MXPA97009472A - Alfa amilasa mutante - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a enzimas alfa-amilasas novedosas en las cuales uno o más residuos de asparagina están sustituidos con un aminoácido diferente o suprimido. Las enzimas alfa-amilasas descritas muestran funcionamiento de hidrólisis de almidón a pH bajo, estabilidad y perfiles de actividad alterados o mejorados.

Description

a-AMILASA MUTANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a a-amilasas que tienen caracteristicas de funcionamiento alterado. La presente invención también está dirigida a enzimas a-amilasas mutantes que tienen al menos un residuo de asparagina el cual está sustituido con un aminoácido diferente o suprimido, en donde la a-amilasa resultante exhibe funcionamiento de hidrólisis de almidón a pH bajo alterado, estabilidad alterada y perfiles de actividad alterados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las a-amilasas (a-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) hidrolizan los enlaces a-1, 4-glucosidicos internos en el almidón, en gran medida al azar, para producir maltodextrinas de peso molecular más bajo. Las a-amilasas son de considerable valor comercial, siendo usadas en las etapas iniciales (licuefacción) del procesamiento del almidón, en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices detergentes; y en la industria textil para desaprestar almidón. Las a-amilasa son producidas por una amplia variedad de microorganismos incluyendo Bacill us y Aspergill us, con las REF: 26223 amilasas más comerciales siendo producidas a partir de fuentes bacterianas tales como Bacill us li cheniformis, Bacill us amyloliquef aciens, Bacill us subtilis, o Bacill us stearothermophil us . En años recientes, las enzimas preferidas en uso comercial han sido aquellas de Bacill us licheniformi s debido a su estabilidad térmica y funcionamiento, al menos a pH neutro y moderadamente alcalino. En general, el procesamiento de almidón a fructosa consiste de cuatro pasos: licuefacción del almidón granular, sacarificación del almidón licuado en dextrosa, purificación e isomerización a fructosa. El objeto de un proceso de licuefacción de almidón es convertir una suspensión concentrada de granulos de polímero de almidón en una solución de dextrinas de longitud de cadena más corta, solubles, de baja viscosidad. Este paso es esencialmente para el manejo conveniente con el equipo estándar y para la conversión eficiente a glucosa u otros azucares. Para licuar el almidón granular, es necesario gelatinizar los granulos elevando la temperatura del almidón granular por encima de aproximadamente 72°C. El proceso de calentamiento rompe instantáneamente los granulos de almidón insoluble para producir una solución de almidón soluble en agua. La solución de almidón solubilizado es licuada entonces por la a-amilasa (EC 3.2.1.1.) .

Un proceso de licuefacción enzimática común implica ajustar el pH de una suspensión de almidón granular a entre 6.0 y 6.5, el pH óptimo de la a-amilasa derivada de Bacill us licheniformis, con la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio o carbonato de sodio. La adición de hidróxido de calcio tiene la ventaja de proporcionar también iones calcio los cuales se sabe estabilizan las a-amilasas contra la inactivación. Después de la adición de las a-amilasas, la suspensión es bombeada a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura a entre 80-115°C. El almidón se gelatiniza inmediatamente y, debido a la presencia de las a-amilasas, se despolimeriza a través de la hidrólisis aleatoria de los enlaces a(l-4) glicosidicos a una masa fluida la cual es fácilmente bombeada. En una segunda variación del proceso de licuefacción, la a-amilasa se agrega a la suspensión de almidón, la suspensión se mantiene a una temperatura de 80-100°C para hidrolizar parcialmente lo granulos de almidón, y la suspensión de almidón parcialmente hidrolizada se bombea a través de un chorro a temperaturas que exceden de aproximadamente 105°C para gelatinizar completamente cualquier estructura granular restante. Después de enfriar el almidón gelatinizado, puede hacerse una segunda adición de a-amilasa para hidrolizar aún más el almidón.

Una tercer variación de este proceso es el llamado proceso de molienda en seco. En la molienda en seco, todo el grano se tritura y combina con agua. El germen se remueve opcionalmente por separación por flotación o técnicas equivalentes. La mezcla resultante, la cual contiene almidón, fibra, proteina y otros componentes del grano, se licúa usando a-amilasa. La práctica general en la técnica es efectuar la licuefacción enzimática a una temperatura más baja cuando se usa el proceso de molienda en seco. De manera general, se cree que la licuefacción a baja temperatura es menos eficiente que la licuefacción a alta temperatura para convertir almidón a dextrinas solubles. Típicamente, después de la gelatinización la solución de almidón se mantiene a una temperatura elevada en presencia de a-amilasa hasta que se alcanza un ED de 10-20, usualmente un periodo de 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (ED) es el estándar de la industria para medir la concentración de azúcar reductores totales, calculada como D-glucosa en una base seca. El almidón granular no hidrolizado tiene un ED de virtualmente cero, mientras que el ED de la D-glucosa se define como 100. La temperatura máxima a la cual la solución de almidón que contiene a-amilasa puede mantenerse depende de la fuente microbiana de la cual la enzima se obtuvo y la estructura molecular de molécula de a-amilasa. Las a-amilasas producidas por cepas naturales de Bacill us subtilis o Bacill us amyl oliquef aci ens se usan típicamente a temperaturas no mayores de aproximadamente 90°C debido a la inactivación térmica excesivamente rápida por encima de esa temperatura, mientras que las a-amilasas producidas por cepas naturales de Bacill us li cheniformis pueden usarse a una temperatura de hasta aproximadamente 110°C. Se sabe que la presencia de almidón e ion calcio estabiliza las a-amilasas contra la inactivación. No obstante, las a-amilasas se usan a valores de pH por encima de 6 para protegerlas contra una rápida inactivación. Se sabe que a bajas temperaturas, la a-amilasa de Bacill us licheniformis presenta actividad hidrolizante sobre el sustrato de almidón a valores de pH tan bajos como 5. Sin embargo, cuando la enzima se usa para la hidrólisis del almidón a temperaturas de chorro comunes, por ejemplo, entre 102°C y 109°C el pH debe mantenerse por encima de al menos un pH de 5.7 para evitar la inactivación excesivamente rápida. El requerimiento de pH desafortunadamente proporciona una ventana de oportunidad de procesamiento estrecha debido a que los valores de pH por encima de 6 dan como resultado subproductos indeseables, por ejemplo, maltulosa. Por lo tanto, en realidad, el pH de licuefacción se mantiene generalmente entre 5.9 y 6.0 para lograr un rendimiento satisfactorio del almidón hidrolizado.

Otro problema relacionado con el pH de licuefacción es la necesidad de elevar el pH de la suspensión de almidón de aproximadamente 4, el pH de una suspensión de almidón de maíz como viene de la etapa de molienda en húmedo, a 5.9-6.0. Este ajuste del pH requiere la adición costosa de productos químicos que neutralicen el ácido y también requiere un refinamiento por intercambio iónico adicional del producto de conversión del almidón final para remover el producto químico. Además, el paso de proceso siguiente después de la licuefacción, típicamente la sacarificación del almidón licuado en glucosa con glucoamilasa, requiere un pH de 4-4.5; por lo tanto, el pH puede ser ajustado hacia abajo de 5.9-6.0 a 4-4.5; requiriendo la adición de productos químicos y el paso de refinamiento adicionales. Después de la licuefacción, el almidón procesado es sacarificado a glucosa con glucoamilasa. Ocurre un problema con los procesos actuales cuando está presente almidón residual en la mezcla de sacarificación debido a una licuefacción incompleta del almidón, por ejemplo, hidrólisis de amilosa ineficiente por la amilasa. El almidón residual es altamente resistente a la hidrólisis por glucoamilasa. Esto representa una pérdida de rendimiento e interfiere con la filtración corriente abajo de los jarabes.

Adicionalmente, se sabe que muchas a-amilasas requieren la adición de ion calcio para su estabilidad. Esto incrementa aún más el costo de la licuefacción En la Patente Estadounidense No. 5,322,778, se logró la licuefacción entre un pH de 4.0 y 6.0 mediante la adición de un antioxidante tal como el bisulfito o sal del mismo, ácido ascórbico o una sal del mismo, ácido eritórbico, o antioxidantes fenólicos tales como el hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o a-tocoferol a la suspensión de licuefacción. De acuerdo a esta patente, el bisulfito de sodio debe agregarse en una concentración mayor de 5 mM. En la Patente Estadounidense No. 5,180,669, se logró la licuefacción entre un pH de entre 5.0 a 6.0 mediante la adición de ion carbonato en exceso con respecto a la cantidad necesaria para amortiguar la solución a la suspensión de almidón triturado. Debido al efecto del pH incrementado que ocurre con la adición del ion carbonato, la suspensión se neutraliza generalmente agregando una fuente de ion hidrógeno, por ejemplo, un ácido inorgánico tal como el ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. En la Publicación PCT No. WO 94/02597, se describe una a-amilasa mutante que tiene estabilidad oxidativa mejorada en donde una o más metioninas son reemplazadas por cualquier aminoácidos excepto cisteína o metionina.

