CN1111601C - 突变型α淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

公开了新型α-淀粉酶，其中一个或多个天冬酰胺残基被不同氨基酸取代或缺失。所公开的α淀粉酶显示已改变的或已改善的低pH淀粉水解特性、稳定性和活性分布图。

Description

突变型α淀粉酶
本发明涉及已改变性能特征的α淀粉酶。本发明还涉及至少一个天冬酰胺残基被不同氨基酸取代或缺失的新突变型α淀粉酶，其中所得α淀粉酶表现出已改变的低pH淀粉水解特性、已改变的稳定性和已改变的活性分布图。
α淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)基本上无规水解淀粉的内α-1，4-糖苷键而产生小分子量的麦芽糖糊精。α淀粉酶商用价值很大，它可用于：淀粉加工的初始阶段(液化)、生产酒精、作为洗涤剂基质中的清洁剂、和在纺织工业中用于淀粉脱浆。α淀粉酶可从很多种微生物包括芽孢杆菌属(Bacillus)和曲霉属(Aspergillus)生产，大部分商品化淀粉酶是从细菌源如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique-faciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacil-lus stearothermophilus)生产的。近年来，商用优选的酶得自地衣芽孢杆菌，归因于其至少在中性和轻度碱性pH下的热稳定性和特性。
一般地，从淀粉至果糖的加工包括四步：液化粒状淀粉，糖化已液化淀粉成葡萄糖，纯化，和异构化为果糖。淀粉液化处理的目的是，将浓缩的淀粉聚合物粒子悬浮液变成低粘度的可溶性、链长更短的糊精。该步骤对于便利用标准设备操作和有效地糖化成葡萄糖或其它糖很重要。要液化粒状淀粉，就需要将粒状淀粉的温度提高至高于约72℃以糊化粒子。加热处理立即破坏不溶性淀粉粒子，生成水溶性淀粉溶液。已溶解的淀粉溶液再用α淀粉酶(EC3.2.1.1)液化。
通常的酶促液化方法包括：调节粒状淀粉浆的pH至6.0～6.5，该pH最适于得自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶，其间加入氢氧化钙、氢氧化钠或碳酸钠。加氢氧化钙的好处还在于提供钙离子，已知钙离子能稳定α淀粉酶以防失活。一旦加入α淀粉酶，就将悬浮液泵送通过蒸汽喷嘴以立即升温至80～115℃。淀粉被迅速糊化，而且由于存在α淀粉酶，通过α(1-4)糖苷键的无规水解而使淀粉解聚变成易于泵送的流体物质。
液化工艺的第二种变化方式是将α淀粉酶加入保持在80～100℃以部分地水解淀粉粒子的淀粉悬浮液，再将该部分水解的淀粉悬浮液泵送通过温度高于约105℃的喷嘴以完全糊化任何残余的粒状结构。待糊化淀粉冷却后，可以再次加入α淀粉酶以进一步水解淀粉。
该工艺的第三种变化方式称为干法磨粉工艺。干法磨粉时，研磨整个粒料并掺合水。通过浮选分离或相当方法任意性地除去胚芽。再用α淀粉酶液化所得混合物，其中含有淀粉、纤维、蛋白质和谷物的其它成分。采用干法磨粉工艺时，本领域中通常的实际操作是在较低温度下进行酶促液化。通常，在将淀粉糖化为可溶性糊精时，认为低温液化没有高温液化效果好。
一般地，糊化后的淀粉溶液在α淀粉酶存在下被保持于较高温度通常达1～3小时，直至达到10～20的DE。葡萄糖值(DE)是衡量总还原糖浓度的工业标准，是基于干基重量的D-葡萄糖计算的。未水解的粒状淀粉DE实际上为零，而D-葡萄糖的DE被规定为100。
含α淀粉酶的淀粉溶液可保持的最高温度依赖于获得该酶的微生物源和α淀粉酶分子的分子结构。从野生型枯草芽孢杆菌菌株或解淀粉芽孢杆菌菌株生产的α淀粉酶使用温度通常不高于90℃，由于高于该温度会导臻过于迅速的热失活，而从野生型地衣芽孢杆菌菌株生产的α淀粉酶可在高达约110℃的温度下使用。已知存在淀粉和钙离子可稳定α淀粉酶以抗失活。然而，在大于6的pH值下使用α淀粉酶可保护该酶以防迅速失活。已知在低温下，得自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶可在低到5的pH值下显示对淀粉基质的水解活性。但是，如果是在惯常的蒸汽喷嘴温度即102℃～109℃间将该酶用于淀粉水解，则必须保持pH至少在pH5.7以上以避免过快失活。遗憾的是该pH要求提供窄范围的加工机会，因为pH值大于6.0会产生不需要的副产物如麦芽寡糖类。因此，实际上液化时pH通常维持在5.9～6.0以获得理想产率的水解淀粉。
有关液化时pH的另一个问题是要求将淀粉悬浮液的pH从4左右，它是得自湿磨阶段的玉米淀粉悬浮液的pH，提高到5.9～6.0。该pH调节中需要加入昂贵的酸中和化学药品，而且还要求额外的离子交换来精制最后的淀粉糖化产品以除去该化学药品。此外，液化后的下一步加工，一般是用葡糖淀粉酶将已液化的淀粉糖化成葡萄糖，要求pH为4～4.5；于是，必须将pH从5.9～6.0下调至4～4.5；需要另外加入化学药品和额外的提纯步骤。
液化步骤之后，用葡糖淀粉酶将加工后的淀粉糖化成葡萄糖。现有工艺中会出现的问题是，由于淀粉的不完全液化，例如由淀粉酶造成直链淀粉低效率水解，则糖化混合物中存在残余淀粉。残余淀粉严重阻碍葡糖淀粉酶水解，体现在产率降低和干扰后处理糖浆过滤。
另外，已知许多α淀粉酶需要加入钙离子以保持稳定，这就进一步增高液化成本。
在美国专利No.5,322,778中，通过在液化浆中加入下述物质于pH4.0～6.0下完成液化：抗氧剂如亚硫酸氢盐，抗坏血酸或其盐，异抗坏血酸，或酚类抗氧剂如丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、或α生育酚。依该发明，必须加入浓度大于5mM的亚硫酸氢钠。
在美国专利No.5,180,669中，是通过在磨碎的淀粉浆中加入过量于缓冲该溶液所需量的碳酸根离子而实现pH5.0～6.0间的液化。由于加入碳酸根离子引起pH增大，浆料中通常要加入能生成氢离子的物质例如无机酸如盐酸或硫酸来进行中和。
在PCT公开号WO94/02597中，描述了氧化稳定性得到改善的突变型α淀粉酶，其中一个或多个蛋氨酸被除半胱氨酸或蛋氨酸之外的任意氨基酸取代。
在PCT公开号WO94/18314中，描述了氧化稳定性得到改善的突变型α淀粉酶，其中一个或多个蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸残基被不可氧化性氨基酸取代。
在PCT公开号WO91/00353中，研究了用野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶液化时的行为特性和有关问题，是通过基因工程方法处理α淀粉酶以包括特异性取代物Ala-111-Thr、His-133-Tyr和/或Thr-149-Ile而进行研究的。
许多研究人员利用重组DNA技术进行了研究，以探讨哪些残基对于淀粉酶的催化活性重要和/或探讨在各种淀粉酶和糖基化酶的活性位点内修饰某些氨基酸的效果(Vihinen等，J.Biochem.，vol.107，pp.267-272(1990)；Holm.等，Protein Engineering，vol.3，pp.181-191(1990)；Takase等，Biochemica et Biophysica Acta，vol.1120，pp.281-288(1992)；Matsui等，Febs Letters，vol.310，pp.216-218(1992)；Matsui等，Biochemistry，Vol.33，pp.451-458(1992)；Sogaard等，J.Biol Chem.，vol.268，pp.22480-22484(1993)；Sogaard等，Carbohydrate Polymers，vol.21，pp.137-146(1993)；Svensson，Plant Mol.Biol.，vol.25，pp.141-157(1994)；Svensson等，J.Biotech.vol.29，pp.1-37(1993))。研究人员们还研究了哪些残基对于热稳定性重要(Suzuki等，J.Bi-ol.Chem.vol.264，pp.18933-18938(1989)；Watanable等，Eur.J.Biochem.vol.226，pp.277-283(1994))；有个研究小组运用这类方法在地衣芽孢杆菌淀粉酶中不同的组氨酸残基上引入突变，基本原理是：已知地衣芽孢杆菌淀粉酶相对于其它类似的芽孢杆菌淀粉酶而言是热稳定的，它有大量的组氨酸，因而认为置换组氨酸会影响该酶的热稳定性。该工作导致在+133位上组氨酸残基和在+209位上丙氨酸残基处鉴别稳定化突变(Declerck等，J.Biol.Chem.，vol.265，pp.15481-15488(1990)；FR2665178-A1；Joyet等，Bio/Technology，vol.10，pp.1579-1583(1992)).
