ES2382071T3 - Nuevo grupo de alfa-amilasas, así como un procedimiento para la identificación y la obtención de nuevas alfaamilasas - Google Patents

Abstract

Proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 en un 95%, preferentemente en un 97,5% y muy preferentemente en un 00%.

Description

Nuevo grupo de alfa-amilasas, así como un procedimiento para la identificación y la obtención de nuevas alfaamilasas

La presente invención se refiere a un nuevo grupo de a-amilasas que pertenecen a un espacio de secuencias común, así como a proteínas suficientemente similares a estas a-amilasas con función amilolítica, a procedimientos para su obtención, así como a diversas posibilidades de aplicación de estas proteínas, especialmente en agentes de lavado y limpieza.

Las a-amilasas (E.C. 3.2.1.1) se hidrolizan en los enlaces a-1,4-glicosídicos, situados en el interior del polímero, de los almidones y de los polímeros similares a los almidones tales como, por ejemplo, amilosa, amilopectina oglicógeno, con formación de dextrinas y de oligosacáridos �-1,6-ramificados. Éstos pertenecen a las enzimas más importantes, que son utilizadas en la industria. Esto se debe a dos motivos: por un lado, son liberadas en su mayoría al medio circundante, igual que muchas enzimas o microorganismos degradantes del substrato, de tal manera que pueden ser obtenidas a escala industrial mediante fermentación y enriquecimiento del medio de cultivo con un coste proporcionalmente reducido. Por otro lado, se requieren amilasas para un gran espectro de aplicaciones.

El primer lugar de las aplicaciones técnicas de la a-amilasa lo ocupa la producción de jarabe de glucosa. Otras aplicaciones son, por ejemplo, las de componentes activos en agentes de lavado y limpieza, para el tratamiento de materias primas en la fabricación de productos textiles, la fabricación de pegamentos o la fabricación de alimentos o ingredientes alimentarios azucarados.

Un ejemplo para una amilasa empleada muy intensamente en el ámbito técnico es, por ejemplo, la a-amilasa procedente de Bacillus licheniformis comercializada por la firma Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, con el nombre comercial Termamyl®. La amilasa que se obtiene a partir de B. subtilis o B. amyloliquefaciens, respectivamente, y que se ha dado a conocer por la solicitud de patente estadounidense US 1 227 374 es comercializada por la misma empresa con el nombre BAN®.

Esta molécula de amilasa o sus parientes próximos, respectivamente, han sido desarrollados en múltiples invenciones cuyo objetivo era optimizar sus propiedades enzimáticas para aplicaciones específicas con la ayuda de diversas modificaciones a nivel de la biología molecular. Estas optimizaciones pueden referirse, por ejemplo, a las especificidades de substrato, a la estabilidad de la enzima en diversas condiciones de reacción o a la misma actividad enzimática. Como ejemplo para estas optimizaciones se citan las siguientes solicitudes de patente: EP 0410498 para el encolado de tejidos y WO 96/02633 para la licuación de almidón.

Puesto que los desarrollos que consisten simplemente en optimizaciones de unas pocas enzimas de partida conocidas están limitados posiblemente en los resultados alcanzables, tiene lugar paralelamente una búsqueda intensiva de enzimas comparables a partir de otras fuentes naturales. Se han identificado enzimas que desintegran el almidón, por ejemplo, a partir de Pimelobacter, Pseudomonas y Thermus para la producción de alimentos, productos cosméticos y fármacos (EP 0 636 693), otras a partir de Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium y Micrococcus (EP 0 628 630), a partir de Pyrococcus (WO 94/19454) y Sulfolobus para la licuación del almidón a altas temperaturas o bien en condiciones de reacción muy ácidas (EP 0 727 485 y WO 96/02633). Se han encontrado amilasas a partir de Bacillus sp. para su aplicación en valores de pH alcalinos (WO 95/26397 y WO 97/00324). Debido a su poca sensibilidad frente a los detergentes, otras amilasas procedentes de diferentes Bacilli (EP 0 670 367) son adecuadas para su utilización en agentes de lavado o limpieza.

Otras optimizaciones de las enzimas aisladas de fuentes naturales para el correspondiente campo de aplicación pueden realizarse, por ejemplo, mediante métodos de biología molecular (por ejemplo, según US 5171673 o WO 99/20768) o a través de modificaciones químicas (DE 4013142). En la solicitud de patente WO 99/43793, por ejemplo, se describe un desarrollo de la conocida a-amilasa Novamyl®. En este caso, se aprovechan las similitudes de secuencia entre Novamyl® y las ciclodextringlucanotransferasas (CGTasas) conocidas para construir un grupo de moléculas emparentadas con la ayuda de técnicas de biología molecular. Se trata de a-amilasas con secuencias consenso adicionales, específicas de CGTasa (cajas) y funciones o, a la inversa, de CGTasas con áreas y funciones adicionales, típicas para las a-amilasas, o bien de quimeras de ambas moléculas. El sentido de este desarrollo consiste en optimizar Novamyl® para estas aplicaciones.

La solicitud de patente WO 99/57250, por ejemplo, da a conocer una teoría sobre cómo enlazar enzimas apropiadas para ser utilizadas en agentes de lavado y limpieza a través de un enlazador químico con un dominio de enlace para aumentar la concentración efectiva de enzimas sobre el objeto a limpiar.

Una tendencia moderna en el desarrollo de las enzimas consiste en combinar elementos de proteínas conocidas, emparentadas entre sí, mediante procedimientos estáticos para formar nuevas enzimas que presentan propiedades que no se habían conseguido hasta el momento. Estos procedimientos se conocen con el término genérico “Directed Evolution” (evolución dirigida). Entre ellos se encuentran, por ejemplo: El método StEP (Zhao y otros (1998), Nat. Biotechnol., tomo 16, p. 258-261), Random priming recombination (Shao y otros, (1998), Nucleic Acids Res., tomo 26, p. 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, tomo 370, p. 389-391), o RACHITT (Coco, W.M. y otros (2001), Nat. Biotechnol., tomo 19, p. 354-359).

La condición previa para la recombinación mediante estos procedimientos es que los ácidos nucleicos utilizados presenten regiones suficientemente largas para conseguir una hibridación en las condiciones respectivas. Para que la hibridación tenga éxito, en las secuencias de partida más del 45% de las identidades han de ser consideradas como practicables entre sí a nivel de los aminoácidos, para forzar la recombinación homóloga más del 50%. Almenos dos secuencias distintas, homólogas entre sí, ya definen un espacio de secuencias. Éste contiene todas las secuencias nuevas que pueden ser derivadas teóricamente a partir de las secuencias de partida mediante la recombinación. Para ello también pueden presentar valores de homología de menos del 45%, siempre que los ácidos nucleicos derivados de ellas pueden ser recombinados de acuerdo con un método establecido según el estado de la técnica.

A pesar de todos estos desarrollos, sigue existiendo sin variación el objetivo de encontrar, además de las pocas enzimas amilolíticas naturales, que son realmente aprovechadas en la industria sin modificaciones o en forma de desarrollos más avanzados, otras que presenten a priori un amplio espectro de aplicación y que puedan servir como punto de partida para desarrollos específicos de aplicación, especialmente para procedimientos de recombinación estadística.

La variedad genética de las bacterias gram-positivas del orden de los actinomicetales, especialmente de la especie Streptomyces a penas ha sido examinada hasta el momento en lo que se refiere a proteínas amilolíticas que son apropiadas para fines técnicos. En este contexto sólo se han de tener en cuenta dos solicitudes de patente japonesas. En la solicitud de patente JP-A 62-143999 se da a conocer una a-amilasa adecuada para su utilización en agentes de lavado y limpieza procedente de un representante de la especie Streptomyces. Este organismo Streptomyces sp. KSM-9 o FERM P-7620 proviene de un hábitat natural y crece en un medio alcalino. En este documento, la enzima amilolítica sólo se describe a través de parámetros enzimáticos y su aptitud para ser utilizada en agentes de lavado y limpieza, pero no en lo que se refiere a su secuencia de ADN o de aminoácidos.

La enzima que se da a conocer por la solicitud de patente JP-A 2000-60546 y proviene del Streptomyces sp. TOTO9805 o FERM BP-6359 presenta propiedades enzimáticas similares a las de la enzima que proviene del Streptomyces sp. KSM-9. En esta solicitud, sin embargo, las características también se refieren sólo a parámetros enzimáticos y no a la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos. Debido a ello, ambas amilasas no están disponibles ni para una expresión y obtención heterólogas, ni para una selección y optimización específica en cuanto a su aplicación. Ya que tanto los procedimientos clásicos de mutagénesis, como también los métodos de la evolución dirigida (EP-PCR, Sequence-Shuffling, Family-Shuffling) están basados en las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos.

Por lo tanto, la presente invención tenía como objetivo, en primer lugar, identificar a-amilasas naturales, no descritas hasta el momento, que fuesen apropiadas para posibles aplicaciones técnicas o que pudieran servir de base para desarrollos específicos de aplicación.

Preferentemente, la solución de este problema debería considerarse conseguida con el descubrimiento de varias aamilasas o secuencias parciales de a-amilasas que son emparentadas entre sí y pueden ser homologadas. Ya que de esta homologación se puede derivar un espacio de secuencias que puede servir, a su vez, de punto de partida para la generación de otras enzimas.

Un objetivo parcial consistía en obtener ácidos nucleicos que codificasen a-amilasas de este tipo, ya que éstos son imprescindibles tanto para la fabricación biotecnológica como también para el desarrollo de estas enzimas.

Otro objetivo parcial consistía en encontrar organismos que produzcan las correspondientes a-amilasas de forma natural.

Otro objetivo parcial consistía en encontrar un procedimiento mediante el cual se puede proporcionar una reserva de a-amilasas de este tipo.

Según otro objetivo parcial, las a-amilasas, los fragmentos de a-amilasa o los genes de a-amilasa, o sus fragmentos, deberían poder utilizarse para encontrar o desarrollar nuevas enzimas.

Otro objetivo parcial consistía en hacer posible la producción biotecnológica de las a-amilasas encontradas o derivadas.

Otro objetivo parcial consistía en definir posibles aplicaciones técnicas de las a-amilasas encontradas.

La solución del primer objetivo y, por lo tanto, el primer objeto de la presente invención lo representan las proteínas amilolíticas tal como son definidas en las reivindicaciones 1 y 2.

Entre ellas están las proteínas amilolíticas con las frecuencias de aminoácidos indicadas en el protocolo de secuencias con SEQ ID NO. 208, así como enzimas que presentan suficiente similitud con las mismas o que pueden ser derivadas de éstas mediante métodos en sí conocidos. Los representantes preferidos pueden ser aislados de organismos naturales, especialmente de aquellos que pertenecen al orden de los actinomicetales.

A partir de estas secuencias se puede derivar a través de la homologación un espacio de secuencias que puede servir, a su vez, como punto de partida para la obtención de otras enzimas.

El segundo objeto de la invención lo constituyen los ácidos nucleicos, según la reivindicación 7 u 8.

Entre ellos están de forma correspondientemente preferida aquellos ácidos nucleicos que codifican las respectivas proteínas que constituyen al primer objeto de la invención.

Otro objeto de la invención está formado por los vectores junto con los ácidos nucleicos que constituyen el segundo objeto de la invención, por células huésped transformadas por estos vectores y por todos los procedimientos biotecnológicos para la obtención de una proteína, de acuerdo con el primer objeto de la invención.

Otro objeto de la invención consiste en las posibles aplicaciones técnicas de las a-amilasas que se encuentran. Entre ellas están agentes de lavado o limpieza que se caracterizan por contener una proteína, según el primer objeto de la invención, procedimientos para la licuación del almidón, especialmente para producir etanol, procedimientos de pegado temporales y diversas posibilidades de utilización, en especial para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricación de textiles, especialmente para el desencolado de algodón, para la obtención de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta, para la hidrólisis de ciclodextrinas, para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de portadores de polisacáridos o ciclodextrinas, para la obtención de alimentos y/o ingredientes alimentarios, para la obtención de piensos para animales y/o ingredientes de piensos y para la disolución de uniones pegadas que contengan almidón.

A efectos de la presente solicitud de patente, debe entenderse por proteína un polímero compuesto de aminoácidos naturales, de estructura esencialmente lineal, casi siempre tridimensional para poder ejercer su función. En la presente solicitud se denominarán los 19 L-aminoácidos proteinogénicos, que son de origen natural con los códigos de 1 y 3 letras que son habituales a nivel internacional.

Por enzima se entenderá, a efectos de la presente solicitud, una proteína que ejerza una determinada función bioquímica. Se entenderá por proteínas amilolíticas o enzimas con función amilolítica aquellas que hidrolicen los enlaces a-1,4-glicosídicos de polisacáridos, especialmente aquellos que se encuentren situados en el interior de los polisacáridos. También se denominarán a-1,4-amilasas (E.C. 3.2.1.1) o, brevemente: a-amilasas.

Muchas proteínas son formadas en forma de las denominadas pre-proteínas, es decir junto con un péptido señal. Debe entenderse por ello la parte N-terminal de la proteína cuya función consiste la mayoría de las veces en garantizar la expulsión de la proteína formada desde la célula productora al periplasma o al medio circundante y/o su plegado correcto. A continuación, el péptido señal es disociado del resto de la proteína en condiciones naturales mediante una peptidasa de señalización, de manera que ésta ejerza su actividad catalítica propiamente dicha sin los aminoácidos N-terminales que están presentes en primer lugar. La a-amilasa nativa procedente de Streptomyces sp. B327*, por ejemplo, tiene una longitud de 461 aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO. 6. Tal como se muestra en SEQ ID NO. 5, el péptido señal de esta enzima comprende 30 aminoácidos, de manera que para la enzima madura resulta una longitud de 431 aminoácidos.

Debido a su actividad enzimática, para las aplicaciones técnicas son preferentes los péptidos maduros, es decir las enzimas procesadas tras su obtención frente a las pre-proteínas.

Las pro-proteínas son precursores inactivos de las proteínas. Sus precursores con secuencia de señal se denominan pre-pro-proteínas.

Por ácidos nucleicos se entenderá, a efectos de la presente solicitud, las moléculas construidas de forma natural por nucleótidos que sirven como portadores de información y que codifican la secuencia lineal de aminoácidos en las proteínas o las enzimas. Pueden estar presentes como hebra simple, como hebra complementaria a esta hebra simple o como hebra doble. Para los trabajos de biología molecular es preferente el ácido nucleico ADN como el portador de información duradero por naturaleza. Por lo contrario, para la realización de la invención en un medio natural tal como, por ejemplo, en una célula de expresión, se formará un ARN por lo cual las moléculas de ARN esenciales, según la invención, representan igualmente formas de realización de la presente invención.

En el ADN han de tenerse en cuenta las secuencias de ambas hebras complementarias en cada una de las tres posibles pautas de lectura. Además, debe tenerse en cuenta que diversos codón-tripletes se pueden codificar para los mismos aminoácidos, de manera que una determinada secuencia de aminoácidos puede derivarse de varias secuencias de nucleótido diferentes y que probablemente presentan sólo poca identidad (degeneración del código genético). Además, los diversos organismos presentan diferencias en el uso de esté codón. Por estos motivos, deben incluirse en el ámbito de la protección tanto las secuencias de aminoácidos como también las secuencias de nucleótidos, y las secuencias de nucleótidos indicadas deben ser consideradas respectivamente tan sólo como un ejemplo de codificación para una determinada secuencia de aminoácidos.

La unidad de información que corresponde a una proteína se denominará a efectos de la presente solicitud como gen.

Mediante métodos generalmente conocidos en la actualidad tales como, por ejemplo, la síntesis química o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en combinación con métodos estándar de biología molecular y/o de química de las proteínas, un experto en la materia tiene la posibilidad de preparar los correspondientes ácidos nucleicos hasta incluso los genes completos a partir de secuencias de ADN y/o de aminoácidos conocidas. Estos métodos se conocen, por ejemplo, por la publicación “Lexikon der Biochemie” (“Diccionario de bioquímica”), ed. Spektrum Akademischer Verlag, Berlin,1999, tomo 1, p. 267-271 y tomo 2, p. 227-229.