En la Publicación PCT No. WO 94/18314, se describe una a-amilasa mutante que tiene estabilidad oxidativa mejorada en donde uno o más de los residuos de metionina, triptófano, cisteína, histidina o tirosina está reemplazado con un aminoácido no oxidable. En la Publicación PCT No. WO 91/00353, las características de funcionamiento y problemas asociados con la licuefacción con a-amilasa de Bacill us licheniformis natural se trataron modificando genéticamente la a-amilasa para que incluyera las sustituciones específicas Ala-lll-Thr, His-133-Tyr y/o Thr-149-lle. Han sido conducidos estudios usando técnicas de ADN recombinante para explorar cuáles residuos son importantes para la actividad catalítica de las amilasas y/o para explorar el efecto de modificar ciertos aminoácidos dentro del sitio activo de varias amilasas y glicosilasas por varios investigadores (Vihinen et al., J. Biochem., vol. 107, pp. 267-272 (1990); Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, pp. 181-191 (1990); Takase et al., Biochemica et Biophysica Acta, vol. 1120, pp. 281-288 (1992); Matsui et al., Febs Letters, vol. 310, pp. 216-218 (1992); Matsui et al., Biochemistry, vol. 33, pp. 451-458 (1992); Sogaard et al., J. Biol. Chem., vol. 268, pp. 22480-22484 (1993); Sogaard et al., Carbohydrate Polymers, vol. 21, pp . 137-146 (1993); Svensson, Plant Mol. Biol., vol. 25, pp. 141-157 (1994); Svensson et al., J. Biotech. vol. 29, pp. 1-37 (1993)). Los investigadores también han estudiado cuáles residuos son importantes para la estabilidd térmica (Suzuki et al., J. Biol. Chem. vol. 264, pp. 18933-18938 (1989); Watanabe et al., Eur. J. Biochem. vol. 226, pp. 277-283 (1994)); y un grupo ha usado tales métodos para introducir mutaciones en varios residuos de histidina en una amilasa de Bacill us licheniformis, el razonamiento es que la amilasa de Bacillus licheniformis que se sabe es relativamente termoestable cuando se compara con otras amilasas de Bacill us • similares, tiene un exceso de histidinas y, por lo tanto, se sugirió que reemplazar una histidina podría afectar la termoestabilidad de la enzima. Este trabajo dio como resultado la identificación de mutaciones estabilizadoras en el residuo de histidina en la posición +133 y el residuo de alanina en la posición +209 (Declerck et al., J. Biol. Chem., vol. 265, pp. 15481-15488 (1990); FR 2 665 178-A1; Joyet et al., Bio/Technology, vol. 10, pp. 1579-1583 (1992)). A pesar de los avances hechos en la técnica anterior, existe la necesidad de una a-amilasa que sea suficientemente efectiva a valores de pH bajos para permitir la licuefacción comercial a un pH más bajo del que es actualmente práctico. De manera similar, existe la necesidad en la técnica de un método el cual permita la licuefacción eficiente de granos molidos en seco a altas temperaturas.

Además, existe la necesidad en la técnica de un método que permita la licuefacción eficiente del almidón con menos dependencia de la adición costosa de calcio. Adicionalmente, existe la necesidad de una enzima más eficiente para efectuar una hidrólisis más completa del almidón en la etapa de licuefacción para asegurar una sacarificación eficiente. Debido a que las amilasas comercialmente disponibles no son aceptables bajo muchas condiciones debido a problemas de estabilidad, por ejemplo, los altos niveles de alcalinidad y oxidante (blanqueador) asociados con los detergentes, existe la necesidad de una amilasa que tenga perfiles de funcionamiento bajo tales condiciones alterados, y preferiblemente mejorados. De este modo, las características de funcionamiento alteradas, tales como mayor actividad, termoestabilidad, estabilidad al pH, estabilidad oxidativa o estabilidad al calcio que puedan lograrse alterando, manteniendo o incrementando también a la vez la actividad enzimática en comparación con el tipo de enzima precursora, podría ser deseable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que tenga perfiles de funcionamiento alterados, tal como estabilidad al pH, estabilidad alcalina, estabilidad oxidativa o actividad enzimática. Un objeto más de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que tenga mayor estabilidad en ausencia del ion calcio agregado durante la licuefacción del almidón. Un objeto más de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que tenga estabilidad a bajo pH alterada para usarse en la licuefacción a pH bajo eficiente. Un objeto aún más de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que permita la licuefacción eficiente de granos molidos en seco a altas temperaturas. Un objeto aún más de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que sea útil en ambientes de pH alto o en presencia de oxidantes o blanqueadores. Un objeto aún más de la presente invención es proporcionar una a-amilasa que efectúe una hidrólisis más completa de las moléculas de almidón para incrementar la eficiencia de la sacarificación. De acuerdo a la presente invención, se proporciona una a-amilasa que es el producto de la expresión de una secuencia de ADN mutante que codifica para una a-amilasa, la secuencia de ADN mutante se deriva de una a-amilasa precursora por la supresión o sustitución de uno o más residuos que tiene el efecto de mejorar el funcionamiento de los residuos de a-amilasa. De manera preferible, el residuo suprimido o sustituido es un residuo de asparagina, de manera más preferible en una posición que corresponde al N188 en Bacill us licheniformis . En donde se desea alterar la termoestabilidad de la a-amilasa, la sustitución de la asparagina puede ser cualquier otro aminoácido, incluyendo cualquiera de los 20 aminoácidos naturales. De manera preferible, la sustitución que corresponde al N188S o N188T en Bacill us licheniformis . También, de manera preferible, la a-amilasa comprende además la supresión o sustitución de un residuo de metionina o triptófano, particularmente en una posición que corresponde a la M15, W138 y/o M197, o en un residuo que corresponde a la V128, H133, S187 y/o A209 en Bacill us licheniformis . En una modalidad más preferida, se proporciona una a-amilasa que comprende sustituciones en los residuos que corresponden a la M15L/N188S o M15T/N188S en Bacillus licheniformis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra los oligonucléotidos mutagénicos útiles durante la mutagénesis dirigida de Asnl88 de la a-amilasa de Bacill us licheniformis . En esta y en las figuras siguientes que ilustran los constructos oligonucleotídicos, las letras negritas indican los cambios de base introducidos por el oligonucléotido y el subrayado indica lo sitios de endonucleasa de restricción introducidos por el oligonucléotido. La Figura 2 ilustra los cebadores de PCR usados para procesar por PCR los patrones oligonucleotídicos mutagénicos. La Figura 3 ilustra la secuencia de ADN del gen para la a-amilasa de Bacill us li cheniformis (NCIB 8061) (SEQ. ID. NO: 33) y la secuencia de aminoácidos deducida del producto de la traducción (SEQ. ID. NO: 1) de acuerdo a lo descrito por Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, pp. 635-643 (1986). La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. NO: 34) de la enzima a-amilasa madura de Bacill us licheniformis . La Figura 5 ilustra la alineación de las estructuras primarias de tres a-amilasas de Bacill us . La a-amilasa de Bacill us licheniformi s (Am-lich) (SEQ ID NO: 35) es descrita por Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, pp. 635-643 (1986); la a-amilasa de Bacill us amyloliquef aciens (Am-Amylo) (SEQ. ID. NO:36) es descrita por Takkinen et al., J.

Biol. Chem., vol. 258, pp. 1007-1013 (1983); y la a-amilasa de Bacill us stearothermophil us (Am-Stearo) (SEQ. ID. NO: 37) es descrita por Ihara et al., J. Biochem., vol. 98, pp. 95-103 (1985) . La Figura 6 ilustra el plásmido pHP13 en donde CmR se refiere a la resistencia al cloranfenicol, EmR se refiere a la resistencia a la eritromicina y Rep pTA1060 se refiere al origen de duplicación o reproducción del plásmido pTA1060. La Figura 7 ilustra el plásmido pBLapr en donde BL AA se refiere al gen de la a-amilasa de Bacill us licheniformis, aprE se refiere al promotor y al péptido de señal que codifica para la región del gen aprE; AmpR se refiere al gen de resistencia a la ampicilina del pBR322; y CAT se refiere al gen de la resistencia al cloranfenicol del pC194. La Figura 8 ilustra el plásmido pHP.BL que contiene el gen de la a-amilasa de Bacill us licheniformis . La Figura 9 ilustra un esquema del método de PCR usado para producir los oligonucléotidos mutantes que corresponden a la a-amilasa derivada de Bacill us licheni formi s . La Figura 10 ilustra una gráfica derivada de un análisis estadístico de enzimas variantes de acuerdo a la invención, M15T/N188S, comparadas con la a-amilasa de Bacill us licheniformi s natural en la licuefacción de almidón a 107°C, 60 ppm de calcio y pH variable. La Figura 11 ilustra una gráfica derivada de un análisis estadístico del funcionamiento de una enzima variante de acuerdo a la invención, M15T/N188S, comparada con la a-amilasa de Bacill us licheniformis natural en la licuefacción del almidón a 107°C, pH 6.0 y concentraciones de calcio variables. La Figura 12 ilustra una gráfica derivada de un análisis estadístico del funcionamiento de una enzima variante de acuerdo a la invención, M15T/N188S, comparada con la a-amilasa de Bacill us licheniformis en la licuefacción de almidón a pH 6.0, 60 ppm de calcio y temperatura variable. La Figura 13 ilustra las uniones de la secuencia de señal-proteína madura en la a-amilasa derivada de Bacillus li cheniformis (SEQ. ID. NO:38), aprE de Bacill us subtilis (SEQ. ID. NO: 39) y Bacill us licheniformis en pBLapr (SEQ. ID.