尽管现有技术中已取得了进展，但需要这样的α淀粉酶：它在低pH值下足够有效，使得商业化液化作用在低于现有pH下进行。类似地，本领域中需要这种方法：它能在高温下有效液化干法磨碎的谷物。进一步地，本领域中需要这种方法，它能有效液化淀粉而减少因加入钙造成的昂贵费用。此外，还需要更有效的酶使淀粉在液化阶段更完全地水解以保证有效的糖化作用。由于可商购的淀粉酶因为稳定性问题而在很多条件下不能被接受，例如与洗涤剂有关的高碱度和高氧化剂(漂白剂)含量，所以要求淀粉酶在这些条件下具有已改变的且优选是提高了的特性分布图。因此，合乎要求的淀粉酶应当：与野生型或前体酶相比，它具有已改变的性能特性例如更高的活性、热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性或钙稳定性而且还改变了、维持了或提高了酶活性。
在发明的一个目的是提供α淀粉酶，它具有已改变的特性分布图，例如pH稳定性、碱稳定性、氧化稳定性或酶活性。
本发明的另一个目的是提供α淀粉酶，它在淀粉液化期间当不另加钙离子时具有更大的稳定性。
本发明的又一个目的是提供α淀粉酶，它用于有效的低pH液化时具有已改变的低pH稳定性。
本发明的再一个目的是提供α淀粉酶，它使干法磨碎的谷物在高温下有效液化。
本发明的又一个目的是提供α淀粉酶，它适用于高pH环境中或存在氧化剂或漂白剂时。
本发明的进一步目的是提供α淀粉酶，它促使淀粉分子更完全水解以提高糖化效率。
依本发明，提供的α淀粉酶是编码α淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，所述突变DNA序列通过缺失或取代一个或多个残基而得自前体α淀粉酶，其中的残基具有改善α淀粉酶残基特性的效果。
缺失的或取代的残基优选是天冬酰胺残基，更优选在相应于地衣芽孢杆菌的N188位上。如果需要改变α淀粉酶的热稳定性，则天冬酰胺取代物可以是任何其它氨基酸，包括20种天然氨基酸的任一种。该取代优选对应于地衣芽孢杆菌中的N188S或N188T。该α淀粉酶还优选包括缺失或取代蛋氨酸或色氨酸残基，特别在相应于地衣芽孢杆菌中的位置M15、W138和/或M197，或在相应于V128、H133、S187和/或A209的残基上。在一个最优选的实施方案中，提供的α淀粉酶包括在相应于地衣芽孢杆菌的M15L/N188S或M15T/N188S的残基上的取代。
图1阐明了当地衣芽孢杆菌α淀粉酶的Asn188定向诱变时有用的诱变寡核苷酸。在该图和后续的阐述寡核苷酸构建物图中，粗体字母表示由寡核苷酸引起的碱基变化，而下划线表示由寡核苷酸引入的限制性内切核酸酶位点。
图2说明了用于PCR加工诱变寡核苷酸模板的PCR引物。
图3说明了有关得自地衣芽孢杆菌(NC1B8061)的α淀粉酶基因的DNA序列(SEQ ID NO：33)和由Gray等，J.Bacteriology，vol.166，pp.635-643(1986)描述的翻译产物的推断氨基酸序列(SEQ ID NO：41)。
图4说明了得自地衣芽孢杆菌的成熟α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。
图5说明了三种芽孢杆菌α淀粉酶的一级结构序列对比。地衣芽孢杆菌α淀粉酶(Am-Lich)(SEQ ID NO：35)是由Gray等，J.Bacteriology，vol.166，pp.635-643(1986)描述的；解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶(Am-Amylo)(SEQ ID NO：36)是由Takkinen等，J.Biol.Chem.，vol.258，pp.1007-101 3(1 983)描述的；而嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(Am-Stearo)(SEQ ID NO：37)是由Ihara等，J.Biochem.，vol.98，pp.95-103(1985)描述的。
图6说明了质粒pHP13，其中CmR表示氯霉素抗性，EmR表示红霉素抗性，而Rep pTA1060表示得自质粒pTA1060的复制起点。
图7说明了pBLapr质粒，其中BLAA表示地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因；aprE表示启动子和aprE基因的信号肽编码区；AmpR表示来自pBR322的氨苄西林抗性基因；而CAT表示来自pC194的氯霉素抗性基因。
图8说明了携带地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因的pHP.BL质粒。
图9阐明了PCR方法示意图，该方法用于生产的突变型寡核苷酸相应于得自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶。
图10说明了对本发明的变体酶M15T/N188S，对照野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶在107℃、60ppm钙和不同的pH下淀粉液化中的特性的统计分析图。
图11说明了对本发明的变体酶M15T/N188S，对照野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶在107℃、pH6.0和不同钙浓度下淀粉液化中的特性的统计分析图。
图12说明了对本发明的变体酶M15T/N188S，对照野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶在pH6.0，60ppm钙和不同温度下淀粉液化中的特性的统计分析图。
图13说明了得自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(SEQ ID NO：38)、枯草芽孢杆菌的aprE(SEQ ID NO：39)和地衣芽孢杆菌的pBLapr(SEQ ID NO：40)中的信号序列-成熟蛋白连接复合体。
“α淀粉酶”表示酶切或水解例如淀粉、支链淀粉或直链淀粉聚合物中α(1-4)糖苷键的酶活性。用于本文的α淀粉酶包括天然生成的α淀粉酶和重组α淀粉酶。本发明中优选的α淀粉酶得自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌，以及真菌的α淀粉酶例如得自曲霉属(即米曲霉和黑曲霉)的那些。
“重组α淀粉酶”表示这种α淀粉酶：其中编码天然α淀粉酶的DNA序列被修饰而得突变型DNA序列，它编码与天然α淀粉酶相对比的α淀粉酶序列中一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失。
“表达载体”表示DNA构建物，它包括能与适当控制序列可操纵连接的DNA序列，其中的控制序列能实现在合适的宿主中表达所述DNA。这类控制序列可包括：实现转录的启动子，控制这种转录的任选操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制终止转录和翻译的序列。优选的启动子是枯草芽孢杆菌aprE启动子。该载体可以是质粒、噬菌体粒子或只是可能的基因组的插入片段。一旦转化入合适的宿主，该载体就可复制和独立于宿主基因组而起作用，或者在某些情况下，自身整合入基因组。本说明书中，用到的质粒和载体有时可互换，因为目前质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意欲包括其它形式的表达载体，它们起等价作用且在本领域中是已知的或将变成已知的。
