CN1242048A - H突变α－淀粉酶 - Google Patents

Abstract

一种改善的蛋白质,其包含一种氨基酸序列,该氨基酸序列是经过替换或删除一个氨基酸残基从其前体氨基酸序列修饰得到的,替换或删除的氨基酸残基与较不稳定的但是同源的蛋白质中的相应氨基酸残基不同,其中所述改善的蛋白质与相应于前体氨基酸序列的蛋白质相比,具有改善了的性质。

Description

H突变α-淀粉酶

发明领域

本发明涉及改善的蛋白质，特别是酶，其通过从较不稳定的同源物或相关蛋白质的残基的补充具有改变的稳定性特征。本发明特别涉及衍生自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的新型突变α-淀粉酶，其具有至少一个与地衣芽孢杆菌中不同的来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和/或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciences)的相应残基的补充。所得的α-淀粉酶在不利环境下显示出改善的稳定性。

发明背景

提高蛋白质稳定性的方法在实践中广泛地应用于增加蛋白质的利用率的目的。这类技术常常涉及利用蛋白质工程和位点特异性突变分离和筛选一些特殊的氨基酸残基，基于其特殊的氨基酸特性和/或蛋白质结构，通过实验证据，这些残基显示出特别相关或相关。例如，Estell等人(美国专利No.4,760,025)提出修饰氧化不稳定的酶赋予其改善的稳定性，方法是通过改变对于氧化敏感的残基如甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸等。Koths等人(美国专利No.4,752,585)提出了一种改善用于治疗的蛋白质的氧化稳定性的方法，即用一个保守的氨基酸残基替换每一个易于被氯胺T氧化的甲硫氨酸残基。Barr等人(美国专利No.4,732,973)提出以一个氧化稳定的氨基酸替换人α₁-抗胰蛋白酶活性位点的甲硫氨酸。

其它提到的技术包括针对进化上相近的酶的蛋白质的同源性模型方法以提供蛋白质工程的基础。Siezen等人，蛋白质工程(ProteinEngineering 1991，卷4，No.7，719-737)公开了一种改善工业过程用蛋白质酶特性的策略，方法是通过掺入或复制多种稳定酶类的特性到目标蛋白质中。

然而，基于同源性模型方法的蛋白质工程需要相对高度的同源性(70％以上)才认为很成功。还有报道说同源性低于30％的情况下这种模型方法很不成功(见Machius等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol)1995，246卷：547)。

在工业生产中特别感兴趣和这里用于举例说明本发明的是α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)，其被希望提高稳定性和/或活性。α-淀粉酶多数情况下随机水解淀粉的α-1，4糖苷键产生小分子量的麦芽糖糊精。它用在淀粉加工的初始阶段(液化处理)，用在酒精生产中；作为去污剂基质中的清洁剂以及用在纺织工业的淀粉除浆过程中，有相当大的商业价值。α-淀粉酶可以由多种细菌、真菌和植物来源生产，包括芽孢杆菌属(Bacillus)和曲霉属(Aspergillus)，在淀粉加工工业中应用的大部分商业淀粉酶产自细菌来源如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.Subtillis)或嗜热脂肪芽孢杆菌。最近几年，商业用途的优选酶是那些来源于地衣芽孢杆菌的酶，这是因为至少在中性或微碱性pH条件下它们的热稳定性和性能较好。衍生自相关的菌种如解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶一般认为在许多情况下稳定性较差。

变异的α-淀粉酶在PCT公开文本No.WO95/10603中提到，具有改善的洗衣或餐具洗涤的性能，并且包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中位点M197单点突变之外的一个突变。在PCT公开文本No.WO94/02597中描述一种突变的α-淀粉酶，具有改善的氧化稳定性，其中一个或多个甲硫氨酸被任何非半胱氨酸或甲硫氨酸的氨基酸替换。在PCT公开文本No.WO94/18314中描述了一种突变的α-淀粉酶，其具有改善的氧化稳定性，其中一个或多个甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸残基被一种不可氧化的氨基酸替换。在PCT公开文本No.WO91/00353中，通过遗传工程方法改变野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，包括特异地替换Ala-111-Thr、His-133-Tyr和/或Thr-149-Ile，解决了该酶的作用特性及与淀粉液化过程有关的问题。

许多研究人员采用重组DNA技术研究探索哪些残基对于淀粉酶的催化活性具有重要性和/或探索在不同的淀粉酶和糖原水解酶的活性部位中修饰特定氨基酸所产生的效果(Vihinen等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，107卷，267-272(1990)；Holm等人，蛋白质工程，3卷，181-191(1990)；Takase等人，生物化学及生物物理学学报(Biochemica etBiophysica Acta)，1120卷，281-288(1992)；Matsui等人，Febs Letter，310卷，216-218(1992)；Matsui等人，生物化学(Biochemistry)，33卷，451-458(1992)；Sogaard等人，生物化学杂志，268卷，22480-22484(1993)；Sogaard等人，碳水化合物聚合物(CarbohydratePolymers)，21卷，137-146(1993)；Svensson，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)，25卷，141-157(1994)；Svensson等人，生物工程杂志(J.Biotech)，29卷，1-37(1993))。研究人员也研究了哪些残基对于热稳定性是重要的(Suzuki等人，生物化学杂志264卷，18933-18938(1989)；Watanabe等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)226卷，277-283(1994))；而且一个研究组采用这种方法在地衣芽孢杆菌淀粉酶的多种组氨酸残基处引入突变，原理在于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与其它相似的芽孢杆菌淀粉酶相比具有相对的热稳定性，据认为是由于其有较多组氨酸，因此建议替换组氨酸可能会影响该酶的热稳定性。这项工作导致确定了+133位点的组氨酸残基和+209位点的丙氨酸残基为其稳定性的突变点(Declerck等人，生物化学杂志，265卷，15481-15488(1990)；FR2665178-A1；Joyet等人，生化工程，10卷，1579-1583(1992)。

