CN102388132A - 包含α淀粉酶和蛋白酶的清洁系统 - Google Patents

Abstract

本发明描述了涉及芽孢杆菌属的α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。所述组合物和方法对冷水清洁的应用特别有效。

Description

包含α淀粉酶和蛋白酶的清洁系统

优先权

本申请要求2009年4月1日提交的美国临时专利申请系列号61/165,813的优先权，其通过引用全文整合到本文中。

技术领域

本发明描述了涉及芽孢杆菌属(Bacillus)的α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。所述组合物和方法对冷水清洁的应用特别有效。

背景

淀粉是直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物。直链淀粉由α-1，4-连接的葡萄糖单位的线性链组成，具有从约60,000至约800,000的分子量(MW)。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单位就含有α-1，6分支点的分支聚合物。它的MW可高达一亿。

形式为浓缩葡萄糖浆的糖类来自淀粉，目前由酶催化过程来生产，所述过程包括(1)用α淀粉酶液化(或稀化)固体淀粉至具有约7-10的平均聚合度的糊精；和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)将所获得的液化淀粉(即，淀粉水解物)糖化。所获得的糖浆具有高葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖浆之后都被酶促异构为葡萄糖/果糖混合物，称为异糖浆(isosyrup)。

α淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是一类通过随机切割内部的α-1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖的酶。该类酶在以下领域具有许多重要的商业应用，例如淀粉加工的初始阶段(液化)、纺织品脱浆、再生纸脱墨、造纸和纸浆工业的淀粉修饰、湿酿酒糟(wet corn milling)、醇生产、甜味剂(例如，糖)生产、饮料工业、酿造业、油田、动物饲料以及去垢剂基质中的清洁剂。例如，此类酶可用于在餐具洗涤和衣物洗涤中去除淀粉性污渍。

α淀粉酶是从多种细菌、真菌、植物和动物来源中分离的。工业上，许多重要的α淀粉酶分离自芽孢杆菌。一种表征过的α淀粉酶是嗜碱性芽孢杆菌菌株TS-23的酶，所述菌株生产至少五种表现出淀粉水解活性的酶(Lin等人，Biotechnol Appl Biochem，28：61-68，1998)。芽孢杆菌TS-23的α淀粉酶具有最优为9的pH，虽然它在宽泛的pH范围内都是稳定的(即，pH4.7至10.8)。它的温度最优为45℃，虽然该酶在较低温度下也具有活性，例如15-20℃。

对具有改变的生物化学特征并提供改善的工业应用性能的变体淀粉酶(例如，α淀粉酶)仍存在需要。

概述

本发明描述了涉及清洁组合物的组合物、系统和方法，所述清洁组合物包括芽孢杆菌属α淀粉酶和淀粉酶，或由芽孢杆菌属α淀粉酶和淀粉酶组成，或基本由芽孢杆菌属α淀粉酶和淀粉酶组成。

在一个方面，提供了这样的清洁组合物，所述清洁组合物包括(a)具有与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列的α淀粉酶；和(b)蛋白酶；其中，所述组合物提供的清洁水平大于对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的水平。在一些实施方案中，所述系统是冷水清洁系统。

在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’或其变体。在一些实施方案中，至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’的Y217L变体。

在一些实施方案中，清洁组合物还包括至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，清洁组合物还包括选自脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶(perhydrolase)、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的至少一种其他的酶。

在一些实施方案中，α淀粉酶源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。

在一些实施方案中，α淀粉酶是具有淀粉酶活性的变体α淀粉酶的成熟形式，并且在选自下述的一个或多个位置上包含取代：

1，2，3，4，5，7，15，16，17，18，19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，59，60，70，71，72，73，75，78，83，87，90，91，93，94，95，104，105，107，108，110，112，113，116，118，125，126，128，129，130，131，134，136，138，142，144，147，149，150，152，154，156，158，160，161，162，165，166，168，169，170，172，174，177，178，182，183，185，189，192，195，197，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，236，237，246，250，254，255，257，264，267，269，270，272，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，447，448，451，453，459，465，470，475，476，483和484；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代在一个或多个位置的天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.0，活性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401和438的一个或多个位置包含取代，并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数＞1.5和稳定性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.5和活性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

在一些实施方案中，变体α淀粉酶在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代。

在一些实施方案中，α淀粉酶是成熟形式的变体α淀粉酶，在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去垢剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一个有益的效果。

在一些实施方案中，α淀粉酶是成熟形式的变体α淀粉酶，在选自5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了这样的α淀粉酶变体，所述变体在pH8下的活性、pH10下的活性、16℃下的活性、32℃下的活性的性能指数值为0.5或更高，在去垢剂中的稳定性或热稳定性的性能指数值为0.5或更高。

在一些实施方案中，α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的243位上的取代。在一些实施方案中，α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。

在一些实施方案中，α淀粉酶变体源自具有与选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列的亲本α淀粉酶。在一些实施方案中，α淀粉酶变体与SEQ IDNO：2所述氨基酸序列具有至少75％的序列同一性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，α淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，α淀粉酶变体在选自对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去垢剂稳定性。

在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括：

(a)在125位的丙氨酸，

在128位的半胱氨酸，

在131位的异亮氨酸，

在165位的异亮氨酸，

在178位的亮氨酸，

在182位的甘氨酸，

在202位的酪氨酸，

在305位的精氨酸，

在319位的苏氨酸，或

在475位的精氨酸；

(b)取代N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和

选自S125A、T131I、T165I、F202Y和D319T的至少一种其它的取代；或

(c)取代

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K，

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K；

其中所述变体任选的还包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失；并且

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。

在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括475位的取代。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。

在一些实施方案中，在低于约25℃的温度下测量时，清洁组合物提供了大于对缺少α淀粉酶或缺失蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平。在一些实施方案中，在低于约20℃的温度下测量时，清洁组合物提供了大于对缺少α淀粉酶或缺失蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平。

在一些实施方案中，α淀粉酶和蛋白酶是共同配制的。

在另一个方面，提供了清洁织品或硬表面的方法，包括将织品或硬表面与任意所述的清洁组合物接触。在一些实施方案中，所述方法是在低于约25℃的温度下实施的。在一些实施方案中，所述方法是在低于约20℃的温度下实施的。

在相关的实施方案中，α淀粉酶变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、70、71、72、73、75、78、82、83、87、90、91、93、94、95、103、104、105、107、108、110、112、113、114、115、116、118、121、123、125、126、127、128、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、170、171、172、174、175、176、177、178、179、182、183、185、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、200、201、202、203、207、210、214、217、221、228、234、237、238、239、240、243、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、272、273、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、314、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位置上包含取代，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14组成的组的成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在优选的实施方案中，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、57、60、70、71、72、73、75、78、82、83、87、90、91、93、94、95、103、104、105、108、112、114、115、116、118、121、123、125、126、128、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、171、172、174、175、176、177、178、179、182、183、185、186、189、190、191、192、193、195、197、199、202、207、214、217、221、228、234、237、238、243、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、272、273、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、447、451、453、459、465、479、475和483，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、57、60、70、71、72、73、75、78、82、83、90、91、93、94、95、103、104、105、108、112、114、115、116、118、121、123、125、126、128、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、171、172、174、175、176、177、178、179、185、186、189、190、191、192、193、195、197、199、202、207、214、217、221、228、234、237、238、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、273、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、318、319、322、323、336、337、338、339、340、344、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、447、451、453、459、465、479、475和483，并且其中所述位置是对应SEQ IDNO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体包括58位的酪氨酸和236位的丙氨酸，且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体包括243位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸，且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自182、183、305、320、379、407、419和475的一个至8个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X182N、X183N、X305Q、X320F、X379A、X407D、X419S和X475T。在这些实施方案的子集中，取代包括1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)的T182N、G183N、Y305Q、Q320F、P379A、Q407D、T419S和G475T。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自160、182、183、189、305、379和475的一个至7个(例如1、2、3、4、5、6或7个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至7个的X160E、X182G、X183N、X189P、X305G、X379E和X475T。在这些实施方案的子集中，取代包括1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)的Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E和G475T。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、214、279、305、319、320和475的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X125A、X182A、X214Q、X279N、X305R、X319T、X320N和X475R。在这些实施方案的子集中，取代包括1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)的S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、Q320N和G475R。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自7、182、298、376、379、407、419和453的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个优选的实施方案中，所述取代包括1至8个的X7H、X182W、X298Q、X376R、X379K、X407W、X419S和X453W。在这些实施方案的子集中，取代包括1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)的E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S和L453W。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自128、178、182和185的一个至四个(例如1、2、3或4个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个实施方案中，所述取代包括1至4个(例如1、2、3或4个)的N128C、K178L、T182G和A185D。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至九个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个实施方案中，所述α淀粉酶变体包括：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。

在一些实施方案中，变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、128、178、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至十一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)位置上包含取代，并且所述α淀粉酶变体包括在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，和320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在一个实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与由SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在另一个实施方案中，所述α淀粉酶变体包括：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在128位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中所述位置是对应SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶的氨基酸序列编号的。在另一个优选的实施方案中，取代选自：N128C、T131I、T134P、Q138E、Y160I、T165I、T165V、K178L、T182A、T182C、T182D、T182M、T182F、T182N、T182G、T182P、T182Q、A185D、A185E、E189P、S243D、S243E和S243Q。

使用示例性α淀粉酶作为起点，即“骨架”，制备和测试刚刚描述过的氨基酸突变，然而，可以理解可以在相关的α淀粉酶中制造等价的氨基酸突变，在所述相关的α淀粉酶中突变预期制造相似的效应和产生相似的优点。其他用作骨架的示例性的α淀粉酶包括但不限于本文中鉴别的那些。

本公开内容进一步提供了编码任一前述篇幅中的α淀粉酶变体的分离的核酸。在一个实施方案中，包括了这样的表达载体，所述载体包含与启动子有效组合的分离的核酸。在另一个实施方案中，包括了包含所述表达载体的宿主细胞。另一个实施方案提供了生产α淀粉酶变体的方法，包括：用包含编码α淀粉酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合生产所述α淀粉酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。另一个实施方案还包括收获所生产的α淀粉酶变体的步骤。另一个实施方案包括芽孢杆菌属物种作为宿主细胞，且在另一个实施方案中，所述芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌。

在一些实施方案中，清洁组合物包括α淀粉酶、蛋白酶、至少一种可以是其他淀粉酶或其他蛋白酶的其他酶。在一个实施方案中，其他的酶是中性金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和/或过氧化物酶。在另一个实施方案中，清洁组合物是洗衣去垢剂，在另一个实施方案中，清洁组合物是餐具洗涤去垢剂。在另一个实施方案中，清洁组合物是含漂白剂的洗衣和/或餐具洗涤去垢剂。在另一个实施方案中，清洁组合物是用于织品的预处理，例如在洗涤之前应用。在另一个实施方案中，清洁组合物是洗衣去垢剂或餐具洗涤去垢剂的添加物。本公开内容还提供了清洁的方法，包括将包含织品的表面和/或物体与包含所述α淀粉酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个实施方案中，方法是餐具洗涤方法，包括步骤：提供i)餐具洗涤组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下将餐具与餐具洗涤组合物接触。在另一个实施方案中，方法是织品清洁方法，包括步骤：提供i)织品清洁组合物，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下将衣物与织品清洁组合物接触。在另一个实施方案中，方法涉及将材料从机织织物(woven fabrics)中的纱线上去除，如在纺织品脱浆(textile desizing)的情况下。

根据本说明书，组合物和方法的上述各个方面和实施方案是显而易见的。

附图的简要说明

图1提供了SEQ ID NO：2和5-14分别所述的各种参照淀粉酶的成熟形式的比对。使用MUSCLE 3.7多重序列比对算法(Edgar，Nucleic Acids Research，32：1792-1797，2004)比对序列。

图2提供了含有地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)LAT启动子(Plat)和来自pUB110(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)的其他元件的pHPLT载体的图，所述其他元件包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标志物(bleo)。

图3提供了pHPLT-BASE质粒的图。

图4提供了pHPLT-ACE-S243Q质粒的图。

图5提供了显示多个α淀粉酶在洗衣去垢剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下：W9(BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-T279N-D319T-Q320N-G475R)；W10(BASE-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-D319T-G475R)；W11(BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-G475R；和ACE-S243Q-G475K)。

图6提供了显示多个α淀粉酶在洗衣去垢剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下：BASE-X8C、BASE-W10EK、ACE-QK和对照(基准的商业酶)。

图7A提供了显示在ACEα淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图7B提供了显示在ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图8提供了显示在BASE-X8C(W11-T131I-T165I)α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图9提供了显示在BASE W10EK(BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图10提供了显示在ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

详细说明

描述了涉及芽孢杆菌属α淀粉酶和蛋白酶的组合物和方法。组合物和方法对于冷水型清洁应用特别有效，例如餐具洗涤(包括自动餐具洗涤)和洗衣。在一些情况下，组合物和方法涉及变体α淀粉酶。所述清洁组合物和方法，以及变体的各个特征将详细的描述如下。

1、α淀粉酶变体的定义和系统命名

本文中除非另外定义，则本文中使用的所有的技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员常规理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY，第2版，John Wiley和Sons，New York(1994)和Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了本文使用的许多术语的通用字典。

所述组合物和方法的一些方面取决于基因工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。下列资源包括了可用于本组合物和方法中的通用方法学的描述：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(第2版，1989)；Kreigler，GENETRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等人编辑，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，本组合物和方法并非意在限于所描述的任何特定的技术、规程和试剂，这是可以改变的。虽然任何与本文所述的相似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本组合物和方法，但优选的方法和材料描述如下。

当描述蛋白质及其编码基因时，基因的名称一般是斜体且非大写的，而蛋白质的名称一般是非斜体且首字母大写。

除非文中明确地另外指出，单数形式“一个”和“这个”包含了复数含义。因此，例如，指代“酶”包括了复数的此种酶，指代“制剂”包括了指代本领域技术人员已知的一个或多个制剂及其等价物，如此类推。

本文中提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用清楚地并入到本文中。

1.1定义

出于清楚的目的，定义下列术语。

本文所用的术语“淀粉”指包含植物复合多糖糖类的任意物质，其包含具有化合式(C₆H₁₀O₅)_x(其中X可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。具体而言，该术语指任意基于植物的物质，其包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更具体而言是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)。

如本文所使用，“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。通常，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此相反，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶(EC3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)从底物的非还原端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖(malto-oligosaccharides)。如本文所使用，淀粉酶包含任意/所有淀粉酶，其包含葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶，如芽孢杆菌属物种，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的那些，而α-淀粉酶包含这些酶的前述子集。

如本文中使用的，“芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶”和类似的词组，指源自芽孢杆菌属物种菌株TS-23的α-淀粉酶。编码所述α-淀粉酶的基因可以是编码所述α-淀粉酶的野生型基因或密码子优化的多核苷酸。芽孢杆菌属物种菌株TS-23的成熟的α-淀粉酶(按从氨基至羧基的方向)是(SEQ ID NO：1)：

NTAPINETMM QYFEWDLPND GTLWTKVKNE AANLSSLGIT ALWLPPAYKG     50

TSQSDVGYGV YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TKTQYIQAIQ AAKAAGMQVY    100

ADVVFNHKAG ADGTEFVDAV EVDPSNRNQE TSGTYQIQAW TKFDFPGRGN    150

TYSSFKWRWY HFDGTDWDES RKLNRIYKFR STGKAWDWEV DTENGNYDYL    200

MFADLDMDHP EVVTELKNWG TWYVNTTNID GFRLDAVKHI KYSFFPDWLT    250

YVRNQTGKNL FAVGEFWSYD VNKLHNYITK TNGSMSLFDA PLHNNFYTAS    300

KSSGYFDMRY LLNNTLMKDQ PSLAVTLVDN HDTQPGQSLQ SWVEPWFKPL    350

AYAFILTRQE GYPCVFYGDY YGIPKYNIPG LKSKIDPLLI ARRDYAYGTQ    400

RDYIDHQDII GWTREGIDTK PNSGLAALIT DGPGGSKWMY VGKKHAGKVF    450

YDLTGNRSDT VTINADGWGE FKVNGGSVSI WVAKTSNVTF TVNNATTTSG    500

QNVYVVANIP ELGNWNTANA IKMNPSSYPT WKATIALPQG KAIEFKFIKK    550

DQAGNVIWES TSNRTYTVPF SSTGSYTASW NVP                      583

如本文所使用，“α-淀粉酶变体”及类似的短语指参照α-淀粉酶的变体/突变体，就该参照α-淀粉酶的亲本(野生型；参考)氨基酸序列而言，其包含氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“变体”与术语“突变体”可互换使用。就亲本信号序列而言，变体α-淀粉酶可在信号序列中包含突变。此外，变体α-淀粉酶可以是含有异源α-淀粉酶信号序列(如来自地衣芽孢杆菌(LAT))的融合蛋白质的形式。

如本文中使用的，词组“亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶”、“野生型芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶”、“参照芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶”和类似的词组，指芽孢杆菌属物种菌株TS-23的多肽。出于便利，术语可以是缩写的“亲本酶”、“野生型酶”、“亲本多肽”、“参照多肽”等。亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶可在亲本多肽的信号序列中包含突变。此外，亲本芽孢杆菌属物种菌株TS-23α-淀粉酶可以是包含异源性α-淀粉酶信号序列的融合蛋白的形式，例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列(LAT)。