“宿主菌株”或“宿主细胞”表示包括DNA的表达载体的合适宿主，其中的DNA编码本发明的α淀粉酶。适用于本发明的宿主细胞通常是原核生物宿主或真核生物宿主，包括任何可转化的微生物，其中可实现本发明的α淀粉酶的表达。特别合适的宿主菌株是产生α淀粉酶的同种或同属菌株例如芽孢杆菌菌株。优选应用的是α淀粉酶阴性芽孢杆菌菌株(基因缺失的)和/或α淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株(ΔamyE、Δapr、Δnpr)。用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这种转化的宿主细胞可以复制编码α淀粉酶及其变体(突变体)的载体，或者表达所需的α淀粉酶。
“液化作用”或“液化”表示将淀粉转化成链长更短和粘度更小的糊精的方法。该方法通常包括糊化淀粉的同时或随后加入α淀粉酶。
依本发明，所提供的α淀粉酶是编码α淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，所述突变DNA序列通过一个或多个天冬酰胺残基的缺失或取代而得自前体α淀粉酶。还提供编码氨基酸序列的核酸分子(DNA)，其中的氨基酸序列包括至少一部分由本发明提供的α淀粉酶，结合这种DNA的表达系统(包括载体和噬菌体)，用这种DNA转化的宿主细胞，和相应于编码所述氨基酸序列的DNA分子的DNA反义链。类似地，本发明包括生产α淀粉酶的方法，是通过表达结合于已转化入宿主细胞的表达系统上的DNA而进行的。本发明的α淀粉酶可用于淀粉的液化、作为洗涤剂中的组分、用于食品加工、用于纺织加工、或用于其中用到α淀粉酶活性的其它任何应用场合。
本发明的α淀粉酶包括得自前体α淀粉酶的氨基酸序列的氨基酸序列。该前体α淀粉酶包括天然α淀粉酶和重组α淀粉酶。α淀粉酶突变体的氨基酸序列通过前体氨基酸序列的一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而得自前体α淀粉酶氨基酸序列。这种修饰通常指修饰编码前体α淀粉酶氨基酸序列的前体DNA序列而不是处理前体α淀粉酶本身。这样处理前体DNA序列的适当方法包括本文公开的方法和并入本文作参考的共同拥有的美国专利Nos.4,760,025和5,185,258的方法。
本发明的α淀粉酶得自前体淀粉酶，前体α淀粉酶由能产生α淀粉酶的任何来源生产。合适的α淀粉酶来源有原核生物或真核生物，包括真菌、细菌、植物或动物。前体α淀粉酶优选产生于芽孢杆菌；更优选由地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌生产；前体α淀粉酶最优选得自地衣芽孢杆菌。
业已发现，从植物、哺乳动物到细菌，迄今测序过的几乎所有的内淀粉酶间存在同源性(Nakajima等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.23，pp.355-360(1986)；Rogers，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.128，pp.470-476(1985)；Janecek，Eur.J.Biochem.，vol.224，pp.519-524(1994))。在一些芽孢杆菌淀粉酶中，有四个区域存在特别高的同源性，如图5中所示，其中下划线部分指示高同源性区。也用序列对比在图中表示芽孢杆菌内淀粉酶之间的关系(Feng等，J.Molec.Evol.，vol.35，pp.351-360(1987))。由Holm等，Protein Engineering，vol.3，No.3，pp.181-191(1990)测得：嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶和地衣芽孢杆菌淀粉酶之间相对序列同源性约为66％，而地衣芽孢杆菌淀粉酶和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶之间的约为81％。虽然序列同源性是重要的，但通常认为在比较淀粉酶或其它酶时，结构同源性也重要。例如，据称真菌淀粉酶和细菌淀粉酶之间存在结构同源性，所以真菌淀粉酶也包括于本发明中。
至于其它，对应于α淀粉酶中天冬酰胺残基的残基在本文被认为缺失或取代。所以，特定的残基如表示氨基酸位置号(即+188)的N188，参照图4中所示为成熟地衣芽孢杆菌α淀粉酶序列指定的号。但是，本发明不限于地衣芽孢杆菌的特定成熟α淀粉酶的突变，而是推广到包含这种氨基酸残基的前体α淀粉酶，即它的残基位置相当于地衣芽孢杆菌α淀粉酶中特定的已鉴别残基。如果前体α淀粉酶的残基与地衣芽孢杆菌α淀粉酶中特定的残基或该残基的部分同源(即在一级或三级结构的位置中相当)或同功(即在化学或结构上具有相同的或类似的结合、反应或相互作用功能)，则认为它们的残基相当。
为了建立与一级结构的同源性，将前体α淀粉酶的氨基酸序列直接与地衣芽孢杆菌α淀粉酶一级序列比较，特别是与已知序列的所有α淀粉酶恒定的一组残基(例如参见图7)比较。也可通过对报道的下述酶晶体结构的三级结构分析测定相当的残基：猪胰α淀粉酶(Buisson等，EMBO Journal，vol.6，pp.3909-3916(1987)；Qian等，Biochemistry，vol.33，pp.6284-6294(1994)；Larson等，J.Mol.Biool.，vol.235，pp.1560-1584(1994))；得自米曲霉的Kaka-淀粉酶A(Matsuura等，J.Biochem.(Tokyo)，vol.95，pp.697-702(1984))；和得自黑曲霉的酸性α淀粉酶(Boel等，Bio-chemistry，vol.29，pp.6244-6249(1990))，前二者结构类似；以及对于麦芽α淀粉酶(Vallee等，J.Mol.Bio.，vol.236，pp.368-371(1994)；Kadziola，J.Mol.Biol.，vol.239，pp.104-121(1994))。尽管已发表了一些初步研究(Suzuki等J.Biochem.，vol.108，pp.379-381(1990)；Lee等，Arch.Biochem.Biophys，vol.291，pp.255-257(1991)；Chang等，J.Mol.Biol.，vol.229，pp.235-238(1993)；Mizuno等，J.Mol.Biol.，vol.234，pp.1282-1283(1993))，但只有对地衣芽孢杆菌α淀粉酶的报导结构(Machius等，J.Mol.Biol.vol.246，pp.545-549(1995))。然而，一些研究人员已预测葡聚糖酶之间(MacGregor等，Biochem.J.，vol.259，pp.145-152(1989))和在α淀粉酶和其它淀粉代谢酶中(Jaspersen，J.Prot.Chem.vol.12，pp.791-805(1993)；Mac-Gregor，Starke，vol.45，pp.232-237(1993))中存在共同的超二级结构；且在与α淀粉酶有相似超二级结构的酶之间具有序列相类点、(Janecek，FEBS Letters，vol.316，pp.23-26(1993)；Janecek等，J.Prot.Chem.，Vol.12，pp.509-514(1993))。业已模拟Taka-淀粉酶A的结构建立了嗜热脂肪芽孢杆菌酶的结构(Holm等，Protein Engineering，vol.3，pp.181-191(1990))。图7中所示的四个高度保守区含被认为是部分活性位点的许多残基(Matsuu-ra等，J.Biochem.(Tokyo)，vol.95，pp.697-702(1984)；Buis-son等，EMBO Journal，vol.6，pp.3909-3916(1987)；Vihinen等，J.Biochem.，Vol.107，pp.267-272(1990))，包括地衣芽孢杆菌编号系统下的His+105；Arg+229；Asp+231；His+235；Glu+261和Asp+328。
缺失或取代的天冬酰胺残基优选是在对应于地衣芽孢杆菌中N188的位置上。如果要改变α淀粉酶的热稳定性，则天冬酰胺取代物可以是其它任何氨基酸，包括20种天然氨基酸的任意种。缺失或取代优选对应于地衣芽孢杆菌中的N188S或N188T。 α淀粉酶还优选包括缺失或取代蛋氨酸或色氨酸残基。
