JP4741186B2 - 変更された生成物生産性を有するユーバクテリアrna−ポリメラーゼ変異体 - Google Patents
変更された生成物生産性を有するユーバクテリアrna−ポリメラーゼ変異体Info
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Description
本発明は、同一の条件下で増殖された同遺伝子系親株における同じ生成物の生成に比較して、注目の生成物の変更された生成を提供するrpoB−遺伝子によりコードされるRNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換をもたらす少なくとも1つの突然変異を含んで成る変異体ユーバクテリア(Eubacteria)に関する。本発明のもう1つの観点は、変異体ユーバクテリアにおいて少なくとも1つの注目の生成物を生成するための方法、及び少なくとも1つの注目の生成物を生成するためへの本発明の変異体ユーバクテリアの使用に関する。
最も研究された細菌RNA−ポリメラーゼは、E. コリRNA−ポリメラーゼであり、そしてそれは、多くの細菌属、例えばサルモネラ(Salmonella)、セラチア(Serratia)、プロテウス(Proteus)、アエロバクター(Aerobacter)及びバチルス(Bacillus)から単離された酵素の代表である(Fukudaなど., 1977, Mol. Gen. Genet. 154:135)。
リファンピシンは、β−サブユニットに結合し、そしてインビトロ及びインビボで酵素によるRNA鎖の生成開始を完全に阻止する(Wehrli and Staehelin, 1971, Bact. Rev. 35: 290)。細胞は、薬剤を結合しない変更されたβサブユニットによってリファンピシンに対する耐性を獲得する。
第3の観点においては、本発明は、少なくとも1つの注目の生成物を生成するためへの本発明の変異体ユーバクテリアの使用に関し、ここで適切な培地において前記変異体ユーバクテリアを培養し、それにより、前記生成物を生成することを含んで成る。
本発明の特定の態様の議論の前、本発明の主要観点に関連する特定の用語の定義が提供される。本明細書及び特許請求の範囲においては、ヌクレオチドについての従来の1文字コード及びアミノ酸残基についての従来の1文字及び3文字コードが使用される。参照を容易にするために、次の命名法が使用される:
元のアミノ酸 位置 置換されたアミノ酸:
この命名法によれば、及び例によれば、位置30でのアスパラギンによるアラニンの置換は、下記のように示され:
Ala30Asn又はA30N
Ala30* 又はA30*
そして追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は下記のように示される:
Ala30AlaLys又はA30AK。
アミノ酸残基30−33により例示される、保存性アミノ酸残基範囲の欠失は、(30-33)*として示される。
*36Asn又は*36N。
複数の突然変異は、下記のように“+”の記号により分離され:
Ala30Asn+Glu34Ser又はA30N+E34S
ここでそれは、それぞれアスパラギン及びセリンがアラニン及びグルタミン酸により位置される位置30及び34での置換を表す。
1又は複数のどちらかのアミン酸残基が所定の位置で挿入される場合、これは下記のように示される:
A30N, E、あるいはA30H又はA30E。
変異体ユーバクテリア:用語“変異体ユーバクテリア”とは、本明細書においては、RNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける5種の特許請求された位置の少なくとも1つの位置に突然変異を得ている別の同遺伝子系親ユーバクテリアを意味する。
β−サブユニット:用語“β−サブユニット”とは、本明細書においては、rpoB遺伝子によりコードされるRpoB−タンパク質を意味し、そしてこのサブユニットは、2:1:1の比でのα、β、β’サブユニットから構成され、そしてそれぞれ遺伝子rpoA, rpoB及びrpoCによりコードされるRNA−ポリメラーゼに含まれる。
rpoB−遺伝子:用語“rpoB−遺伝子”とは、本明細書においては、RNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットをコードスル遺伝子を意味する。
同等の位置:用語“同等の位置”とは、本明細書においては、図1及び例3にまた示されるように、配列番号2の位置461−500のセグメントとの一列整列後の位置を意味する。
外因性:用語“外因性”とは、本明細書においては、例えば、遺伝子が天然においては、通常、宿主生物に存在しないことを意味する。
