedimentos significativos para las estrategias de mutación basadas en el conocimiento. Además, 10 las técnicas de mutagénesis aleatoria u otras estrategias de mutación no basadas en el conocimiento, tales como caldo molecular, a menudo aciertan o fallan proposiciones que requieren la exploración de números masivos de mutantes que incluso no garantizan que ocurra la mutagénesis óptica. Sin embargo, a menudo el investigador que busca mejorar una cierta característica de una proteína tiene a mano una familia de estructuras primarias relacionadas, la mayor parte de las cuales son inferiores en 15 rendimiento con respecto a la proteína que se busca mejorar. Esto surge naturalmente del hecho de que la mejor proteína a menudo se selecciona como la diana principal. Sin embargo, esta "mejor proteína" tiene fallos significativos, cuya mejora tendría grandes beneficios comerciales o industriales. Por lo tanto, el investigador se queda con el problema de determinar cómo modificar la proteína de forma que no afecte a las propiedades deseables de la proteína diana, pero mejorando otras propiedades. En este 20 contexto, los científicos en este documento determinaron que usando alineamientos con proteínas menos deseables, es decir, enzimas menos estables o menos activas, es posible deducir modificaciones de aminoácidos que tendrán una gran posibilidad de éxito en función de ser aceptadas por la "mejor proteína" y sin trastornar en absoluto las buenas propiedades de la misma. De hecho, a menudo de forma natural ya se ha determinado que la modificación seleccionada trabajará en el procedimiento para 25 el que se destina, la probabilidad de éxito es mucho mayor.

[0007] En este documento se describe un procedimiento para obtener proteínas que tienen características funcionales mejoradas, incluyendo, por ejemplo, estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada. 30

[0008] Es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína, por ejemplo, una enzima, que tiene estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada.

[0009] Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una celulasa mejorada que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha modificado a partir de una secuencia de 35 aminoácidos precursores que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei mostrada en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene termoestabilidad aumentada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia de aminoácidos precursores.

[0010] La invención proporciona adicionalmente una secuencia de ADN que codifica la celulasa, 40 junto con un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN y una célula huésped que comprende la secuencia de ADN o el vector de expresión.

[0011] También se proporciona un procedimiento para producir una celulasa mejorada de acuerdo con la invención, comprendiendo el procedimiento:

(a) modificar una secuencia de ADN que codifica la secuencia precursora de aminoácidos 45 para producir una secuencia de ADN de acuerdo con la invención que codifica la celulasa mejorada;

(b) expresar la secuencia de ADN modificada en una célula huésped; y

(c) purificar la proteína de celulasa expresada.

[0012] Además, se proporciona el uso de la celulasa mejorada en la reducción de biomasa, productos de limpieza o composiciones para el tratamiento de tejidos.

[0013] El documento WO 95/24471 se refiere a las celulasas de la Familia 7 y variantes de las celulasas que comprenden un núcleo y opcionalmente un enlace C-terminal que consiste en 10 aminoácidos como máximo. 5

[0014] El documento WO 99/31255 se refiere a las celulasas EGIII y similares a EGIII que comprenden una cadena de aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en uno o más de:

(a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly

(b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp

(c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr 10

(d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Thr/Phe); y

(e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr.

[0015] También se describe en este documento un procedimiento para mejorar una propiedad deseada de una primera proteína que comprende las etapas de: (a) determinar la secuencia primaria de aminoácidos de una primera proteína y una segunda proteína homóloga y alinear dichas secuencias 15 primarias de aminoácidos para producir una alineamiento de secuencias primarias de aminoácidos, teniendo dicha segunda proteína homóloga características menos deseables en función de dicha propiedad deseada que dicha primera proteína; (b) identificar restos que se diferencian en las posiciones correspondientes entre dicha primera proteína y dicha segunda proteína homóloga en dicho alineamiento de secuencias primarias de aminoácidos; (c) preparar proteínas mutantes en las que se 20 hace una sustitución, deleción o adición en dicha primera proteína que corresponde a al menos uno de dichos restos que se diferencian a los que se han seleccionado en la etapa (b); (d) explorar dichas proteínas mutantes para obtener un rendimiento mejorado con respecto a dicha propiedad funcional; (e) seleccionar y determinar la identidad de dichas proteínas mutantes que tienen dicho rendimiento mejorado, en las que dichas proteínas mutantes mejoradas se diferencian en al menos un resto de tanto 25 dicha primera proteína como dicha segunda proteína homóloga, y dicha primera proteína mejorada tiene una función mejorada en función de dicha propiedad mejorada. El alineamiento de la primera proteína puede hacerse con más de una segunda proteína homóloga, y las sustituciones que se han seleccionado en la etapa (c) pueden escogerse de los restos que existen en una porción significativa o todas proteínas homólogas en la posición específica seleccionada para mutación. La proteína mejorada 30 puede tener propiedades de estabilidad mejoradas, alcalina, pH, térmicas u oxidativas, en comparación con una proteína que corresponde a la secuencia de aminoácidos precursores. Además, la proteína puede ser una enzima, por ejemplo, una -amilasa, lipasa, celulasa o proteasa.

[0016] También se describe un procedimiento para la producción de una proteína diana que tiene una mejora en una propiedad deseada en comparación con una primera proteína proporcionada que 35 comprende: (a) alinear las secuencias de aminoácidos de al menos dos proteínas comparativas, una de cuyas proteínas comparativas tiene un rendimiento menos deseable que la otra en función de dicha propiedad deseada; (b) identificar las posiciones en las que los restos se diferencian entre dichas enzimas comparativas y determinar los restos que están presentes en dichas posiciones identificadas en la proteína comparativa que tiene un rendimiento menos deseable en función de dicha propiedad 40 deseada; (c) seleccionar uno o más de los restos que se han determinado en la etapa (b); (d) modificar dicha proteína en una posición que corresponde a la posición en dicha proteína comparativa en la que los restos se han seleccionado en la etapa (c) y sustituir, suprimir o añadir dicho resto seleccionado en dicha primera proteína; en la que dicha proteína diana mejorada se diferencia en al menos un resto de tanto dicha primera proteína como dichas proteínas comparativas, y dicha proteína diana tiene una 45 función mejorada en función de dicha propiedad deseada.

[0017] La comparación puede hacerse con más de una segunda proteína homóloga, y puede reclutarse en la primera proteína un resto que existe únicamente en todas o varias segundas proteínas homólogas menos estables en todas o varias de las segundas proteínas homólogas menos estables para elaborar la proteína mejorada. 50

[0018] Por lo tanto, en este documento se describe una proteína mejorada obtenida de acuerdo con un procedimiento descrito en este documento en el que dicha proteína comprende una modificación de acuerdo con un procedimiento descrito.

[0019] Una ventaja de los procedimientos descritos, es que es posible producir proteínas que tengan propiedades más deseables a través de una técnica simple de análisis de las secuencias 5 alineadas de dos proteínas homólogas que se diferencian en función de dichas propiedades.

[0020] Otra ventaja es que es posible reducir significativamente los grupos de mutantes potenciales a un número de mutantes de fácil detección en comparación con los procedimientos de mutación no basadas en el conocimiento.

