CN102378813A - 包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产、纺织品退浆和/或甜味剂生产。

Description

包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法

优先权

本申请要求2009年4月1日提交的美国临时申请系列号No.61/165,813的优先权，该美国临时申请完整引入本文作为参考。

技术领域

本发明描述了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产；纺织品退浆和/或甜味剂生产。

背景技术

淀粉是直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物。直链淀粉由α-1，4连接的葡萄糖单位的线性链组成，具有从约60,000至约800,000的分子量(MW)。支链淀粉是分支多聚体，其每24-30个葡萄糖单位含有α-1，6分支点。其分子量可以高达1亿。

目前是通过酶催化方法从淀粉产生浓缩的葡萄糖糖浆形式的糖，该催化方法包括：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或薄化)为约7-10平均聚合度的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)对产生的液化淀粉(即，淀粉水解物)的糖化作用。产生的糖浆具有高的葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖糖浆随后被酶促异构化为葡萄糖/果糖混合物，称为异构糖浆(isosyrup)。

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是通过随机切割内在的α-1，4-糖苷键水解淀粉、糖原和有关的多糖的一类酶。这类酶具有多种重要的商业应用，例如在淀粉加工的初始阶段(液化)中、在纺织品的退浆中、在再生纸的脱墨中、在纸和纸浆工业中的淀粉修饰、在湿酿酒糟(wet corn milling)中、在乙醇生产中、在甜味剂(例如糖)生产中、在饮料工业中、在酿造业中、在油田、在动物饲料和在去污剂基质中作为清洁剂。例如，这类酶可以在餐具和洗衣过程中用于去除淀粉污渍。

α-淀粉酶分离自多种细菌、真菌、植物和动物来源。工业上，许多重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌(Bacilli)。一种表征的α-淀粉酶是嗜碱性芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)TS-23菌株的α-淀粉酶，该菌株产生至少五类呈现淀粉水解活性的酶。(Lin等人，Biotechnol.Appl.Biochem.28：61-68，1998)。虽然其在宽范围pH内(即，pH4.7至10.8)稳定，芽孢杆菌物种TS-23菌株的α-淀粉酶的最适宜pH为9。虽然该酶在较低温度例如15-20℃也有活性，但是其最适宜温度为45℃。

还是需要变体淀粉酶(如α-淀粉酶)，该变体具有改变的生化特征，并且在工业应用中提供改善的性能。

发明概述

本发明描述了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产；纺织品退浆和/或甜味剂生产。

在一个方面，提供了分离的α-淀粉酶变体，其中变体是具有淀粉酶活性的α-淀粉酶的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26，28，29，30，32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，59，60，70，71，72，73，75，78，83，87，90，91，93，94，95，104，105，107，108，110，112，113，116，118，125，126，128，129，130，131，134，136，138，142，144，147，149，150，152，154，156，158，160，161，162，165，166，168，169，170，172，174，177，178，182，183，185，189，192，195，197，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，236，237，246，250，254，255，257，264，267，269，270，272，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，447，

448、451、453、459、465、470、475、476、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中不同的氨基酸残基对一个或多个位置上的天然氨基酸残基的取代产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.0，活性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401和438的一个或多个位置上包含取代，并且其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数＞1.5和稳定性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.5和活性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代。

在相关方面，提供了分离的α-淀粉酶，其在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代，其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中该取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去污剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一中有益效果。

在另一相关方面，提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的α-淀粉酶的成熟形式，且其在选自5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中该位置对应于SEQ IDNO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了这样的α-淀粉酶变体，该变体在pH8下的活性、pH10下的活性、16℃下的活性、32℃下的活性的性能指数值为0.5或更高，在去污剂中的稳定性或热稳定性的性能指数值为0.5或更高。

在一些实施方案中，不同氨基酸残基选自：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M.N、P、Q、R、S、T、V、W和Y，条件是该不同氨基酸残基与天然出现的氨基酸残基不同。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体进一步包含在对应于SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的243位上的取代。在一些实施方案中，任意前述α-淀粉酶变体进一步包含在对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，其具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少75％的序列同一性。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少90％的序列同一性。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中该取代提供了改善的清洁性能或改善的去污剂稳定性。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包含：