Las modificaciones de la secuencia de nucleótidos, así como las que pueden ser provocadas, por ejemplo, por métodos de biología molecular en sí conocidos, se denominan mutaciones. En función del tipo de modificación se distingue, por ejemplo, entre mutaciones por deleción, por inserción o por sustitución o aquellas en las que se fusionan (“shuffling”) entre sí diversos genes o partes de genes; esto son mutaciones genéticas. Los organismos asociados a los mismos se denominan mutantes. Las proteínas derivadas de ácidos nucleicos mutados se denominan variantes. De este modo, las mutaciones por deleción, por inserción, por sustitución o las fusiones conducen a genes mutados por deleción, por inserción, por sustitución o a genes de fusión y en el plano de las proteínas a las correspondientes variantes por deleción, por inserción o por sustitución, o bien a las proteínas de fusión.

Se entenderán por fragmentos todas las proteínas o péptidos que sean menores que las proteínas naturales o aquellas que correspondan a genes completamente trasladados y que, por ejemplo, también puedan ser obtenidos de forma sintética. Debido a sus secuencias de aminoácidos pueden ser asociados a las correspondientes proteínas completas. Pueden adquirir, por ejemplo, estructuras iguales o ejercer actividades proteolíticas o actividades parciales, tales como, por ejemplo, la formación de complejos de un substrato. Los fragmentos y las variantes por deleción de las proteínas de partida son equivalentes en principio; mientras que los fragmentos representan trozos más pequeños, los mutantes por deleción carecen únicamente de pequeñas regiones y, por lo tanto, sólo de algunas funciones parciales.

A los fragmentos le corresponden a nivel de ácido nucleico las secuencias parciales.

Se entenderán por proteínas quiméricas o híbridas, en el sentido de la presente solicitud aquellas proteínas que estén compuestas por elementos que procedan por su naturaleza de diversas cadenas de polipéptidos procedentes del mismo organismo o de organismos diferentes. Este proceder se denomina también “Shuffling” o mutagénesis por fusión. El sentido de una fusión de este tipo puede consistir por ejemplo en incorporar o modificar una determinada función enzimática con la ayuda de la parte de la proteína introducida por fusión. A efectos de la invención, no tiene importancia si esta proteína quimérica está formada por una sola cadena de polipéptidos o de varias subunidades a las que se pueden distribuir las diferentes funciones. Para realizar la última alternativa cabe la posibilidad, por ejemplo, de fraccionar una sola cadena de polipéptidos quiméricos en varias, de forma post-translacional o solamente tras una etapa de purificación mediante una disociación proteolítica dirigida.

Entre las proteínas obtenidas mediante mutación por inserción, deben entenderse aquellas variantes que se han obtenido a través de métodos en sí conocidos por incorporación de un fragmento de ácido nucleico o bien de proteína en las secuencias de partida. Éstas deben ser asociadas a las proteínas quiméricas debido a su equivalencia básica. Se diferencian de aquellas únicamente en la relación de tamaño de la parte de la proteína no modificada con respecto al tamaño del conjunto de la proteína. En estas proteínas, mutadas por inserción, la porción en proteína extraña es menor que en las proteínas quiméricas.

La mutagénesis por inversión, es decir la inversión parcial de la secuencia, puede considerarse tanto como forma especial de la deleción como de la inserción. Lo mismo se puede decir para una nueva agrupación de diversaspartes de la molécula que se diferencia de la sucesión de aminoácidos original. Ésta puede considerarse tanto como variante por deleción, como variante por inserción, así como también como variante Shuffling de la proteína original.

A efectos de la presente solicitud, se entenderán por derivados aquellas proteínas cuya cadena de aminoácidos haya sido modificada químicamente. Estas derivaciones pueden llevarse a cabo por ejemplo de manera biológica en combinación con la biosíntesis de la proteína por medio del organismo huésped. En este caso pueden utilizarse métodos de biología molecular. Sin embargo pueden llevarse a cabo también químicamente, por ejemplo mediante la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante el enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido por ejemplo por otra proteína, que haya sido enlazada por ejemplo a través de un compuesto químico bifuncional sobre la proteína según la invención. Estas modificaciones pueden influir, por ejemplo, en la especificidad del substrato o en la fuerza del enlace sobre el substrato, o pueden provocar un bloqueo transitorio de la actividad enzimática, cuando la sustancia acoplada es un inhibidor. Ello puede resultar oportuno, por ejemplo, durante el período de almacenamiento. Del mismo modo debe entenderse por derivación el enlace covalente sobre un soporte macromolecular.

Las proteínas también podrán ser reunidas en grupos de proteínas inmunológicamente emparentadas a través de la reacción con un antisuero o un determinado anticuerpo. Las proteínas pertenecientes a un grupo se distinguen porque presentan el mismo determinante antigénico que es reconocido por un anticuerpo.

A efectos de la presente invención, se recogerán todas las enzimas, proteínas, fragmentos y derivados bajo el término genérico de proteínas, siempre que no sea necesario designarlos explícitamente como tales.

A efectos de la presente invención, se entenderán por vectores los elementos constituidos por ácidos nucleicos, que contengan como región caracterizadora de los ácidos nucleicos un gen que interesa. Ellos son capaces de establecer este elemento genéticamente estable, que se replica en una especie o en una línea celular a través de varias generaciones o de divisiones celulares independientemente del genoma restante. Los vectores son plásmidos especiales, sobre todo cuando se utilizan en bacterias, es decir que son elementos genéticos circulares. En la genética se distingue, por un lado, entre aquellos vectores que sirven para el almacenamiento y por lo tanto en cierta medida también para el trabajo genético, los denominados vectores de clonación y, por otro lado, aquellos que cumplen la función de realizar el gen que interesa en la célula huésped, es decir que posibilitan la expresión de la proteína correspondiente. Estos vectores se denominan vectores de expresión.

Mediante comparación con enzimas conocidas, que están depositadas por ejemplo en bases de datos accesibles al público, se puede deducir la actividad enzimática de una enzima considerada a partir de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos. Dicha actividad puede ser modificada cualitativa o cuantitativamente por otras regiones de la proteína que no participan en la reacción propiamente dicha. Esto podría afectar, por ejemplo, a la estabilidad de la enzima, la actividad, las condiciones de reacción o la especificidad de sustrato.

Dicha comparación se verifica mediante asociación mutua de series similares en las secuencias de los nucleótidos o de los aminoácidos de las proteínas consideradas. Esto se denomina homologación. Una asociación tabulada de las posiciones correspondientes se denomina alineamiento. En el caso del análisis de secuencias de nucleótidos deben tenerse en cuenta a su vez ambas hebras complementarias y, respectivamente, las tres posibles pautas de lectura; asimismo, la degeneración del código genético y el uso del codón específico del organismo. Entre tanto, se han establecido alineamientos por medio de programas de ordenador tal como, por ejemplo, por medio de los algoritmos FASTA ó BLAST; esta forma de proceder se describe por ejemplo por D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) en Science, tomo 227, páginas 1435-1441.

Un conjunto de todas las posiciones coincidentes en las secuencias comparadas se denomina secuencia de consenso.

Una comparación de este tipo permite también una afirmación sobre la similitud o la homología de las secuenciascomparadas entre sí. Ésta se indica en porcentaje de identidad, es decir en la porción de nucleótidos o restos de aminoácidos idénticos en las misas posiciones. Otro concepto de homología establecido incluye en este valor los intercambios conservados de aminoácidos. Entonces se habla de similitud en porcentaje. Estas afirmaciones pueden referirse a proteínas o genes enteros o únicamente a regiones individuales.

La elaboración de un alineamiento constituye el primer paso para definir un espacio de secuencias.

Este espacio hipotético comprende todas las secuencias que se pueden derivar mediante permutación en posiciones individuales y que se obtienen teniendo en cuenta todas las variaciones que se producen en las correspondientes posiciones individuales del alineamiento. Cada molécula de proteína hipotéticamente posible constituye un punto en este espacio de secuencias. Por ejemplo, dos secuencias de aminoácidos que, siendo ampliamente idénticas, presentan solamente en dos puntos dos aminoácidos diferentes, respectivamente, establecen de esta manera un espacio de cuatro secuencias de aminoácidos diferentes. Se obtendrá un espacio de secuencias muy grande, si se encuentra para secuencias individuales de un espacio otras secuencias homólogas, respectivamente. A través de estas homologías altas que existen por pares, también pueden reconocerse secuencias de muy baja homología como pertenecientes a un espacio de secuencias.

Las regiones homólogas de diversas proteínas son aquellas que tienen funciones idénticas, que puedenreconocerse por las coincidencias en la secuencia primaria de aminoácidos. Ésta va hasta la identidad completa en regiones mínimas, que se llaman cajas, que comprenden sólo un reducido número de aminoácidos y que, la mayoría de las veces, ejercen funciones esenciales para el conjunto de la actividad. Debe entenderse por funciones de las regiones homólogas, aquellas funciones parciales, mínimas, de la función ejercida por el conjunto de la proteína, tal como por ejemplo la formación de compuestos individuales con puente de hidrógeno para la formación de complejos de un substrato o complejo de transición.

Así pues, debe entenderse por una proteína amilolítica según la invención no solamente una proteína con la función pura, que lleva a cabo la hidrólisis de los enlaces a-1,4-glicosídicos, que se debe a un número reducido de restos de aminoácidos de un centro activado probablemente por catálisis. Este término abarca, además, todas las funcionesque favorecen la hidrólisis de un enlace a-1,4-glicosídico. Éstas pueden alcanzarse por ejemplo por péptidos individuales así como también por una o varias partes individuales de una proteína mediante actuación sobre las regiones activas realmente catalíticas. El término de función amilolítica abarca también únicamente estas funciones modificadoras. La razón de ello es que, por un lado, no se conoce exactamente qué restos de aminoácidos de la proteína según la invención catalizan realmente la hidrólisis, y, por otro lado, no pueden excluirse desde un principio determinadas funciones individuales definitivamente de la participación en la catálisis. A las funciones auxiliares o actividades parciales pertenecen, por ejemplo, el enlace de un substrato, de un producto intermedio o de un producto final, la activación o la inhibición o la transmisión de un efecto regulador sobre la actividad hidrolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de la formación de un elemento estructural, que se encuentre alejado del centro activo, o de un péptido señal, cuya función se refiera a la expulsión de la proteína formada de la célula y/o se refiera a su plegado correcto y sin el cual, por regla general, in vivo no se forma ninguna enzima apta para ejercer una función. Sin embargo, debe producirse en conjunto una hidrólisis de los enlaces a-1,4-glicosídicos de almidón o de los polímeros similares al almidón.

En este contexto, por ejemplo los fragmentos de las a-amilasas indicados en el protocolo de secuencias con SEQ ID NO. 34 hasta 262 han de considerarse proteínas amilolíticas. La ezón de ello es que, por naturaleza, son componentes de proteínas más grandes que son capaces de hidrolizar en su conjunto los enlaces a-1,4-glicosídicos de almidón o de los polímeros similares al almidón.

En el marco de la presente solicitud ha de distinguirse entre rastreo (“screening”) (rastreo por hibridación o rastreo de DNA) y una prueba de actividad. En general, se entenderá por el rastreo de los transformantes una reacción de detección que sea apta para reconocer aquellos clones en los que se ha producido el suceso de transformación deseado. La mayoría de veces, como por ejemplo en la habitual selección azul-blanco, el mismo está orientado a la detección de una actividad bioquímica que han mantenido los transformantes o que ya no existe una vez realizada la recombinación. Esta forma de reacción de detección bioquímica se denomina, a efectos de la presente solicitud, prueba de actividad.

El rastreo designa el rastreo de un banco de genes con determinados ácidos nucleicos y la eventual identificación de secuencias de ácidos nucleicos suficientemente similares. Esto se realiza, por ejemplo, mediante hibridaciones de Southern o de Northern Blot (transferencia Southern o Northern) tal como se conocen ampliamente por el estado de la técnica. Pero este término abarca, por ejemplo, también procedimientos basados en PCR, según la invención, para identificar y/u obtener nuevos genes a partir de una colección de organismos o ácidos nucleicos, que están caracterizados porque se utilizan cebadores PCR con una región 3’ variable y una región 5’ con alta homología para las correspondientes regiones de genes conocidos.

Se entenderá por la potencia de una enzima su actividad en el sector técnico considerado en cada caso. Esto se basa en la actividad enzimática propiamente dicha, pero además depende de otros factores relevantes para el proceso correspondiente. A éstos pertenecen, por ejemplo, la estabilidad. El enlace con el substrato, la interacción con el material que soporta el substrato o las interacciones con otros componentes, especialmente con sinérgicos. De este modo, se considera, por ejemplo, en los ensayos dirigidos a determinar si una enzima es adecuada para ser utilizada en agentes de lavado o limpieza, su contribución a las prestaciones de lavado o de limpieza de un agente formulado con otros componentes. Para diversas aplicaciones técnicas puede desarrollarse adicionalmente y optimizarse una enzima mediante técnicas de biología molecular en sí conocidas, especialmente las que se han mencionado anteriormente.

Para resolver el problema planteado se proporciona, de acuerdo con la invención, múltiples a-amilasas y todasdeben ser consideradas representantes de un determinado espacio de secuencias. Éste está definido a través de una secuencia parcial de estas a-amilasas, concretamente una parte del elemento estructural de barril (a �)8 conocido para las amilasas. Todas las proteínas amilolíticas cuya secuencia de aminoácidos contiene una parte que pertenece a este espacio de secuencias específico, así como proteínas suficientemente similares, son amilasas según la invención.

Este espacio de secuencias está mostrado en SEQ ID NO. 208.

Esta secuencia define un grupo totalmente nuevo de a-amilasas. Designa una región que está situada entre las dos regiones conservadas C y D, las cuales se muestran en la figura 1. En este caso, se trata de un elemento de estructura secundaria, concretamente de los dominios �4 y 7 de la estructura de barril (a �)8 tal como están definidos en el artículo de S. Janecek (1997), en Prog. Biophys. Mol. Biol 67 (1), páginas 67-97. Esta región se considera característica y un elemento estructural necesario para la familia de enzimas de las a-amilasas, puesto que garantiza la disposición óptima de las otras partes funcionales de la molécula, en especial del centro activo.

Independientemente de ello también es concebible otra reagrupación de dominios para secuencias recién encontradas o generadas. Por esto todas aquellas realizaciones de a-amilasas que contengan en un punto cualquiera una secuencia parcial que puede ser descrita por SEQ ID NO. 208 representan realizaciones de la presente invención.

En los ejemplos se examinarán más a fondo las a-amilasas de las cepas Streptomyces sp. B327*, B40OB y B327. Las áreas parciales de estas amilasas que corresponden a la secuencia de consenso (SEQ ID NO. 263) se muestran en el protocolo de secuencias en SEQ ID NO. 2, 4 y 208. La máxima homología que ha podido detectarse con respecto a una de estas amilasas mediante búsqueda de base de datos, la presenta la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327B. Se sitúa en un 94% de identidad con la a-amilasa procedente de Streptomyces griseus (entrada de base de datos X57568).

Por este motivo se reivindican, de acuerdo con la invención, todas las proteínas amilolíticas cuyas secuencias de aminoácidos contengan una parte que, con respecto a SEQ ID NO. 208 presente una identidad del 95% y de forma crecientemente preferente una identidad del 96%, del 96,5%, del 97%, del 97,5%, del 98%, del 98,5%, del 99%, del 99,5% y muy preferentemente del 100%.

Otras soluciones para el objetivo de la invención las constituyen las proteínas amilolíticas que se obtienen mediante mutación por inserción o proteínas amilolíticas quiméricas que están formadas por una de las proteínas descritas anteriormente, como mínimo, en una parte que tiene una actividad amilolítica.

De acuerdo con la invención, las proteínas obtenidas por fusión presentan, provocan o modifican una funciónamilolítica en el sentido más amplio de la palabra o que favorece la hidrólisis de enlaces a-1,4-glicosídicos. Ésta puede ser ejercida o modificada por una parte de molécula derivada de una proteína, según la invención, y que se sitúa dentro del rango de similitud reivindicado anteriormente para esta parte de molécula.