[0021] Otra ventaja más, es que no es necesario tener información con respecto a la estructura 10 terciaria de la proteína que se va a mejorar, únicamente se necesita un alineamiento de secuencia con una proteína homóloga.

[0022] Otra ventaja más, es que es posible mejorar adicionalmente una proteína superior en base a la información obtenida de las proteínas menos deseables, aumentando de este modo la agrupación de formación disponible para desarrollar de dichas proteínas mejoradas. 15

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023]

La Figura 1 ilustra oligonucleótidos mutagénicos útiles durante la mutagénesis dirigida de Asn188 de la -amilasa de Bacillus licheniformis. En esta y las siguientes figuras que ilustran matrices de oligonucleótidos, las letras en negrita indican los cambios de bases 20 introducidos por los oligonucleótidos y el subrayado indica los sitios de endonucleasas de restricción introducidos por el oligonucleótido. -

La Figura 2 ilustra cebadores de PCR usados para el proceso de PCR de patrones de oligonucleótidos mutagénicos.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ADN del gen para la -amilasa de Bacillus licheniformis 25 (NCIB 8061) (SEQ ID NO: 33) y la secuencia de aminoácidos deducida del producto de traducción (SEQ ID NO: 41) según se describe en Gray y col., J. Bacteriology, vol. 166, págs. 635-643 (1986).

La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 34) de la enzima -amilasa madura de Bacillus licheniformis. 30

La Figura 5 ilustra un alineamiento de las estructuras primarias de tres -amilasas de Bacillus. La -amilasa de Bacillus licheniformis (Am-Lich) (SEQ ID NO: 35) se describe en Gray y col., J. Bacteriology, vol. 166, págs. 635-643 (1986); la -amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (Am-Amylo) (SEQ ID NO: 36) se describe en Takkinen y col., J. Biol. Chem., vol. 258, págs. 1007-1013 (1983); y la -amilasa de Bacillus stearothermophilus 35 (Am-Stearo) (SEQ ID NO: 37) se describe en Ihara y col., J. Biochem., vol. 98, págs. 95-103 (1985).

La Figura 6 ilustra el plásmido pHP13, en el que CmR se refiere a la resistencia al cloroanfenicol, EmR se refiere a la resistencia a la eritromicina y Rep pTA1060 se refiere al origen de la replicación del plásmido pTA1060. 40

La Figura 7 ilustra el plásmido pBLapr, en el que BL AA se refiere al gen de -amilasa de Bacillus licheniformis; aprE se refiere al promotor y a la región codificante del péptido señal del gen aprE; AmpR se refiere al gen de resistencia a ampicilina de pBR322; y CAT se refiere al gen de resistencia a cloroanfenicol de pC194.

La Figura 8 ilustra el plásmido pHP.BL que lleva el gen para la -amilasa de Bacillus 45 licheniformis.

La Figura 9 ilustra un procedimiento esquemático del PCR usado para producir los oligonucleótidos mutantes correspondientes a la -amilasa obtenida a partir de Bacillus licheniformis.

La Figura 10 ilustra las uniones de secuencia señal-proteínas maduras en -amilasa obtenida a partir de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 38), Bacillus subtilis aprE (SEQ ID 5 NO: 39) y Bacillus licheniformis en pBLapr (SEQ ID NO: 40).

La Figura 11 ilustra un alineamiento de secuencias de 8 enzimas de endoglucanasa homólogas que corresponden a ciertas celulasas obtenidas a partir de Trichoerma reesei (EGIII) (SEQ. ID NO: 41), Hypocrea schweinitzii (SEQ ID NO: 42), Aspergillus aculeatus (SEQ ID NO: 43), Aspergillus kawachii (SEQ ID NO: 44), Humicola grisea (SEQ ID NO: 45), 10 Gliocladium roseum (1) (SEQ ID NO: 46), Gliocladium roesum (2) (SEQ ID NO: 47), Gliocladium roseum (3) (SEQ ID NO: 48). La numeración que se proporciona se basa en la numeración de EGIII.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0024] "Vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que comprende una 15 secuencia de ADN que se une operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un huésped adecuado. Dichas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosomas de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Cuando se desea la expresión en un 20 huésped Bacillus, un promotor preferido es el promotor aprE de Bacillus subtilis. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fagos, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez que se ha transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma. Aunque el plásmido y el vector se usan a veces de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector que se usa más 25 habitualmente en la actualidad, la invención pretende incluir las demás formas de vectores de expresión que sirven como funciones equivalentes y que son, o serán, conocidas en la técnica.

[0025] "Cepa huésped" o "célula huésped" se refiere a un huésped adecuado para un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención. Las células huésped útiles en la presente invención generalmente son huéspedes procarióticos o 30 eucarióticos, incluyendo cualquier microorganismo transformable, en las que puede conseguirse la expresión de una proteína dada de acuerdo con la presente invención. Las células huésped no son el cuerpo humano en las diversas fases de su formación y desarrollo. Un experto en la materia estará familiarizado con el mecanismo de expresión y secreción apropiada, incluyendo la célula huésped apropiada, para su uso con una proteína específica. Por ejemplo, son adecuadas las cepas huésped de 35 la misma especie o género a partir de los cuales se obtiene la proteína en particular, por ejemplo, con una -amilasa obtenida de Bacillus, una célula huésped adecuada sería una cepa de Bacillus. En este caso, se usa preferentemente una cepa de Bacillus de -amilasa negativa (genes eliminados) y/o una cepa de Bacillus de -amilasa y proteasa eliminada (amyE, apr, npr). Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Dichas 40 células huésped transformadas son capaces de replicar vectores que codifican la proteína y sus variantes (mutantes) o de expresar la proteína deseada.

[0026] "Proteína recombinante" se refiere a una proteína en la que la secuencia de ADN que codifica la proteína de origen natural o precursora se modifica para producir una secuencia de ADN mutante que codifica la sustitución, inserción y deleción de uno o más aminoácidos en la secuencia de 45 proteína en comparación con una proteína de origen natural o precursora. Como se usa en este documento, la expresión proteína precursora (o enzima) no se refiere a un precursor intermedio en función de una reacción química, sino a la proteína parental a partir de la cual se modela la modificación. Por consiguiente, aunque es el precursor el que define la modificación, la alteración o modificación real tendrá su base en una alteración del ADN que codifica el precursor, cuyo ADN se transforma, se 50 expresa y el producto de la proteína se secreta incorporando la modificación.

