MXPA99003634A - Alfa-amilasa mutante que comprende modificacion en los residuos correspondientes a a210, h405 y/o t5412 en bacillus licheniformis - Google Patents

Abstract

Se divulgan enzimas de alfa-amilasa en las cuales se muta uno o más de los residuos que corresponden a A210, H405 Y T412 en Bacillus lincheniformis. Las enzimas de alfa-amilasa divulgadas muestran estabilidad y/o perfiles de actividad modificados o mejorados.

Description

fl A-AMILASA MUTANTE QUE COMPRENDE MODIFICACIÓN EN LOS RESIDUOS CORRESPONDIENTES A A210, H405 Y/O T412 EN Bacillus licheniformis CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida a-amilasas con mutaciones introducidas en las mismas que proveen estabilidad adicional bajo ciertas condiciones. Se contempla específicamente que la mutante tendrá características de desempeño modificadas como estabilidad modificada y/o perfiles de actividad modificados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las a-amilasas (a-1, -glucan-4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.1) hidrolizan enlaces a-1, -glucosídicos internos en almidón, mayormente al azar, para producir malto-dextrinas de peso molecular más bajo. Las a-amilasas son de considerable valor comercial, ya que se utilizan en las etapas iniciales (licuación) del procesamiento de almidón; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices detergentes; y en la industria textil para descrudar el almidón. Las a-amilasas son producidas por una REF.: 30147 amplia variedad de microorganismos incluyendo Bacill us y Aspergill us, la mayoría de las amilasas comerciales siendo producidas de fuentes bacterianas como Bacill us licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacill us stearothermophil us . En años recientes, las enzimas preferidas para uso comercial han sido aquellas de Bacill us licheniformis debido a su estabilidad calórica y su rendimiento bajo condiciones operativas comerciales. Por lo general, el procesamiento de almidón a fructosa consiste en cuatro pasos: licuación de almidón granular, sacarificación del almidón licuado a dextrosa, purificación e iso erización a fructosa. El objeto de un proceso de licuación de almidón es convertir una suspensión concentrada de granulos de polímeros de almidón en una solución de dextrinas solubles con un largo de cadena más corto y baja viscosidad. Este paso es esencial para la manipulación cómoda con equipo estándar y para la conversión eficiente en glucosa u otros azúcares. Para licuar el almidón granular, hay que gelatinizar los granulos subiendo la temperatura del almidón granular a más de alrededor de 72°C. El proceso de calentamiento instantáneamente desorganiza los granulos de almidón insolubles para producir una solución de almidón soluble en agua. Entonces se licúa a solución de almidón solubilizada con una a-amilasa (EC 3.2.1.1.).

Un proceso de licuación enzimática común comprende ajustar el pH de una lechada de almidón granular a entre 6.0 y 6.5, el pH óptimo de una a-amilasa derivada de Bacill us licheniformis, con la adición de hidróxido calcico, hidróxido sódico o carbonato sódico. La adición de hidróxido calcico tiene la ventaja de proveer además iones de calcio que se sabe que estabilizan las a-amilasas contra inactivación. Una vez agregadas las a-amilasas, se bombea la suspensión a través de un chorro de vapor para subir la temperatura instantáneamente a entre 80 y 115°C. El almidón se gelatiniza inmediatamente y, debido a la presencia de las a-amilasas, se despolimeriza por medio de la hidrólisis aleatoria de enlaces glucosídicos a (1-4) con una masa fluida que se bombea fácilmente. En una segunda variación del proceso de licuación, se agrega a a-amilasa a la suspensión de almidón, se mantiene la suspensión a una temperatura de 80-100°C para hidrolizar parcialmente los granulos de almidón y se bombea la suspensión de almidón parcialmente hidrolizado por un chorro a temperaturas mayores de alrededor de 105°C para gelatinizar completamente cualquier estructura granular restante. Tras enfriar el almidón gelatinizado, se puede realizar una segunda adición de a-amilasa para hidrolizar el almidón aun más. Una tercera variación de este proceso se llama el proceso de molienda seca. En la molienda seca, se muele el grano entero y se combina con agua. Opcionalmente se remueve el germen mediante separación por flotación o técnicas equivalentes. Se licúa la mezcla resultante, que contiene almidón, fibra, proteína y otros componentes del grano, usando a-amilasa. La práctica general en el oficio es emprender la licuación enzimática a una temperatura más baja cuando se utiliza el proceso de molienda seca. Por lo general, se cree que a licuación a baja temperatura es menos eficiente que la licuación a alta temperatura para convertir el almidón en dextrinas solubles. Típicamente, tras la gelatinización se mantiene la solución de almidón a una temperatura elevada en presencia de a-amilasa hasta lograr un DE de 10-20, por lo general un período de 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es la norma de la industria para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculada como D-glucosa en base a peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un DE de virtualmente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100. La temperatura máxima a la cual se puede mantener la solución de almidón que contiene a-amilasa depende de la fuente microbiana de la cual se obtuvo la enzima y la estructura molecular de la molécula de a-amilasa. Las a-amilasas producidas por cepas de tipo salvaje de Bacillus subtilis o Bacilius amyloliquefaciens típicamente se utilizan a temperaturas no mayores de alrededor de 90°C debido a la inactivación térmica excesivamente rápida más allá de esa temperatura, mientras que las a-amilasas producidas por cepas de tipo salvaje de Bacill us licheniformis se pueden usar a temperaturas de hasta alrededor de 110°C. Se sabe Que la presencia de almidón e ion de calcio estabiliza las a-amilasas contra inactivación. No obstante, se utilizan las a-amilasas a valores de pH mayores de 6 para proteger contra la inactivación rápida. A temperaturas bajas se sabe que la a-amilasa de Bacill us licheniformis muestra actividad hidrolizante en el substrato de almidón a valores de pH menores de 5. Sin embargo, cuando se usa la enzima para hidrólisis de almidón a temperaturas de chorro comunes, por ejemplo, entre 102°C y 109°C, hay que mantener el pH por lo menos por encima de un pH de 5.7 para evitar una inactivación excesivamente rápida. El requisito de pH desafortunadamente provee una ventana estrecha de oportunidad para el procesamiento porque los valores de pH mayores de 6.0 resultan en productos secundarios indeseables, por ejemplo maltulosa. Por lo tanto, en realidad por lo general se mantiene el pH de la licuación entre 5.9 y 6.0 para lograr un rendimiento satisfactorio de almidón hidrol zado.