表现出已改变性能特征的本发明的α淀粉酶提供所需的和未料到的结果，这些结果适用于常用α淀粉酶的各种应用。例如，在低pH下表现出已改变性能特征的本发明的α淀粉酶适用于低pH液化淀粉，其中已改变的性能特征包括更好的热稳定性、更好的pH稳定性和/或更好的氧化稳定性。提高了的热稳定性将适用于延长掺有它们的产品的贮存期限。提高了的氧化稳定性或更好的性能尤其适用于清洁制品，存在用于这种清洁制品的漂白剂、过硼酸盐、过碳酸盐或过酸时延长α淀粉酶的贮存期限。反之，降低了的热稳定性或氧化稳定性可适用于要求迅速而有效地抑制淀粉分解活性的工业加工过程。
本发明的α淀粉酶尤其适用于淀粉加工且具体是淀粉液化。在商业化液化处理期间理想的特征条件包括低pH、高温和可能的氧化条件，要求α淀粉酶表现出更好的低pH性能、更好的热稳定性和更好的氧化稳定性。于是，特别适用于液化的本发明的α淀粉酶表现更好的性能时的pH小于约6，优选小于约5.5，且最优选在约5.0～5.5之间。此外，本发明的α淀粉酶表现更大的热稳定性时的温度是约80-120℃之间，且优选在约100-110℃之间，而且有氧化剂存在时更大的稳定性将尤为适用。用于液化的本发明的α淀粉酶，除了缺失或取代天冬酰胺外，优选进一步包括缺失或取代相应于地衣芽孢杆菌中M15、V128、H133、W138、S187、M197和/或A209的一个或多个残基。在一个更优选的实施方案中，用于淀粉液化的本发明的α淀粉酶包括相应于位置N188的缺失或取代。该淀粉酶最优选包括相应于地衣芽孢杆菌中下列位置的取代：M15T/N188S，M15L/N188S，M15T/H133Y/N188S，M15T/H133Y/N188S/A209V，M15T/N188S/A209V，M15T/V128E/H133Y/N188S，M15T/S187D/N188S，M15T/H133Y或M15T/H133Y/A209V。
本领域中的技术人员已知的、适用于液化作用的其它组分例如包括：抗氧化剂，钙，离子，盐或其它酶如内切糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶或其它淀粉酶，这些组分可以依预期的反应条件而加入。例如，本发明的α淀粉酶与得自其它来源的α淀粉酶的组合可提供独特的作用分布图，它尤其适用于特定的液化条件。具体地说，预计本发明的α淀粉酶与得自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶组合将在低于5.5的pH值下提供更强的液化作用，是由于存在互补的作用形式。一个优选的实施方案(其中的加工处理包括液化干法磨碎的淀粉以生产乙醇)包括得自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶和在相应于地衣芽孢杆菌中M15T/N188S或M15L/N188S处有取代的本发明α淀粉酶。
液化时，依已知的液化技术用本发明的α淀粉酶处理得自湿法或干法磨粉加工的淀粉浆，尤其是粒状淀粉浆。一般地，淀粉降解过程的第一步中，淀粉浆在较高温度(在约80℃～约110℃之间)下加热而被糊化。淀粉浆被糊化后，再用α淀粉酶进行液化。
在本发明的另一个实施方案中，以液体、凝胶或粒状形式提供了洗涤剂组合物，它包括本发明的α淀粉酶。这种洗涤剂组合物将尤其受益于加入本发明的α淀粉酶，它具有更高的热稳定性以改善贮存期限或更高的氧化稳定性使得α淀粉酶具有更强的对洗涤剂中常见的漂白剂或过酸化合物的抗性。于是，本发明的α淀粉酶有益于配入pH为约6.5～约12.0之间的已知粉状、液态或凝胶状洗涤剂中。本发明的一个优选实施方案进一步包括蛋氨酸残基或色氨酸残基的缺失或取代，例如描述于共同转让的美国专利申请系列Nos.08/289,351和08/409,771中的M15、M197或W138，它们公开的内容并入本文作参考；在描述于PCT公开号WO91/00353中的M133Y上的取代；或在由DeClerck等，J.Biol.Chem.，vol.265，pp.15481-15488(1990)描述的A209上的取代。在进一步优选的实施方案中，本发明的α-淀粉酶包括相应于地衣芽孢杆菌中M15T、W138Y或M197T的取代。用于洗涤剂组合物中、依本发明的α淀粉酶还优选包括在位置N188上的缺失或取代。包括本发明的α淀粉酶的洗涤剂组合物也可进一步包含其它酶例如内切糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶或其它淀粉酶尤其是得自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶，以及本领域中通常已知的其它成分。
包括本发明的α淀粉酶与蛋白酶的组合的本发明的实施方案优选包括氧化稳定性蛋白酶如描述于并入本文作参考的U.S.Re.34,606中的那些，以及可商购的酶例如DURAZYM(NovoNordisk)、MAXAPEM(Gist-brocades)和PURAFECTR OxP(Genencor International，Inc.)。制备这种蛋白酶突变体(氧化稳定性蛋白酶)的方法，尤其是制备在相当于解淀粉芽孢杆菌中M222位置上取代蛋氨酸的这种突变体，被描述于U.S.Re.34,606中。
本发明的另一个实施方案包括编码本发明的α淀粉酶的DNA和含这种DNA的表达载体。该DNA序列可这样表达：依熟知技术在合适的表达载体中将它们与表达控制序列可操纵地连接，再应用该表达载体转化合适的宿主。多种宿主/表达载体组合可用于表达本发明的DNA序列。适用的表达载体例如包括：染色体片段、非染色体的和合成的DNA序列，例如用于这方面的各种已知质粒和噬菌体。此外，任何表达控制序列通常被用于这些载体中。例如，本申请人发现，对于芽孢杆菌转化体的优选表达控制序列是得自枯草芽孢杆菌的aprE信号肽。
多种宿主细胞也适用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可包括熟知的真核生物宿主和原核生物宿主，例如大肠杆菌(E.coli)菌株、假单胞杆菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌属、链霉菌属(Strepto-myces)、各类真菌、酵母和动物细胞。宿主优选在细胞外表达本发明的α淀粉酶以利于纯化和下游处理。表达和纯化本发明的突变型α淀粉酶可通过进行这种处理的本领域公认方法来完成。
本发明的改进型α淀粉酶与野生型芽孢杆菌α淀粉酶相比具有数个重要优点。例如，一个优点是在普通淀粉液化方法的典型低pH和高温下具有更高的活性；另一个优点是更高的高pH稳定性和氧化稳定性因而有利于它们在洗涤剂中的应用；又一个优点是可达到更完全地水解淀粉分子，这就减少了加工流水线中残余的淀粉；还有一个优点是没有钙离子时它们已改进的稳定性；再一个优点是与野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶相比，加入相等蛋白质剂量的本发明的α淀粉酶可提供更优良的性能，是由于在不利条件下在比活性和稳定性两方面的改善。换言之，由于本发明的淀粉酶普遍提高的稳定性，本发明的淀粉酶对淀粉比活性的提高转变成该变体更好的性能。在野生型酶的失活条件下，本发明的淀粉酶不仅因为其更高的稳定性而有更多的存活，而且由于其更高的比活性使存活酶表达按比例更大的活性。
提出下述实施例，不能认为是限制权利要求的范围。文中所用的缩写，尤其是表示氨基酸的三个字母或一个字母记号被描述于Dale，J.W.，Molecular Genetics of Bacteria，John Wiley & Sons，(1989)Appendix B。
                    实施例
                    实施例1
                  构建质粒pHP.BL