(a)在125位的丙氨酸，

在128位的半胱氨酸，

在131位的异亮氨酸，

在165位的异亮氨酸，

在178位的亮氨酸，

在182位的甘氨酸，

在202位的酪氨酸，

在305位的精氨酸，

在319位的苏氨酸，或

在475位的精氨酸；

(b)取代N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和

选自S125A、T131I、T165I、F202Y和D319T的至少一种其他的取代；或

(c)取代

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K，

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K；

其中该变体任选的还包括在243位上的取代和/或180位和/或181位上的缺失；和

其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包含在位置475的取代。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包含在位置475的精氨酸。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体还包含在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。

在另一方面，提供了分离的α-淀粉酶的变体，其中，该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，

408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个位置包括取代；其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置的取代是在1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个位置的取代。

在一些实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，其选自组BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，其具有与由SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所组成的组的成员至少是75％相同的氨基酸序列。

在另一方面，提供了编码α-淀粉酶变体的分离核酸。在相关方面，提供了包括与启动子有效组合的分离核酸的表达载体。在另一方面，提供了包括表达载体的宿主细胞。

在另一方面，提供了包括α-淀粉酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，清洁组合物进一步包括至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶(perhydrolase)、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN′或其变体。在具体实施方案中，该至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN′Y217L或其变体。

在另一方面，提供了清洁织物或硬表面的方法，其包括将织物或硬表面与该清洁组合物接触。在一些实施方案中，清洁组合物还包括至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，清洁组合物进一步包括至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶。

在具体实施方案中，α-淀粉酶变体包含取代：

N128C+K178L+T182G+F202Y+S243Q+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K。

在一些相关的实施方案中，本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，243，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，

408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ IDNO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该位置选自：1、2、3、4、5、7、16，17，18，19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，57，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，108，112，114，115，116，118，121，123，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，189，190，191，192，193，195，197，199，202，207，214，217，221，228，234，237，238，243，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，447，451，453，459，465，

479、475和483，并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，该位置选自：1、2、3、4、5、7、16、17、18、19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，57，60，70，71，72，73，75，78，82，83，90，91，93，94，95，103，104，105，108，112，114，115，116，118，121，123，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，171，172，174，175，176，177，178，179，185，186，189，190，191，192，193，195，197，199，202，207，214，217，221，228，234，237，238，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，318，319，322，323，336，337，338，339，340，344，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，

419、433、436、438、447、451、453、459、465、479、475和483，并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体包含58位的酪氨酸和236位的丙氨酸，且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体包含243位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸，且其中该位置对应于SEQ IDNO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。

本公开还提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自182、183、305、320、379、407、419和475的一至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该取代包含X182N、X183N、X305Q、X320F、X379A、X407D、X419S和X475T组成的组中的1至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含T182N、G183N、Y305Q、Q320F、P379A、Q407D、T419S和G475T组成的组中的1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自160、182、183、189、305、379和475的1-7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含X160E、X182G、X183N、X189P、X305G、X379E和X475T组成的组中的1至7个。在这些实施方案的亚组中，取代包含Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E和G475T组成的组中的1至7个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)。

本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、214、279、305、319、320和475的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含X125A、X182A、X214Q、X279N、X305R、X319T、X320N和X475R组成的组中的1至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、Q320N和G475R组成的组中的1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

本公开提供另一分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自7、182、298、376、379、407、419和453的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含X7H、X182W、X298Q、X376R、X379K、X407W、X419S和X453W组成的组中的1至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S和L453W组成的组中的1至8个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自128、178、182和185的一个至四个(例如，1、2、3或4个)位置上包含取代，并且该α-淀粉酶变体包含在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该取代包含N128C、K178L、T182G和A185D1组成的组中的1至4个(例如，1、2、3或4个)。

本公开提供另一分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至九个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个)位置上包含取代，并且该α-淀粉酶变体包含在320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该α-淀粉酶变体包含：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。

本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、128、178、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至十一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)位置上包含取代，并且该α-淀粉酶变体包含在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，和320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该α-淀粉酶变体包含：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在128位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中该位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一个优选的实施方案中，取代选自：N128C、T131I、T134P、Q138E、Y160I、T165I、T165V、K178L、T182A、T182C、T182D、T182M、T182F、T182N、T182G、T182P、T182Q、A185D、A185E、E189P、S243D、S243E和S243Q。

使用示例性α-淀粉酶作为起点，即“骨架”，制备和测试本文描述的氨基酸突变，然而，可以理解可以在相关的α-淀粉酶中制备相当的氨基酸突变，其预期制备相似的效应和产生相似的优点。其他用作骨架的示例性的α-淀粉酶包括但不限于本文中鉴别的那些。