Estas partes de moléculas pueden ser partes que, a través de sus secuencias de consenso o cajas (“boxes”), pueden ser reconocidas como homólogas con respecto a las enzimas procedentes de otros organismos. Estas áreas confieren a la enzima, la mayoría de veces, sus funciones enzimáticas características. También pueden estar distribuidas en diversos dominios, es decir en áreas globulares de la molécula de proteína. Al objeto de la invención pertenecen, por lo tanto, también aquellas proteínas quiméricas que, debido a su construcción, presenten una identidad, en su caso inferior, a lo largo de toda su secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos, a la que se ha definido anteriormente para el rango de similitud según la invención, pero que le puedan ser atribuidas en como mínimo una de las regiones incorporadas mediante fusión y que ejerzan en esta parte las mismas funciones que en una amilasa que se encuentra en el rango de homología definido anteriormente.

Lo mismo se puede decir también, debido a su similitud básica, de las variantes de las proteínas amilolíticas indicadas anteriormente que se obtendrán mediante mutación por inserción. El sentido de la mutagénesis por inserción consiste especialmente en la combinación de propiedades individuales de las proteínas según la invención con las de otras proteínas. En este caso, se trata de proteínas según la invención, que se obtendrán mediante mutación por inserción o de proteínas quiméricas, cuando las regiones relacionadas, a través de su homología, con las secuencias indicadas anteriormente presenten valores de homología correspondientes y la proteína obtenida tenga una función amilolítica en el sentido más amplio de la palabra debido a estas regiones.

De esta manera es posible, por ejemplo en aplicación de las enseñanzas del documento WO 99/57250, acoplar una enzima de este tipo a un dominio de enlace de celulosa para aumentar su interacción con el substrato. De forma análoga también pueden fusionarse, por ejemplo, otras enzimas activas para lavado o limpieza con una amilasa, según la invención. En principio no tiene importancia si la fusión se lleva a cabo de forma N- o C-terminal o por inserción.

Sobre todo durante el almacenamiento las proteínas de la invención pueden protegerse mediante estabilizantes por ejemplo contra la desnaturalización, la descomposición o la inactivación, por ejemplo debido a efectos físicos, por oxidación o por proteólisis. A menudo se utilizan también combinaciones de estabilizantes que se complementan o se intensifican mutuamente.

Un grupo de estabilizantes son los inhibidores de proteasa reversibles tales como, por ejemplo, el hidrocloruro de benzamidina y leupeptina, borax, ácido bórico, ácidos borónicos, sus sales o ésteres, peptidoaldehídos o inhibidores peptídicos puros tales como ovomucoide o inhibidores específicos de subtilisina. Otros estabilizantes enzimáticos usuales son los aminoalcoholes tales como la mono-, di-, trietanol-y -propanolamina, los ácidos carboxílicos alifáticos hasta C12, los ácidos dicarboxílicos, los alcoholes alifáticos inferiores, pero sobre todo los polioles tales como, por ejemplo, la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita. Del mismo modo se utilizarán sales de calcio, tales como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio, las sales de magnesio, diversos polímeros tales como, por ejemplo, lignina, éteres de celulosa, poliamidas o vinil-copolímeros solubles en agua para estabilizar la preparación enzimática, sobre todo frente a los efectos físicos o las oscilaciones del valor del pH. Los agentes reductores y los antioxidantes tales como, por ejemplo, el sulfito de sodio o los azúcares reductores aumentan la estabilidad de la proteína frente a la descomposición por oxidación.

A la inversa, las proteínas de la invención pueden ser utilizadas para obtener, identificar o examinar genes de amilasa emparentados o amilasas emparentadas. Esto es posible, por ejemplo, mediante cualquier método de biología molecular en el que se utilizan anticuerpos contra las regiones correspondientes, por ejemplo, en un screening de un banco de genes de expresión.

La SEQ ID NO. 34 hasta la SEQ ID NO. 262 describen las secuencias de aminoácidos que están derivadas de determinados productos de PCR tal como se muestra en el ejemplo 1. Se han obtenido porque se ha hecho reaccionar los ácidos nucleicos aislados de una colección de varios cientos de aislados de actinomicetales como matrices en una reacción en cadena de la polimerasa con los pares de cebadores GEX024 (SEQ ID NO. 9) / GEX026 (SEQ ID NO. 10) y GEX029 (SEQ ID NO. 11) / GEX031 (SEQ ID NO. 12). Las posiciones 8 hasta 93, según la secuencia de consenso de SEQ ID NO. 263, están situadas dentro de los cebadores GEX024 y GEX026, de manera que pueden ser consideradas muy características para la secuencia encontrada.

Por los siguientes motivos, también los ácidos nucleicos asociados deberán ser considerados como soluciones para el objetivo de la invención y, por lo tanto, objetos propios de la invención: Por un lado, se podrán detectar las proteínas mediante biología molecular si están disponibles los correspondientes genes. Esto es válido para la identificación y para la caracterización, pasando por la mutagénesis hasta la producción biotecnológica. También se incluirán las secuencias de nucleótidos derivados debido al codón-uso que varía entre los distintos organismos, así como los ácidos ribonucleicos, ya que de ellos también se pueden derivar enzimas capaces de ejercer una función. Los ácidos nucleicos adecuados pueden utilizarse también para la obtención, la identificación o la examinación de genes de amilasas. De este modo es posible, por ejemplo, diseñar las sondas correspondientes para el rastreo (“Screen”) del banco de genes.

Por otro lado el método descrito de forma detallada en los ejemplos para encontrar las correspondientes a-amilasas está basado en la PCR y, por lo tanto, en los correspondientes ácidos nucleicos.

De esta manera, todos los ácidos nucleicos que codifican proteínas que presentan una parte que se sitúa dentro del rango de similitud definido constituyen realizaciones de este objeto de la invención.

Las realizaciones de este objeto de la invención son los ácidos nucleicos que codifican para proteínas amilolíticas cuya secuencia de aminoácidos contiene una parte que presenta con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 una identidad del 95% y de forma preferente la identidad es creciente del 96%, del 96,5%, del 97%, del 97,5%, del 98%, del 98,5%, del 99%, del 99,5% y muy preferentemente una identidad del 100%.

Las proteínas completas que se han obtenido a través de estas secuencias parciales han sido examinadas en el ejemplo 6 en cuanto a sus propiedades bioquímicas. Parecen ser candidatos prometedores para su aplicación en procesos técnicos o para su optimización ulterior en lo que se refiere a procesos técnicos. Propiedades parecidas podrán esperarse para las proteínas que pueden obtenerse a partir de los ácidos nucleicos de este objeto de la invención.

Los ácidos nucleicos que codifican para una de las enzimas amilolíticas indicadas anteriormente representan realizaciones correspondientemente preferentes de este objeto de la invención.

Constituye un objeto propio de la invención, cuando las proteínas o los ácidos nucleicos proporcionados por la presente solicitud pueden ser utilizados para encontrar más a-amilasas.

De este manera se reivindica la utilización de una proteína, según el primer objeto de la invención, para la identificación de una proteína amilolítica. También se pueden utilizar ácidos nucleicos, según el segundo objeto de la invención, para la identificación y/o obtención de una nueva amilasa.

Las realizaciones preferentes representan estos usos para la fusión dirigida, aprovechando regiones altamente homólogas de las secuencias de aminoácidos, interfaces de restricción comunes de los ácidos nucleicos o a través de una fusión basada en la PCR.

Otra posibilidad consiste en la utilización de interfaces de restricción comunes de los ácidos nucleicos, especialmente aprovechando las regiones altamente homólogas de las secuencias de aminoácidos, o bien a través de una función basada en la PCR.

Las regiones altamente homólogas de las secuencias de aminoácidos que representan, la mayoría de veces, regiones conservadas que ejercen una función pueden servir de anclaje para los cebadores de la PCR, en su caso de cebadores degenerados. Las interfaces de restricción comunes de los ácidos nucleicos de dos genes diferentes hacen posible una fusión inmediata a nivel de ADN. Se dispone de todos los métodos establecidos según el estado de la técnica así como del método de la invención con sus diferentes realizaciones para combinar las diferentes regiones genéticas.

A un objeto propio de la invención se le asocian vectores que contengan una de las regiones de ácido nucleico del segundo objeto de la invención.

Estos vectores constituyen puntos de partida preferentes para los ensayos de biología molecular y bioquímicos del gen correspondiente o de la proteína correspondiente, para el desarrollo adicional según la invención y para la amplificación y la producción de la proteína según la invención.

Vectores adecuados pueden derivarse de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o también contener elementos de origen diverso. Con los otros elementos genéticos presentes en cada caso los vectores son capaces de establecerse en forma de unidades estables en las células huésped correspondientes a lo largo de varias generaciones. En este caso no tiene importancia, a efectos de la invención, que se establezcan de manera extracromosómica como unidades propias o que se integren en un cromosoma. El sistema elegido entre el gran número de sistemas conocidos por el estado de la técnica, dependerá de cada caso particular. Podrá ser decisivo, por ejemplo, el número de copias alcanzable, los sistemas de selección disponibles, entre ellos sobre todo la resistencia a los antibióticos, o la aptitud al cultivo de las células huésped capaces de alojar a los vectores.

Son realizaciones preferentes de este objeto de la invención los vectores de clonación.

Éstos son adecuados, además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen que interesa, para la caracterización del gen correspondiente, por ejemplo mediante el establecimiento de un mapa de restricción o mediante la secuenciación. Los vectores de clonación también son formas preferentes de realización de la presente invención porque representan una forma transportable y almacenable del ADN reivindicado. También son productos de partida preferentes para las tecnologías de biología molecular que no están relacionadas con la célula tal como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa.

Son realizaciones preferentes de este objeto de la invención los vectores de expresión.

Debido a los correspondientes elementos genéticos son capaces de replicarse en los organismos huésped optimizados para la producción de proteínas y hacen que el gen obtenido se exprese en los mismos. Son formas preferentes de realización los vectores de expresión, que portan en sí mismos los elementos genéticos necesarios para la expresión. Los promotores regulan la transcripción del gen. Ejemplos para ello son promotores naturales, localizados inicialmente por los correspondientes genes. Dado que no puede suponerse que éstos sean conocidos para la mayoría de los genes, según la invención, serán preferentes aquellas realizaciones en las que, tras la fusión genética, se proporciona otros promotores conocidos para regular el transgén. Puede tratarse de un promotor de la célula huésped, un promotor modificado o uno totalmente distinto procedente de otro organismo. Son realizaciones preferentes aquellos vectores de expresión que pueden regularse mediante modificaciones de las condiciones de cultivo o mediante la adición de determinados compuestos tal como, por ejemplo, la densidad celular o factores especiales.

Los vectores de expresión posibilitan, en función de los elementos genéticos respectivos, que la expresión de la proteína se produzca de manera heteróloga u homóloga. También pueden ser realizaciones de la presente invención los sistemas de expresión exentos de células, en los que la biosíntesis de las proteínas se realiza in vitro. Estos sistemas de expresión están asimismo establecidos por el estado de la técnica y están basados en los genes proporcionados por los vectores de clonación o de expresión.

En este objeto de la invención se incluyen células huésped, que expresan una proteína o derivado de la invención o que pueden ser estimuladas a expresarse. Esto se realiza preferentemente utilizando un vector de expresión adecuado.

La síntesis in vivo de una enzima amilolítica por células vivas, según la invención, requiere la transferencia del gen correspondiente a una célula huésped, la denominada transformación. Como células huésped son adecuados en principio todos los organismos excepto el hombre, es decir las procariotas, las eucariotas y las cianofitas. Son preferentes aquellas células huésped que se puedan manipular bien genéticamente, por ejemplo en cuanto a la transformación con el vector de expresión y a su establecimiento estable. Además las células huésped preferentes se caracterizan por ser fácilmente manipulables a nivel microbiológico y biotecnológico. Esto se refiere por ejemplo a la fácil aptitud de cultivo, a las altas tasas de crecimiento, a los reducidos requisitos exigidos a los medios de fermentación y a las buenas tasas de producción y de secreción para la proteína extraña. Frecuentemente tienen que detectarse experimentalmente los sistemas de expresión óptimos para cada caso particular entre el gran número de los diversos sistemas, disponibles según el estado de la técnica.

Representan formas preferentes de realización aquellas células huésped que pueden regularse en cuanto a su tasa de formación de proteína debido a los elementos de regulación genéticos, que pueden estar disponibles por ejemploen el vector de expresión, así como también pueden estar presentes desde un inicio en estas células. Éstas pueden ser estimuladas a expresarse, por ejemplo, mediante la adición controlada de compuestos químicos, que sirven como activadores, mediante la modificación de las condiciones de cultivo o cuando se alcance una determinada densidad celular. Esto posibilita una producción muy económica de las proteínas que interesan.

Una variante de este principio de ensayo está representada por sistemas de expresión en los que genes adicionales, por ejemplo aquellos que están disponibles en otros vectores, influyen sobre la producción de las proteínas según la invención. En este caso puede tratarse de productos genéticos modificados o de aquellos que deban ser purificados conjuntamente con la proteína según la invención, por ejemplo para influir sobre su función amilolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de otras proteínas o enzimas, de inhibidores o de aquellos elementos que influyen sobre la interacción con diversos substratos.

Según una realización preferente, la célula huésped está caracterizada porque es una bacteria, en especial una batería que segrega al medio circundante la proteína o el derivado formado.

Las células huésped preferentes son células procariotas o células bacterianas. Las bacterias se caracterizan frente a las eucariotas generalmente por tiempos más cortos de generación y por menores exigencias en relación con las condiciones de cultivo. De este modo pueden establecerse procedimientos económicos para la obtención de proteínas según la invención. Representan una realización preferente aquellas células huésped que están caracterizadas por ser bacterias gram-positivas.

Las bacterias gram-positivas tales como, por ejemplo, Bacilli o actinomicetos u otros representantes de los actinomicetales no tienen membrana externa, de manera que las proteínas segregadas son liberadas directamente al medio circundante de cultivo del cual, según otra realización preferente, se dejan purificar directamente las proteínas expresadas, según la invención.

Representan una realización preferente aquellas células huésped que están caracterizadas porque pertenecen a las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

Éstas representan sistemas de expresión gram-positivos establecidos.

Representan una realización preferente aquellas células huésped que están caracterizadas porque son bacterias gram-negativas.

Ya que en bacterias gram-negativas tales como, por ejemplo, E. Coli o Klebsiella se ha obtenido las mejores experiencias hasta el momento en la producción biotecnológica. En este caso se segregarán además múltiples proteínas en el espacio periplasmático, es decir en el compartimento comprendido entre ambas membranas que encierran a las células. Esto puede ser aprovechado para aplicaciones especiales. Por otro lado, también puede ser preferente la liberación dirigida de enzimas producidas por bacterias gram-negativas al espacio extracelular. Un procedimiento para ello está descrito, por ejemplo, por la solicitud de patente internacional PCT/EP01/04227 con el título “Procedimiento para la producción de proteínas recombinantes por bacterias gram-negativas”.

Son preferentes aquellas células huésped que están caracterizadas porque pertenecen al género Escherichia, preferentemente a la especie Escherichia coli, de forma especialmente preferente a una de las cepas E. coli JM 109,

E. coli DH 100B o E. Coli DH 12S.

En este caso, se trata de cepas de laboratorio y de producción establecidas y de acceso general. La cepa E. Coli DH 12S ha sido utilizada con éxito en el ejemplo 6 para la expresión heteróloga de los genes de actinomicetales obtenidos; debido a ello se han podido obtener proteínas con actividad enzimática de a-amilasa detectable.

Representan otra realización las células huésped que están caracterizadas porque son células eucariotas, en especial aquellas que modifican la proteína formada de forma post-translacional.

Ejemplos para ello son hongos o levaduras tales como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede resultar muy ventajoso, por ejemplo cuando las proteínas han de sufrir en relación con su síntesis modificaciones específicas que posibilitan estos sistemas. Entre ellos está, por ejemplo, el enlace de compuestos de bajo peso molecular tales como anclajes con la membrana u oligosacáridos.

Otra realización de este objeto de la invención consiste en procedimientos para la producción de una proteína, según la invención. A tal efecto, se utilizan ácidos nucleicos, según la invención, opcionalmente utilizando un vector adecuado y/o utilizando la correspondiente célula huésped o utilizando una célula que forma la misma de manera natural.

