BRPI0614869A2 - polipeptìdeos funcionais, polipeptìdeo maduro funcional isolado, enzima, composição, método para preparar uma composição, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para produzir o polipeptìdeo, meio de armazenagem, e , processo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEOS FUNCIONAIS, POLIPEPTìDEO MADURO FUNCIONAL ISOLADO, ENZIMA, COMPOSIçãO, MéTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIçãO, CONSTRUTO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MéTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTìDEO, MEIO DE ARMAZENAGEM, E, PROCESSO. Uma cepa nova de Bacillus sp. P203 (Bacillus Plakortiensis) é descrita. é descrito polipeptídeo funcional maduro isolado que é obtenível da cepa de bactéria Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419.

Description

"POLIPEPTÍDEOS FUNCIONAIS, POLIPEPTÍDEO MADURO FUNCIONAL ISOLADO, ENZIMA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, MEIO DE ARMAZENAGEM, E, PROCESSO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos polipeptídeos funcionais codificados pelos polinucleotídeos compreendidos no genoma de cepas de uma nova espécie de Bacillus, Bacillus plankortiensis. A cepa de referência desta espécie é Bacillus sp. P203 depositada sob DSM 17419. A invenção refere-se em adição aos polinucleotídeos e aos construtos de tais polinucleotídeos codificadores de tais polipeptídeos ou facilita sua expressão bem como ao método para preparar o polipeptídeo. Ainda mais a invenção refere-se às composições compreendendo os polipeptídeos e os polinucleotídeos e aos usos do polipeptídeo. Ainda mais a invenção refere-se a uma bactéria Bacillus sp. P203 conforme depositada sob o número de

acesso DSM 17419. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Cepas alcalifílicas de Bacillus estão em foco na biotecnologia industrial. Cepas alcalifílicas e especialmente enzimas daquelas espécies possuem potencial grande em aplicações bioquímicas onde atividade enzimática (ou até mesmo atividade máxima) em valores altos de pH é requerida para processos biotécnicos (Horikoshi: "Alkaliphiles: Some Applications of Their Products for Biotechnology", Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 63, No. 4, 1999). Exemplos de cepas alcalifílicas de Bacillus como fonte de novos catalisadores são B. clausii, B. pseudofirmus, B. clarkii, B. gibsonii. Em busca de novas enzimas também é conhecida a triagem de tais novas enzimas pela sujeição das candidatas aos ensaios enzimáticos específicos. Esta abordagem é limitada à disponibilidade dos ensaios enzimáticos e não permite a identificação de enzimas funcionais ou de polipeptídeos funcionais para os quais a atividade ainda é desconhecida.

Ademais, seqüenciamento de genoma inteiro é um método conhecido para obter a informação sobre todos os genes de um dado microorganismo e.g. como descrito em Fleischmann et ai; " Whole genome sequences and assembly of Haemophilus influenzae Rd"; Nature 269: 496- .512; (1995).

As enzimas para uso industrial são em sua maioria enzimas que são secretadas para o meio por um microorganismo. Contudo, apenas uns poucos percentuais de um genoma de microorganismo codifica proteínas secretadas. Por exemplo apenas aproximadamente 4% do genoma de Bacillus subtilis ou deus parentes mais próximos codificam proteínas secretadas (Van Dijl et ai: "Protein transport pathways in Bacillus subtilis: a genome-based road map"; em aBacillus subtilis and its closest relatives - From genes to cells"; p.337-355; A. L. Sonenshein (ed.); ASM Press 2002).

Uma desvantagem do seqüenciamento do genoma é que a vasta maioria das seqüências obtidas codifica proteínas não secretadas.

Uma desvantagem adicional do seqüenciamento genômico particular a eucariotos tais como fungos é que o tamanho do genoma é muitas vezes maior do que um genoma bacteriano tornando a descoberta de gene por este método muito custosa e consumidora de tempo.

O seqüenciamento randômico de cDNAs (etiquetas de seqüência expressada ou ESTs) é uma outra abordagem que permite a descoberta de proteínas secretadas. Em geral, abordagens de EST sofrem de duas desvantagens com relação à identificação de proteína secretada: 1) dependência das condições de indução usadas para a biblioteca de cDNA seqüenciada, muito poucos, tipicamente entre 0,5% e 15% ou até mesmo 1% e 5% dos cDNAs codificam proteínas secretadas, 2) os clones provêm todos de uma coleção de cDNAs derivada de mRNAs que estão presentes no organismo em proporção ao nível de indução de cada gene particular.

Também é conhecida a captação de sinal que é um método para identificar genes incluindo nucleotídeos codificadores de um peptídeo de sinal usando uma fusão de tradução em um gene repórter extracelular faltante de seu próprio sinal (WO 01/77315).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm encontrado uma cepa de uma nova espécie de Bacillus5 Bacillus plankortiensis. A cepa de referência/tipo desta espécie é Bacillus sp. P203 depositada sob DSM 17419. A cepa desenvolve em pH (7-11) e em temperaturas baixas (4-3 O0C). Esta cepa é interessante porque a distância filogenética entre as cepas publicamente conhecidas e a cepa DSM17419 é significativa e porque as condições de desenvolvimento são similares às condições para várias aplicações para enzimas industriais.

O genoma de um microorganismo contém milhares de genes diferentes; alguns codificando polipeptídeos alguns codificando RNAs. Apenas um número limitado dos genes no genoma de um microorganismo codificam polipeptídeos funcionais que são secretados pelo microorganismo para o meio circundante servindo com um propósito externo para o microorganismo. Tais polipeptídeos são interessantes para a indústria do ponto de vista de que tais polipeptídeos podem ser produzidos em quantidades consideráveis em processos contínuos sem destruir as células produtoras dos polipeptídeos.

Um objetivo da presente invenção é identificar e proporcionar polipeptídeos secretados da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 que possuem propósito funcional para a cepa Bacillus sp. P203 porque tais polipeptídeos podem não apenas ser usados para propósitos industriais mas também podem ser produzidos em quantidades e processos industrialmente relevantes.

Em um primeiro aspecto a invenção proporcionam polipeptídeos funcionais codificados por polinucleotídeos compreendidos no genoma de cepas de Bacillus species Bacillus plankortiensis depositada sob o número de acesso DSM 17419, e um polipeptídeo funcional maduro isolado que é pelo menos 70 % idêntico ao e exibe a mesma função de um polipeptídeo secretado correspondente obtenível da cepa de bactéria Bacillus sp. P203.

Em . outros aspectos a invenção proporciona um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo da invenção; um construto de nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo da invenção, operacionalmente ligado em uma ou mais seqüências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira; um vetor de expressão recombinante compreendendo o construto de nucleotídeos da invenção e uma célula hospedeira recombinante compreendendo o construto de nucleotídeos da invenção.

Em ainda outros aspectos a invenção proporciona um método de preparar um polipeptídeo da invenção compreendendo:

(a) cultivar uma cepa compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo da invenção cuja cepa é capaz de expressar e de secretar o polipeptídeo e

(b) recuperar o polipeptídeo.

Em um outro aspecto a invenção proporciona uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção e um método para preparar uma tal composição compreendendo misturar o polipeptídeo da invenção com um excipiente.

Em um outro aspecto a invenção proporciona uma composição compreendendo um polinucleotídeo da invenção e um método para preparar uma tal composição compreendendo misturar o polinucleotídeo da invenção com um excipiente.

Em outros aspectos a invenção proporciona o uso do polipeptídeo da invenção ou de uma composição compreendendo o citado poiipeptídeo em várias aplicações.

Em um aspecto final a invenção proporciona um meio de armazenagem eletrônica compreendendo informação da seqüência de aminoácidos de polipeptídeos da invenção ou das seqüências de nucleotídeos do polinucleotídeo da invenção.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

o presente pedido contém informação na forma de uma listagem de seqüências, que está anexada ao pedido e também submetida a um portador de dados acompanhando este pedido. Os conteúdos do portador de dados são aqui totalmente incorporados como referência.

SEQ ID NO: 1 codifica serina protease compreendida em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 codifica a anidrase carbônica compreendida em SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 codifica a anidrase carbônica compreendida em SEQ ID NO:6; SEQ ID NO: 7 codifica xilanase compreendida em SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9 codifica ramnogalacturonana liase compreendida em SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 codifica galactanase compreendida em SEQID NO: 12.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra as características de desenvolvimento de Bacillus sp. P203.

Figura 2 mostra a estabilidade de anidrase carbônica de Bacillus sp. P203.

Figura 3 mostra a inibição de anidrase carbônica com acetazolamida.

Figura 4 mostra a inibição de anidrase carbônica com íons de metal, azida e outros reagentes. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições *

O termo "identidade" como aqui usado, é para ser entendido como a homologia entre duas seqüências de aminoácidos ou entre duas seqüências de nucleotídeos. Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre as duas seqüências de aminoácidos foi determinado pelo uso de AlignX no programa de Vector NTI ver. 7.1 (Informax inc., 7600 Wisconsin Avenue5 Suite #1100, Bethesda, MD 20814, USA). Alinhamento, de aminoácidos foi criado usando o algoritmo Clustal W (Nucleic Acid

Research, 22 (22): 4673-4680, 1994). Os seguintes parâmetros adicionais são usados: penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,05, faixa de penalidade de separação de lacuna de 8. Parâmetros de alinhamentos pareados foram Ktuple - 1, penalidade de lacuna = 3, penalidade de abertura de comprimento de lacuna = 10, penalidade de comprimento de lacuna = 0,1, tamanho de janela = 5 e diagonais = 5. O grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos é determinado usando o mesmos algoritmo e pacote de programas de como descritos acima com òs seguintes ajustes: penalidade de lacuna de 10, e penalidade de comprimento de lacuna de 10. Parâmetros de alinhamento pareado são Ktuple=3, penalidade de lacuna =3 e janelas =20.

O termo "polipeptídeo funcional" como aqui usado no contexto da presente invenção significa um polipeptídeo que pode ser expressado e secretado por uma célula e que constitui uma unidade operacional capaz de operar de acordo com a função para qual ele é planejado cumprir pela célula. Opcionalmente, cofatores podem ser requeridos para o polipeptídeo para adotar a função intencional. Um exemplo de polipeptídeos funcionais é polipeptídeos cataliticamente ativos ou enzimas que ajudam a célula catalisando reações no ambiente circundando a célula. Outro exemplo poderia ser polipeptídeos que servem como substância de sinal. Exemplos adicionais são polipeptídeos que funcionam como sensores (receptores) para parâmetros ambientais (compostos químicos no ambiente circundando a célula) ou polipeptídeos, que são ativos contra outros organismos ((poli)peptídeos antimicrobianos) ou polipeptídeos, que contribuem para a

integridade estrutural da célula.

O termo "região madura" como aqui usado sobre a porção de uma seqüência de aminoácidos ou de um polipeptídeo significa a porção ou o domínio ou a seção das seqüências de aminoácidos ou do polipeptídeo que é o

polipeptídeo funcional maduro.

O termo "região de seqüência de nucleotídeos codificadora

de um polipeptídeo maduro" como aqui usado significa a região de uma seqüência de nucleotídeos contando do triplete codificador do primeiro aminoácido de um polipeptídeo maduro ao último triplete codificador do último aminoácido de um polipeptídeo maduro.

O termo " polipeptídeo secretado" como aqui usado é para ser entendido como um polipeptídeo que após expressão em uma célula quer é transportado para e liberado para o meio extracelular circundante quer é associado/embebido na membrana celular de modo que pelo menos uma parte do polipeptídeo é exposta ao meio extracelular circundante.

Polipeptídeos da invenção

A presente invenção refere-se aos polipeptídeos similares

àqueles polipeptídeos secretados obteníveis da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419. Em particular a invenção proporciona um polipeptídeo funcional maduro isolado ique é pelo menos70%, preferivelmente80% ou mais, tal como90%,95%,96%, 97%, 98% ou99% idêntico ao e exibe a mesma função de um polipeptídeo secretado correspondente obtenível da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número

de acesso DSM 17419.