本公开进一步提供了编码任意前述段落中的α-淀粉酶变体的分离的核酸。在一个实施方案中，包括了这样的表达载体，该表达载体包含与启动子有效组合的分离的核酸。在另一实施方案中，包括了包含该表达载体的宿主细胞。另一实施方案提供了产生α-淀粉酶变体的方法，其包括：用包含编码α-淀粉酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合产生该α-淀粉酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。另一实施方案进一步包括收获所产生的α-淀粉酶变体的步骤。另一实施方案包括作为宿主细胞的芽孢杆菌物种，且在另一实施方案中，该芽孢杆菌物种是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。

本公开提供了清洁组合物，其包含任意前述段落的α-淀粉酶变体，进一步包含至少一种其他酶。在一个实施方案中，其他的酶是选自蛋白酶(包括但不限于枯草杆菌蛋白酶、中性金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶等)、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶。在另一实施方案中，清洁组合物是洗衣去污剂，在另一实施方案中，清洁组合物是洗碗去污剂。在另一实施方案中，清洁组合物是含漂白剂的洗衣和/或洗碗去污剂。在另一实施方案中，清洁组合物是用于织物的预处理，例如在洗涤之前应用。在另一实施方案中，清洁组合物是洗衣去污剂或洗碗去污剂的添加物。本公开进一步提供了清洁的方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与包含该α-淀粉酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个实施方案中，方法是洗碗方法，其包括步骤：提供i)洗碗组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下将餐具与洗碗组合物接触。在另一实施方案中，方法是织物清洁方法，其包括步骤：提供i)织物清洁组合物，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下将衣物与织物清洁组合物接触。在另一实施方案中，方法涉及将材料从编织的织物中的纱线上去除，如在纺织品脱浆的情况下。

根据本说明书，组合物和方法的这些和其他方面和实施方案是显而易见的。

附图简述

图1提供了SEQ ID NOS：2和5-14分别所示的各种对照淀粉酶的成熟形式的比对。使用MUSCLE 3.7多重序列比对算法(Edgar，Nucleic Acids Research，32：1792-1797，2004)比对序列。

图2提供了含有地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)LAT启动子(Plat)和来着pUB110(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)的其他元件的pHPLT载体的图，该其他元件包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)。

图3提供了pHPLT-BASE质粒的图。

图4提供了pHPLT-ACE-S243Q质粒的图。

图5提供了显示多个α-淀粉酶在洗衣去污剂应用中的洗涤性能的图图表。所测试的酶如下：W9(BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-T279N-D319T-Q320N-G475R)；W10(BASE-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-D319T-G475R)；W11(BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-G475R)；和ACE-S243Q-G475K。

图6提供了显示多个α-淀粉酶在洗衣去污剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下：BASE-X8C、BASE-W10EK、ACE-QK和对照(基准的商业酶)。

图7A提供了显示在ACE α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图7B提供了显示在ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图8提供了显示在BASE-X8C(W11-T131I-T165I)α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图9提供了显示在BASE W10EK (BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

图10提供了显示在ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。

发明详述

本发明描述了涉及淀粉酶变体，尤其涉及芽孢杆菌α-淀粉酶的变体的组合物和方法。本文所述淀粉酶变体具有该变得生化特征且在多种工业应用中显示出特别功效(例如洗衣和洗碗)。该变体以及用于使用变体的方法的各个特征将详细的描述如下。

1、α-淀粉酶变体的定义和系统命名

除非本文中另外定义，否则本文中所有的技术和科学术语都具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY，第2版，John Wiley和Sons，New York(1994)和Hale &Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了本文使用的许多术语的通用字典。

组合物和方法的一些方面取决于基因工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。下列资源包括了可用于本组合物和方法中的通用方法学的描述：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(第2版，1989)；Kreigler，GENETRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等人编辑，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，本组合物和方法并非旨在限于所描述的任何特定的技术、方案和试剂，这是可以改变的。虽然任何与本文所述的相似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本组合物和方法，但优选的方法和材料描述如下。

当描述蛋白质及其编码基因时，基因的名称一般是斜体且非大写的，而蛋白质的名称一般是非斜体且首字母大写。

除非文中明确地另外指出，单数形式“一个”、“这个”和“该”包含了复数含义。因此，例如，指代“一种酶”包括了复数的此种酶，指代“这个配方”包括了指代本领域技术人员已知的一个或多个配方及其等价物，如此类推。