Todos los elementos ya mencionados anteriormente pueden combinarse en procedimientos para la obtención de las proteínas según la invención. En este caso, para cada una de las proteínas según la invención es concebible una multitud de posibilidades de combinación de etapas del procedimiento. Todas ellas ponen en práctica la idea en la que está basada la presente invención, concretamente la obtención cuantitativa de representantes de un tipo de proteína definido por medio de la función amilolítica y, al mismo tiempo, por la elevada homología en relación con las secuencias indicadas en los protocoles de secuencias, con ayuda de la correspondiente información genética. El procedimiento óptimo debe determinarse experimentalmente para cada caso concreto individual.

En principio se procederá de la manera siguiente: Se ligan los ácidos nucleicos, según la invención, en forma del ADN en un vector adecuado de expresión. Éste es transferido a la célula huésped, por ejemplo a células de una cepa de bacterias fácilmente cultivable, que expulsan al medio de cultivo circundante las proteínas, cuyos genes son controlados por elementos genéticos adecuados; pudiéndose poner a disposición elementos reguladores, por ejemplo, por el vector de expresión. A partir del medio circundante o mediante rotura celular a partir de la misma célula huésped se puede purificar la proteína según la invención a través de varias etapas de purificación tales como, por ejemplo, precipitaciones o cromatografías. Un experto en la materia es capaz de extrapolar un sistema, que haya sido optimizado experimentalmente a escala de laboratorio, a una escala de producción industrial.

Las posibilidades técnicas de aplicación para las amilasas, según la invención, constituyen un objeto propio de la invención. Ya que el objetivo en el que se basaba la misma consistía en poner a disposición las amilasas apropiadas para diversos procesos técnicos. Los más importantes se detallarán a continuación.

Se ha indicado un gran número de posibilidades de aplicación, establecidas en la industria, para las enzimas amilolíticas en los manuales tales como, por ejemplo, el libro “Industrial enzymes and their applications” (“Enzimas industriales y sus aplicaciones”) de H. Uhlig, ed. Wiley-Verlag, Nueva York, 1998, la siguiente recopilación no deberá entenderse como una enumeración concluyente sino que representa una selección entre todas las posibilidades de aplicación técnica. Si se pusiese de manifiesto que algunas proteínas individuales que se sitúan dentro del rango de similitud fuesen adecuadas además para otras posibles aplicaciones adicionales, no reivindicadas aquí expresamente, éstas quedarán incluidas con ello en el ámbito de protección de la presente invención.

Una realización de este objeto de la invención lo constituyen los agentes de lavado y limpieza que están caracterizados porque contienen una proteína, según la invención.

Un campo de aplicación importante de las enzimas amilolíticas consiste en el de su utilización como componentes activos en los agentes de lavado o limpieza para la limpieza de textiles o de superficies duras tales como, por ejemplo, vajilla, suelos o equipos de trabajo. En estas aplicaciones la actividad amilolítica sirve para disolver y desprender del fondo por hidrólisis las impurezas hidrocarbonadas, especialmente las que son a base de almidón. A tal efecto, pueden emplearse solas, en medios adecuados o también en agentes de lavado o limpieza. Las condiciones a elegir para ello tal como, por ejemplo, la temperatura, el valor pH, la fuerza iónica, las condiciones redox o influencias mecánicas deberían ser optimizadas para cada problema de limpieza a resolver, es decir en relación al ensuciamiento y al material de soporte. Las temperaturas habituales para agentes de lavado y limpieza se sitúan en rangos de 10ºC para agentes de lavado manuales, pasando a 40ºC y 60ºC hasta los 95ºC para agentes de lavado de máquina o en aplicaciones técnicas. Preferentemente también los ingredientes de los agentes en cuestión están ajustados entre sí. Dado que en lavadoras y lavavajillas modernos la temperatura casi siempre deja ajustarse de forma continua, también se incluyen todos los niveles intermedios de temperatura. Las demás condiciones podrán ser adaptadas asimismo de forma muy variable a cada fin de limpieza a través de los restantes componentes de los agentes.

Los agentes preferentes, según la invención, están caracterizados porque mediante la adición de la enzima amilolítica de la invención las prestaciones de lavado o de limpieza de este agente pueden ser mejoradas con respecto a la formulación que no contiene esta enzima, en cualesquiera condiciones que pueden ser definidas de este modo. A este respecto, se incorporarán preferentemente estas proteínas amilolíticas en agentes según la invención, en los que se desee mejorar la potencia de lavado o de limpieza.

Además, los agentes preferentes se caracterizan porque las enzimas amilolíticas y los demás componentes tienen un efecto sinérgico para la eliminación de las impurezas. Esto se produce, por ejemplo, mediante la solubilización de los agentes de hidrólisis de las proteínas amilolíticas por medio de otros componentes de los agentes tales como, por ejemplo, los tensioactivos. Una proteína según la invención puede encontrar aplicación tanto en agentes para el consumo industrial o en aplicaciones industriales como también en productos para el consumo de particulares, representando todas las formas de presentación establecidas según el estado de la técnica y/o oportunas también realizaciones de la presente invención.

Las amilasas se combinarán en agentes, según la invención, por ejemplo con uno o varios de los siguientes ingredientes: tensioactivos aniónicos, catiónicos y/o no iónicos, sustancias de soporte (Builder), blanqueadores, activadores de blanqueo, catalizadores de blanqueo, enzimas tales como por ejemplo proteasas, otras amilasas, lipasas, celulasas, hemicelulasas u oxidasas, estabilizadores, especialmente estabilizadores enzimáticos, disolventes, espesantes, sustancias abrasivas, colorantes, sustancias odorizantes, inhibidores de grises, inhibidores del corrido de los colores, inhibidores de la espuma, inhibidores de la corrosión, especialmente protectores de la plata, blanqueadores ópticos, sustancias activas antimicrobianas, protectores contra los rayos UV y otros componentes conocidos por el estado de la técnica.

Los agentes preferentes están caracterizados porque contienen desde 0,000001% en peso hasta 5% en peso y, de forma preferente de modo creciente desde 0,00001 hasta 4% en peso, desde 0,0001 hasta 3% en peso, desde 0,001 hasta 2% en peso, o desde 0,01 hasta 1% en peso de la proteína amilolítica.

Los agentes preferentes están caracterizados porque están compuestos de más de una fase. Entre ellos puede haber agentes sólidos, en especial aquellos en los que, como mínimo, dos diferentes componentes sólidos, en especial polvos, granulados o productos extruidos estén presentes de forma mezclada entre sí y en su conjunto sueltos, o en los que como mínimo dos fases sólidas estén presentes de forma ligada entre sí, en especial tras una etapa de compactación común. Adicionalmente, al menos una de las fases puede contener un material sensible a la amilasa, en especial almidón, o al menos puede estar envuelta parcialmente o recubierta del mismo.

Asimismo, los productos preferentes están caracterizados porque son en su conjunto líquidos, en forma de gel o pastosos. Preferentemente, la proteína contenida en el mismo y/o al menos una de las enzimas contenidas y/o al menos uno de los demás componentes contenidos se encuentra encapsulado individualmente o junto con otros ingredientes, preferentemente en microcápsulas, muy preferentemente en aquellas que están hechas de un material sensible a la amilasa.

Según una realización preferente, la actividad amilolítica es modificada por uno de los demás componentes del agente, en especial es estabilizada y/o se aumenta su aportación a las prestaciones de lavado o de limpieza del agente.

De acuerdo con estas consideraciones, también todos los procedimientos de lavado o de limpieza que estén basados al menos en una etapa parcial en una a-amilasa, según la invención, o en los que se utiliza preferentemente un agente de la invención, representan realizaciones de la presente invención.

Asimismo, cada utilización de una a-amilasa de la invención o, preferentemente, de un agente de la invención para el lavado o la limpieza de textiles o superficies duras representa una realización de la presente invención.

La utilización de una proteína o un derivado de la invención para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricación de textiles, en especial para el desencolado de algodón, representa otra realización.

Las materias primas y los productos intermedios de la fabricación de textiles, por ejemplo para aquellos a base de algodón, son dotados de almidón en el marco de su fabricación y elaboración ulterior para hacer posible una elaboración mejorada. Este procedimiento, aplicado tanto a hilos, a productos intermedios así como a textiles se denomina encolado (“sizing”). Para eliminar el apresto, es decir la capa protectora que contiene almidón (desencolado, “desizing”) son adecuadas las proteínas amilolíticas, según la invención.

Representan otra forma de realización los procedimientos para la licuación del almidón, especialmente para la producción de etanol, que están caracterizados por la utilización de una proteína o un derivado, según la invención.

Para la licuación del almidón se incuba el almidón hinchable en agua o en tampón con enzimas amilolíticas, debido a lo cual se disocia el polisacárido en componentes más pequeños, al final principalmente en maltosa. Las enzimas según la invención se utilizarán preferentemente para un procedimiento de este tipo o en una etapa parcial del mismo cuando puedan adaptarse perfectamente a un procedimiento de producción correspondiente debido a sus propiedades bioquímicas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando deban incorporarse en una etapa además de otras enzimas que requieran las mismas condiciones de reacción. Las proteínas amilolíticas según la invención son especialmente preferentes cuando constituyan el centro de interés precisamente los productos formados por las mismas. La licuación del almidón puede representar también una etapa en un procedimiento de varias etapas para la obtención de etanol o productos derivados del mismo, por ejemplo ácido acético.

Representa otra forma de realización la utilización de una proteína, según la invención, para la obtención de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta.

Debido a su actividad enzimática, las proteínas amilolíticas según la invención, procedentes de polímeros similares al almidón forman al cabo de un corto período de incubación mayoritariamente oligosacáridos de elevado peso molecular tales como, por ejemplo, maltohexaosa, maltoheptaosa o maltooctaosa. Al cabo de un período más prolongado de incubación aumenta la porción de oligosacáridos inferiores entre los productos de la reacción tales como, por ejemplo, maltosa o maltotriosa. Podrán utilizarse variantes correspondientes de las proteínas según la invención cuando exista un interés especial en determinados productos de la reacción y/o cuando se establezcan de manera correspondiente las condiciones de la reacción. Esto resulta especialmente atractivo cuando no se trate de obtener compuestos puros sino mezclas de compuestos similares tal como, por ejemplo, la formación de soluciones, suspensiones o geles con únicamente propiedades físicas determinadas.

Representa otra forma de realización la utilización de una proteína, según la invención, para la hidrólisis de las ciclodextrinas.

Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos enlazados de manera a-1,4-glicosídica, entre las cuales tienen el mayor significado económico las que están constituidas por 6, 7 u 8 monómeros de glucosa, las a-, �- o bien yciclodextrinas (o ciclohexa-, -hepta-, o bien -octa-amilosas). Con moléculas huésped hidrófobas tales como, por ejemplo, fragancias, sabores o sustancias farmacéuticamente activas, se pueden formar compuestos de inclusión, a partir de los cuales podrán volverse a liberar las moléculas huésped si fuera necesario. Estos compuestos de inclusión son significativos, según el campo de aplicación de los ingredientes, por ejemplo para la fabricación de artículos comestibles, de artículos farmacéuticos o de artículos cosméticos, por ejemplo en productos correspondientes para el consumidor final. La liberación de los componentes a partir de las ciclodextrinas representa por lo tanto una posibilidad de aplicación de las proteínas según la invención.

Representa otra forma de realización la utilización de una proteína, según la invención, para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de polisacáridos o de ciclodextrinas.

Debido a su actividad enzimática las proteínas amilolíticas, según la invención, pueden liberar también compuestos de bajo peso molecular a partir de otros polisacáridos enlazados de manera a-1,4-glicosídica. Esto puede tener lugar en el plano molecular en el caso de las ciclodextrinas, así como también en sistemas más grandes tales como, por ejemplo, los ingredientes que están encapsulados en forma de microcápsulas. El almidón, por ejemplo, es un material establecido según el estado de la técnica para encapsular durante el almacenamiento compuestos tales como, por ejemplo, enzimas que deban aportarse en cantidades definidas en las cargas de la reacción. El procedimiento de liberación controlada a partir de estas cápsulas puede ser favorecido por las enzimas amilolíticas según la invención.

Representa otra forma de realización la utilización de una proteína, según la invención, para la obtención de alimentos y/o ingredientes alimentarios.

Asimismo, la utilización de una proteína, según la invención, para la obtención de piensos para animales y/o ingredientes de piensos constituye una forma de realización de este objeto de la invención.

Siempre que el almidón o los hidratos de carbono derivados del almidón sean importantes como ingredientes de alimentos o piensos, podrá aplicarse una actividad amilolítica para la obtención de este artículo. La misma aumenta la porción de monómeros o de oligómeros frente a los azúcares polímeros, lo cual favorece por ejemplo el sabor, la digestibilidad o la consistencia del alimento. Esto puede ser necesario para la fabricación de determinados piensos para animales, por ejemplo también en el caso de la fabricación de zumos de frutas, vino u otros alimentos, cuando la porción de azúcar polímero deba reducirse y la de los azúcares dulces y/o fácilmente solubles deba aumentarse. La posibilidad de aplicación indicada anteriormente para la licuación del almidón y/o la producción de etanol puede considerarse una variante industrial de este principio.

Además, las amilasas contrarrestan también a la pérdida de sabor de los artículos de panadería conocida como envejecimiento del pan (efecto “anti staling”). Para ello las mismas se añadirán a la masa oportunamente antes del horneado. Por lo tanto, las realizaciones preferentes de la presente invención son aquellas en las que se utilizan proteínas, según la invención, para la fabricación de productos de panadería.

Representa otra forma de realización la utilización de una proteína, según la invención, para la disolución de uniones pegadas que contengan almidón.

Del mismo modo, los procedimientos de pegado temporales, caracterizados porque en los mismos se utiliza una proteína, según la invención, representan una forma de realización de este objeto de la invención.

Además de otros productos naturales se utiliza también el almidón desde hace siglos como aglutinante en la fabricación del papel y para el pegado de papeles y cartones diversos. Esto se refiere por ejemplo a la industria gráfica y del libro. En el transcurso de largos períodos de tiempo estos papeles pueden ondularse o romperse en condiciones desfavorables tales como, por ejemplo, la humedad, lo cual puede llevar a su destrucción total. Al restaurar estos papeles y cartones puede que sea necesario disolver las capas de pegamento, lo cual se facilita considerablemente utilizando una proteína amilolítica, según la invención.

Los polímeros vegetales tales como el almidón o la celulosa y sus derivados solubles en agua se utilizan, entre otras cosas, como pegamentos o engrudos. Para ello los mismos tienen que hincharse primero en agua y secarse, tras aplicación sobre el objeto a ser pegado, con lo cual éste se fija sobre la base. La enzima según la invención puede añadirse a una suspensión acuosa de este tipo para influir en las propiedades de pegado del engrudo formado. Sin embargo, la misma también puede ser añadida al engrudo en lugar de esta función o adicionalmente a la misma, para permanecer inactivo sobre el objeto pegado tras el secado durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo durante algunos años. También se puede utilizar la modificación específica de las condiciones ambientales, por ejemplo mediante humectación, para activar la enzima en un momento posterior y, de este modo, provocar la disolución del engrudo. De este modo el objeto pegado puede desprenderse de nuevo fácilmente de la base. En este procedimiento la enzima de la invención actúa, debido a su actividad amilolítica, como agente separador en un procedimiento de pegado temporal o como el denominado “conmutador” para desprender el objeto pegado.

Ejemplos

Ejemplo 1

5 Construcción de oligonucleótidos cebadores para la amplificación de zonas de secuencias variables de a-amilasas

Basándose en comparaciones de secuencias conocidas de a-amilasas (E.C. 3.2.1.1) de eubacterias gram-positivas de diferentes géneros del orden de los actinomicetales (Streptomyces, Thermomonospora y otros) de la base de datos GenBank (Centro Nacional de Información Biotecnológica NCBI, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, 10 EEUU; Revisión Noviembre 1998) se han identificado zonas de secuencias potencialmente conservadas que están flanqueando zonas de secuencias muy variables. Como bloques de secuencias conservadas se han identificado losbloques A hasta E resaltados en la figura 1. Éstos se extienden a través de las siguientes posiciones de aminoácido:

A: 58-91, B: 94-141, C: 155-207, D: 295-345, E: 392-427. Por medio de las secuencias de estas zonas se ha diseñado los oligonucleótidos recopilados en la tabla 1 como cebadores o primer; sus secuencias se indican en el

15 protocolo de secuencias con los números 9 hasta 33. Su posición en relación con los bloques de secuencias conservadas A hasta E se muestra a título de ejemplo en la a-amilasa procedente del Streptomyces griseus (número de acceso a GenBank: X57568) representado en la figura 1. Se pueden diferenciar en cuanto a la orientación con respecto a este gen en cebadores directos e inversos.