NO: 40 ) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN "a-Amilasa" significa una actividad enzimática la cual rompe o hidroliza el enlace a(l-4) glicosídico, por ejemplo, .que se encuentra en los polímeros de almidón, amilopectina o amilosa. La a-amilasa como se usa aquí incluye a las a-amilasas naturales así como a las a-amilasas recombinantes. Las a-amilasas preferidas en la presente invención son aquellas derivadas de Bacill us licheniformis , Bacill us amyloliquef aciens o Bacill us stearothermophil us, así como las a-amilasas fúngales tales como aquellas derivadas de Aspergill us (es decir, A. oryzae y A. niger) . "a-Amilasa recombinante" significa una a-amilasa en la cual la secuencia de ADN que codifica para la a-amilasa natural se modificó para producir una secuencia de ADN mutante que codifica para la sustitución, inserción o supresión de uno o más aminoácidos en la secuencia de la a-amilasa comparada con la a-amilasa natural. "Vector de expresión" significa un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN la cual está ligada de manera operable a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de tal ADN en un huésped adecuado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión ribosomales de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Un promotor preferido es el promotor aprE de Bacill us subtili s . El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede reproducirse y funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede, en algunos casos, integrarse al genoma en sí. En la presente especificación, plásmido y vector se usaron algunas veces de manera intercambiable, puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de un vector hasta ahora. Sin embargo, la invención pretende incluir aquellas otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se conocen, o están, dentro de la técnica. "Cepa huésped" o "célula huésped" significa un huésped adecuado para un vector de expresión que comprende el ADN que codifica para la a-amilasa de acuerdo a la presente invención. Las células huésped útiles en la presente invención son generalmente huéspedes procarióticos o eucarióticos, incluyendo cualquier microorganismo transformable en el cual la expresión de la a-amilasa de acuerdo a la presente invención puede lograrse. Específicamente, las cepas huésped de las mismas especies o género de las cuales la a-amilasa se deriva son adecuadas, tales como una cepa de Bacill us . De manera preferible, se usa una cepa de Bacill us negativa a la a-amilasa (con genes suprimidos) y/o una cepa de Bacill us con a-amilasa y proteasas suprimidas (ÁamyE, Aapr, Anpr) . Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos usando las técnicas del ADN recombinante. Tales células huésped transformadas son capaces de reproducir los vectores que codifican para la a-amilasa y sus variantes (mutantes) o expresar la a-amilasa deseada. "Licuefacción" o "licuación" significa un proceso mediante el cual el almidón es convertido a dextrinas de cadena más corta y menos viscosas. De manera general, este proceso implica la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguida por la adición de a-amilasa. De acuerdo a la presente invención, se proporciona una a-amilasa que es el producto de expresión de una secuencia de ADN mutante que codifica para una a-amilasa, la secuencia de ADN mutante se deriva de una a-amilasa precursora por la supresión u sustitución de uno o más residuos de asparagina. También se proporciona una molécula de ácido nucleico (ADN) que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una parte de la a-amilasa proporcionada por la presente invención, sistema de expresión que incorporan tal ADN que incluyen vectores y fagos, células huésped transformadas con tal ADN, y hebras antisentido de ADN que corresponde a la molécula de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos. De manera similar, la presente invención incluye un método para producir una a-amilasa mediante la expresión del ADN incorporado en un sistema de expresión que ha sido transformado en una célula huésped. La a-amilasa de la invención puede ser usadas en la licuefacción del almidón, como un ingrediente en detergentes, en el procesamiento de alimentos, en el procesamiento de textiles, o en cualquier otra aplicación en la cual la actividad de la a-amilasa sea útil. Las a-amilasas de acuerdo a la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una a-amilasa precursora. Las a-amilasas precursoras incluyen a las a-amilasas naturales y las a-amilasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la a-amilasa mutante se deriva de la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa precursora por la sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es generalmente de la secuencia de ADN precursora que codifica para la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa precursora más que la manipulación de la enzima a-amilasa precursora per se . Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos descritos aquí y las Patentes Estadounidenses Nos. 4,760,025 y 5,185,258, comúnmente poseídas, incorporadas aquí como referencia. Las a-amilasas de acuerdo a la presente invención se derivan de una amilasa precursora. La a-amilasa precursora es producida por cualquier fuente capaz de producir a-amilasa. Las fuentes adecuadas de a-amilasas son los organismos procarióticos o eucarióticos, incluyendo los hongos, bacterias, plantas o animales. De manera preferible, la a-amilasa precursora es producida por un Bacill us; de manera más preferible por Bacill us licheniformis, Bacill us amyloliquef aciens o Bacill us stearothermophil us ; de manera más preferible, la a-amilasa precursora se deriva de Bacill us lich eni formis . Se han encontrado homologías entre casi todas las endo-amilasas secuenciadas a la fecha, incluyendo las de las plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol 23, pp 355-360 (1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 128, pp. 470-476 (1985); Janecek, Eur. J. Biochem., vol. 224. Pp. 519-524 (1994)). Existen cuatro áreas de homología particularmente alta en ciertas amilasas de Bacill us, como se muestra en la Figura 5, en donde las secciones subrayadas designan las áreas de alta homología. También han sido usadas las alineaciones de secuencia para trazar la relación entre las endo-amilasas de Bacill us (Feng et al., J. Molec. Evol., vol. 35, pp. 351-360 (1987)). La homología de secuencia relativa entre la amilasa de Bacill us stearothermophil us y Bacill us licheniformis es de aproximadamente el 66% y la de entre las amilasas de Bacill us licheniformis y Bacill us amyl oliquef aciens es de aproximadamente el 81%, de acuerdo a lo determinado por Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, No. 3. Pp. 181-191-(1990) . Aunque la homología de secuencia es importante, se reconoce de manera general que la homología estructural también es importante en la comparación de las amilasas u otras enzimas. Por ejemplo, se ha sugerido una homología estructural entre las amilasas fúngicas y la amilasa bacteriana y, por lo tanto, las amilasas fúngicas son abarcadas por la presente invención. Entre otros, los residuos que corresponden a los residuos de asparagina en la a-amilasa son identificados aquí para la supresión o sustitución. De este modo, residuos específicos tales como el N188 se refieren a el número de posición de un aminoácido (es decir, +188) el cual se refiere al número asignado a la secuencia de la a-amilasa de Bacill us li cheniformi s maduro ilustrado en la Figura 4. La invención sin embargo, no se limita a la mutación de la a-amilasa madura particular de Bacill us li cheniformi s sino que se extiende a las a-amilasas precursoras que contienen aminoácidos residuales en posiciones que son equivalentes al residuo particular identificado en la a-amilasa de Bacill us li cheniformi s . Un residuo de una a-amilasa precursora es equivalente a un residuo de a-amilasa de Bacill us licheniformis si es homólogo (es decir, corresponde en posición para cualquier estructura primaria o terciaria) o análogo a un residuo específico o porción de ese residuo en la a-amilasa de Bacill us licheniformis (es decir, que tiene la misma o una capacidad funcional para combinarse, reaccionar, o interactuar química o estructuralmente) . Para establecer la homología para la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa precursora se comparó directamente con la secuencia primaria de la a-amilasa de Bacill us licheniformis y particularmente con un conjunto de residuos que se sabe no varían en todas las a-amilasas para las cuales se conocen las secuencias (véase, por ejemplo, la Figura 7) . También es posible determinar residuos equivalentes por el análisis de la estructura terciaria de las estructuras cristalinas reportadas para la a-amilasa pancreática porcina (Buisson et al., EMBO Journal, vol. 6, pp. 3909-3916 (1987); Qian et al., Biochemistry, vol. 33, pp. 6284-6294 (1994); Larson et al., J. Mol. Biol., vol. 235, pp . 1560-1584 (1994)); Taka-amilasa A de Aspergill us oryzae (Matsuura et al., J. Biochem.