如本文中使用的，“亲本核酸/多核苷酸”、“野生型核酸/多核苷酸”或“参照核酸/多核苷酸”指编码亲本多肽的核酸序列及与其互补的核酸。

如本文所使用的，“变体核酸/多核苷酸”指编码变体多肽的核酸序列或与其互补的核酸，或就亲本多核苷酸序列或与其互补的核酸而言具有至少一个碱基取代、插入或缺失的多核苷酸序列。指定时，此类核酸可以包含与参考序列具有指定程度的同一性的序列，或能够例如在严格条件[例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH7.0)]或高度严格条件[例如，65℃和0.1X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH7.0)]下与参考序列杂交的序列。可以优化变体核酸以反映用于指定的宿主生物，如甲基营养酵母(例如毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)等)或丝状真菌(例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))等)或其他表达宿主(例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等)的优选的密码子选择。

如本文中所使用的，当用于提到主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组体”指已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变修饰该主题，或指该细胞衍生自经这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于该细胞的天然(非重组体)形式内的基因或表达否则将异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。

如本文中所使用的，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从至少一种其天然与之结合和见于自然界中的成分移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

本文所用的术语“纯化的”指处于相对纯的状态的，例如至少约90％纯的，至少约95％纯的，至少约98％纯的，或甚至至少约99％纯的物质(例如分离的多肽或多核苷酸)。

本文所用的术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶暴露于升高的温度后保持活性的能力。通过其以分钟、小时或天给出的半衰期(t_1/2)测量酶，如α-淀粉酶的热稳定性，在限定的条件下，酶活性在半衰期内丧失一半。可以通过在暴露于(即通过其攻击)升高的温度后测量残留的α-淀粉酶活性来计算半衰期。

本文所用的“pH范围”指酶显示催化活性的pH值的范围。

本文所用的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”指酶在大范围的pH值保持活性预定的时期(例如15分钟、30分钟、1小时等)的能力。

本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，可互换使用。这种氨基酸序列显示活性时，可将它们称为“酶”。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。

本文所用的术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体和合成分子。核酸可以是单链的或双链的，且可以是化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可用一个以上密码子编码特定的氨基酸，本组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，分别以5′至3′的方向从左至右书写核酸；以氨基至羧基的方向从左至右书写氨基酸序列。

本文所用的术语“同源物”指与参考氨基酸或核苷酸序列具有某种程度的同一性，或具有另一指定的共同结构或功能特征的氨基酸或核苷酸序列。同源序列用来包含这样的氨基酸序列，使用常规序列比对工具(例如Clustal、BLAST等)，其与主题序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性。通常，除非另作指定，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。

如本文所使用，“杂交”指一条核酸链通过其与互补链形成碱基配对的方法，如印迹杂交技术和PCR技术过程中所发生。

如本文所使用，通过体外化学或酶促合成产生而非通过生物产生“合成”分子。

如本文所使用，用来谈论细胞时，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”指该细胞具有整合入其基因组或作为保持多代的附加型质粒携带的非天然(例如异源的)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的背景中，术语“引入”指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

本文所用的术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指已将包含编码目的多肽(例如变体α-淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体引入其中的生物。示例性宿主菌株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包含从细胞，如芽孢杆菌属物种的细胞产生的原生质体。

提到多核苷酸或蛋白质时，本文所用的术语“异源的”指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

提到多核苷酸或蛋白质时，本文所用的术语“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所使用，术语“表达”指通过其来根据基因的核酸序列产生多肽的方法。该方法包括转录和翻译二者。

本文所用的“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主中表达以便于选择携带该基因的宿主细胞的基因。选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或新霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。

本文所用的“培养”指在适宜的条件下在液体或固体培养基中培养微生物细胞群体。培养包括发酵性生物转化含有颗粒淀粉的淀粉底物为终产物(通常在容器或反应器中)。

本文所用的“发酵”是通过微生物酶促降解有机物来产生更简单的有机化合物。虽然发酵通常发生于厌氧条件下，但此术语并非旨在仅限于严格的厌氧条件，因为在氧气存在下也发生发酵。

本文所用的“基因”指涉及产生多肽的DNA片段，并包含编码区、编码区之前和之后的区域和单个编码片段(外显子)间的间插序列(内含子)。

本文所用的“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

本文所用的“表达载体”指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，该DNA序列与能够影响该DNA在适宜的宿主中表达的适宜的控制序列有效连接。此类控制序列可以包含影响转录的启动子、控制转录的可选的操纵基因序列、编码mRNA上适宜的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

本文所用的“启动子”是涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。示例性启动子是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL)启动子。

本文所用的术语“有效连接”指指定的成分处于允许它们以预期的方式发挥功能的关系(包括但不限于毗连)中。例如，与编码序列有效连接的调控序列将如此连接，使得该编码序列的表达处于该调控序列的控制下。

本文所用的术语“处于转录控制下”指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与促成转录起始或促进转录的元件有效连接。

本文所用的术语“处于翻译控制下”指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻译为多肽依赖于其与促成翻译起始或促进翻译的元件有效连接。

如本文中使用的，“信号序列”是附着在蛋白质的N端部分的氨基酸序列，其有利于蛋白质分泌到细胞外。胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。

如本文中使用的，“生物学活性的”指序列具有特定的生物学活性，例如酶活性。在本发明的淀粉酶的情况下，所述活性是α-淀粉酶活性。

如本文中使用的，“水硬度”是对水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。

如本文中使用的，术语“冷水”指温度低于约25℃的水。具体而言，冷水指温度低于约20℃的水。示例性的冷水范围是从约15℃至约25℃，从约15℃至约20℃。

如本文中使用的，术语“性能指数(PI)”指变体性能与亲本或参照淀粉酶的比值。性能(即，特性)的测量包括热稳定性、清洁性能、表达水平等，根据上下文是显而易见的。

如本文中使用的，改善性能的突变被称为“上升突变(upmutation)”，对于特定的特性具有PI＞1。“中性突变”对于特定的特性具有PI＞0.5。“无害突变”对于特定的特性具有PI＞0.05。“有害突变”对于特定的特性具有PI ≤0.05。“组合突变”对于至少一种特性具有PI≥0.5，且对于所有特性具有PI＞0.05。组合突变可以在同一个变体中共存，产生具有至少一种有益特性的酶。

如本文中使用的，术语“活性测量”指测量本文所述的酶活性。此类活性测量包括在pH8下的清洁性能、pH10下的清洁性能、16℃下的清洁性能、32℃下的清洁性能和使用合成底物的活性。

如本文中使用的，术语“稳定性测量”指测量本文所述的酶稳定性。此类稳定性测量包括在去垢剂中的稳定性和热稳定性。

如本文中使用的，术语“共同配制”意指对象成分(例如酶)共存于同一液体、半固体或干燥的组合物中。

如本文中使用的，“糖化作用”是指淀粉向葡萄糖的酶促转化。

如本文中使用的，“胶凝作用”指通过蒸煮溶解淀粉分子形成粘稠的悬浮液。

如本文中使用的，“液化”指淀粉转化中的阶段，其中胶凝作用的淀粉水解产生低分子量的可溶性糊精。

如本文中使用的，术语“初级液化”指浆液的温度升高或接近其胶凝作用温度时的液化步骤。在温度升高后，将浆液通过热交换器或喷射至200-300°F的温度，例如220-235°F。在用于热交换器或喷射温度后，将浆液在所述温度下保持3-10分钟的时间段。保持浆液在200-300°F的这一步骤就是初级液化。

如本文中使用的，术语“次级液化”指在初级液化(加热至200-300°F)之后的液化步骤，此时允许浆液冷却至大气温度。该冷却步骤可以是30分钟至180分钟(3小时)，例如90分钟至120分钟(2小时)。

如本文中使用的，术语“次级液化的分钟数”指从开始次级液化时至测量DE时已流逝的时间。

如本文中使用的，术语“聚合度(DP)”指给定糖类中的无水呋喃葡萄糖单位的数目。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示具有聚合度大于3的聚合物。

如本文中涉及淀粉转化时使用的，术语“终产物”或“理想的终产物”指从淀粉底物酶促转化成的具体的碳源来源的分子。

如本文中使用的，术语“干燥固体含量(ds)”指浆液中的总固体，以％干重表达。

如本文中使用的，术语“浆液”指含有不可溶的固体的含水混合物。

如本文中使用的，术语“剩余的淀粉”指在发酵或酶促水解含淀粉的底物后，组合物中剩余的淀粉(可溶的或不可溶的)。

如本文所使用，“回收步骤”指醪液成分的回收，其可含有剩余的淀粉、酶和/或发酵含淀粉底物的微生物。

如本文中使用的，术语“醪液”指含有可发酵碳源(例如糖类)的水性混合物，其可以用来产生发酵产物，如乙醇。术语“啤酒”和“醪液”可互换使用。

如本文中使用的，术语“釜馏物”指未发酵的固体和水的混合物，其表示从发酵醪液去除醇后的残留物。

如本文中使用的，术语“干酒糟(DDG)”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷粒发酵的有用副产物。

如本文所使用，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物由于它们表达单独或一起将糖转化为乙醇的一种或多种酶的能力而是产乙醇的。

如本文所使用，术语“乙醇产生者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任意生物或细胞。通常，产乙醇细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包含真菌微生物，如酵母。优选的酵母包含酵母属(Saccharomyces)菌株，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

如本文中使用的，就淀粉酶和它们的底物而言，术语“接触”指将酶置于足够接近底物，以使酶能够将底物转化为终产物。接触可包括混合。

如本文中使用的，术语“源自”意指“起源自”、“基于”、“获得自”、“可获得自”或“分离自”，取决于上下文。

如本文中使用的，术语“酶促转化”一般指通过酶作用(例如，淀粉酶)对底物(例如，淀粉)的修饰。

如本文所使用，术语“分解”指与生物膜中的单个微生物细胞连接和结合在一起的生物膜基质中的多糖的水解，从而可从生物膜释放和去除微生物细胞。

如本文中使用的，“样片(swatch)”是可以在其上应用污渍用于评估组合物清洁效率的一片材料，如织物。

如本文中使用的，术语“比活”指在特定条件下每单位时间通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活表示为单位(U)/mg蛋白质。

如本文中使用的，术语“产量”指方法生产的终产物的量，例如以浓度、体积、量或起始材料的百分比来表示。

如本文中使用的，“ATCC”指位于Manassas，Va.20108(ATCC)的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。

如本文中使用的，“NRRL”指Agricultural Research ServiceCulture Collection，National Center for Agricultural UtilizationResearch(之前称为USDA Northern Regional Research Laboratory)，Peoria，IL。

数值范围包括定义范围的数。

一般而言，小标题是描述性的，并非意在限制。

1.2命名

在本说明书和权利要求中，氨基酸残基使用常规的单字母和三字母代码。为了便于参照，通过使用下列命名描述本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体：

原始氨基酸：位置：取代的氨基酸。

根据这一命名，例如用丙氨酸取代242位的丝氨酸显示为：Ser242Ala或S242A。删除30位的丙氨酸显示为：Ala30＊或A30＊或ΔA30。插入额外的氨基酸残基，如赖氨酸，显示为：Ala30AlaLys或A30AK。

删除连续一段的氨基酸残基，例如氨基酸残基30-33，标示为(30-33)＊或Δ(A30-N33)或Δ30-33。删除2个连续的氨基酸，如氨基酸残基R180-S181，标示为ΔRS或Δ180-181。

当相比其他α-淀粉酶，特定的α-淀粉酶含有“删除”，且在该位置产生插入时，标示为：对于36位插入天冬氨酸则标示为：＊36Asp或＊36D。

通过加号或减号分隔多个突变：Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S，Ala30Asp-Glu34Ser或A30N-E34S，表示30和34位的突变分别是用天冬酰胺和丝氨酸取代丙氨酸和谷氨酸。

当一个或多个可选的氨基酸残基可以取代给定位置的残基时，标示为：A30N、E或A30N或A30E。

此外，当本文鉴别的适合进行修饰的位置没有提示任何特定的修饰时，理解为可以用任何氨基酸残基取代所述位置存在的氨基酸残基。因此，例如当提到30位的丙氨酸的修饰但未说明时，理解为所述丙氨酸可以被删除或被任何其他的氨基酸取代，即，R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任一种。

此外，“A30X”意指任一种下列取代：A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V；或简写为：A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。

使用下列命名来表示非特定的亲本淀粉酶的位置上的氨基酸残基，其中，所述位置根据SEQ ID NO：2所述的参照α-淀粉酶的氨基酸序列编号：例如“X30N”或“X30N、V”的情况下，变体淀粉酶的30位存在N或V之一，而亲本淀粉酶(例如，野生型或变体酶)中存在20种标准氨基酸之一。

1.3氨基酸残基的特征

带电的氨基酸包括：Asp、Glu、Arg、Lys和His。带负电荷氨基酸(首先是具有最多负电的残基)是Asp和Glu。带正电荷氨基酸(首先是具有最多正电的残基)是Arg、Lys和His。

中性氨基酸包括：Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr和Pro。

疏水性氨基酸残基(具有最大疏水性的残基列举在最后)包括：Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe和Trp。

亲水性氨基酸残基(具有最大亲水性的残基列举在最后)包括：Thr、Ser、Cys、Gln和Asn。

1.4同源性(同一性)

与另一种序列具有特定百分比(例如，75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽意指比对时，在比较两条序列中碱基或氨基酸残基的百分比是相同的。可以使用本领域已知的任何合适的软件程序来确定这一比对和百分比同源性或同一性，例如CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人，(编辑)1987，Supplement 30，7.7.18节)中描述的那些。优选的程序包括Vector NTIAdvanceTM 9.0(InVitrogen Corp.Carlsbad，CA)、GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等人，(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.，和Altschul等人，(1997)NAR25：3389-3402)。另一个优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)，优选使用默认参数。另一种可使用的序列软件程序是在SequenceSoftware Package Version 6.0(Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)中可获得的TFASTA Data SearchingProgram。

同源性可以确定为两条序列之间相同的程度，表示第一序列源自第二序列。可以通过本领域已知的计算机程序适当的确定同源性，例如GCG程序包(如上所述)中提供的GAP。因此，GAP GCG v8可使用同一性的默认评分矩阵和下列默认参数：对于核酸序列比较分别是空位产生罚分为5.0，空位延伸罚分为0.3，对于蛋白质序列比较分别是空位产生罚分为3.0，空位延伸罚分为0.1。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453的方法，产生比对和计算同一性。

可使用BASE(SEQ ID NO：2)或BASE变体与例如另一种α-淀粉酶之间的结构性比对，来鉴别具有高度同源性的其他α-淀粉酶中的等价/相应的位置，例如与AmyTS23约75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％。一种获得此类结构性比对的方法是使用GCG包中的Pile Up程序，使用空位罚分的默认值，即空位产生罚分为3.0，空位延伸罚分为0.1。其他的结构性比对方法包括疏水聚类分析(Gaboriaud等人，(1987)，FEBSLETTERS 224，第149-155页)和逆向联系(reverse threading)(Huber和Torda，PROTEIN SCIENCE，第7卷，第1期，第142-149页(1998))。

图1提供了各种参照淀粉酶的成熟形式的示例性比对。参照淀粉酶包括：本文中称为AmyTS23t或BASE的截短的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶，SEQ ID NO：2(GENBANK登录号：AAA63900)；本文中称为AmyL或LAT的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶，SEQ ID NO：5(GENBANK登录号：AAA22240)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(之前的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))α-淀粉酶AmyS，SEQ ID NO：6(GENBANK登录号：AAA22241)；解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶BACAM，SEQ ID NO：7(GENBANK登录号：AAA22191)；本文中称为AmyG6或Amy#707的芽孢杆菌属物种#707α-淀粉酶，SEQ ID NO：8(GENBANK登录号：AAA22231)；巨大芽孢杆菌(B.megaterium)α-淀粉酶AmyG5或AmyBm，SEQ ID NO：9(GENBANK登录号：AAK00598)；芽孢杆菌属物种α-淀粉酶ALBA，SEQ ID NO：10(GENBANK登录号：CAL48155和WO 2006/037484)；B.halmapalus淀粉酶AmyBh，SEQID NO：11(GENBANK登录号：AAE00432和美国专利号5,856,164)；芽孢杆菌属物种淀粉酶AA560，SEQ ID NO：12(GENBANK登录号：CAC16486和WO2000/060060)；芽孢杆菌属物种KSM-AP1378α-淀粉酶AmyKSM1378，SEQ ID NO：13(GENBANK登录号：CAD35985和EP No.1199356A)；芽孢杆菌属物种pHSP-K38淀粉酶AmyK38，SEQ ID NO：14(GENBANK登录号：CAJ00040和WO2005/045045)。使用MUSCLE 3.7多重序列比对算法(Edgar，NucleicAcids Research，32：1792-1797，2004)比对序列。表1提供了显示图1的α-淀粉酶序列比对的百分比同一性的矩阵。

1.5杂交

可以基于所讨论的α-淀粉酶的完整或部分的核苷酸或氨基酸序列，适当的制备在上文表征AmyTS23中使用的寡核苷酸探针。

测试杂交的合适条件涉及在5X SSC中预浸泡和在20％甲酰胺、5X Denhardt氏液、50mM磷酸钠、pH6.8和50mg变性的超声化小牛胸腺DNA的溶液中40℃预杂交1小时，再在补充了100mM ATP的相同溶液中40℃杂交18小时，再在2X SSC，0.2％SDS中洗涤滤膜3次，40℃下30分钟(低严谨度)，优选50℃(中等严谨度)，更优选65℃(高严谨度)，甚至更优选75℃(非常高严谨度)。关于杂交方法的更多细节可参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989。

在上下文中，“源自”意在并非仅表示由所讨论的生物的菌株生产的或可生产的α-淀粉酶，而且也表示由此类菌株中分离的DNA序列编码的α-淀粉酶和在用此类DNA序列转化的宿主生物体中生产的α-淀粉酶。最后，该术语意在表示这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码，且具有所讨论的α-淀粉酶的鉴别特征。该术语还意在表示亲本α-淀粉酶可以是天然存在的α-淀粉酶的变体，即作为天然存在的α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基的修饰(插入、取代、缺失)结果的变体。