内因性:用語“内因性”とは、本明細書においては、例えば宿主生物内に起因することを意味する。
コード配列:用語“コード配列”とは、本明細書において使用される場合、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列を包含することを意図する。コード配列の境界は一般的に、ATG開始コドンにより通常開始する読み取り枠により決定される。そのコード配列は典型的には、DNA、cDNA及び組換えヌクレオチド配列を包含する。
発現ベクター:用語“発現ベクター”とは、本明細書においては、本発明のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成り、そしてその転写を提供する追加のセグメントに操作可能に連結される、線状又は環状DNA分子を包含する。
宿主細胞:用語“宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、核酸構造体による形質転換に対して敏感であるいずれかの宿主細胞型を包含する。
リファンピシン耐性をもたらすE. コリ突然変異は、上記で論じられたように多面性効果を示す。E. コリにおいては、この耐性は、タンパク質の3種の別々の領域内に位置するrpoB遺伝子における点突然変異による(Jin and Gross, 1988, J. Mol. Biol. 202: 45-58)。いくつかの報告される事例においては、突然変異はまた、変更されたレベルの特定タンパク質をもたらす。配列決定されている、異なった細菌からの既知のrpoB遺伝子の中で、高い程度の相同性が見出された。
単離された変異体の分析は、B. リケニルホルミス(B. licheniformis)及びB. クラウジ(B. clausii)におけるリファンピシン耐性がrpoB遺伝子における点突然変異のためであることを示しており、そしてさらに、例4及び5に示されるような興味ある特定の生成物の製造の上昇を確実にもたらす特定の突然変異が同定された。
RpoBタンパク質における5種の特定位置の1つにおける1つのアミノ酸の単一置換が注目の生成物の改良された製造をもたらすほとんどの場合、複数の特定の突然変異の組合せの相乗効果が存在する。
単離された変異体のDNA配列から、少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸置換をもたらし、そして注目の生成物の改良された製造を提供するいくつかの特定の突然変異が同定されている。従って、1つの態様においては、本発明は、上記に記載されるように、rpoB−遺伝子によりコードされるRNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換に関し、ここで少なくとも1つのアミノ酸の少なくとも1つの置換はQ469R, A478D, A478V, H482R, H482P, R485H, 又は S487Lを含んで成り、ここで位置は配列番号2と一列整列される場合、それらのβ−サブユニットのその同等の位置に対応する。
本発明の単離された細菌は、上記で言及された比での3種のサブユニットα、β及びβ’から構成されるRNA−ポリメラーゼを含んで成り、そして前記β−サブユニットのアミノ酸配列は配列番号2の位置461〜500からのRpoBタンパク質の配列と一列を整列され得、そして少なくとも75%の相同性をもたらす40個のアミノ酸の連続配列を含んで成る。
いくつかの細菌属、例えばエスシェリシア(Escherichia), サルモネラ(Salmonella)、ネイセリア(Neiseria)及びシュードモナス(Pseudomonas) におけるいくつかのグラム−陰性細菌においては、B. リケニホルミス(配列番号2)における位置478に対応する同等の位置は、図1から明らかなように、アラニン(A)の代わりに、通常セリン(S)であり、ここでB. リケニホルミスからの配列番号2における位置461〜500からのアミノ酸セグメントが種々の細菌からのRpoB−タンパク質の公開された配列と一列整列されている。
従って、例えばA478D又はA478Vからの位置478でのアミノ酸の本発明の置換、又はA478のランダム置換はまた、本発明においては、S478D又はS478V、又はS478のいずれかのランダム置換を含んで成るべきである。
本発明のさらなる態様においては、前記細菌は、バチルス・リケニホルミスである。
本発明によれば、注目の生成物は、遺伝子生成物又は代謝経路の生成物を含んで成り、その生成物はrpoB−遺伝子によりコードされるRNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸の少なくとも1つの置換の結果として改良される。