[0027] La proteína mejorada de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína precursora

(también denominada en este documento como la "primera proteína"), siendo las modificaciones específicas en la proteína las que se proporcionan en este documento. La proteína precursora puede ser una proteína de origen natural o una proteína recombinante. La secuencia de aminoácidos de la proteína mejorada se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora mediante la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos 5 precursores. En general, dicha modificación se realiza en la secuencia de ADN precursora que codifica la secuencia de aminoácidos de las proteínas precursoras en lugar de la manipulación de la proteína precursora per se. Los procedimientos adecuados para dicha manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los procedimientos descritos en este documento y en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.760.025 y 5.185.258 del mismo solicitante, incorporadas en este documento por referencia. 10

[0028] "Propiedades deseadas" se refiere a cualquier propiedad para la que se deseada mejorar una proteína. Dichas propiedades deseadas pueden comprender propiedades funcionales, tales como estabilidad térmica, pH, alcalina, oxidativa o química, actividad catalítica, unión al sustrato, unión al receptor, alergenicidad, actividad antimicrobiana o cualquier otra característica deseable asociada a una proteína. 15

[0029] "Alineamiento de la secuencia primaria de aminoácidos" se refiere a un alineamiento de la secuencia primaria de al menos dos proteínas en función de la producción de un grado significativo de identidad de secuencia. Los algoritmos de alineamiento diferentes existen en forma de software disponible en el mercado que son adecuados y son de uso rutinario para un experto en la materia. Estos programas proporcionan la entrada de diferentes parámetros de algoritmos que pueden efectuar los 20 resultados obtenidos. Sin embargo, la presente invención no requiere una preferencia por ningún algoritmo de alineamiento de secuencia específico, ya que la elección es generalmente la optimización de los parámetros. En general, los alineamientos se consideran aproximados, y por lo tanto, el uso de diferentes procedimientos para optimizar el alineamiento debe proporcionar ventajosamente conjuntos ligeramente diferentes de mutantes a seleccionar. No obstante, ya que una ventaja de la presente 25 invención es producir un conjunto centrado de proteínas mutantes a partir de las cuales se seleccionan proteínas mejoradas, la presente invención debe aplicarse igualmente independientemente del programa o parámetros usados para determinar el alineamiento.

[0030] De acuerdo con un procedimiento descrito en este documento, una proteína se modifica como se indica a continuación para mejorar su rendimiento en función de una propiedad deseada. La 30 secuencia primaria de aminoácidos de la proteína que se va a modificar, denominada, "primera proteína", se alinea con la secuencia primaria de aminoácidos de una "segunda proteína homóloga" comparativa que tiene un rendimiento menos deseable en función de la propiedad deseada. A partir del alineamiento, se determinan las posiciones en las que los restos se diferencian y los restos presentes en la secuencia de la segunda proteína homóloga en la que se identifican las posiciones. Después, al 35 menos uno de los restos seleccionados de la etapa anterior se incorpora en la secuencia de aminoácidos de la primera proteína. Como se determina por los inventores, la proteína modificada producida de esta manera tiene una probabilidad significativa de tener un rendimiento mejorado en función de la propiedad deseada. Por consiguiente, un conjunto de proteínas mutantes producido de esta manera que tiene diversas combinaciones de restos identificados sustituidos, eliminados o 40 añadidos comprenderá, con toda probabilidad, un conjunto de proteínas mejoradas entre las cuales podrá después seleccionarse la "ganadora".

[0031] En una variación, es posible producir alineamientos de más de dos secuencias primarias de aminoácidos. En este procedimiento, la primera proteína se alinea con más de una secuencia primaria de aminoácidos de una segunda proteína homóloga, correspondiendo cada secuencia primaria 45 de aminoácidos de una segunda proteína homóloga a una proteína diferente que tiene una actividad menos beneficiosa que la que tiene la primera proteína. A partir de este alineamiento, se seleccionan restos que existen en una o más de las segundas proteínas homólogas en las posiciones en las que hay una diferencia entre la secuencia primaria de aminoácidos de la primera proteína y al menos dos de las secuencias primarias de aminoácidos de la segunda proteína homóloga. En una alternativa que extiende 50 el conjunto de mutantes disponibles, cada una de las variaciones entre la primera proteína puede usarse una segunda proteína homóloga como base para producir un mutante. En otra alternativa preferida que limita el número de mutantes disponibles a los más propensos a impartir con éxito características funcionales mejoradas en las proteínas mutantes seleccionadas, se seleccionan únicamente aquellas diferencias en las que cada una de las secuencias de una segunda proteína homóloga comprende un 55 resto idéntico.

[0032] En una variación del procedimiento anterior, el alineamiento se prepara con dos o más proteínas homólogas que no se comparan directamente con la primera proteína. Por ejemplo, dos proteínas comparativas homólogas, cada una de las cuales es capaz de alinearse con la primera proteína, se alinean para determinar donde difiere el resto. Después, el alineamiento resultante se analiza para determinar los restos en la proteína o proteínas comparativas que tienen un rendimiento 5 menos deseable en función de la propiedad deseada, y después este resto se sustituye, suprime o añade a la primera proteína en una posición correspondiente. En este procedimiento, no es necesario que las proteínas comparativas sean mejores o peores que la primera proteína, únicamente que el resto seleccionado para la modificación en la proteína diana se obtenga a partir de la proteína comparativa homóloga que tiene un rendimiento menos deseable en función de la propiedad deseada. Además, es 10 posible alinear más de dos secuencias primarias de aminoácidos de una segunda proteína homóloga y seleccionarlos entre ellas en base al rendimiento de las segundas proteínas homólogas en función de la propiedad deseada.

[0033] Los solicitantes han descubierto que puede obtenerse una proteína que tiene una propiedad funcional mejorada preparando un alineamiento de dos o más proteínas homólogas o 15 relacionadas y haciendo referencia a los restos que existen en diversas ubicaciones en las proteínas que tienen un rendimiento menos deseable en función de una propiedad deseada. Por ejemplo, pueden obtenerse mejoras ventajosas en las propiedades deseadas en un porcentaje significativo de dichas modificaciones comparando una primera proteína frente a una segunda proteína homóloga que tiene características menos deseables en función de la propiedad funcional, identificando restos que se 20 diferencian, preparando un conjunto de mutantes en base a dichas mutaciones diferentes, y seleccionando los mutantes que se mejoran en función de la propiedad deseada en comparación con la primera proteína. Por lo tanto, un uso excelente de los procedimientos de la presente invención es producir un conjunto relativamente pequeño y manejable de mutantes (en comparación con el grupo de mutantes aleatorios) a partir del cual es posible seleccionar una proteína que tenga propiedades 25 funcionales significativamente mejoradas al compararla con la primera proteína. Además, este resultado es posible sin tener demasiada información sobre la función de la estructura.

[0034] No es necesario que las proteínas alineadas tengan una actividad y una función comparable. Sin embargo, en un ejemplo preferido, las proteínas tienen actividad comparable, es decir, actividad biológica similar, función, actividad catalítica u otros criterios de este tipo que se usan 30 habitualmente para clasificar una proteína específica. Sin embargo, ya que los procedimientos de la presente invención se basan en la determinación de posiciones en las que la naturaleza ha determinado que puede existir un resto en el contexto de una proteína sin afectar significativamente su valor a un organismo huésped, no es necesario que todas las características de las proteínas comparadas sean idénticas, únicamente que tengan algo de homología. "Sustancialmente homólogo" se refiere a que las 35 proteínas tienen un nivel significativo de aminoácidos conservados, es decir, idénticos, de tal forma que sus secuencias puedan alinearse de forma significativa y se definan sitios estructurales principales, funcionales o catalíticos. Preferentemente, la primera proteína y las segundas proteínas homólogas tienen una identidad de secuencia de al menos el 30%, preferentemente una identidad de secuencia del 50%, más preferentemente una identidad de secuencia del 70% y mucho más preferentemente una 40 identidad de secuencia del 85%.

