MXPA00000384A - Mutantes de alfa amilasa que tiene introducido un enlace disulfuro - Google Patents
Mutantes de alfa amilasa que tiene introducido un enlace disulfuroInfo
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Abstract
Enzimas novedosas de ?-amilasa son publicadas en las cuales uno o más enlaces disulfuro están introducidos en la enzima vía adición o substitución de un residuo con una cisteina. Las enzimas ?-amilasa publicadas mostraron estabilidad alterada o mejorada y/o perfiles de actividad.
Description
MUTANTE DE a-AMILASA QUE TIENE INTRODUCIDO UN ENLACE DISULFURO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida para a-amilasas mutantes que tienen introducidos uno o más puentes disulfuro. En particular, los puentes disulfuro se introducen por mutación de un a-amilasa precursora para introducir uno o más residuos de cisteína así co o para producir un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína en dicha a-amilasa mutante. Está específicamente contemplado que el mutante tendrá características alteradas en su desempeño tales como estabilidad alterada y/o perfiles de actividad alterada.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las a-Amilasas (a-1, 4-glucano-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) hidroliza uniones glucosídicas a-1, 4- internas en almidón, en gran medida al azar, para producir maltodextrinas de peso molecular más pequeño. Las a-Amilasas son de un considerable valor comercial, siendo usadas en las etapas iniciales (licuefacción) de procesamiento de almidón; en producción de alcohol; como agentes limpiadores en matrices de detergente; y en la industria textil para desaprestar almidón. Las a-Amilasas REF.: 88842 son producidas por una amplia variedad de microorganismos incluyendo Bacill us y Aspergillus, con la mayoría de amilasas comerciales siendo producidas de fuentes bacterianas tales como Bacillus licheniformis, Bacillus amylolíquefaciens, Bacillus subtilis, o Bacillus stearothermophil us . En años recientes, las enzimas preferidas en el uso comercial han sido aquellas de Bacillus licheniformis a causa de su estabilidad al calor y funcionamiento bajo condiciones de operación comercial.
En general, el procesamiento de almidón a fructuosa consiste en 4 etapas: licuefacción de almidón granular, sacarificación del almidón licuado en dextrosa, purificación, e isomerización de fructuosa. El objeto del proceso de licuefacción del almidón es convertir una suspensión concentrada de granos de polímeros de almidón en una solución de dextrinas solubles con una cadena más corta de longitud de baja viscosidad. Este paso es esencial para la operación conveniente con equipo estándar y para la conversión eficiente de glucosa u otros azúcares. Para licuar almidón granular, es necesario gelatinizar los granulos por aumento de temperatura del almidón granular por encima de los 72 °C. El proceso de calentamiento trastorna instantáneamente los granulos de almidón insoluble para producir una solución de almidón soluble en agua. La solución de almidón solubilizada es entonces licuada por una a-a ilasa (EC 3.2.1.1.).
Un proceso de licuefacción enzimática común involucra el ajuste del pH de un almidón granular lechado a entre 6.0 y 6.5, el pH óptimo de la a-amilasa derivada de Bacillus licheniformis, con la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio o carbonato de sodio. La adición de hidróxido de calcio tiene la ventaja de proveer también iones de calcio los cuales se sabe que estabilizan las a-amilasas contra la inactivación. Acerca de la adición de a-amilasas, la suspensión es bombeada a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura a entre 80 y 115°C. El almidón es inmediatamente gelatinizado y, debido a la presencia de a-amilasas, despolimerizadas a través de hidrólisis al azar de un (1-4) enlaces glucosídicos para una masa fluida la cual es fácilmente bombeada.
En una segunda variante del proceso de licuefacción, la a-amilasa es agregada a la suspensión de almidón, la suspensión es mantenida a una temperatura de 80-100°C para hidrolizar parcialmente los granulos de almidón, y la suspensión de almidón parcialmente hidrolizada es bombeada mediante un chorro a temperaturas por encima de cerca de 105°C para gelatinizar a conciencia cualquier estructura granular sobrante. Después de enfriar el almidón gelatinizado, una segunda adición de a-amilasa puede ser hecha para hidrolizar el almidón más adelante.
Una tercera variante de este proceso es llamada proceso de fabricación seca. En la fabricación seca el grano entero es sedimentado y combinado con agua. El germen es opcionalmente removido por separación de flotación o técnicas equivalentes. La mezcla resultante, la cual contiene almidón, fibra, proteína y otros componentes del grano, es licuado usando una a-amilasa. La práctica general en el arte es emprender la licuefacción enzimática a una temperatura más baja cuando se usa el proceso de fabricación seca. Generalmente, la licuefacción a baja temperatura se cree que es menos eficiente que la licuefacción a temperatura alta para convertir almidón a dextrinas solubles.
Típicamente, después de la gelatinización la solución de almidón es mantenida a una temperatura elevada en la presencia de a-amilasa hasta que es logrado un DE de 10-20, usualmente en un período de 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar de la industria para medir la concentración del total de azúcares reducidas, calculadas como D-glucosa en una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un DE virtualmente de cero, mientras que el DE de la D-glucosa es definido como 100.
La temperatura máxima a la cual la solución de almidón que contiene a-amilasa puede ser mantenida depende de la fuente microbiana de la cual la enzima fue obtenida y la estructura molecular de la molécula de a-amilasa. Las a-amilasas producidas por cadenas de tipo salvaje de Bacillus subtillis o Bacillus amyloliquefaciens son típicamente usadas a temperaturas no más altas que 90°C debido a la inactivación termal excesivamente rápida más arriba de esa temperatura, mientras que las a-amilasas producidas por cadenas de tipo salvaje de Bacill us licheniformis pueden ser usadas a temperaturas arriba de los 110°C. La presencia de almidón y ion de calcio se sabe que estabilizan las a-amilasas contra la inactivación. Sin embargo, las a-amilasas son usadas a valores de pH por encima de 6 para protegerlas contra la inactivación rápida. A bajas temperaturas, la a-amilasa de Bacill us licheniformis se sabe que muestra actividad hidrolizante en sustrato de almidón a valores de pH tan bajos como 5. Sin embargo, cuando la enzima es usada para hidrólisis de almidón a temperatura de chorro común e.g., entre 102°C y 109°C, el pH debe ser mantenido por encima al menos de 5.7 para evitar la inactivación excesivamente rápida. El requerimiento de pH desafortunadamente proporciona una ventana limitada de oportunidad de procesamiento porque los valores de pH arriba de 6.0 resultan en productos indeseables, e.g., maltulosa. Por consiguiente, en realidad, el pH de licuefacción es generalmente mantenido entre 5.9 y 6.0 para alcanzar la producción satisfactoria de almidón hidrolizado.
Otro problema relativo al pH de licuefacción es lo necesitado para subir el pH de la suspensión de almidón de cerca de 4, el pH de una suspensión de almidón de maíz como viene de la etapa de fabricación húmeda, a 5.9-6.0. Este ajuste de pH requiere la costosa adición de químicos neutralizadores de ácido y también requiere cambio iónico adicional refinando del producto de conversión de almidón final para remover el químico. Además, el siguiente proceso en la etapa después de la licuefacción, típicamente sacarificación del almidón licuado en glucosa con glucosamilasa, requiere de un- pH de 4-4.5; Por lo tanto, el pH debe ser ajustado nuevamente de 5.9-6.0 a 4-4.5;. requiriendo adición de químico adicional y etapas de refinación.