Otro problema relacionado con el pH de la licuación es la necesidad de aumentar el pH de la suspensión de almidón de desde alrededor de 4, el pH de una suspensión de almidón de maíz como viene de la etapa de molienda húmeda, a 5.9-6.0. Este ajuste de pH requiere la adición costosa de agentes químicos ácido-neutralizantes y también requiere la refinación adicional del intercambio de iones del producto de conversión de almidón final para remover el agente químico. Además, el próximo paso en el proceso después de la licuación, típicamente la sacarificación del almidón licuado en glucosa con glucoamilasa, requiere un pH de 4-4.5; por lo tanto, hay que ajustar el pH hacia abajo de 5.9-6.0 a 4-4.5, lo cual requiere pasos adicionales de adición química y refinación. Tras la licuación, se sacarifica el almidón procesado a glucosa con glucoamilasa. Ocurre un problema con los procesos actuales cuando hay almidón residual presente en la mezcla de sacarificación debido a una licuación incompleta del almidón, por ejemplo hidrólisis de amilosa insuficiente por amilasa. El almidón residual es altamente resistente a hidrólisis por glucoamilasa. Representa una pérdida en rendimiento y estorba la filtración de los jarabes corriente abajo. Además, se saoe que muchas a-amilasas requieren la adición de ion de calcio para estabilidad. Esto aumenta aun más el costo de la licuación. En la Patente estadounidense no. 5.322.778, se logró la licuacón a un pH de entre 4.0 y 6.0 agregando un antioxidante como bisulfito o una sal del mismo, ácido ascórbico o una sal del mismo, ácido eritórbico o antioxidantes fenólicos como hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o a-tocoferol a la lechada de liación. Según esta patente, debe agregarse bisulfito sódico en una concentración mayor de 5 mM. En la Patente estadounidense No. 5.180.669, se logró la licuación a un pH de entre 5.0 a 6.0 mediante la adición de ion ce carbonato en exceso de la cantidad necesaria para tamponar la solución a la lechada de almidón molido. Debido a un efecto de pH aumentado que ocurre con la adición del ion de carbonato, por lo general se neutraliza la lechada agregando una fuente de ion de hidrógeno, por ejemplo un ácido inorgánico como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. En la Publicación de PCT No. C 95/35382, se describe una a-amilasa mutante con estabilidad de oxidación mejorada y con cambios en las posiciones 104, 128, 187 y/o 188 en la a-amilasa de B. lí cheniformis . En la Publicación de PCT No. WC 96/23873, se describen a-amilasas mutantes que tienen cualquiera de un número de mutaciones. ?0.

En la Publicación,' de PCT No. WC 94/02597, se describe una a-amilasa il íante con estabilidad oxidante mejorada donde se reemplaza una metionina a más con cualquier aminoácido salvo cisteína o metionina. En la Publicación de PCT No. WC 94/18314, se describe una a-amilasa mutante con estabilidad oxidante mejorada donde se reemplaza uno o más de los residuos de metionina, triptófano cisteína, histidina o tirosina con un aminoácido no oxidable. En la Publicación de PCT No. WC 91/00353, se enfocan las características y los problemas de rendimiento asociados con la licuación con a-amilasa de Bacill us licheniformis de tipo salvaje mediante la ingeniería genética de la a-amilasa - para incluir las sustituciones específicas de Ala-111-Tr, His-133-Tir y/o Tr-149-Ile. Varios investigadores (Vihinen et al., J. Biochem., Vol 107, págs. 267-272 (1990); Holm et al., Protein Engineering, vol. 3, págs. 181-191 (1990); Takáse et al., Biochemica et Biophysica Acta, Vol. 1120, págs. 281-288 (1992); Matsui et al., FEBS Letters, Vol. 310, págs. 216-218 (1992); Matsui et al., Biochemistry, Vol. 33, págs. 451-458 (1992); Sogaard et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, págs. 22480-22484 (1993); Sogaard et al., Carbohydrate Polymers, Vol. 21, págs. 137-146 (1993); Svensson, Plant Mol. Biol., Vol. 25, págs. 141-157 (1994); Svensson et al., a? J. Biotech., Vol. 29, págs. 1-37 (1993)) han realizado estudios utilizando técnicas de ADN recombinante para explorar cuáles residuos son importantes para la actividad catalítica de las amilasas y/o para explorar el efecto de modificar ciertos aminoácidos dentro del sitio activo de varias amilasas y glicosilasas. Los investigadores también han estudiado cuáles residuos son importantes para la estabilidad térmica (Suzuki et al., J. Biol. Chem. Vol. 264, págs. 18933-18938 (1989); Watanabe et al., Eur. J. Biochem... Vol. 226, págs. 277-283 (1994)); y un grupo ha usado tales métodos para introducir mutaciones en varios residuos de histidina en una amilasa de Bacill us licheniformis , siendo el fundamento que la amilasa de Bacill us licheniformis que se sabe que es relativamente termoestable en comparación con otras amilasas de Bacill us similares tiene un exceso de histidinas y, por lo tanto, se sugirió que el reemplazo de una histidina podría afectar la termoestabilidad de la enzima. Este trabajo resultó en la identificación de mutaciones estabilizantes en el residuo de histidina en la posición +133 y el residuo de alanina en la posición +209 (Declerck et al., J. Biol. Chem., Vol. 265. págs. 15481-15488 (1990); FR 2 665 178-A1; Joyet et al., Bio/Technology, Vol. 10, págs 1579-1583 (1992)). A pesar de los avances logrados en las anterioridades, existe la necesidad de una a-a?ilasa que sea más eficaz en los procesos de licuación comerciales pero que permita la actividad a un pH más bajo de lo que actualmente es práctico. Además, existe la necesidad de amilasas mejoradas que tengan características que las hagan más eficaces bajo las condiciones de uso detergente. Ya que las amilasas comercialmente disponibles no son aceptables bajo muchas condiciones debido a problemas de estabilidad, por ejemplo los altos niveles de alcalinidad y oxidantes (blanqueo) asociados con los detergentes, o las temperaturas bajo las cuales funcionan, existe la necesidad de una amilasa con perfiles de rendimiento modificados, y preferentemente aumentados, bajo tales condiciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