因此，在蛋白质工程领域已经付出了大量努力以生产更稳定的酶。这种技术包括从稳定性较高的酶类中借取残基到稳定性低的酶类、随机突变、序列比较以及同源性模型方法等，目前已经有许多成功的实例。然而在这一领域仍需要更多的技术用以生产改良的酶类。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种蛋白质，其具有提高的稳定性。

本发明进一步的目的是提供一种蛋白质如α-淀粉酶，其具备改变的稳定性分布图，如pH稳定性、碱稳定性、氧化稳定性和/或热稳定性。

根据本发明，提供了一种改善的蛋白质，其包含一个氨基酸的序列，该序列已被从前体氨基酸序列加以改变，方法是通过替换或删除与稳定性差但同源的蛋白质中相应的氨基酸不同的氨基酸残基。优选地，改善的蛋白质比相应的前体氨基酸序列的蛋白质具有改善的稳定性。同样优选地，这种替换或删除发生在位于分子表面而不是藏在内部的残基。

同样优选地，蛋白质是一种酶，最优选地是一种α-淀粉酶、脂酶、纤维素酶或蛋白酶。在本发明的一个优选的组合物实施方案中，酶是衍生自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶，和稳定性较低但是同源的蛋白质，其包含一种或两种衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶。

在本发明一个特别的优选实施方案中，前体蛋白质为来源于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶，而在改善的蛋白质中替换的残基在嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中不同，包含A33、A52、N96、H133、S148、A209、A269、A379和A435中的一个或多个残基，优选地包含了下面特异的替换，其自然发生于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中，如A33S、A52S、N96Q、H133Y、S148N、A209V、A269K、A379S和/或A435S。

在本发明的方法实施方案中，在前体蛋白质的基础上生产改善蛋白质的方法包括：(a)列出前体蛋白质以及其稳定性较低但是同源的酶的序列，确定一个或多个前体蛋白质与其稳定性较低但是同源的酶之间不同的残基；(b)选择(a)步骤中确定的一个或多个残基用于前体蛋白质中的替换；并且(c)修饰前体蛋白质以(掺入)(b)步骤中挑选的用于替换的残基。优选地，替换发生于蛋白质表面的残基而不是其内部的残基。

本发明的一个优点在于，它可以通过一种简单的技术即分析两种同源但稳定性不同的蛋白质的序列排列生产出更为稳定的蛋白质。

附图简述

图1描述了用于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶Asn188的定点突变过程中的致突变寡核苷酸。在本图和下一个图中描绘了寡核苷酸构建体，黑体字指示的是寡核苷酸引入的碱基改变，下划线指示的是寡核苷酸引入的限制性内切酶位点。

图2描述了用于致突变寡核苷酸模板进行PCR扩增的PCR引物。

图3描述了地衣芽孢杆菌(NCIB8061)的α-淀粉酶基因的DNA序列(SEQ ID No：33)和其翻译产物推断的氨基酸序列(SEQ ID No：41)，如Gray等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)，166卷，635-643(1986)所述。

图4描述了来自地衣芽孢杆菌成熟的α-淀粉酶的氨基酸序列(SEQID No：34)

图5描述了三种α-淀粉酶的一级结构的比较。地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶资料(Am-Lich)(SEQ ID No：35)如Gray等人，细菌学杂志，166卷，635-643(1986)所述；解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶资料(Am-Amylo)(SEQID No：36)如Takkinen等人，生物化学杂志，258卷，1007-1013(1983)所述；嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶资料(Am-Stearo)(SEQ ID No：37)如Ihara等人，生化杂志，98卷，95-103(1985)。

图6描述了质粒pHP13，其中Cm^R指的是氯霉素抗性，Em^R指的是红霉素抗性，Rep pTA1060指的是来源于质粒pTA1060的复制起点。

图7描述了质粒pBLapr，其中BLAA指的是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因；aprE指的是aprE基因的启动子和信号肽编码区；Amp^R指的是来源于质粒pBR322的氨苄青霉素抗性基因；CAT指的是来源于质粒pC194的氯霉素抗性基因。

图8描述了携带地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒pHP.BL。

图9描述了用于产生相应于衍生自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的突变型寡核苷酸的PCR方法流程图。

图10描述了来源于地衣芽孢杆菌(SEQ ID No：38)、枯草芽孢杆菌aprE(SEQ ID No：39)和地衣芽孢杆菌位于质粒pBLapr(SEQ ID No：40)中的α-淀粉酶的信号肽和成熟蛋白质间的连接区。