本领域技术人员将认识到本发明组合物和方法涵盖的序列也可由在严谨杂交条件下与示例的碱基序列(例如SEQ ID NO：4)杂交的能力来定义。当在恰当的温度和溶液离子强度的条件下，核酸的单链形式可以与其他核酸退火时，核酸与另一核酸序列是可杂交的。杂交和洗涤条件是本领域普遍已知的(参见例如，Sambrook(1989)，见上文，特别是第9和11章)。在一些实施方案中，严谨的条件对应于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。

1.6亲本α-淀粉酶

根据本公开内容，任何α-淀粉酶都可用作亲本(即，骨架)α-淀粉酶。在优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的BASE(AmyTS23t)。

1.7改变的特性

下列章节描述了存在于本文所述变体淀粉酶中的突变之间的关系，和可由其获得的理想的特性改变(相对于亲本α-淀粉酶)。说明书全文详细的描述了本发明组合物和方法涵盖的变体，下列篇幅仅做一概述。

如上文所述，组合物和方法的方面涉及源自或可源自芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的α-淀粉酶，包括相对于亲本淀粉酶具有改变的特性的变体/突变体。亲本淀粉酶是上述的亲本α-淀粉酶以及包括至少一部分α-淀粉酶(例如成熟多肽的氨基酸序列)的杂合或嵌合淀粉酶。

当BASE α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)用作起点来讨论变体淀粉酶时，可以理解与BASE α-淀粉酶具有高度同源性的其他芽孢杆菌属α-淀粉酶可作为亲本淀粉酶，而不破坏所述组合物和方法的范围。这对于其他的天然存在的芽孢杆菌属α-淀粉酶是特别合适的，其中所述α-淀粉酶相比BASE α-淀粉酶只包含极小的序列差异，而不包括属于本公开内容对象的取代、缺失或插入。

在本发明组合物和方法的第一个方面，提供了亲本芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的变体。在一些实施方案中，所述α-淀粉酶变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、70、71、72、73、75、78、82、83、87、90、91、93、94、95、103、104、105、107、108、110、112、113、114、115、116、118、121、123、125、126、127、128、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、147、149、150、152、154、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、170、171、172、174、175、176、177、178、179、182、183、185、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、200、201、202、203、207、210、214、217、221、228、234、237、238、239、240、243、246、250、254、255、257、264、266、267、268、269、270、272、273、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、314、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位置上包含取代。除非另外指出，否则所述位置是对应于SEQ ID NO：2所述的参照α淀粉酶(BASE)的氨基酸序列来编号的(例如，在α淀粉酶序列比对中相同的位置，如图1提供的)。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在其他优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自这样的亲本α淀粉酶，所述亲本α淀粉酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括58位的酪氨酸和236位的丙氨酸。在一些实施方案中，α淀粉酶变体包括243位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸。

还提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的182、183、305、320、379、407、419和475的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶，和/或所述取代包括一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)的T182N、G183N、Y305Q、Q320F、P379A、Q407D、T419S和G475T(例如，BASE组合文库1的变体)。

此外，本公开内容提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的160、182、183、189、305、379和475的一个至七个(例如1、2、3、4、5、6或7个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶，和/或所述取代包括一个至七个(例如1、2、3、4、5、6或7个)的Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E和G475T(例如，BASE组合文库2的变体)。

本公开内容提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、214、279、305、319、320和475的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶，和/或所述取代包括一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)的S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、Q320N和G475R(例如，BASE组合文库3的变体)。

本公开内容提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的7、182、298、376、379、407、419和453的一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶，和/或所述取代包括一个至八个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)的E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S和L453W(例如，BASE组合文库4的变体)。

本公开内容提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自128、178、182和185的一个至四个(例如1、2、3或4个)位置上包含取代，并且α-淀粉酶变体包含在243位的丝氨酸或谷氨酰胺。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶，和/或所述取代包括一个至四个(例如1、2、3或4个)的N128C、K178L、T182G和A185D(例如，BASE-S1至-S32的变体)。

在其他实施方案中，本公开内容提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至九个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个)位置上包含取代，所述α淀粉酶变体在320位包含谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体包括：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸(例如，BASE-P1至P12变体)。

本公开内容还提供了分离的α淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、128、178、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至十一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)位置上包含取代，所述α淀粉酶变体在243位包含丝氨酸或谷氨酰胺，和在320位包含谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。在一些优选的实施方案中，α淀粉酶变体包括：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在128位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸(例如，BASE-W1至W13变体)。

公开了多种示例性的α淀粉酶变体用于要求保护的组合物和方法。下列α淀粉酶变体是示例性的α淀粉酶变体：BASE SEL变体、ACE-Q SEL变体、BASE组合文库1变体、BASE组合文库2变体、BASE组合文库3变体、BASE组合文库4变体、BASE-S1至S32组合变体、BASE-P1至P12组合变体、BASE-W1至W13组合变体和ACE-QK变体。然而，本公开内容的α淀粉酶变体不限于示例性变体，并且包括在相应位置具有取代的其他芽孢杆菌属物种亲本α淀粉酶的变体。基于比对和本文提供的其他数据，可以理解在其他α淀粉酶多肽中，即，在其他“骨架”中制造的相应取代，所获得的淀粉酶变体预计具有与所示例的相似的特性。

1.7.1稳定性

在本文所述变体的上下文中，对于实现改变的稳定性(即，更高或更低的)，特别是改善的稳定性而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，所述稳定性尤其是在高温(即，70-120℃)和/或极端pH(即，低或高pH，即，分别是pH 4-6或pH8-11)条件下的，特别是在低于60ppm的游离(即，未结合，因而在溶液中)钙浓度下。可以如下文“方法”章节中所述确定稳定性。

1.7.2Ca²⁺稳定性

改变的Ca²⁺稳定性意指改善了在Ca²⁺耗尽的条件下的酶的稳定性，即更高或更低的稳定性。在目前描述的变体的上下文中，对于实现改变的Ca²⁺稳定性，特别是改善的Ca²⁺稳定性(即，更高或更低的稳定性)而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，所述Ca²⁺稳定性尤其是在高pH(即，pH8-10.5)条件下的。

1.7.3比活

在其他方面，对于获得表现出改变的比活的变体，特别是增加或减少的比活而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，所述比活尤其是在10-60℃，优选20-50℃，尤其30-40℃的温度下的。可以如下文“方法”章节中所述确定比活。

1.7.4氧化稳定性

所述变体可具有相比亲本α淀粉酶改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。增加的氧化稳定性在例如去垢剂组合物中是有利的，而减少的氧化稳定性在用于淀粉液化的组合物中是有利的。可以如下文“方法”章节中所述确定氧化稳定性。

1.7.5改变的pH谱

对于获得具有改变的pH谱的变体重要的位置和突变包括位于活性位点残基附近的氨基酸残基的突变，所述pH谱特别是在特别高pH(即，pH8-10.5)或低pH(即，pH4-6)下的改善的活性。优选的突变是本文所述的。合适的测定描述在下文“方法”章节中。

1.7.6洗涤性能

对于获得在特别高pH(即，pH8.5-11)下具有改善的洗涤性能的变体重要的位置和突变包括本文所述的特定突变。可以如下文“方法”章节中所述测试洗涤性能。

2、制备α淀粉酶变体的方法

本发明组合物和方法的一个方面是制备具有特定取代、缺失、倒位、插入及其组合的本α淀粉酶变体的方法。这些变体可具有有利的特征，例如，增加的pH稳定性、增加的温度稳定性、降低的Ca²⁺需求、增加的比活、增加的餐具洗涤或洗涤性能、增加的溶解度、增加的储藏稳定性，或其组合。

向基因中导入突变和表达这些基因编码的突变多肽的若干方法是本领域已知的。在简要讨论克隆α淀粉酶-编码DNA序列之后，将讨论在α淀粉酶-编码序列中的特定位点产生突变的方法。

2.1克隆编码α淀粉酶的DNA序列

使用本领域普遍已知的各种方法，可以从生产所讨论的α淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲本α淀粉酶的DNA序列。首先，可以使用生产所研究的α淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果α淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成同源的、标记寡核苷酸探针，用于从所讨论的生物体制备的基因组文库中鉴别α淀粉酶-编码克隆。可选的，可以使用含有与已知的α淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针作为探针来鉴别α淀粉酶-编码克隆，使用低严谨度的杂交和洗涤条件。

鉴别α淀粉酶-编码克隆的另一种方法涉及在表达载体中插入基因组DNA片段，用获得的基因组DNA文库转化α淀粉酶-阴性细菌，然后将转化的细菌在含有α淀粉酶底物的琼脂上涂板，从而允许鉴别表达α淀粉酶的克隆。

可选的，可以通过已建立的标准方法合成制备编码酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的phosphoamidite方法或Matthes等(1984)描述的方法。在phosphoamidite方法中，在例如自动化DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到恰当的载体中。

最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成的起源、混合的合成和cDNA起源，或混合的基因组和cDNA起源，通过根据标准技术连接合成的、基因组的或cDNA起源的片段而制备(恰当时，片段对应完整DNA序列的各部分)。还可以使用特定的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如美国专利4,683,202或R.K.Saiki等(1988)中描述的。

2.2定点诱变

一旦分离了α淀粉酶-编码DNA序列，并鉴别出理想的突变位点，则可以使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有在理想的突变位点两侧的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的过程中插入突变核苷酸。在特定的方法中，在携带α淀粉酶基因的载体中，产生桥接α淀粉酶-编码序列的DNA的单链空位。然后，将具有所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。然后，用DNA聚合酶I(Klenow片段)填满剩余的空位，使用T4连接酶连接构建体。该方法的具体实例描述在Morinaga等(1984)中。美国专利号4,760,025公开了通过实施盒的最小改变，导入编码多个突变的寡核苷酸。然而，通过Morinaga方法甚至可以任一次导入更多的突变，因为可以导入各种长度的多个寡核苷酸。

Nelson和Long(1989)中描述了向α淀粉酶-编码DNA序列中导入突变的另一种方法。涉及3步法产生含有所需突变的PCR片段，所述突变是通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一条引物导入的。从PCR产生的片段中，可以通过限制性内切核酸酶切割而分离携带突变的DNA片段，并重新插入到表达质粒中。

提供变体的替代方法包括基因改组，例如WO95/22625(AffymaxTechnologies N.V.)或WO96/00343(Novo Nordisk A/S)所述，或者获得包含突变的杂交酶的其他相应技术，所述突变例如所讨论的取代和/或缺失。

2.3表达α淀粉酶变体

通过上述方法或本领域已知的任何替代方法生产的编码α淀粉酶变体的DNA序列，可用于使用表达载体来表达变体α淀粉酶(即，酶)，所述载体通常包括控制序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号，和任选的抑制基因或多个激活子基因。

携带编码α淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是常规进行重组DNA程序的任何载体，载体的选择一般依赖于其将导入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。可选的，载体可以是当导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制的载体。

在载体中，DNA序列应该与合适的启动子序列有效连接。启动子可以是任何DNA序列，在选择的宿主细胞中表现出转录活性，并可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指导编码本发明组合物和方法的α淀粉酶变体的DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中转录的合适的启动子的实例是大肠杆菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有效的启动子的实例是源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因。

表达载体还可以包括与编码本发明组合物和方法的α淀粉酶变体的DNA序列有效连接的合适的转录终止子，和在真核细胞中多聚腺苷酸化序列。终止子和多聚腺苷酸化序列可以适当的源自启动子相同的来源。

载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可以包括可选择的标志物，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌的dal基因，或者产生抗生素抗性的基因，所述抗性例如氨苄霉素、卡那霉素、新霉素或四环素抗性。此外，载体可以包括曲霉属(Aspergillus)选择标志物，例如amdS、argB、niaD和sC，产生潮霉素抗性的标志物，或可以通过共同转化实现选择，例如WO91/17243中所述。

虽然在一些方面细胞内表达是有利的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时，但表达一般优选的是胞外的。一般而言，本文提及的芽孢杆菌属物种α淀粉酶包括允许所表达的蛋白酶分泌到培养基中的前原区或信号序列。如果需要，可以用不同的前原区或信号序列替换该前原区，这通过编码各种前原区的DNA序列取代方便的实现。

本领域技术人员普遍已知用于分别连接编码α淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的程序，和将其插入到含有复制必需信息的合适载体中的程序(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor，1989)。

包含DNA构建体或表达载体的细胞有利的用作重组生产α淀粉酶变体的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一份或多份拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便的用编码所述变体的本发明组合物和方法的DNA构建体来转化细胞。该整合一般被认为是有利的，因为DNA序列更易于稳定的维持在细胞中。可以根据常规方法，例如同源或异源重组，实施DNA构建体向宿主染色体中的整合。可选的，对于不同类型的宿主细胞，可以如上所述用表达载体转化细胞。细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫，但优选是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

合适的细菌的实例是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。可以例如通过原生质体转化或使用感受态细胞，以本身已知的方式来实现细菌的转化。

可以有利的从酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)中选择酵母生物体，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。丝状真菌可以有利的属于曲霉属(Aspergillus)的物种，例如米曲霉或黑曲霉。可以以本身已知的方式，用涉及原生质体形成和原生质体转化，之后再再生细胞壁的方法，来转化真菌细胞。转化曲霉属宿主细胞的合适程序描述在EP238023中。

用于培养细胞的培养基可以是适合所讨论的宿主细胞生长和获得α淀粉酶变体表达的任何常规培养基。合适的培养基可获得自商业供应商，或者可根据公开的配方制备(例如，美国典型培养物收藏中心的目录中所述)。

可以通过普遍已知的程序从培养基中方便地回收宿主细胞分泌的α淀粉酶变体，包括通过离心或过滤将细胞与培养基分离，和通过盐(如硫酸铵)的手段，沉淀培养基的蛋白质组分，再使用层析程序，例如离子交换层析、亲和层析等。

3、去垢剂组合物

本发明组合物和方法的一个方面涉及去垢剂组合物，或去垢剂添加剂，包括α淀粉酶和蛋白酶。去垢剂组合物可以配制成手洗或机洗的洗衣去垢剂组合物、适合预处理玷污织品的洗衣添加剂组合物、漂洗添加的织品软化剂组合物、一般家用硬表面清洁的去垢剂组合物，或手洗或机洗的餐具洗涤组合物。

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的。微生物起源是优选的。包括了化学修饰的或蛋白改造的变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶或糜蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛起源的)和WO89/06270和WO94/25583中描述的镰孢霉属(Fusarium)蛋白酶。

有效的蛋白酶的实例还包括但不限于美国专利号RE34,606、5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，美国专利公开号2008/0090747，和国际专利公开号WO98/23732、WO99/20770、WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116、WO98/34946、WO95/23221、WO92/21760和WO89/06270中描述的变体，尤其是具有一个或多个下列位置上的取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

示例性的可商购的蛋白酶包括

DURAZYM^TM、

和

(Novozymes A/S)、MAXACAL、PURAFECT

和

PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM和PURAFAST^TM(来自Genencor)和BLAP^TM(来自Henkel Kommanditgesellschaft aufAktien，Duesseldorf，Germany)。

在其他一些实施方案中，可用于本发明的金属蛋白酶包括但不限于WO07/044993中描述的中性金属蛋白酶。

除α淀粉酶和蛋白酶外，去垢剂组合物或添加剂可以包括一种或多种其它的酶，例如，脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶如另一种α淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽淀粉酶(maltogenic amylase)、CGT酶和/或纤维素、甘露聚糖酶(例如，Danisco U.S.A.，Inc.，Genencor Division的MANNASTAR^TM)、果胶酶、胶质裂合酶、角质酶和/或漆酶。一般而言，选定的酶的特性应该与选定的去垢剂相容，(即，pH优化的，与其他酶的和非酶的成分相容，等)，且酶应该以有效量存在。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白改造的变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热丝孢霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中所述的棉毛腐质霉(H.lanuginosa)(棉毛嗜热丝孢霉(T.lanuginosus))的那些，或来自WO96/13580中描述的特异腐质霉(H.insolens)的那些、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种菌株SD 705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的那些、芽孢杆菌属脂肪酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的那些。适用于所述制剂的其它示例性脂肪酶变体包括WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的。可商购的脂肪酶包括LIPOLASE^TM和LIPOLASEULTRA^TM(Novozymes A/S)。

聚酯酶：组合物中可包括合适的聚酯酶。合适的聚酯酶包括例如WO01/34899和WO01/14629中描述的那些。

淀粉酶：还可以包括一种或多种其它的淀粉酶(除本文所述的变体淀粉酶外)。合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰的或蛋白改造的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α淀粉酶，例如GB1,296,839中详细描述的特定的地衣芽胞杆菌菌株。有效的α淀粉酶的实例是WO94/18314、WO96/39528、WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个下列位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。可商购的α淀粉酶是DURAMYL^TM  、LlQUEZYME^TM TERMAMYL^TM、NATALASE^TM、STAINZYME^TM PLUS、STAINZYME^TM ULTRA、FUNGAMYL^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM(来自Genencor)。

纤维素酶：组合物中可添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰的或蛋白改造的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳霉属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如在美国专利号4,435,307、美国专利号5,648,263、美国专利号5,691,178、美国专利号5,776,757和WO89/09259中公开的由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)生产的真菌纤维素酶。示例性里氏木霉纤维素酶公开在美国专利号4,689,297、美国专利号5,814,501、美国专利号5,324,649、WO92/06221和WO92/06165中。示例性芽孢杆菌属纤维素酶公开在美国专利号6,562,612中。可商购的纤维素酶包括

和(Novozymes A/S)、

和

(Genencor International Inc.)和(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰的或蛋白改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包含描述于WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。市售过氧化物酶包含GUARDZYME^TM(Novo Nordisk A/S)。