Es un objeto de esta Invención proveer una a-amilasa con perfiles de rendimiento modificados. Es un objeto adicional de esta invención Proveer una a-amilasa con estabilidad mejorada a alta temperatura. En consecuencia, esta invención provee una a-amilasa en la cual se ha introducido una mutación que comprende la adición, substitución o supresión de un residuo que corresponde a A210, H405 y/o T412 en la a- amilasa de Bacill us licheniformis. En una realización particularmente preferida de la invención, se deriva la a-amilasa de una fuente bacteriana o fúngica y comprende una sustitución correspondiente a Bacill us licheniformis . Más preferentemente, la a-amilasa se deriva de Bacill us y las mutaciones corresponden a A210T, H405D y/o 7412A en Bacillus licheniformis . La invención comprende además ácidos nucleicos que codifican tales amilasas mutantes, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, células huéspedes transformadas con tales vectores y métodos para expresar a-amilasas mutantes que utilizan tales células huéspedes. La invención comprende además el usó de a-amilasas mutantes según la invención para licuar almidón en el camino del procesamiento de almidón a glucosa u otros derivados de almidón, como aditivo en detergentes como detergentes para lavar ropa y vajilla, a modo de ayuda para la cocción y para descrudar textiles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS, La Figura 1 ilustra la secuencia de ADN del gen para una a-amilasa de Bacill us licheniformis (NCIB 8061) (Número de Identificación de Secuencia 1) y la secuencia aminoácida deducida del producto de transferencia (Número de Identificación de Se Élncia 2) según lo descrito por Gray et al., J. Bacteriology, Vol. 166, págs. 635-643 (1986) . La Figura 2 ilustra la secuencia aminoácida Número de Identificación de Secuencia 3) de la encima de a-amilasa madura de Bacill us licheniformis . La Figura 3 ilustra una alineación de las estructuras primarias de tres a-amilasas de Bacill us . Gray et al., J. Bacterialogy, Vol. 166, págs. 635-643 (1986) describen la a-amilasa de Bacillus licheniformis (Am-Lich) (Número de Identificación de Secuencia 4); Takkinen et al., J. Biol. Chem., Vol. 258, págs. 1007-1013 (1983) describen la a-amilasa de Bacíll us amyloliquefaciens (Am-Amylo) (Número de Identificación de Secuencia 5); e Ihara et al., J. Biochem, vol. 98, págs. 95-103 (1985) describen la a-amilasa de Bacill us stearothermophii us (Am-Stearo) (Número de Identificación de Secuencia 6) . La Figura 4 ilustra al plásmido pHP13 donde CmR se refiere a la resistencia a cloranfenicol, EMR se refiere a la resistencia a eritromicina y Rep pTA1060 se refiere al origen de replicación del plásmido pTA1080. La Figura 5 ilustra el plásmido pBLapr donde BL AA se refiera al gen de la a-amilasa de Bacill us licheniformis ; aprE se refiere a la región de codificación del péptido señalizador y promotor del gen de aprE; AmpR se refiere al gen resistente a ampicilina de pBR322; y CAT se ( W refiere al gen resistente a cloranfenicol de pC194. La Figura 6 ilustra el plásmido pHP.BL que lleva 5 el gen para la a-amilasa de Bacillus lícheniformis .