图3中所示α淀粉酶基因是由地衣芽孢杆菌NC1B8061克隆化而得(Gray等，J.Bacteriology，vol.166，pp.635-643(1986))。编码信号序列最后三个残基、整个成熟蛋白质和终止区的1.72kbPstl-Sstl片段，被亚克隆到M13mp18中。利用如下形式的合成寡核苷酸盒将合成终止子加入Bcll和Sstl位点之间：
Bcll                                                         Sstl
5′-GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT-3′(SEQ ID NO：1)
3′     TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC     5′(SEQ ID NO：2)设计成含解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶转录终止子(Wells等，Nucleic Acid Research，vol.11，pp.7911-7925(1983))。
构建携带地衣芽孢杆菌α淀粉酶的基因的pBLapr质粒。如图7中所示，pBLapr包括6.1kb质粒，其中含有来自pBR322的氨苄西林抗性基因和来自pC194的氯霉素抗性基因，aprE启动子和编码地衣芽孢杆菌α淀粉酶的基因(“BLAA”)。aprE启动子由编码该启动子和枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的信号序列的660bp HindIII-Pst I片段构建而得。除去PstI位点，并加入SfiI位点至靠近aprE/BLAA接头。BLAA基因包括上述的1720bp Pst1-Sst1片段。在本文所述的工作中，用SfiI位点构建pBLapr，该位点邻接成熟淀粉酶基因的编码序列起始部分的5′端。具体而言，pBLapr构建物的5′端在EcoR1-SstII片段上从pBLapr被亚克隆至M13BM20(BoehringerMannheim)以获得对下列诱变寡核苷酸的编码链模板：
5′-CCC ATT AAG ATT  GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3′(SEQ ID NO：3)该引物引入一个Sfil位点(下划线所示)，使得在该独特的限制酶切位点存在下筛选正确形式。把EcoR1-SstII片段亚克隆回pBLapr载体得到含Sfi1位点的质粒形式。
用限制酶EcoR1和HindIII消化质粒pHP13(Haima等，Mol.Gen.Genet.，vol.209，pp.335-342(1987))(图6)，将所得载体在聚丙烯酰胺(polyacrymide)凝胶上纯化后洗脱。质粒pBLapr用HindIII，Asp718消化后分别与Asp718、EcoRI保温，再用凝胶纯化c将两条带即HindIII-Asp718(1203bp)和Asp718-EcoRI(1253bp)用凝胶纯化，从凝胶上洗脱后通过3步连接法(3-way ligation)连接入载体，得质粒pHP.BL，该质粒用于表达α淀粉酶(图8)。
                      实施例2
构建编码含对天冬酰胺188进行取代的α淀粉酶的质粒
合成出一系列如图1(SEQ ID NOS：4-22)中所示的诱变引物，它们编码以每个天然氨基酸对Asn188(“N188”)进行的取代。编码这些变化的α淀粉酶基因突变体都是利用图2中所示的PCR引物(SEQ ID NOS：23-32)依归纳于图9中的方法用PCR制备的。
步骤(1)：诱变引物被用作PCR引物PCR A+和PCR B-的模板，产生变长的(61bp)双链DNA。每一个在位置188上含不同的氨基酸置换物，且除N188M之外所有都含不同的限制酶切位点。开始时在35℃下使PCR引物退火5分钟，接着在75℃下用tag聚合酶进行DNA延伸反应1分钟。然后在95℃下解链双链DNA达1分钟，再进行退火和延伸步骤。继续进行解链、退火和延伸，共循环30次。
步骤(2)：在不同的PCR反应中形成位置188上游和下游的DNA。模板是pBLapr；对于上游DNA，PCR引物是LAAfs5(SEQID NO：27)和PCR A-(SEQ ID NO：24)，而对于下游DNA，PCR引物是PCRB+(SEQ ID NO：25)和PCR Cla-Sall(SEQ ID NO：28)。DNA在95℃下被解链1分钟，在45℃下退火3分钟再在68℃下延伸3分钟。上游部分是290bp，而下游部分是498bp。用pfu聚合酶重复该过程达18次循环。在步骤(3)和(4)中应用相同的PCR步骤。
步骤(3)：将步骤(2)中所述的DNA上游部分连接到步骤(1)中所述的双链诱变引物上。应用引物LAAfs5(SEQ ID NO：27)和PCR B-(SEQ ID NO：26)。引物设计的结果是在这些模板之间形成24bp重叠序列，使这两段DNA连接。
步骤(4)：将步骤(2)中所述的DNA下游部分和步骤(3)的产物连接而得最终产物。两个PCR产物之间的24bp重叠序列使之得以连接。所用的引物是LAAfs5(SEQ ID NO：27)和PCR ClaI-Sall(SEQ ID NO：28)。
步骤(5)：独特的限制酶切位点即Asp718和BssHll分别定位于188位点的上游和下游。用Asp718和BssHll消化最后的PCR产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离333bp片段，亚克隆到pHP.BL载体中而得pHP.N188X。
由双脱氧测序法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol.74，pp.5463-5467(1977))证实突变。
参照图3中所用的DNA序列和编号系统，编码+188氨基酸位置的密码子在碱基对812-814上；PCR引物A+和A-对应于碱基对784-807；PCR引物B+和B-对应于碱基对821-844；PCR引物LAAfs5的5′端对应于碱基对518；PCR引物PCR ClaI-SaII的5′端对应于碱基对1317；Asp718位点对应于碱基对724；BssHII位点对应于碱基对1053。
                   实施例3
构建编码M15和N188处突变的质粒
依美国专利申请No.08/194,664(PCT公开号WO94/18314)构建在氨基酸15处以苏氨酸取代蛋氨酸的pBLapr质粒。用Sfil和Asp718消化该质粒(pBLapr M15T)，而477碱基对片段在pHP.BL中被亚克隆化生成pHP.M15T。按类似于前述实施例1所述的方法，用Asp718和BssHII消化pHP.M15T，经凝胶纯化后从凝胶中洗脱。然后将含Asp718至BssHII的333碱基对片段和得自pHP.N188S的片段亚克隆化入pHP.M15T而得质粒pHP.M15T/N188S。以类似的方式从质粒pBLaprM15L和pHP.N188Y开始，构建质粒pHP.M15L/N188Y。
                       实施例4
将质粒转化入枯草芽孢杆菌，表达和纯化突变型α淀粉酶
用实施例1-3中所述的质粒转化后，在枯草芽孢杆菌中表达α淀粉酶。pHP13是一种可在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制的质粒。用大肠杆菌菌株MM294构建含不同变体的质粒，分离质粒后依Anagnostopoulos等，J.Bacter.，vol.81，pp.741-746(1961)所述将其转化入枯草芽孢杆菌。该芽孢杆菌菌株已缺失两种蛋白酶(Δapr，Δnpr)(例如参见Ferrari等，美国专利No.5,264,366)和淀粉酶(ΔamyE)(例如参见Stahl等，J.Bacter.，vol.158，pp.411-418(1984))。发现在含1％不溶性淀粉的琼脂板上，表达M15L/N188Y的芽孢杆菌菌株比表达M15L的菌株形成更大的清亮区，表明已提高的淀粉分解活性。转化后，依PBS-1介导的转导法(Hoch，J.Bact.，vol.154，pp.1513-1515(1983))引入sac U(Hy)突变(Henner等，J.Bacter.，vol.170，pp.296-300(1988))。