(Tokyo), vol. 95, pp. 697-702 (1984)); y una a-amilasa acida de A. niger (Boel et al., Biochemistry, vol. 29, 6244-6249 (1990)), con las dos primeras estructuras siendo similares, y para la a-amilasa de cebada (Vallee et al., J. Mol. Biol., vol. 236, pp. 368-371 (1994); Kadziola, J. Mol. Biol., vol. 239, pp. 104-121 (1994)). Aunque han sido publicados algunos estudios preliminares (Suzuki et al., J. Biochem., vol. 108, pp. 379-381 (1990); Lee et al., Arch. Biochem. Biophys, vol. 291, pp. 255-257 (1991); Chang et al, J. Mol. Biol., vol. 229, pp. 235-238 (1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol., vol. 234, pp. 122-1283 (1993) ) , únicamente existe una estructura publicada para la a-amilasa de Bacill us licheniformis (Machius et al., J. Mol. Biol. vol, 246, pp. 545-549 (1995)).

Sin embargo, varios investigadores han predicho estructuras supersecundarias comunes entre las glucanasas (MacGregor et al., Biochem. J., vol. 259, pp. 145-152 (1989)) y dentro de las a-amilasas y otras enzimas que metabolizan almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem. vol. 12, pp. 791-805 (1993); MacGregor, Starke, vol. 45, pp. 232-237 (1993)); y similitudes de secuencia entre enzimas con estructuras supersecundarias similares a las de las a-amilasas (Janecek, FEBS Latters, vol. 316, pp. 23-26 (1993); Janecek et al., J. Prot. Chem., vol. 12, pp. 509-514 (1993)). Se ha modelado una estructura para la enzima de Bacill us stearothermophil us sobre la de la Taka-a ilasa (Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, pp. 181-191 (1990)). Las cuatro regiones altamente conservadas mostradas en la Figura 7 contienen muchos residuos que se piensa son parte del sitio activo (Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo), vol. 95, pp. 697-702 (1984); Buisson et al., EMBO Journal, vol. 6, pp . 3909-3916 (1987); Vihinen et al., J. Biochem., vol. 107, pp. 267-272 (1990) incluyendo His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 y Asp +328 bajo el sistema de numeración para el Bacill us licheniformis. De manera preferible, el residuo de asparagina suprimido o sustituido se encuentra en una posición que corresponde a N18 en Bacill us licheniformis . En donde se desea alterar la termoestabilidad de la a-amilasa, la sustitución de la asparagina puede ser cualquier otro aminoácido, incluyendo cualquiera de los 20 aminoácidos naturales. De manera preferible, la supresión o sustitución corresponde a N188S o N188T en Bacill us licheniformi s . También, de manera preferible, la a-amilasa comprende además la supresión o sustitución de un residuo de metionina o triptófano. Las a-amilasas de acuerdo a la presente invención exhiben características de funcionamiento alteradas que proporcionan resultados deseables e inesperados que son útiles en varias aplicaciones para las cuales las a-amilasas son comúnmente usadas. Por ejemplo, las a-amilasas de acuerdo a la presente invención que exhiben características de funcionamiento alterado a pH bajo, incluyendo termoestabilidad mejorada, estabilidad al pH mejorada y/o estabilidad oxidativa mejorada, son útiles en la licuefacción del almidón a pH bajo. La termoestabilidad mejorada será útil para extender la vida de anaquel de los productos que las incorporen. La estabilidad oxidativa mejorada o el funcionamiento mejorado es particularmente deseable en los productos de limpieza, y para extender la vida de anaquel de la a-amilasa en presencia de los blanqueadores, perborato, percarbonato o perácidos usados en tales productos de limpieza. Por el contrario, la estabilidad térmica o estabilidad oxidativa reducida puede ser útil en procesos industriales que requieren una extinción rápida y eficiente de la actividad amilolítica. La a-amilasa de la presente invención es especialmente útil en el procesamiento del almidón y particularmente en la licuefacción del almidón. Las condiciones presentes durante los procesos de licuefacción comercialmente deseables incluyen de manera característica pH bajo, temperatura alta y condiciones de oxidación potenciales que requieren las a-amilasas exhiban funcionamiento a pH bajo me-j*orado, estabilidad térmica mejorada y estabilidad oxidativa mejorada. En consecuencia, las a-amilasas de acuerdo a la presente invención que son particularmente útiles en la licuefacción exhiben un funcionamiento mejorado a un pH menor de aproximadamente 6, de manera preferible menor de aproximadamente 5.5, y de manera más preferible de entre aproximadamente 5.0 y 5.5. De manera adicional, las a-amilasas de acuerdo a la presente invención que exhiben estabilidad térmica mejorada o aumentada a temperaturas de entre aproximadamente 80-120°C, y de manera preferible entre aproximadamente 100-110°C, y estabilidad mejorada o incrementada en presencia de oxidantes serán particularmente útiles. De manera preferible, las a-amilasas de acuerdo a la presente invención que se usan en la licuefacción, además de la supresión o sustitución de una asparagina, comprenden además una supresión o sustitución en uno o más residuos que corresponden a M15, V128, H133, W138, S187, M197 y/o A209 en Bacill us licheniformis . En una modalidad más preferida, la a-amilasa usada en la licuefacción del almidón de acuerdo a la presente invención comprende una supresión o sustitución que corresponde a la posición N188. De manera más preferible, la a-amilasa comprende una sustitución que corresponde a M15T/N188S, M15L/N188S, M15T/H133Y/N188S, M15T/H133Y/N188S/A209V, M15T/N188S/A209V, M15T/V128E/H133Y/ N188S, M15T/S187D/N88S, M15T/H133Y o M157/H133Y/A209V en Bacill us licheniformis . Pueden agregarse componentes adicionales conocidos por aquellos expertos en la técnica que son útiles en la licuefacción, incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, calcio, iones, sales u otras enzimas tales como las endoglicosidasa, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas amilasas dependiendo de las condiciones de reacción pretendidas. Por ejemplo, las combinaciones de la a-amilasa de acuerdo a la presente invención con las a-amilasas de otras fuentes pueden proporcionar perfiles de acción únicos que encuentran uso particular bajo condiciones de licuefacción específicas. En particular, se contempló que la combinación de la a-amilasa de acuerdo a la presente invención con la a-amilasa derivada de Bacill us stearothermophil us proporcionará una mejor licuefacción a valores de pH inferiores a 5.5 debido a los patrones de acción complementarios. Una modalidad preferida en donde el proceso implica la licuefacción o molienda en seco del almidón para la producción de etanol comprende una a-amilasa derivada de Bacill us stearothermophil us y a-amilasa de acuerdo a la presente invención que tiene una sustitución que corresponde a M15T/N188S o M15T/N18S en Bacill us lich eni formi s.

Durante la licuefacción, el almidón, especialmente suspensiones de almidón granular de cualquiera de un proceso de molienda en húmedo o en seco, se trata con una a-amilasa de la presente invención de acuerdo a las técnicas de licuefacción conocidas. De manera general, en el primer paso del proceso de degradación del almidón, la suspensión de almidón se gelatiniza calentando a una temperatura relativamente alta (de entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 110°C) . Después de que la suspensión de almidón se gelatiniza, se licúa usando una a-amilasa. En otra modalidad de la presente invención se proporcionan composiciones detergentes ya sea en forma líquida, de gel o granular, que comprenden la a-amilasa de acuerdo a la presente invención. Tales composiciones detergentes se beneficiarán particularmente de la adición de una a-amilasa de acuerdo a la presente invención la cual tiene estabilidad térmica mejorada o incrementada para mejorar la vida de anaquel o estabilidad mejorada incrementada, de modo que la a-amilasa tiene mejor resistencia al blanqueador, compuestos de perácido comúnmente presentes en los detergentes. De este modo, la a-amilasa de acuerdo a la presente invención puede ser formulada de manera ventajosa en detergentes pulverizados, líquidos o en gel conocidos que tienen un pH de entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 12.0. Una modalidad preferida de la presente invención comprende además la supresión o sustitución de un residuo de metionina o un residuo de triptófano, por ejemplo M15, M197 o W138 como se describe en las Solicitudes de Patentes Estadounidenses Nos. de Serie 08/289,351 y 08/409,771 comúnmente asignadas, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia; una sustitución en M133Y como se describe en la Publicación PCT No. WO91/00353; o una sustitución en A209 como se describe en DeClerck, et al., J. Biol. Chem., vol. 265, pp . 15481-15488 (1990).

También, de manera preferible, una a-amilasa de acuerdo a la presente invención usada en composiciones detergentes comprenden una supresión o sustitución en la posición N188.