Polipeptídeos da invenção são, em particular, secretados pela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 com o propósito de servirem com uma função para aquela célula particular.

Dentre os milhares de genes potenciais no genoma da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 os polinucleotídeos deste genoma codificaram 6 polipeptídeos maduros funcionais secretados compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, que forma determinados funcionais, isto é traduzidos em polipeptídeos funcionais pela célula hospedeira escolhida. Ademais em uma modalidade particular os genes codificadores

de citados polipeptídeos maduros podem ser todos expressados e seus polipeptídeos maduros correspondentes podem ser secretados quando se cultiva um hospedeiro E. coli transformado com polinucleotídeos compreendendo aquelas regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID

NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificadoras de um polipeptídeo maduro. Pela comparação de homologia ou identidade das seqüências das 6 seqüências de polipeptídeo com seqüências conhecidas a função particular dos polipeptídeos foi anotada. Todos os 6 polipeptídeos funcionais secretados foram determinados como enzimas.

Em particular o polipeptídeo isolado é selecionado do grupo

consistindo de:

(a) um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo dos polipeptídeos maduros

compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 10 e SEQID NO: 12, e

(b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de (i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo de regiões de SEQ ID NO: I5 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro,

(ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro;

no qual o polipeptídeo exibe a função do polipeptídeo maduro correspondente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 10 e SEQID NO: 12.

Em uma modalidade particular o polipeptídeo da invenção é selecionado dentre as enzimas secretadas pela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso 17419 e isolado pelos presentes inventores, i.e. o grupo de enzimas consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase.

A invenção também proporciona uma enzima isolada selecionada do grupo consistindo de.

(a) uma enzima compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com a seqüência de aminoácidos de uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso 17419 e

(b) uma enzima que é codificada por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de

(i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos compreendida na cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso .17419 codificando uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada daquela cepa;

(ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos compreendida na cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 codificando uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada daquela cepa e

na qual a enzima possui uma função selecionada de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase.

O polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo isolado, preferivelmente a preparação do polipeptídeo da invenção contém no máximo 90% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual pode estar nativamente associado (percentagens menores de outro material de polipeptídeo são preferidas, e.g. no máximo 80% em peso, no máximo 60% em peso, no máximo 50% em peso, no máximo 40% no máximo 30% em peso, no máximo 20% em peso, no máximo 10% em peso, no máximo 9% em peso,no máximo 8% em peso, no máximo 6% em peso, no máximo 5% em peso, no máximo 4% no máximo 3% em peso, no máximo 2% em peso, no máximo 1% em peso e no máximo 0,5% em peso). Assim, é preferido que o polipeptídeo isolado da invenção seja pelo menos 92% puro, i.e. que o polipeptídeo da invenção constitua pelo menos 92% em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação, e percentagens maiores são preferidas tal como pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99%, e no máximo 99.5% puro. Em particular, é preferido que o polipeptídeo da invenção esteja "na forma essencialmente pura, i.e. que a preparação de polipeptídeo esteja essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente associada. Isto pode ser conseguido, .33

Stg-." ^

por exemplo, pela preparação do polipeptídeo da invenção por meio de métodos recombinantes bem conhecidos. O polipeptídeo da invenção da invenção pode ser sinteticamente preparado, ser naturalmente ocorrente ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade particular o polipeptídeo da invenção pode ser obtido de um microorganismo tal como uma célula procariótica, uma célula archaea ou uma célula eucariótica. A célula pode ser sido adicionalmente modificada por engenharia genética.

Em uma célula particular, o polipeptídeo da invenção é uma enzima exibindo atividade enzimática ótima em uma temperatura dentro da faixa de IO0C a cerca de 80°C, particularmente dentro da faixa de cerca de20°C a cerca de 60°C.

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma enzima, que é funcionalmente estável em uma temperatura de até 100°C, em particular até 80°C, mais particularmente de até 60°C. Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma enzima exibindo pelo menos20%, em particular pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, em particular pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos80%, tal como pelo menos 90%, muito mais particularmente pelo menos 95%, tal como cerca de ou pelo menos 100% da atividade enzimática de uma enzima selecionada de enzimas naturais compreendidas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

Em particular o polipeptídeo funcional maduro isolado é pelo menos 70 % idêntico ao e exibe a mesma função de um polipeptídeo secretado correspondente obtenível da cepa bacteriana Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 e especificamente o polipeptídeo da invenção compreende, contém ou consiste de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com uma seqüência de polipeptídeo selecionada do grupo consistindo de polipeptídeos maduros compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12. A identidade percentual é particularmente pelo menos 95%, e.g. pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, e ainda mais particularmente pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade.

Em outra modalidade particular a identidade percentual é pelo menos 50%; particularmente pelo menos 60%, particularmente pelo menos 65%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 80%, e ainda mais particularmente pelo menos 85% de identidade. Em uma célula particular, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da invenção difere em no máximo dez aminoácidos (e.g. em dez aminoácidos), em particular em no máximo cinco aminoácidos (e.g. em cinco aminoácidos), tal como em no máximo quatro aminoácidos (e.g. em quatro aminoácidos), e.g. em no máximo três aminoácidos (e.g. em três aminoácidos), em particular em no máximo dois aminoácidos (e.g. em dois aminoácidos), tal como em um aminoácido dos polipeptídeos maduros compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 10 e SEQID NO: 12.

O polipeptídeo da invenção pode ser um polipeptídeo de tipo selvagem isolado de uma fonte natural tal como a cepa Bacillus sp. P203, número de depósito DSM 17419, ou outra cepa de tipo selvagem, contudo a presente invenção também inclui variantes, onde um polipeptídeo da invenção tem sido mutado por exemplo pela adição e/ou deleção de um ou mais aminoácidos do citado polipeptídeo simultaneamente retendo a função do polipeptídeo e/ou outras propriedades. Conseqüentemente, o polipeptídeo da invenção pode ser uma variante artificial, na qual pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção de um aminoácido tem sido feita em uma seqüência de aminoácidos compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro compreendido em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

Os polipeptídeos da invenção também incluem fragmentos funcionais das seqüências de aminoácidos aqui descritas e ácidos nucleicos codificando fragmentos funcionais das seqüências de aminoácidos aqui descritas, incluindo fragmentos das enzimas maduras secretadas da cepa Bacillus sp. P203, depositada sob o número de acesso DSM 17419, como aqui descritas, incluindo fragmento de uma enzima selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419. Variantes artificiais podem ser construídas por técnicas padrão conhecidas na arte normalmente seguidas por triagem e/ou caracterização. Técnicas padrão incluem mutagênese clássica, e.g. por irradiação UV das células ou tratamento das células com mutagenes químicos como descritos por Gerhardt et ai. (1994); rearranjo de gene in vivo como descrito em WO 97/07205; rearranjo in vitro como descrito por Stemmer, (1994) ou WO 95/17413, mutagênese randômica como descrita por Eisenstadt E. et ai., (1994); técnicas de PCR como descritas por Poulsen et ai. (1991); rearranjo de família como descrito por J. E. Ness, et al, Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 893-896 (1999); mutagênese sítio-direcionada como descrita por Sambrook et al. (1989), Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Uma descrição geral de substituição de nucleotídeo pode ser encontrado em e.g. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2, p. 95-107.

Tais métodos de engenharia genética padrão também podem ser usados para preparar uma biblioteca diversificada de seqüências de nucleotídeos variantes a partir dos genes codificando uma ou mais enzimas parentais da invenção, expressando as variantes de enzima em uma célula hospedeira adequada e selecionando a(s) variante(s) preferida(s). Uma biblioteca diversificada pode ser estabelecida por uma variedade de técnicas conhecidas na arte (Reetz MT; Jaeger KE, em Biocatalysis - from Discovery to Application editado por Fessner WD, Vol. 200, pp. 31-57 (1999); Stemmer, Nature, vol. 370, p.389-391, 1994; Zhao e Arnold, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, vol. 94, pp. 7997-8000, 1997; ou Yano et al., Proc. Natl. A- cad. ScL, USA, vol. 95, pp 5511-5515, 1998).

Em uma célula particular da invenção, mudanças de aminoácido (na variante artificial bem como na enzima de tipo selvagem) são de uma natureza menor, isto é substituições de aminoácido conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou a atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões amino- ou carboxil-terminais pequenas, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo linker pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança da carga efetiva ou de outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos s (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina, valina e metionina), aminoácidos aromáticos (fenil-alanina, triptofeno e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina e treonina). Substituições de aminoácido que geralmente não alteram e/ou prejudicam a função da proteína são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hills 1979, em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As trocas mais comumente ocorrentes são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Vai, Ala/Glu, e Asp/Gly bem como estas ao inverso.

Em uma célula particular as trocas de aminoácido são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, podem ser relizadas mudanças de aminoácido que melhoram a estabilidade térmica da enzima, que alteram a especificidade por substrato, que muda o pH ótimo, e semelhantes.

Particularmente, o número de tais substituições, deleções e/ou inserções nopolipeptídeo da invenção, particularmente naqueles polipeptídeos selecionados do grupo consistindo de polipeptídeos maduros compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 para produzir uma variante artificial é no máximo 10, tal como no máximo 9, e.g. no máximo 8, mais preferivelmente no máximo 7, e.g. no máximo 6, tal como no máximo 5, muito mais preferivelmente no máximo 4, e.g. no máximo 3, tal como no máximo 2, em particular no máximo 1.

Em uma célula particular a variante artificial é uma variante, que possui uma imunogenicidade especialmente alergenicidade alterada, preferivelmente reduzida, em animais incluindo homem em comparação com uma enzima parental. O termo "imunogenicidade" no contexto é para ser entendido como uma capacidade da variante artificial de invocar uma resposta imunológica, em particular reduzida quando administrada a um animal, incluindo administração intravenosa, cutânea, oral e intratraqueal. O termo "resposta imunológica" neste contexto significa que a administração da variante artificial causa uma alteração nos níveis de imunoglobulina no corpo animal, tal como em IgE, IgG e IgM ou uma alteração no nível de citocina no corpo animal. Métodos para mapeamento de epítopos imunogênicos/antigênicos de uma proteína, preparação de variantes com imunogenicidade alterada e métodos para medição de uma resposta imunológica são bem conhecidos na arte e são descritos e.g. em WO 92/10755, WO 00/26230, WO 00/26354 e WO 01/31989. O termo "alergenicidade" neste contexto é para ser entendido como uma capacidade da variante artificial de invocar uma produção alterada, em particular reduzida, de IgE em um animal bem como a capacidade de ligar IgE do citado animal. Particularmente aiergenicidade decorrente de administração intratraqueal da variante de polipeptídeo ao animal é particularmente de interesse (também conhecida como aiergenicidade respiratória).

Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo que é codificado por seqüências de nucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência pelo menos alta, particularmente sob condições de estringência muito alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de

(i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro,

(ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: SEQ ID

NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro

(iii) um fragmento de (i) ou (ii) codificando um polipeptídeo secretado possuindo a função do polipeptídeo maduro correspondente compreendido em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning5 A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

Em particular, o polipeptídeo da invenção é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro ou uma seqüência diferindo do mesmo em virtude da degeneração do código genético. Mais particularmente, o polipeptídeo da invenção é codificado por um polinucleotídeo consistindo de uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: .3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro ou uma seqüência diferindo do mesmo em virtude da degeneração do código genético. As seqüências de nucleotídeos de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro ou uma sua subseqüência, bem como as seqüências de aminoácidos dos polipeptídeos maduros compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento, podem ser usadas para planejar uma sonda de polinucleotídeo para identificar e clonar DNA codificando enzimas da invenção de cepas de gêneros ou espécies diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou da espécie diferente, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, com o objetivo de identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, mas devem ser de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos em comprimento, tal como pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Contudo, é preferido que a sonda de polinucleotídeo seja de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sonda de polinucleotídeo pode ser de pelo menos 200 nucleotídeos em comprimento, pelo menos 300 nucleotídeos em comprimento, pelo menos .400 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos 500 nucleotídeos em comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, e.g., sondas de polinucleotídeo que são de pelo menos 600 nucleotídeos em comprimento, pelo menos 700 nucleotídeos em comprimento, pelo menos 800 nucleotídeos em comprimento, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Ambas as sondas de DNA e RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detecção do gene correspondente (por exemplo, com 32Ρ, 3H, 35Si biotina, ou avidina). Assim, uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico preparada de tais outros organismos pode ser tríada para DNA, que hibridiza com as sondas descritas acima e que codifica enzimas da invenção. DNA genômico ou outro DNA de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado sobre nitrocelulose ou outros materiais adequados. Com o objetivo de identificar um clone ou DNA que possui a homologia e/ou identidade requerida com os nucleotídeos selecionados de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro, o material de suporte com o DNA imobilizado é usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, hibridização indica que a seqüência de nucleotídeos hibridiza com uma sonda de polinucleotídeo marcada que de novo hibridiza com uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro sob condições de estringência alta a muito alta. Moléculas nas quais a sonda de polinucleotídeo hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando filme de raios-X ou por qualquer outro método conhecido na arte. Sempre que o termo "sonda de polinucleotídeo" for usado no presente contexto, é para ser entendido que uma tal sonda contém pelo menos 15 nucleotídeos.

Em uma modalidade interessante, a sonda de polinucleotídeo é a fita complementar de uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro. Em outra modalidade interessante, a sonda de polinucleotídeo é a fita complementar de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo de SEQ ID NO: Ij SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade adicional interessante, a sonda de polinucleotídeo é a fita complementar de uma região codificadora de um polipeptídeo maduro de uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 9 e SEQID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência alta a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 1,0% SDS, 5X solução de Denhardt5 100 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, seguido por procedimentos padrão de Southern blotting. Preferivelmente, as sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos não contêm mais do que 1.000 nucleotídeos. Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, o material de suporte é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 0,1 χ SSCi 0,1 % SDS a 60°C (estringência alta), em particular lavado três vezes cada por 15 minutos usando 0,1 χ SSC, SDS 1% a 68°C (estringência muito alta).

Embora não particularmente preferido, é contemplado que sondas mais curtas, e.g. sondas que são de cerca de 15 a 99 nucleotídeos em comprimento, tal como de cerca de 15 a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, também podem ser usadas. Para sondas curtas, condições de estringências são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização a 5°C a IO0C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, 0,5% NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, fosfato de sódio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por mL seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting.

Para sondas curtas que são cerca de 15 nucleotídeos a 99 nucleotídeos em comprimento, o material de suporte é lavado uma vez em 6X SCC mais SDS 1% por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC a 50C a IO0C abaixo da Tm calculada. SEO IP NO: 2. Serina protease

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma serina protease compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou 85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos 96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos 98%, mais particularmente pelo menos 99% ou muito mais particularmente 100% de identidade com uma serina protease obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a serina protease madura compreendida em SEQ ID NO: 2. A serina protease da presente invenção é adicionalmente descrita em Exemplo 4. SEO ID NO: 4, Anidrase carbônica

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma anidrase carbônica compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou 85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos 96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos 98%, mais particularmente pelo menos 99% ou muito mais particularmente 100% de identidade com a anidrase carbônica obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a anidrase carbônica madura compreendida em SEQ ID NO: 4. A anidrase carbônica da presente invenção é adicionalmente descrita em Exemplo 8. SEOID NO: 6, Anidrase carbônica

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma anidrase carbônica compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou 85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos 96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos .98%, mais particularmente pelo menos 99% ou muito mais particularmente .100% de identidade com a anidrase carbônica obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a anidrase carbônica madura compreendida em SEQID NO: 6. SEO ID NO: 8. Xilanase

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma xilanase compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou 85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos 96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos .98%, mais particularmente pelo menos 99% ou muito mais particularmente .100% de identidade com a xilanase obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a xilanase madura compreendida em SEQ ID NO: 8. A xilanase da presente invenção é adicionalmente descrita em Exemplo 6.

SEOID NO: 10. Ramnogalacturonana liase

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma Ramnogalacturonana liase compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou .85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos .96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos 98%, mais particularmente pelo menos 99% ou muito mais particularmente 100% de identidade com a Ramnogalacturonana liase obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a Ramnogalacturonana liase madura compreendida em SEQ ID NO: 8. A Ramnogalacturonana liase da presente invenção é adicionalmente descrita em Exemplo 5.

SEO ID NO: 12. Galactanase

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é uma Galactanase compreendendo ou consistindo de uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% ou 85%, particularmente pelo menos 95%, mais particularmente pelo menos 96%, mais particularmente pelo menos 97%, mais particularmente pelo menos 98%), mais particularmente pelo menos 99%» ou muito mais particularmente 100% de identidade com a Galactanase obtenível da cepa Bacillus sp. P203, em particular daquela cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, mais particularmente a Galactanase madura compreendida em SEQ ID NO: 8. A Galactanase da presente invenção é adicionalmente descrita em Exemplo 7. Polinucleotídeos

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos, particularmente polinucleotídeos isolados, compreendendo ou consistindo de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo da invenção. Em uma célula particular, a seqüência de nucleotídeos é como apresentada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 incluindo seqüências de nucleotídeos diferindo da mesma em virtude da degeneração do código genético. Em uma modalidade adicional o polinucleotídeo da invenção é uma seqüência de nucleotídeos modificada que compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQID NO: Ii SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro e que compreende pelo menos uma modificação/mutação comparada com a seqüência de nucleotídeos parental compreendida em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.

As técnicas usadas para isolar e/ou clonar uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima são conhecidas na arte e incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma sua combinação. Á clonagem das seqüências de nucleotídeos da presente invenção de tal DNA genômico pode ser efetuada, e.g., pelo uso de bem conhecida reação em cadeia de polimerase (PCR) ou triagem por anticorpo das bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturais compartilhadas. Veja, e.g., Innis et ai., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press5 Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação baseada em seqüências de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. A seqüência de nucleotídeos pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrão usados em engenharia genética para relocar a seqüência de nucleotídeos de sua localização natural para um sítio diferente onde ela será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento desejado compreendendo a seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor, e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde cópias múltiplas ou clones da seqüência de nucleotídeos serão replicadas(os). A seqüência de nucleotídeos pode ser de origem sintética, semi-sintética, genômica, cDNA, RNA, ou qualquer uma de suas combinações.

Em particular o polinucleotídeo compreende, preferivelmente consiste de, uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 50% de identidade com uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um poiipeptídeo maduro. Particularmente, a seqüência de nucleotídeos possui pelo menos 65% de identidade, mais particularmente pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um poiipeptídeo maduro. Particularmente, a seqüência de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um poiipeptídeo maduro. Em uma modalidade ainda mais particular, a seqüência de nucleotídeos consiste de uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um poiipeptídeo maduro.

Em particular o polinucleotídeo compreende, preferivelmente consiste de, uma seqüência de nucleotídeos codificando uma enzima madura selecionada de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase e que possui pelo menos 50% de identidade, particularmente pelo menos 65% de identidade, mais particularmente pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima madura selecionada de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso 17419. SEQID NO: 1

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 1 codificando uma serina protease madura. SEO ID NO: 3

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 codificando uma anidrase carbônica madura. SEO ID NO: 5

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90%» de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 codificando uma anidrase carbônica madura. SEOID NO: 7

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97%» de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 7 codificando uma xilanase madura. SEOID NO: 9

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70%» de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo Jfs

menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100%» de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 9 codificando a ramnogalacturonana liase madura.

SEO ID NO: 11

Em uma célula particular o polinucleotídeo da invenção codifica uma serina protease e compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 70% de identidade, mais particularmente pelo menos 80% de identidade, mais particularmente pelo menos 90% de identidade, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, mais particularmente pelo menos 96% de identidade, mais particularmente pelo menos 97% de identidade, mais particularmente pelo menos 98% de identidade, mais particularmente pelo menos 99% de identidade ou muito mais particularmente 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 11 codificando uma galactanase madura.

Modificação de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção em comparação com uma seqüência de aminoácidos selecionada de polipeptídeo maduro compreendida em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID. NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: IOeSEQ ID NO: 12.

Será evidente para aquelas pessoas experientes na arte que tais modificações podem ser feitas para conservar a função da enzima i.e. feitas fora das regiões críticas para a função da enzima. Resíduos de aminoácido que são essenciais para a função são portanto preferivelmente não submetidos à modificação, tal como substituição. Resíduos de aminoácido essenciais para a função podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, tal como mutagênese sítio-direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (veja, e.g., Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081- 1085). Sítios de interação de substrato-enzima podem ser determinados por análise da estrutura tridimensional conforme determinada por técnicas tais como análise de ressonância nuclear magnética, cristalografia ou marcação de fotoafinidade (veja, e.g., de Vos et ai., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64). Além disso, uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima da invenção pode ser modificada pela introdução de substituições de nucleotídeo que não ocasionam outra seqüência de aminoácidos da enzima codificada pela seqüência de nucleotídeos, mas que corresponde à utilização de códons do organismo hospedeiro intencionada

para a produção da enzima.

A introdução de uma mutação em uma seqüência de

nucleotídeos para substituir um nucleotídeo por outro nucleotídeo pode ser realizada por mutagênese sítio-direcionada usando qualquer um dos métodos conhecidos na arte. Particularmente útil é o procedimento, que utiliza um vetor de DNA de fita dupla, super enrolado com um inserto de interesse e dois iniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeo, complementam cada um as fitas opostas do vetor, se estendem durante o ciclo de temperatura por meio de Pfu DNA polimerase. Sob incorporação dos iniciadores, é gerado um plasmídeo mutado contendo falhas alternadas. Após o ciclo de temperatura, o produto é tratado com DpnI, que é específica para DNA metilado e semi-metilado para digerir o modelo de DNA parental e para selecionar DNA sintetizado contendo mutação. Outros procedimentos conhecidos na arte também podem ser usados. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, pode-se consultar e.g., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo compreendendo, preferivelmente consistindo de, uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da invenção e que hibridiza sob condições de estringência alta, preferivelmente sob condições de estringência muito alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de:

(i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro,

(ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos selecionada das regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro e,

(iii) um fragmento de (i) ou (ii) codificando um polipeptídeo maduro secretado possuindo a função dos polipeptídeos maduros correspondentes compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12

Como será entendido, detalhes e particularidades referentes à hibridização das seqüências de nucleotídeos serão iguais ou análogas aos aspectos de hibridização discutidos em seção intitulada aqui como "polipeptídeos da invenção".

A presente invenção também inclui um meio de armazenagem adequado para uso em um dispositivo eletrônico, preferivelmente digital, compreendendo informação da seqüência de aminoácidos de polipeptídeos da invenção ou das seqüências de nucleotídeos do polinucleotídeo da invenção, em particular de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo ou polinucleotídeo da invenção em uma forma eletrônica ou digital, tal como código binário ou outro código digital. O meio de armazenagem pode ser adequadamente um disco magnético ou óptico e o dispositivo eletrônico um dispositivo de computador e a informação pode ser em particular armazenada no meio de armazenagem em uma forma digital. Vetores de expressão recombinantes

A presente invenção também se refere aos vetores de expressão recombinantes compreendendo o construto de ácido nucleico da invenção. As várias seqüências de controle e de nucleotídeos descritas acima podem ser unidas juntas para produzir um vetor de expressão recombinante, que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeos da presente invenção pode ser expressada pela inserção da seqüência de nucleotídeos ou de um construto de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetor de expressão apropriado. Na criação do vetor de expressão, a seqüência codificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadora seja operacionalmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor

(e.g., um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode produzir a expressão da seqüência de nucleotídeos. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira dentro da qual o vetor é para ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, e.g. um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial.