依下述方法从枯草芽孢杆菌培养物中常规地回收分泌的淀粉酶：将培养物上清液调至20％饱和硫酸铵，并在4℃下搅拌1小时。离心后，将所得上清液调至70％饱和硫酸铵，并在4℃下搅拌1小时。离心上清液后，所得片状物被再溶于50mM pH6.0的乙酸钠，5mM氯化钙；再无菌过滤。
                       实施例5
分析测定α淀粉酶活性
可溶性底物分析：基于由Megazyme(Aust.)Pty.Ltd.提供的终点分析盒进行速率分析。将1小瓶底物(p-nitrophenyl malto-heptaoside，BPNPG7)溶于10ml无菌水，接着在分析缓中液(50mM马来酸盐缓冲液，pH6.7，5mM氯化钙，0.002％吐温20)中进行1∶4稀释。在25℃的小池中，将10μl淀粉酶加入790μl底物而进行分析。延时75秒后，以410nm处吸光度的变化率测定水解速率。该分析呈线性直至速率为0.2吸光度单位/分。
应用牛血清白蛋白标准物利用标准的Bio-Rad分析法(Bio-Rad Laboratories)测定α淀粉酶蛋白质浓度，其中的分析法基于Bradford，Anal.Biochem.，vol.72，p.248(1976)的方法。
淀粉水解分析：通过下述分析方法测定α淀粉酶对淀粉的活性：该分析法基于淀粉与碘形成蓝色络合物的能力和当淀粉被水解成更短的糊精分子后该颜色的消失。按产生颜色变化所需的消化时间定义α淀粉酶活性，其中的颜色变化指示淀粉糊精化的一定的状态。
所用的试剂如下：
磷酸盐缓冲液：将磷酸二氢钾(340g)和氢氧化钠(25.3g)溶于水后稀释至约2升。该缓冲液被冷却至室温，调节pH至6.2±0.1。在容量瓶中将此缓冲液稀释至2升。
淀粉底物：将10克(干物质)可溶性林特纳(lintner)淀粉悬浮于50ml水，再洗入约300ml沸水。又将该悬浮液煮沸，并在不停的搅拌下煮沸5分钟。不停地搅拌下冷却该淀粉溶液至室温，加入125ml磷酸盐缓冲液。用水稀释该溶液至500ml，每天都配制新鲜的淀粉底物。
贮备碘溶液：将碘晶体(5.5g)和碘化钾(11.0g)溶于水后，于容量瓶中稀释至250ml。避光保存该溶液。
稀碘溶液：将碘化钾(20g)和2ml贮备碘溶液溶于水后在容量瓶中稀释至500ml。每天配制新鲜的该溶液。
酶稀释溶液：将氯化钙(11.1g)溶于4升水。所有试剂中用到的水或是蒸馏水或是去离子水。
用酶稀释溶液将α淀粉酶样本稀释至10-15 LU/ml(如下述定义)。对许多商品化α淀粉酶制剂，合适的稀释度为2000倍。将5毫升等分稀碘溶液分配入13×100mm试管，并取10ml淀粉底物置于23×200mm试管内。所有试管均置于30℃水浴中。用装有特殊的α淀粉酶色板(目录号620-s5)的Hellige比色卡进行读数。将5毫升已稀释的酶(也在30℃下)与淀粉底物混合并开始计时。在适当的时间间隔，例如在反应早期间隔为1分钟而反应后期间隔为15秒，将1ml等分酶-底物混合物转入含稀碘溶液的试管。该淀粉碘溶液混合后转入13mm精密的矩形管(square tube)，并用Hellige比色卡中的标准α淀粉酶色板比色。当接近终点时，以0.25分钟间隔取样。
记录样本颜色与色板颜色相当所需的时间，并依下式计算活性(以每克或每ml的淀粉酶活性单位(liquefon)数表示)：其中：LU＝淀粉酶活性单位
      V＝酶体积(5ml或克数)
      t＝糊精化时间(分)
      D＝稀释因子：稀释体积除以已稀释酶的ml数或g数
依本发明实施例1-4中制备的突变型α淀粉酶被测试其对淀粉和可溶性底物的比活性。如表1中所示的结果表明：与AA20野生型α淀粉酶相比，本发明的突变型淀粉酶对于两种底物均提供更好的活性分布图。
                       表1
      以野生型活性百分数表示的某些α淀粉酶对
          可溶性底物和淀粉的比活性
   α淀粉酶 可溶性底物分析   淀粉水解分析
  SpezymeAA20     100     100
    M15T/N188S     212     166
                      实施例6
淀粉液化条件……测定液化淀粉DE(葡萄糖值)
利用这种反应器进行淀粉液化：将50英尺直径为0.24英寸(0.21英寸i.d.)不锈钢管形材料弯成直径约10英寸、高约5.5英寸的旋管。该旋管装有一个11.5英寸在线静止混合器(Cole-Parmer#G-04669-60)，固定在离前端～4英尺处。在旋管后端装有一个Swagelok在线可调减压阀(#SS-4CA-3)，设定开启压力约为20psi。用活塞计量泵以～70ml/min的速率向旋管装入淀粉浆料，将反应器浸入甘油-水浴中使反应器旋管的温度保持在105.5℃，用循环加热器/温度控制器(Fisher Scientific model 7305)维持浴液中的温度。
试验规模的淀粉液化通常是用Hydroheater M103-M喷汽器来进行，装有一个在混合室之后的2.5升延迟旋管(delay coil)和一个管端止回阀(terminal back pressure valve)。用Moyno泵将淀粉料泵入喷汽器，用一条150psi蒸汽管道提供蒸汽，减压至90-100psi。恰好在Hydroheater喷汽喷嘴后和止回阀前装有温度传感器。以约350ml/min的速率向喷汽器中引入淀粉，喷汽器温度保持在105-107℃。从蒸汽加热锅将淀粉样转至一个95℃的第二阶液化过程并保持90分钟。
粒状淀粉得自玉米湿磨机并在2天内使用。用去离子水将淀粉稀释至约30-35％干固形物的要求固含量，用2.5％NaOH或6％HCl调节pH至所需值，以CaCl2·2H2O的形式加入钙。典型的液化条件如下：
淀粉        30％-35％固形物
钙          40-60ppm(30ppm为加入的)
pH          5.0-6.0
α淀粉酶    12-14LU/g糖(干基)
将淀粉样从反应器转至一个95℃的第二阶段液化浴并保持90分钟。在第二阶段液化后立即测定淀粉液化度，是依the StandardAnalytical Methods of the Member Companies of the Corn RefinersAssociation，Inc.sixth ed.，Analytical Procedure Committee(1980)中所述方法，通过测定样本的葡萄糖值(DE)而进行测定的。
                      实施例7
比较M15T/N188S和野生型α淀粉酶在105.5℃下液化中的情 况
比较依实施例1-4制备的包括M15T/N188S取代的α淀粉酶与得自地衣芽孢杆菌的野生型α淀粉酶(SpezymeAA20，可从Genencor International，Inc.商购)在105.5℃下液化中的情况。如表2所示，突变型酶在淀粉的汽流液化中、尤其在低pH下提供显著提高的性能。试验规模液化是这样进行的：在105.5℃下进行第一步液化，再在95℃下进行第二步液化。以12LU/g糖(干基)加入淀粉酶。
              表2
   α淀粉酶在105.5℃下的液化特性比较
    淀粉酶     pH     DE
   SpezymeAA20(2次平均值)     6.0     9.85
   G11(4次平均值)     6.0     12.2
   SpezymeAA20     5.5     5.4
   G11(2次平均值)     5.5     8.7
  SpezymeAA20     5.2     1.8
  G11     5.2     3.0
                    实施例8