Las composiciones detergentes que comprende la a-amilasa de acuerdo a la presente invención pueden incluir además otras enzimas tales como endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas amilasas, particularmente a-amilasa derivada de Bacill us stearothermophil us , así como ingredientes adicionales como es sabido de manera general en la técnica. Las modalidades de la presente invención que comprende una combinación de a-amilasa de acuerdo a la presente invención con enzimas proteasas preferiblemente incluyen proteasas estables oxidativamente tales como aquellas descritas en la U.S. Re. 34,606, incorporada aquí como referencia, así como enzimas comercialmente disponibles tales como DURAZYM (Novo Nordisk), MAXAPEM (Gist-brocades) y PURAFECT® OxP (Genencor International, Inc.). Los métodos para producir tales proteasas mutantes (proteasas estables oxidativamente) , y particularmente mutantes que tienen una sustitución para la metionina en la posición equivalente a M222 en Bacill us amyloliquef aciens , se describe en la U.S. Re. 34,606. Una modalidad adicional de la presente invención comprende el ADN que codifica para una a-amilasa de acuerdo a la presente invención y vectores de expresión que comprenden tal ADN. Las secuencias de ADN pueden expresarse ligándolas operablemente a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un huésped apropiado de acuerdo a las técnicas bien conocidas. Pueden emplearse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión en la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, incluyen segmentos de secuencias de ADN cromosomal, no cromosomal y sintético, tales como los diferentes plásmidos y fagos conocidos útiles para este propósito. Además, generalmente se usan cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión en esos vectores. Por ejemplo, los solicitante han descubierto que una secuencia de control de la expresión preferida para los transformantes de Bacill us es el péptido de señal aprE derivado de Bacill us subtili s . Una amplia variedad de células huésped son también útiles para la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Esos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como las cepas de E. Coli , Pseudomonas, Bacill us, Streptomyces , varios hongos, levaduras y células animales. De manera preferible, el huésped expresa la a-amilasa de la presente invención extracelularmente para facilitar la purificación y procesamiento posterior. La expresión y purificación de la a-amilasa mutante de la presente invención pueden efectuarse a través de los medios reconocidos en la técnica para llevar a cabo tales procesos. La a-amilasas mejoradas de acuerdo a la presente invención proporcionan varias ventajas importantes cuando se comparan con las a-amilasas de Bacill us, naturales. Por ejemplo, una ventaja es la actividad incrementada encontrada a pH bajo y temperaturas altas típicas de los método de licuefacción de almidón comunes. Otra ventaja es la estabilidad a pH alto y oxidativa incrementada que facilita su uso en detergentes. Otra ventaja es que se logra una hidrólisis más completa de las moléculas de almidón, lo cual reduce el almidón residual en la corriente de proceso. Otra ventaja es su estabilidad mejorada en ausencia de ion calcio. Otra ventaja más es que la adición de dosis de proteína iguales de a-amilasa de acuerdo a la presente invención proporcionan un funcionamiento superior cuando se compara con la a-amilasa de Bacillus licheniformis, debido a mejoras tanto en la actividad específica como en la estabilidad bajo condiciones tensas. En otras palabras, debido a la estabilidad generalmente incrementada de las a-amilasas de acuerdo a la presente invención, la actividad específica incrementada sobre el almidón de las amilasas de la invención se traduce en beneficios de funcionamiento potencial aún mayores de esta variante. Bajo condiciones en donde la enzima natural es activada, no solo sobrevive más amilasa de la invención debido a su estabilidad incrementada, sino que la que sobrevive expresa proporcionalmente más actividad debido a su actividad específica incrementada. Lo siguiente se presenta a manera de ejemplo y no debe constituirse en una limitación del alcance de las reivindicaciones. Las abreviaciones usadas aquí, particularmente las notaciones de tres letras y una letra para los aminoácidos se describen en Dale, J. W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley, & Sons (1989) Apéndice B.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción Del Plásmido pHP.BL El gen de la a-amilasa mostrado en la Figura 3 se clonó de Bacill us licheniformi s NCIB8061 (Gray et al., J. Bacteriology, vol. 166, pp. 635-643 (1986)). El fragmento Pstl-Ssrl de 1.72KB-3-1, que codifica para los últimos tres residuos de la secuencia de señal, toda la proteína madura y la región terminadora, se subclonó a M13mpl8. Se agregó un terminador sintético entre los sitios BcII y SstI usando un cásete oligonucleotídico sintético de la forma: BcII Sstl ' -GATCAññACOTAAñAASO^^ (SEQ ID NO:l) 3' TTTTCTATI-ITI^^ 5' (SEQ ID O:2) diseñados para que contenga el terminador transcripcional subtilisina de Bacill us amyloliquef aciens (Wells et al., Nucleic Acid Research, vol. 1. pp. 7911-7925 (1983)). Se construyó el plásmido pBLapr que contiene el gen para la a-amilasa de Bacill us li cheniformis . Como se ilustra en la Figura 7, el pBLapr comprende un plásmido de 6.1 kb que incluye el gen de resistencia a la ampicilina del pBR322 y el gen de resistencia al cloranfenicol del pC194, el promotor aprE y el gen que codifica para el a-amilasa de Bacill us licheniformi s ("BL AA") . El promotor aprE se construyó a partir de un fragmento HindIII-PstI de 660 pb que codifica para el promotor y la secuencia de señal de la proteasa alcalina de Bacill us subtilis . Se removió el sitio PstI, y se agregó un sitio Sfil cercano a la unión apr£/BL AA. El gen BL AA comprende el fragmento PStI-SstI de 1720 pb descrito anteriormente. En el trabajo descrito aquí, el pBLapr se construyó con un sitio Sfil adyacente al extremo 5' al inicio de a secuencia que codifica para el gen de la amilasa madura. Específicamente, el extremo 5' de la construcción pBLapr se subclonó en un fragmento EcoRI-SstII del pBLapr en el M13BM20 (Boehringer Mannheim) para obtener un patrón de hebra que codifica para el oligonucléotido mutante siguiente: ' -CCC ATT AAG ATT GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3' (SEQ. ID. NO: 3) Este cebador introdujo un sitio Sfil (indicado por el subrayado) , el cual permitió que fuesen .detectadas las formas correctas por la presencia de este sitio de restricción único. La subclonación del fragmento EcoRI-SstII de nuevo al vector pBLapr dio una versión del plásmido que contiene un sitio Sfil. El plásmido pHP13 (Haime et al., Mol. Gen. Genet., vol. 209, pp. 335-342 (1987)) (Figura 6) se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII y el vector resultante purificado sobre un gel de poliacrilamida y a continuación se eluyó. El plásmido pBLapr se digirió con HindIII, Asp718 en una incubación por separado con Asp718, EcoRI y se purificó por gel. Se eluyeron dos bandas, HindIII-Asp718 (1203 pb) y Asp718-EcoRI (1253 pb) purificadas sobre gel, del gel y se ligaron en el vector por una ligación de 3 vías, para dar el plásmido pHP.BL, el plásmido usado en la expresión de la a-amilasa (Figura 8).

EJEMPLO 2 Construcción Del Plásmido Que Codifica Para la a-Amilasa Que Comprende Sustituciones Para La Asparagina 188 Se sintetizó una serie de cebadores mutagénicos que codifican para sustituciones de Asnl88 ("N188") con cada uno de los aminoácidos naturales y se muestran en la Figura 1 (SEQ. ID. NOS:4-22). Las mutaciones del gen de la a-amilasa que codifican para esos cambios se hicieron por PCR, de acuerdo al procedimiento resumido en la Figura 9, usando los cebadores de PCR mostrados en la Figura 2 (SEQ. ID. NOS : 23-32) . Paso (1): Se usaron cebadores mutagénicos como patrones para los cebadores de PCR, PCR A + y PCR B- que dieron como resultado un ADN de dos hebras alargado (61 pb) . Cada uno tuvo un reemplazo de aminoácido diferente en la posición 188, todos excepto la N188M tuvieron un sitio de restricción diferente. Inicialmente los cebadores de PCR fueron recosidos a 35°C durante cinco minutos seguidos por una extensión de ADN de un minuto con polimerasa taq a 75°C. El ADN de dos hebras se fundió entonces a 95°C durante un minuto, seguido por los pasos de recosido y extensión. La fusión, recosido y extensión continuó durante un total de 30 ciclos . Paso (2) : Las porciones de ADN corriente arriba y corriente abajo de la posición 188 se hicieron en reacciones de PCR separadas. El patrón fue el pBLapr, y los cebadores para la PCR fueron LAAfs5 (SEQ. ID. NO: 27) y PCR A- (SEQ. ID. NO: 24) para la porción corriente arriba; y PCR B+ (SEQ. ID. NO:25) y PCR Cla-Sall (SEQ. ID. NO:28) para el ADN corriente abajo. El ADN se fundió a 95°C durante un minuto, se recoció a 45°C durante tres minutos y se alargó a 68°C durante 3 minutos. La porción corriente arriba es de 290 pb y corriente abajo es de 498 pb. Este procedimiento se repitió durante 18 ciclos usando polimerasa pfu. En los pasos (3) y (4) se usó el mismo procedimiento de PCR. Paso (3) : La porción corriente arriba del ADN descrito en el paso (2) se unió al cebador mutagénico de dos hebras descrito en el paso (1) . Se usaron los cebadores LAAfs5 (SEQ. ID. NO:27) y PCR B- (SEQ. ID. NO:26). Como resultado del diseño del cebador existe una superposición de 24 pb entre esos patrones que permite la unión de las dos piezas de ADN. Paso (4) : Las porciones de ADN corriente abajo descritas en el Paso (2) y el producto del Paso (3) se unieron para dar el producto final. Una superposición de 24 pb entre los dos productos de la PCR permiten la unión. Los cebadores usados fueron LAAfs5 (SEQ. ID. NO: 27) y PCR Clal-Salí (SEQ. ID. NO:28) . Paso (5) : Los sitios de restricción únicos, Asp718 y BssHII, se localizaron corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, del sitio 188. El producto de la PCR final se digirió con Asp718 y BssHII, el fragmento de 333 pb se aisló por electroforesis sobre gel de poliacrilamida y se subclonó en el vector pHP.BL para obtener el pHP.N188X. Las mutaciones fueron confirmadas por secuenciamiento con didesoxi (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., vol. 74, pp. 5463-5467 (1977)).