2種の遺伝子の組込みは、WO91/09129号及びWO91/14968号(Novo Nordisk)(それらの内容は、引用により本明細書に組み込まれる)に記載されている。良好な安定性を達成するために逆平衡のダンデムに密接した間隔での2種の遺伝子の組込みが、WO99/41358号(Novo Nordisk)(その内容は引用により本明細書に組み込まれる)に記載されており、そして遺伝子の安定した染色体複コピー組込みがWO02/00907号(Novo zymes A/S)(この内容は引用により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
従って、さらなる態様においては、本発明は、上記に定義されるような単離された変異体ユーバクテリアに関し、ここで前記注目の生成物をコードする遺伝子は、組込みの部位で、いずれの抗生物質耐性マーカー遺伝子も残さないで、その変異体ユーバクテリア宿主染色体上に組み込まれる。
興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中への挿入の前、ヌクレオチド配列の操作は、所望には、又は必要には、発現ベクターに依存する。組換えDNA方法を用いてのヌクレオチド配列の修飾技法は、当業界において良く知られている。
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
本発明はまた、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々のヌクレオチド及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター(その複製は染色体複製には無関係である)、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする1又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、1つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと)。
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明のヌクレオチド配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
好ましい態様は、第1の観点の変異体に関し、ここで注目の生成物は、ポリペプチド、ビタミン、アミノ酸、抗生物質、炭水化物又は界面活性剤を含んで成り;好ましくは、注目の生成物はポリペプチド、好ましくは酵素であり;さらにより好ましくは、酵素は、オキシドレダクターゼ(EC1)、トランスフェラーゼ(EC2)、ヒドロラーゼ(EC3)、リアーゼ(EC4)、イソメラーゼ(EC5)及びリガーゼ(EC6)である。
本発明の特定の突然変異は、宿主細胞において存在する場合、注目の生成物の変更された製造をもたらす。その変更された製造は、上記で定義されたように、改良された収率又は改良された生産性であり得る。
本発明の宿主細胞は、適切な栄養培地において、所望するポリペプチドの生成を可能にする条件下で培養され、この後、得られるポリペプチドが任意には、細胞、又は培養ブイヨンから回収される。
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除)、電気泳動方法(例えば、分離用等電気泳動(IEF))、示差溶解性(硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出により精製され得る(例えば、Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと)。
本発明の第2の観点は、適切な培地において本発明の第1の観点のいずれかの態様に定義されるような変異体ユーバクテリアを培養し、それにより、前記生成物を生成することを含んで成る、変異体ユーバクテリアにおいて興味ある少なくとも1つの生成物を生成するための方法に関する。培養のための適切な培地、及び本発明の方法に対する任意の追加の段階である生成された生成物の精製又は単離方法は、上記に記載される。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により、栄養培地から回収され得る。
本発明は、次の例によりさらに例示されるが、それらは本発明を制限するものではない。前述の記載及び次の例に開示される特徴は、別々に及びそれらのいずれかの組合せで、それらの種々の形で本発明を実現するための材料であり得る。
バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)からのrpoB遺伝子のDNA配列を、標準技法により、B. リケニホルミス染色体DNAのフラグメントクローンから決定した。B. リケニホルミスのクローンを含むプラスミドライブラリーを、ATCC14580から得た。そのDNA配列は、配列番号1で示される。