本文中提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用清楚地合并到本文中。

1.1定义

出于清楚的目的，定义下列术语。

如本文使用的，术语“淀粉”指包括植物糖类的复杂多糖的任何材料，包括具有通式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。特别而言，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更特别的是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、黍、马铃薯、甘薯和木薯粉(tapioca)。

如本文使用的，术语“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。一般而言，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割淀粉分子内部的α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。相反，外切作用的淀粉水解酶，例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶，如产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，从底物的非还原端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。如本文中使用的，淀粉酶包括任何/所有的淀粉酶，包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属物种的淀粉酶，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的淀粉酶，同时，α-淀粉酶包括这些酶的上述亚组。

如本文中使用的，“芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶”和类似的词组，指源自芽孢杆菌属物种TS-23菌株的α-淀粉酶。编码该α-淀粉酶的基因可以是编码该α-淀粉酶的野生型基因或密码子优化的多核苷酸。芽孢杆菌属物种TS-23菌株的成熟的α-淀粉酶(按从氨基至羧基的方向)是(SEQ ID NO：1)：

NTAPINETMM QYFEWDLPND GTLWTKVKNE AANLSSLGIT ALWLPPAYKG    50

TSQSDVGYGV YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TKTQYIQAIQ AAKAAGMQVY    100

ADVVFNHKAG ADGTEFVDAV EVDPSNRNQE TSGTYQIQAW TKFDFPGRGN    150

TYSSFKWRWY HFDGTDWDES RKLNRIYKFR STGKAWDWEV DTENGNYDYL    200

MFADLDMDHP EVVTELKNWG TWYVNTTNID GFRLDAVKHI KYSFFPDWLT    250

YVRNQTGKNL FAVGEFWSYD VNKLHNYITK TNGSMSLFDA PLHNNFYTAS    300

KSSGYFDMRY LLNNTLMKDQ PSLAVTLVDN HDTQPGQSLQ SWVEPWFKPL    350

AYAFILTRQE GYPCVFYGDY YGIPKYNIPG LKSKIDPLLI ARRDYAYGTQ    400

RDYIDHQDII GWTREGIDTK PNSGLAALIT DGPGGSKWMY VGKKHAGKVF    450

YDLTGNRSDT VTINADGWGE FKVNGGSVSI WVAKTSNVTF TVNNATTTSG    500

QNVYVVANIP ELGNWNTANA IKMNPSSYPT WKATIALPQG KAIEFKFIKK    550

DQAGNVIWES TSNRTYTVPF SSTGSYTASW NVP                      583

如本文中使用的，“α-淀粉酶变体”和类似的词组，指对照α-淀粉酶的变体/突变体，其包括相对于对照α-淀粉酶的亲本(野生型；对照)氨基酸序列的氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“变体”与术语“突变体”可互换的使用。变体α-淀粉酶可包括相对于亲本信号序列的信号序列中的突变。此外，变体α-淀粉酶可以是包含异源性α-淀粉酶信号序列，例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列(LAT)的融合蛋白的形式。

如本文中使用的，词组“亲本芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶”、“野生型芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶”、“对照芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶”和类似的词组指芽孢杆菌属物种TS-23菌株的多肽。方便起见，术语可以是缩写的“亲本酶”、“野生型酶”、“亲本多肽”、“对照多肽”等。亲本芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶可在亲本多肽的信号序列中包含突变。此外，亲本芽孢杆菌属物种TS-23菌株α-淀粉酶可以是包含异源α-淀粉酶信号序列，例如来自地衣芽孢杆菌的信号序列(LAT)的融合蛋白的形式。

如本文中使用的，“亲本核酸/多核苷酸”、“野生型核酸/多核苷酸”或“对照核酸/多核苷酸”指编码亲本多肽的核酸序列，和与其互补的核酸。

如本文中使用的，“变体核酸/多核苷酸”指编码变体多肽的核酸序列，或与其互补的核酸，或相对于亲本多核苷酸序列或与其互补的核酸具有至少一个碱基取代、插入或缺失的多核苷酸序列。其中特定的此类核酸可包括与对照序列具有特定程度同源性的核酸，或者能够与对照序列杂交的核酸，例如在严格条件下(例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M Na₃柠檬酸，pH7.0))或高严格条件下(例如，65℃和0.1X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M Na₃柠檬酸，pH7.0))杂交。可以优化变体核酸来反映特定宿主生物体的优选的密码子选择，例如甲基营养酵母(例如，毕赤酵母(Pichia)、汉逊氏酵母(Hansenula)等)或丝状真菌(例如，木霉(Trichoderma)(如里氏木霉(T.reesei))等)或其他的表达宿主(例如，芽孢杆菌、链霉菌(Streptomyces)等)。