可以通过添加含有一种或多种酶的分离的添加剂，或者通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，使去垢剂组合物包括去垢剂酶。本发明组合物和方法的去垢剂添加剂，即分离的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如，颗粒状、液体、浆状等。优选的去垢剂添加剂配方是颗粒状的，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定的液体，或浆。

可以例如，按美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的那样来产生无尘颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔质量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。GB1483591中给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。例如，可以按照已建立的方法，通过加入诸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液态酶制品。可按照EP238216中公开的方法来制备受保护的酶。

一般而言，去垢剂组合物可以是任何便利的形式，例如条状、片状、粉末、颗粒、糊状或液体。液体去垢剂可以是含水的，典型的含有多达约70％水，和0％至约30％有机溶剂。压缩的去垢剂凝胶含有例如约30％或更少的水。

Persil、

2X冷水型和Ariel去垢剂是本文用于测试示例性α淀粉酶变体的示例性去垢剂。本发明的α淀粉酶变体不限于示例性组合物，它们被认为可在存在广泛范围的常用清洁组合物的条件下发挥作用。

去垢剂组合物包括一种或多种表面活性剂，可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂存在的水平通常是按重量计0.1％至60％。在含有阴离子型和非离子型表面活性剂的去垢剂组合物中测试示例性α淀粉酶变体。认为本文描述的α淀粉酶变体在含有其他常用于去垢剂中的表面活性剂的组合物中也是有活性的。

当包括在其中时，去垢剂通常含有从约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。

当包括在其中时，去垢剂通常含有从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

去垢剂可含有0-65％的去垢剂助剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如，Hoechst的SKS-6)。

去垢剂可包括一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去垢剂可含有漂白剂系统，所述系统可包含H₂O₂源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可与形成过酸的漂白活性剂组合(例如，四乙酰乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)。可选的，漂白剂系统可包含过氧酸(例如，酰胺、亚胺或砜类型的过氧酸)。漂白系统还可以是酶促漂白剂系统。参见例如WO05/056782。

可以使用常规的稳定剂稳定本发明组合物和方法的去垢剂组合物的酶，例如多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，且组合物可如例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制。

去垢剂还可与含有其他的常规去垢剂成分，例如织品护理剂，包括粘土(clay)、增泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污渍悬浮剂、抗污渍再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助溶剂、褪色抑制剂或香料。

本发明的α淀粉酶可添加的量对应于约0.01至约100mg酶蛋白/升洗涤液，例如约0.05至约5.0mg酶蛋白/升洗涤液，或约0.1至约1.0mg酶蛋白/升洗涤液。

本发明的α淀粉酶还可掺入在WO97/07202公开的去垢剂配方中，其通过引用整合到本文中。

4、组合物和用途

本发明的α淀粉酶/蛋白酶清洁组合物可用于涉及去垢剂组合物和清洁的方法中，特别是洗衣去垢剂组合物、餐具洗涤去垢剂组合物、硬表面清洁组合物等。

4.1洗衣去垢剂组合物和用途

一个实施方案，组合物和方法是洗衣去垢剂组合物及其使用方法。去垢剂组合物可以是无尘颗粒、稳定液体或受保护的酶的形式。干燥的配方可以是颗粒状或微型粒状的形式。无尘颗粒可以按例如美国专利号4,106,991和4,661,452公开的生产，并可任选的用本领域已知的方法包被。蜡质包被材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子且具有15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三甘油酯。例如GB专利号1483591中给出了适合流化床技术应用的成膜型包被材料的实例。液体酶制品可以是根据已建立的方法，通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。其他的酶稳定剂是本领域普遍已知的。可以根据例如EP申请号238,216中公开的方法来制备被保护的酶。多元醇长期被视为蛋白质的稳定剂和改善蛋白质的溶解度。参见例如，J.K.Kaushik等人，J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)及其中引用的参考文献；和Monica Conti等人，J.Chromatography757：237-245(1997)。

组合物可以包括一种或多种本发明的淀粉酶和蛋白酶作为主要的酶组分。可选的，组合物可以包括多种其他的酶活性，例如氨肽酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及下文讨论的其他酶。可通过属于曲霉属、木霉属、腐质霉属(例如特异腐质霉)和镰孢霉属的微生物生产其他酶。曲霉属的示例性成员包括棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉或米曲霉。腐质霉属的示例性成员包括Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、Fusariumheterosporum、Fusarium negundinis、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides和Fusarium venenatum。

去垢剂组合物可以是任何有效的形式，例如，粉末状、颗粒状、糊状或液体。液体去垢剂可以是含水的，通常含有多达约70％水，和0％至约30％有机溶剂。还可以是含有仅约30％水的压缩凝胶类型的形式。酶可以用于与酶的稳定性相容的任何去垢剂组合物中。可以通过已知的封装形式保护酶免受一般性的有害组分，例如颗粒化或隔离在水凝胶中。酶，特别是α淀粉酶，不限于洗衣和餐具洗涤应用，还可用于表面清洁剂、从淀粉或生物质中生产乙醇。

去垢剂组合物包括一种或多种表面活性剂，可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。去垢剂通常含有0％至约50％的阴离子型表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸(LAS)、α-烯属磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇磺酸盐)(AS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。该组合物也可以包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如WO92/06154中所述)。

去垢剂组合物可以额外的包含一种或多种任意组合的其他酶，例如脂肪酶、角质酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶。见上文。

去垢剂可任选的含有约1％至约65％的去垢剂助剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。去垢剂也可以是无助剂的，即基本上不含去垢剂助剂。

去垢剂可任选的包括一种或多种聚合物。实例包含羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去垢剂可任选的含有漂白剂系统，所述系统可包含H₂O₂源，例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可与形成过酸的漂白活性剂组合，例如，四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸(NOBS)。可选的，漂白系统可包含过氧酸，例如，酰胺、亚胺或砜类型。漂白系统还可以是酶促漂白剂系统，其中过水解酶激活过氧化物，例如WO05/056782中所述。

可以使用常规的稳定剂稳定去垢剂组合物的酶，例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；且组合物可如例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制。

去垢剂还可与含有其他的常规去垢剂成分，例如织品护理剂，包括粘土(clay)、增泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污渍悬浮剂、抗污渍再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂或香料。

pH(在使用浓度下的含水溶液中测量)通常是中性或碱性的，例如约7.0至约11.0的pH。

可以配制包含α淀粉酶变体的特定类型的去垢剂组合物，以包括：

1)配制为具有至少600g/L的体积密度(bulk density)的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约2％至约6％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。

2)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

3)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

4)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

5)水性液体去垢剂组合物，其包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

6)水性结构型液体去垢剂组合物，其包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

7)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。

8)配制为颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

9)配制为颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。

10)水性液体去垢剂组合物，其包含约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

11)水性液体去垢剂组合物，其包含约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

12)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。

13)上文组合物1)-12)中所述的去垢剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

14)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。

15)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的去垢剂组合物，其包含约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶硅酸盐(例如Na₂O、2SiO₂)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。

16)上文1)-15)中所述的去垢剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经指定的漂白系统的替代物。

17)上文1)、3)、7)、9)和12)中所述的去垢剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的去垢剂组合物，其还含有锰催化剂。例如锰催化剂是Hage等人，Nature 369：637-639(1994)中描述的化合物之一。

19)配制为非水性去垢剂液体的去垢剂组合物，其包含液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助剂系统(例如磷酸盐)、酶(一种或多种)和碱。该去垢剂也可包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

一种或多种本发明的α淀粉酶可以掺入到去垢剂常规使用的浓度中。目前认为，在去垢剂组合物中，α淀粉酶或其变体可以添加的量对应于0.00001-1.0mg酶/升洗涤液(按纯酶蛋白计算)。

在另一个实施方案中，2，6-β-D-果聚糖水解酶可以掺入到去垢剂组合物中，用于去除/清洁在家用和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜。

去垢剂组合物可以配制成例如手洗或机洗的洗衣去垢剂组合物，包括适合预处理玷污织品的洗衣添加剂组合物、漂洗添加的织品柔软剂组合物，或者配制成用于一般家用硬表面清洁操作的去垢剂组合物，或者配制成用于手工或机器洗衣操作。

在特定的方面，去垢剂组合物还可以包含2，6-β-D-果聚糖水解酶、除一种或多种本发明的α淀粉酶变体以外的一种或多种其它的α淀粉酶，和一种或多种其它的清洁用酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶、和/或过氧化物酶，和/或其组合。

一般而言，选定的酶的特性应该与选定的去垢剂相容(例如，pH优化、与其他的酶和非酶学成分相容，等)，且酶应该以有效量存在。在一些实施方案中，淀粉酶和蛋白酶是共同配制的(即，一起配制在相同的液体、颗粒等中)。可选的，淀粉酶和蛋白酶配制成分离的液体或颗粒，之后组合到清洁组合物中。

4.2餐具洗涤去垢剂组合物和用途

在另一个实施方案中，提供了餐具洗涤去垢剂组合物，包括下列：

1)粉末状自动化餐具洗涤组合物

2)粉末状自动化餐具洗涤组合物

3)粉末状自动化餐具洗涤组合物

4)粉末状自动化餐具洗涤组合物

5)粉末状自动化餐具洗涤组合物

6)含清洁表面活性剂系统的粉末状和液体的餐具洗涤组合物

非离子型表面活性剂                              0-1.5％

二水合十八烷基二甲胺N-氧化物                    0-5％

80∶20wt.的二水合十八烷基二甲胺N氧化物和二水合十六烷基二甲胺N氧化物的C18/C16掺合物                          0-4％

70∶30wt的无水十八烷基双(羟乙基)胺N氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N氧化物的C18/C16掺合物                0-5％

平均乙氧基化程度为3的C₁₃-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐    0-10％

平均乙氧基化程度为3的C₁₂-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐    0-5％

平均乙氧基化程度为12的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇         0-5％

平均乙氧基化程度为9的C₁₂-C₁₅乙氧基化醇的掺合物  0-6.5％

平均乙氧基化程度为30的C₁₃-C₁₅乙氧基化醇的掺合物 0-4％

二硅酸钠                                        0-33％

三聚磷酸钠                                      0-46％

柠檬酸钠                                        0-28％

柠檬酸                                        0-29％

碳酸钠                                        0-20％

单水合过硼酸钠                                0-11.5％

四乙酰乙二胺(TAED)                            0-4％

马来酸/丙烯酸共聚物                           0-7.5％

硫酸钠                                        0-12.5％

酶                                            0.0001-0.1％

7)不含水的液体自动化餐具洗涤组合物

液体非离子型表面活性剂(例如，醇类乙氧化物)    2.0-10.0％

碱金属硅酸盐                                  3.0-15.0％

碱金属磷酸盐                                  20.0-40.0％

选自较大乙二醇、聚乙二醇、                    25.0-45.0％

聚氧化物、乙二醇醚的液体载体

稳定剂(例如，磷酸和C₁₆-C₁₈链烷醇的部分酯)     0.5-7.0％

抑泡剂(例如，硅氧烷)                          0-1.5％

酶                                            0.0001-0.1％

8)不含水的液体餐具洗涤组合物

液体非离子型表面活性剂(例如，醇类乙氧化物)    2.0-10.0％

硅酸钠                                        3.0-15.0％

碱金属碳酸盐                                  7.0-20.0％

柠檬酸钠                                      0.0-1.5％

稳定系统(例如，精细分离的硅氧烷和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)                                       0.5-7.0％

低分子量聚丙烯酸聚合物                        5.0-15.0％

粘土凝胶增稠剂(例如，皂粘土)                  0.0-10.0％

羧丙基纤维素聚合物            0.0-0.6％

酶                            0.0001-0.1％

选自较大乙二醇、聚乙二醇、    平衡

多氧化物、乙二醇醚的液体载体液体

9)触变性液体自动化餐具洗涤组合物

抑泡剂，染料，香料，水 平衡

10)液体自动化餐具洗涤组合物

11)含保护性漂白剂颗粒的液体自动化餐具洗涤组合物

11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自动化餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐取代。

12)如1)-6)所述的自动化餐具洗涤组合物，其额外的含有锰催化剂。所述锰催化剂是例如Hage等人，Nature 369：637-639(1994)中描述的一种化合物。

5、方法

5.1滤纸筛选测定

下文讨论的测定可用于筛选现有α淀粉酶，鉴别相比亲本或参照α淀粉酶，在高或低pH下，和/或Ca²⁺耗尽的条件下具有改变的稳定性的变体。

5.2高pH滤纸测定

将芽孢杆菌属文库在TY琼脂平板上在醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤纸(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)的夹心上涂板，所述平板含有10μg/ml卡那霉素，37℃下至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

在涂板后，每个滤纸夹心都用针头具体标记，但在孵育前，为了能够在滤纸上定位阳性变体，将具有结合的变体的硝酸纤维素滤纸转移到含对羟苯基甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的容器中，室温(可以在10-60℃变化)孵育15min。将具有菌落的醋酸纤维素滤纸室温储存在TY平板上直到使用。孵育后，在对羟苯基甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)中，检测含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的平板上剩余的活性。和滤纸夹心相同的方式标记有硝酸纤维素滤纸的测定平板，并且室温孵育2小时。在去除滤纸后，用10％Lugol溶液将测定平板染色。降解淀粉的变体检测为深蓝背景上的白点，然后在储藏平板上鉴别。在与第一次筛选相同的条件下，将阳性变体重新筛选2次。

5.3低钙滤纸测定

将芽孢杆菌属文库在TY琼脂平板上在醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤纸(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)的夹心上涂板，所述平板含有相关的抗生素，例如卡那霉素或新霉素，37℃下至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

在涂板后，每个滤纸夹心都用针头具体标记，但在孵育前，为了能够在滤纸上定位阳性变体，将具有结合的变体的硝酸纤维素滤纸转移到具有不同的EDTA浓度(0.001mM-100mM)的含碳盐酸/二碳酸盐缓冲液(pH8.5-10)的容器中。室温孵育滤纸1小时。将具有菌落的醋酸纤维素滤纸室温储存在TY平板上直到使用。孵育后，在碳盐酸/二碳酸盐缓冲液(pH8.5-10)中，检测含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的平板上剩余的活性。和滤纸夹心相同的方式标记有硝酸纤维素滤纸的测定平板，并且室温孵育2小时。在去除滤纸后，用10％Lugol溶液将测定平板染色。降解淀粉的变体检测为深蓝背景上的白点，然后在储藏平板上鉴别。在与第一次筛选相同的条件下，将阳性变体重新筛选2次。

5.4低pH滤纸测定

将芽孢杆菌属文库在TY琼脂平板上在醋酸纤维素(OE 67，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)和硝酸纤维素滤纸(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)夹心上涂板，所述平板含有10微克/ml新霉素，37℃下至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

在涂板后，每个滤纸夹心都用针头具体标记，但在孵育前，为了能够在滤纸上定位阳性变体，将具有结合的变体的硝酸纤维素滤纸转移到柠檬酸缓冲液(pH4.5)的容器中，在80℃孵育20分钟(当筛选野生型骨架中的变体时)或在85℃孵育60分钟(当筛选亲本α-淀粉酶的变体时)。将具有菌落的醋酸纤维素滤纸室温储存在TY平板上直到使用。孵育后，在柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，检测含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的测定平板上剩余的活性。和滤纸夹心相同的方式标记有硝酸纤维素滤纸的测定平板，并且在50℃孵育2小时。在去除滤纸后，用10％Lugol溶液将测定平板染色。降解淀粉的变体检测为深蓝背景上的白点，然后在储藏平板上鉴别。在与第一次筛选相同的条件下，将阳性变体重新筛选2次。

5.5二次筛选

从储藏平板上挑取重新筛选后的阳性转化子，并在二次平板测定中测试。阳性转化子在5ml LB+新霉素中37℃生长22小时。将每种阳性转化子的芽孢杆菌属培养物和作为对照表达相应骨架的克隆孵育在柠檬酸缓冲液中，pH4.5，90℃，在0、10、20、30、40、60和80分钟时采样。将3微升的样品点在测定平板上。用10％Lugol溶液将测定平板染色。改良的变体可视为具有比骨架更高剩余活性的变体(根据测定平板上的光晕来检测)。通过核苷酸测序确定改良的变体。

5.6未纯化变体的稳定性测定

如下测定变体的稳定性：将表达待分析的变体的芽孢杆菌属培养物在10ml LB+新霉素中37℃生长21小时。将800微升培养物与200μL柠檬酸缓冲液，pH4.5混合。在PCR管中制备与多个采样时间点对应的多个70μL等分试样，并在PCR机器中，在70℃或90℃孵育不同的时间点(通常5、10、15、20、25和30分钟)。0min样品不在高温下孵育。如下文在“α-淀粉酶活性测定”中所述，通过转移20μL至200μL的α-淀粉酶PNP-G₇底物MPR3(BoehringerMannheim货号1660730)中，来测量样品中的活性。结果绘制为相对于时间的百分比活性(相对于0时间点)，或者叙述为孵育一定时间段后的百分比剩余活性。

5.7α-淀粉酶变体的发酵和纯化

携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株可以如下发酵和纯化：将菌株从-80℃贮藏物划线于含有10μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上并在37℃过夜生长。将菌落转移至500mL摇瓶中补充有10μg/ml新霉素的100mL PS-1培养基。

PS-1培养基的组成

培养物在37℃以270rpm振摇5日。通过以4500转/分钟离心20-25分钟从发酵肉汤除去细胞和细胞碎片。此后，过滤上清液以获得完全清亮的溶液。将滤液浓缩并在UF-滤器(10,000MW截止值膜)上洗涤并且将缓冲液换成20mM乙酸盐pH5.5。在S-Sepharose F.F.上施加UF-滤液并通过逐步洗脱法用相同缓冲液中的0.2M NaCl实施洗脱。洗脱液对pH9.0的10mM Tris透析并施加在Q-sepharose F.F.上并且用从0-0.3M NaCl的线型梯度经6个柱体积洗脱。汇集含有(由Phadebas测定法测量的)活性的级分，将pH调节至pH7.5并且通过用0.5％w/vol活性碳处理5分钟除去剩余颜色。