发明详述

“表达载体”指的是一种DNA构建体，包含有效地连接于合适的调控序列的DNA序列，该调控序列在适当宿主中能够影响所述DNA的表达。这种调控序列可包括一个作用于转录的启动子、一个任选的操纵子序列以调控这种转录、一段编码合适的mRNA-核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。需要在芽孢杆菌宿主中表达时，优选的启动子为枯草杆菌aprE启动子。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是一段潜在的基因组插入片段。一旦转化进入适当的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和行使功能，或者在某些情况下自身整合进入基因组。因为质粒是目前最常用的载体形式，有时侯质粒和载体也可以相互交换使用，本发明意在包括已经或正在成为本领域公知的与质粒具有同样功能的其它形式的表达载体。

“宿主菌株”或“宿主细胞”指的是一种对于表达载体合适的宿主，其包含按照本发明蛋白质的DNA。本发明中用到的宿主一般是原核或真核宿主，包括任何可以转化并能表达本发明中给定的蛋白质的微生物。本领域技术人员熟悉适当的表达和分泌机制，包括针对特定的蛋白质采用适当的宿主。例如与该蛋白质来源为同一种或属的宿主菌株是合适的，例如对于衍生自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，合适的宿主为芽孢杆菌菌株。在本案中，优选使用α-淀粉酶阴性(基因缺失)的芽孢杆菌菌株和/或α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株(ΔamyE、Δapr、Δnpr)。用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这种转化的宿主细胞可以复制编码目的蛋白质和其变异体(突变体)的载体，或者可以表达所需蛋白质。

“重组蛋白质”是指一种蛋白质，其编码自然生成的或前体蛋白质的DNA序列经修饰产生一种突变DNA序列，与自然生成的或前体蛋白质相比其编码缺失、替换或插入一个或多个氨基酸的蛋白质序列。这里应用的术语前体蛋白质(或酶)并非指化学反应中的立即前体物，而是指一个修饰已被模型化了的亲本蛋白质。这样，尽管前体定义了修饰，实际上改变或修饰基于编码前体的DNA中的改变，然后转化该DNA并表达，分泌的蛋白质产物中掺入了修饰。

按照本发明，改善的蛋白质包含一个衍生自其前体蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列。前体蛋白质可以是自然生成的蛋白质或重组蛋白质。改善的蛋白质的氨基酸序列衍生自其前体蛋白质氨基酸系列，方法是通过前体氨基酸序列的一个或多个氨基酸的删除、替换或插入。这种修饰常常在编码前体蛋白质氨基酸序列的DNA上而不是在蛋白质本身进行操作。对前体DNA序列进行这种操作的合适方法包括这里公开的方法和美国专利No.4,760,025；5,185,258，此处引入作为参考。

按照本发明，蛋白质如下进行修饰。蛋白质涉及序列不同的同源蛋白质。例如可以运用众所周知的序列比较技术列出两种相关蛋白质的序列，并指出它们的保守(相同的)位点和两种蛋白质的不同位点。在本发明实践中，令人惊讶和意想不到的发现针对低稳定性蛋白质参照目标蛋白质，鉴定并挑选与不稳定蛋白质不同的特定残基用于目标蛋白质的修饰，可获得稳定性有利的改善。两种蛋白质之间有可比的活性或功能，并且基本上是同源的。由可比的活性，蛋白质间应有相似的生物活性、功能、催化活性或其它常规用于特定蛋白质分类的标准。“基本上同源”指的是蛋白质之间具有非常高的保守性，即相同的氨基酸，这样其序列间才可有意义地进行序列比较，确定主要结构、功能和催化位点。优选的，两蛋白质的序列同一性至少为60％，更优选的为65％序列同一性，最优选的是80％序列同一性。

本发明中的改善的蛋白质在任何给定条件下的稳定性至少应该为其前体蛋白质的50％，更优选的是至少70％，最优选的是至少90％，但在其它条件下具有改善的稳定性。因此，一种改善的蛋白质与前体蛋白质相比，在高温下其稳定性至少达到前体蛋白质的50％，同时在氧化条件下的稳定性也有所改进，这种情况也属于本发明的范围。在一个特定的优选实施方案中，改善的蛋白质的稳定性在氧化物存在和高温条件下与前体蛋白质相比都有所提高。

在一个优选的实施方案中，蛋白质包含一种酶。酶可以包含五种主要酶类(水解酶，氧化还原酶，转移酶，裂解酶或连接酶)中的任一种。自本发明受益的特定酶类包括淀粉酶、脂酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶、葡萄糖淀粉酶、酯酶、乳糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、木质素酶，氧化酶、过氧化物酶、葡萄糖异构酶或任何存在的、密切相关且稳定性略差的同源酶。

α-淀粉酶作为本发明的方法和组合物的例子加以阐明。此处所用的“α-淀粉酶”指裂解或水解淀粉、支链淀粉或直链淀粉聚合物中的α-1，4糖苷键的酶活性。α-淀粉酶包括自然生成的α-淀粉酶也包括重组α-淀粉酶。本发明中优选的α-淀粉酶是那些衍生自芽孢杆菌属的酶，特别那些衍生自地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的酶，以及真菌的α-淀粉酶如那些衍生自曲霉属(即：米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger))的酶。相应的，依本发明的α-淀粉酶均来源于其前体α-淀粉酶。前体α-淀粉酶来源于任何可以产生α-淀粉酶的来源。α-淀粉酶的适当的来源为真核和原核生物，包括细菌、真菌、植物或动物。优选地α-淀粉酶由芽孢杆菌产生，更优选的是由地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌产生，最优选的，前体α-淀粉酶衍生自地衣芽孢杆菌。