[0035] En un ejemplo, la proteína comprende una enzima. La enzima puede comprender cualquier enzima en las cinco clasificaciones de enzimas principales de hidrolasa, oxidorreductasa, transferasa, liasa o ligasa. Los ejemplos específicos de enzimas que pueden beneficiar los procedimientos de la presente invención incluyen amilasa, lipasa, celulasa, proteasa, hemicelulasa, 45 glucoamilasa, esterasa, lactasa, poligalacturonasa, -galactosidasa, ligninasa, oxidasa, peroxidasa, glucosa isomerasa o cualquier enzima para la que exista homólogos estrechamente relacionados y menos estables.

[0036] A continuación se ilustrará la -amilasa como ejemplar de los procedimientos y composiciones de la presente invención. "-Amilasa", como se usa en este documento, se refiere a una 50 actividad enzimática que escinde o hidroliza el enlace (1-4)glucosídico, por ejemplo, en de los polímeros de almidón, amilopectina o amilosa. La -amilasa incluye -amilasa de origen natural, así como -amilasas recombinantes. Las -amilasas preferidas en la presente invención con las obtenidas a partir de Bacillus sp., particularmente a partir de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefectens o Bacillus stearothermophilus, así como -amilasas fúngicas, tales como las obtenidas a partir de 55

Aspergillus (es decir, A. oyzee y A. niger). Por consiguiente, las -amilasas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se obtienen a partir de una -amilasa precursora. La -amilasa precursora se produce mediante cualquier fuente capaz de producir -amilasa. Las fuentes adecuadas de -amilasas son organismos procarióticos o eucarióticos, incluyendo hongos, bacterias, plantas o animales. Preferentemente, la -amilasa precursora se produce por un Bacillus; más preferentemente, 5 por Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefectens o Bacillus stearothemophilus; mucho más preferentemente, la -amilasa se obtiene a partir de Bacillus licheniformis.

[0037] Se han descubierto homologías entre casi todas las endo-amilasas secuenciadas hasta la fecha, que varían de plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima y col.; Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 23, págs. 355-360 (1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 128, págs. 470-476 (1985); 10 Janecek, Eur. J. Biochem., vol. 224, págs. 519-524 (1994)). Existen cuatro zonas de homología particularmente alta en ciertas amilasas de Bacillus, como se muestra en la Figura 5, en la que las secciones subrayadas designan las zonas de alta homología. También se han usado alineamientos de secuencias para mapear la relación entre las endo-amilasas de Bacillus (Feng y col., J. Molec. Evol., vol. 35, págs. 351-360 (1987)). La homología de secuencia relativa entre la amilasa de Bacillus 15 stearothermophilus y Bacillus licheniformis es de aproximadamente el 66% y entre las amilasas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens es de aproximadamente el 81%, como se determina en Holm y col., Protein Engineering, vol. 3, Nº 3, págs. 181-191 (1990). Para establecer la homología a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una -amilasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de -amilasa de Bacillus lichenlformis y particularmente con un 20 conjunto de restos conocidos que no variará para ninguna -amilasa, cuyas secuencias se conocen (véase, por ejemplo, la Figura 7). También es posible determinar los restos equivalentes mediante el análisis de estructura terciario de las estructuras cristalinas indicadas para la -amilasa pancreática porcina (Buisson y col., EMBO Journal, vol. 6, págs. 3909-3916 (1987); Qlan y col., Biochemistry, vol. 33, págs. 6284-6294 (1994); Larson y col., J. Mol. Biol., vol. 235, págs. 1560-1584 (1994)); Taka-amilasa 25 A de Aspergillus oryzae (Matsuura y col., J. Blochem. (Tokio), vol. 95, págs. 697-702 (1984)); y una -amilasa ácida de A. niger (Boel y col. Biochemistry, vol. 29, págs. 6244-6249 (1990)), siendo las dos estructuras anteriores similares, y para la -amilasa de cebada (Vallee y col., J. Mol. Biol., vol. 236, págs. 368-371 (1994); Kadzlola, J. Mol. Biol., vol. 239, págs. 104-121 (1994)). Aunque se han publicado algunos estudios preliminares (Suzuki y col, J. Blochem., vol. 108, págs. 379-381 (1990); Lee y col., 30 Arch. Biochem. Biophys, vol. 291, págs. 255-257 (1991); Chang y col, J. Mol. Biol., vol. 229, págs. 235-238 (1993); Mizuno y col., J. Mol. Biol., vol. 234, págs. 1282-1283 (1993)), únicamente hay una estructura publicada para la -amilasa de Bacillus licheniformis (Machlus y col., J. Mol. Biol. vol. 246, págs. 545-549 (1995)). Sin embargo, varios investigadores han predicho estructuras súper-secundarias comunes entre las glucanasas (MacGregor y col., Biochem. J., vol. 259, págs. 145-152 (1989)) y entre 35 las -amilasas y otras enzimas metabolizadoras de almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem. vol. 12, págs. 791-805 (1993); MacGregor, Starke, vol. 45, págs. 232-237 (1993)); y similitudes de secuencias entre enzimas con estructuras súper-secundarias similares a -amilasas (Janecek, FEBS Letters, vol. 316, págs. 23-26 (1993); Janecek y col., J. Prot. Chem., vol. 12, págs. 509-514 (1993)). Una estructura para la enzima de Bacillus stearothermophilus se ha modelado en base a la Taka-amilasa A (Holm y col., 40 Protein Engineering, vol. 3, págs. 181-191 (1990)). Las cuatro regiones altamente conservadas que se muestran en la Figura 7 contienen muchos residuos pensados para que formen parte del sitio activo (Matsuura y col., J. Blochem. (Tokio), vol. 95, págs. 697-702 (1984); Buisson y col., EMBO Journal, vol. 6, págs. 3909-3916 (1987); Vihinen y col., J. Biochem., vol.107, págs. 267-272 (1990)) incluyendo His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 y Asp +328 en el sistema de numeración de Bacillus 45 licheniformis. Se ha publicado la estructura cristalina de una enzima híbrida de amilasa bacteriana en la Publicación PCT Nº WO 96/23874.

[0038] Como se ha descrito anteriormente, las todas las -amilasas de Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus subtilis tienen un grado significativo de homología. Sin embargo, se sabe que en condiciones de licuefacción industrial de almidón, por ejemplo, 50 alta temperatura (exceso de 90ºC), bajo pH (pH 4-6) y bajo calcio, una -amilasa obtenida a partir de Bacillus licheniformis proporciona el rendimiento más aceptable. No obstante, incluso la -amilasa de Bacillus lichenifomris es susceptible a una inestabilidad indeseada en condiciones de licuefacción haciendo deseable una alternativa más estable. Por consiguiente, se ha trabajado mucho sobre la molécula derivada de Bacillus licheniformis con el fin de introducir a esta enzima propiedades que son 55 deseable junto con su uso en procedimientos de licuefacción. Alineando la secuencia de la -amilasa de Bacillus licheniformi frente a la de una -amilasa de Bacillus stearothermophilus o Bacillus

amylollquefaciens es posible identificar restos que difieren entre los homólogos. De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, después, las posiciones en las que los residuos se diferencian en -amilasa de B. stearothermophilus o B. amyloliquefaciens comparadas con la -amilasa de B. lichenlformis se seleccionan para la sustitución en -amilasa de B. licheniformis. El resto sustituido puede ser realmente un resto idéntico al que existen en la -amilasa de B. stearothermophilus o B. 5 amyloliquefaciens. El resto sustituido puede corresponder a una posición en la que existe el mismo residuo en tanto la -amilasa B. stearothermophilus como la B. amyloliquefaciens.