5.8比活性测定

μL使用

测定法(Pharmacia)，测定比活性为活性/mg酶。遵循制造商说明书实施(也见下文“α-淀粉酶活性测定法”)。

5.9确定等电点

通过等电聚焦(ex：Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)确定pI。

5.10加速的稳定性测定

在50ml Propylene管中，加入10ml目标去垢剂。用移液器进行恰当的稀释，使得在含有去垢剂的单独的管中测量180ppm的各种α-淀粉酶。将去垢剂和每种α-淀粉酶振荡30sec，然后置于RotaMix(ATR RKVS Model)上10分钟。用移液器测量含突变酶的100μL去垢剂，并稀释1∶651。使用嵌段的对硝基苯基麦芽七糖苷(嵌段的PBNPG7)底物在Konelab，Model 20XT上测定突变体的初始活性。然后，在设定为37℃的恒温孵育箱中孵育去垢剂样品。在1、2、4、7和17天移出样品，并测定酶活性。

5.11α-淀粉酶活性测定法

5.11.1Phadebas测定法

α-淀粉酶活性由使用

小片作为底物的方法确定。Phadebas小片(淀粉酶试验，由Pharmacia Diagnostic供应)含有交联的不溶性蓝颜色淀粉聚合物，该聚合物已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并造片。

对于每个单一测量，将一个小片悬浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl₂，用NaOH调节pH至目的值)的管中。试验在目的温度的水浴中进行。在50mM Britton-Robinson缓冲液若干毫升中稀释待测试的α-淀粉酶。将1毫升这种α-淀粉酶溶液添加至5mL的50mMBritton-Robinson缓冲液。淀粉被α-淀粉酶水解，产生可溶性蓝色碎片。以分光光度方式在620nm测量的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。

重要的是在温育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm处的0.2至2.0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，活性与吸光度之间存在线性关系(Lambert-Beer定律)。因而必须调整酶的稀释度以符合这个标准。在指定的条件集合(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶会水解某个量的底物，并且蓝颜色会产生。在620nm测量颜色强度。测量的吸光度与给定条件集合下所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)直接成比例。

5.11.2备选方法

α-淀粉酶活性由使用对硝基苯基-α，D-麦芽七糖苷(PNP-G₇)底物的方法确定，所述对硝基苯基-α，D-麦芽庚糖苷是可以被内切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割后，该试剂盒中包含的α-葡萄糖苷酶消化此底物以释放具有黄颜色并因而可以通过可见光分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)测量的游离PNP分子。含有PNP-G₇底物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim制造(目录号1054635)。

为制备试剂溶液，如制造商推荐，将10mL底物/缓冲液添加至50mL酶/缓冲液。通过转移20μl样品至96孔微量滴定平板并在25℃温育实施该测定法。添加预平衡至25℃的200μL试剂溶液。将溶液混合并预温育1分钟并且在ELISA读数仪中在OD 405nm在4分钟范围内每隔30秒测量吸收。

时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件集合下所讨论的α-淀粉酶的活性直接成比例。

5.12确定去垢剂组合物中的酶性能

5.12.1US条件

使用Terg-o-tometer(United States Testing，Hoboken，N.J.)模拟美国典型的洗涤条件。使用标准去垢剂在20℃执行量效曲线(DEC)，所述去垢剂例如不含光学增亮剂的液体AATCC 2003和/或粉末状AATCC 1993(美国纺织化学及色料师协会(American Association ofTextile Chemists and Colorists))。然后，执行作比较的α-淀粉酶的相应DEC，来比较本发明的突变体酶的污渍去除性能。在40℃重复该过程。通常，将4片CS-28稻淀粉污渍(荷兰的CFT)置于Terg-o-tometer不锈钢容器中，容器中装有1升DI水和1.5g液体AATCC。当使用粉末状AATCC时，在分析天平(Model PM4800，Mettler Instrument Corp.，Highstown，N.J.08520)上称出1.5g去垢剂粉末，并添加至Terg-o-tometer中。同时运行一式两份。除非另外指出，则测试进行12分钟，漂洗3分钟。洗涤后，将片空气干燥，用Konica Minolta生产的Chroma Meter Model CR-410测量测试片的反射率。用恰当的统计学分析处理所收集到的数据。

5.12.2欧洲条件

使用Launder-O-meter(Atlas Comp any，Atlanta，Georgia)模拟欧洲典型的洗涤条件。使用标准的欧洲测试去垢剂在40℃执行目标突变酶的量效曲线(DEC)，所述去垢剂为IEC A和含漂白剂(TAED-四乙酰乙二胺醋酸盐)和过硼酸钠的IEC A。然后，执行作比较的突变酶的相应DEC曲线，来比较本发明的突变酶的污渍去除性能。需要时，在更高的洗涤温度下重复该过程。通常，将4片EMPA161玉米淀粉污渍(EMPA，瑞士)置于含250ml DI水的不锈钢容器中，水中含6.8g/L的IEC A去垢剂或8.0g/L的含漂白剂去垢剂的IEC A。同时运行一式两份。除非另外指出，则测试进行45分钟，漂洗5分钟。洗涤后，将片空气干燥，用Chroma Meter Model CR-410测量测试片的反射率。用恰当的统计学分析处理所收集到的数据。

5.12.3评估去垢剂组合物的微片方法

各种α-淀粉酶和蛋白酶清洁测定是本领域已知的。示例性的清洁测定涉及施加了污渍的片(swatch)，这是材料例如织品的片。该材料可以例如是用棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制造的织品。片还可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶而言，污渍是基于淀粉的，但是可以包括血、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、乳酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。

一些测定使用更大片的较小部分，该片已经用单孔打孔装置切割过或者已经用定制的96孔打孔机切割过，其中多孔打孔机的样式与标准的96孔微量滴定平板匹配，或者该部分已经从片以别样方式取下。片可以是纺织品、纸、金属或其他合适的材料。较小的片可以在其置入24-孔、48-孔或96-孔微量滴定板的孔之前或之后附着有污渍。也可以通过施加污渍至一小片材料来制作较小的片。例如，较小片可以是带有直径5/8″或0.25″的一块玷污的织品。定制的打孔机以这样的方式设计，从而它同时送递96片至96孔平板的全部孔。该装置允许通过简单地装载相同的96孔平板多次而递送每孔多于一个片。可构想多孔打孔装置以同时送递片至任何形式的平板，包括但不限于24孔、48孔和96孔平板。在另一个可构想的方法中，弄脏的测试平台可以是以污物基质涂布的由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他合适材料制成的珠子，用于测试除纺织品外的其它材料的清洁组合物。一颗或多颗涂布的珠子随后置入96-孔、48-孔或24-孔平板或更大形式平板的含有合适缓冲液和酶的孔中。在这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在次级显色反应后对上清液检验释放的污物。对释放污物的分析也可以通过质谱分析进行。又一个微量筛选测定法可以是送递并固定片(例如靛蓝染色的粗纹棉布)至多孔平板的孔，并且添加颗粒如砂或更大颗粒例如过筛以包括6至8或9号颗粒的石榴石，并且摇动该平板，从而造成片被添加的颗粒摩擦。该测定法已经用于砂洗应用中纤维素酶的评估。可以通过至反应缓冲液的颜色释放(例如，释放的靛蓝溶解于二甲基亚砜中并且测量A₆₀₀nm处的吸光度)或通过磨损片的反射度测量判断该酶的效果。

例如当未处理的BMI(血/乳/墨)片在无漂白剂的去垢剂中洗涤时，大部分的墨水甚至在无蛋白酶辅助的情况下释放。添加蛋白酶导致墨释放的少量增加，这可能在大背景上难以定量。一方面提供了允许控制污渍固定程度的处理方案。结果，可能产生例如在所测试的酶不存在下洗涤时释放可变量污渍的片。固定片的使用导致洗涤测定法中信噪比的显著改善。此外，通过变动固定的程度，可以产生在多种清洗条件下给出最佳结果的污渍。

在多种类型材料上具有已知“强度”污渍的片是商业上可获得的(EMPA，St.Gallen，瑞士；wfk-Testgewebe GmbH，德国克雷菲尔德；或荷兰弗拉尔丁恩实验材料中心(Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制作(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280-286，(1982))。其他的试验片包含但不限于在含棉织品上的血/乳/墨(BMI)污渍，在含棉织品上的菠菜污渍，或在含棉织品上的草，和在含棉织品上的巧克力/乳/烟灰。

BMI污渍可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢固定到棉上。其他的组合包括用0.001％至1％戊二醛固定的草或菠菜、用0.001％至1％戊二醛固定的明胶和考马斯(Coomassie)亮蓝污渍，或者用0.001％至1％戊二醛固定的巧克力、乳和烟灰。

也可以在随酶和/或去垢剂制剂一起孵育期间搅动片。清洗性能数据依赖于片在孔中的朝向(水平对垂直)，特别是在96孔板中。这将表明孵育期间混合是不充足的。虽然存在保证孵育期间充分摇动的众多方式，但是可以构建一个平板固定器，其中微量滴定平板夹在两块铝板之间。这可以如下这样简单：例如在孔上安放一块粘性平板封盖，随后用任一类型的适当的市售夹子把两块铝板夹至96孔板上。平板随后可以安置在商业摇床上。设定振荡器至约400转/分钟产生极高效的混合，同时固定器有效防止泄露或交叉污染。

三硝基苯磺酸(TNBS)可以用来定量洗涤液中氨基的浓度。这可以充当从片中除去的蛋白质的量的量度(如见Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200，1997)。然而，如果去垢剂或酶样本导致非常小的肽片段形成(例如，因样本中存在肽酶)，则会得到更大的TNBS信号，即更多“噪音”。

测量血/乳/墨或其他污渍的清洗性能的另一种手段基于墨释放。片上蛋白质的蛋白酶解导致墨颗粒的释放，这可以通过测量洗涤液吸光度进行定量。吸光度可以在350nm与800nm之间的任意波长处测量。波长在410nm或620nm处测量。也可以检测洗涤液以测定对含有草、菠菜、明胶或考马斯亮蓝污渍的污渍的洗涤性能。用于这些污渍的示例性波长包括用于菠菜或草的670nm和用于明胶或考马斯亮蓝的620nm。例如，将等分试样的洗涤液取出(一般，例如从96孔微量培养板中取出100至150μL)并且置于比色皿或多孔微量平板中。然后将其置于分光光度计中并且在适当的波长处读出吸光度。

例如使用在合适基质如布、塑料或陶瓷上的血/乳/墨污渍，该系统也可以用来测定用于餐具洗涤的增强型酶和/或去垢剂组合物。

在一个方面，通过在25℃施加0.3％过氧化氢至BMI/棉片30分钟，或在60℃施加0.03％过氧化氢至BMI/棉片30分钟，将BMI污渍固定至棉上。将大约0.25″的较小片从BMI/棉片切下并且置于96孔微量滴定平板的孔中。向每个孔置入去垢剂组合物和酶(如变体蛋白)的已知混合物。在将粘性平板封盖安置在微量滴定平板的顶部后，将微量滴定平板夹到铝板上并且在有定轨摇床上以大约250转/分钟摇动约10至60分钟。这段时间结束时，将上清液转移到一块新微量滴定平板的孔中并且在620nm处测量墨的吸光度。这可以类似地用于测试菠菜污渍或草污渍，其中通过在25℃施加0.01％戊二醛30分钟至菠菜/棉片或草/棉片，将所述菠菜污渍或草污渍固定至棉上。可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍进行相同的测试。美国专利号7,122,334(Genencor International，Inc.)中提供了其他的血/乳/墨的测定和条件。

5.13确定LAS敏感度

用不同浓度的LAS(线性的烷基苯磺酸；Nansa 1169/P)在40℃孵育变体10分钟。使用

测定方法或使用PNP-G₇底物的备选方法，确定剩余活性。在0.1M磷酸缓冲液pH7.5中稀释LAS。使用下列浓度：500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm和10ppm或无LAS。

在不同的LAS缓冲液中稀释变体至浓度为0.01-5mg/l，总体积10ml，在控温水浴中孵育10分钟。通过将小的等分试样转移至冷的测定缓冲液中，终止孵育。重要的是，为了不影响活性测量，在活性测量的过程中，LAS浓度低于1ppm。

然后，使用上述

测定或备选方法，一式两份的确定剩余活性。在减去空白后测量活性。不含LAS的活性为100％。

为了便于阅读，将本申请组织为多个章节；但是，读者可以理解，在一个章节中的陈述也可用于其他章节。以该方式，本公开内容的用于不同章节的小标题不应被视为限制。

为了进一步示例本发明组合物和方法及其优势，给出下列具体的实施例，应理解它们供示例本发明组合物和方法，且不应以任何方式被视为限制其范围。

实验

下列实施例进一步详细的描述了本公开内容，其不以任何方式意在限制要求保护的公开内容的范围。

下列缩写用于公开内容的全文：AE(醇类乙氧化物)；AEO(醇类乙氧化物)；AEOS(醇类乙氧基硫酸酯)；AES(醇类乙氧基硫酸酯)；AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)；AGU(葡糖淀粉酶活性单位)；AOS(α-硫酸烯烃酯)；AS(醇类硫酸酯)；BAA(解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶)；BLA(地衣芽孢杆菌或LAT)；BPNPG7(对硝基苯麦芽七糖苷)；BSA(牛血清白蛋白)；cDNA(互补DNA)；CMC(羧甲基纤维素)；DNA(脱氧核糖核酸)；DP3(聚合度为3个亚单位)；DPn(聚合度为n个亚单位)；DTMPA(二乙基三胺五乙酸)；EC(进行酶分类的酶协会)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EO(环氧乙烷)；F&HC(织品和家用护理)；FAU(真菌淀粉酶单位)；GA(葡糖淀粉酶)；gpg(格令/加仑)；HFCS(高果糖玉米糖浆)；HFSS(高果糖基于淀粉的糖浆)；IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)；LAS(线性烷基苯磺酸)；LOM(Launder-O-meter)；LU(Liquiphon单位)；MTP(微滴度板)；MW(分子量)；MWU(修饰的Wohlgemuth单位)；NOBS(壬酰氧苯磺酸盐)；NTA(次氮基三乙酸)；PCR(聚合酶链式反应)；PEG(聚乙二醇)；PI(性能指数)；PVA(聚乙烯醇)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；RNA(核糖核酸)；SAS(仲烷基磺酸酯)；SEL(位点评估文库)；TAED(四乙酰乙二胺)；TCA(三氯醋酸)；TSB(胰蛋白酶(tryptic)大豆肉汤)；UFC(超滤浓度)；℃(摄氏度)；H₂O(水)；dH₂O或DI(去离子水)；dIH₂O(去离子水，Milli-Q过滤)；ETOH(乙醇)；eq(当量)；N(正常)；DS(干固体)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl和μL(微升)；ml和mL(微升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；DO(溶解氧)；WT％(重量百分比)；w/v(重量/体积)；W/W(重量/重量)；v/v(体积/体积)；GENEART(GENEART GmbH，Regensburg，Germany)；和Genencor(Danisco US Inc，GenencorDivision，Palo Alto，CA)。

实施例1

测定法

在下列实施例中，使用下文所述的各种测定法用于便于阅读。指出了自下文提供的规程的任何偏离。在这些实验中，使用分光光度计测量在反应完成后形成的产物的吸光度。

A.蛋白质含量测定法

使用在37℃和80％湿度下，300rpm振荡生长3天的微滴度板(MTP)中的过滤培养上清液，来实施该测定法。通过高效液相色谱法，将含有50μl上清液/孔的新鲜的96孔平底MTP用于所述蛋白质测定。上清液在含有5％乙腈和10％氯化钠的10mM磷酸钾缓冲液pH7.25中稀释3倍，分析10μl的各种稀释样品。使用装备了Swift^TMRP-all PN 68-1030-041(Teledyne Isco，Inc.)柱的Agilent 1100(HewletPackard)HPLC。溶剂系统由水相的0.1％三氟醋酸和乙腈的0.07％三氟醋酸组成。读取222nm的吸收度，基于纯化的BASE(AmyTS23t)蛋白的标准曲线，确定样品的蛋白质浓度。

B.Ceralpha淀粉酶测定法

该α-淀粉酶测定法的原理是基于在存在过量水平的热稳定性α-葡萄糖苷酶的条件下，定义的寡糖(BPNPG7)成为葡萄糖和游离对硝基苯的水解。测量400nm的吸光度，其与所分析样品中的活性淀粉酶水平直接相关。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂和溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖苷(maltoheptaoside)(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；和

3)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)。

将一瓶含有54.5mg BPNPG7底物溶解在10ml的milliQ水中。在MOPS缓冲液中稀释淀粉酶样品(发酵上清液)。通过在MTP的孔中添加25μl稀释的淀粉酶溶液，之后添加25μl5.45mg/ml BPNPG7底物溶液，来实施测定。混合溶液，并用平板密封器将微滴度板密封，置于孵育器/振荡器(iEMS-Thermo/Labsystems)中25℃和900rpm下30分钟。通过添加50μl STOP缓冲液终止反应，并在MTP读板器中读取400nm波长的吸光度。使用无酶对照校正背景吸光度值。

C.CS-28稻淀粉微片测定法

该α-淀粉酶测定法的原理是基于整合到微片中的稻淀粉水解产生橙色染料的释放。测量488nm的吸光度，在理想条件下(pH、温度和缓冲液)，其与所分析样品中的淀粉酶活性水平相关。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂和溶液是：

1)CS-28微片(稻淀粉，有色)；

2)25mM HEPES，2mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80缓冲液，pH8.0；

3)25mM CAPS，2mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80缓冲液，pH10.0；和