配列番号1でのDNA配列の読取り枠から翻訳されるようなB. リケニホルミスRpoBタンパク質は、配列番号2で示される。
配列番号2における位置461〜500からのB. リケニホルミスRpoBタンパク質の40個のアミノ酸セグメントを、種々の細菌からのRpoBタンパク質の公開された配列に対するBLAST調査に使用した。その一列整列は、上部でのB. リケニホルミスRpoB配列と共に、図1に示される。
材料及び方法:
発現カセットを、WO91/09129号及びWO99/41358号に記載されるように、下記菌株の染色体中に1又は複数のコピーで組み込んだ。
JA677:その内因性α−アミラーゼの変異体を過剰生産するAB. リケニホルミス(BLA)。
JA678:アミノ酸変更Q469RをもたらすrpoBにおける突然変異を有するJA677。
JA688:B. ステアロサーモフィラスα−アミラーゼの変異体を過剰生成するAB. リケニホルミス(BSG)。
JA688:アミノ酸変更Q469RをもたらすrpoBにおける突然変異を有するJA688。
JA690:アミノ酸変更H482RをもたらすrpoBにおける突然変異を有するJA688。
JA684:B. アミロリケファシエンスα−アミラーゼを過剰生成するAB. リケニホルミス(BAN)。
SJ4671:その内因性α−アミラーゼを過剰生成するAB. リケニホルミス(BLA)。
SJ4671rif10:アミノ酸変更A478VをもたらすrpoBにおける突然変異を有するSJ4671。
SJ4490:その内因性α−アミラーゼを過剰生成するAB. リケニホルミス。
JA675:アミノ酸変更Q469R及びR485HをもたらすrpoBにおける突然変異を有するSJ4490。
SJ6129:バチルスα−アミラーゼの変異体を過剰生成するAB. リケニホルミス(WO00/60060号に開示する);(訂正−実際の内部参照番号はSJ6093である)。
SJ6129rif10:アミノ酸変更S487LをもたらすrpoBにおける突然変異を有するSJ6129(SJ6093)。
LB寒天:カゼインからの10g/Lのペプトン;5g/Lの酵母抽出物;10g/Lの塩化ナトリウム;pH6.8−7.2に調節された12g/LのBacto−寒天。50KANを有するLB寒天:50mg/Lのカナマイシンを有するLB−寒天。M−9緩衝液(脱イオン水が使用される):8.9g/Lのリン酸水素二ナトリウム・2H2O;3g/Lのリン酸二水素カリウム;4g/Lの塩化ナトリウム;0.2g/Lの硫酸マグネシウム・7H2O。
最初に、菌株を、37℃で1日、寒天スラント上で増殖した。(SJ4671; SJ4671rif10 ; SJ4490; JA675についてのLB−寒天、JA 677; JA 678; JA 688; JA 689; JA 690; JA684; JA687についての50KANを有するLB)。次に、寒天をM-9緩衝液により洗浄し、そして得られる細胞懸濁液の650nmでの光学密度(OD650nm)を測定した。
バチルス・クラウジからのrpoB遺伝子の一部のDNA配列を、標準技法により、B. クラウジ染色体DNAのフラグメントを含むプラスミドクローンから決定した。B. クラウジクローンを含むプラスミドライブラリーを、NCIB10309から得た。そのDNA配列の一部が配列番号3で示される。
配列番号3でのDNA配列の読み取り枠から翻訳されるようなB. クラウジRpoBタンパク質が配列番号4で示される。
配列番号2における位置461〜500に示されるB. リケニホルミスからのRpoBに対して相同且つ位置において相当する、配列番号4の位置462〜501に示されるB. クラウジRpoBの40個のアミノ酸セグメントを、異なった細菌からのRpoBタンパク質の公開された配列に対するBLAST研究に使用した。その一列整列は、上部でのB. リケニホルミスRpoB配列及び前記上部配列の下の列のB. クラウジと共に図1に示される。
材料及び方法:
発現は、生来の発現システムから行われた。
NCIB10309:AB. クラウジ(その内因性プロテアーゼを生成する、BCP)。
PP143:配列番号2における位置461〜500に示されるB. リケニルホルミスのRpoBに対して相同である、配列番号4における位置462〜501に示されるB. クラウジRpoBの40個のアミノ酸セグメントをコードするDNA−領域における突然変異を有さない、B. クラウジNCIB10309の従来の変異体。