比较M15T/N188S和野生型α淀粉酶在107.0℃下液化中的情 况
比较依实施例1-4制备的包含M15T/N188S取代的α淀粉酶与得自地衣芽孢杆菌的野生型α淀粉酶(SpezymeAA20，可从Genencor International，Inc.商购)在107℃下液化中的情况。如表3所示，突变型酶在淀粉的汽流液化中、尤其在低pH下液化期间提供显著提高的性能，如DE值所示。试验规模液化是这样进行的：在107℃下进行第一步液化，再在95℃下进行第二步液化。以12LU/g糖(干基)加入淀粉酶。
               表3
α淀粉酶在107℃下的液化特性比较
    变体     pH     DE
    AA20     6.0     7.4
    G11     6.0     11.6
    AA20     5.5     3.5
    G11     5.5     6.0
    AA20     5.2     0
    G11     5.2     1.1
                       实施例9
突变型和野生型α淀粉酶液化结果的统计分析
在统计设计试验中详尽研究了SpezymeAA20和M15T/N188S突变体的相对液化特性。应用2.0版“X-STAT”程序(Coyright，Wiley Scientific and Technical Software，John Wiley &Sons，NeW York，(1992))，设计Box-Behnken工厂规模的试验；将第一步液化温度从106℃变为110℃，液化pH从pH5.3变为pH6.0，淀粉底物中总的钙含量从30ppm变为90ppm。构成试验基础的表4和5中的数据产生于15次试验规模的液化，每次用12LU/克干固底物的SpezymeAA20和M15T/N188S。然后使数据符合二次方程式模型。至于M15T/N188S突变体，数据符合方程DE＝842.41+28.374×pH-17.557×温度+1.5005×钙浓度+1.6243(pH×温度)-0.081506(pH×钙浓度)-0.0092099(温度×钙浓度)-16.841(pH)2+0.038379(温度)2-0.000124(钙浓度)2，回归的标准误差约为1.313，平均(R)2的可解释的变分约为93.99％。至于SpezymeAA20，使数据符合方程DE＝-652.0+(132.35×pH)+(4.716×温度)+(1.3989×钙浓度)-0.050515(pH×温度)-0.019603(pH×钙浓度)-0.011118(温度×钙浓度)-10.206(pH)2+0.02104(温度)2-0.000522(钙浓度)2。回归的标准误差约为0.5772，平均(R2)可解释的变分约为98.69％，利用这些方程绘制曲线，以计算的DE对pH，对钙浓度，对温度描点。在107℃和60ppmCa2+时数据的二维图分别如图10-12所示。图10-12显示，突变型淀粉酶由于在更低的pH、更少的钙含量和更高的温度下使淀粉更有效地液化而优于野生型淀粉酶。
                      表4
pH 温度(℃) 钙(ppm) 观测的葡萄糖值M15T/N188S
    6.00     110.2     60.0     9.8
    6.00     105.9     60.0     11.7
    5.30     110.2     60.0     2.1
    5.30     106.5     60.0     8.1
    6.00     108.0     90.0     11.3
    6.00     107.6     30.0     10.3
    5.30     108.4     90.0     5.9
    5.30     108.5     30.0     1.7
    5.65     110.2     90.0     9.5
    5.65     109.8     30.0     9.9
    5.65     106.0     90.0     11.9
    5.65     105.5     30.0     9.9
    5.65     107.8     60.0     9.5
    5.65     108.1     60.0     9.6
    6.00     108.3     60.0     11.6
                             表5
pH 温度(℃) 钙(ppm) 观测到的葡萄糖值SpezymeAA20
    6.00     110.0     60     7.4
    6.00     106.2     60     9.9
    5.30     109.7     60     0.6
    5.30     105.8     60     2.9
    6.00     108.3     90     8.5
    6.00     108.4     30     7.8
    5.30     108.6     90     1.2
    5.30     107.5     30     0.4
    5.65     110.0     90     4.1
    5.65     109.5     30     4.0
    5.65     106.8     90     8.6
    5.65     106.0     30     6.4
    5.65     107.8     60     6.1
    5.65     109.0     60     5.9
    5.65     109.0     60     5.9
虽然以多个优选的实施方案描述了本发明，但熟练的技术人员会明白可作各种修改、替换、删去和改变而不会脱离本发明的实质和范围。因此，本发明的范围只由后续权利要求范围，包括其相当内容来限定。
                      实施例10
制备其它突变型α淀粉酶并测定热稳定性
大致依实施例1-4中提供的方法制备在V128E、H133Y、S187D和/或A209V的一个或多个位置上进行取代的突变型α淀粉酶，不同的是提供适当的PCR引物以产生所需的突变。各种淀粉酶被纯化至这一程度即此时野生型地衣芽孢杆菌α淀粉酶表现为1087LU/mg蛋白质的比活性。由278nm处的吸光度测定蛋白质浓度，利用野生型酶的143,255M-1cm-1这一摩尔消光系数。
依如下方法测定各种突变体的热失活速率。使淀粉酶贮备溶液充分透析入pH6.5的20mM乙酸铵，4mM CaCl2。为测定稳定性，在pH5.0的50mM乙酸铵、5mM CaCl2、0.02％吐温20中将该贮备液稀释50倍以上至最终浓度为30～50μg/ml。将6个100μl等分样注入微量离心管，并置于83℃的水浴中。定期取出微量离心管，在30秒～5分钟的间隔进行测定并放在冰上停止灭活。用实施例5中所述的可溶性底物分析残余活性。以活性的自然对数对保温时间描点，从直线斜率得失活的速率常数。各种突变体的结果列于表6。
                                  表6
淀粉酶 失活速率常数(k(min-1)   半寿期(ln2/k)(min)   相对野生型的改善量
    Wild Type     1.2    0.56     1.0
    M15T/N188S     0.81    0.86     1.5
    M15L/N188S     0.76    0.91     1.6
    M15T/H133Y     0.39    1.8     3.2
    M15T/H133Y/N188S     0.31    2.2     4.0
    M15T/N188S/A209V     0.27    2.5     4.5
    M15T/H133Y/N188S/A209V     0.054    13     23