4)10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80(稀释缓冲液)。

1/4″环状直径的CS-28微片是由Testmaterials中心(CFT，Vlaardingen，The Netherlands)递送的。在96孔微滴度板的每个孔中垂直放置2个微片，暴露整个表面积(例如，不平放在孔底部)。在若干条件下测试适当浓度的淀粉酶样品(发酵上清液)，在10mMNaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80溶液中预稀释：

1)pH8(25mM HEPES缓冲液)和16℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.025μg/ml；

2)pH8(25mM HEPES缓冲液)和32℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.012μg/ml；

3)pH10(25mM CAPS缓冲液)和32℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.025μg/ml；和

4)pH10(25mM CAPS缓冲液)和50℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.012μg/ml。

将孵育箱/振荡器设置在理想的温度，16℃(冷储藏室或冰箱)、32℃或50℃。将微片放置在96孔MTP的孔中。在10mM NaCl，0.1mMCaCl₂，0.005％

80中稀释培养上清液样品20X至理想的最终浓度。向微片-MTP的每个孔加入190μl的HEPES或CAPS缓冲液，之后向每个孔加入10μl酶溶液，获得总体积为200μl/孔。用平板密封器将MTP密封，置于孵育器/振荡器中，在理想温度下(16℃、32℃或50℃)和1150rpm下60分钟。在适当条件下孵育后，从每个孔转移100μl溶液至新的MTP中，使用MTP分光光度计测量488nm的吸光度。含有2个微片和缓冲液，但不含酶的对照包括在内作为背景减去。

根据空白值(在缺少酶的条件下孵育微片后获得的)校正所获得的吸光度，所获得的吸光度是水解活性的测量。计算每个样品(变体)的性能指数(PI)。性能指数比较了相同蛋白质浓度的变体(实际值)和参照酶(理论值)的性能。使用参照酶的Langmuir等式的参数，可以计算理论值。大于1的PI(PI＞1)鉴别了更好的变体(相比参照或标准酶【例如，野生型】)，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准表现差得变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不理想的变体。

D.热稳定性测定——确定初始和剩余的活性

通过在定义的条件下的MOPS缓冲液，pH7.15中孵育淀粉酶样品，来确定淀粉酶变体相比参照淀粉酶的热稳定性。选择这样的孵育温度，使得约70％的初始参照淀粉酶活性丧失。使用Ceralpha方法确定初始和剩余的淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)10mM NaCl，10mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液(稀释缓冲液)；

3)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

4)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

5)淀粉酶培养上清液，含有50-150μg/ml蛋白质。

通过在10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液中稀释培养上清液20X，后续在MOPS缓冲液中42X稀释的步骤，来制备“主稀释”平板。从主稀释液中，使用25μl来确定初始淀粉酶活性，和100μl用于热孵育。将100μl样品置于用铝带密封的MTP(Greiner 655.101)中，并在65.5℃孵育60分钟，并在iEMS孵育箱中900rpm搅拌。孵育后，在确定剩余的淀粉酶活性之前，在冰水中冷却MTP。为了确定初始(t₀₀)和剩余的(t₆₀)活性，将25μl样品转移到含有25μl BPNPG7溶液/孔的新的MTP中，并在25℃孵育30分钟。如上述章节B所述实施Ceralpha淀粉酶测定。

如下使用剩余和初始的淀粉酶活性的比例来计算热稳定性：热稳定性＝[t_-60值]/[t_-00值]。还计算每个变体的性能指数，所述性能指数比较了变体与参照(标准)酶的热稳定性。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴别了更好的变体(相比参照或标准酶【例如，野生型或骨架】)，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准同样稳定的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准更不稳定的变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不稳定的变体。

E.热稳定性测定——确定T₅₀值

热稳定性测定如上文章节D所述，仅可以排列在给定条件下丧失活性的变体。在给定条件下100％稳定的变体则不能彼此区分。因而，确定T₅₀值是排列具有显著增加的热稳定性的变体的更合适的测定法，所述T₅₀值是丧失50％初始活性的孵育温度。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和EppendorfMastercycler。在MOPS缓冲液中将含有淀粉酶变体的培养上清液稀释1000X，如上述章节B所述使用Ceralpha淀粉酶测定来确定初始淀粉酶活性。使用稀释的淀粉酶样品，制备含有100μl/孔的PCR平板。平板在Eppendorf Mastercycler上孵育60min，温度梯度跨60℃-80℃(单位点突变体)或60℃-100℃(组合突变体)。在孵育后，在确定剩余的淀粉酶活性之前，将MTP冷却至4℃。

针对孵育温度绘制剩余和初始淀粉酶活性的比例，使用下列等式拟合数据：y＝a₀+a₁/(1+(x/a₂)^a3)。之后，计算每个淀粉酶变体的T₅₀值(例如，剩余活性为50％时的温度)。因而，T₅₀值是变体的热稳定性的测量，可以相对于参照淀粉酶和相对于彼此来排列变体。

F.10％去垢剂稳定性测定法

在存在10％去垢剂(商业去垢剂；热失活的)的定义条件下孵育后，测量参照淀粉酶及其变体的稳定性，使用Ceralpha淀粉酶测定法确定初始和剩余淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)液体去垢剂(HDL商业产品，酶失活的，95℃下2小时)；

3)在25mM HEPES缓冲液中10.5％去垢剂，pH8.0；

4)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

5)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

6)含有50-150μg/ml的蛋白质的淀粉酶培养上清液。

简而言之，将95μl的10.5％去垢剂溶液转移到微滴度板(MTP)中，并与5μl培养上清液混合。移出3μl等分试样用于确定初始的淀粉酶活性。在iEMS孵育箱中40℃下900rpm搅拌孵育MTP(或者，在具有更高稳定性的BASE组合变体的情况下为50℃)30分钟。孵育后，使用3μl去垢剂-酶混合物测量剩余的淀粉酶活性。初始(t₀)和剩余(t₃₀)的淀粉酶活性：在122μl MOPS缓冲液中稀释3μl“去垢剂-酶”混合物，之后使用上述的Ceralpha淀粉酶测定，用25μl来确定淀粉酶活性。

如下使用剩余和初始的淀粉酶活性的比例来计算“10％去垢剂”稳定性：稳定性＝[t₃₀值]/[t_-0值]。还计算每个变体的性能指数。性能指数比较了淀粉酶变体与参照淀粉酶的10％去垢剂稳定性。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴别了更稳定的变体(相比参照或标准酶【例如，野生型】)，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准同样稳定的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准更不稳定的变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不稳定的变体。

G.100％去垢剂稳定性测定法——温度梯度曲线

在存在100％去垢剂(商业去垢剂；酶失活的)的定义条件下孵育后，测量BASE骨架和BASE变体的HDL去垢剂稳定性，使用Ceralpha淀粉酶测定法确定初始和剩余淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)；EppendorfPCR Mastercycler和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)液体去垢剂(HDL商业产品，95℃下热失活2小时)；

3)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

4)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

5)含有50-150μg/ml的蛋白质的淀粉酶培养上清液。

在HDL去垢剂中20X稀释淀粉酶培养上清液，并完全混合。使用上述章节B中的Ceralpha淀粉酶测定来确定初始淀粉酶活性。使用稀释的淀粉酶-HDL样品，制备含有100μl/孔的PCR平板。平板在Eppendorf Master循环仪中以跨越30℃-70℃的温度梯度孵育30min。孵育后，在如上所述确定剩余的淀粉酶活性之前，将MTP冷却至4℃。

为了计算HDL T50值，针对孵育温度绘制剩余和初始的淀粉酶活性比例，使用下列等式拟合数据：y＝a₀+a₁/(1+(x/a₂)^a3)。之后，计算每个BASE变体的T₅₀值(例如，剩余活性为50％时的温度)。因而，T₅₀值是变体的热稳定性的测量，可以相对于参照淀粉酶和相对于彼此来排列变体。

H.AAPF蛋白酶

为了确定本公开内容的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性，测量N-琥珀酰基-L-内氨酰-L-内氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺(AAPF)的水解。使用的试剂溶液是：

1)100mM Tris/HCl，pH8.6，含有0.005％

-80(Tris稀释缓冲液)；

2)100mM Tris缓冲液，pH8.6，含有10mM CaCl2和0.005％-80(Tris/Ca缓冲液)；和

3)DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储液)(Sigma：S-7388)。

为了制备suc-AAPF-pNA工作溶液，将1ml AAPF储液添加到100ml Tris/Ca缓冲液中，充分混合至少10秒。通过向每个孔添加10μl稀释的蛋白酶溶液，之后立即添加190μl 1mg/ml AAPF-工作溶液，来实施测定。混合溶液5sec，在25℃下，MTP读板器中以动态模式(5分钟内读取20次)读取410nm的吸光度改变。蛋白酶活性表示为AU

实施例2

产生表达BASE(AmyTS23t)及其变体的枯草芽孢杆菌菌株

在该实施例中，描述了表达BASE(芽孢杆菌属物种TS-23α淀粉酶或AmyTS23t)及其变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。BASE是源自嗜碱性和嗜热性芽孢杆菌属物种菌株TS-23的TS-23α淀粉酶(AmyTS23)的截短的淀粉酶的成熟形式(Lin等人，J Appl Microbiol，82：325-334，1997)。

AmyTS23的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述：

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAKTSNVTFTVNNATTTSGQNVYVVANIPELGNWNTANAIKMNPSSYPTWKATIALPQGKAIEFKFIKKDQAGNVIWESTSNRTYTVPFSSTGSYTASWNVP.

编码AmyTS23的成熟形式的密码子修饰的核酸序列如SEQ IDNO：3所述：

aatacggcgccgatcaacgaaacgatgatgcagtattttgaatgggatctgccgaatgatggaacgctgtggacgaaagtcaaaaacgaagcggcgaatcttagcagcctgggaatcacagcactttggcttccgccggcatataaaggaacgagccaaagcgatgtcggctatggcgtctatgatctgtatgacctgggcgaatttaaccaaaaaggcacgatccggacgaaatatggcacgaaaacacagtatatccaagcgatccaggcagcaaaagcagcaggcatgcaagtctatgccgacgtcgtctttaatcataaagcgggagcggatggcacagaatttgtcgatgccgtcgaagttgatccgagcaacagaaaccaagaaacgagcggcacgtatcaaatccaagcgtggacgaaatttgattttccgggcagaggcaatacgtatagcagctttaaatggcgctggtatcattttgacggcacggattgggatgaaagcagaaaactgaaccggatctataaatttcggagcacgggcaaagcatgggattgggaagtcgatacggaaaacggcaactatgactatctgatgtttgccgatctggatatggatcatccggaagtcgtcacggaactgaaaaattggggcacgtggtatgttaatacgacgaacatcgatggctttagactggatgccgtcaaacatatcaaatatagcttttttccggactggctgacgtatgtcagaaaccagacgggcaaaaacctttttgccgtcggcgaattttggagctatgacgtcaacaaacttcataactatatcacgaaaacgaacggcagcatgagcctttttgatgccccgcttcataacaacttttatacggcgagcaaaagctcaggctattttgatatgagatatctgctgaacaacacgctgatgaaagatcaaccgagcctggcagtcacactggtcgataaccatgatacacaaccgggccaaagccttcaaagctgggtcgaaccgtggtttaaaccgctggcgtatgcctttatcctgacgagacaagaagggtatccttgcgtcttttatggcgactattatggcatcccgaaatataatatcccgggcctgaaaagcaaaatcgatccgctgctgatcgccagacgggattatgcctatggcacacagcgggattatatcgaccatcaggacatcatcggctggacaagagaaggcatcgatacgaaaccgaatagcggactggcagcactgattacagatggaccgggcggaagcaaatggatgtatgtcggcaaaaaacatgccggcaaagtcttttatgatctgacgggcaacagaagcgatacggtcacgatcaatgctgatggctggggagaatttaaagtcaatggcggcagcgtttcaatctgggtcgccaaaacgagcaatgtcacgtttacggtcaacaatgccacgacaacgagcggccaaaatgtctatgtcgtcgccaatatcccggaactgggcaattggaatacggcgaacgcaatcaaaatgaacccgagcagctatccgacatggaaagcgacaatcgctctgccgcaaggaaaagcgatcgaatttaaatttatcaaaaaagaccaggcgggcaatgttatttgggaaagcacgagcaatagaacgtatacggtcccgtttagcagcacaggaagctatacagcgagctggaatgttccgtga.

通过删除编码信号肽的前90bp的5’序列区和编码酶的羧基端的297bp的3’序列产生BASE，产生截短的α淀粉酶。成熟形式的BASE(AmyTS23t)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述：

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGSVSIWVAK.

通过GENEART生产合成的DNA片段(0723013)，其含有用于在枯草芽孢杆菌中表达的密码子修饰的BASE基因，将所述DNA片段作为模板DNA(SEQ ID NO：4)用于构建枯草芽孢杆菌菌株，其表达BASE及其变体。为了表达BASE，使用唯一的PstI和HpaI限制性位点，通过GENEART将BASE DNA片段克隆到pHPLT载体(Solingen等人，Extremophiles 5：333-341，2001)中。pHPLT表达载体含有地衣芽胞杆菌LAT启动子(Plat)和pUB110的其他元件(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)，所述其他元件包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标志物(bleo)。

LAT信号肽的编码区如SEQ ID NO：15所述：atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca.

LAT信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所述：MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA.

图2显示了pHPLT表达载体的图谱，而图3显示了含有BASE基因的pHPLT载体的图谱。由GENEART生产的、编码成熟形式的BASE(AmyTS23t)的密码子修饰的核酸序列如SEQ ID NO：4所述，具有以粗体显示的N001N-末端密码子和K484C-末端密码子：

1 tctgcagct tcagcaaac accgcgccg attaacgaa accatgatg cagtatttcgaatgggat ctgccgaac

73 gatggcacc ctgtggacc aaagtgaaa aacgaagcg gcgaacctg agcagcctgggcattacc gcgctgtgg

145 ctgccgccg gcatataaa ggcaccagc cagagcgat gtgggctat ggcgtgtatgatctgtac gatctgggc

217 gaatttaac cagaaaggc accattcgt accaaatat ggcaccaaa acccagtatattcaggcg atccaggcg

289 gcgaaagcg gcgggtatg caggtgtat gcggatgtg gtgtttaac cataaagcgggtgcggat ggcaccgaa

361 tttgtggat gcggtggaa gtggatccg agcaaccgt aaccaggaa accagcggcacctatcag attcaggcg

433 tggaccaaa tttgatttt cccggccgt ggcaacacc tatagcagc tttaaatggcgctggtat cattttgat

505 ggcaccgat tgggatgaa agccgtaaa ctgaaccgc atctataaa tttcgtagcaccggcaaa gcgtgggat

577 tgggaagtg gataccgaa aacggcaac tatgattac ctgatgttc gcagacctggatatggat catccggaa

649 gtggtgacc gaactgaaa aactggggc acctggtat gtgaacacc accaacattgatggcttt cgtctggat

721 gcggtgaaa cacatcaaa tacagcttt tttccggat tggctgacc tatgtgcgtaaccagacc ggcaaaaac

793 ctgtttgcg gtgggcgaa ttttggagc tatgatgtg aacaaactg cacaactacatcaccaaa accaacggc

865 agcatgagc ctgtttgat gcgccgctg cataacaac ttttatacc gcgagcaaaagcagcggc tattttgat

937 atgcgttat ctgctgaac aacaccctg atgaaagat cagccgagc ctggccgtgaccctggtg gataaccat

1009 gatacccag ccgggccag agcctgcaa agctgggtg gaaccgtgg tttaaaccgctggcctac gcgtttatt

1081 ctgacccgt caagagggc tatccgtgc gttttttat ggcgattat tacggcatcccgaaatat aacattccg

1153 ggcctgaaa agcaaaatt gatccgctg ctgattgcg cgtcgtgat tatgcgtatggcacccag cgtgattat

1225 attgatcac caggatatt attggctgg acccgtgaa ggcattgat accaaaccgaacagcggc ctggccgcg

1297 ctgattacc gatggcccg ggtggcagc aaatggatg tatgtgggc aaaaaacatgcgggcaaa gtgttttat

1369 gatctgacc ggcaaccgt agcgatacc gtgaccatt aacgcggat ggctggggtgagtttaaa gtgaacggc

1441 ggcagcgtg agcatttgg gtggcgaaa taagttaac aga.