Subsecuente a la licuefacción, el almidón procesado es sacarificado a glucosa con glucosamilasa. Un problema con los presentes procesos ocurre cuando almidón residual está presente en la mezcla de sacarificación debido a una licuefacción incompleta del almidón, e.g., ineficiente hidrólisis de amilosa por amilasa. El almidón residual es altamente resistente a la hidrólisis de glucosamilasa. Eso representa una menor producción e interfiere con la filtración corriente debajo de los jarabes.
Adicionalmente, muchas a-amilasas son conocidas por requerir la adición de iones de calcio para su estabilidad. Esto ' incrementa el costo de la licuefacción más adelante.
En la U.S. Patent No. 5,322,778, la licuefacción entre pH 4.0 y 6.0 fue conseguida por medio de adición de un antioxidante tal como bisulfito o una sal de éste, ácido ascórbico o una sal de éste, ácido eritórbico, o antioxidantes fenólicos tales como butilato de hidroxianisol, butilato de hidroxitolueno o a-tocoferol para la licuefacción lechada. Acorde a esta patente, el bisulfito de sodio debe ser agregado en una concentración de más de 5mM.
En la U.S. Patent 5,180,669, la licuefacción entre un pH de 5.0 a 6.0 fue lograda por la adición de ion de carbonato en exceso del monto necesitado para amortiguar la solución para el asiento de almidón lechado. Debido al efecto del pH incrementado el cual ocurre con la adición del ion carbonato, el lechado es generalmente neutralizado por adición de una fuente de ion hidrógeno, por ejemplo, un ácido inorgánico como ácido hidroclórico o ácido sulfúrico.
En la Publicación PCT No. WO 95/35382, una a-amilasa mutante es descrita teniendo estabilidad de oxidación mejorada y teniendo cambios a posiciones 104, 128, 187 y/o 188 en a-amilasa de B. licheniformis .
En la Publicación PCT No. WO 96/23873, son descritas a-amilasas mutantes las cuales tienen algunas de un número de mutaciones .
En la Publicación PCT No. WO 94/02597, una a-amilasa mutante teniendo estabilidad oxidativa mejorada es descrita en la cual una o más metioninas son remplazadas por algún aminoácido excepto cisteína o metionina.
En la Publicación PCT No. WO 94/18314, una a-amilasa mutante teniendo estabilidad oxidativa mejorada es descrita en la cual uno o más residuos de metionina, triptofano, cisteína, histidina o tirosina es remplazado con un aminoácido no-oxidante.
En la publicación PCT No. WO 91/00353, las características del desempeño y problemas asociados con la licuefacción con la a-amilasa tipo salvaje de Bacill us licheniformis son enfocados por ingeniería genética de la a-amilasa para incluir substituciones específicas Ala-111-Thr, His-133-Tyr y/o Thr-149-lle.
Estudios utilizando técnicas de ADN recombinante para explorar cuales residuos son importantes para la actividad catalítica de amilasas y/o para explorar el efecto de modificar ciertos aminoácidos dentro de el sitio activo de varias amilasas y glicosilasas ha sido llevado a cabo por varios investigadores (Vihinen et al., J. Biochem., Vol. 107. pp. 267-272 (1990); Holm et al., Protein Engineering, Vol. 3, pp. 181-191 (1990); Takase et al., Biochemica et Biophysica Acta, Vol. 1120, pp . 281-288 (1992); Matsui et al., FEBS Letters, Vol. 310, pp. 216-218 (1992); Matsui et al . , Biochemistry; Vol. 33, pp. 451-458 (1992); Sogaard et al., J. Biol. Chem., Vol 268, pp. 22480-22484 (1993); Sogaard et al., Carbohydrate Polymers, Vol. 21, pp. 137-146 (1993): Svensson Plant Mol. Biol., Vol. 25, pp. 141-157 (1994); Svensson et al., J. Biotech. Vol. 29, pp. 1-37 (1993)). Los investigadores han estudiado también cuales residuos son importantes para la estabilidad térmica (Suzuki et al., J. Biol. Chem., Vol. 264, pp. 18933-18938 (1989); Watanabe et al., Eur. J. Biochem. Vol. 226, pp. 277-283 (1994)); y un grupo ha utilizado tales métodos para introducir mutaciones a varios residuos de histidina en una amilasa de Bacillus licheniformis, siendo lo racional que la amilasa de Bacill us Licheniformis la cual es conocida por ser relativamente termoestable cuando se compara con otra amilasa de Bacill us similar, tiene un exceso de histidina y, por lo tanto, fue sugerido que el remplazar una histidina podría afectar la termoestabilidad de la enzima. Este trabajo resultó en la identificación de mutaciones estabilizantes al residuo de histidina a la posición +133 y el residuo de alanina a posición +209
(Declérck et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, pp. 15481-15488 (1990); FR 2 665 178-A1; Joyet et al., Bio/Technology, Vol. 10, pp. 1579-1583 (1992)).
La introducción de puentes disulfuro dentro de proteínas por mutagénesis de sitio-dirigido permite un medio de estabilización nativa, conformaciones plegadas, ver e.g., Villafranca et al., Science, Vol. 222, pp. 782-788 (1983). Hazes et al., Prot. Eng., Vol. 2, No. 2 pp. 119-125 (1988) sugiere introducir puentes disulfuro para una proteína por medio de un algoritmo modelo el cual comienza con la generación de la posición Cß de N, posiciones de átomos Ca y C disponible de un modelo tridimensional conocido. Un primer grupo de residuos es seleccionado en la base de las distancias Cß-Cß; son generadas las posiciones S? las cuales satisfacen el requerimiento que, con valores ideales de la longitud de enlace de la Ca- Cß y Cß-S? y para el ángulo de enlace a
Cß, la distancia entre el S? del residuo 1 y Cß del residuo 2 en un par (determinada por el ángulo de enlace a S?2) esta en, o muy cerca de, su valor ideal; y las dos posiciones aceptables de S? son encontradas para cada cisteína y las cuatro diferentes conformaciones para cada puente disulfuro establecidas. Finalmente las cuatro conformaciones están sujetadas a procedimiento de minimización de energía para remover grandes desviaciones de la geometría ideal y sus energías finales calculadas. Sowdhamini et al., Prot. Eng., Vol. 3 No.2, pp.95-103 (1989) revela que la introducción de puentes disulfuro en proteínas por mutagénesis de sitio dirigido permite un medio de estabilización nativa de conformaciones plegadas y sugieren técnicas de modelaje por computadora para calcular la apropiada estereoquímica de pares de residuos en proteínas como sitios potenciales para introducción de puentes disulfuro de cisteínas. El autor sugiere que la condición elemental para considerar posiciones de residuos en proteínas, como sitios potenciales de introducción de cisteína, para generar disulfuros no encadenados es que la distancia al carbono alfa entre los dos residuos de cisteína para ser unidos vía el puente disulfuro (Ca-Ca) sea menos que o igual a 6.5 Angstroms y que la distancia del carbono beta entre los dos residuos de cisteína para ser unidos por medio de enlace disulfuro (Cß-Cß) distancia de menos que o igual a 4.5 Angstroms.