[0039] Los restos identificados específicamente en este documento para el reemplazo en Bacillus lichanitormis son aquellos que difieren de los restos en una posición correspondiente en Bacillus amyloliquefaciens y/o Bacillus stearothermophilus, y particularmente A33, A52, S85, N98, H133, S148, 10 A209, A269, A379 y A435. Los reemplazos específicos preferidos para estos residuos se seleccionan entre los presentes tanto en Bacillus amyloliquefaciens como Bacillus stearothermophilus y corresponden con A33S, A52S, N96Q, H133Y, S148N, A209V, A269K, A379S y/o A435S, apareciendo todos para contribuir a un beneficio en la estabilidad. También se ha descubierto que la mutación A85D, que se recluta únicamente de Bacillus amyloliquefaciens también proporciona un beneficio en la 15 estabilidad. Los restos anteriores pueden alterarse junto con otras modificaciones que proporcionan un beneficio en el rendimiento.

[0040] Las proteínas mejoradas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención muestran características de rendimiento mejoradas que hacen que estas proteínas sean particularmente útiles en diversas aplicaciones para las que se usan habitualmente las proteínas y para las que se desea 20 una estabilidad mejorada. Por ejemplo, las enzimas, incluyendo las -amilasas, mostrarán una termoestabilidad mejorada, estabilidad del pH mejorada y/o estabilidad oxidativa mejorada. La estabilidad potenciada será útil para prolongar la durabilidad de los productos que los incorporen y para aplicaciones a altas temperaturas. La estabilidad oxidativa potenciada o el rendimiento mejorado se desea particularmente en productos de limpieza, y para prolongar la durabilidad de la enzima en 25 presencia de lejía, perborato o perácidos usados en dichos productos de limpieza. Una -amilasa, como se describe en este documento, es especialmente útil en el procesamiento de almidón, y particularmente en la licuefacción de almidón, en la que es particularmente importante la estabilidad oxidativa y térmica. También se describen en este documento celulasas que tienen beneficios mejorados en la estabilidad y son particularmente útiles en, por ejemplo, la reducción de una biomasa, productos de limpieza o 30 composiciones para el tratamiento textil.

[0041] Una realización adicional de la presente invención comprende ADN que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención y vectores de expresión que comprenden dicho ADN. Las secuencias de ADN pueden expresarse uniéndolas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando este vector de expresión para transformar 35 un huésped apropiado de acuerdo con técnicas bien conocidas. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, incluyen segmentos de secuencias de ADN no cromosómicas y sintéticas, tales como los diversos plásmidos y fagos conocidos útiles para este fin. Además, en general se usa cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión en 40 estos vectores. Por ejemplo, con la -amilasa obtenida a partir de Bacillus, los Solicitantes han descubierto que una secuencia de control de expresión preferida para los transformantes de Bacillus es el péptido señal aprE obtenido a partir de Bacillus subtills.

[0042] También es útil una amplia variedad de células huésped para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien 45 conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, diversos hongos, levaduras y células animales. Preferentemente, el huésped expresa la proteína de la presente invención extracelularmente para facilitar la purificación y el procesamiento en la dirección 3'. La expresión y la purificación de la proteína mejorada de la invención puede efectuarse a través de medios reconocidos en la técnica para realizar dichos procedimientos. 50

[0043] Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como limitante del alcance de las reivindicaciones. Las abreviaturas usadas en este documento, particularmente notaciones de tres letras o una letra, se describen en Dale, J.W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, (1989) Apéndice B.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 DE REFERENCIA

CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PHP.BL

[0044] El gen -amilasa mostrado en la Figura 3 se clonó a partir de Bacillus lichenifomris NCiB8061 (Gray y col., J. Bacteriology, vol. 166, págs. 635-643 (1986)). El fragmento Psti-SstI de 1,72 5 kb, que codifica los tres últimos restos de la secuencia señal, la proteína madura completa y la región de terminación, se subclonó en M13mp18. Se añadió un terminador sintético entre los sitios BclI y SstI usando un casete de oligonucleótidos sintéticos de la forma:

BcII

SstI

5'-GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT-3'

(SEQ ID NO: 1)

3'-TTTTGTATTTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC-5'

(SEQ ID NO: 2)

diseñado para contener el terminador transcripcional de subtilisina de Bacillus amyloliquefaclens (Wells y col., Nucleic Acid Research, vol. 11, págs. 7911-7925 (1983)). 10

[0045] El plásmido pBLapr se construyó portando el gen para la -amilasa de Bacillus licheniformis. Según se ha ilustrado en la Figura 7, pBLapr comprende un plásmido de 6,1 kb que incluye el gen de resistencia a ampicilina de pBR322 y el gen de resistencia a cloranfenicol de pC194, el promotor aprE y el gen que codifica la -amilasa de Bacillus lichenifonnis (BL AA''). El promotor aprE se construyó a partir de un fragmento de Hindill-Psti de 660 pb que codifica el promotor y la secuencia 15 señal de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis. El sitio Pstl se eliminó y se añadió una dosis de sitio Sfll a la unión de aprE/BL AA. El gen BL AA comprende el fragmento Pstl-Sstl de 1720 pb que se ha descrito anteriormente. En el trabajo que se describe en este documento, pBLapr se construyó con un sitio Sfil adyacente al extremo 5' del comienzo de la secuencia codificante para el gen de amilasa madura. Específicamente, el extremo 5' de la construcción pBLapr se subclonó en un fragmento EcoRI-SstII a 20 partir de pBLapr en M13BM20 (Boehringer Mannheim) para obtener un patrón de hebra codificante para el oligonucleótido mutagénico que se indica a continuación: 5'-CCC ATT AAG ATT GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3' (SEQ ID NO: 3). Este cebador introdujo un sitio SfiI (indicado por subrayado) que permitió corregir las formas a explorar por la presencia de este único sitio de restricción. La subclonación del fragmento EcoRi-Sstil de nuevo en el vector pBLapr dio una versión del plásmido que 25 contenía un sitio SfiI.

[0046] El plásmido pHP13 (Haima y col., Mol. Gen. Genet., vol. 209, págs. 335-342 (1987)) (Figura 6) se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII y el vector resultante se purificó en un gel de poliacrimida y después se eluyó. El plásmido pBLapr se digirió con HindIII, Asp718 y en una incubación separada con Asp718, EcoRI y se purificó en gel. Dos bandas, HindIII-Asp718 (1203 pb) y 30 Asp718-EcoRI (1253 pb) se purificaron con gel, se eluyeron en gel y se ligaron en el vector por una ligadura de 3 vías para dar el plásmido pHP.BL, el plásmido usado en la expresión de la -amilasa (Figura 8).

EJEMPLO 2 DE REFERENCIA

CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO QUE CODIFICA LA -AMILASA QUE COMPRENDE 35 SUSTITUCIONES PARA ASPARAGINA 188

[0047] Una serie de cebadores mutagénicos que codifican para sustituciones de Asn188 ("N188") con cada uno de los aminoácidos de origen natural se sintetizaron y se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO: 4-22). Las mutaciones del gen de -amilasa codificantes para estos cambios se hicieron por PCR, de acuerdo con el procedimiento recopilados en la Figura 9, usando los cebadores de PCR que se 40 muestran en la Figura 2 (SEQ ID NO: 23-32).