GENEART使用pHPLT-BASE载体DNA转化枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr)和(degU^Hy32，oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC)。如本领域已知的实施枯草芽孢杆菌的转化(WO02/14490)。在含有心浸液琼脂(Difco，货号244400)和10mg/L新霉素硫酸酯(Sigma，货号N-1876，含有732μg新霉素/mg)的琼脂平板上，选择枯草芽孢杆菌转化子。在含有MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)、5mM CaCl₂和10mg/L新霉素的摇瓶中实施具有pHPLT-BASE GENEART载体的枯草芽孢杆菌转化子的选择性生长。除了从基础培养基中排除NH₄Cl₂，FeSO₄和CaCl₂以外，基本按本领域已知的制备MBD培养基(Neidhardt等人，J Bacteriol，119：736-747，1974)，使用3mMK₂HPO₄，并且在基础培养基中补充60mM尿素，75g/L葡萄糖，和1％Soytone。将微量营养素制备成100X储液，在1升中包含：400mgFeSO₄7H₂O、100mg MnSO₄.H₂O、100mg ZnSO₄7H₂O、50mg CuCl₂2H₂O、100mg CoCl₂ 6H₂O、100mg NaMoO₄ 2H₂O、100mg Na₂B₄O₇10H₂O、10ml的1M CaCl₂和10ml的0.5M柠檬酸钠。生长导致产生具有淀粉水解活性的分泌型BASE淀粉酶。

实施例3

产生BASE(AmyTS23t)位点评估文库

由GENEART使用专利方法(WO2004/059556A3)实施位点评估文库(SEL)的生产。出于表达蛋白质的目的，通过PCR优化核苷酸序列的方法和装置，以及DNA分子的生产利用了属于或得到GENEART许可的技术(欧洲专利号0200362和0201184以及美国专利号4,683,195，4,683,202和6,472,184)。利用基于专利性GENEART技术诀窍和/或知识产权的基因优化、基因合成和文库产生的技术平台，通过GENEART实施构建该实施例描述的BASE SEL。GENEART生产SEL的序列变换方法一般性的描述在公司的网站上。

将pHPLT-BASE质粒DNA用作模板生产SEL。在发明人预先选择的(表3-1)位置由GENEART生产BASE SEL。用至少16种(在可能的19种中)不同的氨基酸密码子分别取代相应的DNA密码子。如本领域已知的(WO2002/014490)，使用密码子诱变的pHPLT-BASE混合物转化感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])，产生BASE SEL。将转化混合物涂板在含有10mg/L新霉素硫酸酯的HI琼脂平板(心浸液琼脂)上。对于每个文库，挑取单个菌落，并在含10mg/L新霉素选择的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，进行后续的DNA分离和基因序列分析。序列分析数据揭示每个文库最多19个BASE成熟变体。表3-2中列举了在BASESEL中鉴别的BASE变体。为了产生供生物化学表征的BASE和BASE变体酶样品，在96孔MTP中实施BASE SEL变体的选择性生长，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例4

产生BASE(AmyTS23t)组合文库

合成的BASE组合文库含有合成的BASE基因的混合物，其中特定的DNA序列替代了成熟序列中的两个或多个选定的密码子。在与Genencor的合约下，GENEART生产了4个合成的BASE组合文库，使用GENEART的专利性GENEART技术诀窍和/或知识产权的基因优化、基因合成和文库产生的技术平台。GENEART生产组合文库的先进诱变方法一般性的描述在公司的网站上。

表4-1至4-4列举了合成性BASE组合文库的成员中可能存在的取代(根据SEQ ID NO：2的BASE成熟氨基酸序列编号)。在每个文库中，靶向的BASE位置具有相等的机会仍然保留野生型(wt)或被表4-1至4-4列举的特定氨基酸取代。通过克隆pHPLT载体中的诱变BASE基因，产生pHPLT-BASE质粒DNA的变体，之后转化枯草芽孢杆菌细胞，来生产BASE组合文库。转化混合物置于含有10mg/L新霉素硫酸酯和0.5％RBB-淀粉(Sigma-Aldrich货号S7629，与Remazol Brilliant Blue R共价连接的土豆淀粉)的HI琼脂平板(心浸液琼脂)上。对于每个文库，挑取产生清晰区域的单菌落，并在含有10mg/mL新霉素的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长。为了产生供生物化学表征的BASE组合变体酶样品，在96孔MTP中实施BASE组合文库成员的选择性生长，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例5

产生BASE组合变体

在该实施例中，描述了构建表达BASE组合变体的枯草芽孢杆菌菌株。为了表达BASE组合变体，将BASE变体DNA片段克隆到pHPLT载体中，使用唯一的PstI和HindIII限制性位点，之后导入到枯草芽孢杆菌菌株中。如下所述构建BASE DNA变体片段。对于表5-1(S1至S32)列举的每个BASE组合变体，使用表5-2和表5-3列举的引物实施PCR反应。

对于下文描述的PCR反应，使用终浓度为0.2μM DNA引物和0.1-10ng质粒DNA模板。表5-2列举了用于构建每个变体的特定pDNA模板和引物对。此外，所有的PCR反应都在50μL的体积中完成，使用Finnzymes(Finnzymes OY，Espoo，Finland)Phusion高保真DNA聚合酶(货号F-530L)。所有的PCR反应混合物含有10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，总体积为50μL。使用MJ Research PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)如下运行PCR程序：98℃，30秒，25X(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下25秒)和最后72℃下5min。

对于BASE组合变体S1至S16，通过第三次PCR将PCR1和2产生的扩增DNA片段融合。将0.5μL等分的PCR1和PCR2扩增DNA片段添加到含有引物PstI-FW和HindIII-RV的第三次反应混合物中。纯化扩增的线性1.5kb DNA片段(

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用PstI和HindIII限制性酶消化。之后，纯化(

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)BASE组合变体DNA片段S1至S16和pHPLT pDNA(用PstI和HindIII限制性酶消化的50ng/μL)，并连接。反应条件如下：4μL纯化的、PstI和HpaI消化的BASE变体片段，2μL纯化的、PstI和HindIII消化的pHPLT DNA片段，8μL T4DNA连接酶缓冲液(

货号46300-018)，25μL去离子化高压蒸汽灭菌水，和1μL T4DNA连接酶，1单位/μL(

货号15224-017)。在20℃实施连接反应16-20小时。

为了将连接反应混合物直接转化到枯草芽孢杆菌细胞中，使用TempliPhi试剂盒(Amersham货号25-6400)扩增连接的pHPLT-BASE变体DNA。出于该目的，将1μL连接反应混合物与TempliPhi试剂盒的5μL样品缓冲液混合，在95℃加热3分钟，变性DNA。将反应混合物置于冰上冷却2分钟，然后简单离心。然后，加入5μL反应缓冲液和0.2μL TempliPhi试剂盒的phi29聚合酶，在MJ Research PCR机器中30℃孵育反应4小时。在65℃下孵育，热失活phi29酶10min。

为了将BASE变体导入到枯草芽孢杆菌中，将0.1μL TempliPhi扩增反应产物与500μL感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))混合，之后在37℃剧烈振荡1小时，将100μL和500μL置于含有10mg/L新霉素硫酸酯和0.5％RBB-淀粉的心浸液琼脂(Difco货号244400)上。对于每个变体，挑取产生清晰区域的单菌落，并在含有10mg/L新霉素选择的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，用于后续的质粒DNA分离和基因序列分析。通过序列分析确定BASE组合变体的身份。如本文所述，用pHPLT-BASE S1至S16质粒DNA作为模板DNA，构建BASE组合变体S17至S32。为了产生供生物化学表征的BASE组合变体酶样品，在96孔MTP中生长BASE组合变体，在MBD培养基中37℃下68小时。

＊-标记＝野生型残基

*M＝DNA A或C；Y＝DNA C或T；R＝DNA G或A；和K＝DNA G或T.

通过使用BASE组合变体P1至P12，构建BASE组合变体W1至W13。从实施例4描述的BASE组合文库1-4中选择表5-4的P1-P12变体。对于表5-5中列举的每个BASE组合变体(W1至W32)，使用表5-6列举的引物实施PCR反应。所有的PCR反应条件都与上述用于产生BASE组合变体S1至S32的规程相似。

＊BASE性能变体号在括号中显示。BASE P1-P12变体在位置Y160、T214、Q407和T149具有野生型残基。

构建BASE组合变体W1至W13的PCR示意图显示在表5-7和5-8中。变体生产始于5个PCR反应(系列A至E)，并持续2个融合PCR反应(系列F和G)。使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒(货号28106)纯化所有的PCR片段。如构建变体S1至S32所述，用PstI和HindIII消化PCR G1至G13的融合DNA片段，并连接至PstI和HindIII消化的pHPLT载体DNA中。之后，将phi29聚合酶扩增的连接混合物导入枯草芽孢杆菌中。对于每个变体，挑取产生清晰区域的单个菌落，并在含有10mg/L新霉素的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，进行后续的质粒DNA分离和基因序列分析。通过序列分析确定BASE组合变体的身份。为了产生供生物化学表征的组合变体W1至W13的酶样品，在96孔MTP中选择性生长BASE组合变体，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例6

产生ACE(AmyTS23tΔRS)位点评估文库

在该实施例中，描述了构建表达BASE变体：BASE-ΔR180-ΔS181(也称为AmyTS23tΔRS或ACE)；和BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q(也称为AmyTS23tΔRS-S243Q，即ACE-S243Q或ACE-Q)的枯草芽孢杆菌菌株。此外，描述了产生ACE-Q位点评估文库(SEL)。

含有DNA密码子修饰的BASE基因的合成DNA片段056426(Geneart，Regensburg，Germany生产)作为模板DNA。使用唯一的PstI和HpaI限制性位点，将该BASE DNA片段克隆到pHPLT载体中(Solingen等人，Extremophiles，5：333-341，2001)。pHPLT表达载体含有地衣芽胞杆菌LAT启动子(Plat)，后接用于克隆BASE的PstI和HpaI限制性位点，和来自pUB110的其他元件(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)，包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标志物(bleo)。图3显示了pHPLT-BASE质粒的图谱。使用pHPLT-BASE作为模板DNA和表6-1列举的DNA引物，产生含密码子180(CGG)和181(AGC)删涂的BASE DNA(BASE-ΔR180-ΔS181，也称为ACE)。由Sigma(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，The Netherlands)合成和脱盐DNA引物。

使用pHPLT-BASE模板DNA，使用引物对TS-delRS-FW/pHPLT-HpaI-RV和TS-delRS-RV/pHPLT-PstI-FW，实施两次PCR反应。为了融合2次PCR产生的片段，将1μl来自2次反应的未纯化的PCR混合物加入到第三次PCR反应中，其中加入了引物pHPLT-PstI-FW和pHPLT-HpaI-RV。纯化扩增的线性1.5kbDNA片段(使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用PstI和HpaI限制性酶消化。

对于所有所述的PCR反应，使用终浓度为0.2μM DNA引物，和0.1-10ng的DNA模板。此外，所有的PCR反应都在50μL的体积中完成，使用Finnzymes(Finnzymes OY，Espoo，Finland)Phusion高保真DNA聚合酶(货号F-530L)。所有的PCR反应混合物还含有10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，产生的最终体积为50μL。使用MJResearch PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)如Finnzymes所述实施PCR程序(98℃，30秒；30X(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下22秒/kb)和最后步骤72℃下5min)。

之后，纯化(使用Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)BASE-ΔR180-ΔS181DNA片段和pHPLT质粒DNA(50ng/μL，用PstI和HpaI限制性酶消化)，然后使用下列反应条件在PstI和HpaI末端连接：4μL纯化的、PstI和HpaI消化的BASE-ΔR180-ΔS181DNA片段，2μL纯化的、PstI和HpaI消化的pHPLT DNA片段，8μL T4DNA连接酶缓冲液(

货号46300-018)，25μL去离子化高压蒸汽灭菌水，和1μL T4DNA连接酶，1单位/μL(货号15224-017)。在20℃实施连接反应16-20小时。

如WO02/014490所述，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr)和(degUHy32，oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，(Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB))中，通过引用细菌转化教导整合到本文中。在含有10mg/L新霉素和心浸液琼脂(Difco，货号244400)的琼脂平板上选择枯草芽孢杆菌转化子。在含有25ml MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)和10mg/L新霉素的摇瓶中实施具有pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181质粒的枯草芽孢杆菌转化子的选择性生长。这导致产生具有淀粉水解活性的分泌型BASE-ΔR180-ΔS181淀粉酶。pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181质粒在本文中也称为pHPLT-ACE。

为了产生表达BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株，使用相似的规程。使用引物ACE-S243Q-FW和pHPLT-HpaI-RV、引物ACE-S243Q-RV和pHPLT-PstI-FW，pHPLT-ACE模板DNA，来实施前2次PCR反应。引物序列列举在表6-1中。具有pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q的枯草芽孢杆菌转化子生产和分泌BASEΔR180-ΔS181-S234Q淀粉酶，具有淀粉水解活性。图4中显示了pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q质粒的图谱，也称为pHPLT-ACE-S243Q。

pHPLT-ACE-S243Q质粒DNA作为生产位点评估文库(SEL)的模板。根据成熟的BASE氨基酸序列(SEQ ID NO：2)编号选择针对ACE-Q SEL的氨基酸位置，包括：R127，Y305，Q320，P379，T419，L453和G475。用编码最多20个不同氨基酸的突变密码子分别替代相应的DNA密码子。该pHPLT-ACE-S243Q质粒含有唯一的BglII限制性位点，所述位点在SEL构建的过程中被利用。用于产生文库的引物序列(商业合成和脱盐)列举在表6-2中。

为了构建ACE-Q SEL，实施3次反应：2次诱变反应在ACE-QDNA序列中导入诱变的目标密码子，第三次反应将2条PCR片段融合。诱变方法基于密码子特异性突变方法。在该方法中，使用编码特定设计的三体DNA序列NNS((A，C，T或G)，(A，C，T或G)，(C或G))的正向和反向寡核苷酸引物，实现在特定的DNA三体中产生所有可能的突变，所述三体DNA序列与待突变的密码子序列对应，并保证在目标密码子处随机掺入核苷酸。表6-2的引物名中列举的编号对应于特定的ACE-Q密码子位置(基于成熟的BASE氨基酸序列的编号)。用于构建SEL的两条额外寡核苷酸引物编码唯一的BglII限制性位点，和位于BglII限制性位点两侧的pHPLT DNA序列。

用2个初级扩增反应开始构建每个SEL：第一PCR使用pHPLT-BglII-FW引物和特定的ACE-Q反向诱变引物；第二PCR使用pHPLT-BglII-RV引物和特定的ACE-Q正向诱变引物。使用Finnzymes Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，Finland)(货号F-530L)实施在成熟ACE-Q序列中导入突变。根据生产商提供的规程实施所有的反应。初级反应的PCR条件如下。对于初级PCR 1：pHPLT-BglII-FW引物和特定的ACE-Q反向诱变引物——均为1μL(10μM)，0.1-10ng的DNA模板(pHPLT-ACE-S243Q)，10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，至最终体积为50μL。对于初级PCR 2：pHPLT-BglII-RV引物和特定的ACE-Q正向诱变引物——均为1μL(10μM)，0.1-10ng的DNA模板(pHPLT-ACE-S243Q)，10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，至最终体积为50μL。

使用PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)和下列程序：98℃，30秒；30X循环(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下，1分钟)和72℃下5min。对于每步SEL初级扩增反应，产生2条约2-3kb的DNA片段，其在目标的ACE-Q密码子周围具有约30个核苷酸重叠。为了融合两条DNA片段，将1μL来自2次反应的未纯化的PCR混合物加入到第三次扩增PCR反应中，其中加入了引物pHPLT-BglII-FW和pHPLT-BglII-RV。纯化扩增的线性5.2kbDNA片段(使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用BglII限制性酶消化，在融合片段的两侧产生粘性末端。将含有35μL纯化的线性DNA片段，4μL

3缓冲液(Invitrogen，Paisley PA49RF，UK)和1μL BglII，10单位/ml(Invitrogen，PaisleyPA49RF，UK)的限制性消化物在30℃孵育1小时。

为了产生ACE-Q SEL，如WO02/014490所述，使用密码子诱变的pHPLT-ACE-S243Q连接混合物转化感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])。将转化混合物涂板在含有10mg/mL新霉素硫酸酯(Sigma，货号N-1876；含有732μg新霉素/mg)的HI琼脂平板(心浸液琼脂)上。对于每个文库，挑取单个菌落，并在10mg/mL新霉素选择下基于胰蛋白胨和大豆的培养液的液体培养基中生长，用于进行后续的质粒DNA分离和ACE-Q基因变体的DNA序列分析。由BaseClear B.V.(Leiden，The Netherlands)实施DNA序列分析。序列分析数据揭示每个文库最多18个ACE-Q变体。表6-3中列举了在7个ACE-Q SEL中鉴别的所有ACE-Q变体。为了产生供生物化学表征的ACE-Q变体酶样品，在96孔MTP中进行ACE-QSEL成员的选择性生长，在MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)中37℃下68小时。

实施例7

BASE变体的性能指数值

在该实施例中，描述了确定BASE及其变体的清洁性能(在pH10/32℃、pH10/50℃、pH8/16℃和pH8/32℃的CS-28微片测定法)、去垢剂稳定性、热稳定性、BPNPG7淀粉酶活性和HPLC蛋白质浓度(目标特性的测试)的实验结果。结果是使用实施例1的方法获得的。如全文所述，BASE变体的功能性定量为性能指数(PI)，是变体与亲本蛋白质的性能比例。表10-1显示了针对测试的特性的多种BASE变体的PI值。指出了在多个氨基酸位置导入的突变。将小于或等于0.05的性能指数固定为0.05。对于每种HPLC蛋白质PI小于或等于0.05的变体，所有的值固定为0.05。此外，对于两种稳定性测量，如果稳定性测定中的初始活性的PI小于或等于0.05，则将相关的稳定性PI固定为0.05。表7-1提供了具有可组合突变的BASE变体的性能指数，其在本文中定义为这样的突变，所述突变在变体中对于至少一种特性的PI值≥0.5，且对于所有的特性PI值＞0.05。

出现在表3-2中、但在表7-1中缺失的BASE SEL成员的其他821种突变，较不适合包括在亲本α淀粉酶的组合变体中。同样的，位于与所述821种非可组合突变相同的对应于SEQ ID NO：2的位置上的天然存在的α淀粉酶的残基也被认为存在于性能低下的天然存在的α淀粉酶中，因而是诱变的候选对象。由此，本公开内容提供了用于生产具有理想的特性组合的变体α淀粉酶的详细方案。