A pesar de los avances hechos en el arte previo, hay una necesidad de una a-amilasa la cual sea más efectiva en el proceso de licuefacción comercial pero que permita actividad a pH más bajo que la practicada actualmente. Adicionalmente hay una necesidad por análisis mejorados teniendo características las cuales las hacen más efectivas bajo las condiciones de uso detergente. A causa de que las amilasas comercialmente disponibles no son aceptables bajo muchas condiciones debido a problemas de estabilidad, por ejemplo, los altos niveles de alcalinidad y oxidación (cloro) asociado con detergentes, o temperaturas bajo las cuales ellas operan, se encuentra la necesidad de una amilasa teniendo alterada, y preferiblemente incrementada, los perfiles de función bajo tales condiciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Es un objeto de la presente invención proporcionar una a-amilasa habiendo alterado sus perfiles de función.
Es más adelante objeto de lá presente invención proporcionar una a-amilasa habiendo mejorado su estabilidad a altas temperaturas.
Por consiguiente la presente invención proporciona una a-amilasa mutante habiendo introducido en ella uno o más residuos de cisteína, en los cuales al menos uno de los residuos de cisteína introducidos es capaz de formar un puente disulfuro con otro residuo de cisteína. Preferentemente, la cisteína (s) introducida y el otro residuo de cisteína con el cual se forma un puente disulfuro corresponde a posiciones en el precursor a-amilasa teniendo una distancia de enlace Ca-Ca de entre cerca de 4.4-6.8 Angstroms y una distancia de enlace Cß-Cß de entre cerca de 3.45 y 4.5 Angstroms. En una modalidad de la invención preferida particularmente, la a-amilasa es derivada de una fuente bacteriana o fungal y comprende una sustitución correspondiendo para E119C/S130C y/o D124C/R127C de Bacill us licheniformis . Más preferentemente, la a-amilasa es derivada de Bacillus .
La invención más adelante comprende ácidos nucleicos que codifican tales amilasas mutantes, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, células huésped transformadas con tales vectores y métodos de expresión de las a-amilasas mutantes que utilizan tales células huésped.
La invención más adelante comprende el uso de a-amilasas mutantes acorde a la invención para licuar el almidón en el camino del procesamiento del almidón a glucosa u otros derivados de almidón, como un aditivo en detergentes tales como de lavandería y detergentes para trastes, como una ayuda para hornear y para desaprestar textiles.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra las regiones de estructura secundaría las cuales están estabilizadas por la introducción de
E119C/S130C y D124C/R127C correspondiendo a a-amilasa de Bacillus licheniformis.
La Figura 2 ilustra la secuencia de ADN del gene para a-amilasa de Bacill us licheniformis (NCIB 8061) (SEC ID NO:l) y secuencia de aminoácidos deducida del producto de traducción (SEC ID NO: 2) como es descrito por Gray et al., J. Bacteriology, Vol.166, pp. 635-643 (1986).
La Figura 3 ilustra la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 3) de la enzima a-amilasa madura de Bacillus lich eni for i s .
La Figura 4 ilustra un alineamiento de las estructuras primarias de tres a-amilasas de Bacill us . La a-amilasa de Bacillus licheniformis (Am-Linch) (SEC ID NO: ) es descrita por Gray et al., J. Bacteriology, Vol 166, pp. 635-643 (1986) ; la a-amilasa de Bacill us amyloliquefaciens (Am-Amylo) (SEC ID NO: 5) es descrita por Takkinen et al., J. Biol. Chem., Vol. 258, pp.1007-1013 (1983) ; y la a-amilasa de Bacill us stearothermophil us (Am-Stearo) (SEC ID NO: 6) es descrita por Ihara et al., J. Biochem., Vol.98, pp. 95-103 (1985).
La Figura 5 ilustra el plásmido pHP 13 el cual CmR se refiere a resistencia a cloramfenicol, EmR se refiere a resistencia a eritromicina y Rep pTA1060 se refiere al origen de replicación desde el plásmido pTA1060.
La Figura 6 ilustra el plásmido pBLapr en el cual BL AA se refiere al gen a-amilasa de Bacill us licheniformis; aprE se refiere al promotor y péptido señal codificando la región del gen aprE; AmpR se refiere al gen de resistencia a ampicilina de pBR322; y CAT se refiere al gene de resistencia a cloramfenicol de pC194.
La Figura 7 ilustra el plásmido pHP.BL llevando el gen para a-amilasa de Bacill us licheniformis .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS
"a-Amilasa" significa una actividad enzimática la cual corta o hidroliza el a(l-4) enlace glicosídico, e.g., esto en almidón, amilopectina o polímeros de amilosa. a-Amilasa como es usada aquí incluye a-amilasas producidas naturalmente y así como a-amilasa recombinantes. Las a-amilasas preferidas en la presente invención son aquellas derivadas de Bacill us licheniformis, Bacill us amyloliquefaciens o Bacillus stearothermophilus, así como a-amilasas fúngales tales como aquellas derivadas de Aspergillus (i.e.', A. oryzae y A. niger) .
"a-Amilasa recombinante" significa una a-amilasa en la cual la secuencia de ADN codificando la a-amilasa naturalmente producida es modificada para producir una secuencia de ADN mutante que codifica la substitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos en la secuencia de a-amilasa comparada con la a-amilasa producida naturalmente.
"Vector de expresión" significa un constructor de ADN comprendiendo una secuencia de ADN la cual esta operativamente unida a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un huésped adecuado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora adicional para controlar tal transcripción, una secuencia codificando un adecuado mARN de sitio de unión a ribosoma y secuencias que controlen la terminación de la transcripción y traducción. Un promotor preferido es el promotor aprE de Bacill us subtilis . El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un potencial genómico insertado. Una vez transformado en un huésped, adecuado, el vector puede replicar y funcionar independientemente del genoma huésped, o puede, en algunos casos, integrarse el mismo dentro del genoma. En la presente especificación, plásmidos . y vectores son algunas veces usados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma usada de vector más común en el presente. Sin embargo, la invención trata de incluir tales formas de expresión de vectores los cuales cumplen funciones equivalentes y los cuales son, o serán, conocidos en el arte.
"Cadena huésped" o "célula huésped" significa un huésped adecuado para un vector de expresión, comprendiendo ADN que codifica la a-amilasa según la presente invención. Las células huéspedes útiles en la presente invención son generalmente huéspedes procarióticos o eucarióticos, incluyendo cualquier microorganismos transformable en el cual la expresión de a-amilasa según a la siguiente invención pueda ser lograda.
Específicamente, cadenas huéspedes de la misma especie o género del cual la a-amilasa es derivada son adecuadas, tal como la cadena de Bacill us . Preferiblemente, una cadena de a-amilasa negativa de Bacillus (genes eliminados) y/o una a-amilasa y proteasa eliminada de la cadena de Bacill us (AamyE, Aapr, Anpr) es usada. Células huésped son transformadas o transfectadas con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Tales células huéspedes transformadas son capaces tanto de replicación de vectores codificando la a-amilasa y sus variantes (mutantes) como de expresar la a-amilasa deseada.