DESCRIPCIÓN DETALLADA. "a-Amilasa" significa una actividad enzimática que divide o hidroliza el enlace glucosídico a(l-4), por ejemplo, aquel en almidón, amilopectina o polímeros de amilosa. La a-amilosa utilizada en la presente invención incluye a-amilasas que ocurren naturalmente así como a-amilasas recombinantes. Las a-amilasas preferidas en esta invención son las derivadas de Bacill us lechíniformis, Bacill us amyl oliquefaciens o Bacill us stearothermophil us, así como las a-amilasas fúngicas como las derivadas de Aspergill us (es decir, A. oryzae y A. niger) . 20 "a-Amilasa recombinante" significa una a-amilasa en la cual se modifica la secuencia de ADN que codifica la a-amilasa que ocurre naturalmente para producir una secuencia de ADN mutante que codifica la sustitución, inserción o supresión de un aminoácido o más en la secuencia de a-amilasa en comparación con la a-amilasa que ocurre naturalmente. "Vector de expresión" significa una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que está enlazada operablemente a una secuencia de control apropiada capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un huésped apropiado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción una secuencia operadora opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica los sitios de enlace de ribosoma de ARNm apropiados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la transferencia. Un promotor preferido es el promotor de aprE de Bacill us subtilis . El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o sencillamente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped apropiado, el vector puede realizar la replicación y funcionar independientemente del genoma huésped, o puede, en algunas instancias, integrarse en el genoma mismo. En la especificación actual, a veces se utilizan el plásmido y el vector intercambiablemente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada en la actualidad. Sin embargo, la intención de la invención es incluir tales otras formas de vectores de expresión que cumplan funciones equivalentes y que se conozcan o lleguen a conocerse en el oficio. "Cepa huésped" o "célula huésped" significa un huésped apropiado para un vector de expresión que comprende el ADN que codifica la a-amilasa según esta invención. Por lo general las células huéspedes útiles en esta invención son huéspedes procarióticos o eucarióticos, incluyendo todo microorganismo transformable en el cual se puede lograr la expresión de una a-amilasa según esta invención. Específicamente, las cepas huéspedes de la misma especie o género del cual se deriva la a-amilasa son apropiadas, como una cepa de Bacill us . Preferentemente, se utiliza una cepa de Bacíll us negativa para a-amilasa (genes suprimidos) y/o una cepa de Bacillus con la a-amilasa y proteasa suprimidas (?amiE) , &apr, Anpr) . Se transforman o transfectan las células huéspedes con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Tales células huéspedes transformadas son capaces de o replicar vectores que codifican la a-amilasa y sus variantes (mutantes) o de expresar la a-amilasa deseada. "Licuación" o "licuar" significa un proceso por el cual se convierte el almidón en dextrinas de cadena más corta y menos viscosas. Por lo general, este proceso involucra la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguido por la adición de a-amilasa. Según esta invención, se provee una a-amilasa mutante en la cual se ha introducido una sustitución, adición o supresión en A210, H405 y/o T412. La supresión, según lo utilizado modificación de la secuencia aminoácida de la a-amilasa precursora en si, pero preferentemente se refiere al uso de ingeniería genética para mutar un ácido nucleico que codifica la a-amilasa precursora de modo que se £odifique el residuo suprimido, sustituido o agregado en la proteína expresada. Las a-amilasas precursoras incluyen a-amilasas que ocurren naturalmente y a-amilasas recombinantes. La modificación de la secuencia de ADN del precursor que codifica la secuencia aminoácida de la a-amilasa precursora puede realizarse por métodos descritos en la presente y en las Patentes estadounidenses de propiedad común números 4.760.025 y 5.185.258, incorporadas en la presente por referencia. También se provee una molécula de ácido nucleico (ADN) que codifica una secuencia aminoácida que comprende la a-amilasa mutante provista por esta invención, sistemas de expresión que incorporan tal ADN incluyendo vectores y fagos, células huéspedes transformadas con tal ADN y hebras anti-sentido ce ADN que corresponden a la molécula de ADN que codifica la secuencia aminoácida. En forma similar, •esta invención incluye un método para producir una a-amilasa mutante expresando el ADN incorporado en un sistema de expresión que ha sido transformado en una célula huésped. La a-amilasa mutante de la invención puede usarse en la licuación de almidón, como ingrediente en detergentes para lavar ropa, detergentes para lavavaj illas automáticas, productos de limpieza para superficies duras, en el procesamiento de alimentos incluyendo aplicaciones de cocción, en procesamiento textil incluso como agente para descrudar o en cualquier otra aplicación en la cual es útil la actividad de la a-amilasa. La a-amilasa precursora es producida por cualquier fuente capaz de producir a-amilasa. Fuentes apropiadas de a-amilasa son organismos procarióticos o eucarióticos, incluyendo hongos, bacterias, plantas o animales. Preferentemente, la a-amilasa precursora es producida por un Bacillus, más preferentemente por Bacill us licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus stearothermophil us; más preferentemente, la a-amilasa precursora se deriva de Bacill us li cheniformis . Se han hallado homologías entre casi todas las endo-amilasas secuenciadas hasta la fecha, incluyendo las de plantas, mamíferos y bacterias (Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 23, págs. 355-360 (1986); Rogers, Biochem, Biophys. Res. Commun., Vol. 128, págs. 470-476 (1985); Janecek, Eur. J. Biochem., Vol. 224, págs. 519-524 (1994)). Hay cuatro áreas de homología particularme te alta en ciertas amilasas de Bacill us, como lo ilustra la Figura 3, donde las secciones subrayadas designan las áreas de alta homología. También se han utilizado alineaciones de secuencias para delinear la t.r relación entre las endo-amilasas de Bacill us (Feng et al., J. Molec. Evol., Vol. 35, págs. 351-360 (1987)). La 5 homología de secuencias relativas entre las amilasas de Bacillus stearothermophilus y Bacillus licheniformis es de alrededor del 66% y la que hay entre las amilasas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens es de alrededor del 81%, según lo determinado por Holm et al., Protein Engineering, Vol. 3, No. 3, págs. 181-191 (1990). Aunque la homología de secuencias es importante, por lo general se reconoce que la homología estructural también es importante al comparar amilasas u otras enzimas. Por ejemplo, se ha sugerido una homología estructural entre las amilasas fúngicas y las amilasas bacterianas y, por lo tanto, las amilasas fúngicas están incluidas dentro de esta invención. Entre otras cosas, en la presente se identifican adición, supresión o sustitución en los residuos que corresponden a A210, H405 y/c T412 en la a-amilasa de Bacill us licheniformis . Por lo tanto, residuos específicos como A210 se refieren a un número de posición de aminoácido (es decir, +210) que hace referencia al número asignado a la secuencia de la a-amilasa de Bacill us licheniformis madura ilustrada en la Figura 1. Sin embargo, la invención no está limitada a la mutación de la a-amilasa madura particular de Bacill us lidreniformis sino que se extiende a W a-amilasas precursoras que contienen residuos aminoácidos en posiciones que son equivalentes al residuo identificado 5 en particular en la a-amilasa de Bacíll us licheniformis. Un residuo de una a-amilasa precursora es equivalente a un residuo de la a-amilasa de Bacill us licheniformis si es u homólogo (es decir, corresponde en posición para la estructura primaria o terciaria) o análogo a un residuo específico o una porción de ese residuo en la a-amilasa de Bacill us licheniformis (es decir, que tiene una capacidad igual o similar para combinar, reaccionar o interactuar química o estructuralmente) . Para establecer la homología con la estructura primaria, se compara la secuencia aminoácida de una a-amilasa precursora directamente con la secuencia primaria de la a-amilasa de Bacillus li cheniformis y particularmente con un conjunto de residuos que se sabe que son invariables para todas las a-amilasas cuyas secuencias se conocen (ver por ejemplo la Figura 3) . También es posible determinar los residuos equivalentes mediante el análisis de la estructura terciaria de las estructuras de cristal comunicadas para la a-amilasa pancreática porcina (Buisson et al., EMBO Journal, Vol. 6, págs. 390'J-3916 (1987); Qian et al., Biochemistry, Vol. 33, págs. 6284-6294 (1994); Larson et al., J. Mol. Biol., Vol. 235, págs. 1560-1584 (1994)); Taka-amilasa A de Aspergillvs oryzae (Matsuura et al., J. Biochem (Tokyo), Val. 95 (págs. 697-702 (1084)); y una a-amilasa acida de A. niger (Boel et al., Biochemistry, Vol. 29, págs. 6244-6249 (1990)), siendo similares las dos estructuras anteriores, y para la a-amilasa de cebada (Vallee et al., J. Mol. Biol., Vol. 236, págs. 368-371 (1994); Kadziola, J. Mol. Biol., Vol. 239, págs. 104-121 (1994) ) . Se han publicado varios estudios preliminares relacionados con la estructura secundaria de la a-amilasa, (es decir, Suzuki et al., J. Biochem., Vol. 108, págs. 379- 381 (1990); Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 291, págs. 255-257 (1991); Chang et al., J. Mol Biol., Vol. 229, págs. 235-238 (1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol. Vol. 234, págs. 1282-1283 (1993)) y se ha publicado por lo menos una estructura para la a-amilasa de Bacill us licheniformis cristalina (Machlus st al., J. Mol. Biol., Vol. 246, págs. 545-549 (1995)). Sin embargo, varios investigadores han afirmado estructuras supersecundarias comunes entre glucanasas (MacGregor et al., Biochem. J., Vol. 259, págs. 145-152 (1989)) y dentro de a-amilasas y otras enzimas que metabolizan almidón (Jaspersen, J. Prot. Chem., Vol. 12, págs. 791-805 (1993); MacGregor, Starke, Vol. 45, págs. 232-237 (1993)); y similitudes en las secuencias entre enzimas con estructuras supersecundarias similares y a-amilasas (Janecek, FEBS Letters, Vol. 316, págs. 23-26 (1993); Janecek et al.; J. Prot. Chem., Vol. 12, págs. 509-514 (1993)). Se ha modelada una estructura para la enzima de Bacill us stearothermophil us en la de Taka-amilasa A (Holm et al.., Protein Engineering, vol. 3, págs. 181-191 (1990)). Las cuatro regiones altamente conservadas mostradas en la Figura 3 contienen muchas residuos que se piensa que son parte del sitio activo (Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 95, págs. 697-702 (1984), Buisson et al., EMBO Journal, Vol. 6, págs. 3909-3916 (1987); Vihinen et al., J. Biochem., Vol. 107, págs. 267-272 (1990)), incluyendo His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 y Asp +328 baje el sistema de numeración de Bacill us licheniformis . Las a-amilasas según esta invención que muestran características de rendimiento modificadas que proveen resultados deseables e imprevistos son útiles en las diversas aplicaciones para las cuales se utilizan las a-amilasas comúnmente. Por ejemplo, las a-amilasas según esta invención que muestran características de