20 Tabla 1: Cebadores de PCR para amplificar secuencias parciales de a-amilasas de representantes del orden de los actinomicetales. Se indica en cada caso los nombres utilizados en la figura 1, el número asociado según el protocolo de secuencias de la presente solicitud de patente y la orientación del cebador en relación a los genes de amilasa asociados.

Nombre

SEQ ID NO. Orientación

GEX 015

13 directo

GEX 016

14 directo

GEX 017

15 directo

GEX 018

16 directo

GEX 019

17 inverso

GEX 020

18 inverso

GEX 021

19 inverso

GEX 022

20 inverso

GEX 023

21 directo

GEX 024

9 directo

GEX 025

22 inverso

GEX 026

10 inverso

GEX 027

23 directo

GEX 028

24 directo

GEX 029

11 directo

GEX 030

25 inverso

GEX 031

12 inverso

GEX 036

26 directo

GEX 037

27 directo

GEX 038

28 inverso

GEX 039

29 inverso

GEX 040

30 directo

GEX 041

31 directo

GEX 042

32 inverso

GEX 043

33 inverso

Como matriz sirven, según métodos estandarizados las preparaciones de ADN genómicas conservadas de aislados bacterianos conocidos y desconocidos de diversas muestras de suelo, siempre en cultivo puro. Los cebadores han sido utilizados en combinaciones de un cebador directo con un cebador inverso para una PCR, respectivamente. Los

30 productos de la PCR han sido separados mediante electroforesis en gel de agarosa tal como se describirá más adelante y se han utilizado para el rastreo de genes completos.

Entre las cargas de PCR se encontraban también aquellas con las combinaciones de cebadores GEX024 (directo) /GEX026 (inverso) y GEX029 (directo) / GEX031 (inverso). Éstos son derivados de las zonas de secuencias C

35 (GEX024 y GEX029) y D (GEX026 y GEX031) (figura 1) que corresponden a los dominios de amilasa �4 y �7 de la estructura de barril (a�)8 tal como están definidos en la artículo “Alpha-Amylase family: molecular biology and evolution” (“Familia de alfa-amilasa: biología molecular y evolución”) (Janecek, S. (1997), Prog. Biophys. Mol. Biol. 67 (1), páginas 67 – 97). Las secuencias de nucleótidos para estos cuatro cebadores están indicadas en el protocolo de secuencias con las denominaciones SEQ ID NO. 9 hasta SEQ ID NO. 12.

Estos cuatro cebadores dieron lugar en las cargas de la PCR con los ácidos nucleicos aislados de aislados bacterianos fragmentos de un tamaño reproducible. En la figura 2 se muestra, a título de ejemplo, un análisis de tamaños de los productos amplificados obtenidos de 20 preparaciones elegidas aleatoriamente de aislados del 5 orden de los actinomicetales; con el par de cebadores GEX024/GEX026 de la figura 2A y con el par de cebadores GEX029/GEX031 de la figura 2B. Las condiciones de la PCR están indicadas en el ejemplo 2; después de la reacción se separa 1/10 del volumen de reacción, respectivamente, en un gel de agarosa al 2,5%. Las cargas están basadas en las cepas de Streptomyces sp. recopiladas en la siguiente tabla.

10 Tabla 2: Cepas de Streptomyces sp., cuyos productos de PCR con los pares de cebadores GEX024/GEX026 y GEX029/GEX031 se muestran en la figura 2.

Bandas

Streptomyces sp. … SEQ ID NO.

1

B101A 45

2

B114C 83

3

B134 97

4

B135A 98

5

B138A 101

6

B152A 108

7

B153(B) 109

8

B161A 116

9

B156B 111

10

B157C 112

11

B158A 113

12

B160B 115

13

B161A 116

14

B373 232

15

B375 234

16

B380 236

17

B390 238

18

B392A 239

19

B392A 239

20

B394 241

Con ambos pares de cebadores se amplificaron fragmentos de ADN de acuerdo con una banda de 300 bp. Además, 15 en algunas cargas apareció un fragmento de aprox. 500 bp. Ambos productos fueron determinados mediante secuenciación (veáse el ejemplo 2) como secuencias de a-amilasa. Los demás cebadores indicados anteriormente y en el protocolo de secuencias mostraron una selectividad inferior.

Todas las cepas indicadas en el protocolo de secuencias dieron los mismos resultados; especialmente la banda de 20 300 bp fue reproducible para todas las cepas. Todos los fragmentos, especialmente los fragmentos de 300 bp que pudieron obtenerse de este modo a partir de las muestras sometidas a ensayo, pueden homologarse. Especialmente en las regiones de los cebadores presentan grandes coincidencias, aunque no necesariamente una total homología, que fueron suficientes para identificarlos con el método de la invención. A través de las variaciones de secuencia entre ellos, tal como se han indicado también en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO. 263 y en la figura 3, 25 definen un espacio de variación de secuencias dentro del grupo de las proteínas amilolíticas.

Ejemplo 2

La obtención del ADN genómico a partir de actinomicetos y amplificación y clonación de secuencias genéticas de la 30 a-amilasa, mediante métodos basados en PCR

La aplicabilidad del método, según la invención, fue sometida a ensayo con una colección de varios centenares de aislados individuales del orden de los actinomicetales, que se habían obtenido a partir de muestras de suelo de acuerdo con métodos microbiológicos convencionales. Se trataba en cada caso de cepas individuales cultivadas. 35 El aislamiento se llevo a cabo en este ejemplo según métodos estandarizados a partir de muestras de suelo utilizando medio GYM (4,0 g/l de glucosa, 4,0 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de extracto de malta; 2,0 g/l CaCO3; 10 g/l de agar, ph 7,2) con adición de 50 μg/ml de nistatina para suprimir la flora acompañante.

40 El cultivo de las cepas

El cultivo de las cepas de los actinomicetos se realizó mediante inoculación de 5 ml de medio GHPF (10 g/l de glucosa; 5 g/l de peptona de caseína; 5 g/l de extracto de carne; 5 g/l de extracto de levadura; 0,74 g/l CaCl2 x 2H2O; pH 7,2) con 50 μl de suspensión de esporas a la temperatura específica de cada cepa (28ºC hasta 50ºC) y a una velocidad de agitación de 200 rpm.

Tras suficiente formación de micelas se inocularon 200 ml de medio YEME (3 g/l de extracto de levadura; 5 g/l de bacto-triptona; 3 g/l de extracto de malta; 10 g/l D(+)glucosa; 340 g/l de sacarosa; pH 7,2; tras tratamiento en autoclave, adición de MgCl2 5 mM y, en función de la cepa, entre 0,5 – 20 g/l de glicina) con el precultivo entero y se agitaron durante 3 días en un matraz con desviadores de un litro a la misma temperatura y con una velocidad de 170 rpm.

El aislamiento de ADN

Para la preparación de ADN 1 g del micelio lavado en glicerina al 20% (v/v) se resuspendió en 3 ml de tampón TE25S (Tris 25 mM, pH 8,0; EDTA 25 mM; sacarosa 0,3 M) con adición de 2 mg/ml de lisozima, se invirtió durante 30 min a 37ºC y, tras adición de 4 ml 2x de solución Kirby-Mix (2% SDS; 120 g/l de sodio-4-aminosalicilato; Tris 100 mM, pH 8,0; 6% de fenol, saturado con Tris 50 mM /pH 8,0 y suplementado con 0,1% de hidroxiquinolina) se invirtió otros 10 min. A continuación, se realizó una doble extracción de la fase acuosa primero con 8 y luego con 3 ml de fenol/cloroformo/isoamilalcohol (25:24:1) por inversión durante 10 minutos, seguidos de otros 10 min de centrifugado a 2500 x g. El ADN fue precipitado por inversión suave con adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (no tamponado) y 0,6 de volumen de isopropanol, insuflado y limpiado cinco veces con etanol al 70%. El pellet (torta) fue recogido en 3 ml de tampón HE (HEPES 10 mM, pH 8,0 con NaOH; EDTA 1 mM), incubado durante 1 hora a 5055ºC y disuelto durante la noche a 4ºC.

En su caso, se puede añadir a continuación una etapa de limpieza a efectos de eliminar eventuales componentes que acompañan el ADN y tienen un efecto inhibidor sobre la reacción de amplificación. Esto fue necesario en algunas preparaciones en las que, en un principio, no se había formado ningún producto de PCR (véase más adelante). En este caso, se debió impedir primero la influencia de componentes inhibidores en la preparación del ADN mediante dilución (hasta 1:100) o por purificación a través de una columna de purificación PCR QlAquick (Qiagen, Hilden) de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Al día siguiente tuvo lugar un procesamiento del ADN mediante una incubación durante una hora a 37ºC, sucesivamente con 40 μg/ml de RNasaA (inactivada por calor) y con 0,5 mg/ml de proteinasa K. A continuación, se extrajo la fase acuosa en el mismo volumen de fenol/cloroformo/isoamilalcohol (25:24:1), se invirtió durante 10 min, se centrifugó a 2500 x g y se precipitó como el día anterior, se lavó tras el insuflado y se disolvió en 1 ml de tampón HE.

La amplificación de las secuencias de amilasa mediante la PCR según la invención

Antes de la caracterización de las secuencias de amilasa se procedió primero a una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esto se llevó a cabo utilizando la polimerasa HotStar Taq (firma Qiagen, Hilden) y los cebadores específicos de la amilasa (ejemplo 1, tabla 3). A tal efecto se utilizaron 4 μl del ADN genómico aislado conforme al procedimiento descrito anteriormente en presencia de 200 μM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP dGTP, respectivamente), 20 pmol de un cebador directo y uno inverso, 2,5 U de polimerasa HotStar Taq (firma Qiagen, Hilden) y 1 x tampón PCR, respectivamente, en 50 μl de volumen total. Se amplificaron fragmentos de los tamaños de 280 hasta 500 bp en los siguientes ciclos: 1 ciclo de 15 min a 95ºC; 40 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC y 30 segundos a 72ºC cada uno; 1 ciclo de 7 min a 72ºC.

Especialmente del par de cebadores GEX024/GEX026 se obtuvo resultados constantes en todos los ADNs genómicos con respecto a un producto de 300 bp que mostró homologías con respecto a las amilasas en la secuenciación (véase el ejemplo 1). En algunas preparaciones de ADN no hubo formación de producto, en un principio. Primero se debió impedir la influencia de componentes inhibidores en la preparación del ADN mediante dilución (hasta 1:100) o por purificación a través de una columna de purificación PCR QlAquick® (Qiagen, Hilden), de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

Las bandas (aprox. 300 bp) que se obtuvieron con la combinación de cebadores GEX02MGEX028 fueron eluídos para su secuenciación mediante el kit QIAEX II® de la firma Qiagen (Hilden) y clonados en el vector pCR2.1-TOPO® mediante el kit TOPO TA® (firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Con los productos de ligadura se transformó TOP® 10F’ (firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos) en E.Coli. Tras la selección azul/blanco de clones recombinantes sobre el medio LB con ampicilina (100μg/ml), IPTG (100mM), X-Gal (40mg/ml) se examinó el ADN plasmídico mediante los clones blancos tras una minipreparación en un análisis de restricción con EcoRI para determinar si contenía ADN insertada.

El análisis de secuencias de los plásmidos con ADN insertada se realizó de forma rutinaria sobre un ABI PRISM® 310 (firma Perkin Elmer, Weiterstadt) mediante un kit terminador AmpliTaq-FS-Big-Dye® (firma Perkin Elmer, Weiterstadt) de acuerdo con las indicaciones del fabricante, utilizando 200-500 ng de ADN plasmídico, 10 pmol de cebador (TopoF: 5’-GCTCGGATCCACTAGTAACG-3’ y TopoR: 5’-CTCTAGATGCATGCTCGAG-3’), 4 μl de Premix en un volumen total de 20 μl. Las secuencias de ADN obtenidas fueron transcritas conceptualmente y de forma rutinaria en una secuencia de aminoácidos, comparadas con los registros existentes en la base de datos GenBank mediante los algoritmos BlastX, BlastN y BlastP e identificadas, de este modo, como secuencias parciales de genes de a-amilasa. Las secuencias parciales encontradas se detallan en el protocolo de secuencias en los números SEQ ID NO. 2, 4 y 34 hasta 262 y son emparejadas en la secuencia de consenso de la figura 3, o en la SEQ ID NO. 263, respectivamente.

Ejemplo 3

La detección de secuencias genéticas de longitud completa (full-length) que codifican para a-amilasa mediante el rastreo de actividad de bancos de genes de expresión

Para montar y aislar genes completos de a-amilasa a partir de actinomicetales se eligió una clonación de expresión en el organismo huésped heterólogo Escherischia coli y, concretamente de la cepa DH 12S. Como promotor se utilizó el promotor �-galactosidasa del operón lac (promotor lac) inducible por IPTG (isopropiltiogalactosida). Éste se puso a disposición sobre el vector plasmídico pUC18 (GenBank (National Center for Biotechnology Informaion NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EEUU); número de acceso L08752; figura 4).

La elaboración de bancos de genes de expresión para cada cepa

El ADN genómico purificado a partir de las correspondientes cepas de actinomicetales, que se había obtenido según el ejemplo 2, fue disociado parcialmente con la enzima de restricción Aci I y el rango de magnitud de 3 hasta 5 kb se ligó en los vectores plasmídicos pUC18 (figura 4) linearizados con la enzima de restricción Acc I. Con tamaños medios de inserto de 4 kb y un tamaño de genoma de actinomicetos estimado de 8 Mb se obtiene para una cobertura deseada de 5 veces del genoma en un banco de genes un número de 20 000 clones primarios. Dado que la expresión parte del promotor lac propio del plásmido, los insertos sin embargo pueden ser integrados en dos orientaciones, este número se eleva a, como mínimo, 40 000 clones. Esto era el número mínimo de clones que se ha conseguido para cada banco de genes.

Para averiguar los parámetros de restricción óptimos para la digestión parcial preparativa del ADN genómico a partir de actinomicetos se realizaron primero cinéticas de restricción utilizando 6 μg de ADN y enzimas de restricción (Aci) en concentraciones de 0,1 hasta 0,4 U por μg de ADN en 1 x tampón, en su caso, según las indicaciones del fabricante con albúmina de suero bovino (BSA) en un volumen total de 15 μl. Las cargas fueron temperadas primero sin enzima a 37ºC. Luego se inicio la correspondiente reacción mediante adición de endonucleasa de restricción. En intervalos predeterminados entre 0 y 10 min se pusieron sobre hielo 1,5 μl de carga de reacción con cada 1 x tampón de paro (6X: Tris 10 mM, pH 7,0; 20% glicerina; 0,1% SDS) y se analizó sobre un gel de agarosa al 0,7%. Debido a ello se detectó para cada preparación de ADN individualmente el tiempo de restricción óptimo para una digestión parcial; la media estaba en 4 a 5 min.

La digestión parcial preparativa se realizó tal como se ha descrito anteriormente, pero en una carga diez veces superior y utilizando 60 μg de ADN cromosomal de actinomicetos y la cantidad de enzima optimizada anteriormente durante el tiempo determinado individualmente para cada caso. Tras parar la reacción mediante la adición de 1 x tampón de paro la carga fue separada por electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,7%, la zona del gel con ADN del tamaño de 3-5 kb fue recortada y aislada mediante electroelución en tubos de diálisis durante dos horas a 4ºC. El ADN precipitado con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y 2,5 veces el volumen de etanol y recogida en un volumen más pequeño fue sometido a una segunda electroforesis en gel para separar otros fragmentos más pequeños, seguido de una electroelución y nuevamente una concentración.