"Licuefacción" o "licuado" significa un proceso por el cual el almidón es convertido a una cadena más corta y dextrinas menos viscosas. Generalmente este proceso involucra la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguida por la adición de a-amilasa.
De acuerdo a la presente invención, una a-amilasa mutante es proporcionada teniendo introducido en ella un primer residuo de cisteína el cual en capaz de formar un puente disulfuro con un segundo residuo de cisteína. Preferentemente, el primer residuo de cisteína comprende una adición o substitución a un precursor de a-amilasa. Es más adelante posible incorporar el segundo residuo de cisteína como una adición o así como una substitución, y esto puede ser preferible si un residuo de cisteína provechoso no estuviera presente en una locación provechosa para estabilizar la porción deseada de la molécula. Con respecto a la a-amilasa de Bacill us licheniformis, es necesario incorporar dos residuos de cisteína dado que la molécula de tipo salvaje no posee cisteínas. La adición o substitución de un aminoácido como es usada aquí se refiere a cualquier modificación de una secuencia de aminoácidos por si misma o el precursor de a-amilasa, pero preferentemente se refiere al uso de ingeniería genética para mutar un ácido nucleico codificando la a-amilasa precursora de tal manera que codifique el residuo de cisteína añadida o substituida en la proteína expresada. El precursor de a-amilasas incluye a-amilasas obtenidas naturalmente y a-amilasas recombinantes. La modificación de la secuencia precursora de ADN la cual codifica la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa precursora puede ser mediante métodos descritos aquí y que comúnmente corresponden a la U.S. Patent Nos. 4,760,025 y 5,185,258, incorporadas aquí por referencia.
También se proporciona una molécula de ácido nucleico (ADN) la cual codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la a-amilasa mutante proporcionada por la presente invención, sistemas de expresión que incorporan tales ADN incluyendo vectores y fagos, células huésped transformadas con tales ADN, y fibras en contra sentido de ADN que corresponde a la molécula de ADN la cual codifica la secuencia de aminoácidos. De manera similar, la presente invención incluye un método para producir una a-amilasa mutante mediante la expresión del ADN incorporado en un sistema de expresión el cual ha sido transformado en una célula huésped. La a-amilasa mutante de la invención puede ser utilizada en licuefacción de almidón, como un ingrediente en detergentes de ropa, detergentes de lavatrastes automáticos, productos limpiadores de superficies duras, en el procesamiento de la comida incluyendo aplicaciones para hornear, en el procesamiento textil incluyendo como un agente desaprestante, o en cualquier otra aplicación en la cual la actividad de la a-amilasa sea útil.
La a-amílasa precursora es producida por cualquier fuente capaz de producir a-amilasa. Fuentes apropiadas de a-amilasas son organismos procarióticos o eucarióticos, incluyendo hongos, bacterias, plantas o animales. Preferentemente, la a-amilasa precursora es producida por un Bacill us; más preferentemente, por Bacill us licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus stearothermophil us; y más preferentemente, la a-amilasa precursora se deriva del Bacillus licheniformis .
Se han encontrado homologías entre casi todas las endo-amilasas secuenciadas a la fecha, y van desde plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 23, pp.355-360 (1986); Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 128," pp. 470-476 (1985); Janecek, Eur. J. Biochem., Vol. 224, pp. 519-524 (1994)). Hay cuatro áreas de particularmente alta homología en ciertas amilasas de Bacill us, como se muestra en la Figura 4, en donde las secciones subrayadas designan las áreas de alta homología. Alineamientos en la secuencia también han sido utilizados para trazar la relación entre Bacillus endo-amilasas (Feng et al., J. Molec. Evol . , Vol. 35, pp. 351-360 (1987)) . La relativa homología en la secuencia entre la amilasa de Bacill us stearothermophilus y Bacill us licheniformis es de cerca del 66 % y aquella entre las amilasas de Bacill us licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens es cerca del 81 %, como es determinado por Holm et al., Protein Engineering, Vol. 3, No. 3, pp . 181-191 (1990) . Mientras la homología en la secuencia es importante, es generalmente reconocido que la homología estructural es también importante cuando se compara amilasas u otras enzimas. Por ejemplo, la homología estructural entre amilasas de hongos y amilasas bacterianas ha sido sugerida y, por lo tanto, las amílasas de hongos se abarcan dentro de la presente invención.
Entre otras, las substituciones en los residuos que corresponden a E119C/S130C y/o D124C/R127C en la a-amilasa de Bacill us licheniformis se identifican aquí por substitución. Así, residuos específicos tales como E119 se refieren a un número de posición del aminoácido (i.e., +119) lo cual refiere el número asignado a la secuencia de la a-amilasa madura del Bacill us licheniformis ilustrada en la Figura 2. La invención, sin embargo, no se limita a la mutación de la a-amilasa madura particular del Bacill us licheniformis sino que se extiende a a-amilasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en posiciones las cuales son equivalentes al residuo particular identificado en la a-amilasa del Bacill us licheniformis . Un residuo de una a-amilasa precursora es equivalente al residuo de la a-amilasa del Bacill us licheniformis si es ya sea homólogo (i.e., corresponde en posición para ya sea la estructura primaria o terciaria) o análogo a un residuo específico o porción de ese residuo en la a-amilasa del Bacillus licheniformis (i.e., teniendo la misma o similar capacidad funcional para combinar, reaccionar, o interactuar químicamente o estructuralmente) .
Para establecer homología a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una a-amilasa precursora es comparada directamente a la secuencia primaria de la a-amilasa del Bacill us licheniformis y particularmente a un grupo de residuos que se conocen por ser invariantes a todas las a-amilasas por los cuales las secuencias son conocidas (ver e.g., Figura 4). También es posible determinar residuos equivalentes mediante análisis de la estructura terciaria de las estructuras de cristal reportadas para la a-amilasa pancreática porcina (Buisson et al., EMBO Journal, Vol. 6, pp. 3909-3916 (1987); Qian et al., Biochemestry, Vol. 33, pp. 6284-6294 (1994); Larson et al., J. Mol. Biol., Vol. 235, pp. 1560-1584 (1994) ) ; Taka-amilasa A de Aspergill us oryzae (Matsuura et al., J. Biochem. (Tokio), Vol. 95, pp. 697-702 (1984)); y una a-amilasa acida de A. Níger (Boel et al., Biochemestry, Vol. 29, pp. 6244-6249 (1990)), con las dos estructuras anteriores siendo similares, y por la a-amilasa de cebada (Vallee et al., J. Mol . Biol .. , Vol. 236, pp. 368-371 (1994); Kadziola, J. Mol. Biol.., Vol. 239, pp. 104-121 (1994)). Varios estudios preeliminares han sido publicados en relación a la estructura secundaria de la a-amilasa, i.e., (Suzuki et al., J. Biochem., Vol. 108, pp. 379-381 (1990); Lee et al., Arch.