[0048] Etapa (1): Los cebadores mutagénicos se usaron como patrones para los cebadores de PCR PCR A+ y PCR B- dando como resultado un ADN de doble hebra alargado (61 pb). Cada una

contenía un reemplazo de aminoácidos diferentes en la posición 188, y todos, excepto N188M, contenían un sitio de restricción diferente. Inicialmente, los cebadores de PCR se reconocieron a 35ºC durante cinco minutos seguido de una extensión de ADN de un minuto con polimerasa taq a 75ºC. Después, el ADN de doble hebra se fundió a 95ºC durante un minuto seguido de las etapas de reconocimiento y extensión. La fusión, el reconocimiento y la extensión continuaron durante un total de 5 30 ciclos.

[0049] Etapa (2): El ADN en la dirección 5' y en la dirección 3' de la posición 188 se hizo en reacciones PCR separadas. El patrón fue pBLapr, y los cebadores de PCR fueron LAAfs5 (SEQ ID NO: 27) y PCR A- (SEQ ID NO: 24) para el ADN en la dirección 5'; y PCR B+ (SEQ ID NO: 25) y PCR Cla-Sall (SEQ ID NO: 28) para el ADN en la dirección 3'. El ADN se fundió a 95ºC durante un minuto, se 10 reconoció a 45ºC durante tres minutos y se extendió a 68ºC durante 3 minutos. La porción en la dirección 5' es de 290 pb y en la dirección 3' es de 498 pb. Este procedimiento se repitió durante 18 ciclos usando polimerasa pfu. Se usó el mismo procedimiento de PCR en las etapas (3) y (4).

[0050] Etapa (3): La porción en la dirección 5' de ADN que se ha descrito en la etapa (2) se unió a los cebadores mutagénicos de doble hebra que se han descrito en la etapa (1). Se usaron los 15 cebadores LAAfs5 (SEQ ID NO: 27) y PCR B- (SEQ ID NO: 26). El resultado del diseño del cebador es una superposición de 24 pb entre estos patrones permitiendo la unión de las dos piezas de ADN.

[0051] Etapa (4): Las porciones en la dirección 3' del ADN que se han descrito en la Etapa (2) y el producto de la Etapa (3) se unieron para dar el producto final. Una superposición de 24 pb entre los dos productos de PCR permite la unión. Se usaron los cebadores LAAfs5 (SEQ ID NO: 27) y PCR Clal-20 Sall (SEQ ID NO: 28).

[0052] Etapa (5): Los sitios de restricción únicos, Asp718 y BssHII, se localizan en la dirección 5' y en la dirección 3', respectivamente, del sitio 188. El producto de PCR final se digiere con Asp718 y BssHII, el fragmento de 333 pb se aisló mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se subclonó en el vector pHP.BL para obtener pHP.N188X. 25

[0053] Las mutaciones se confirmaron por secuenciación de didesoxi (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 74, págs. 5463-5487 (1977)).

[0054] Haciendo referencia a la secuencia de ADN y el sistema de numeración que se usa en la Figura 3, el codón codificante para la posición del aminoácido +188 amino está en los pares de bases 812-814. Los cebadores de PCR A+ y A- corresponden a los pares de bases 784-807. Los cebadores de 30 PCR B+ y B- corresponden a los pares de bases 821-844. El extremo 5' del cebador de PCR LAAfs5 corresponde al par de bases 518. El extremo 5' del cebador de PCR Clal-Sell de PCR corresponde al par de bases 1317. El sitio Asp718 corresponde al par de bases 724. El sitio BssHII corresponde al par de bases 1053.

EJEMPLO 3 DE REFERENCIA 35

CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO QUE CODIFICA MUTACIONES EN M15 Y N188

[0055] Un plásmido pBLapr que tiene treonina sustituida con metionina en el aminoácido 15 se realizó de acuerdo con la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/194.664 (Publicación PCT Nº WO 94/18314). Este plásmido (pBLaprM15T) se digirió con Sfil y Asp718, y el fragmento de par de bases 477 se subclonó en pHP.BL para crear pHP.M15T. De una manera análoga a la que se ha 40 descrito anteriormente, el Ejemplo 1, pHP.M15T se digirió con Asp718 y BssHll, se purificó en gel y se eluyó del gel. Después, el fragmento de par de bases 333 que comprende Asp718 a BssHII y el fragmento de pHP.N188S se subclonaron en pHP.M15T para dar el plásmido pHP.M15T/N188S. De una manera análoga, partiendo de los plásmidos pBL aprM15L y pHP.NI88Y, se construyó el plásmido pHP.M15L/N188Y. 45

EJEMPLO 4 DE REFERENCIA

TRANSFORMACIÓN DE PLÁSMIDOS EN BACILLUS SUBTILIS. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE -AMILASA MUTANTE

[0056] La -amilasa se expresó en Bacillus subtilis después de la transformación con los plásmidos que se han descrito en los Ejemplos 1-3. pH13 es un plásmido capaz de replicarse en E. coli y en Bacillus subtills. Los plásmidos que contienen variantes diferentes se construyeron usando la cepa MM294 de E. coli, los plásmidos se aislaron y después se transformaron en Bacillus subtilis según se describe en Anagnostopoulos y col., J. Bacter., vol. 81, págs. 741-746 (1961). La cepa Bacillus se ha 5 suprimido por dos proteasas (epr, npr) (véase, por ejemplo, Ferrari y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.264.366) y por amilasa (amyE) (véase, por ejemplo, Stahl y col., J. Bacter., vol. 158, págs. 411-418 (1984)). Se ha descubierto que la cepa bacillus que expresa M15UN188Y forma áreas más grandes de aclaramiento que la cepa que expresa M15L en placas de agar que contienen almidón insoluble al 1% que indica una actividad amilolítica aumentada. Después de la transformación, la mutación sacU(Hy) 10 (Henner y col., J. Bacter., vol., 170, págs. 296-300 (1988)) se introdujo por transducción mediada con PBS-1 (Hoch, J. Bact., vol. 154, págs. 1513-1515 (1983)).

[0057] Las amilasas secretadas se recuperaron de forma rutinaria a partir de cultivos de Bacillus subtilis como se indica a continuación: El sobrenadante de cultivo se ajustó con sulfato de amonio saturado al 20% y se agitó durante una h a 4ºC. Después de la centrifugación, el sobrenadante 15 resultante se ajustó con sulfato de amonio saturado al 70% y se agitó durante una h a 4ºC. Después de la centrifugación del sobrenadante, la pastilla resultante se disolvió de nuevo en acetato sódico 50 mM, pH 6,0, cloruro cálcico 5 mM y se filtró estéril.