La ligación con el vector plasmídico pUC18 se realizó por la noche a 16ºC en un volumen total de 20 μl utilizando 150 ng del vector pUC18 linearizado con Acc I y desfosforilado de acuerdo con las indicaciones del fabricante con CIAP (fosfatasa alcalina a partir de timo de ternera) y 450 ng de ADN genómico parcialmente disociado, así como una cantidad adecuada de ligasa (en este caso 400 unidades NEB) en 1 x tampón de ligasa.

La transformación de células competentes de E.coli DH 12S (firma Gibco Life Technologies, Karlsruhe) se llevó a cabo por electrotransformación. A tal efecto, se mezclaron 1 μl de carga de ligación y 30 μl de células, se incubaron en una cubeta de electroporación durante 1 minuto sobre hielo y fueron tratados en el electroporador (BTX® ECM399, firma Genetronics Inc., San Diego, CA, EEUU) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Tras su inmediata incorporación en 1 ml de medio SOC (2% de bacto-triptona; 0,5% de extracto de levadura; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; pH 7,0 ajustado con NaOH; tratamiento en autoclave; suplementado con MgSO4 10 mM y MgCl2, así como D(+)glucosa 20 mM) siguió una fase de recuperación de 1 h a 37ºC antes de su colocación en placas.

Para examinar la calidad del banco de genes se determinó el número de los transformantes primarios generados en total y el número de clones portadores de un inserto a través de la selección azul/blanco en placas de ensayo. A tal efecto se distribuyeron 1 μl y 10 μl, respectivamente, de la carga de ligación sobre el medio LB con ampicilina, IPTG, X-Gal (tal como se ha descrito anteriormente) y se incubó durante la noche a 37ºC. Para confirmar los tamaños de inserto clonados realmente se llevó a cabo el aislamiento de los plásmidos de como mínimo 10 colonias blancas de las placas de ensayo y una digestión de restricción adecuada con el subsiguiente análisis de tamaño por electroforesis en gel.

Ensayo de actividad de los bancos de genes

Primero se comprobó la capacidad de los bancos de genes para la degradación de almidón. A tal efecto, se utilizó agar LB con almidón soluble al 1% (firma Merck, Darmstadt, nº de art. #1252) donde, debido a la aparición de halos de lisis, se podía identificar clones capaces de degradar el almidón. Esto requirió un almacenamiento de las placas durante dos hasta cuatro semanas a 4ºC hasta su enturbiamiento, después del cual la degradación del almidón era visible en forma de zonas más claras alrededor de las colonias en las placas. Adicionalmente se utilizó Cibacron Brilliant Red® 3B-A (firma Aldrich, Taufkirchen) como almidón soluble y marcado (aprox. al 0,6% p/v) (Blely, P., Mislovicova, D., Markovic, O., Kalac, V. (1988): “A new chromogenic substrate for assay and detection of alphaamylase” (“Un nuevo sustrato cromogénico para el ensayo y la detección de alfa-amilasa”); Anal. Biochem., tomo 172 (1), páginas 176-179), donde la degradación de almidón se aprecia por una decoloración del agar rojizo en la zona del clon positivo. Antes de su uso, se añadió a las placas en ambos casos IPTG (100 mM) para la inducción del promotor y ampicilina (100 μg/ml) para ejercer la presión seleccionada sobre los transformantes.

En función del título de cada banco creado, se distribuyó uniformemente un volumen definido de la carga de transformación con aproximadamente 10 000 colonias por placa (14 cm de diámetro) mediante bolas de vidrio en las placas (colocación en placa primaria). Tras incubación durante 16 horas a 37ºC las placas se siguieron incubando durante 24 – 48 horas más a 28ºC para la expresión de la amilasa y su liberación. Para ello, la incubación a 28ºC era imprescindible por norma general para hacer visible la degradación del almidón. En este contexto podrían tener importancia un plegado mejorado de la proteína y la permeabilización de la membrana exterior de la célula (Stathopoulos, C., Georgiou, G., Earhart, C.F. (1996): “Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp’OmpA(46-159)-PhoA fusión protein localized in the outer membrane” (“Caracterización de Escherichia coli expresando una proteína de fusión Lpp’OmpA(46-159) localizada en la membrana exterior”); Appl. Microbiol. Biotechnol., tomo 45 (1-2), páginas 112-119). Ello iba acompañado, por lo tanto, por una liberación de la a-amilasa formada en cada caso, y no fue necesario realizar una lisis adicional de la célula para la detección de amilasas de citoplasma no exportadas.

Tras la individualización de las colonias a partir de los halos aparecidos en la colocación primaria en placas mediante una nueva colocación (secundaria) sobre las mismas placas de almidón, se pudo seleccionar colonias individuales formadoras de amilasa por medio de una nueva formación de halos. Para fines de documentación fotográfica ha dado buenos resultados la coloración de las placas de almidón, tras asegurar los clones, mediante una solución de Lugol al 50% (firma Merck) para la visualización inequívoca de zonas libres de almidón (halos de degradación).

En la figura 6 se muestra una placa de agar LBAmp, que contiene almidón y ha sido colorada adecuadamente, sobre la que se ha aplicado gotas de las suspensiones de clones positivos de la colocación secundaria en placas.

El aislamiento de clones individuales

El ADN plasmídico de clones positivos obtenido tras la minipreparación (kit de la firma Qiagen, Hilden, Alemania, utilizado según indicaciones del fabricante) fue examinado mediante un análisis de restricción con Eco R I o Sac II Hlnd III en cuanto al tamaño de inserto y seguidamente fue secuenciado. Primero se utilizaron los cebadores M13 que flanquean el inserto (M13 directo: 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’; M13 inverso: 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) para obtener finalmente la secuencia total a través de lo que se denomina circulación de cebadores (“Primerwalking”), tal como se conoce por el estado de la técnica. El principio de este procedimiento consiste en que a partir de secuencias detectadas en una serie que se repite se pueden derivar nuevos cebadores de secuenciación y éstos pueden ser utilizados para la secuenciación de las siguientes regiones todavía desconocidas; a partir de éstos se pueden derivar, a su vez, los próximos cebadores de secuenciación.

Ejemplo 4

La expresión heteróloga de a-amilasas en sistemas de expresión procariotas

Para la caracterización de las propiedades bioquímicas de las a-amilasas clonadas, éstas deberían ser producidas en cantidades más grandes de forma soluble. La misma se realizó para los genes completos de amilasa de Streptomyces sp. B327*, Streptomyces sp. B400B y el aislado de actinomicetales Streptomyces sp. B327B. Como anfitrión de expresión se utilizo Streptomyces lividans TK24; como vector de expresión sirvió pAX5a (figura 5). En ella la expresión está controlada por el promotor constitutivo ermE.

Para insertar las interfaces Spe I y Eco RI necesarias para la clonación y para sustituir los codones de inicio más raros y, por lo tanto, eventualmente peor trasladados del gen de amilasa de B327* (GTG) y B400B (TTG) por ATG, se llevó a cabo una PCR con cebadores adecuadamente modificados. Para la clonación de la a-amilasa completa a partir de Streptomyces sp. B327*, por ejemplo, se utilizó el cebador directo: 5’ aaaactagtAAGGAGAACC-CCCACaTGATATCGAG3’ y el cebador inverso: 5’ gaattcgcccttTCAGCAGTTGGCCTTGCCCG3’. Los nucleótidos nuevos, no complementarios se han reproducido aquí con letras minúsculas. En el cebador directo se han subrayado los puntos de reconocimiento para la enzima de restricción Spe I y el codón de inicio; la secuencia Shine-Dalgarno está resaltada en negrita. En el cebador inverso se ha subrayado el punto de reconocimiento para la enzima de restricción Eco RI y se ha resaltado en negrita el codón de paro (con orientación inversa). Como matriz sirvieron los clones genómicos aislados a partir de los bancos de genes.

Tras una clonación intermedia de los productos PCR generados mediante la polimerasa Pfx Platinum en el vector pCR Blunt II TOPO (firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos) se llevó a cabo la inserción dirigida en el vector de expresión pAX5a de estreptomicetos utilizando las interfaces de restricción Spe I y Eco RI. A continuación, se llevó a cabo la transformación de protoplastos de S. lividans TK 24, según Kieser y otros (Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., Hopwood, D.A. (2000): “PEG-assisted transformation of Streptomyces protoplasts with plasmid DNA. Rapid small-scale procedure.” (“Transformación de protoplastos de Streptomyces asistida por PEG con ADN plasmídico. Proceso rápido a pequeña escala”) en “Practical Streptomyces Genetics”, The John Innes Foundation (edición), Crows, Norwich, Inglaterra) y una colocación en placas de los transformantes sobre el medio de regeneración selectivo R2YE. Éste está compuesto de: 103 g de sucrosa, 0,25 g K2SO4, 0,12 g MgCl2 x 6 H2O, 10 g de glucosa, 100 mg de Difco Casaminoacids (firma Difco, Heidelberg), 10 ml de solución KH2PO4 al 0,5% (p/v), 80 ml de solución CaCl2 al 3,68% (p/v), 1,5 ml de L-Prolina, 100 ml de tampón TES (pH 7,2; ácido 2{[Tris(hidroximetil)metil)amino}-etansulfónico), 0,2 ml de solución de elementos traza (40 mg/l ZnCl2, 200 mg/l FeCl3 x 6 H2O, 10 mg/l CuCl x 2 H2O, 10 mg/l MnCl2 x 2 H2O, 10 mg/l Na2B4O7 x 10 H2O, 10 mg/l (NH4) 6 Mo7O24 x 4 H2O) y 5 ml de extracto de levadura Difco al 10% (p/v) (firma Difco, Heidelberg) sobre 1 l H2O con 75 μg/ml de tioestreptona como antibiótico selectivo.

Tras recolocación sobre placas indicadoras NBSA (8 g/l de nutriente Broth Difco, 15 g/l de agar Serva, almidón soluble Merck #1252 al 1,5% (p/v), pH 8,0; fabricante: firma Difco, Heidelberg; firma Serva, Heidelberg; firma Merck, Darmstadt) e identificación de clones positivos de amilasa que pudieron ser reconocidos por los halos de degradación de almidón que se estaban formando, se realizó un cultivo en medio líquido para obtener excedentes enzimáticamente activos. A tal efecto se cultivó un precultivo de 5 ml durante 16 h y después un cultivo de 50 ml en un matraz de Erlenmeyer de 300 ml con desviadores utilizando un medio GYM (4 g/l de glucosa, 4 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de extracto de malta, 2 g/l CaCO3) con 75 μg/ml de tioestreptona durante 4 días. El excedente de cultivo que contenía amilasa se obtuvo mediante separación de la masa celular mediante centrifugado durante 15 min a 2500 g y subsiguiente filtración (0,45 μm), y fue llevado directamente a la medición o bien almacenado a -20ºC en el refrigerador tras ultracongelación en nitrógeno líquido.

Ejemplo 5

La caracterización de la actividad amilolítica de representantes de a-amilasas

La caracterización de las propiedades enzimáticas

Teniendo en cuenta que las a-amilasas tienen campos de aplicación muy diversos, se realiza la caracterización de las propiedades enzimáticas que puede constituir la base para la selección de las enzimas en relación a su aplicación. La representación de las enzimas puede realizarse mediante clonación o expresión heteróloga de las secuencias genéticas según los ejemplos 3 y 4, y de acuerdo con el procedimiento mostrado anteriormente.

La actividad amilolítica fue determinada por el método dinitrosalicílico (ensayo DNSS). Mediante el mismo se determina la hidrólisis de un sustrato de almidón complejo por medio del aumento de los terminales reductores del polisacárido y la absorción de reactivo DNSS transformado a 540 nm sirve como medida para la actividad hidrolítica.

Para el ensayo se presentaron en una placa de 96 pocillos para un termociclador de PCR (0,2 ml “thin-wall plate” (placa de paredes delgadas) #3416, MBP (Molecular BioProducts, San Diego, EEUU) en cada uno de los pocillos de muestra y de blanco 25 μl de solución de sustrato (1% almidón soluble p.a. Merck en tampón Tris-maleato 180 mM, pH 8,6 o en 180 mM del correspondiente tampón de ensayo) y se preincubaron en un bloque termociclador durante 5 min a 50ºC o a la temperatura de ensayo correspondiente en cada caso. Tras adición de 20 μl de solución de enzimas por pocillo se llevó a cabo la conversión de substrato durante 15 min a 50ºC, o bien a la temperatura de ensayo correspondiente. Tras adición de 65 μl de reactivo DNSS (8,8 g de ácido dinitrosalicílico, 250 g de tartrato de potasio y sodio, 6,3 g de disulfito de sodio, 334 ml NaHO al 4,5% (p/v), 915 ml H2O) a los pocillos de muestra y de blanco, así como la adición de 20 μl de solución de enzimas a los pocillos de blanco la placa de ensayo fue transferida de inmediato a un bloque térmico precalentado a 100ºC e incubado durante 20 min a 100ºC. La medición de las muestras se realizó mediante transferencia de 60 μl de la carga de ensayo a 200 μl H2O, respectivamente, que se habían presentado en una placa de medición de 96 pocillos (PS-Microplate, 96 Well #655101, Greiner) y la subsiguiente determinación de la absorción a 540 nm mediante un espectrofotómetro para placas de microtitulación (Spectramax 190, firma Molecular Devices, Sunnivale, EEUU) con H2O como referencia. Se realizaron tres mediciones respectivamente; la evaluación se realizó mediante sustracción del valor medio de los 3 pocillos de blanco del valor medio de 3 pocillos de muestra.

Estabilidad térmica y perfil de temperatura

Para determinar la estabilidad térmica se preincubaron las soluciones de las a-amilasas obtenidas de forma recombinante durante 15 min a diferentes temperaturas y, a continuación, se determinó la actividad residual según el

5 procedimiento descrito anteriormente a 50ºC y con Tris-maleato 100 mM, pH 8,6. Para la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327B se obtuvo máxima estabilidad a 45ºC, pero con temperaturas más elevadas, hasta 61ºC el efecto era relativamente moderado con actividades residuales de más del 80%. Los demás resultados están resumidos en la tabla 3, donde el valor óptimo de 45ºC se ha fijado con 100%.

10 Tabla 3: Estabilidad térmica de la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327*

Temperatura de pre-incubación [ºC]

Actividad residual en relación con la de 45ºC [%]

45

100

50,4

94

55,8

86

61

84

64,7

46

Para determinar el perfil de temperatura se realizó la conversión según el modo de proceder descrito anteriormente a diferentes temperaturas y con tampón de Tris-maleato 100 mM, pH 8,6. Para la a-amilasa procedente de

15 Streptomyces sp. B327* se obtuvo máxima actividad a 41,3ºC. Temperaturas más elevadas condujeron a esta enzima a importantes pérdidas de actividad (véase la tabla 4). La actividad de la amilasa procedente de Streptomyces sp. B327B, en cambio, se mantuvo relativamente constante en el rango de temperatura del ensayo (véase tabla 5).

20 Tabla 4: Perfil de temperatura de la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327*

Temperatura [ºC]

Actividad en relación con la de 41,3ºC [%]

40

87

41,3

100

50,7

38

56

38

59,8

35

Tabla 5: Perfil de temperatura de la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327B.

Temperatura [ºC]

Actividad en relación con la de 41,3ºC [%]

40

103

41,3

100

50,7

117

56

92

59,8

83

Se reconoce que la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327B es más estable en un rango de temperatura más amplio y hasta temperaturas más elevadas que la procedente de Streptomyces sp. B327*. Las enzimas amilolíticas puestas a disposición por la presente invención se distinguen por lo tanto en lo que se refiere a su

30 sensibilidad térmica por presentar una variabilidad remarcable.

La estabilidad frente a oscilaciones de valores de pH

Para determinar la actividad de las a-amilasa-amilasas en diferentes condiciones de pH se preparó una solución de

35 sustrato de almidón en un rango de pH de 6,0 hasta 8,6 con un tampón de Tris-maleato 180 mM adecuadamente ajustado; para un pH de 8,6 y el rango de pH superior al mismo, se ha preparado la solución con un tampón glicina-NaOH 180 mM. Tras dilución de la solución de sustrato se obtuvo en las condiciones de ensayo los valores de pH deseados y las concentraciones de tampón Tris-maleato 100 mM, o bien de tampón glicina-NaOH 100 mM deseadas. Mediante la medición en un pH 8,6 en ambos sistemas de tampón pudieron compensarse las influencias

40 del sistema de tampón. La determinación de la actividad amilolítica con los valores de pH respectivos se realizó tal como se ha descrito anteriormente a 50ºC. Los resultados obtenidos se recogen, a continuación, en la tabla 6. Las actividades con un ph 6,5 de ambas a-amilasas procedentes de Streptomyces sp. B327* y B327B se han fijado en el 100% en ambos casos; los valores indicados a continuación se refieren a las mismas.