Con referencia a la secuencia de ADN y el sistema de numeración usado en la Figura 3, el codón que codifica para la posición de aminoácido +188 es un par de bases 812-814. Los cebadores para la PCR A+ y A- corresponden a los pares de bases 784-807. Los cebadores para la PCR B+ y B-corresponden a los pares de bases 821-844. El extremo 5' del cebador para la PCR LAAfs5 corresponde al par de bases 518. El extremo 5' del cebador para la PCR, PCR Clal-Sall corresponde al par de bases 1317. El sitio Asp718 corresponde al par de bases 724. El sitio BssHII corresponde al par de bases 1053.

EJEMPLO 3 Construcción Del Plásmido Que Codifica Para Las Mutaciones En M15 y N188 Se construyó un plásmido pBLapr que tiene sustituida la trionina por metionina en el aminoácido 15 de acuerdo a la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/194,664 (Publicación PCT No. WO 94/18314). Este plásmido (pBLaprM15T) fue digerido con Sfil y Asp718, y el fragmento de 477 pares de bases se subclonó en pHP.BL para crear el pHP.M15T. En una forma análoga descrita a la anteriormente, Ejemplo 1, el pHP.M15T fue digerido con Asp718 y BssHII, purificado sobre gel y eluído del gel. El fragmento de 333 pares de bases que comprende Asp718 a BssHII y el fragmento del pHP.N188S fueron subclonados entonces en pHP.M15T para dar el plásmido pHP.M15T/N188S. En una forma análoga, comenzando con los plásmidos pBL aprM15L y pHP.N188Y, se construyó el plásmido pHP.M15L/N188Y.

EJEMPLO 4 Transformación De Los Plásmidos En Bacillus subtilis, Expresión Y Purificación De La a-Amilasa Mutante La a-amilasa se expresó en Bacill us subtili s después de la transformación con los plásmidos descritos en los Ejemplos 1-3. El pHP13 es un plásmido capaz de reproducirse en E. coli y en Bacill us subtilis . Se construyeron plásmidos que contienen diferentes variantes usando la cepa MM294 de E. Coli , los plásmidos se aislaron y a continuación se transformaron en Bacill us subtilis como se describe en Anagnostopoulos et al., J. Bacter., vol. 81, pp. 741-746 (1961) . La cepa de Bacillus había sido suprimida para dos proteasas (?apr, ?npr) (véase por ejemplo, Ferrari et al., Patente Estadounidense No. 5,264,366) y para la amilasa (?aipyE) (véase por ejemplo, Stahl et al., J. Bacter., vol. 158, pp. 411-418 (1984)). Se encontró que la cepa de bacillus que expresa M15L/N188Y forma grandes zonas limpias a diferencia de la cepa que expresa M15L sobre placas de agar que contienen 1% de almidón insoluble indicando una actividad a inolítica incrementada. Después de la transformación, se introdujo la mutación sacU(Hy) (Henner et al., J. Bacter., vol. 170, pp. 296-300 (1988)) por transducción mediada por el PBS-1 (Hoch, J. Bact., vol. 154, pp. 1513-1515 (1983)). Las amilasas secretadas fueron recuperadas de manera rutinaria de cultivos de Bacill us subtilis como sigue: El sobrenadante de cultivo se ajustó a 20% de sulfato de amonio saturado y se agitó durante una hora a 4°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultantes se ajustó a 70% de sulfato de amonio saturado y se agitó durante una hora a 4°C. Después de la centrifugación del sobrenadante, el sedimento resultante se redisolvió en acetato de sodio 50mM, pH 6.0, cloruro de calcio 5mM, y se filtró de manera estéril .

EJEMPLO 5 Ensayo Para Determinar la Actividad de la a-Amilasa Ensayo del Sustrato Soluble: Se desarrolló un ensayo de velocidad basado en un equipo de ensayo de punto final distribuido por Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. Un frasco de sustrato (p-nitrofenil maltoheptaósido, BPNPG7) se disolvió en lOml de agua estéril seguida por un dilución 1:4 en amortiguador de ensayo (amortiguador de maleato 50mM, pH 6.7, cloruro de calcio 5mM, 0.002% de Tween20) . Los ensayos se efectuaron agregando lOµl de amilasa a 790µl del sustrato en una cubeta a 25°C. Las velocidades de hidrólisis se midieron con la velocidad de cambio de la absorbancia a 410nm, después de un retraso de 75 segundos. El ensayo fue lineal hasta velocidades de 0.2 unidades de absorción/min. La concentración de la proteína a-amilasa se midió usando el Ensayo Bio-Rad estándar (Bio-Rad Laboratories) basado en el método de Bradford, Anal. Biochem., vol. 72, p. 248 (1976) usando estándares de seroalbúmina bovina.

Ensayo de Hidrólisis del Almidón: La actividad de la a-amilasa sobre el almidón se determinó a través de un ensayo que depende de la capacidad del almidón para formar un complejo de color azul con el yodo y la desaparición de este color cuando el almidón se hidrolizó a moléculas de dextrina más cortas. La actividad de la a-amilasa se definió en términos del tiempo de digestión requerido para producir un cambio de color que denota un estado definido de la dextrinización del almidón. Los reactivos usados fueron los siguientes: Amortiguador de fosfato - Se disolvieron fosfato ácido de potasio (340 g) e hidróxido de sodio (25.3 g) en agua y se diluyeron hasta ~ dos litros. El amortiguador se enfrió a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 6.2±0.1. El amortiguador se diluyó hasta dos litros en un matraz volumétrico.

Sustrato de Almidón - Se suspendieron diez gramos (sustancia seca) de almidón de algodón en 50 ml de agua y se lavaron en ~300 ml de agua hirviente. La suspensión se llevó nuevamente hasta el punto de ebullición y se ebulló durante cinco minutos con agitación constante. La solución de almidón se enfrió con agitación constante a temperatura ambiente y se le agregaron 125 ml de amortiguador de fosfato. La solución se diluyó hasta 500 ml con agua. El sustrato de almidón se hizo fresco diariamente.

Solución patrón de yodo - Se disolvieron cristales de yodo (5.5 g) y yoduro de potasio (11.0 g) en agua y se diluyeron volumétricamente hasta 250 ml . La solución se protegió de la luz.

Solución diluida dé yodo - Se disolvieron yoduro de potasio (20 g) y dos ml de solución patrón de yodo en agua y se diluyó volumétricamente a 500 ml . La solución se hizo fresca diariamente.