                       实施例11
突变型α淀粉酶的低pH液化特性
依实施例1-4和10制备含M15T/N188S或M15T/H133Y/
依实施例1-4和10制备含M15T/N188S或M15T/H133Y/N188S取代的α淀粉酶，并依实施例6在液化研究中进行比较。在105.5℃下进行液化，在95℃下第二步液化中保持90分钟，液化条件包括：94ppmSO2，淀粉酶浓度为16LU/g糖(干基)。结果列于下表7。
                   表7
    淀粉酶     pH     DE
    M15T/N188S     5.50     11.6
    M15T/H133Y/N188S     5.50     13.9
    M15T/N188S     5.35     7.8
    M15T/H133Y/N188S     5.35     10.0
    M15T/N188S     5.20     3.2
    M15T/H133Y/N188S     5.20     5.0
                     实施例12
M15T/V128E/H133Y/N188S、M15T/H133Y/N188S和 M15T/N188S在不同钙含量下的低pH液化特性
依实施例1-4和10制备包括不同取代的α淀粉酶并依实施例6在液化研究中进行比较。在105.5℃下进行液化，液化条件包括：pH为5.50，95ppmSO2，淀粉酶浓度为12LU/g糖(干基)。结果列于下表8。
                       表8
    淀粉酶 加入的钙     DE
    M15T/V128E/H133Y/N188S     44     11.8
    M15T/H133Y/N188S     44     12.4
    M15T/N188S     44     9.9
    M15T/V128E/H133Y/N188S     0     8.9
    M15T/H133Y/N188S     0     7.6
    M15T/N188S     0     4.9
                  实施例13
M15T/H133Y和M15T/H133Y/A209V在不同pH值下的低 pH液化特性
依实施例1-4和10制备包括不同取代的α淀粉酶并依实施例6在液化研究中进行比较。在105.5℃下进行液化，液化条件包括：98ppmSO2，淀粉酶浓度为19LU/g糖(干基)。用去离子水将干玉米淀粉(Clinton Brand 106-B Pearl cornstarch，ADM Corn Processing，Clinton，lowa)调成浆，并水化16小时。结果列于下表9。
                         表9
    淀粉酶     pH     DE
    M15T/H133Y/N188S     5.00     6.8
    M15T/H133Y/N188S/A209V     5.00     10.0
    M15T/H133Y/N188S     5.25     11.6
    M15T/H133Y/N188S/A209V     5.25     13.2
    M15T/H133Y/N188S     5.50     14.3
    M15T/H133Y/N188S/A209V     5.50     15.9
                          实施例14
与野生型相比，突变型α淀粉酶已改善的液化特性
依实施例1-4和10制备含在M15T/S187D/N188S取代的α淀粉酶并依实施例6在液化研究中与野生型比较。用去离子水将干玉米淀粉(Clinton Brand 106-B Pearl cornstarch，ADM Corn Pro-cessing，Clinton，loWa)调成浆(约50升中约23kg)并水化16小时。在105.6℃下，用相等蛋白质含量的淀粉酶在9.0μg淀粉酶/g糖(干基)(3.1mg淀粉酶/升的35％干固形物淀粉浆)浓度下进行液化。由于受益于来自突变型α淀粉酶的比活性，淀粉酶的活性：对野生型淀粉酶而言为11LU/g糖(干基)，对突变体而言为24LU/g糖。测定的活性表明，突变型淀粉酶相对于野生型的活性增量为：对hepta-naltose为410％，对淀粉为219％。液化结果列于下表10。
                   表10
    淀粉酶     pH     DE
    野生型     6.00     8.9
    M15T/S187D/N188S     6.00     11.2

Claims (29)

1.一种α淀粉酶，它是编码α淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，其中的突变DNA序列通过至少一个或多个天冬酰胺残基的缺失或取代而得自前体α淀粉酶，其中所述α淀粉酶包括在相应于地衣芽孢杆菌中N188的位置上的缺失或取代。
2.权利要求1的α淀粉酶，其中所述α淀粉酶包括相应于地衣芽孢杆菌中N188S或N188T上的取代。
3.权利要求1的α淀粉酶，其中所述α淀粉酶进一步包括蛋氨酸或色氨酸残基的缺失或取代。
4.权利要求3的α淀粉酶，其中所述蛋氨酸或色氨酸残基的缺失或取代包括相应于地衣芽孢杆菌中M15、W138或M197的取代或缺失。
5.权利要求1的α淀粉酶，其中所述α淀粉酶进一步包括相应于地衣芽孢杆菌中V128、H133、S187或A209的残基的缺失或取代。
6.α淀粉酶，它是编码α淀粉酶的突变DNA序列的表达产物，其中的突变DNA序列通过相应于地衣芽孢杆菌中M15T/N188S，M15L/N188S，M15T/H133Y/N188S，M15T/H133Y/N188S/A209V，M15T/N188S/A209V，M15T/V128E/H133Y/N188S，M15T/S187D/N188S或M15T/H133Y的取代而得自前体α淀粉酶。
7.权利要求4的α淀粉酶，其中所述蛋氨酸残基的取代包括相应于地衣芽孢杆菌中M15T、W138Y或M197T的取代。
8.权利要求1的α淀粉酶，其中所述前体α淀粉酶得自芽孢杆菌属。
9.权利要求8的α淀粉酶，其中所述前体α淀粉酶得自地衣芽孢杆菌。
10.权利要求9的α淀粉酶，其中所述α淀粉酶包括位置N188上的缺失或取代。
11.权利要求10的α淀粉酶，其中所述α淀粉酶包括N188S的取代。
12.编码权利要求1的α淀粉酶的DNA。
13.编码权利要求4的α淀粉酶的DNA。
14.编码权利要求5的α淀粉酶的DNA。
15.编码权利要求6的α淀粉酶的DNA。
16.包括权利要求12的DNA的表达载体。
17.包括权利要求13的DNA的表达载体。
18.包括权利要求14的DNA的表达载体。
19.包括权利要求15的DNA的表达载体。
20.用权利要求16的表达载体转化的宿主细胞。
21.用权利要求17的表达载体转化的宿主细胞。
22.用权利要求18的表达载体转化的宿主细胞。
23.用权利要求19的表达载体转化的宿主细胞。
24.包括权利要求1的α淀粉酶的洗涤剂组合物。
25.包括权利要求5的α淀粉酶的洗涤剂组合物。
26.包括权利要求6的α淀粉酶的洗涤剂组合物。
27.权利要求24的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂适用于洗涤变脏的织物或碗碟。
28.权利要求25的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂适用于洗涤变脏的织物或碗碟。
29.权利要求26的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂适用于洗涤变脏的织物或碗碟。
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