O vetor pode conter qualquer meio para garantir auto- replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual (quais) ele tem sido integrado. Ademais, um vetor ou plasmídeo único ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais marcadores selecionáveis que permitem fácil seleção das células transformadas. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência viral ou a biocida, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos, e semelhantes.

Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tal como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfmotricina acetiltransferase), hygB (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento(s) que permite(m) a integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não-homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter seqüências de nucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As seqüências de nucleotídeos adicionais permitem que o vetor seja integrado no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem preferivelmente conter um número suficiente de nucleotídeos, tal como 100 a 1.500 pares de base, preferivelmente de 400 a1.500 pares de base, e mais preferivelmente 800 a 1.500 pares de base, que são elevadamente homólogos com a seqüência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Ademais, os elementos de integração podem ser seqüência de nucleotídeos não-codificadora ou codificadora. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não-homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode adicionalmente compreender uma origem de replicação permitindo que o vetor replique autonomamente na célula hospedeira em questão. Exemplos de origens de replicação bacterianas são origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUBllO, pE194, pTA1060, e ρΑΜβΙ permitindo replicação em Bacillus. Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são as origens de replicação de 2 micrômetros, ARS1, ARS4, a combinação de ARSl e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. A origem de replicação pode ser uma possuindo uma mutação que torna seu funcionamento sensível à temperatura na célula hospedeira (veja, e.g., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

Mais do que uma cópia de uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópias da seqüência de nucleotídeos pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com a seqüência de nucleotídeos onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais da seqüência de nucleotídeos, podem ser selecionados por cultivo das células na presença de agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinante da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa experiente na arte (veja, e.g., Sambrook et ai., 1989, supra). Células hospedeiras recombinantes

A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira recombinante compreendendo o construto de ácido nucleico da invenção, que são vantajosamente usados na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico auto-replicante como descrito no início.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, e.g., um procarioto ou um microorganismo não-unicelular, e.g., um eucarioto.

Células unicelulares são células bacterianas tais como bactérias gram-positivas incluindo, mas não se limitando a, uma célula de Bacillus, e.g., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, e.g., Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus subtilis. Em outra modalidade preferida, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalifílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (veja, e.g., Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (veja, e.g., Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (veja, e.g., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (veja, e.g., Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou de fungo.

Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula de fungo. "Fungos" como aqui usado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definidos por Hawksworth et a., em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bem como os Oomycota (como citados em Hawksworth et al., 1995, supra, página171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al.,1995, supra). Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedura. "Levedura" como aqui usado inclui levedura ascosporogena (Endomycetales), levedura basidiosporogena, e levedura pertencente ao Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M., e Davenport5 R.R., eds, Soe. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em uma modalidade ainda mais preferida, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomycesi Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.

Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyees kluyveri, Saccharomyees norbensis ou Saccharomyees oviformis. Em outra modalidade mais preferida, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em outra modalidade mais preferida, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica cell.

Em outra modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica é uma célula fungica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et ai., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelar composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. Desenvolvimento vegetativo é pelo alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, desenvolvimento vegetativo por leveduras tal como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de uma espécie de, mas não limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

Em uma modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outra modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica filamentosa uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmoram, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em uma modalidade ainda mais preferida, a célula parental fungica filamentosa é uma célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). Em outra modalidade mais preferida, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningn, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Células fungicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em uma maneira por si conhecida. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus são descritos em EP 238.023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adequados para a transformação de espécie Fusarium são descritos por Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. Levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

A cepa doadora

A invenção também proporciona a cepa Bacillus sp. P203, como depositada sob o número de acesso DSM 17419, e composições compreendendo este microorganismo. A invenção também proporciona cepas do gênero Bacillus consistindo de uma espécie nova (Bacillus plakortiensis). A espécie nova compreende cepas de Bacillus álcali- e halo-tolerantes que desenvolvem de pH 7-11 e em concentração de NaCl de 0-12% nos meios em temperaturas variando de 4-3 O0C. Condições ótimas foram de 4-20°C, em pH7,5 e em NaCl 10%. Cepas de espéice nova podem ser adicionalmente distinguidas das cepas relacionadas pelos seguintes parâmetros: as cepas poderia utilizar glicerol, glicose, D-frutose, D-manose, D-manitol, arbutina, aesculina, salicina, gelatina, citrato, tributirato de glicerol, D-maltose, D- trealose, leite desnatado, AZCL-caseína, AZCL-arabinana e AZCL-galactana mas não amido, Tween 20, AZCL-xiloglicano, AZCL-pululana, AZCL- arabinoxilana, AZCL-dextrina, AZCL-celulose, AZCL-beta-glicano, AZCL- xilano, amilose vermelha, pululana vermelha e amido vermelho. Hidrólise de ONPG foi observada. Produção de indol (usando reagente de Kovacs) foi negativa, reação de Voges Proskauer (produção de acetoína) e teste para atividade de catalase e de oxidase foram positivos.

Cepa P203 teve 98% de identidade de nucleotídeos da seqüência de 16S rDNA para a cepa tipo de Bacillus gibsonii (número de depósito DSM8722). Características de desenvolvimento de cepa P203 são mostradas em figura 1. Bacillus plakortiensis está mais relacionado com Bacillus gibsonii do que com qualquer outra espécie de Bacillus conhecida, baseado em análise comparativa de 16S rDNA. Contudo, homologia de DNA entre Bacillus plakortiensis, cepa P203, e a espécie de Bacillus mais proximamente conhecida cepa tipo B. gibsonii é (25,8-29,5%) hibridização de DNA-DNA e conteúdo de G+C DNA, determinado por HPLC em fase reversa em DSMZ, Braunschweig, Alemanha. DNA foi isolado usando uma prensa French (Thermo Spectronic™) e purificado por cromatografia sobre hidróxiapatita como descrito por (Cashion, et al., 1977). Hibridização DNA- DNA foi realizada como descrito por Ley, J. D., Cattoir, H. & Reynaerts, A. (1970): "The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates". Eur J Biochem 12, 133-42, com as modificações descritas por Huss, V. A. R., Festl, H. & Schleifer, Κ. H. (1983): "Studies on the spectrophotometry determination of DNA hybridization from renaturation rates". Syst Appl Microbiol 4, 184-192, usando um espectrofotômetro UV- VIS modelo Gary 100 Bio equipado com um trocador de multicélulas 6x6 termostatizado Peltier e um controlador de temperatura com sonda de temperatura in situ (Varian).

Métodos para preparação de polipeptídeos de enzima

A presente invenção também se refere aos métodos para produzir uma enzima da invenção compreendendo (a) cultivar uma cepa compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima da invenção cuja cepa é capaz de expressar e de secretar a enzima e (b) recuperar a enzima. Em uma célula particular a cepa uma cepa de tipo selvagem tal como a cepa Bacillus sp. P203 DSM 17419, enquanto que em outra modalidade a cepa é uma célula hospedeira recombinante como descrito, supra.

Nestes métodos da invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção da enzima usando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, fermentação em escala pequena ou em escala grande (incluindo fermentações contínua, em batelada, em batelada alimentada, ou no estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (e.g., em catálogos da American Type Culture Collection). Como a enzima é secretada no meio nutriente, a enzima pode ser

recuperada diretamente do meio.

A enzima resultante pode ser recuperada por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, a enzima pode ser recuperada por do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, fütração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, cromatografia (e.g., troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (e.g., focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (e.g. precipitação com sulfato de amônio), SDS- PAGE, ou extração (veja, e.g., Protein Purification, J. -C. Janson e Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).

Os métodos da invenção também incluem o método TAST de WO 01/77315 Al em uma amostra da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso 17419, i.e. por fusão de genes (e.g. de uma biblioteca de gene) do genoma da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 com um gene codificando um gene repórter sem sinal, tal como uma beta-lactamase, via uma etiqueta transposon, desenvolvimento de clones de célula hospedeira compreendendo os genes da cepa Bacillus sp. P203 DSM 17419 fundidos com um gene codificando um repórteres sem sinal, tal como uma beta-lactamase, via uma etiqueta transposon em um meio revelando a presença do repórter, tal como um meio contendo ampicilina, detecção de clones secretando o repórter e isolamento de gene e de polipeptídeo da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 compreendida naquele clone. Quando em desenvolvimento os clones de célula hospedeira compreendendo os genes da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso 17419 fundido com um gene codificando um repórter sem sinal, tal como uma beta-lactamase, via uma etiqueta transposon em um meio revelando a presença do repórter, tal como um meio contendo ampicilina, apenas aqueles clones expressando e secretando o repórter (e.g. beta- lactamase) serão detectados (e.g. sobreviverão). Contudo o repórter apenas será secretado se o gene no qual o gene repórter está fundido tiver um promotor e sítio dè ligação de ribossomo intactos (i.e. um gene que é expressado pela célula para produzir um polipeptídeo em vida real), que pode ser reconhecido na cepa hospedeira, e se o repórter for traduzido de modo que o polipeptídeo sintetizado seja transportado através da membrana citoplasmática e dobrado corretamente. Conseqüentemente, quando se insere o gene fundido em uma célula hospedeira selecionada, aqueles clones, para os quais uma presença de repórter é detectada (e.g. resistência à ampicilina), conterão um gene da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419, que codifica um polipeptídeo funcional secretado.

Plantas transgênicas

A presente invenção também se refere a uma planta transgênica, parte de planta transgênica, ou célula de planta transgênica que tem sido transformada com uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima da invenção de modo a expressar e produzir a enzima. Em uma modalidade a planta poderia ser usada como hospedeira para a produção da enzima em quantidades recuperáveis. A enzima pode ser recuperada da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo a enzima recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou de uma ração, e.g., melhorando o valor nutricional, a palatabilidade, e as propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo. Em particular a planta ou as partes de planta expressando a enzima podem ser usadas como um material inicial melhorado para a produção de bio-etanol ou álcoois combustíveis.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como grama do prado (blue grass, Poa), capim de forragem tal como festuca, lolium, capim temperado, tal como Agrostis, e cereais, e.g., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho.

Exemplos, de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batateiras, beterraba, ervilha, feijão e feijão-soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tal como couve-flor, colza, e o organismo modelo proximamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Exemplos de partes de planta são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes, e tubérculos. Também tecidos de planta específicos, tais como cloroplasto, apoplasto, mitocôndria, vacúolo, peroxissomos, e citoplasma são considerados como uma parte e planta. Ademais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem, é considerada como sendo uma parte de planta.

Também estão incluídas dentro do escopo da presente invenção as progênies de tais plantas, partes de planta e células de planta.

A planta ou célula de planta transgênica expressando uma enzima da invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na arte. Resumidamente, a planta ou célula de planta é construída pela incorporação de um ou mais construtos de expressão codificando uma enzima da invenção no genoma hospedeiro da planta e propagação da planta ou célula de planta em uma planta ou célula de planta transgênica.

Convenientemente, o construto de expressão é um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima da presente invenção operacionalmente ligada com seqüências regulatórias apropriadas requeridas para expressão da seqüência de nucleotídeos na planta ou parte de planta de escolha. Ademais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células hospedeiras nas quais o construto de expressão tem sido integrado e seqüências de DNA necessárias para introdução do construto na planta em questão (as últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de seqüências regulatórias, tais como seqüências de promotor e de terminador e opcionalmente seqüências de trânsito ou de sinal, é determinada, por exemplo, baseando-se quando, onde, e como a enzima é desejada para ser expressada. Por exemplo, a expressão do gene codificando uma enzima da invenção pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica de desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser selecionado para uma parte de planta ou um tecido específica(o) tal como sementes ou folhas. Seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et ai, 1988, Plant Physiology 86: 506. Para expressão constitutiva, o promotor 35S-CaMV pode ser usado (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294). Promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de escoamento de armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de escoamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant MoI. BioL 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, de prolamina, de globulina, ou de albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba de legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenagem napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na arte, e.g., como descrito em WO 91/14772. Ademais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz e de tomateiro (Kyozuka et aL, 1993, Plant Physiology 102: 991- 1000, o promotor de gene de adenina metil-transferase de vírus de chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor de gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou promotor induzível por ferimento tal como o promotor pin2 de batateira (Xu et aL, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

Um elemento intensificador de promotor também pode ser usado para alcançar expressão maior da enzima da invenção na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotor pode ser um íntron que está posicionado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificando uma enzima da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra descrevem o uso de primeiro íntron do gene de actina 1 de arroz para intensificar expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na arte. O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Presentemente, transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para geração de dicots transgênicas (para uma revisão, veja Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). Contudo também pode ser usada para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação sejam geralmente preferidos para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerar monocots transgênicas é bombardeio de partículas (partículas microscópicas de ouro ou de tungstênio revestidas com ο DNA transformante) de caules embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamotoi1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et ai., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et ai., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428. Após transformação, os transformantes possuindo incorporado neles o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem estabelecidos na arte.