到目前为止从植物、动物到细菌几乎所有测序的内源性淀粉酶都发现有同源性(Nakajima等人，应用微生物生物工程(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，23卷，355-360(1986)；Rogers，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun)，128卷，470-476(1985)；Janecek，欧洲生物化学杂志，224卷，519-524(1994))。在特定芽孢杆菌淀粉酶中有四个同源性极高的区域，如图5所示，其中下面划线的部分显示的为高同源区域。序列比较也用于揭示各种芽孢杆菌淀粉酶之间的相互关系(Feng等人，分子进化杂志(J.Molec.Evol.)，35卷，351-360(1987))。地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶之间相关序列的同源性大约为66％，而地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶之间相关序列的同源性大约为81％，如Holm等人，蛋白质工程(Proteinengineering)，3卷，181-191(1990)所确定。

为了建立一级结构的同源性，对前体α-淀粉酶的氨基酸序列和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的一级序列直接进行比较，特别包括那些在所有序列已知的α-淀粉酶中发现有变异的残基组(图7)。同时也可以通过对报道的猪胰α-淀粉酶的晶体结构三级结构分析确定等价残基(Buisson等人，EMBO.J，6卷，3909-3916(1987)；Qian等人，生物化学，33卷，6284-6294(1994)；Larson等人，分子生物学杂志，235卷，1560-1584(1994))；对来源于米曲霉Taka淀粉酶A的分析(Matsuura等人，生物化学杂志(Tokyo)，95卷，697-702(1984))；对一种来源于黑曲霉的酸性α-淀粉酶的分析(Boel等人，生物化学，29卷，6244-6249(1990))；其中前两者的结构类似；还包括大麦的α-淀粉酶(Vallee等人，分子生物学杂志，236卷，368-371(1994)；Kadziola，分子生物学杂志，239卷，104-121(1994))。虽然已经有一些初步的研究发表(Suzuki等人，生物化学杂志，180卷，379-381(1990)；Lee等人，生物化学生物物理学文献(Arch.Biochem.Biophys)，291卷，255-257(1991)；Chang等人，分子生物学杂志，229卷，235-238(1993)；Mizuno等人，分子生物学杂志，234卷，1282-1283(1993))，仅有一个公开的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶结构(Machius等人，分子生物学杂志，246卷，545-549(1995))。然而一些研究者已经预测了葡聚糖酶(MacGregor等人，生物化学杂志(Biochem.J.)，259卷，145-152(1989))和α-淀粉酶及其它淀粉代谢酶类中的共有超二级结构(Jaspersen，蛋白质化学杂志(J.Prot.Chem.)12卷，791-805(1993)；MacGergor，Starke，45卷，232-237(1993))，以及超二级结构与α-淀粉酶相似的酶之间的序列相似性(Janecek，FEBS Letters，316卷，23-26(1993)；Janecek等人，蛋白质化学杂志，12卷，509-514(1993))。嗜热脂肪芽孢杆菌酶的结构在Taka-淀粉酶A结构的基础上进行了模拟(Holm等人，蛋白质工程，3卷，181-191(1990))。图7中所示的四个高度保守的区域含有许多被认为是活性位点的一部分的残基(Matsuura等人，生物化学杂志(Tokyo)，95卷，697-702(1984)；Buisson等人，EMBO.J.，6卷，3909-3916(1987)；Vihinen等人，生物化学杂志，107卷，267-272(1990))，以地衣芽孢杆菌编号方式残基包括His+105、Arg+229、Asp+231、His+235、Glu+261和Asp+328。细菌淀粉酶的杂和体酶的晶体结构发表在PCT公开文本No.WO96/23874。

如上所述，来源于地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶均具有非常明显的同源性。但是，已知在工业淀粉液化条件下，如高温(超过90℃)、低pH值(pH4-6)和低钙条件下衍生自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶有最可接受的性能。然而，甚至地衣芽孢杆菌α-淀粉酶在液化条件下的不期望的不稳定性产生了对更为稳定的替换的需要。因此，为了引入此酶适应其在液化工艺中的稳定性的目的，对地衣芽孢杆菌来源的分子进行了大量工作。通过比较地衣芽孢杆菌来源的α-淀粉酶和来源于嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的序列，有可能确定同源物之间不同的残基。然后根据本发明，选择和来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶相比，与来自嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶中不同的残基位点作为在来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的替换位点。优选地，替换的残基是存在于嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶中的同一残基。更优选地，替换的残基之位置相应于在来自嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶中存在的相同残基的位置。