Tabla 6: Actividad amilolítica de las a-amilasas procedentes de Streptomyces sp. B327* y del aislado de actinomicetal Streptomyces sp. B327B con valores de pH alcalinos

Valor pH de la preincubación

Actividad relativa de la a-amilasa procedente de St. sp. B327* [%] Actividad relativa de la a-amilasa procedente de St. sp. B327B [%]

6,5

100 100

8,6

38 129

10

21 84

12

13 43

5 Frente a la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327* la procedente de Streptomyces sp. B327B es más estable en un medio más alcalino y también presenta una mayor estabilidad o una mayor actividad amilolítica hasta con valores de pH muy elevados.

La estabilidad frente a tensioactivos

10 Para determinar la estabilidad frente a los tensioactivos se llevaron a cabo dos líneas de medición de actividad. En la primera se pre-incubó la a-amilasa tal como se ha descrito anteriormente con una solución de sustrato de almidón con dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,018% (p/v), de manera que tras la dilución se obtuvo una concentración de 0,01% de SDS en la carga del ensayo. La determinación de la actividad se realizó otra vez a 50ºC y con un tampón

15 de Tris-maleato 100 mM, pH 8,6. Si se fija para estos valores el 100%, respectivamente, las dos a-amilasas examinadas presentan en ausencia de SDS una menor actividad: la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327* presenta sin SDS una actividad del 94,2% y la procedente de Streptomyces sp. B327B una del 89%. Esto muestra que ambos representantes del nuevo grupo de a-amilasas elegidos al azar poseen suficiente estabilidad en presencia de una concentración de tensioactivos típica en muchas aplicaciones.

20 Para la caracterización de la actividad enzimática en presencia de iones bivalentes potencialmente estabilizadores, o en presencia de formadores de complejos se incubaron las enzimas elegidas al azar con una solución de sustrato de almidón (1% de almidón) que contiene CaCl2 3,6 mM, o bien con una solución de sustrato de almidón que contiene EDTA 1,8 mM, de manera que en el ensayo realizado tal como se ha descrito anteriormente se obtuvo

25 concentraciones finales de Ca2+ 2mM, o bien EDTA 1 mM, respectivamente. La determinación de la actividad restante se realizó otra vez a 50ºC y con un tampón de Tris-maleato 100 mM, pH 8,6.

Si se fijan las actividades de ambas enzimas con CaCl2 2 mM en el 100%, la actividad de la a-amilasa procedente de Streptomyces sp. B327* baja al 91% en presencia de EDTA 1 mM. La de la a-amilasa procedente de

30 Streptomyces sp. B327B baja al 57% en presencia de EDTA 1 mM. Esto muestra que ambas enzimas presentan actividades residuales notablemente altas en presencia de tensioactivos y de formadores de complejos. Sin embargo, ambas enzimas reaccionan de forma claramente distinta y diversa a estas influencias tal como muestran las actividades diferentes en presencia de formadores de complejos.

35 Los resultados de este ejemplo muestran, por un lado, que las enzimas encontradas, según la invención, no solamente han de ser consideradas como a-amilasas por sus secuencias de ADN y de proteína, sino que realmente disponen también de una actividad desintegradora de almidón. Las diferencias entre ambas enzimas examinadas en lo que se refiere a sus requisitos con respecto a las condiciones de reacción pueden considerarse una prueba de que la presente invención pone a disposición, más allá de la homología básica, un amplio espectro de enzimas

40 amilolíticas con diferencias individuales.

Descripción de las figuras

Figura 1: Posición de los bloques de secuencias de aminoácidos potencialmente conservadas (“ancla de secuencia”

45 A-E) en a-amilasas (glicosil hidrolasas familia 13, E.C. 3.2.1.1), derivada de las secuencias de a-amilasa de actinomicetales, y la posición relativa de los cebadores de PCR esenciales para la invención, recogidos en la tabla 3 e indicados en el protocolo de secuencias (ejemplo 1).

A título de ejemplo, se representan los 567 aminoácidos, o las secuencias de aminoácidos o de ADN que

50 comprenden 1701 bp de la a-amilasa procedente de Streptomyces griseus (GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EEUU), número de acceso X57568) con los dominios conservados A hasta E, que se extienden a través de las siguientes posiciones de aminoácidos: A: 58-91, B: 94-141, C: 155-207, D: 295-345, E: 392-427.

55 Figura 2: Análisis de tamaño de los productos de reacción de la PCR, según la invención, de las combinaciones de cebadores GEX024 / GEX026 (figura 2 A) y GEX29 / GEX031 (figura 2 B) en ADN de estreptomicetos (ejemplo 1).

Como matriz sirven, en este caso, preparaciones de ADN genómico de las siguientes 20 cepas de Streptomyces sp. elegidas al azar: 1: B101A, 2: B114C, 3: B134, 4: B135A, 5: B138A, 6: B152A, 7: B153B, 8: B161A, 9: B156B1, 10: B157C, 11: B158A, 12: B160B, 13: B161A, 14: B373, 15: B375, 16: B380, 17: B390, 18: B392A, 19: B392A, 20: B394.

Los productos de reacción (1/10 del volumen de reacción) fueron separados en un gel de agarosa al 2,5%; ambos productos parcialmente presentes con un tamaño de aproximadamente 300 bp y aproximadamente 500bp, respectivamente, fueron identificados como secuencias de amilasa mediante secuenciación. Marcadores (M): 100 bp de la escalera de ADN (en bp desde arriba abajo: 3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100).

Figura 3: Secuencia de consenso de a-amilasas a partir de 231 cepas del género Streptomyces (SEQ ID NO. 2, 4 y 34 hasta 262) con las correspondientes variantes para cada posición (ejemplo 3).

La secuencia de consenso está basada en un alineamiento con el programa Clustal X®, versión 1.64b (configuración estándar; descrita en: Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994), “CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice” (“CLUSTAL W: Mejorando la sensibilidad del alineamiento múltiple progresivo de secuencias mediante la ponderación de secuencias, penalizaciones por introducir huecos en posiciones específicas y la elección de la matriz de pesos”), Nucleic Acids Res., tomo 22, páginas 4673-4680). Las posiciones de los aminoácidos 1-7 y 94-100 están en gran medida predeterminadas por las secuencias de cebador de PCR (GEX024/GEX026 y GEX029/GEX031) en función de la selectividad de la PCR que se ha llevado a cabo.

Se trata de una representación alternativa de la secuencia de consenso indicada en la SEQ ID NO. 263.

Figura 4: Representación esquemática del vector plasmídico pUC18 (GenBank, National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EEUU), número de acceso: L08752, ejemplo 4) utilizado para los bancos de genes de expresión.

El vector fue linearizado en ambos casos con la enzima de restricción Acc I, para absorber ADN genómico de estreptomicetos fragmentado en Aci I.

ORI: Origen de la replicación: lac I: gen para el represor lac; lacZ-alfa: gen para el a-péptido de la �-galactosidasa; ampicilina R: el gen resistente a la ampicilina de la -lactamas.

Figura 5: El vector plasmídico pAX5a utilizado para la expresión de amilasas en Streptomyces lividans TK 24 (ejemplo 4).

En él significan: pUC19 ori: Origen de replicación en E. Coli; AmpicilinaR, gen resistente a la ampicilina (beta-lactamasa); tioestreptonaR, gen resistente a la tioestreptona; plJ101, Replicon Origen de replicación en Streptomyces; ermE, ermE-up-Promotor de S. Erythrea (descrito en: Faß, S.H., Engels, J.W. 1996, “influence of Specific Signal Peptide Mutations on the Expression and Secretion of the alpha-Amylase Inhibitor Tendamistat in Streptomyces lividans” (“influencia de mutaciones de péptidos señal específicos en la expresión y secreción del inhibidor de la alfa-amilasa tendamistat en Streptomyces lividans”, J. Biol. Chem., tomo 271 (nº 25), páginas 15244-15252). Utilizando la secuencia de tendamistat los genes a clonar pueden insertarse a través de los puntos de reconocimiento Spe I- (5’terminal) y EcoRI- (3’-terminal) en pAX5a y luego expresarse a partir de un promotor ermE constitutivo.

Figura 6: Detección de la actividad amilolítica de las a-amilasas procedentes de Streptomyces sp. B327* y Streptomyces sp. B400B tras su expresión heteróloga en Escherichia coli.

Tras la expresión heteróloga de las correspondientes secuencias genéticas en Escherichia coli (ejemplo 3), la aplicación de las células huésped transformadas sobre placas de agar LBAmp con almidón soluble al 1% y la subsiguiente coloración de las placas mediante solución de Lugol, se pueden reconocer en los halos de degradación las colonias cuyas células exprimen las secuencias genéticas introducidas.

Para esta figura se han aplicado muestras de clones derivados de las cargas de transformación mediante separación:

1.

Control positivo: Cepa de expresión con la a-amilasa procedente de Streptomyces griseus en pUC18);

2.

Control negativo (pUC18 sin ADN insertada);

3.

Muestra de un clon positivo de amilasa, que contiene ADN genómico a partir de Streptomyces sp. B400B;

4.

y 5. Muestras de dos clones genómicos obtenidos mediante la misma transformación a partir de Streptomyces sp. B327*;

6. hasta 8. Muestras de tres clones genómicos obtenidos mediante la misma transformación a partir de Streptomyces sp. B327B;

9. hasta 12. Muestras de cuatro clones genómicos obtenidos mediante la misma transformación a partir de

Streptomyces griseus.

PROTOCÓLOS DE SECUENCIAS

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

<120> Eine neue Gruppe von Alpha-Amylasen sowie ein Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung neuer Alpha-Amylasen

<130> H 4890 PCT

<140>

<141>

<150> DE 10131441.8

<151> 2001-06-29

<160> 263

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 302

<212> ADN

<213> Streptomyces sp. B327*

<220>

<221> CDS

<222> (2)..(301)

<400> 1 <210> 2

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B327*

<400> 2 10

<210> 3

<211> 293

<212> ADN 5 <213> Streptomyces sp. B400B

<220>

<221> CDS

<222> (2)..(292) 10

<400> 3

15 <210> 4

<211> 97

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400B

20 <400> 4 <210> 5

<211> 1386 5 <212> ADN

<213> Streptomyces sp. B327*

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1386)

<220>

<221> misc_feature

<222>

(1).. (3) 15 <223> INIT_MET

<220>

<221> mat_peptide

<222>

(91) 20

<400> 5

<210> 6

<211> 461

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B327*

<400> 6

<210> 7

<211> 1377

<212> ADN

<213> Streptomyces sp. B400B 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1377)

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> INIT_MET

15 <220>

<221> mat_peptide

<222> (88)

<400> 7

<210> 8

<211> 458

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400B

<400> 8

5

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Cebador PCR (GEX024) <400> 9 cgtcgacggc ttccgsatcg acrc 24

15

<210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Cebador PCR (GEX026)

<400> 10 gctcggtgtc gtggttgtcs acgwa

25

<210> 11

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX029)

<400> 11 cggcgtcgac ggctkscgbn tsga

<210> 12

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX031)

<400> 12 gctgggtgtc gtggttgtcs acsma

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX015)

<400> 13 ggtggacgtc ctaccagccs gt

<210> 14

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX016)

<400> 14 gcacccgcag gagcacrycs agg

<210> 15

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX017)

<400> 15 cgcggccggc gtsaagrt

<210> 16

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX018)

<400> 16 tggtcaacac ctgccacgms gc

<210> 17

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX019)

<400> 17 cgcggcgtcg atgckgaagm mgtc

<210> 18

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX020)

<400> 18 ggagccgtac ggccasgcsa gcatga

<210> 19

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX021)

<400> 19 cccttgtcgc cgcgsscgaa sgc

<210> 20

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX022)

<400> 20 ggcgtcctcg tggttgawsg csac

<210> 21

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX023)

<400> 21 ggtctacgcc gacgtcgtsw wcaacca

<210> 22

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX025)

<400> 22 ggcgtcgatg cggaasccgt c

<210> 23

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX027)

<400> 23 gcgtccaggt ctacgtcgac rysgtshtsa a 31

<210> 24

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX028)

<400> 24 caggtctacg tcgacgtcgt shtsaacca 29

<210> 25

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX030)

<400> 25 cggcggggat gtgctksrcs rmgtcsa 27

<210> 26

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX036)

<400> 26 gtacgccgac gccgtnwtha ayca 24

<210> 27

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX037)

<400> 27 gtacgccgac gccgtnwtha aycaya

<210> 28

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX038)

<400> 28 ggcggcgtcg atcckraanc crtc

<210> 29

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX039)

<400> 29 cttggcggcg tcgatnckra ancc

<210> 30

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador PCR (GEX040)

<400> 30 tcttgctcgg cgtggayggn ttymg

<210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR (GEX041)

<400> 31 ccggatcgac gccgynaarc ayat

24

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR (GEX042)

<400> 32 cgctcggtgt cgtggttntc nacvma

26

<210> 33 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR (GEX043)

<400> 33 cgttccgctc ggtgtcgyrr ttntcnac

28

<210> 34

<211> 100 <212> PRT <213> Streptomyces sp. B1002

<400> 34

<210> 35

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1003B

<400> 35

<210> 36

<211> 97

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1006

<400> 36

<210> 37

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B1008A1

<400> 37

<210> 38

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1009A

<400> 38

<210> 40

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1011

<400> 40

<210> 41

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1012B

<400> 41

<210> 42

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B1014A1

10

<210> 39

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1010

15

<400> 39

<400> 42

<210> 43

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1017C

<400> 43

<210> 44

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1019

<400> 44

<210> 45

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B101A

<400> 45

<210> 46

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B101B

<400> 46

<210> 47

<211> 84 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B102

<400> 47

<210> 48

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1020C

<400> 48

10 <210> 49

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1022A

15 <400> 49

<210> 50

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1028

<400> 50

<210> 51

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B1029

<400> 51 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1030A

<400> 52 10

<210> 53

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1035B

<400> 53

<210> 54 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1036

<400> 54 15

<210> 55

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1037A

<400> 55

<210> 56

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1039A

<400> 56

<210> 57 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B103A

<400> 57 15

<210> 58

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1041A1

<400> 58

<210> 59

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1043A

<400> 59

<210> 60

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1044C

<400> 60

<210> 61

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1045

<400> 61

10

<210> 62

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1046A

15

<400> 62

<210> 63

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1047A1

<400> 63

<210> 64

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B1048A

<400> 64 5 <210> 65

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1049A

10 <400> 65

<210> 66

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1050A

<400> 66

<210> 67

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1052A2

<400> 67

<210> 68

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1053

<400> 68

<210> 69

<211> 97

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B1059

<400> 69

<210> 70

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1060

<400> 70

<210> 71

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1061B

<400> 71

<210> 72

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B1065

<400> 72

<210> 73

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1067A

<400> 73

<210> 74

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1068

<400> 74

<210> 75 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1069B

<400> 75 15

<210> 76

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B106C

<400> 76

<210> 77

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B107

<400> 77

<210> 78 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1070A

<400> 78 15

<210> 79

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1071

<400> 79

<210> 80

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B1072A

<400> 80

10 <210> 81

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B108

15 <400> 81

<210> 82

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B109A

<400> 82

<210> 83

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B114C

<400> 83

<210> 84

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B115

<400> 84

<210> 85

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B117A1

<400> 85

<210> 86

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B118

<400> 86

<210> 87

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B119E

<400> 87

<210> 88

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B120alt

<400> 88

<210> 89 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B123

<400>

89 15

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B124

<400>

90 10

<210> 91

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B125C

<400> 91

10

<210> 92

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B126A

15

<400> 92

<210> 93

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B127A

<400> 93

<210> 94

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B128B

<400> 94

<210> 95

<211> 100

<212> PRT 10 <213> Streptomyces sp. B130B

<400> 95

<210> 96

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B131

<400> 96

10

<210> 97

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B134

15

<400> 97

<210> 98

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B135A

<400> 98

<210> 99

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B137

<400> 99

<210> 100

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B138

<400> 100

<210> 101

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B138A

<400> 101

<210> 102

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B138A2

<400> 102

<210> 103

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B140

<400> 103

<210> 104

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B141

<400> 104

<210> 105

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B142

<400> 105

<210> 106

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B143

<400> 106

<210> 107

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B148A

<400> 107

<210> 108

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B152A

<400> 108

<210> 109

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B153(B)