A presente invenção também se refere aos métodos para produzir uma enzima da invenção compreendendo (a) cultivar uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma enzima da invenção sob condições que conduzem à produção da enzima e (b) recuperar a enzima.

Composições compreendendo polipeptídeos e métodos para a sua preparação

A invenção proporciona uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção e preferivelmente um excipiente e um método para preparar uma tal composição compreendendo misturar o polipeptídeo da invenção com um excipiente. Em particular a composição compreende pelo menos dois polipeptídeos da invenção diferentes, preferivelmente pelo menos3, mais preferivelmente pelo menos 4, mais preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6. Mais a composição compreende todos os polipeptídeos secretados quando se fermenta uma amostra de cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 ou um seu mutante na qual um ou mais genes têm sido deletados ou adicionados.

Em uma célula particular o polipeptídeo da invenção é o maior componente (polipeptídeo) da composição, e.g., uma composição de mono- componente. O excipiente neste contexto é para ser entendido como qualquer agente ou composto auxiliar usado para formular a composição e inclui solvente, veículos, estabilizadores e semelhantes.

A composição pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, haloperoxidase, invertase, Iacase5 lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na arte e podem estar na forma de uma composição líquida ou sólida. Por exemplo, a composição de enzima pode ser formulada usando métodos conhecidos na arte de formulação de polipeptídeos e/ou produtos farmacêuticos, e.g. em grânulos ou microgrânulos revestidos ou não revestidos. O polipeptídeo da invenção pode ser assim proporcionado na forma de um grânulo, preferivelmente um grânulo não-pulverulento, um líquido, em particular um líquido estabilizado, uma lama ou um polipeptídeo protegido. Para certas aplicações, imobilização do polipeptídeo sobre uma matriz sólida pode ser preferida.

O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na arte e.g. por estabilização do polipeptídeo na composição pela adição de antioxidante ou agente redutor para limitar a oxidação do polipeptídeo ou pode ser estabilizada pela adição de polímeros tais como PVP, PVA, PEG ou outros polímeros adequados conhecidos como sendo benéficos para a estabilidade dos polipeptídeos em composições sólidas ou líquidas.

Em uma outra modalidade a composição da invenção é uma composição de detergente que, em adição ao polipeptídeo da invenção, compreende um tensoativo e opcionalmente compostos selecionados do grupo consistindo de reforçadores tal como zeólitas, agentes alvejantes tal como percarbonato, intensificadores de alvejamento tal como TAED ou NOBS, supressores de espumas, fragrâncias, etc.

Em uma outra modalidade a composição da invenção é uma composição de ração que em adição ao polipeptídeo da invenção compreende um produto de cereal ou grão.

Em uma outra modalidade a composição da invenção é uma composição de alimento tal como uma composição de farinha de padeiro, um produto fermentado, um suco de frutas, um produto de óleo ou lardo compreendendo o polipeptídeo da invenção.

Em uma outra modalidade a composição da invenção uma composição de polpa, que em adição ao polipeptídeo da invenção, compreende polpa.

Uso de polipeptídeos ou composições compreendendo-os

Em ainda outros aspectos a invenção proporciona o uso dos polipeptídeos ou polinucleotídeos da invenção ou de uma composição compreendendo citados polipeptídeos ou polinucleotídeos em várias aplicações, particularmente processos (técnicos) tais como processos realizados em indústria ou ambiente doméstico, aqui sob os propósitos de pesquisa comercial. Conseqüentemente a invenção inclui um processo compreendendo o emprego de um polipeptídeo da invenção ou de um polinucleotídeo da invenção em um processo industrial (técnico), de pesquisa ou doméstico.

Em uma modalidade o polipeptídeo ou a composição da invenção é usado(a) para limpeza de tecido celulósico.

Em outra modalidade o polipeptídeo ou a composição da invenção é usado(a) para preparar um aditivo de ração ou alimento.

Em ainda outra modalidade o polipeptídeo ou a composição da invenção é usado(a) para tratamento de materiais lignolíticos e de polpa. Em particular anidrase carbônica pode ser usada para fixação de carbono a partir de correntes de emissão de CO2, e.g. em reatores de membrana para separação de CO2 de correntes gasosas usando anidrase carbônica para aplicações em e.g. chaminés de gás de combustão de geração elétrica, gases de estufa, mas também aplicações não convencionais tais como cabinas de piloto e roupas espaciais de astronauta para manter o ar de respiração livre de níveis tóxicos de CO2. Em outra modalidade anidrases carbônicas podem ser úteis para promover purificação de água ou mineralização de meios aquosos pela produção de bicarbonato que pode complexar com íons dissolvidos nos meios aquosos, especialmente íons divalentes tal como cálcio, e auxiliar floculação ou precipitação destes íons dos meios aquosos. Tal precipitação pode em algumas aplicações ser usada para reduzir dureza da água, e em outras aplicações pode ter um benefício adicional de aumento de peso, volume, ou opacidade de certos produtos, tais como em processo de fabricação de papel, ou em remediação de solos e rochas.

Ademais anidrase carbônica também pode ser usada como alvos para o desenvolvimento de droga tais como inibidores de anidrase carbônica (e.g. derivados de sulfonamida). DESCRIÇÃO DE DETERGENTE

O polipeptídeo da invenção pode ser adicionado em e portanto se tornar um componente de uma composição de detergente.

A composição de detergente da invenção pode ser por exemplo formulada como uma composição de detergente para lavagem de roupas manual ou à máquina incluindo uma composição de aditivo para lavagem de roupas adequada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição de amaciante de tecido adicionada no enxágüe, ou ser formulada como uma composição de detergente para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica em geral, ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina.

Em um aspecto específico, a invenção proporciona um aditivo de detergente compreendendo o polipeptídeo da invenção. O aditivo de detergente bem como a composição de detergente podem compreender uma ou mais enzimas tais como uma protease, uma Iipasej uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, e.g., a Iacase5 e/ou uma peroxidase.

Em geral as propriedades da(s) enzima(s) escolhida(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado, (i.e. pH-ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades efetivas.

Proteases: proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Origem microbiana é preferida. Mutantes engenhados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos.

A protease pode ser uma serina protease ou uma metalo protease, preferivelmente uma protease microbiana ou uma protease semelhante à tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, e.g., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas em WO89/06279). Exemplos de proteases semelhantes à tripsina são tripsina (e.g. de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusarium descrita em WO89/06270 e WO 94/25583.

Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36,57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e274.

Enzimas protease comercialmente disponíveis preferidas incluem Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase®, e Kannase® (Novozymes AIS), Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect OxP®, FN2®, e FN3® (Genencor International Inc.).

Lipases: lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes engenhados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), e.g. de H. Ianuginosa (T. lanuginosus) como descrito em EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descrito em WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas5 e.g. de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, e.g. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta,1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO91/16422).

Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Enzimas lipase comercialmente disponíveis preferidas incluem Lipolase™, Lipolase Ultra™ e Lipex (Novozymes A/S).

Amilases: amilases adequadas (alfa e/ou beta) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mutantes engenhados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, e.g. uma cepa especial de B. licheniformis, descritos com mais detalhe em GB 1.296.839.

Exemplos de amilases úteis são as variantes descritas em WO94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, .105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, .264, 304, 305, 391, 408, e 444. Amilases comercialmente disponíveis são Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ e ΒΑΝ™ (Novozymes A/S), Rapidase™ e Purastar™ (de Genencor International Inc.).

Celulases: celulases adequadas incluem aquelas de origem fungica ou bacteriana. Mutantes engenhados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, e.g. como celulases fungicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum descritas em US .4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259.

Celulases especialmente adequadas são celulases alcalinas ou neutras possuindo benefícios para o cuidado da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas EP 0495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas em WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US .5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme®, e Carezyme® (Novozymes), Clazinase®, e Puradax HA® (Genencor International Inc.), e KAC-5 OO(B) © (Kao Corporation).

Peroxidases/Oxidases: peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fungica. Mutantes engenhados de proteína ou quimicamente modificados estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, e.g. de C. cinereus, e suas variantes aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.

Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme® (Novozymes A/S). A(s) enzima(s) pode(m) de detergente pode(m) ser incluída(s) em uma composição de detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, i.e. um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado e.g. com um granulado, um líquido, uma lama, etc. Formulações de aditivo de detergente preferidas são granulados, em particular granulados não- pulverulentos, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou lamas.

Granulados não-pulverulentos podem ser produzidos, e.g., como descrito em US 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na arte. Exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de poli(óxido de etileno) (poli(etileno- glicol), PEG) com pesos moleculares médios de 1.000 a 20.000; nonil-fenóis etoxilados possuindo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. Preparações líquidas de enzima podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno-glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238,216.

A composição de detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, e.g., uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70% de água e 0-30% de solvente orgânico, ou não-aquoso.

A composição de detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não-iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwiteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,1% a 60% em peso.

Quando incluído no mesmo o detergente normalmente conterá de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico tal como alquil- benzeno-sulfonato Iinear5 alfa-olefma-sulfonato, alquil-sulfato (sulfato de álcool graxo), álcool-etóxi-sulfato, alcano-sulfonato secundário, metil-éster de ácido alfa-sulfo-graxo, ácido alquil- ou alquenil-succínico ou sabão. Quando incluído no mesmo o detergente normalmente conterá de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não-iônico tal como etoxilato de álcool, etoxilato de nonil-fenol, alquil-poliglicosídeo, alquil-dimetil-amina-óxido, monoetanol-amina de ácido graxo etoxilado, monoetanol-amida de ácido graxo, amida de ácido poli-hidróxi-alquil-graxo, ou N-acil N-alquil derivados de glicosamina ("glicamidas"). O detergente pode conter 0-65 % de um reforçador de detergente ou agente complexante tal como zeólita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilo-triacético, ácido etileno- diamino-tetraacético, ácido alquil- ou alquenil-succínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (e.g. SKS-6 da Hoechst).

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carbóxi-metil-celulose, poli(vinil-pirrolidona), poli(etileno- glicol), poli(vinil-álcool), poli(vinilpiridina-N- oxido), poli(vinil-imidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/ácido acrílico e copolímero de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de alvejamento que pode compreender uma fonte de H2O2 tal como perborato ou percarbonato que pode estar combinada com um ativador de alvejante formador de perácido tal como tetraacetil-etileno-diamina ou nonanoil-óxi-benzeno-sulfonato. Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender peróxi-ácidos de e.g. tipo amida, imida, ou sulfona.

A(s) enzima(s) da composição de detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizadores convencionais, e.g., um poliol tal como propileno-glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, e.g., um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil-borônico tal como ácido 4-formil-fenil-borônico, e a composição pode ser formulada como descrito em e.g. WO 92/19709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais tais como e.g. condicionadores de tecido incluindo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti- corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes de anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos, hidrótropos, inibidores de mancha, ou perfumes.