在此处特别提到的用于在地衣芽孢杆菌中替换的残基是那些在嗜热脂肪芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌的相应位置上不同的残基，特别是指A33、A52、S85、N96、H133、S148、A209、A269、A379和A435。而特别优选的残基替换是选自那些同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶中的残基，相应于A33S、A52S、N96Q、H133Y、S148N、A209V、A269K、A379S和/或A435S。同时还发现，只来自解淀粉芽孢杆菌中的A85D突变也有益于稳定性。上述的残基改造可以和其它对性能有益的修饰联合采用。在本发明的一个最优选的实施方案中，上述残基改造与相应于地衣芽孢杆菌中的M15、N188和/或M197，特别是M15T、N188S和/或M197T的突变结合。如本发明此处提到的任何修饰形式联合相应于地衣芽孢杆菌中M15T/H133Y/N188S/A209V突变会使稳定性分布图得到特别的改善。在地衣芽孢杆菌中相应于下列位点的改造也特别期望：M15T/A33S/H133Y/N188S/A209V；M15T/D28N/A33S/H133Y/N188S/A209V；M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V；M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V/L230F；M15T/S85D/H133Y/N188S/A209V；M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V；M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V/I479T；M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V；M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S；M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/G433D；M15T/H133Y/N188S/A209V/A379S；M15T/H133Y/N188S/A209V/A210S/T322A/A379S，这些修饰代表了进行本发明的最佳模式。

按照本发明的改善的蛋白质显示出改善的功能特征，其使那些蛋白质在多种蛋白质通常应用和有改善的稳定性要求的应用领域中非常有用。例如，根据本发明的酶包括α-淀粉酶，显示出改善的热稳定性、改善的pH稳定性和/或改善的氧化稳定性。增强的热稳定性可以延长含有其的产品的保存期，以及在高温条件下的应用。提高的氧化稳定性或改进的性能对于清洁用产品特别需要，在这类清洁用产品中所用的漂白剂、过硼酸盐、过碳酸盐或过酸类的存在下延长其中酶的保存期。本发明中的α-淀粉酶在淀粉加工特别是淀粉液化中特别有用，其中氧化和热稳定性在此特别重要。

本发明又一个实施方案包含编码根据本发明蛋白质的DNA和包含这种DNA的表达载体。可通过众所周知的技术有效地连接到适当的表达载体之表达调控序列中，并且利用该表达载体转化合适的宿主细胞使DNA序列得以表达。多种宿主/表达载体联合体都可用以表达本发明的DNA序列。有用的表达载体包括例如染色体片段、非染色体和合成的DNA序列，如各种已知的质粒和适于此目的的噬菌体。另外多种表达调控序列中的任一种一般都可以在这些载体中应用。例如，对于芽孢杆菌来源的α-淀粉酶，申请人已经发现对于芽孢杆菌转化体优选的表达调控序列为来源于枯草芽孢杆菌的aprE信号肽。

在本发明中多种宿主细胞都可以用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可包括已知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、多种真菌、酵母和动物细胞。优选地，宿主表达本发明的蛋白质至胞外，以利于纯化和下游加工。本发明改善的蛋白质的表达和纯化可用本领域已公知的进行这种加工的方法来实现。

下面以举例方式列出，但并不代表对权利要求的范围限制。此处所用的缩写特别是对氨基酸的三字母或单字母缩写见Dale，J.W.，细菌分子遗传学，John Wiley&Sons，(1989)，附录B。

                      实施例

          实施例1：质粒pHP.BL的构建

图3所示的α-淀粉酶基因克隆自地衣芽孢杆菌NCIB8061(Gray等人，细菌学杂志，166卷，635-643(1996))。编码信号序列最后3个残基和完整的成熟蛋白质以及终止区的1.73kb PstI-SstI片段亚克隆入载体M13mp18。合成的终止子采用如下的合成寡核苷酸盒的方式加在BclI和SstI位点之间：Bcll                                                          SstI5′-GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT-3′(SEQ ID NO：1)3′     TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC     5′(SEQ ID NO：2)

设计使包含解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌素转录终止子(Wells等人，核酸研究(Nucleic Acid Research)，11卷，7911-7925(1983))。

构建携带地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒pBLapr。如图7所示，pBLapr包含6.1kb的质粒，包括来源于pBR322的氨苄青霉素抗性基因和来源于pC194的氯霉素抗性基因，以及aprE启动子和编码衣芽孢杆菌α-淀粉酶的基因(‘BLAA’)。aprE启动子从编码枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的启动子和信号肽序列的660bp HindIII-PstI片段构建。PstI位点被去除，在紧靠aprE/BLAA连接处加上SfiI位点。BLAA基因包含上述1720bp的PstI-SstI片段。在此处描述的工作中，pBLapr在邻近成熟淀粉酶基因编码序列的起始点的5’端构建一个SfiI位点。特别地，将pBLapr结构的5’端在EcoRI-SstII片段上亚克隆入M13BM20(BoehringerMannheim)，获得下面诱变寡核苷酸的编码链模板：5′-CCC ATT AAG ATT  GGC CGC CTG GGC CGA CAT GTT GCT GG-3′(SEQ ID NO：3)

这一引物引入一个SfiI位点(下划线表示)，以保证通过这一单一的酶切位点筛查正确的形式。然后将EcoRI-SstII片段重新亚克隆入pBLapr载体，产生含有一个SfiI位点的质粒。

质粒pHP13(Haima等人，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，209卷，335-342(1987))(图6)以限制性内切酶EcoRI和HindIII消化，所得载体通过聚丙烯酰胺凝胶纯化然后洗脱。质粒pBLapr以HindIII和Asp718酶切，另一组以EcoRI和Asp718酶切，随后凝胶纯化。凝胶纯化两条带即HindIII-Asp718(1203bp)和Asp718-EcoRI(1253bp)，从凝胶上洗脱后通过3方连接连入载体，构成质粒pHP.BL，这一质粒用于α-淀粉酶表达(图8)。