NN49201:配列番号4における位置462〜501に示される40個のアミノ酸セグメント内のコードされるRpoBにおける置換A479DをもたらすrpoB−遺伝子のおける突然変異を有するPP143。配列番号4における置換A479Dは、図1における一列整列の2種の上部列から明確に見出されるように、配列番号2における同等の置換A478Dに対応する。
寒天:B. クラウジの良好な増殖を支持するための適切な寒天、例えばB3−寒天。6g/Lのペプトン;4g/Lのペプチカーゼ;3g/Lの酵母抽出物;1.5g/Lの肉抽出物;1g/Lのグルコース・1H2O;20g/Lの寒天、脱イオン水の使用。NaOH/HClによりpHの7.35への調節;121℃で40分の滅菌の後、10%(v/v)の1MのNaHCO3(pH9)の添加、濾過による滅菌及び脱イオン水、10%(v/v)の脱脂粉乳の添加、120℃で40分間の滅菌。
M-9緩衝液(脱イオン水が使用される):8g/Lのリン酸水素二ナトリウム・2H2O;3g/Lのリン酸二水素カリウム;4g/Lの塩化ナトリウム;0.2g/Lの硫酸マグネシウム・7H2O。
最初に、菌株を、寒天スラント上で37℃で1日、増殖した。次に、寒天を、M−9緩衝液により洗浄し、そして得られる細胞懸濁液の660nmでの光学密度(OD660nm)を測定した。
個々の振盪フラスコを、OD650nm測定に基づいて、同じ量の細胞により接種する。ODxmlの細胞懸濁液の接種強度=0.1を、この場合に使用した。個々の菌株を、2個の振盪フラスコに接種した。それらの振盪フラスコを、300rpmで37℃でインキュベートし、そしてサンプルを、1,2及び3日後に採取した。pH、OD650nm及びプロテアーゼ活性を測定し、そして相対的活性を菌株当たり測定し、そして相対的活性を個々のrpoB変異体株について、親株について、親株に対して計算した。結果は表2に示される。rpoBにおけるそれらの3個の突然変異が酵素の生産性/収率に対して有意な効果を有することが、それらの結果から明白である。
Claims (9)
- 分泌される組換えポリペプチドの製造のための、rpoB−遺伝子によりコードされるRNA−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸の置換をもたらす少なくとも1つの変異を含んで成るバチルス細菌の変異体であって、前記少なくとも1つのアミノ酸の置換が、配列番号2におけるH482R、A478D、A478V、Q469R+R485H、もしくはS487Lのいずれかで、又はいずれかのRNA−ポリメラーゼβ−サブユニットファミリーメンバーにおける同等の位置に存在することを特徴とし、同じ条件下に培養した場合に、上記の変異を含まない親株に比べて高い前記組換えポリペプチドの生産性を示す変異体。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸の置換が、A478D又はA478Vを含んで成る請求項1に記載の変異体。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸の置換が、A478Vを含んで成る請求項1又は2に記載の変異体。
- 前記バチルス細菌が、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウジ(Bacillus clausii)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ラウタス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)及びバチルス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)から選択される請求項1〜3のいずれか1項記載の変異体。
- 前記細菌が、バチルス・リケニホルミスである請求項1〜4のいずれか1項記載の変異体。
- 前記分泌される組換えポリペプチドが酵素である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異体。
- 前記酵素が、オキシドレダクターゼ(EC1)、トランスフェラーゼ(EC2)、ヒドロラーゼ(EC3)、リアーゼ(EC4)、イソメラーゼ(EC5)及びリガーゼ(EC6)から成る酵素種類の群から選択された種類の酵素である請求項6に記載の変異体。
- 前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、マンナナーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る酵素活性の群から選択された活性を有する酵素である請求項6又は7に記載の変異体。
- 前記酵素が、アミラーゼである請求項6〜8のいずれか1項に記載の変異体。
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