Atualmente é contemplado que nas composições de detergente qualquer enzima, em particular a enzima da invenção, pode ser adicionada em uma quantidade correspondendo a 0,01-100 mg de proteína enzima por litro de licor de lavagem, preferivelmente 0,05-5 mg de proteína enzima por litro de licor de lavagem, em particular 0,1-1 mg de proteína enzima por litro de licor de lavagem.

A enzima da invenção pode ser adicionalmente incorporada nas formulações de detergente descritas em WO 97/07202 que é por isto incorporada como referência. MICROORGANISMOS DEPOSITADOS

O seguinte microorganismo foi depositado pelo requerente de acordo com o Tratado de Budapeste sobre Reconhecimento Internacional de depósitos de Microorganismos para o Propósito de Procedimentos de Patente na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH5 Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha:

.23 de junho de 2005; cepa Bacillus sp. P203; número de acesso em DSM: DSM 17419. EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação de polipeptídeos funcionais secretados pela

cepa Bacillus sp. P203, DSM 17419

A. Construção de biblioteca genômica

DNA cromossômico da cepa Bacillus sp. P203 (DSM 17419) foi preparado pelo uso de técnicas de biologia molecular padrão (Ausuble et ai. 1995 "Current protocols in molecular biology Publ: John Wiley and Sons). O DNA preparado foi parcialmente clivado com MboI e separado em um gradiente de sacarose por ultracentrifugação. Fragmentos de 3 a 10 quilobases foram extraídos, precipitados e ressuspensos em um tampão adequado.

Uma biblioteca genômica foi preparada pelo uso de Stratagene ZAP Express™ predigested Vetor kit e Stratagene ZAP Express ™predigested Gigapack ® cloning kit (BamH I pré-digerida) (Stratagene Inc., USA) seguindo as instruções/recomendações do vendedor. A biblioteca lambdaZAP resultante compreendeu l,25xl06 pfu dos quais 40.000 foram coletados para excisão de massa. As 10.000 colônias de E. coli resultantes foram reunidas e os plasmídeos foram preparados pelo uso de Qiagen Spin Mini prep kit (Qiagen, Alemanha). O eluato de aproximadamente 1 mL contendo o DNA plasmídeo foi precipitado em uma centrífuga com 1 parte em volume de acetato de Na de pH 5 e 2 partes em volume de etanol 96% a20.000 rpm a 4°C, lavado com etanol 70% (v/v), seco na temperatura ambiente e ressuspenso em 200 microlitros de tampão TE. A concentração de DNA do DNA de plasmídeo de coleção da biblioteca genômica de cepa Bacillus sp. P203 foi de 0,7 micrograma/microlitro.

B. Preparação e construção de transposon

A base lógica por trás da metodologia da Captação de Sinal Auxiliada por Transposon (TAST) como descrito em WO 01/77315 Al é a fusão de todos os genes dentro de um genoma selecionado com um gene codificando uma beta-lactamase sem sinal via uma etiqueta transposon. Conseqüentemente clones de célula hospedeira em desenvolvimento compreendendo os genes de um genoma fundido com um gene codificando uma beta-lactamase sem sinal via uma etiqueta transposon em um meio contendo ampicilina apenas aqueles clones expressando e secretando uma beta-lactamase sobreviverão. Contudo a beta-lactamase apenas será secretada se o gene ao qual o gene de beta-lactamase está fundido possuir um promotor e um sítio de ligação de ribossomo intactos (i.e. um gene que é expressado pela célula para produzir um polipeptídeo em vida real), que pode ser reconhecido na cepa hospedeira, e se a beta-lactamase for traduzida de modo que o polipeptídeo sintetizado seja transportado através da membrana citoplasmática e dobrado corretamente. Conseqüentemente, quando se insere o gene fundido em uma célula hospedeira selecionada, aqueles clones, que são resistentes à ampicilina contêm um gene que codifica um polipeptídeo funcional secretado.

Normalmente, quando se emprega a metodologia de TAST até

mesmo não é necessário expressar o gene inteiro. Quando se etiquetam os genes com um transposon, expressão da parte N-terminal dos genes como proteína de fusão mostra que os genes contêm seqüências de transcrição, de tradução e de secreção intactas. Conseqüentemente a expressão da parte N- terminal dos genes como fusão de proteína é normalmente considerada como suficiente para garantir expressão e secreção do gene inteiro.

Assim pode ser concluído que os genes obtidos pelo método de TAST realmente codificam polipeptídeos funcionais secretados. Construção de um transposon SigA4 contendo o gene repórter de beta- lactamase:

Seguindo as instruções de WO 01/77315 Al, a construção de um transposon contendo um gene de beta-lactamase sem sinal foi realizada usando técnicas de biologia molecular padrão. O gene de beta-lactamase sem sinal foi inicialmente amplificado por PCR a partir do vetor pUC19) usando uma polimerase revisora (Pfu Turbo, Stratagene, USA). O fragmento de PCR resultante continha os sítios de restrição NotI e EcoRI com o objetivo de auxiliar a clonagem. O plasmídeo pEntranceposon(Camr) contendo o Entranceposon e os marcadores de resistência a antibiótico CAT (codificando resistência a cloranfenicol no transposon) foi obtido de Finnzymes, OY (Espoo Finlância). O plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição NotI e EcoRIs purificado em gel e ligado com fragmento contendo beta-lactamase sem sinal. A ligação foi transformada em células DHlOB eletrocompetentes e o clone de E.coli contendo o plasmídeo recombinante com a beta-lactamase sem sinal foi identificado por análise de restrição e chamado de SigA2.

Para preparação de transposon, foi construído um derivado menor de SigA2, que foi faltante do gene bla codificando beta-lactamase: dois iniciadores de oligonucleotídeo SigA2NotU-P 5'-TCG CGA TCC GTT TTC GCA TTT ATC GTG AAA CGC T-3* (SEQ ID NO: 15) e SigA2NotD-P 5*- CCG CAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA GAT GCT GAA-3' (SEQ ID NO: 16), que se ligam para iniciar e terminar o gene bla de SigA2 direcionando para foram usados para amplificar por PCR SigA2 sem o gene bla. Um amplificado de aproximadamente 3,6 kb gerado nesta reação de PCR foi relegado e transformado em uma cepa de E. coli adequada. Foi isolado um plasmídeo de 3,6 kb de um transformante que foi capaz de desenvolver sobre cloranfenicol LB mas não sobre ampicilina LB. Este plasmídeo manteve ambos os sítios BgIII e foi faltante de gene bla ativo e foi chamado de pSig4 (veja o pedido de patente PA 2004000010).

.60 microlitros de preparação de pSigA4 plasmídeo DNA com uma concentração de 0,3 micrograma/microlitro foram digeridos com BgIII e separados sobre um gel de agarose. A banda de SigA2 transposon DNA de 2 kb foi eluída e purificada pelo uso de "GFX™PCR, DNA e Gel Band Purification Kit" (Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA) de acordo com as instruções do vendedor e eluída em 200 microlitros de tampão EB. C. Etiquetação de transposon

O transposon preparado de pSigA4 traz um gene bla 5'- truncado codificando uma beta-lactamase da qual o sinal de secreção foi removido. A beta-lactamase transmite resistência à ampicilina em E. coli apenas quando a proteína é secretada para o periplasma, enquanto que expressão citoplásmica de beta-lactamase não confere resistência à ampicilina. Sem uma seqüência de sinal, a enzima beta-lactamase não será transportada para o periplasma e portando o clone não desenvolverá sobre meio contendo ampicilina. O gene de beta-lactamase sem sinal estava contido no transposon em um tal modo que houve uma matriz de leitura aberta contínua entre a borda de transposon e a região codificadora de beta- lactamase. Nesta maneira o transposon modificado, quando transpõe para dentro de um gene codificando uma proteína que é secretada, poderia causar uma fusão em matriz com o gene alvo. Isto resultou em um produto de gene de fusão que é secretado para o periplasma de E. coli e transmite resistência à ampicilina. Se o transposon integrado até mesmo em matriz para dentro de um gene codificando uma proteína não-secretada, o respectivo hospedeiro não se tornará resistente à ampicilina.

Para a etiquetação de transposon in vitro da biblioteca de cepa Bacillus sp. P203, 250 nanogramas de transposon SigA2 foram misturados com 2,5 microgramas da concentração de DNA plasmídeo de coleção da biblioteca genômica de cepa Bacillus sp. P203, 2,5 microlitros de Finn-zymes MuA Transposase (0,22 micrograma/microlitro) e 10 microlitros de 5x tampão de Finn-zymes OY5 Espoo, Finlândia) em um volume total de 50 microlitros e incubados a 30°C por 3 h e seguido por inativação por calor a75°C por 10 min. O DNA foi precipitado pela adição de 5 microlitros acetato de Na 3M de pH 5 e 110 microlitros de etanol 96%, incubado a -20°C por 20 h e centrifugado por 30 min a 20.000 rpm. A pelota foi lavada com etanol70%, seca e ressuspensa em 10 microlitros de tampão TE. D. Transformação e seleção

Células de E. coli DHlOB eletrocompetentes foram transformadas por eletroporação em um dispositivo Biorad Gene Pulse (50 pF, 25 mAmp, 1,8 kV) com 5 microlitros da coleção de plasmídeo etiquetado com transposon, misturados com 1 mL de meio SOC, pré-incubadas por 1 h a37°C e plaqueadas sobre LB com 25 microlitros/mililitro de ampicilina, 50 microlitros/mililitro de canamicina, 10 microlitros/mililitro de cloranfenicol e incubadas por 2-3 dias a 30°C. Dos transformantes resistentes 1152 colônias foram selecionadas. Modelos para seqüenciamento de DNA da biblioteca captada de sinal foram preparados por amplifícação de ciclo rolante usando o Templyphi 500 kit (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante.

E. Preparação e seqüenciamento de plasmídeo

Aproximadamente 500 plasmídeos etiquetados com transposon foram seqüenciados com o iniciador A2up AGCGTTTGCGGCCGCGATCC (SEQ ID NO: 13) que leu a montante no sentido do gene etiquetado com transposon, e, em uma segunda reação, com iniciador B TTATTCGGTCGAAAAGGATCC (SEQ ID NO: 14) que leu a jusante no sentido do gene etiquetado com transposon. F. Anotação e montagem de seqüência

As seqüências obtidas foram montadas em contíguos pelo uso do programa PhredPhrap (Brent Ewing, LaDeana Hillier, Michael C. Wendl, e Phil Green, "Base-calling of automated sequencer traces using phred I. Accuracy assessment" (1998) Genome Research 8:175-185; Brent Ewing e Phil Green, "Base-calling of automated sequencer traces using phred II. Error probabilities" (1998) Genome Research 8:186-194). Os contíguos obtidos foram subseqüentemente comparados com seqüências disponíveis em bancos de dados de seqüências de proteína e de DNA públicos padrão pelo uso do programa BLASTX 2.0al9MP-WashU [14-Jul-1998] [Build linux-x86 .18:51:44 30- Jul-I 998] (Gish5 Warren (1994-1997). Ν; Gish, Warren e David J. States (1993). "Identification of protein coding regions by database similarity search". Nat. Genet. 3:266-72). As seqüências obtidas foram genes funcionais que codificaram polipeptídeos funcionais e intactos, porque foram obtidos como clones resistentes à ampicilina como explicado supra. Exemplo 2: Determinação de função por homologia.