                      实施例2

  编码包含天冬氨酸188替换的α-淀粉酶的质粒的构建

合成一系列编码用于以各个自然存在的氨基酸替换Asn188(N188)的致突变引物，见图1(SEQ ID No：4-22)。编码这些变异的α-淀粉酶基因突变体按照图9所示的步骤以PCR方法进行，采用的引物见图2(SEQ IDNo：23-32)。

步骤(1)：致突变引物作为模板以PCR引物PCR A+和PCR B-合成一段延长的(61bp)的双链DNA。每个产物包含一种188位点的不同氨基酸替换，除N188M变异体外都包含一个不同的酶切位点。PCR引物首先在35℃退火5分钟，随后在Taq聚合酶存在下75℃延伸1分钟。双链DNA然后在95℃变性1分钟，紧接着是退火和延伸步骤。变性、退火和延伸持续共进行30个循环。

步骤(2)：188位点上下游的DNA由不同的PCR反应合成。模板为质粒pBLapr，上游DNA的PCR引物为LAAfs5(SEQ ID No：27)和PCR A-(SEQID No：24)；下游DNA的PCR引物为PCR B+(SEQ ID No：25)和PCRClaI-SalI(SEQ ID No：26)。DNA在95℃变性1分钟，45℃退火3分钟，68℃延伸3分钟。上游部分为290bp，下游部分为498bp。这一反应采用pfu聚合酶重复18次循环。相同的PCR步骤应用于步骤(3)和(4)。

步骤(3)：步骤(2)中描述的DNA上游部分粘接到步骤(1)中描述的双链致突变引物上。采用PCR引物LAAfs5(SEQ ID No：27)和PCR B-(SEQ ID No：26)。由于两引物设计在这些模板之间有24bp的重叠部分可以保证两段DNA粘接到一起。

步骤(4)：步骤(2)中的DNA下游部分和步骤(3)的产物粘接起来形成最终产物。在两个PCR产物之间24bp的重叠部分保证两段PCR产物的粘接。所用引物为LAAfs5(SEQ ID No：27)和PCR ClaI-SalI(SEQ IDNo：28)。

步骤(5)：单一的酶切位点Asp718和BssHII分别位于188位点的上游和下游。最终的PCR产物以Asp718和BssHII酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出333bp的片段，亚克隆入pHP.BL载体得到质粒pHP.N188X。

突变情况由双脱氧测序来证实(Sanger等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，74卷，5463-5467(1977))。

至于图3中所用的DNA序列和编号体系，+188氨基酸位置的密码子碱基对812-814。PCR引物A+和A-对应于碱基对784-807。PCR引物B+和B-对应于碱基对821-844。PCR引物LAAfs5的5’末端对应于碱基518。PCR引物ClaI-SalI对应于碱基对1317。Asp718位点对应于碱基对724。BssHII位点对应于碱基对1053。

                      实施例3

         编码M15和N188突变的质粒的构建

pBLapr质粒在氨基酸位点15由苏氨酸替换甲硫氨酸，构建方法见美国专利申请系列号08/194,664(PCT公开文本No.WO 94/18314)。该质粒(pBLaprM15T)以SfiI和Asp718酶切，477bp的片段亚克隆入pHP.BL生成质粒pHP.M15T。按照与前述相似的方式(实施例1)，pHP.M15T以Asp718和BssHII酶切，凝胶纯化并凝胶洗脱。333bp的片段包含Asp718-BssHII片段和来源于质粒pHP.N188S片段，被亚克隆入pHP.M15T形成质粒pHP.M15T/N188S。按照相似方式，从质粒pBLaprM15L和pHP.N188Y构建质粒pHP.M15L/N188Y。

                      实施例4

  质粒转化枯草芽孢杆菌，表达并纯化α-淀粉酶突变体

以实施例1-3中描述的质粒转化枯草芽孢杆菌后表达α-淀粉酶。pHP13是一种可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行复制的质粒。携带不同突变型的质粒用大肠杆菌菌株MM94构建，分离质粒后转化枯草芽孢杆菌，如Anagnostopoulos等人，细菌学杂志，81卷，741-746(1961)所述。该芽孢杆菌缺失两种蛋白酶(Δapr，Δnpr)(Ferrari等人，美国专利No.5,264,366)和淀粉酶(ΔamyE)(Stahl等人，细菌学杂志，158卷，411-418(1984))。发现表达M15L/N188Y的芽孢杆菌菌株比表达M15L的菌株在含有1％的可溶性淀粉的琼脂糖平板上形成更大的清亮带，表明其具有更强的淀粉水解活性。转化后，sacU(Hy)突变(Henner等人，细菌学杂志，170卷，296-300(1988))由PBS-1介导的转导引入(Hoch，细菌学杂志，154卷，1513-1515(1983))。

分泌的淀粉酶按如下的常规方法从枯草芽孢杆菌培养物中回收：培养物上清液调节为20％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃搅拌1小时。离心后剩余上清液调节为70％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃搅拌1小时。上清液离心后，所得沉淀重溶于50mM醋酸钠(pH6.0)和5mM氯化钙中，过滤除菌。