rendimiento modificadas a un pH bajo, incluyendo termoestabilidad mejorada, estabilidad de pH mejorada y/o estabilidad oxidante mejorada, son útiles en la licuación de almidón a bajo pH. La termoestabilidad realzada sera útil para prolongar la vida de estante de productos que las i ' Á? 22 incorporan. La estabilidad oxidante realzada o el rendimiento mejorado es particularmente deseable en los productos de limpieza y para prolongar la vida de estante de la a-amilasa en la presencia de blanqueo, perborato, percarbonato o perácidos utilizados en tales productos de limpieza. Por el contrario, la estabilidad térmica o estabilidad oxidante reducidas pueden ser útiles en procesos industriales que requieren la supresión rápida y eficiente de la actividad amiolítica. Las a-amilasas de esta invención que muestran una estabilidad mejorada a bajo pH serán especialmente útiles en el procesamiento del almidón y particularmente en la licuación del almidón. Las condiciones presentes durante los procesos de licuación comercialmente deseables característicamente incluyen condiciones de bajo pH, alta temperatura y posible oxidación que requieren a-amilasas que muestren rendimiento mejorado a bajo pH, estabilidad térmica mejorada y estabilidad oxidante mejorada. Por lo tanto, las a-amilasas según esta invención que son particularmente útiles en la licuación muestran un rendimiento mejorado a un pH de menos de alrededor de 6, preferentemente menos de alrededor de 5.5 y más preferentemente menos de alrededor de 5.0. Además, serán particularmente útiles las a-amilasas según esta invención que muestran una estabilidad térmica aumentada a temperaturas de entre alrededor de 80-120°C, y preferentemente entre alrededor de 100-110°C, así como un aumento en estabilidad en la presencia de oxidantes. Se podrá agregar componentes adicionales conocidos por los peritos en la técnica por ser útiles en la licuación, incluyendo, por ejemplo, antioxidantes, calcio, iones, sales u otras enzimas como endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas de amilasa según las condiciones de reacción deseadas. Por ejemplo, las combinaciones de la a-amilasa según esta invención con a-amilasas de otras fuentes pueden proveer perfiles de acción únicos que hallan uso particular bajo condiciones específicas de licuación. En particular, se contempla que la combinación de la a-amilasa según esta invención con la a-amilasa derivada de Bacill us stearothermophil us proveerá licuación realzada a valores de pH menores de 5.5 debido a patrones de acción complementarios. Durante la licuación, se trata el almidón específicamente lechadas de almidón granular de un proceso d& molienda húmeda o seca, con una a-amilasa de esta invención según las técnicas de licuación conocidas. Por lo general, en el primer paso del proceso de degradación del almidón, se gelatiniza la lechada de almidón calentándola a una temperatura relativamente alta (entre alrededor de 80°C y alrededor de 110°C) . Una vez gelatinizada la lechada de almidón, se licúa utilizando una a-amilasa. En otra realización de esta invención, pueden ser [ ÍT útiles las composiciones detergentes en forma ya sea de líquido, gel o granulos, que comprenden la a-amilasa según esta invención. Tales composiciones detergentes se beneficiarán particularmente por la adición de una a-amilasa según esta invención que tiene estabilidad térmica aumentada para mejorar la vida de estante o estabilidad oxidante aumentada tal que la a-amilasa tiene , 10 resistencia mejorada a los compuestos de blanqueo o perecido comúnmente presentes en los detergentes. Por lo tanto, la a-amilasa según esta invención puede formularse ventajosamente en detergentes conocidos en forma de polvo, liquido o gel con un pH de entre alrededor de 6.5 y alrededor de 12.0. Las composiciones detergentes que comprenden la a-amilasa según esta invención pueden incluir ' además otras enzimas como endoglicosidasas, celulasas, proteasas, lipasas u otras enzimas de amilasa, particularmente a-amilasa derivada de Bacill us stearothermophil us, así como ingredientes adicionales según lo conocido generalmente en la técnica. Una realización preferida de esta invención también comprende, además de la sustitución adición o supresión de residuos según lo provisto en la presente, 25 una o más de cualquiera de las sustituciones conocidas en la técnica por conferir estabilidad o actividad aumentada. Por ejemplo, la supresión o sustitución de un residuo de metionina o un residuo de triptofano, por ejemplo M15, M197 0 W138 según lo descrito en WO 94/18314, la divulgación de la cual está incorporada por referencia; la sustitución en H133Y según lo descrito en la Publicación de PCT No. WO 91/00353 o la sustitución en A209 según lo descrito en Declerck et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, págs. 15481- 15488 (1990), o cualquiera de las sustituciones descritas en la Publicaciones de PCT Nos. WO 95/106C3, WO 96/23873 y WO 96/23874. En realizaciones particularmente preferidas, la a-amilasa según esta invención puede comprender además una supresión o sustitución en un residuo o más correspondiente a M15, A33, A52, S85, N96, V129, H133, S148, S187, N188, A209, A269 y/o A379 en Bacill us 1 i che ni formi s. Las realizaciones de esta invención que comprenden una combinación de la a-amilasa según esta invención con enzimas de proteasa preferentemente incluyen proteasas oxidablemente estables como las descritas en Re. estadounidense 34.606, incorporadas en la presente por referencia, así como las enzimas comercialmente disponibles como DURAZYM (Novo Nordisk) y PURAFECT® OxP (Genencor International, Inc.). Los métodos para realizar tales mutantes de proteasa (proteasas oxidablemente estables) y particularmente tales mutantes con una sustitución por la metionina en una posició^^equivalente a M222 en Bacill us W amyl oliquefaciens están descritos en Re. estadounidense 34.606. 5 Una realización adicional de esta invención comprende una a-amilasa que codifica ADN según esta invención y vectores de expresión que comprenden tal ADN. Las secuencias de ADN pueden expresarse enlazándolas operablemente con una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un huésped apropiado según técnicas bien conocidas. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huéspedes/vectores de expresión para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, como los diversos plásmidos y fagos conocidos útiles para este fin. Además, por lo general se usa cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión en estos vectores. Por ejemplo, los solicitantes han descubierto que una secuencia de control de expresión preferida para transformadores de Bacillus es el péptido señalizador de aprE derivado de Bacillus subtilis. 25 Una amplia variedad de células huéspedes también es útil para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes ^ W eucarióticos y procarióticos bien conocidos, cómo cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces , diversas 5 células de hongos, levadura y animales. Preferentemente, el huésped expresa la a-amilasa de esta invención en forma extracelular para facilitar la purificación y el procesamiento corriente abajo. Se puede efectuar la expresión y purificación de la a-amilasa mutante de la invención mediante medios reconocidos en la técnica para realizar tales procesos. Se contemplan las a-amilasas mejoradas según esta invención para proveer ventajas importantes en comparación con a-amilasas de Bacill us de tipo salvaje. Por ejemplo, una ventaja es el aumento en actividad que se encuentra a bajo pH y altas temperaturas típicos de los métodos de ' licuación de almidón comunes. Otras ventajas pueden incluir un aumento en la estabilidad oxidante y a alto pH que facilita su uso en detergentes; se logra una hidrólisis más completa de las moléculas de almidón lo cual reduce el almidón residual en el chorro de procesamiento; estabilidad mejorada en la ausencia del ion de calcio; y es posible que la adición de dosis iguales de proteínas de a-amilasa según la invención provea rendimiento superior en comparación con la a-amilasa de Bacill us licheniformis de tipo salvaje debido a mejoras tanto en estabilidad como actividad específica bajo condicionar esforzadas. Lo siguiente se presenta como ejemplo y no debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones. Las abreviaturas utilizadas en la presente, particularmente las notaciones de tres letras o una letra para los aminoácidos están descritas en Dale, J.W., Molecular Genetics of Bacteria [Genética molecular de las bacterias] John Wiley & Sons. (1989) Apéndice B.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción del plásmido pHP.BL Se clonó el gen de la a-amilasa mostrado en la Figura 1 de Bacill us licheniformis NCIB8061 (Gray et al., J. Bacteriology, Vol. 166, págs. 635-643 (1986)). El fragmento 1.72kb Pstl-Sstl, que codifica los últimos tres residuos de secuencia señalizadora, la proteína madura completa y la región del terminador, fue subclonado en M13mpl8. Se agregó terminador sintético entre los sitios EciT y SstI usando un cassette oligonucleótido sintético de la forma: ?.-MTC??AA ^T- Uk-t_ftACCa(-ttCTTOGe^ (S€Q 10 N?¿7) r-TTTTOT M i l i t?CCGGAACCG9GQGC&CCMUkAJU TMTA/ J Ub& (SEO fD NO*} t diseñado para contener el terminador transcriptor de subtilisina de Bacill us amyl oliquefaciens (Wells et al., Nucleic Acid Research, Vol. 11, págs. 7911-7925 (1983)). 5 Se construyó el plásmido pBLapr que lleva el gen para la a-amilasa de Bacill us licheniformis . Como lo ilustra la Figura 5, pBLapr comprende un plásmido 6.1kb que incluye el gen de resistencia a ampicilina de pBR322 y el gen de resistencia a cloranfenicol de pC194, el promotor aprE y el gen que codifica para la a-amilasa de Bacill us licheniformis ("BL AA") . Se construyó el promotor de aprE de un fragmento de 660bp HindII-PstI que codifica para el promotor y la secuencia señalizadora de la proteasa alcalina de Bacill us subtilis . Se removió el sitio de PstI y se agregó un sitio de Sfil cerca de la unión aprE/BL AA. El gen BL AA comprende el fragmento 1720 bp Pstl-Sstl descrito arriba. En al trabajo descrito en la presente, se construyó pBLapr con un sitio de Sfil adyacente al extremo 5' del principio de la secuencia de codificación para el gen de amilasa maduro. Específicamente, se subclonó el extremo 5' de la construcción pBLapr en un fragmento EcoRI- Sstll de pBLapr a M13BM20 (Boehringer Mannheim) para obtener una plantilla de hebra codificadora para el oligonucleótido mutágeno a continuación: (K g-eee ATTAAS ATGtsaecee ere ese CGAeATgrtQctf5c>y (seaiDNOrß) Este molde introdujo un sitio de sfil: (indicado por el subrayado) que permitió que se seleccionaran las formas correctas mediante la presencia de este sitio de restricción único. La subclonación del fragmento EcoRI- Sstll de vuelta en el vector pBLapr dio una versión del plásmido con un sitio de Sfil. Se digirió el plásmido pHP13 (Haima et al., Mol. Gen. Genet., vol. 209, págs. 335-342 (1987)) (Figura 4) con enzimas de restricción EcoRI y HindIII y se purificó el vector resultante en un gel de poliacrimida y luego se levigó. Se digirió el plásmido pBLapr con HindIII, Asp718 y en una incubación separada con Asp718, EcoRI y se purificó mediante gel. Se purificaron mediante gel dos bandas, HindIII-Asp718 (1203 bp) y Asp718-EcoRI, (1253 bp) , se levigaron del gel y se ligaron al vector mediante ligadura tridireccional, para dar el plásmido pHP.BL, el plásmido utilizado en la expresión de la a-amilasa (Figura 6) .