实施例8

α淀粉酶中的限制性和非限制性位置

描述了确定BASE及其变体的洗涤性能(在pH10/32℃、pH10/50℃、pH8/16℃和pH8/32℃的CS-28微片测定法)、去垢剂稳定性、热稳定性、BPNPG7淀粉酶活性和HPLC蛋白质浓度(目标特性的测试)的实验结果。结果是使用实施例1的方法获得的。如全文所述，BASE变体的功能性定量为性能指数(PI)，是变体与亲本或参照淀粉酶的性能比例。下述各种术语用于描述所述突变：上升突变具有PI＞1；中性突变具有PI＞0.5；无害突变具有PI＞0.05；有害突变具有PI≤0.05；可组合突变是所述突变使变体具有对于至少一种特性的PI≥0.5，且对于所有特性＞0.05。可组合突变是可以组合使蛋白质对一种或多种理想特征产生恰当PI的突变。

突变发生的位置如下分类：非限制性位置对至少一种特征具有≥20％的中性突变；限制性位置对于活性和稳定性具有＜20％的中性突变。表8-1显示了限制性位置，其中检测到关于活性和稳定性的少于20％的中性突变(PI＞0.5)。表8-2显示了非限制性位置，其中检测到关于至少一种测试特性≥20％的中性突变(PI＞0.5)。％＝满足中性突变定义的所评估变体的百分比。

一般而言，不应该突变限制性位置，因为对于任何特征，在这些位置上都仅有极少数取代是中性的。当必须改变这类位置时，它们要求氨基酸取代是保守性取代。例如，在58位的2种突变是可组合的，即A58G和A58T，而且236位的2种突变是可组合的，即Y236F和Y236W。非限制性位置是最合适用于构建组合文库的位置，因为它们具有大量的可组合突变。因为同源蛋白质共享相同的结构，因此，限制性位置在所有的同源淀粉酶中都是限制性的，因其对于蛋白质的结构和/或功能是重要的。如本公开内容所示，只有通过测试可能的氨基酸突变和测量一种所述蛋白质(例如，α淀粉酶)的特性，才可以鉴别出限制性位置。应注意，两个限制性位点在图1的序列比对中是保守的，但保守本身并非位置是否是限制性的指标。例如，Q71、K72和G73在序列比对中都是保守的，但所有三个位置都具有一些比亲本的活性、稳定性或两者更好的突变。对每种特性具有大于20％中性突变的非限制性位置一般是组合突变的非常好的选择。在α淀粉酶中，198个测试位置中有115个位置满足该标准。

实施例9

ACE-Q淀粉酶变体的去垢剂稳定性

在存在10％去垢剂(商业去垢剂；失活的)的定义条件下，70℃孵育后，测量ACE-Q(ACE-S243Q)淀粉酶变体的去垢剂稳定性，如实施例1所述，使用Ceralpha方法(BPNPG7)确定初始和剩余淀粉酶活性。氨基酸残基的编号对应于BASE α淀粉酶的编号。下表9-1的结果显示为每种变体相对于ACE α淀粉酶的ACE性能指数(PI)。

表9-1PI≥0.5的ACE-Q变体的去垢剂稳定性

所示变体是SEL数据鉴别出得可组合突变。只显示了PI≥0.5的变体。可以组合这些突变产生稳定性和活性的理想组合。

实施例10

ACE-Q变体的清洁性能

如实施例1所述，在pH8/16℃、pH8/32℃、pH10/32℃和pH10/50℃这四种不同的条件下，使用CS28微片测量ACE-Q(ACE-S243Q)淀粉酶变体的洗涤性能。氨基酸残基的编号对应于BASE α淀粉酶的编号。下表10-1至10-4中的结果显示为每种变体相对于ACE α淀粉酶的性能指数(PI)。

表10-1PI≥0.5的ACE-Q变体(118)，针对CS-28，pH8，16℃洗涤性能

表10-2PI≥0.5的ACE-Q变体(118)，针对CS-28，pH8，32℃洗涤性能

表10-3PI≥0.5的ACE-Q变体(87)，针对CS-28，pH10，32℃洗涤性能

表10-4PI≥0.5的ACE-Q变体(73)，针对CS-28，pH10，50℃洗涤性能

实施例11

BASE单突变变体的热稳定性

从SEL筛选中选择了BASE的23个单突变变体在热失活的100％Persil(Henkel)HDL中进行精确的T_50％确定。商业去垢剂的热失活发挥破坏任何酶组分的活性的作用，同时保留非酶组分的特性。选择基于热稳定性和10％Persil HDL稳定性测定中改善的性能指数，如SEL筛选中实施的。表11-1中列举了在100％Persil HDL中具有其各自的T_50％值的选定的变体。

实施例12

BASE组合变体的热稳定性

如实施例5所述，选择BASE参照淀粉酶的5个位置(N128C，K178L，T182G，A185D和S243Q)来构建组合文库。在该组合文库的32个可能的变体中(命名为BASE-S1至BASE-S32)，在热失活的Persil HDL中测定30个变体的稳定性。表12-1列举了这些变体、其各自的突变和在Persil HDL中测量的T_50％，相比野生型BASE(参照淀粉酶)、ACE和ACE-S243Q淀粉酶变体。

结果显示，ACE和ACE-S243Q相比WT BASE具有显著增加的热稳定性。此外，若干组合变体也表现出显著增加的热稳定性，6个变体(BASE-S26，BASE-S20，BASE-S31，BASE-S12，BASE-S27，BASE-S28)表现出超过50％的稳定性增加。

实施例13

BASE组合变体的清洁性能和热稳定性

如实施例5所述，构建13个组合的BASE变体，掺入了性能增强突变和稳定性增强突变。测定α淀粉酶变体BASE-W1至BASE-W13在两种不同条件(pH8，16℃和pH8，32℃)下在CS28微片的清洁性能(PI或性能指数)，和在MOPS缓冲液和100％PersilHDL中的热稳定性(T_50％)，如表13-1中显示。

＊BASE-W10变体还包含F202Y取代。

结果显示，若干组合变体相比WT BASE表现出显著增加的清洁性能和去垢剂稳定性。3种变体，BASE-W9，BASE-W10和BASE-W11，在低温清洁中表现出3倍以上的改善，与此同时表现出1.75倍以上的改善的去垢剂稳定性。

实施例14

BASE变体W9、W10、W11和ACE-QK的清洁性能

在洗衣去垢剂应用中测试BASE变体W9、W10和W11，和ACE-QK的洗涤性能。在launder-o-meter实验中，使用购自当地超市的热失活的Ariel去垢剂(Proctor and Gamble)，在棉花上对CFTCS-28稻淀粉(Center for Testmaterials BV，Vlaardingen，Netherlands)和在棉花上对EMPA161淀粉(Test materials AG，St.Gallen，Switzerland)测量污渍去除。在Brother Hi-Speed微波炉中，90℃至100℃失活Ariel去垢剂8分钟。允许去垢剂冷却至低于50℃，然后在微波炉中再次加热7min。重复该步骤1次。

在处理之前和之后，使用Tristimulus Minolta Meter CR-400光学反射测量EMPA片。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，并与未洗涤污垢(洗涤前)与未污染织品的差异相比，按百分比污渍去除指数(％SRI)表示污渍的清洁。

在launder-o-meter中30℃进行洗涤处理。洗涤时间是45分钟(15分钟达到30℃，然后在30℃下30分钟)，用冷自来水漂洗5分钟时间。将水硬度调节至8.5°GH，并使用4.5ml/L热失活Ariel。污垢负载由ea.EMPA 161和2CFT CS-28片/烧杯+6颗钢球组成。在洗涤处理后，离心干燥所有的片，再空气干燥，并如上所述读取光学反射率。对照包括基准的商业酶。图5显示了所述结果。

一般而言，BASE变体存在的量是相比对照从约0.05至约0.5PPM改善的性能，BASE变体的相对性能遵循模式W10＞W11＞W9＞ACE-Q。

实施例15

BASE变体X8C、W10EK和ACE-QK的清洁性能

使用Terg-o-tometer，在洗衣去垢剂应用中测试其他BASE变体BASE-X8C(即W11-T131I-T165I)、BASE-W10EK(即，BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)和ACE-S243Q-G475K(即，ACE-QK)的洗涤性能。在16℃进行性能评估。污垢负载由下述组成：2ea.CS-28稻淀粉(Center forTestmaterials BV，Vlaardingen，Netherlands)、2ea.AS-10色素油乳(CFT of Holland)、2ea.EMPA 161玉米淀粉、2ea.EMPA 160巧克力奶油和2ea.EMPA 163粥(EMPA Testmaterials AG，St.Gallen，Switzerland)片/Terg-o-tometer的烧杯，烧杯填充了1L的DI水。水硬度调节为6格令/加仑，使用1.0ml/L热失活的Great Value(Walmart)去垢剂。洗涤时间为15分钟。在洗涤处理后，离心干燥所有的片，再空气干燥。

在处理之前和之后，使用Minolta Reflectometer Chroma MeterModel CR-410(Konica Minolta)测量每个污渍的光学反射率，设定为D65(6500°K)标准照明。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，按污渍去除指数(SRI)表示污渍的清洁。图6中显示了EMPA160片的清洁结果。所有的测试BASE变体相比对照都表现出有效的清洁。

实施例16

BASE变体和枯草杆菌蛋白酶之间的洗涤应用协同作用

在完整规模的洗衣应用中，对巧克力奶油玷污的EMPA 160和粥玷污的EMPA 163片测量BASE和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L；BPN′Swissprot登录号P00782)之间对污渍去除的协同作用。在缓冲的5mM HEPES(Sigma，H4034)pH8.0和热失活的

2X冷水型去垢剂(Proctor&Gamble，Cincinnati，Ohio)中测试EMPA 160和EMPA 163片的污渍去除。商业去垢剂的热失活发挥破坏酶组分的活性同时保留非酶组分的特性的作用。通过将预称重的液体去垢剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴2小时来实施热失活。去垢剂购自当地超市。未加热和加热的去垢剂都在去垢剂溶解的5分钟内进行测定，以精确的确定无效的百分比。通过AAPF和Ceralpha测定法测试酶活性。

使用Minolta Reflectometer CR-410在处理前后测量EMPA片的光学反射率，设定为D65(6500°K)标准照明。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，并与未洗涤污垢(洗涤前)与未污染织品的差异相比，按百分比污渍去除指数(％SRI)表示污渍的清洁。在Kenmore洗衣机中进行44L洗涤处理。使用“冷水自动温度(ColdAuto Temperature)”设定装填洗衣机，并使用15,000gpg 3∶1Ca∶Mg水硬度储液将水硬度调节至6gpg。加入

冷水失活的去垢剂(43.12g)，并将温度调节至32℃。加入枯草杆菌蛋白酶至终浓度0.6ppm，加入ACE淀粉酶至终浓度0.1ppm。每种洗涤条件使用4片，并加入漂白的棉花双面针织布作为压载物，提供40g/L总织品负载。洗涤条件如下：含二次漂洗(3min)的正常循环(15.5min)，洗涤/漂洗温度为89.6°F/32℃，快速搅拌和快速甩干。在洗涤后，在低热下机器干燥所述片，并如上所述读取光学反射率。

如图7A所示，ACE α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中产生协同的清洁效应。用ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α淀粉酶和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L变体)进行相似的洗衣应用协同测试。如图7B所示，ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中产生协同的清洁效应，提示BASE变体和蛋白酶可以在洗衣应用中组合用于更优异的清洁。

实施例17

BASE变体和枯草杆菌蛋白酶的剂量效应

使用Terg-o-tometer产生选定浓度的ACE-S243Q和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L；BPN′Swissprot登录号P00782)的剂量效应曲线。在20℃和40℃都进行性能评估。通常，将2ea片的CS-28稻淀粉(Center for Testmaterials BV，Vlaardingen，Netherlands)、AS-10色素油乳(CFT of Holland)、EMPA 161玉米淀粉、EMPA 160巧克力奶油，和EMPA 163粥(EMPATestmaterials AG，St.Gallen，Switzerland)置于Terg-o-tometer的不锈钢容器中，所述容器中装有1L的DI水和1.0g商业

(SunProducts，购自美国)洗衣去垢剂或4.5g OMO^TM(Unilever，购自丹麦)洗衣去垢剂。同时运行两个重复。除非另外指出，所述测试进行12分钟，并漂洗片3分钟。在洗涤后，将片空气干燥。

在处理之前和之后，使用Minolta Reflectometer Chroma MeterModel CR-410(Konica Minolta)测量每个污渍的光学反射率，设定为D65(6500°K)标准照明。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，按污渍去除指数(SRI)表示污渍的清洁。

表17-1所示结果证实，BASE变体和蛋白酶的组合对一些技术性清洁污垢产生了显著的清洁益处。这些数据证实，使用BASE变体和蛋白酶的组合获得了独一无二的清洁益处。

表17-1：ACE-S243Q与蛋白酶的清洁性能

如上所述，进一步在EMPA 160和EMPA 163片上测试其他的BASE变体(即，BASE-X8C(即，W11-T131I-T165I)、BASE W10EK(即，BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)和ACE-S243Q-G475K(即，ACE-QK))组合BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶的洗衣应用协同效应。图8(BASE-X8C)、图9(BASE W10EK)和图10(ACE-QK)显示了所述结果。这些数据证实使用BASE变体与蛋白酶组合获得独一无二的清洁益处。

本说明书中提及的所有专利和出版物是发明所属领域的技术人员的水平指标。本领域技术人员可以容易的理解，本发明很适于实施所提及的目标并获得所述结果和优势，以及其他本文内在的属性。本文描述的组合物和方法是代表优选实施方案的，是示例性的，并非意在限制本发明的范围。在不脱离发明的范围和精神的条件下，可以对本文公开的发明进行多种取代和修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。

本文说明性描述的发明可以适当地在缺少本文未具体公开的任何要素或限制的情况下实施。所使用的术语和表述用于描述而非限制，这些术语和表述的使用并不旨在排除所述特征的任何等同物或其部分，而是应该认识到，在要求保护的本发明范围内可以有多种修改。因此，应该理解，尽管通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可应用本文所公开概念的修饰和变体，这些修饰和变体均认为落入本文所定义的本发明范围之内。

本文已经宽泛并一般性地描述了发明。落入一般性公开范围内的任何较小种类和亚类也都构成发明的一部分。这包含对本发明的一般性描述，其前提或反面限制为从该类中去除任何主题，无论所去除的内容是否在本文中具体描述。

Claims (30)

1.清洁组合物，其包含：

(a)α淀粉酶，其具有与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列；和

(b)蛋白酶；

其中，组合物提供的清洁水平大于对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的水平。

2.权利要求1的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶。

3.权利要求2的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’或其变体。

4.权利要求3的清洁组合物，其中至少一种其他的酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’的Y217L变体。

5.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其还包括至少一种表面活性剂。

6.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其还包括选自脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的至少一种其他的酶。

7.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶源自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α淀粉酶。

8.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是具有淀粉酶活性的变体α淀粉酶的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、50、51、52、53、54、55、56、59、60、70、71、72、73、75、78、83、87、90、91、93、94、95、104、105、107、108、110、112、113、116、118、125、126、128、129、130、131、134、136、138、142、144、147、149、150、152、154、156、158、160、161、162、165、166、168、169、170、172、174、177、178、182、183、185、189、192、195、197、201、202、203、207、210、214、217、221、228、234、236、237、246、250、254、255、257、264、267、269、270、272、275、279、283、284、298、301、303、305、306、310、311、314、318、319、320、322、323、336、337、338、339、340、344、359、374、375、376、377、379、381、382、393、394、399、401、407、408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、470、475、476、483和484的一个或多个位置上包含取代；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且

其中所述用不同的氨基酸残基取代在一个或多个位置的天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.0，和活性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

9.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401和438的一个或多个位置包含取代，并且其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数＞1.5和稳定性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

10.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.5和活性测量的性能指数＞1.0的α淀粉酶变体。

11.权利要求8的清洁组合物，其中变体α淀粉酶在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代。

12.权利要求1-7的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是变体α淀粉酶的成熟形式，其在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置对应于SEQID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去垢剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一个有益的效果。

13.权利要求1-7的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶是变体α淀粉酶的成熟形式，其在选自5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483和484的一个或多个位置上包含取代；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列中的氨基酸残基；并且

其中所述用不同的氨基酸残基取代天然存在的氨基酸残基产生了这样的α淀粉酶变体，所述变体在pH8下的活性、pH10下的活性、16℃下的活性、和32℃下的活性的性能指数值为0.5或更高，在去垢剂中的稳定性和热稳定性的性能指数值为0.5或更高。

14.权利要求8-13的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的243位上的取代。

15.权利要求8-13的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体还包含在对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。

16.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体源自具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列的亲本α淀粉酶。

17.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列具有至少75％的序列同一性。

18.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

19.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中α淀粉酶变体与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

20.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述变体在选自对应于SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去垢剂稳定性。

21.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括：

(a)在125位的丙氨酸，

在128位的半胱氨酸，

在131位的异亮氨酸，

在165位的异亮氨酸，

在178位的亮氨酸，

在182位的甘氨酸，

在202位的酪氨酸，

在305位的精氨酸，

在319位的苏氨酸，或

在475位的精氨酸；

(b)取代N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和选自S125A、T131I、T165I、F202Y和D319T的至少一种其它的取代；或

(c)取代

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K，

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K；

其中所述变体任选的还包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失；并且

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。

22.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括475位的取代。

23.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。

24.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶变体包括在243位的取代和/或180位和/或181位的缺失。

25.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中在低于约25℃的温度下测量时，组合物提供了比对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平更大的清洁水平。

26.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中在低于约20℃的温度下测量时，组合物提供了比对缺少α淀粉酶或缺少蛋白酶的相应组合物所观察到的清洁水平更大的清洁水平。

27.前述权利要求的任一项的清洁组合物，其中所述α淀粉酶和蛋白酶是共同配制的。

28.清洁织品或硬表面的方法，其包括将织品或硬表面与前述权利要求的任一项的清洁组合物接触。

29.权利要求28的方法，其中所述方法在低于约25℃的温度下实施。

30.权利要求29的方法，其中所述方法在低于约20℃的温度下实施。

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