Solución de dilución de enzima - Se disolvió cloruro de calcio (11.1 g) en cuatro litros de agua. El agua usada para todos los reactivos fue agua destilada o desionizada. Se diluyó una muestra de a-amilasa hasta entre 10-15 LU/ml (como se define más adelante) con solución de dilución de enzima. Para muchas preparaciones de a-amilasa comerciales se encontró que una dilución adecuada era de 2000 veces. Se distribuyeron alícuotas de cinco mililitros de solución diluida de yodo en tubos de prueba de 13 x 100 mm y se agregaron 10 ml de sustrato de almidón en un tubo de prueba de 23 x 200 mm. Todos los tubos fueron colocados en el baño de agua a 30°C. Se usó un comparador de Hellige equipado con un disco de color de a-amilasa especial (número de catálogo 620-s5) para hacer las lecturas. Se mezclaron cinco mililitros de enzima diluida (también a 30°C) con el sustrato de almidón y se comenzó el cronometraje. A intervalos de tiempo apropiados, por ejemplo intervalos de un minuto al comenzar la reacción e intervalos de 15 segundos después de la reacción, se transfirieron alícuotas de un ml de la mezcla enzima-sustrato a un tubo que contenía la solución diluida de yodo. La solución de yodo y almidón se mezcló y transfirió a un tubo cuadrado con una precisión de 13 mm y se comparó el color con el disco de color de a-amilasa estándar en el comparador de Hellige. Cuando el tiempo se aproximó al punto final, se tomaron muestras a intervalos de 0.25 minutos . Se registró el tiempo requerido para que los colores de las muestras y el disco de color se igualaran y se calculó la actividad (en unidades de licuefacción por gramo o ml) de acuerdo a la fórmula: LU/ml o LU/g = {570/V x t}x D en donde : LU= unidad de licuefacción V= volumen de enzima (5 ml o gramos) t= tiempo de dextrinización (minutos) D= factor de dilución: volumen de dilución dividido por ml o g de enzima diluida.

Las a-amilasas mutantes de acuerdo a la invención preparadas como en los Ejemplos 1-4 se probaron por su actividad específica sobre el almidón y el sustrato soluble. Los resultados, como se muestra en la Tabla 1, ilustran que la amilasa mutante de acuerdo a la invención proporciona un perfil de actividad superior en comparación con la a-amilasa natural AA20 sombre ambos sustratos.

TABLA 1 Actividad Especifica De Ciertas a-Amilasas Sobre Sustrato Soluble y Almidón Como Porcentaje de La Actividad Natural EJEMPLO 6 Condiciones De Licuefacción del Almidón — Determinación Del DE (Equivalente de Dextrosa) del Almidón Licuado La licuefacción del almidón se efectuó usando un reactor compuesto de una tubería de acero inoxidable de 50 pies de 0.24 pulgadas de diámetro (0.21 pulgadas de diámetro interno) doblada en forma de un serpentín de aproximadamente 10 pulgadas de diámetro, de ~5.5 pulgadas de altura. El serpentín fue equipado con un mezclador estático en línea de 11.5 pulgadas (Cole-Par er #G-04660-60) montado ~4 pies desde el extremo anterior. El extremo posterior del serpentín se equipó con una válvula de anillo de presión ajustable en línea Swagelok (# SS-4CA-3) fijada a una presión de fistulización de aproximadamente 20 psi. La suspensión de almidón se alimentó al serpentín a una velocidad de ~70 ml/minuto con una bomba dosificadora de pistón. La temperatura de el serpentín del reactor se mantuvo a 105.5°C mediante la inmersión del reactor en un baño de glicerol-agua. La temperatura en el baño se mantuvo usando un calentador de circulación/controlador de temperatura (Fisher Scientific modelo 7305) .

La licuefacción del almidón a escala piloto se efectuó típicamente usando un Hidrocalentador M 103-M equipado con chorro de vapor con un serpentín de retraso de 2.5 litros detrás de la cámara de mezclado y una válvula de contrapresión terminal. El almidón se alimentó al chorro por medio de una bomba Moyno y el vapor se suministró por medio de una línea de vapor de 150 psi, reducida a 90-100psi. Se instalaron sondas de temperatura justo después del Hidrocalentador y justo antes de la válvula de contrapresión. El almidón se introdujo en el chorro a aproximadamente 350 ml/minuto. La temperatura del chorro se mantuvo a 105-107°C. Las muestras de almidón se transfirieron del dispositivo de cocción a chorro a una segunda etapa de licuefacción a 95°C y se mantuvieron durante 90 minutos. El almidón granular se obtuvo de un molido de molienda en húmedo de maíz y se usó dentro de dos días. El almidón se diluyó al nivel de sólidos deseado de aproximadamente 30-35% de sólidos secos con agua desionizada y el pH se ajustó con NaOH al 2.5% o HCl al 6% de acuerdo a lo requerido. Se agregó calcio en forma de CaCl2-2H20. Las condiciones de licuefacción típicas fueron: Almidón 30% - 35% de sólidos Calcio 40-60 ppm (se agregaron 30 ppm) pH 5.0-6.0 a-amilasa 12 - 14 LU/g de carbohidrato (base seca) Las muestras de almidón se transfirieron del reactor a un baño de licuefacción de la segunda etapa a 95°C y se mantuvieron durante 90 minutos. El grado de licuefacción del algodón se midió inmediatamente después de la segunda etapa de licuefacción determinando el equivalente de dextrosa (ED) de acuerdo al método descrito en Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Com Refiners Associati on, Inc . sixth ed., Analytical Procedure Committee (1980) .

EJEMPLO 7 Comparación de la M15T/N188S y la a-Amilasa Natural en la Licuefacción a 105.5°C La a-amilasa que comprende la sustitución M15T/188S hecha como en los Ejemplos 1-4 se comparó con la a-amilasa natural derivada de Bacillus licheniformis (Spezyme® AA20, disponible comercialmente de Genencor International, Inc.) en la licuefacción a 105.5°C. Como se muestra en la Tabla 2, las enzimas mutantes proporcionaron un funcionamiento significativamente incrementado en la licuefacción a chorro del almidón, especialmente a un pH bajo. La licuefacción a escala piloto se efectúo con una primer etapa de licuefacción a 105.5°C y una segunda etapa de licuefacción a 95°C. La amilasa se agregó a 12 LU/g de carbohidrato (base seca) .

TABLA 2 Funcionamiento Comparativo de la Licuefacción en las a- Amilasas a 105.5°C.

EJEMPLO 8 Comparación de la M15T/N188S y la a-Amilasa Natural en la Licuefacción a 107.0°C La a-amilasa que comprende la sustitución M15T/188S hecha como en los Ejemplos 1-4 se comparó con la a-amilasa natural derivada de Bacill us licheniformis (Spezyme® AA20, disponible comercialmente de Genencor International, Inc.) en la licuefacción a 107°C. Como se muestra en la Tabla 3, las enzimas mutantes proporcionaron un funcionamiento significativamente incrementado en la licuefacción a chorro del almidón especialmente a un pH bajo, como lo muestra el valor de ED, durante el proceso de licuefacción. La licuefacción a escala piloto se efectúo con una primer etapa de licuefacción a 107°C y una segunda etapa de licuefacción a 95°C. La amilasa se agregó a 12 LU/g de carbohidrato (base seca) .

TABLA 3 Funcionamiento Comparativo de la Licuefacción de la a-Amilasa a 107°C.

EJEMPLO 9 Análisis Estadístico de los Resultados de la Licuefacción para la a-Amilasa Mutante y Natural El funcionamiento relativo de la licuefacción de Spezyme® AA20 y la variante M15T/188S se exploró extensivamente en un experimento de diseño estadístico. Usando el programa "X-STAT", Versión 2.0 (Derechos Reservados, Wiley Scientific and Technical Software, John Wiley & Sons, New York, (1992)), se diseñó un experimento factorial de Box-Behnken; haciendo variar la temperatura de la licuefacción primaria de 106°C a 110°C, el pH de licuefacción de pH 5.3 a pH 6.0, y el nivel de calcio total en el sustrato de almidón de 30 ppm a 90 ppm. Los datos en las Tablas 4 y 5 que formaron la base de este experimento se generaron el 15 licuefacciones a escala piloto cada una usando 12 LU/gramo de sustrato sólido seco de Spezyme® AA20 y M15T/188S. Los datos se ajustaron entonces a modelos cuadráticos. Para la variante M15T7188S, los datos se ajustaron a la ecuación ED = 842.41 + 28.374 x pH - 17.557 x Temperatura + 1.5005 x Concentración de calcio + 1.6243 (pH x Temperatura) - 0.081506 (pH x Concentración de calcio) 0.0092099 (Temperatura x Concentración de calcio) - 16.841 (pH)2 + 0.038379 (Temperatura)2 - 0.000124 (Concentración de calcio)2 con un error estándar aproximado de la regresión de 1.313 y una variación explicada aproximada de la media de (R)2 de 93.99%. Para la Spezyme® AA20, los datos se ajustaron a la ecuación ED = -652.0 + (132.35 x pH) + (4.716 x Temperatura) + (1.3989 x Concentración de calcio) 0.050515 (pH x Temperatura) - 0.019603 (pH x Concentración de calcio) - 0.011118 (Temperatura x Concentración de calcio) -10.206 (pH)2 + 0.02104 (Temperatura)2 - 0.000522 (Concentración de calcio)2. Con un error estándar aproximado de la regresión de 0.5772 y una variación explicada aproximada de la media de (R)2 de 98.69%, esas ecuaciones se usaron para preparar curvas graficando la ED vs. pH vs. Concentración de calcio vs . Temperatura. Las representaciones bidimensionales de los datos a 107°C y 60 ppm de Ca+ se ilustran en las Figuras 10-12, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 10-12, la amilasa mutante funcionó mejor que la amilasa natural permitiendo una licuefacción más eficiente del almidón a pH bajo, niveles de calcio más bajos y temperatura más baja. i ;? TABLA 4 Continuación de la TABLA 4 TABLA 5 Continuación de la TABLA 5 Aunque la invención ha sido descrita en términos de varias modalidades preferidas, un experto en la técnica apreciará que pueden hacerse varias modificaciones, sustituciones, omisiones y cambios sin apartarse del espíritu y alcance de la misma. En consecuencia, se pretende que el alcance de la presente invención se limite únicamente al alcance de las reivindicaciones anexas, incluyendo las equivalentes de las mismas.