Biochem. Biophys. Vol. 291, pp. 255-257 (1991); Chang et al., J. Mol. Biol., Vol. 229, pp. 235-238 (1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol.., Vol. 234, pp. 1282-1283 (1993)), y por lo menos una estructura ha sido publicada para la a-amilasa cristalina del Bacillus licheniformis (Machius et al., J. Mol. Biol.. Vol. 246, pp. 545-549 (1995)). Sin embargo, varias investigaciones han predicho estructuras comunes super-secundarias entre glucanasas (MacGregor et al., Biochem. J., Vol. 259, pp. 145-152 (1989)) y dentro de las a-amilasas y otras enzimas metabolizantes de almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem. Vol. 12, pp. 791-805 (1993); MacGregor, Starke, Vol. 45', pp. 232-237 (1993)); y similaridades en la secuencia entre enzimas con estructuras similares super-secundarias a a-amilasas (Janecek, FEBS Letters, Vol. 316, pp_, 23-26 (1993);
Janecek et al., J. Prot. Chem., Vol. 12, pp. 509-514
(1993)) . Una estructura para la ' enzima del Bacillus stearothermophil us ha sido modelada en aquella de la
Taka-amilasa A (Holm et al., Protein Engineering, Vol. 3, pp. 181-191 (1990)). Las cuatro regiones altamente conservadas mostradas en la Figura 4 contienen muchos residuos que se piensa que son parte del sitio activo
(Matsuura et al., J. Biochem. (Tokio), Vol. 95, pp. 697- 702 (1984); Buisson et al., EMBO Journal, Vol. 6, pp. 3909-3916 (1987); Vihinen et al., J. Biochem., Vol. 107, pp. 267-272 (1990)) incluyendo His + 105; Arg +229; Asp +
231; His + 235; Glu + 261 y Asp + 328 bajo el sistema de numeración del Bacill us licheniformis .
En la práctica de la presente invención, ciertos parámetros son útiles para determinar con especificidad substituciones apropiadas. La información que concierne a la estructura del cristal de una enzima específica debería ser obtenida. Las estructuras de cristal de la a-amilasa del Bacill us licheniformis, la a-amilasa pancreática de puerco, la a-amilasa del Aspergillus níger y Aspergill us oryzae, y la a-amilasa de la cebada indicadas, supra, son útiles para este propósito. Con información relacionada a la estructura del cristal de la enzima blanco, es entonces útil obtener información relacionada a la inestabilidad de la enzima bajo condiciones específicas, y preferentemente obtener información relacionada a la presencia de residuos inestables específicos o regiones las cuales contribuyen a la inestabilidad e.n general de la enzima. Como un ejemplo específico, los Aspirantes estaban conscientes que la a-amilasa derivada del Bacill us licheniformis comprende varios residuos que son particularmente inestables bajo condiciones oxidantes, i.e., M197 y W138. En la práctica de la presente invención, los Aspirantes estudiaron específicamente la región que rodea al S148 debido a la habilidad de la mutación S148N de conferirle estabilidad aumentada. La hipótesis de que esta región puede tener elementos estructurales secundarios los cuales están hechos más estables por esta substitución guió a los Aspirantes a intentar estabilizar la enzima vía la introducción de puentes disulfuro en las regiones proximales de la estructura secundaria.
Para determinar los residuos específicos para la substitución, las distancias entre los carbonos alfa y los carbonos beta para cada uno de los residuos en la proteína doblada fueron medidos desde la estructura de cristal para determinar cuales pares caen dentro de las distancias permitidas para un puente disulfuro fueron ambos residuos de cisteína. Por ejemplo, el residuo par para el cual está contempiado incorporar una substitución (es) que resulte en dos residuos de cisteína debería preferentemente tener una distancia de carbonos alfa (Ca-Ca) de entre cerca de 4.4 y cerca de 6.8 Angstroms. De manera similar, la distancia de carbonos beta (Cß-Cß) debería ser entre cerca de 3.45 y 4.5 Angstroms. Seleccionando pares de aminoácidos los cuales caen dentro de estos criterios de distancia de carbonos y utilizando estrategias reseñadas en Swodhamini et al., supra, y Hazes et al., supra, fue posible minimizar el trastorno de la proteína el cual puede ser causado por la substitución de una cisteína y la formación subsecuente de un puente disulfuro entre dos tales cisteínas. De esta manera, es posible seleccionar un primero y un segundo residuos de cisteína para los cuales las condiciones son favorables para la formación de un puente disulfuro. Los Aspirantes así señalaron D124-R127 y E119-S130 como substituciones particularmente preferidas. Sin embargo, cualquier residuo par puede ser así utilizado mientras caiga dentro de los criterios apropiados proporcionados aquí.
Las a-amilasas según la presente invención las cuales exhiben características de un desempeño alterado que proporcionan resultados deseables e inesperados son útiles en las varias aplicaciones para las cuales las a-amílasas son comúnmente utilizadas. Por ejemplo, las a-amilasas según la presente invención las cuales exhiben características de un desempeño alterado a pH bajo, incluyendo termoestabilidad mejorada, estabilidad al pH mejorada y/o estabilidad oxidativa mejorada, son útiles en la licuefacción de almidón a pH bajo. La termoestabilidad mejorada será útil en la extensión de la vida de almacenamiento de los productos los cuales la incorporan. La estabilidad oxidativa mejorada o el desempeño mejorado es particularmente deseable en la limpieza de productos, y para la extensión de la vida media de la a-amilasa en la presencia de cloro, perborato, percarbonato o perecidos utilizados en tales productos de limpieza. Por el contrario, la estabilidad térmica reducida o la estabilidad oxidativa pueden ser útiles en procesos industriales los cuales requieran la supresión rápida y eficiente de la actividad amilolítica.
Las a-amilasas de la presente invención las cuales exhiben una mejor estabilidad a pH bajo serán especialmente útiles en el procesamiento del almidón y particularmente en la licuefacción del almidón. Las condiciones presentes durante los procesos de licuefacción comercialmente deseables característicamente incluyen pH bajo, alta temperatura y condiciones de potencial de oxidación que requieren a-amilasas que exhiban un mejor desempeño a pH bajo, una mejor estabilidad térmica y una mejor estabilidad oxidativa. Por consiguiente, las a-amilasas según la presente invención las cuales son particularmente útiles en la licuefacción exhiben un mejor desempeño a un pH de menos de cerca de 6, preferentemente de menos de cerca de 5.5, y más preferentemente menos de cerca de 5.0.
Adicionalmente, las a-amilasas según la presente invención las cuales exhiben una estabilidad térmica aumentada a temperaturas de entre cerca de 80-120°C, y preferentemente entre cerca de 100-110°C, y una estabilidad aumentada en la presencia de oxidantes que serán particularmente útiles.
Los componentes adicionales conocidos por los expertos en el arte a ser útiles en la licuefacción, incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, calcio, iones, sales u otras enzimas como las endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas amilasa pueden ser añadidos dependiendo de las condiciones de reacción proyectadas.
Por ejemplo, las combinaciones de la a-amilasa según la presente invención con a-amilasas de otras fuentes pueden proporcionar perfiles de acción únicos los cuales encuentran un uso particular bajo condiciones específicas de licuefacción. En particular, se contempla que la combinación de la a-amilasa según la presente invención con a-amilasa derivada del Bacill us stearothermophil us proporcionará una licuefacción mejorada a valores de pH debajo de 5.5 debido a los patrones de acción complementarios .