Ejemplo 2 ( W Construcción de un plásmido que codifica la a-amilasa que comprende A210T/H405A/T412D Se construyó un plásmido pBLapr con treonina sustituida por metionina en el aminoácido 15 según la Solicitud de patente estadounidense número de serie 08/194.664 (Publicación de PCT No. WC 94/15314). Para introducir las mutaciones, se utilizan los siguientes ( moldes mutágenos que codifican para las sustituciones de A210T/M405D/T412A junto con moldes no mutágenos para introducir las mutaciones deseadas en las repeticiones en tándem, múltiples lineales del plásmido por el método de multimerización según lo descrito a continuación. -(411) CCA GCC GAC MT GTC ATO GTC ÚTC GAAATA ATC (401) (SEQ ID NO: 10) 2ior?s? (205) CCTOATGTC OCA*CA GAAATTAAGAGATGG (21$) (SEsQ ID NOríl) (4.1ß) GTCGCC TTC CCTTGC CCA GCCGACAATGTC(407) (SEQ ID N0;12) Se genera un fr igmento empezando en el tipo mutágeno apropiado para la mutación deseada (mostrada arriba) y terminando al final del molde no mutágeno por PCR. Se purifica por gel este fragmento y se utiliza para generar repeticiones en tándem lineales largas del plásmido que codifica las mutaciones deseadas de la siguiente manera : Se linealiza el vector (pBLapr) por digestión restrictiva (Sal I) y se purifica usando kits de Qiagen. Las reacciones de multimerización típicamente contienen 5.4 mM Tris de tampón de pH. 8.0, lx XL de tampón (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) , 0.2 mM dNTPs, 1.1 mM Mg(OAc)2, 3 ng/µl de fragmento entrante, 0.15 ng/µl de vector linealizado, 4 U rTh de polimerasa de ADN, XL (Perkin Elmer) en 100 µl de mezcla de reacción. Las reacciones de PCR típicamente se realizan en un termoc-iclador bajo las siguientes condiciones: 20 ciclos (15s 94°C, 5 min 68°C) y 15 ciclos (15s 94°C, 10 min 68°C) . Los multímeros resultantes se transforman directamente en células competentes con B. subtilis utilizando técnicas estándares. Si aisla el ADN del plásmido de los transformadores usando técnicae estándares. Se confirmaron las mutaciones mediante secuenciado dideoxí (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, págs. 5463-5467 (1977)).