<400> 109

<210> 110

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B154A

<400> 110 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B156B

<400> 111 10

<210> 112

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B157C

<400> 112

<210> 113 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B158A

<400> 113 15

<210> 114

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B159

<400> 114

<210> 115

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B160B

<400> 115

<210> 116

<211>

100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B161A

<400> 116

<210> 117

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B166B

<400> 117

<210> 118

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B168

<400> 118

<210> 119

<211>

100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B179

<400> 119

<210> 120

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B181C

<400> 120

10

<210> 121

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B183B

15

<400> 121

<210> 122

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B184

<400> 122

<210> 123

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B185(B)

<400> 123 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B186A

<400> 124 10

<210> 125

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B187A

<400> 125

10 <210> 126

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B187A2

15 <400> 126

<210> 127

<211> 97

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B194A

<400> 127

<210> 128

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B194B1

<400> 128

<210> 129 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B196A2C

<400> 129 15

<210> 130

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B196B

<400> 130

<210> 131

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B197B

<400> 131

<210> 132

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B198C2

<400> 132

<210> 133

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B200B

<400> 133

<210> 134

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B201A

<400> 134

<210> 135

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B202A

<400> 135

10

<210> 136

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B202B

15

<400> 136

<210> 137

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B206A

<400> 137

<210> 138

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B207

<400> 138

10 <210> 139

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B208B

15 <400> 139

<210> 140

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B209B

<400> 140

<210> 141

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B210

<400> 141

<210> 142 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B211A

<400> 142 15

<210> 143

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B212B1

<400> 143

<210> 144

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B213

<400> 144 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B214B

<400> 145 10

<210> 146

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B214C

<400> 146

10 <210> 147

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B215

15 <400> 147

<210> 148

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B218D2

<400> 148

<210> 149

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B219A

<400> 149

<210> 150

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B220B

<400> 150 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B221A

<400> 151 10

<210> 152

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B222(B)

<400> 152

10 <210> 153

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B223A

15 <400> 153

<210> 154

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B224(A)

<400> 154

<210> 155

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B225B

<400> 155

<210> 156

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B226B

<400> 156

<210> 157

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B227B2

<400> 157

10 <210> 158

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B228B

15 <400> 158

<210> 159

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B230B1

<400> 159

<210> 160

<211> 100 15 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B231A

<400> 160

<210> 161

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B233C

<400> 161

<210> 162

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B234

<400> 162

<210> 163

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B235A

<400> 163 5 <210> 164

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B237A

10 <400> 164

<210> 165

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B238A

<400> 165

10

<210> 166

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B240A

15

<400> 166

<210> 167

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B241B2

<400> 167

<210> 168

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B242A1

<400> 168

<210> 169

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B243C

<400> 169 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B244B2

<400> 170 10

<210> 171

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B246

<400> 171

<210> 172

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B247A

<400> 172

<210> 173

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B248B2

<400> 173

<210> 174

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B249A

<400> 174

<210> 175 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B249C

<400> 175 15

<210> 176

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B250A2

<400> 176

<210> 177

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B251B

<400> 177

<210> 178

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B252A

<400> 178

<210> 179

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B253

<400> 179

<210> 180

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B253A

<400> 180

<210> 181

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B255B2

<400> 181

<210> 182

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B256A

<400> 182

<210> 183

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B259A

<400> 183

<210> 184

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B261

<400> 184

<210> 185

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B278

<400> 185

<210> 186

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B279

<400> 186 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B280C

<400> 187 10

<210> 188

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B284A

<400> 188

<210> 189

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B286A

<400> 189

<210> 190

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B287

<400> 190

<210> 191

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B292A

<400> 191

<210> 192 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B3001org

<400> 192 15

<210> 193

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B3002org

<400> 193

<210> 194

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B3003org

<400> 194

<210> 195 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B3017

<400> 195 15

<210> 196

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B306

<400> 196

<210> 197

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B308

<400> 197

<210> 198 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B311

<400> 198 15

<210> 199

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B315

<400> 199

<210> 200

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B317

<400> 200

10 <210> 201

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B318

15 <400> 201

<210> 202

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B319

<400> 202

<210> 203

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B320A

<400> 203

<210> 205

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B322A

<400> 205

<210> 206

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B323

5

<210> 204

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B321

10

<400> 204

<400> 206

<210> 207

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B326

<400> 207

<210> 208

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B327B

<400> 208

<210> 209 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B335org

<400> 209 15

<210> 210

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B345

<400> 210

<210> 211

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B346

<400> 211

<210> 212

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B347

<400> 212

<210> 213

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. 8348

<400> 213

<210> 214

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B350

<400> 214

<210> 215 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B352

<400> 215 15

<210> 216

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B353

<400> 216

<210> 217

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B354

<400> 217

<210> 218 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B355

<400> 218 15

<210> 219

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B356

<400> 219

<210> 220

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B357

<400> 220

<210> 221

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B358

<400> 221

<210> 222

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B359

<400> 222

<210> 223

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B360

<400> 223

<210> 224

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B361

<400> 224

<210> 225

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B362

<400> 225

<210> 226 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B363org

<400> 226 15

<210> 227

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B366

<400> 227

<210> 228

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B368

<400> 228 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B370

<400> 229 10

<210> 230

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B371

<400> 230

<210> 231 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B372

<400> 231 15

<210> 232

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B373

<400> 232

<210> 233

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B374B

<400> 233

<210> 234 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B375

<400> 234 15

<210> 235

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B376

<400> 235

<210> 236

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B380

<400> 236

<210> 237 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B382

<400> 237 15

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B390

<400> 238

<210> 239

<211> 100

<212>

PRT 15 <213> Streptomyces sp. B392A

<400> 239

<210> 240

<211> 100

<212>

PRT 10 <213> Streptomyces sp. B393

<400> 240

<210> 241

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B394

<400> 241

<210> 242

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B395

<400> 242

<210> 243 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B396(A)

<400> 243 15

<210> 244

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400

<400> 244

<210> 245

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B4006

<400> 245 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B4006B

<400> 246 10

<210> 247

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400A

<400> 247

<210> 248 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400A2

<400> 248 15

<210> 249

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400B3

<400> 249

<210> 250

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400C

<400> 250

<210> 251

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400C2

<400> 251

<210> 252

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400D

<400> 252

<210> 253

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400D2

<400> 253

<210> 254 10 <211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400E

<400> 254 15

<210> 255

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400G

<400> 255

<210> 256

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400G2

<400> 256

10

<210> 257

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400I

15

<400> 257

<210> 258

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400J

<400> 258

<210> 259

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400K

<400> 259

10 <210> 260

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B400L

15 <400> 260

<210> 261

<211> 100

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. B902.

<400> 261

<210> 262

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Streptomyces sp. B907

<400> 262

<210> 263

<211> 100

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)

<223> Ile o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9)

<223> Ala o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)

<223> Lys o Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)

<223> Met o Ile <220>

<221> VARIANTE

<222> (13)

<223> Ser o Pro o Asp o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14)

<223> Ala o Thr o Ser o Glu o Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (15)

<223> Asp o Ala o Glu o Thr o Gly o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (16)

<223> Asp o Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> (17)

<223> Val o Leu o Pro o Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18)

<223> Ala o Thr o Glu o Asn o Gln

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)

<223> Ala o Asn o Asp o His o Thr o Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (20)

<223> Ile o Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (21)

<223> Lys o Glu o Trp o Arg o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (22)

<223> Gly o Ser o Pro o Ala o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (23)

<223> Lys o Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> (24)

<223> Met o Leu o Val o Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (25)

<223>

<220>

<221> VARIANTE

<222> (26)

<223> Asp o Asn o Ser o Lys o Arg

<220>

<221> VARIANTE

<222> (27)

<223> Pro o Arg o Thr o Gln o Gly o Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (28)

<223> <220>

<221> VARIANTE

<222> (29)

<223> Val o Ala o Thr o Pro o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (30)

<223> Phe o Tyr o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (31)

<223> Trp o Arg o Ile o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (32)

<223> Val o Lys o Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> (33)

<223> Thr o Gln o His o Leu o Met

<220>

<221> VARIANTE

<222> (34)

<223> Glu o Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> (35)

<223> Val o Ala o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (36)

<223> Ile o Thr o Met o Tyr o Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> (37)

<223> His o Tyr o Phe o Gly o Pro o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> (38)

<223> Gly o Ala o Ser o Trp o Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (39)

<223> Gly o Ala o Asp o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (40)

<223> Gly o Asn o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (41)

<223> Glu o Pro o Ile

<220>

<221> VARIANTE

<222> (42)

<223> Ala o Thr o Pro o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (43)

<223> Val o Ile o Ala o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (44)

<223> Gln o Ser o Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> (45)

<223> Pro o Ser o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (46)

<223>

<220>

<221> VARIANTE

<222> (47)

<223> Glu o Asp o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (48)

<223> Tyr o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (49)

<223> Thr o Leu o Tyr o Val o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> (50)

<223> Ser o Gly o Asp o Arg o Thr o Asn o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (51)

<223> Ile o Ser o Asn o Ala o Thr o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (52)

<223> Gly o Cys

<220>

<221> VARIANTE

<222> (53)

<223> Asp o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (54)

<223> Val o Ala o Ser <220>

<221> VARIANTE

<222> (55)

<223> Asp o Gln o His o Leu o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (56)

<223> Glu o Asp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (57)

<223> Phe o Leu o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (58)

<223> Arg o Ser o Cys o His o Asp o Thr o Gln

<220>

<221> VARIANTE

<222> (59)

<223> Tyr o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (60)

<223> Gly o Ala o Ser o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (61)

<223> Gly o Ser o Tyr o Arg o Trp o Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222> (62)

<223> His o Asp o Ser o Gly o Gln o Arg o Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222> (63)

<223> Leu o Val o Ile <220>

<221> VARIANTE

<222> (64)

<223> Lys o Ser o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> (65)

<223> Ser o Arg o Gln o His

<220>

<221> VARIANTE

<222> (66)

<223> Ala o Val o Ile o Thr o Ser o Asp o Met

<220>

<221> VARIANTE

<222> (67)

<223> Phe o Val o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (68)

<223>

<220>

<221> VARIANTE

<222> (69)

<223> Gly o Asn o Gln o Arg o Ser o Asp o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (70)

<223> Gly o Glu o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (71)

<223> <220>

<221> VARIANTE

<222> (72)

<223> Leu o Pro o Ile o Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (73)

<223> Pro o Ala o Thr o Ser o Lys

<220>

<221> VARIANTE

<222> (74)

<223> Gly o Gln o Tyr o His o Glu o Asp o Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> (76)

<223> Arg o Asn o Ser o Glu o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (77)

<223> Ser o Asn o Lys o Thr o Tyr o Gly

<220>

<221> VARIANTE

<222> (78)

<223> Ile o Val o Tyr o Phe o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (79)

<223> Ala o Gly o Ser o Asp o Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (80)

<223> Asp o Glu o Val o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (81)

<223> Gly o Asp o Ala o Ser o nada <220>

<221> VARIANTE

<222> (82)

<223> Gly o Trp o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (83)

<223> Gly o Val o Ala o nada

<220>

<221> VARIANTE

<222> (84)

<223> Lys o Tyr o His o Arg o Phe o Leu

<220>

<221> VARIANTE

<222> (85)

<223> Leu o Met o Ile o Val o Pro o Thr

<220>

<221> VARIANTE

<222> (86)

<223>

<220>

<221> VARIANTE

<222> (87)

<223> Gly o Ser o Asn o Tyr o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222> (88)

<223> Ala o Asp o Gly o Ser o Thr o Pro o Asn

<220>

<221> VARIANTE

<222> (89)

<223> <220>

<221> VARIANTE

<222> (90)

<223> Ala o Ser o Pro

<220>

<221> VARIANTE

<222> (91)

<223> Arg o Gly o Ser o Asn o Ala o Val

<220>

<221> VARIANTE

<222> (92)

<223> Thr o Val o Ser

<220>

<221> VARIANTE

<222> (93)

<223> Tyr o Phe o Trp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (100)

<223> Glu o Gln

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)

<223> Ala o Thr o Gly

<220>

<223> Consenso de secuencia

<400> 263

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 en un 95%, preferentemente en un 97,5% y muy preferentemente en un 100%.

2. 2.

   Proteína amilolítica obtenida mediante mutación por inserción o proteína amilolítica quimérica que está formada, al menos en una porción que confiere una actividad amilolítica, por una proteína, según la reivindicación 1.

3. 3.

   Proteína amilolítica, según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque se obtiene a partir de un organismo natural, en especial a partir de un microorganismo.

4. 4.

   Proteína amilolítica, según la reivindicación 3, caracterizada porque el microorganismo es una bacteria grampositiva.

5. 5.

   Proteína amilolítica, según la reivindicación 4, caracterizada porque la bacteria gram-positiva pertenece al orden de los actinomicetales.

6. 6.

   Proteína amilolítica, según la reivindicación 5, caracterizada porque se trata de una especie de Streptomyces.

7. 7.

   Ácido nucleico que codifica para una proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 en un 95%, preferentemente en un 97,5% y muy preferentemente en un 100%.

8. 8.

   Ácido nucleico que codifica para una de las proteínas amilolíticas indicadas en la reivindicación 2.

9. 9.

   Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la identificación de una proteína amilolítica.

10. 10.

    Utilización de un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 7 u 8, para la identificación y/u obtención de una nueva amilasa.

11. 11.

    Vector que contiene una región de ácido nucleico indicada en las reivindicaciones 7 u 8.

12. 12.

    Vector de clonación, según la reivindicación 11.

13. 13.

    Vector de expresión, según la reivindicación 11.

14. 14.

    Célula huésped que expresa una de las proteínas, en forma recombinante, indicadas en las reivindicaciones 1 a 6 o que puede ser estimulada a su expresión utilizando un vector de expresión, en forma recombinante, según la reivindicación 13.

15. 15.

    Célula de huésped, según la reivindicación 14, caracterizada porque es una bacteria, en especial una bacteria que segrega la proteína generada al medio circundante.

16. 16.

    Célula huésped, según la reivindicación 15, caracterizada porque es una bacteria gram-positiva.

17. 17.

    Célula huésped, según la reivindicación 16, caracterizada porque pertenece al género Bacillus, preferentemente a las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

18. 18.

    Célula huésped, según la reivindicación 15, caracterizada porque es una bacteria gram-negativa.

19. 19.

    Célula huésped, según la reivindicación 18, caracterizada porque pertenece al género Escherichia, preferentemente a la especie Escherichia coli, muy preferente a una de las cepas E. Coli JM 109, E. Coli DH 100B o

    E. Coli DH 12S.

20. 20.

    Célula huésped, según la reivindicación 14, caracterizada porque es una célula eucariota, en especial una que modifica de forma postranslacional la proteína generada.

21. 21.

    Procedimiento para la obtención de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, utilizando un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 7 u 8, y/o utilizando un vector, según una de las reivindicaciones 11 a 13, y/o utilizando una célula huésped, según una de las reivindicaciones 14 a 20, o utilizando una célula que genera ésta de forma natural.

22. 22.

    Agente de lavado o limpieza, caracterizado porque contiene una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a

23. 6.

24. 23.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricación de textiles, en especial para el desencolado de algodón.

25. 24.

    Procedimiento para la licuación de almidón, en especial para la producción de etanol, caracterizado porque se utiliza una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6.

26. 25.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la obtención de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta.

27. 26.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la hidrólisis de ciclodextrinas.

28. 27.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de portadores de polisacáridos o ciclodextrinas.

29. 28.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de alimentos y/o ingredientes alimentarios.

30. 29.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de piensos para animales y/o ingredientes de piensos.

31. 30.

    Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la disolución de uniones pegadas que contienen almidón.

32. 31.

    Procedimiento de pegado temporal, caracterizado porque se utiliza una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6.