                      实施例5

             α-淀粉酶活性测定试验

可溶性底物试验：开发了采用在Megazyme(Aust.)Pty.Ltd提供的终点试验试剂盒的基础上改进的速率试验。一瓶底物(对硝基maltoheptaoside，BPNPG7)溶于10ml无菌水，随后1∶4稀释于试验缓冲液(50mM马来酸缓冲液，pH6.7，5mM氯化钙，0.002％Tween 20)。在一个比色杯中，向790μl底物加入10μlα-淀粉酶进行试验，25℃温育。75秒后，水解速率由410nm处的吸光值的变化速率来计算。这一试验的线性值大至0.2吸收单位/分钟。

α-淀粉酶蛋白质浓度测量按照Bradford，分析生物化学(Anal.Biochem.)，72卷，248(1976)方法的基础上建立的标准Bio-Rad试验(Bio-Rad实验室)进行，以牛血清白蛋白作为标准物。

淀粉水解试验：α-淀粉酶对淀粉的活性测定通过这样的试验：依赖于淀粉和碘分子可以形成蓝色复合物的能力，而淀粉被水解成小的糊精分子后蓝色将消失。α-淀粉酶的活性就按照其产生颜色变化即淀粉的完全糊精化状态所需的消化时间来定义。

所用试剂如下：

磷酸缓冲液：磷酸二氢钾(340g)和氢氧化钠(25.3g)溶于水，稀释至约2升。缓冲液冷却至室温，pH值调至6.2±0.1，缓冲液在一个容量瓶中定容至2升。

淀粉底物：10g(干物质)可溶性lintner淀粉悬浮于50ml水中，冲洗至约300ml沸水中。悬浮液重新煮沸并持续5分钟，不断搅拌。持续搅拌使淀粉溶液冷却至室温，加入125ml磷酸缓冲液。溶液用水稀释至500ml。淀粉底物需要每天新鲜配制。

碘溶液储存液：碘晶体(5.5g)和碘化钾(11.0g)溶于水，稀释定容至250ml。溶液避光保存。

稀释的碘溶液：碘化钾(20g)和2ml碘溶液储存液溶于水，稀释定容至500ml。该溶液需要每天新鲜配制。

酶稀释液：氯化钙(11.1g)溶于4升水。所有试剂用水均为无菌水或去离子水。

α-淀粉酶样品用酶稀释液稀释成10-15LU/ml(定义见后文)。对于许多商业α-淀粉酶制备物其合适的稀释度为2000倍。5ml稀释碘溶液等份放入13×100mm试管，在一个23×200mm试管中加入10ml淀粉底物。所有试管都置于30℃水浴中。一套装有特殊的α-淀粉酶色盘的Hellige比色装置(目录号620-s5)用于读数。5ml稀释酶液(同样置于30℃)与淀粉底物混合并开始计时。在合适的时间间隔，如在反应早期以1分钟为间隔，在反应后期以15秒为间隔，1ml酶-底物混合液等份转移至一个盛有稀释碘溶液的试管中。淀粉-碘溶液混匀后转移至一个13mm的精密方形管中，颜色与Hellige比色装置中的标准α-淀粉酶色盘进行比较。当反应时间到达终点时，每间隔0.25分钟取一次样品。

记录下样品颜色和色盘相配所需要的时间，酶活力按下列公式计算(以液化值(liquefon)/g或ml为单位)：

LU/ml或LU/g＝

在这里：LU＝液化值单位

         V＝酶溶液体积(5ml或g)

         T＝糊精化时间(分钟)

         D＝稀释系数：等于稀释的体积除以稀释的酶的毫升或克

                      实施例6

     制备和检测其它α-淀粉酶突变体的热稳定性

α-淀粉酶突变体通过替换相应于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中相同的5个残基中的一个或多个来制备，包括A33S、A52S、N96Q、S148N、A379S，它们与M15T/H133Y/N188S/A209V联用，与仅有M15T/H133Y/N188S/A209V替换的突变体相比较。另外突变S85D代表来源于解淀粉芽孢杆菌的补充。除去为有效扩增所需突变的适当PCR引物外，根据实施例1-4中提供的方法制备突变体。

各种突变体的热失活率按下述步骤测量，淀粉酶储存液在20mM醋酸铵、4mM氯化钙(pH6.5)中充分透析。为测量其稳定性，该储液在设计用于引发野生型淀粉酶快速失活的溶液(50mM醋酸铵，5mM氯化钙，0.02％Tween 20(pH4.8或4.9))中稀释50倍以上，至终浓度为30-50μg/ml之间。6个100μl等份加入Eppendorf管，置于82℃或83℃水浴中。Eppendorf管在测定过的固定的时间间隔(30秒到5分钟之间)取出，放置冰上终止失活反应。剩余的活性采用实施例5中描述的方法运用可溶性底物测量。酶活力的自然对数对温育时间作图，失活率常数由直线的斜率获得。半衰期由ln(2)除以速率常数计算，各种突变体的结果见表1-4：

                             表1

pH4.9，83℃
			变体	失活速率常数(分钟-1)	t1/2(分钟)
M15T/H133Y/N188S/A209V	0.171	4.05
			M15T/D28N/A33S/H133Y/N188S/A209V	0.137	5.06
M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V/L230F	0.144	4.81
			M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V/1479T	0.162	4.27
M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/G433D	0.121	5.73
			M15T/H133Y/N188S/A209V/A379S	0.145	4.78