Durante la licuefacción, el almidón, específicamente almidón granular lechado de ya sea un proceso de molido húmedo o seco, es tratado con una a-amilasa de la presente invención según las técnicas de licuefacción conocidas. Generalmente, en el primer paso del proceso de degradación del almidón, el almidón lechado es gelatinizado mediante calentamiento a una temperatura relativamente alta (entre cerca de 180°C y cerca de 110°C) . Después de que el almidón lechado es gelatinizado, es licuado usando una a-amilasa.
En otra modalidad de la presente invención, las composiciones de detergente en ya sea forma líquida, gel o granular, la cual comprende la a-amilasa según la presente invención puede ser útil. Tales composiciones del detergente se beneficiarán particularmente de la adición de una a-amilasa según la presente invención la cual ha incrementado la estabilidad térmica para mejorar la vida del almidón o la estabilidad oxidativa aumentada tanto que la a-amilasa ha mejorado la resistencia al cloro o compuestos perácído comúnmente presentes en los detergentes. Así, la a-amilasa según la presente invención puede ser formulada venta osamente en detergentes en polvo, líquidos o en gel conocidos que tengan un pH de entre cerca de 6.5 y cerca de 12.0. Las composiciones de detergente que comprenden la a-amilasa según la presente invención pueden incluir más adelante otras enzimas tales como endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas amilasa, particularmente a-amilasa derivadas del Bacill us stearothermophilus, así como ingredientes adicionales como se conoce generalmente en el arte.
Una modalidad preferida de la presente invención más adelante comprende, en adición a la substitución de dos o más residuos de cisteína, cualquiera de uno o más de las substituciones conocidas en el arte para conferir estabilidad o actividad aumentada. Por ejemplo, la eliminación o substitución de un residuo de metionina o un residuo de triptofano, por ejemplo M15, M197 o W138 como se describe en WO 94/18314, la revelación de la cual es incorporada aquí mediante referencia; la substitución en H133Y como se describe en PCT Publication No. WO 91/00353; o la substitución en A209 como se describe en DeClerck, et al., J. Biol.. Chem., Vol. 265, pp. 15481-15488 (1900); o cualquiera de las substituciones descritas en PCT Publication Nos. WO 95/10603, WO 96/23873 y WO 96/23874. En reivindicaciones particularmente preferidas, la a-amilasa según la presente invención puede comprender más adelante una eliminación o substitución en uno o más residuos que corresponden a M15, A33, A52, S85, N96, V128, H133, S148N, S187, N188, A209, A269 y/o A379 en la a-amilasa de Bacillus licheniformis . Reivindicaciones particulares de la amilasa de la presente invención pueden comprender un patrón de substitución que corresponde a M15T/E119C/S130C/N188S, M15L/E119C/S130C/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S/A209V, M15T/E119C/S130C/N188S/A209V, M15T/E119C/V128E/S130C/H133Y/N188S, M15T/E119C/S130C/S187D/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S/A209V, M15T/E119C/S130C/H133Y/A209V o,
M15T/E119C/S130C/H133Y/S148N/A209V/A379S en Bacillus licheniformis .
Las reivindicaciones de la presente invención las cuales comprenden una combinación de la a-amilasa según la presente invención con enzimas proteasa preferentemente incluye proteasas oxidativamente estables como aquellas descritas en U.S. Re. 34, 606, incorporada aquí mediante referencia, así como enzimas comercialmente disponibles como el DURAZYM (Novo Nordisk) y PURAFECT® OxP (Genencor International, Inc.). Los métodos para hacer tales proteasas mutantes (proteasas oxidativamente estables) , y particularmente tales mutantes que tienen una substitución para la metionina en una posición equivalente a M222 en Bacillus amyloliquefaciens, son descritos en U.S. Re. 34, 606.
Una modalidad adicional de la presente invención comprende ADN que codifica una a-amilasa según la presente invención y vectores de expresión que comprenden tal ADN. Las secuencias de ADN pueden ser expresadas uniéndolas operablemente a una secuencia control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ése vector de expresión para transformar un huésped apropiado según las técnicas bien conocidas. Una amplia variedad de combinaciones de vector de expresión/huésped pueden ser empleadas en la expresión de secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, incluyen segmentos de secuencias de ADN cromosomal, no-cromosomal y sintético, tales como los varios plásmidos y fagos conocidos útiles para este propósito. Además, cualquiera de una amplia variedad de secuencias control de expresión son generalmente utilizadas en estos vectores. Por ejemplo, los Aspirantes han descubierto que una secuencia control de expresión preferida para transformantes de Bacilluses la péptido señal aprE derivada del Bacill us subtilis .
Una amplia variedad de células huésped también son útiles en la expresión de secuencias de ADN de esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como .cadenas de E. coli , Pseudomonas, Bacill us, Streptomyces, varios hongos, levaduras y células animales. Preferentemente, el huésped expresa la a-amilasa de la presente invención extracelular ente para facilitar la purificación y el procesamiento en el extremo inferior. La expresión y purificación de la a-amilasa mutante de la invención puede ser llevada acabo a través de medios reconocidos en el arte para llevar a cabo tales procesos.
Las a-amilasas mejoradas según la presente invención son consideradas para proporcionar varias ventajas importantes cuando se les compara con las a-amilasas de Bacillus tipo salvaje. Por ejemplo, una ventaja es la actividad aumentada encontrada a pH bajo y altas temperaturas típicas de los métodos de licuefacción del almidón comunes. Otra ventaja es el pH alto aumentado y la estabilidad oxidativa la cual facilita su uso en detergentes. Otra ventaja es que una hidrólisis más completa de moléculas de almidón es lograda la cual reduce el almidón residual en la corriente de procesamiento. Aún otra ventaja es su estabilidad mejorada en la ausencia de ion de calcio. Aún otra ventaja es que la adición de dosis iguales de proteínas de a-amilasa según la invención proporciona un desempeño superior cuando se le compara con la a-amilasa de Bacill us licheniformis de tipo salvaje debido a las mejoras en tanto la actividad específica y la estabilidad bajo condiciones de estrés. En otras palabras, a causa de la estabilidad generalmente aumentada de las amilasas según la presente invención, la actividad específica aumentada en el almidón de las amilasas inventivas se traduce a beneficios de potencial de desempeño aún mayores de esta variante. Bajo condiciones donde la enzima tipo salvaje está siendo inactivada, no solamente más de la amilasa inventiva sobrevive por su estabilidad aumentada, sino también aquella la cual sobrevive expresa proporcionalmente más actividad a causa de su actividad específica aumentada.
Lo siguiente es presentado a modo de ejemplo y no debe de ser interpretado como una limitación al campo de las reivindicaciones. Las abreviaciones utilizadas aquí, particularmente notaciones de tres o una letras para los aminoácidos se describen en Dale, J.W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, (1989) Apéndice B.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Construcción Del Plásmido pHP.BL
El gen de la a-amilasa mostrado en la Figura 2 fue clonado del Bacill us licheniformis NCIB8061 (Gray et al., J. Bacteriology, Vol. 166, pp. 635-643 (1986)). El fragmento 1.72kb Pstl-Sstl, que codifica los últimos tres residuos de la secuencia señal, la proteína entera madura y la región terminador, fue subclonada en M13mpl8. Un terminador sintético fue añadido entre los sitios Bell y Sstl utilizando un cartucho de oligonucleótido sintético de la forma:
'- GATCAA?ACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT- 3' (SEC ID N0:7) 3' -TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAA?AATAATAAA?AC-5'
(SEC ID NO: 8)
diseñada para contener el Bacillus amyloliquefaciens subtilis en terminador transcrípcional (Wells et al., Nucleic Acid Research, Vol. 11, pp. 7911-7925 (1983)).