As funções dos polipeptídeos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 foram anotadas por comparação de seqüências com genes ou polipeptídeos de função conhecida. Os polipeptídeos da invenção foram comparados com uma lista de seqüências proximamente relacionadas dos bancos de dados públicos e de casa de contíguos. Os contíguos foram subseqüentemente comparados com seqüências disponíveis em bancos de dados de seqüências de proteína e de DNA públicos e padrão pelo uso do programa BLASTX 2.0al9MP- WashU [ 14-Jul-1998]. Uma análise cuidadosa dos alinhamentos de seqüências de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 com suas seqüências relacionadas mais próximas com função conhecida de outros bancos de dados tornou possível predizer a função destes polipeptídeos tendo por base o grau de identidade de aminoácido. Até mesmo quando a identidade de aminoácido total esteve abaixo de 40%, que normalmente torna difícil fazer uma predição boa, fomos capazes de predizer a função de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12 pelas análise e interpretação cuidadosas dos resíduos de aminoácido nos sítios catalíticos ou em regiões importantes das seqüências de polipeptídeo. Se os aminoácidos do sítio catalítico de seqüências conhecidas também estavam presentes no polipeptídeo da invenção, combinados com uma identidade de aminoácido total suficiente, foi concluído que o polipeptídeo de Bacillus sp. P203 (DSM 17419) tinha a mesma função que a da seqüência conhecida. Exemplo 3: Preparação de polipeptídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQID NO: 10 e SEQ ID NO:12.

Para preparar os polipeptídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, os genes compreendidos em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando estes polipeptídeos são expressados pela fusão do DNA codificando a matriz de leitura aberta no DNA um promotor, sítio de ligação de ribossomo e terminador adequados para expressão de genes em uma cepa hospedeira apropriada, por exemplo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou Bacillus clausii ou um derivado de cepa Bacillus sp. P203. O promotor pode ser quer um promotor induzível quer um promotor constitutivo. Quaisquer seqüências de sinal podem ser trocadas com um peptídeo de sinal adequado de outra bactéria. O construto de expressão pode ser quer parte de um plasmídeo ou de um DNA linear. Pode ser integrado no cromossomo da cepa hospedeira por recombinação ou pode estar presente na célula hospedeira em um plasmídeo. Então as células transformadas trazendo o gene de interesse são desenvolvidas em um meio adequado no volume desejado. Se um promotor induzível for usado, a expressão de gene é iniciada pela adição de indutor. De outro modo nenhum indutor é necessário e as células serão desenvolvidas até que seja produzida uma quantidade adequada de proteína do gene de interesse. Então a cultura é colhida e as proteínas são recuperadas por métodos padrão.

Exemplo 4: PROTEASE

O fluido de cultura ou um lisado de células de uma cepa

hospedeira sintetizando e secretando uma serina protease em um tampão adequado pode ser ensaiado para aquela atividade. Um volume adequado de uma tal amostra é pontualmente aplicada sobre placas de agarose que contêm o substrato cromogênico insolúvel AZCL-caseína (Megazyme ™) e um tampão adequado em pH apropriado. A placa é incubada por um tempo apropriado, e.g. um dia, em uma temperatura adequada, e.g. 55°C. A atividade é visível como halos azuis ao redor dos pontos. Como uma alternativa à AZCL-caseína, caseína não marcada pode ser usada. Sobre caseína não marcada pontualmente aplicadas sobre placas de agarose, zonas claras formam na presença de uma serina protease. Exemplo 5: RAMNOGALACTURONANA LIASE.

Ramnogalacturonana é um polissacarídeo maior encontrado nas regiões ramificadas de pectina. Ramnogalacturonana liase (PL4 e PLl 1) e ramnogalacturonase (GH28) são enzimas que podem degradar a estrutura principal de ramnogalacturonana de pectina mas não possuem especificidade para homoga-lacturonana. Um volume adequado do fluido de cultura ou de um lisado celular de uma cepa hospedeira sintetizando e secretando uma ramnogalacturonana liase em um tampão adequado em uma temperatura apropriada, e.g. 30°C é usado para medir a atividade. Um volume adequado de uma tal amostra é pontualmente aplicado sobre placas de agarose que contêm o substrato cromogênico insolúvel AZCL- ramnogalacturonana I (Megazyme). A placa é incubada por um tempo apropriado, e.g. um dia em uma temperatura apropriada, e.g. 30°C. A atividade é visível como halos azuis ao redor de pontos. Como uma alternativa AZCL-galactana ou AZCL-arabinada desramificada ou galactana péctica de batata não marcada ou ramnogalacturonana é adicionada nas placas de ágar ou como solução de substrato no ensaio de enzima. Atividade de enzima pode ser detectada como halos azuis ao redor de pontos zonas claras ou por métodos publicados por Mutter, M. et al., "Characterization of Recombinant Rhamnogalacturonan alpha-L- Rhamnopyranosyl-(l,4)-alpha-D-Galactopyranosyluronide Lyase of

Aspergillus aculeatus", Plant Physiol. (1998) 117: 141-152 e de McKie, V. et al., "A new family of rhamnogalacturonan liases contains a enzyme that binds to cellulose", Biochem. J. (2001) 355, 167-177.

Exemplo 6: XILANASE

Xilanases são enzimas endo-atuantes que clivam polímeros de beta-l,4-xilose. Para a medição de endo-1,4-beta-D-xilanase em preparações de enzima o Xylanase Assay Kit (Megazyme) pode ser usado. Alternativamente, um volume adequado do fluido de cultura ou de um lisado celular de uma cepa hospedeira sintetizando e secretando uma xilanase em um tampão adequado em uma temperatura apropriada, e.g. 3 O0C é usado para medir a atividade Um volume apropriado de uma tal amostra é pontualmente aplicado sobre placas de agarose que contém o substrato cromogênico insolúvel AZCL-xilana ou AZCL-arabinoxilana (Megazyme). A placa é incubada por um tempo apropriado, e.g. um dia em uma temperatura adequada, e.g. 30°C. A atividade é visível como halos azuis ao redor de pontos.

Exemplo 7: GALACTANASE

Proteínas deste tipo são hemicelulases que podem hidrolisar xilo-oligossacarídeos curtos, e.g. arabinana. O fluido de cultura ou um lisado de célula de uma cepa hospedeira sintetizando ou secretando uma xilosidase em um tampão adequado pode ser ensaiado para aquela atividade. Um volume adequado do fluido de cultura ou de um lisado de célula de uma cepa hospedeira sintetizando e secretando uma xilanase em um tampão apropriado em uma temperatura adequada, e.g. 30°C é usado para medir a atividade. Um volume apropriado de uma tal amostra é pontualmente aplicado sobre placas de agarose que contém o substrato cromogênico insolúvel AZCL-arabinana (Megazyme). A placa é incubada por um tempo apropriado, e.g. um dia em uma temperatura adequada, e.g. 30°C. A atividade é visível como halos azuis ao redor de pontos..

Exemplo 8: Expressão de anidrase carbônica de cepa Bacillus sp. P203 em B. subtilis O peptídeo de sinal da alfa-amilase de B. Iicheniformis (AmyL) foi fundido por PCR em matriz no gene codificando a anidrase carbônica (SEQ ID NO: 3). O DNA codificando a seqüência codificadora resultante foi integrado por recombinação homóloga no genoma de cepa hospedeira Bacillus subtilis. O construto de gene foi expressado sob o controle de um sistema de promotor triplo (como descrito em WO 99/43835), consistindo dos promotores de gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), e promotor crylIIA de Bacillus thuringiensis incluindo seqüência estabilizadora. O gene codificador de Cloranfenicol acetil-transferase foi usado como marcador. (Descrito e.g em Diderichsen et ai, "A useful cloning vetor for Bacillus subtilis". Plasmid, 30, p. 312, 1993).

Transformantes resistentes a cloranfenicol foram analisados por seqüenciamento de DNA para verificar a seqüência de DNA correta do construto. Um tal clone foi selecionado.

Fermentações de uma clone de expressão de anidrase carbônica (SEQ ID NO: 4) foram realizadas em uma mesa agitadora rotativa em frascos Erlenmeyer de 1 L com defletores cada um contendo 400 mL de meio LB suplementado com 34 mg/l de cloranfenicol. O clone foi fermentado por 3 dias a 25-30°C. Uma atividade de anidrase carbônica foi determinada de acordo com Wilbur, K.M. e Anderson, N. G., "Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase", J Biol Chem5 1948, 176, p.147-154. Alternativamente, a atividade de anidrase carbônica pode ser medida como atividade de esterase com para-nitro-fenol-acetato como substrato de acordo com Chirica, L. C. et al., "Cloning, expression and some properties of alpha- carbonic anhydrase from Helicobacter pylori", Biochim. Biophys. Acta, 2001,1544, p. 55-63. Um ensaio padrão continha 900 microlitros de PNPA, 10 microlitros de Tris 300 mM pH 7,5 e 90 microlitros de solução de proteína anidrase carbônica. Após uma pré-incubação por 5 min, a enzima foi adicionada na mistura de tampão PNPA e o aumento em absorbância (devido à hidrólise do substrato e à liberação de p-nitro-fenol) a 348 nm foi monitorado fotometricamente em uma cubeta de quartzo durante um período de 10 min. Como um controle positivo para ambos os ensaios de atividade, pode ser usada uma solução de anidrase carbônica bovina (Calbiochem, 1 mg por mL).

Exemplo 9: Expressão de anidrase carbônica de cepa Baciilus sp. P203 em E. coli

Alternativamente ao exemplo 8, uma anidrase carbônica pode ser expressada em E. coli. Plasmídeo pEG131377-9 foi gerado pela ligação do vetor pGEM-T (Promega) com um produto de PCR anidrase carbônica (SEQ NO. 3) amplificado de DNA genômico de Bacillus sp. P203 (extraído com Qiagen Genomic DNA Kit, 19060) usando iniciadores específicos de gene BOCAfwd (5' TAGTCCGTACATATGAGAAAAACAA 31) (SEQ ID NO:17) e BOCArev (5' TTCAAAGCTTATAGTGAAATCCAACT 31) (SEQ ID NO: 18). O plasmídeo foi usado como modelo para geração de plasmídeo pETBlueCA. O plasmídeo pETBlueCA para expressão de uma anidrase carbônica em E. coli foi construído por amplificação por PCR com os iniciadores específicos de gene pQECAfwd (5' ATC C G CATG CTGAG AAAAACAAA 31) (SEQ ID NO: 19) e pQE-CArev (5' AATTAAG CTTAATAGTGAAATCCAACT 31) (SEQ ID NO: 20) do modelo de plasmídeo pEGl 31377-9 seguido por uma ligação do produto de PCR com o linear pETBlue-1 AccepTor™ vetor system (Novagen) de acordo com as instruções do fabricante. Plasmídeos foram transformados em células competentes de E. coli NovaBlue Singles™ (Novagen) para triagem azul- branca. Insertos de três plasmídeos foram verificados por seqüenciamento de DNA usando iniciadores pET-BlueUP, pETB IueDOWN (Novagen, iniciadores flanqueando a região de inserto) e iniciador CAmit- SEQrev (51 CACTTG GTGAATG GAAATG 3') (SEQ ID NO: 21). O plasmídeo de clone pETBlueCA no. 8 (pETBlueCA8) foi verificado correto e foi transformado em células competentes de E. coli Tuner(DE3)pLacl para sobre-expressão de anidrase carbônica de Bacillus sp. P203 sob controle do promotor Iac

(induzível por IPTG). Exemplo 10: Purificação e caracterização de anidrase carbônica (SEQ ID

NO: 4) de cepa Bacillus sp. P203

Purificação

Caldo de cultura foi centrifugado (lO.OOOg, 15 minutos) e os sobrenadantes foram cuidadosamente decantados dos precipitados. O sobrenadante de cultura reunido foi concentrado para 1/10 do volume por filtração de fluxo cruzado (corte de MW de 10.000 Da) e purificado em uma coluna de cromatografia específica para anidrase carbônica. Para purificação de anidrase carbônica recombinante de Bacillus plankortiensis, uma coluna de afinidade elevadamente seletiva foi preparada. Em princípio, a coluna de afinidade foi preparada como descrito antes (Khalifah5 R.G. et ai., aCarbon-13 nuclear magnetic resonance probe of active-site ionizations in human carbonic anhydrase", B. Biochem. 1977, 16, p. 2241-7) com as seguintes modificações: O ligante sulfonamida 4-amino-metil-benzeno-sulfonamida (0,2 g, Sigma) foi dissolvido em 12 mL de tampão de copulação (NaHCO3 0,1 M, pH 8, NaCl 0,5 Μ). 1 g de CH Sepharose 4B™ ativado (Amersham Biosciences) foi dissolvido em aproximadamente 20 mL de HCl 1 mM e intensamente lavado com 250 mL de HCl 1 mM sobre um filtro de vidro sinterizado. O gel foi eluído com o filtro com 6 mL de HCl 1 mM e deu o ligante dissolvido em um tubo Falcon de 50 mL. A mistura foi cuidadosamente girada extremidade-sobre-extremidade por 1 h na temperatura ambiente. Para remover ligante em excesso, o gel foi lavado com 250 mL de tampão de copulação. Bloqueio de quaisquer grupos ativos restantes foi realizado por lavagem do gel com Tris-HCl 0,1 M, pH 8 e incubação naquele tampão por 1 hora. Três ciclos de a) 250 mL de Tris 0,1 M, pH 8, NaCl 0,5 M e b) acetato de sódio O5I Mj pH 4, NaCl 0,5 M foram usados para lavagem do gel após bloqueio. O gel foi transferido para um béquer e extensivamente lavado com tampão de carregamento D (Na2SO4 0,25 M, Tris 25 mM pH 8,3) antes do uso.