                             表2

pH4.85，83℃
			变体	失活速率常数(分钟-1)	t1/2(分钟)
M15T/H133Y/N188S/A209V	0.252	2.75
			M15T/H133Y/N188S/A209V	0.235	2.95
M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S	0.114	6.05

                             表3

pH4.85，82℃
			变体	失活速率常数(分钟-1)	t1/2(分钟)
M15T/H133Y/N188S/A209V	0.203	3.41
			M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S	0.106	6.54
M15T/H133Y/N188S/A209V/A210V/A210S/T322A/A379S	0.141	4.89
			M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V	0.122	5.65

                             表4

pH4.80，82.2℃
			变体	失活速率常数(分钟-1)	t1/2(分钟)
野生型	＞2.0	＜0.35
			M15T/N188S	＞1.9	＜0.36
M15T/H133Y/N188S/A209V	0.267	2.59
			M15T/S85D/H133Y/N188S/A209V	0.236	2.93

Claims (28)

1.一种改善的蛋白质，其包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列是经过替换或删除一个氨基酸残基从其前体氨基酸序列修饰得到的，其中替换或删除的氨基酸与低稳定性但是同源的蛋白质中相应的氨基酸残基不同，其中所述改善的蛋白质与相应于前体氨基酸序列的蛋白质相比，具有改变了的稳定性。

2.根据权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质包括酶。

3.根据权利要求2的酶，其中所述酶包含水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶或连接酶。

4.根据权利要求3的酶，其中所述酶包括淀粉酶、脂酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶、葡糖淀粉酶、酯酶、乳糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶或木质素酶。

5.根据权利要求4的α-淀粉酶，其中所述前体氨基酸序列包括相应于来自地衣芽孢杆菌的氨基酸序列，所述低稳定性的但同源的酶包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的酶。

6.根据权利要求5的α-淀粉酶，其中所述替换的氨基酸残基选自与同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基不同的氨基酸残基，其中所述同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基为相同的氨基酸。

7.根据权利要求6的α-淀粉酶，其中所述替换的氨基酸残基是以与同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基相同的氨基酸替换。

8.根据权利要求5的α-淀粉酶，其中所述替换的氨基酸残基相应于A33、A52、S85、N96、H133、S148、A209、A269、A379和A435。

9.根据权利要求7的α-淀粉酶，其中所述替换的氨基酸残基相应于A33S、A52S、N96Q、H133Y、S148N、A209V、A269K、A379S和/或A435S。

10.根据权利要求7的α-淀粉酶，其包括在位点M15、N188和/或M197额外的替换。

11.根据权利要求10的α-淀粉酶，其中所述替换包括：

M15T/A33S/H133Y/N188S/A209V；M15T/D28N/A33S/H133Y/N188S/A209V；

M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V；M15T/A52S/H133Y/N188S/A209V/L230F；

M15T/S85D/H133Y/N188S/A209V；M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V；

M15T/N96Q/H133Y/N188S/A209V/1479T；M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V；

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/A379S；

M15T/H133Y/S148N/N188S/A209V/G433D；M15T/H133Y/N188S/A209V/A379S；

M15T/H133Y/N188S/A209V/A210S/T322A/A379S.

12.根据权利要求1的蛋白质，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有60％的序列同一性。

13.根据权利要求12的蛋白质，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有65％的序列同一性。

14.根据权利要求12的蛋白质，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有80％的序列同一性。

15.根据权利要求1的蛋白质，其中所述修饰的蛋白质与所述前体蛋白质相比有提高的稳定性。

16.一种在前体蛋白质基础上生成改善的蛋白质的方法，包括：

(a)比较所述前体蛋白质与低稳定性但同源的酶的序列，确定一个或多个前体蛋白质与所述低稳定性但同源的蛋白质的序列之间不同的残基；

(b)挑选一个或多个步骤(a)中确定的残基用于在所述前体蛋白质中进行替换；

(c)修饰所述前体蛋白质以掺入步骤(b)中所选用于替换的残基。

17.根据权利要求16的方法，其中所述蛋白质包括酶。

18.根据权利要求17的方法，其中所述酶包括水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶或连接酶。

19.根据权利要求17的方法，其中所述酶包括淀粉酶、脂酶、纤维素酶、蛋白酶、半纤维素酶、葡糖淀粉酶、酯酶、乳糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶或木质素酶。

20.根据权利要求19的方法，其中所述前体氨基酸序列包括相应于来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的氨基酸序列，所述低稳定性但同源的酶包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的酶。

21.根据权利要求20的方法，其中所述替换的氨基酸残基选自与同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基不同的氨基酸残基，其中所述同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基为相同的氨基酸。

22.根据权利要求21的方法，其中所述替换的氨基酸残基由与同时存在于嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的相应残基相同的氨基酸替换。

23.根据权利要求16的方法，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有60％的序列同一性。

24.根据权利要求12的方法，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有65％的序列同一性。

25.根据权利要求12的方法，其中所述低稳定性但同源的蛋白质与所述前体蛋白质至少有80％的序列同一性。

26.一种淀粉液化的方法，包括下述步骤：

(a)制备淀粉的水溶液；且

(b)用上述淀粉水溶液和根据权利要求5的α-淀粉酶相接触。

27.一种包含如权利要求2的酶的去污剂组合物。

28.一种包含如权利要求2的酶的食品添加组合物。

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