El plásmido pBLapr fue construido transportando el gen para la a-amilasa del Bacillus licheniformis . Como se ilustra en la Figura 6, el pBLapr comprende un plásmido de ß.lkb incluyendo el gen de resistencia a la ampicilina del pBR322 y el gen de resistencia al cloramfenicol del pC194, el promotor aprE y el gen que codifica para la a-amilasa del Bacill us licheniformis ("BLAA") . El promotor aprE fue construido de un fragmento de 660bp HindlII-Pstl que codifica para el promotor y la secuencia señal de la proteasa alcalina del Bacill us subtilis . El sitio del Pstl fue removido, y un sitio Sfil añadido cerca del empalme aprE/BL AA. El gen BLAA comprende el fragmento de 1720 bp Pstl-Sstl descrito arriba. En el trabajo descrito aquí, el pBLapr fue construido' con un sitio Sfil adyacente al extremo 5' del inicio de la secuencia codificante para el gen de la amilasa maduro. Específicamente, el extremo 5' de la construcción pBLapr fue subclonado en un fragmento EcoRI-Sstll del pBLapr en M13BM20 (Boehringer Mannheim) para obtener una fibra codificante de plantilla para el oligonucleótido mutagénico de abajo:
' -CCC ATT AAG ATT GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3' (SEC ID NO: 9)
Este iniciador introdujo un sitio Sfil (indicado mediante el subrayado) el cual permitió que las formas correctas fueran protegidas mediante la presencia de este sitio de restricción único. El subclonaje del fragmento EcoRI-Sstll de vuelta dentro del vector pBLapr dio una versión del plásmido que contiene un sitio Sfil.
El plásmido pHP13 (Haima et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 209, pp. 335-342 (1987) ) (Figura 5) fue digerido con enzimas de restricción EcoRI y HindIII y el vector resultante purificado en gel de poliacrimida y entonces eluido. El plásmido pBLapr fue digerido con HindIII, Asp718 y en una incubación separada con Asp718, EcoRI y gel purificados. Dos bandas, HindIII-Asp718 (1203 bp) y Asp718-EcoRI (1253 bp) fueron purificadas con gel, eluidas del gel y ligadas dentro del vector mediante una ligadura de 3 vías, para dar el plásmido pHP.BL, el plásmido utilizado en la expresión de la a-amilasa (Figura 7) .
EJEMPLO 2
Construcción Del Plásmido .Que Codifica La a-Amilasa Que Comprende Substituciones En E119C/S130C O D124C/R127C
Un plásmido pBLapr que tiene treonina substituida por metionina en el aminoácido 15 fue construido según la U.S. Patent Application Serial No. 08/194,664 (PCT Publication No. WO 94/18314) . Para introducir los residuos de cisteína adicionales, los siguientes iniciadores mutagénicos que codifican para substituciones de E119C/S130C y D124C/R127C fueron usadas junto con iniciadores no-mutagénicos para introducir las mutaciones deseadas dentro de múltiples repeticiones tándem lineares del plásmido mediante el método de multimerización como se describe abajo.
119C/130C AA CCg Cgg TTT gCg TCg ATC CCg CTg ACC gCA ACC gCg TAA
TTT gCg gAg AAC ACC (SEC ID NO: 10)
124C/127C TCg ATC CCg CTT gCC gCA ACTgCg TAA TTT Cag gAg AA (SEC ID
NO:ll)
Un fragmento que empieza en el iniciador mutagénico (mostrada arriba) y que termina en el extremo 3' de la región codificante fue generado mediante PCR. Este fragmento fue purificado con gel y utilizado para generar largas, repeticiones tándem lineares del plásmido que codifica las mutaciones de cisteína deseadas como sigue:
El vector (pBLapr/M15T) fue linearizado mediante digestión por restricción (Sal I) y purificado utilizando equipos Qiagen. Las reacciones de multimerización típicamente contenían 5.4 mM Tris amortiguador pH 8.0, lx XL amortiguador (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) , 0.2 mM dNTPs, 1.1 mM Mg (Oac)2,3 ng/µl de fragmento entrante, 0.15 ng/µl de vector linearizado, 4 U rTth ADN polimerasa, XL (Perkin Elmer) en 100 µl de mezcla de reacción. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo típicamente en un termociclizador bajo las siguientes condiciones: 20 ciclos (15 s 94°C, 5 min 68°C) y 15 ciclos (15 s 94°C, 10 min 68°C) .
Los multímeros resultantes fueron transformados directamente en células competentes de B. Subtilis utilizando técnicas estándar. El plásmido de ADN fue aislado de los transformantes utilizando técnicas estándar.
Las mutaciones fueron confirmadas mediante secuencias dideoxi (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, pp. 5463-5467 (1977)).
EJEMPLO 3
Transformación De Plásmidos En Bacill us subtilis, Expresión Y Purificación de a-Amilasa Mutante
La a-amilasa puede ser expresada en Bacill us subtilis después de la transformación con los plásmidos descritos arriba. El pHP13 es un plásmido capaz de replicarse en E. coli y en Bacillus subtilis . Los plásmidos que contienen diferentes variantes fueron construidos utilizando la cadena MM294 de E. coli, los plásmidos aislados y entonces transformados en Bacill us subtilis como se describe en Anagnostopoulos et al., J. Bacter., Vol 81, pp. 741-746 (1961) . La cadena de Bacillus ha sido eliminada por dos proteasas (Capr, Cnpr) (ver e.g., Ferrari et al., U.S. Patent No. 5,264,366) y por amilasa
(CamyE) (ver e.g., stahl et al., J. Bacter., Vol. 158, pp. 411-418 (1984) ) . Después de la transformación, la mutación sacU(Hy) (Henner et al., J. Bacter., Vol. 170, pp. 296-300 (1988)) fue introducida mediante transducción mediada PBS-1 (Hoch, J. Bact., Vol. 154, pp. 1513-1515
(1983) ) .
La amilasa secretada fue recuperada de los cultivos de Bacill us subtilis como sigue: Se añadió cloruro de sodio al sobrenadante del cultivo a 20 mM y el pH fue ajustado a aproximadamente 7.0 con 1 M tris amortiguador, pH 7.2. Ei sobrenadante fue entonces calentado a 70°C durante 15 minutos, y el precipitado fue . eliminado por centrifugación. Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante a 1.3 M seguido de 20 ml de fenil sefarosa flujo rápido 6 (substitución alta) resina (Farmacia) . Después de la agitación, la resina fue separada mediante filtración, y lavada en 1 M de sulfato de amonio, 20 mM de acetato de amonio a pH 7.0, 5 mM de cloruro de calcio. La amilasa determinada fue eluida en 20 mM de acetato de amonio a pH 7.0, 5 mM de cloruro de calcio, y precipitada mediante la adición de sulfato de amonio a 70 % de saturación. El material precipitado fue conglomerado mediante centrifugación, vuelto a disolver en un volumen mínimo de 20 mM de acetato de amonio a pH 7.0, 5 mM de cloruro de calcio y dializado contra el mismo amortiguador .