Ejemplo 3 Transformación de plásmidos en Bacill us subtilis, Expresión y purificación de a-amilasa mutante Se puede expresar la a-amilasa en Bacill us subtilis tras la transformación con los plásmidos descritos arriba. PHP13 es un plásmido capaz de replicación en E. coli y en Bacíll us subtilis . Se construyeron plásmidos que contenían diversos variantes usando la cepa MM294 de E. coli , se aislaron los plásmidos y luego se transformaron en Bacill us subtilis según lo descrito en Anagnostopoulos et al., J. Bacter., vol. 81, págs. 741-746 (1961). Se había suprimido la cepa de Bacill us para dos proteasas (?apr, ?npr) (ver por ejemplo Ferrari et al., Patente estadounidense no. 5.264.366) y para amilasa (?amiE) (ver por ejemplo Stahl et al., J. Bacter., Vol. 158, págs. 411-418 (1984) ) . Tras la transformación, se introdujo la mutación sacU(Hy) (Henner et al., J. Bacter., Vol. 170, págs. 296-300 (1988)) por transducción mediada por PJS-1 (Hoch, J Bact., Vol. 154, págs. 1513-1515 (1983)). Se recuperó amilasa secretada de cultivos de Bacill us subtilis de la siguiente manera: se agregó cloruro sódico al sobrenadaste del cultivo hasta 20 .tiM y se ajustó el pH a aproximadamente 7.0 con 1M tris de tampón, pH 7.2.