EJEMPLO 5 DE REFERENCIA

ENSAYO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE -AMILASA 20

[0058] Ensayo del Sustrato Soluble: Se realizó un ensayo de velocidad en base a un kit de ensayo de criterio de valoración suministrado por Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. Un vial de sustrato (p-nitrofenil maltoheptaosido, BPNPG7) se disolvió en 10 ml de agua estéril seguido de una dilución 1:4 en tampón de ensayo (tampón maleato 50 mM, pH 6,7, cloruro cálcico 5 mM, Tween20 al 0,002%). Los ensayos se realizaron añadiendo 10 l de amilasa a 790 l del sustrato en una cubeta a 25ºC. Las 25 velocidades de la hidrólisis se midieron como la velocidad del cambio de absorbancia a 410 nm, después de un retraso de 75 segundos. El ensayo fue lineal hasta velocidades de 0,2 unidades de absorción/min.

[0059] La concentración de proteína -amilasa se midió usando el Ensayo Bio-Rad convencional (Bio-Rad Laboratories) en base al método de Bradford, Anal. Biochem., vol. 72, pág. 248 (1976) usando 30 patrones de albúmina sérica bovina.

[0060] Ensayo de Hidrólisis del Almidón: La actividad de la -amilasa en almidón se determinó a través de un ensayo que dependía de la capacidad del almidón para formar un complejo de color azul con yodo y la desaparición de este color cuando el almidón se hidroliza en moléculas de dextrina más cortas. La actividad de la -amilasa se definió con respecto al tiempo de digestión necesario para 35 producir un cambio de color que definía un estado definido de dextrinación del almidón.

[0061] Se usaron los reactivos que se indican a continuación:

[0062] Tampón fosfato - Se disolvieron dihidrógeno fosfato potásico (340 g) e hidróxido sódico (25,3 g) en agua y se diluyeron para dar dos litros. El tampón se enfrió a temperatura ambiente y el pH se ajusto a 6,2  0,1. El tampón se diluyó para dar dos litros en un matraz volumétrico. 40

[0063] Sustrato de almidón - Se suspendieron diez gramos (sustancia seca) de almidón de Lintner soluble en 50 ml de agua y se lavaron en ~300 ml de agua en ebullición. La suspensión se llevó de nuevo a ebullición y se hirvió durante cinco minutos con agitación constante. La solución de almidón se enfrió con agitación constante a temperatura ambiente y se añadieron 125 ml de tampón fosfato. La solución se diluyó para dar 500 ml con agua. El sustrato de almidón se preparó a diario. 45

[0064] Solución madre de yodo - Se disolvieron cristales de yodo (5,5 g) y yoduro potásico (11,0 g) en agua y se diluyeron volumétricamente hasta un volumen de 250 ml. La solución se protegió de la luz.

[0065] Solución diluida de yodo - Se disolvieron yoduro potásico (20 g) y dos ml de solución madre de yodo en agua y se diluyeron volumétricamente hasta un volumen de 500 ml. La solución se preparó a diario.

[0066] Solución de dilución de enzimas - Se disolvió cloruro cálcico (11,1 g) en cuatro litros de agua. El agua que se usó para todos los reactivos era destilada o desionizada. 5

[0067] Una muestra de -amilasa se diluyó hasta un volumen de entre 10-15 UL/ml (como se define a continuación) con una solución de dilución de enzimas. Para muchas preparaciones de -amilasa comerciales, se descubrió que una dilución adecuada era de 2000 veces. Se dispensaron cinco mililitros de alícuotas de una solución diluida de yodo en tubos de ensayo de 13 x 100 mm y se pusieron 10 ml de sustrato de almidón en un tubo de ensayo de 23 x 200 mm. Todos los tubos se colocaron en el 10 baño de agua a 30ºC. Se usó un comparador Hellige equipado con un disco de color de -amilasa especial (número de catálogo 620-s5) para hacer las lecturas. Se mezclaron cinco mililitros de enzima diluida (también a 30ºC) con el sustrato de almidón y el cronometrado comenzó. A intervalos de tiempo apropiados, por ejemplo, intervalos de un minuto al principio de la reacción e intervalos de 15 segundos después de la reacción, se transfirió un ml de alícuotas de la mezcla del sustrato enzimático a un tubo 15 que contenía la solución diluida de yodo. La solución de almidón-yodo se mezcló y se transfirió a un tubo cuadrado de precisión de 13 mm y el color se comparó con el disco de color de la -amilasa convencional en el comparador Hellige. Cuando el tiempo del criterio de valoración se alcanzó, las muestras se recogieron en intervalos de 0,25 minutos.

[0068] El tiempo requerido para que los colores de las muestras y el disco de color coincidieran 20 se registraron y la actividad (en unidades de dilución por gramo o ml) se calculó de acuerdo con la fórmula:

UL/ml o UL/g =

En la que: UL = unidad de dilución

V = volumen de la enzima (5 ml o gramos) 25

t = tiempo de dextrinización (minutos)

D = factor de dilución:volumen de dilución dividido por ml o g de enzima diluida.

EJEMPLO 6 DE REFERENCIA

PREPARACIÓN Y ENSAYO DE ALFA-AMILASAS MUTANTES ADICIONALES PARA ESTABILIDAD TÉRMICA 30

[0069] Bacillus stearothermophilus y Bacillus amyloliquefaciens producen una -amilasa que tiene peor estabilidad que la -amilasa producida por Bacillus licheniformis. A partir de un alineamiento de estas amilasas, se identificaron restos que diferían en B. stearothermophilus o B. amylollquefaciens comparados con B. lichaniformis. A partir de este análisis, se prepararon -amilasas mutantes en base a la secuencia de B. licheniformis que tenían sustituciones en una o más de cinco posiciones para las que 35 correspondían restos tanto en Bacillus stearothermophilus como en Bacillus emyloliquefactens que eran idénticos pero diferían en B. licheniformis: A33S, A52S, N96Q S148N, A379S junto con M15T/H133Y/N1885/A209V y en comparación con un mutante que comprendía únicamente las sustituciones M15T/H133Y/N1885/A209V. Además, se incorporó la mutación S85D que representaba un reclutamiento únicamente de la -amilasa de Bacillus emylotiquefaciens. Las mutaciones se prepararon 40 de acuerdo con los procedimientos que se han proporcionado en los Ejemplos 1-4 con la excepción de que se proporcionaron los cebadores de PCR apropiados para realizar las mutaciones deseadas.

[0070] Las velocidades de inactivación térmica para los diversos mutantes se realizaron de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las soluciones madre de amilasa se dializaron extensamente en acetato de amonio 20 mM, CaCl2 4 mM, pH 6,5. Para medir la estabilidad, esta solución madre se 45 midió >50 veces en una solución diseñada para inducir una inactivación rápida de amilasa de tipo natural: acetato de amonio 50 mM, CaCl2 5 mM, en Tween 20 y un pH de 4,9, ó 4,8 para dar una concentración final de entre 30 y 50 g/ml. Se pusieron 100 l de alícuotas en tubos Eppendorf y se

colocaron en un baño de agua a 82ºC u 830ºC. Los tubos Eppendorf se retiraron a intervalos medidos regulares de entre 30 segundos y 5 minutos y se colocaron en hielo para detener la inactivación. La actividad residual se ensayó usando un sustrato soluble según se ha descrito en el Ejemplo 5. El registro natural de la actividad se trazó como función del tiempo de incubación, y la constante de velocidad para la inactivación se obtuvo del desnivel de la línea recta. La semivida se calculó como In(2) dividido por la 5 constante de velocidad. Se proporcionan resultados para diversos mutantes en las Tablas 1-4.