La concentración fue determinada utilizando el ensayo de substrato soluble, asumiendo actividad específica tipo salvaje .
EJEMPLO 4
Ensayo Para La Determinación De La Actividad De La a- Amilasa
Ensayo de Substrato Soluble: Un ensayo de proporción fue desarrollado basado en un equipo de ensayo de punto final proporcionado por Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. Un frasco de substrato (p-nitrofenil maltoheptaosida, BPNPG7) fue disuelto en 10 ml de agua estéril seguida de una dilución
1:4 en un amortiguador de ensayo (50 mM de amortiguador maleato, pH 6.7, 5 mM de cloruro de calcio, 0.002 %
Tween20) . Los ensayos fueron llevados a cabo mediante la adición de 10 µl de amilasa a 790 µl del sustrato en un recipiente a 25 °C. Las tasas de hidrólisis fueron medidas a razón del cambio de absorción a 410 nm, después de un retraso de 75 segundos. El ensayo fue linear hasta tasas de absorción de 0.2 unidades/min.
La concentración de proteína a-amilasa fue medida utilizando el Ensayo Bio-Rad estándar (Bio-Rad Laboratories) basado en el método de Bradford, 7?nal . Biochem. , Vol. 72, p. 248 (1976) utilizando albúmina de sueros bovinos estándar.
EJEMPLO 5
Preparación y Prueba de Alfa-Amilasas Mutantes Adicionales para Estabilidad Térmica
Las alfa-amilasas mutantes de B.' Licheniformis fueron preparadas conteniendo substituciones en M15T o M15T/E119C/S130C. Las tasas de inactivación térmica para los varios mutantes fueron medidas según el procedimiento siguiente. Las soluciones de amilasa almacenada fueron dializadas extensivamente en 20 mM .de acetato de amonio, 4 mM CaCl2 a pH 6.5. Cada muestra fue separada en dos frascos iguales se le añadió ditiotreitol a uno de los frascos a 10 mM y se le guardó por lo menos durante la noche a 4°C. Para la medición de estabilidad, ésta reserva fue diluida >50fold en 50 mM de acetato de amonio, 5 mM de CaCl2, 0.02 % Tween 20 pH 4.8 a una concentración final de entre 30 y 50 µg/ml. Para aquellas reservas que contienen 10 mM DTT, los amortiguadores de dilución contenían 1 mM DTT. Seis alícuotas de 100 µl fueron puestas en tubos eppendorf y colocadas en un baño de agua o un bloque caliente a 83°C. Los tubos eppendorf fueron removidos a intervalos, medidos regularmente de entre 30 segundos y 5 minutos y colocados en hielo para detener la inactivación. La activación residual fue ensayada usando un sustrato soluble como se describe en el Ejemplo 4. El logaritmo natural de la actividad fue colocado contra el tiempo de incubación, y la proporción constante para la inactivación obtenida de la pendiente de la línea recta. Los resultados para varios mutantes se proporcionan en la Tabla 1.
TABLA 1
Como se muestra en la Tabla 1, las enzimas mutantes a las que se les ha introducido dos residuos de cisteína capaces de formar un enlace disulfuro muestran una estabilidad significativamente aumentada sobre la enzima mutante M15T que no presenta enlaces cisteína. Además, como se muestra en la Tabla 1, las 'enzimas mutantes a las que se les ha introducido un enlace disulfuro entre E119C y S130C mostraron una estabilidad significativamente mejorada sobre el mutante M15T o el mutante M15T/E119C/S130C el cual fue tratado con DTT (i.e., enlace disulfuro disminuido y/o roto) .
Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
Claims (8)
- RE I VINDI CAC I ONE S Una a-amilasa mutante capaz de formar un enlace disulfuro entre un primero y un segundo residuo de cisteína, caracterizada porque dicha a-amilasa mutante se deriva de un precursor de la a-amilasa y dicho primer residuo de cisteína resulta de una substitución o adición de un aminoácido a dicho precursor de la a-amilasa.
- La a-amilasa mutante según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho primer residuo de cisteína corresponde a un residuo en dicho precursor de la a-amilasa que tiene una distancia de enlace Ca-Ca de entre cerca de 4.4-6.8 Angstroms y una distancia de enlace Cß-Cß de entre cerca de 3.45 y 4.5 Angstroms con dicho segundo residuo de cisteína o un residuo que corresponde a dicho residuo de cisteína en dicho precursor de la a-amilasa.
- La a-amilasa según la reivindicación 2, caracterizada porque dicha a-amilasa comprende una substitución que corresponde a E119C/S130C y/o D124C/R127C de Bacillus licheniformis .
- 4. La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha a-amilasa se deriva de una fuente bacteriana o fungal.
- 5. La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha a-amilasa se deriva del Bacill us.
- 6. La a-amilasa según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha a-amilasa se deriva del Bacill us licheniformis, Bacill us stearothermophil us o Bacillus amyl oli qu efa ci en s . 1 .
- La a-amilasa según la reivindicación 1 caracterizada porque dicha a-amilasa comprende más adelante la eliminación o substitución de un residuo correspondiente a M15, A33, A52, S85, N96, V129, H133, S148N, S187, N188, A209, A269 y/o A379 en Bacill us licheniformis .
- 8. Una a-amilasa caracterizada por ser el producto de expresión de una secuencia de ADN mutada que codifica una a-amilasa, la secuencia de ADN mutada siendo derivada de un precursor de la a-amilasa mediante una substitución correspondiente a M15T/E119C/S130C/N188S, M15L/E119C/S130C/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S/A209V, M15T/E119C/S130C/N188S/A209V, M15T/E119C/V128E/S130C/H133Y/N188S, M15T/E119C/S130C/S187D/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N1888S/A209V, M15T/E119C/S130C/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S, o M15T/E119C/S130C/H133Y en Bacill us licheniformis . La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque la substitución más adelante comprende la substitución o eliminación de un residuo correspondiente a M15T, W138Y y/o M197T en Bacill us licheniformis . . Un ADN caracterizado porque codifica la a-amilasa según ía reivindicación 1. . Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ADN de la reivindicación 10. . Una célula huésped caracterizada por estar transformada con el vector de expresión de la reivindicación 11. . Una a-amilasa según las reivindicaciones 1, 3 o 7 caracterizada porque tiene un desempeño mejorado a pH bajo. . Una composición detergente caracterizada porque comprende la a-amilasa según la reivindicación 1. . La composición detergente según la reivindicación 14, caracterizada porque dicho detergente es útil para limpiar ropa sucia y /o trastes sucios. . Un método de licuefacción de almidón caracterizado porque comprende la puesta en contacto de almidón lechado con la a-amilasa según la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08890383 | 1997-07-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA00000384A true MXPA00000384A (es) | 2001-03-05 |
Family
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