Luego se calentó el sobrenadante a 70°C durante 15 minutos y se removió el precipitado por centrifugación. Se agregó sulfato amónico al sobrenadante hasta 1.3 M seguido por 20 mL de resina de flujo rápida 6 (alta sustitución) de sefarosa de fenilo (Pharmacia) . Tras agitación, se separó la resina por filtración y se lavó en 1 M de sulfato amónico, 20 mM de acetato amónico de pH 7.0, 5 mM de cloruro calcico. Se levigó la amilasa aglutinada en 20 mM de acetato amónico de pH 7.0, 5 mM de cloruro calcico, y se precipitó por la adición de sulfato amónico a una saturación del 70%. Se peletizó el material precipitado por centrifugación, se volvió a disolver en un volumen mínimo de 20 mM de acetato amónico de pH 7.0, 5 mM de cloruro calcico, y se dializó contra el mismo tampón. Se determinó la concentración usando un ensayo de substrato soluble, suponiendo actividad específica a tipo salvaje.

Ejemplo 4 Ensayo para determinar actividad de a-amilasa Ensayo de substrato soluble: Se desarrol Ló un ensayo de velocidad en base a un equipo de ensayo de punto final provisto por Megazyf© (Aust.) Pty. Ltd. Se disolvió un frasco de substrato (maltoheptaosido de p-nitrofenilo, BPNPG7) en 10 mL de agua estéril seguidos por una dilución de 1:4 en tampón de ensayo (50 mM de tampón de maleato, pH 6.7, 5 mM de cloruro calcico. 0.002% de Tween20) . Se realizaron ensayos agregando 10 µL de amilasa a 790 µL del substrato en una probeta a 25°C. Se midieron las velocidades de hidrólisis corno la velocidad de cambio de absorbencia a 410 mM, tras una demora de 75 segundos. El ensayo fue lineal hasta velocidades de 0.2 unidades de absorción/minuto . Se midió la concentración de proteína de a-amilasa usando el Ensayo Bio-Rad estándar (Bio-Rad Laboratories) basado en el método de Bradford, Anal. Biochem., Vol. 72, pág. 248 (1976) usando normas de albúmina sérica bovina.

Ejemplo 5 Preparación y ensayo de a-amilasas mutantes adicionales por estabilidad térmica Se preparó a-amilasa de B. licheniformis mutante con sustituciones en A21OT/H405D/T412A. Se midió la velocidad de inactivación térmica para el mutante según el siguiente procedimiento. Se dializaron soluciones de cepas W de amilasas extensamente en 20 mM de acetato amónico, 4 mM de CaCl2 pH 6.5. 5 Se almacenó cada muestra a 4°C. Para medir la estabilidad, se diluyó esta cepa >50 veces en 50 mM de acetato amónico, 5 mM de CaCl2, Tween 20 al 0.02%, pH 4.8 a una concentración final de entre 30 y 50 µg/mL. Se pusieron seis alícuotas de 100 µL en tubos de Eppendorf y se colocaron en un baño de agua o bloque caliente a 83°C. Se removieron los tubos de Eppendorf en intervalos medidos regulares de entre 30 segundos y 5 minutos y se colocaron en hielo para detener la inactivación. Se ensayó la actividad residual usando un substrato soluble según lo descrito en el Ejemplo 4. Se trazó el logaritmo natural de la actividad contra el tiempo de incubación y se obtuvo la constante de velocidad para la inactivación de la inclinación de la línea recta. Se proveen los resultados en la Tabla I. 20 .Tabla 1 Como lo muestra la Tabla I, las enzimas mutantes en las cuales se han introducido las mutaciones según la invención tienen estabilidad significativamente mejorada bajo las condiciones del ensayo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro a partir de la manufactura de los objetos a los que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una a-amilasa mutante que se deriva de una 5 a-amilasa precursora por la supresión, sustitución o adición a dicha a-amilasa precursora de un residuo que corresponde a A210, H405 y/o T412 en la a-amilasa de Bacillus licheniformis. 10

2. La a-amilasa mutante según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación comprende la supresión, sustitución o adición en dos o más de A210, H405 y/o T412 en la a-amilasa de Bacillus licheniformis . 15

3. La a-amilasa según la reivindicación 2, caracterizada porque dicha a-amilasa comprende una sustitución que corresponde a A210T/H405D/T412A en la a- amilasa de Bacill us licheniformis . 20

4. La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha a-amilasa se deriva de una fuente bacteriana o fúngica.

5. La a-amilasa según la reivindicación 1, 25 caracterizada porque dicha a-amilasa se deriva de Bacillus licheniformis, Bacillus ' stearothermophilus o Bacillus amyl oliqu efa ciens.

7. La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha a-amilasa comprende además la supresión o sustitución de un residuo que corresponde a M15, A33, A52, S85, N96, V129, H133, S148N, S187, N188, A209, A269 y/o -A379 en la a-amilasa de Bacill us lícheni formi s .

8. La a-amilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución comprende además sustituir o suprimir un residuo que corresponde a M15T, W13BY y/o M197T en Bacill us licheniformis.

9. Un ADN que codifica la a-amilasa según la reivindicación 1.

10. Un vector de expresión que comprende el ADN de la reivindicación 9.

11. Una célula huésped transformada con el Vector de expresión de la reivindicación 10.

12. Una a-amilasa según las reivindicaciones 1, 3 ó 7 con rendimiento realzado a bajo pH y/o termoestabilidad aumentada.

13. Una Composición detergente que comprende la a-amilasa según la reivindicación 1.

14. La composición detergente según la reivindicación 13, caracterizado porque comprende dicho detergente es útil para limpiar ropa sucia y/o vajilla sucia.

15. Un método para licuar almidón caracterizado porque comprende poner en contacto una lechada de almidón con la a-amilasa según la reivindicación 1.