TABLA 1

pH 4,9, 83ºC

Variante

Constante de la velocidad de inactivación (min-1) t1/2 (min)

M15T/H133Y/N188S/A209V

0,171 4,05

M15T/D28N/A33S/H133Y/N188S/A209V

0,137 5,06

M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V/L230F

0,144 4,81

M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V/I479T

0,162 4,27

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/G433D

0,121 5,73

M15T/H133Y/N188S/A209V/A379S

0,145 4,78

TABLA 2

pH 4,85, 83ºC

Variante

Constante de la velocidad de inactivación (min-1) t1/2 (min)

M15T/H133Y/N188S/A209V

0,252 2,75

M15T/H133Y/N188S/A209V

0,235 2,95

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S

0,114 6,05

10

TABLA 3

pH 4,85, 82ºC

Variante

Constante de la velocidad de inactivación (min-1) t1/2 (min)

M15T/H133Y/N188S/A209V

0,203 3,41

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S

0,106 6,54

M15T/H133Y/N188S/A209V/A210ST322A/A379S

0,141 4,89

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V

0,122 5,65

TABLA 4

pH 4,80, 82,2ºC

Variante

Constante de la velocidad de inactivación (min-1) t1/2 (min)

Tipo Natural

>2,0 <0,35

M15T/N188S

>1,9 <0,36

M15T/H133Y/N188S/A209V

0,267 2,59

M15T/S85D/H 133Y/N188S/A209V

0,236 2,93

EJEMPLO 7

RECLUTAMIENTO DE RESIDUOS DE CELULASAS MENOS ESTABLES A CELULASAS MÁS ESTABLES PARA LA MEJORA DE LA ESTABILIDAD DE LA CELULASA MÁS ESTABLE 5

[0071] Se obtuvieron homólogos de celulasa EGIII de Trichoderma reesei de diversas especies y se ensayaron para comprobar su estabilidad térmica. Las celulasas se obtuvieron de (A) Hypocrea schweinitzii, (B) Aspergillus aculeatus, (C) Aspergillus kawachii, (D) Gliocladium roseum (1), (E) Gliocladium roseum (2), (F) Gliocladium roseum (3) y (G) Humicola grisea. De las anteriores, las celulasas (a) a (f) son menos estables térmicamente que EGIII en las condiciones del ensayo. La 10 celulasa (g) es más estable que EGIII. Por consiguiente, a partir de las secuencias alineadas de estas celulasas (según se proporciona en la Figura 11), es posible diferenciar los residuos que existen en la celulasa menos estable en comparación con la celulasa más estable. Para una lectura simplificada de la tabla, las posiciones marcadas para mutaciones se resaltan en negrita. Después, los mutantes de EGIII se prepararon en base a esta información. Además, la celulasa mutante (g) se preparó en base a 15 reclutamientos de EGIII.

[0072] Los experimentos de dicroismo circular de equilibrio se realizaron en un espectrofotómetro Aviv 62DS o 62ADS, equipado con un soporte de celda termoeléctrica de 5 posiciones suministrado por Aviv. Las condiciones de tampón fueron de bis-tris propano 50 mM y acetato de amonio 50 mM ajustado a pH 8,0 con ácido acético. La concentración de proteína final para cada experimento estaba en el 20 intervalo de 5-30 M. Los datos se recogieron en una célula de trayecto de 0,1 cm.

[0073] Los espectros se recogieron a partir de 265-~10 nm. Las desnaturalizaciones térmicas se realizaron a 217 nm de 30 a 90ºC con datos recogidos cada dos grados. El tiempo de equilibración en cada temperatura fue de 0,1 minutos y los datos se recogieron durante 4 segundos por muestra.

[0074] El resto de la muestra a pH 8,0 se dividió en alícuotas de 5 x 400 l. Se ajustaron dos 25 muestras a pH 5 y 7 con ácido acético y otras dos se ajustaron a pH 9 y 10 con hidróxido sódico. Las desnaturalizaciones térmicas de todas las muestras se realizaron simultáneamente según se ha descrito anteriormente.

[0075] La Tabla 5 ilustra 24 mutantes que se prepararon en base a reclutamientos de celulasas menos estables en EGIII y 3 mutantes que se prepararon en base a reclutamientos de EGIII en un 30 homólogo aislado de Humicola grisea (obsérvese que la numeración de la Tabla 5 para H. grisea es en base a la numeración de EGIII en la Figura 11). De estos, un número significativo tuvo estabilidad mejorada sobre la molécula de tipo natural (EGIII o celulasas (g)) como se muestra en negrita en la Tabla5.

TABLA 5

Mutación  Tm Tm (ºC) Error de ajuste

PR

Producto 54,10 0,09

0

WT EG3 54,60 0,18

1

W7Y -1,03 53,40 0,24

2

T11S/T16I 1,07 55,50 0,13

3

A35S -4,03 50,40 0,14

4

S39N 0,47 54,90 0,17

5

G41A 2,47 56,90 0,11

6

S63V -0,83 53,60 0,11

7

A66N 0,07 54,50 0,10

8

S77G 0,07 54,50 0,09

9

N91D 0,47 54,90 0,17

10

S143T 0,47 54,90 0,12

11

T163S 0,27 54,70 0,07

12

N167S 0,17 54,60 0,10

13

A188G 0,47 54,90 0,17

14

G31Q -14,03 40,40 0,15

15

Q162P 0,07 54,50 0,19

16

Y168F -0,03 54,40 0,12

17

N174D 1,17 55,60 0,44

18

V192L -0,23 54,20 0,13

19

N164D -2,33 52,10 0,33

20

P201C 3,9/17,4 58,3/71,8 ,15/,23

21

V210C 0,47 70,60 70,80

22

Q162P/T166P (17a* R2-2) -1,43 53,00 0,29

23

M79I -7,13 47,30 0,27

24

T145E/Y147W (25a4) 0,77 55,20 0,05

G0

WT H. greisii 0,00 68,5 0,11

G1

C210V 1,50 70 0,2

G2

C170G 2,10 70,6 0,23

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP 5 declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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• US 4752585 A, Koths [0002]

• US 4732973 A, Barr [0002]

• US 5605793 A, Steamer [0004]

• WO 9524471 A [0013]

• WO 9931255 A [0014] 15

• US 5185258 A [0027]

• WO 9623874 A [0037]

• US 194664 A [0055]

• WO 9418314 A [0055]

• US 5264366 A [0056] 20

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• Takkinen et al. J. Biol. Chem., 1983, vol. 258, 1007-1013 [0023]

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una 5 termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos.
2. 2. Una secuencia de ADN que codifica una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1.
3. 3. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2. 10
4. 4. Una célula huésped que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.
5. 5. Un procedimiento para producir una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

   (a) modificar una secuencia de ADN que codifica la secuencia precursora de aminoácidos para 15 producir una secuencia de ADN a modificada como se ha definido en la reivindicación 2 que codifica la celulasa mejorada;

   (b) expresar la secuencia de ADN modificada en una célula huésped; y

   (c) purificar la proteína de celulasa expresada.
6. 6. Uso de una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1 en la reducción de una biomasa, 20 productos de limpieza o composiciones para el tratamiento textil.