EJEMPLO 10 Preparación y Prueba de a-Amilasas Mutantes Adicionales para la Estabilidad Térmica Se prepararon alfa-amilasas mutantes que tenían sustituciones en una o más de las posiciones V128E, H133Y, S187D y/o A209V, generalmente de acuerdo a los procedimientos proporcionado en los Ejemplos 1-4 excepto que se proporcionaron los cebadores para PCR apropiados para efectuar las mutaciones deseadas. Las amilasas se purificaron hasta un punto en donde la a-amilasa de Bacill us licheniformis natural mostró una actividad específica de 1087 LU/mg de proteína. La concentración de proteína se determinó por absorción a 278 nm, usando un coeficiente de Extinción Molar de la enzima natural de 143,255 M"1 cm"1. Las velocidades de inactivación térmica para los diferentes mutantes se midieron de acuerdo al siguiente procedimiento. Se dializaron soluciones patrón de amilasa extensamente en acetato de amonio 20mM, CaCl2 4 mM pH 6.5. Para la medición de la estabilidad, este patrón se diluyó >50 veces en acetato de amonio 50 mM, CaCl2 5 mM, Tween 20 al 0.02%, pH 5.0 a una concentración final de entre 30 y 50 µg/ml. Se colocaron seis alicuotas de 100 µl en tubos de eppendorf y se colocaron en un baño de agua a 83°C. Los tubos de eppendorf se removieron a intervalos regulares, medidos, de entre 30 segundos y 5 minutos y se colocaron en hielo para detener la inactivación. La actividad residual se ensayo usando un sustrato soluble como se describe en el Ejemplo 5. Se gráfico el logaritmo natural de la actividad contra el tiempo de incubación, y la constante de velocidad para la inactivación se obtuvo de la pendiente de la línea recta. En la Tabla 6 se proporcionan los resultados para varios mutantes.

TABLA 6 EJEMPLO 11 Funcionamiento de la Licuefacción a pH Bajo de las a-Amilasas Variantes La a-amilasa que comprende las sustituciones M15T/N188S o M15T/H133Y/N188S se hicieron como en los Ejemplos 1-4 y 10 y se compararon en estudios de licuefacción como en el Ejemplo 6. La licuefacción se efectuó a 105.5°C con una retención secundaria de 90 minutos a ,95°C bajo condiciones que incluyeron 94 ppm de S02 con amilasa a una concentración de 16 LU/g de carbohidrato (base seca) . Los resultados se proporcionan en la Tabla 7 a continuación.

TABLA 7 EJEMPLO 12 Funcionamiento de la Licuefacción a pH Bajo de M15T/V128E/H133Y/N188S, M15T/H133Y/N188S y M15T/N188S a Varios Niveles de Calcio Se hicieron a-amilasas que comprenden varias supresiones como en los Ejemplos 1-4 y 10 y se compararon en estudios de licuefacción con el Ejemplo 6. La licuefacción se efectuó a 105.5°C bajo condiciones que incluyeren un pH de .50, 95 ppm de S02 con amilasa a una concentración de 12 LU/g de carbohidrato (base seca) . Los resultados se proporcionan en la Tabla 8 a continuación.

TABLA 8 EJEMPLO 13 Funcionamiento de la Licuefacción a pH Bajo de M15T/H133Y y M15T/H133Y/A209V a Niveles de pH Variables Se hicieron a-amilasas que comprenden varias supresiones como en los Ejemplos 1-4 y 10 y se compararon en estudios de licuefacción con el Ejemplo 6. La licuefacción se efectuó a 105.5°C bajo condiciones que incluyeron 98 ppm de S02 con amilasa a una concentración de 19 LU/g de carbohidrato (base seca) . Se suspendió almidón de maíz seco (Clinton Brand 106-B Pearl cornstarch, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) con agua desionizada (~23 kg en ~50 litros) y se dejó hidratar durante 16 horas. Los resultados se proporcionan a continuación en la Tabla 9.

Tabla 9 EJEMPLO 14 Funcionamiento de la Licuefacción Mejorada de la a-amilasa Variante Comparada con la Natural Se hicieron a-amilasas que comprenden una sustitución en M15T/S187D/N188S como en los Ejemplos 1-4 y 10 y se compararon con la natural en estudios de licuefacción como en el Ejemplo 6. Se suspendió almidón de maíz seco (Clinton Brand 106-B Pearl cornstarch, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) en agua desionizada (~23 kg en ~50 litros) y se dejó hidratar durante 16 horas. La licuefacción se efectuó a 105°C con niveles de proteína iguales de amilasa a 9.0 µg de amilasa/g de carbohidrato (base seca) (3.1 mg de amilasa/litro de suspensión de almidón sólido seco al 35%) . Debido al beneficio de la actividad específica derivada de la a-amilasa mutante, la actividad de la amilasa fue de 11 LU/g de carbohidrato (base seca) para la amilasa natural y 24 LU/g de carbohidrato para la mutante. Las actividades medidas mostraron que la amilasa mutante tuvo un incremento en la actividad de 410% de la natural sobre la heptamaltosa y 219% de la natural sobre el almidón. Los resultados de la licuefacción se proporcionan en la Tabla 10 a continuación.

TABLA 10 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (31)

REIVINDICACIONES

1. Una a-amilasa, caracterizada porque es el producto de la expresión de una secuencia de ADN mutante que codifica para una a-amilasa, la secuencia de ADN mutante se deriva de una a-amilasa precursora por la supresión o sustitución de al menos uno o más residuos de asparagina.

2. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la a-amilasa comprende una supresión o sustitución que corresponde al N188 en Bacillus licheniformis.

3. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la a-amilasa comprende una sustitución que corresponde al N188S o N188T en Bacill us lich eniformi s .

4. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la supresión o sustitución comprende además la supresión o sustitución de un residuo de metionina o triptófano.

5. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la supresión o sustitución del residuo de metionina o triptófano comprende una sustitución o supresión que corresponde al M15, W138 o M197 en Bacillus licheniformis .

6. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la supresión o sustitución comprende además la supresión o sustitución de un residuo que corresponde al V129, H133, S187 o A209 en Bacillus licheniformis .

7. Una a-amilasa, caracterizada porque es el producto de la expresión de una secuencia de ADN mutante que codifica para una a-amilasa, la secuencia de ADN mutante se deriva de una a-amilasa precursora por una sustitución que corresponde a M15T/N188S, M15L/N188S, M15T/H133Y/N188S, M15T/H133Y/N188S/A209V, M15T/N188SS/A209V, M15T/V128E/H133Y/N188S, M15T/S187D/N188S o M15T/H133Y en Bacill us licheniformis .

8. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la sustitución de los residuos de metionina comprende una sustitución que corresponde al M15T, W138Y o M197T en Bacillus licheniformis .

9. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la a-amilasa precursora se deriva de Bacill us .

10. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la a-amilasa precursora se deriva de Bacillus licheniformis.

11. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la a-amilasa comprende una supresión o sustitución en la posición N188.

12. La a-amilasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la a-amilasa comprende una sustitución que es N188S.

13. Un ADN, caracterizado porque codifica para la a-amilasa de conformidad con la reivindicación 1.

14. Un ADN, caracterizado porque codifica para la a-amilasa de conformidad con la reivindicación 2.

15. Un ADN, caracterizado porque codifica para la a-amilasa de conformidad con la reivindicación 5.

16. Un ADN, caracterizado porque codifica para la a-amilasa de conformidad con la reivindicación 6.

17. Un ADN, caracterizado porque codifica para la a-amilasa de conformidad con la reivindicación 7.

18. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 13.

19. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 14.

20. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 15.

21. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 16.

22. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 17.

23. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 18.

24. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 19.

25. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20.

26. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 21.

27. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 22.

28. La a-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1, 6 ó 7, caracterizada porque tiene funcionamiento a pH bajo aumentado o mejorado.

29. Una composición detergente, caracterizada porque comprende la a-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1, 6 ó 7.

30. La composición detergente de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el detergente es útil en un lavado de tela sucia.

31. La composición detergente de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el detergente es útil para lavar platos sucios.