.5 mL de meio de afinidade foram adicionados quer em 50 mL de caldo de cultura concentrado de exemplo no. 8 quer no extrato de proteína bruta livre de células de exemplo no. 9. A suspensão foi suavemente agitada na temperatura ambiente por uma hora e então derramada em uma coluna deixando a gravidade rechear a coluna. A coluna foi lavada intensivamente com 10 volumes de volume de carregamento com tampão D até proteína não ser mais detectável. Eluição de anidrase carbônica foi iniciada por fechamento da saída e pela adição de 10 mL de tampão de eluição E (KSCN 0,4 M, Tris 25 mM pH 8,3). Após 10 min de incubação com agitação moderada da coluna, frações de 500 microlitros foram coletadas. As frações contendo atividade de anidrase carbônica foram reunidas após a primeira fração ativa (normalmente frações 4-10). As frações reunidas foram retamponadas intensivamente em um dispositivo Centricon (Millipore, a 4.000xg) com um corte de MW de 10.000 Da usando 10 volumes de tampão de armazenagem F de anidrase carbônica (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, sulfato de zinco 50 micromolar). Alíquotas de anidrase carbônica purificada foram armazenadas a -20°C até uso posterior. A anidrase carbônica recombinante purificada mostrou uma única banda de proteína sobre geles de poliacrilamida SDS. Caracterização

A atividade de anidrase carbônica foi determinada de acordo com Wilbur, K.M. e Anderson, N. G., "Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase", J Biol Chem, 1948, 176, p.147-154. A anidrase carbônica recombinante purificada foi testada para estabilidade de temperatura a 4-60°C por 1 e 17 h. Foi verificado que a proteína é estável a 4°C em tampão F por uma semana com perda mínima de atividade (97±4% da atividade original) e na temperatura ambiente (20 C, 95±4%). Não foi detectada perda de atividade (99±4%) após armazenagem da proteína a -20°C por uma semana em tampão F. A estabilidade de anidrase carbônica rapidamente diminuiu em temperaturas acima de 37°C (veja figura 2). Foi verificado que armazenagem de anidrase carbônica recombinante em tampão F suplementado com ditiotreitol (DTT) 1 mM estabiliza a enzima. Estudos de inibição de anidrase carbônica recombinante foram realizados com íons azida e inibidor de anidrase carbônica específico acetazolamida (Sigma). Os valores de IC50 foram de 500 micromolar para azida e 0,09 micromolar para acetazolamida, inibição completa foi observada na presença de acetazolamida 7,5 micromolar (veja figura 3).

Inibição de anidrase carbônica por íons de metal divalentes e trivalentes, azida e outros reagentes comumente usados em ciência de proteína (veja figura 4).

Os seguintes inibidores foram usados:

Tabela 1: Inibidores

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A enzima foi pré-incubada com 1 mM de substâncias por 1 h sobre gelo em um volume total de 50 microlitros antes de testar a atividade com 10 microlitros da mistura com o método de Wilbur e Andersonj 1948. O controle sem aditivos (água) foi ajustado em atividade de 100%. O detergente Triton X 100 e os íons Fe3+ e Cr2+ (marcados com asteriscos em tabela 1) alteraram o ensaio quando em concentração dada de 1 mM no volume de ensaio total. Em vez disso é dada atividade com concentração de 25 micromolar.

Exemplo 11: Expressão de galactanase.

O peptídeo de sinal de alfa-amilase de B. Iicheniformis

(AmyL) foi fundida por PCR em matriz com o gene codificando a galactanase (SEQ ID NO: 12). O DNA codificando a seqüência codificadora resultante foi integrado por recombinação homóloga no genoma da cepa hospedeira Bacillus subtilis. O construto de gene foi expressado sob o controle de um sistema de promotor triplo (como descrito em WO 99/43835), consistindo de promotores de gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis e (amyL), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens amyQ), e promotor crylIIA de BaciUus thuringiensis incluindo a seqüência estabilizadora. O gene codificador para cloranfenicol acetil-transferase foi usado como marcador. (Descrito e.g em Diderichsen et ai., "A useful cloning vetor for Bacillus subtilis". Plasmid, 30, p. 312, 1993).

Transformantes resistentes a cloranfenicol foram analisados para seqüenciamento de DNA para verificar a seqüência de DNA. Um tal clone foi selecionado. Fermentações do clone de expressão de galactanase (SEQ ID NO: 12) foi realizada em uma mesa agitadora rotativa em frascos Erlenmeyer de 500 mL com defletores cada um contendo 100 mL de meio LB suplementado com 34 mg/l de cloranfenicol. O clone foi fermentado por 3 dias a 30°C. A atividade foi determinada com OPNG como substrato.

Exemplo 12: Verificação de atividade de galactanase de cepa Bacillus sp.

P203 Ensaio:

.50 microlitros de sobrenadante livre de células de exemplo no. 17 foram adicionados em 750 microlitros de uma solução 4,5 mM de orto- nitro-fenil-galactopiranosídeo (ONPG)s em tampão fosfato 50 mM de pH 7,6. A mistura foi incubada a 40°C por 15 min e a reação foi interrompida pela adição de 300 microlitros de carbonato de sódiol M. As soluções foram centrifugadas a 13.000 rpm antes das medições espectrométricas e diluídas com água se necessário. A absorbância de o-nitro-fenol é medida opticamente a 420 nm. T .TSTAfiFM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Novozymes A/S

<1.20> Polqieptideos da cepa Bacillus sp. 203

«130> 10S07.204-WQ

<160> 21

<170> PatentIn versão 3.3

c2Í0> 1

<2ll> 1053

<212> Dm

<213> Bacillus sp. P 203

<220>

<221> CDS <222> « · {1953)

<223> serinaprotease

<220>

<221> sig^peptídeo <222> (1) , . (111)

<22 O >

<221> mafc_ peptídeo <222> (112)♦. (1953)

<400> 1

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220 225

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470 475

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<210> 3

<211> 828

<212> Om

<213> Bacillus Bp. P 203

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(S28)

<223> anidrase cartònica

<220>

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<222> (1) .. (87)

<22 0>

<22l> peptídeo

<222> (88)..(B28)

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<212 > DNA

<213> BacillUS sp. P2Q3

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (702)

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<220> '

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<222> (91).. (702)

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<212 > <213>

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<221> CDS

<222> (1)..(1080)

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<220>

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<221> mat pepüdeo

<222> (73) .. (1080) Ill

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Claims (26)

1. Polipeptídeos funcionais, caracterizados pelo fato de serem codificados por polinucleotídeos compreendidos no genoma de cepas de espécie Bacillus, Bacillus plankortiensis depositada sob o número de acesso DSM17419.

2. Polipeptídeo maduro funcional isolado, caracterizado pelo fato de ser obtenível da bactéria de cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com uma seqüência de um polipeptídeo maduro compreendida no grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQID NO: 12; (b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de (i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro. (ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro. (c) um fragmento de um polipeptídeo maduro compreendido em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: IOe SEQ ID NO: 12 em que o polipeptídeo possui uma função dos polipeptídeos maduros correspondentes compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQID NO: 12.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma enzima possuindo uma função selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase.

5. Enzima de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de selecionada do grupo consistindo de: (a) uma enzima possuindo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com uma seqüência de aminoácidos selecionada de enzimas naturais compreendidas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQID NO: 10 e SEQID NO: 12; (b) uma enzima que é codificada por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de (i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: I5 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando a enzima madura, (ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos selecionada de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando o polipeptídeo maduro; (c) um fragmento da enzima matura compreendido em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, e em que a enzima possui uma função dos polipeptídeos maduros correspondentes compreendidos em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo consiste de uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de regiões de SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificando um polipeptídeo maduro ou uma seqüência diferindo do mesmo em virtude da degeneração do código genético.

7. Enzima isolada, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo de: (a) uma enzima compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70% de identidade com a seqüência de aminoácidos de uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada da cepa Bacillus sp. P203 depositado sob DSM 17419; (b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições de estringência alta com uma sonda de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de: (i) a fita complementar a uma seqüência de nucleotídeos compreendida na cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 codificando uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada daquela cepa; (ii) a fita complementar à seqüência de cDNA contida em uma seqüência de nucleotídeos compreendida na cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 codificando uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada daquela cepa; (c) um fragmento de uma enzima madura selecionada do grupo consistindo de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase secretada da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419; em que a enzima possui uma função selecionada de xilanase, serina protease, anidrase carbônica, ramnogalacturonana liase e galactanase.

8. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido nas reivindicações 1 a 7.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois polipeptídeos diferentes como definidos nas reivindicações 1 a 7, preferivelmente pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 20 polipeptídeos diferentes como definidos nas reivindicações 1 a 7.

10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender todos os polipeptídeos secretados quando se fermenta uma amostra de cepa Bacillus sp. P203 DSM 17419 ou um seu mutante na qual um ou mais genes têm sido deletados ou adicionados.

11. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender uma ou mais enzimas adicionais.

12. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser uma composição de detergente que, em adição ao polipeptídeo, compreende um tensoativo.

13. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser uma composição de ração que em adição ao polipeptídeo compreende um produto de cereal ou de grão.

14. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser uma composição de alimento.

15. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um polissacarídeo ou uma mistura de polissacarídeos.

16. Método para preparar uma composição como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender misturar o polipeptídeo como definido nas reivindicações 1 a 7 com um excipiente.

17. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de possuir uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo definido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

18. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 17.

19. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência de nucleotídeos como definida na reivindicação 17 operacionalmente ligada em uma ou mais seqüências de controle que dirigem a produção de polipeptídeo em uma célula hospedeira.

20. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 19.

21. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de compreender o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 19.

22. Método para produzir o polipeptídeo como definido nas reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar uma cepa, que em sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, para produzir o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

23. Método para produzir um polipeptídeo como definido nas reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante como definida na reivindicação 22 sob condições que conduzem à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de compreender: (i) fundir genes do genoma da cepa Bacillus sp. P203 depositada sob o número de acesso DSM 17419 com um gene codificando um repórter sem sinal, via uma etiqueta de transposon, (ii) desenvolver os clones de célula hospedeira compreendendo um gene fundido da cepa Bacillus sp. P203 (DSM 17419) em um meio revelando a presença do repórter, (iii) detectar clones secretando o repórter e (iv) isolar o gene e o polipeptídeo da cepa Bacillus sp. P203 (DSM 17419) compreendida naquele clone.

25. Meio de armazenagem, caracterizado pelo fato de ser adequado para uso em um dispositivo eletrônico compreendendo informação da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo como definida nas reivindicações 1 a 7 ou a seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo como definida na reivindicação 17.

26. Processo, caracterizado pelo fato de compreender empregar um polipeptídeo como definido nas reivindicações 1 a 7 ou um polinucleotídeo como definido na reivindicação 17 em um processo técnico industrial ou doméstico.