如本文中使用的，术语“重组”当用于指对象细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该对象已通过引入异源的核酸或蛋白质或者对天然核酸或蛋白质的改变而修饰，或者该细胞来自上述修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中没有发现的基因，或者异常的表达、低表达或完全不表达天然表达的基因。

如本文中使用的，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指去除了天然相关的和在自然界中发现的至少一种组分的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文中使用的，术语“纯化的”指处于相对纯的状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或者甚至至少约99％纯。

如本文中使用的，术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶在暴露于升高的温度下之后，保持活性的能力。酶(例如α-淀粉酶)的热稳定性是通过它的半衰期(t1/2)按分钟、小时或天来测量的，在该过程中，一半的酶活性在所定义的条件下丧失。通过测量暴露于(受激于)升高的温度下之后剩余的α-淀粉酶活性，可以计算半衰期。

如本文中使用的，“pH范围”指酶表现出催化活性下的pH值的范围。

如本文中使用的，术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及酶在宽泛的pH值范围内维持预定时间段的活性的能力(例如，15分钟、30分钟、1小时等)。

如本文中使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义的，并可互换的使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，可称为“酶”。本文中的氨基酸残基使用常规的一字母或三字母代码。

如本文中使用的，术语“核酸”涵盖了DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链的，并可以是化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换的使用。因为遗传密码是简并的，可使用一个以上的密码子编码特定的氨基酸，而本发明的组合物和方法涵盖了编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指出，核酸按从5’至3’方向由左至右的书写；氨基酸序列按从氨基至羧基方向由左至右的书写。

如本文中使用的，术语“同源物”指与对照氨基酸或核苷酸序列，或与另一种特定的共同结构或功能特征具有一定程度同一性的氨基酸或核苷酸序列。同源序列包括使用常规的序列比对工具(例如Clustal、BLAST等)，与对象序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％相同的氨基酸序列。一般的，除非另外说明，同源物包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基。

如本文中使用的，“杂交”指一条核酸链与互补链碱基配对的过程，发生在印迹杂交技术和PCR技术的过程中。

如本文中使用的，“合成的”分子是通过体外化学或酶促合成而非生物体产生的。

如本文中使用的，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”用于指这样的细胞，意味着该细胞具有整合到其基因组中的非天然的(例如，异源的)核酸序列，或携带该序列作为在多个世代中维持的附加体质粒。

术语“引入”在向细胞插入核酸序列的上下文中，意指“转染”、“转化”或“转导”，如本领域已知的。

如本文中使用的，术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指引入了包含编码目标多肽(例如，变体α-淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体的生物体。示例性的宿主菌株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体，例如芽孢杆菌的原生质体。

如本文中使用的，涉及多核苷酸或蛋白质的术语“异源的”指在宿主细胞中非天然多核苷酸或蛋白质。

如本文中使用的，涉及多核苷酸或蛋白质的术语“内源的”指在宿主细胞中天然多核苷酸或蛋白质。

如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

如本文中使用的，“选择性标记”或“选择性标记”指能够在宿主中表达，有利于选择携带该基因的宿主细胞的基因。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或新霉素)和/或产生代谢优势的基因，如宿主细胞的营养优势。

如本文中使用的，“培养”指在合适条件下，在液体或固体培养基中生长微生物细胞群体。培养包括将含有颗粒状淀粉的淀粉底物发酵性生物转化为终末产物(通常是在容器或反应器中)。

如本文中使用的，“发酵”是微生物对有机物的酶促降解，产生更简单的有机化合物。发酵一般发生在厌氧的条件下，但该术语并非旨在仅限于严格厌氧条件，因为发酵也可以在存在氧的条件下发生。

如本文中使用的，“基因”指参与产生多肽的DNA片段，包括编码区、在编码区前后的区域和单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文中使用的，“载体”指设计为将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

如本文中使用的，“表达载体”指包含编码目标多肽的DNA序列的DNA构建体，其与能够影响DNA在合适宿主中的表达的合适控制序列有效连接。此类控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的优化操纵子序列、编码mRNA上的合适的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

如本文中使用的，“启动子”是涉及结合RNA聚合酶、起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。示例性的启动子是地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyL)启动子。

如本文中使用的，术语“有效连接”意指特定的组分所处的关系(包括但不限于邻接)允许它们以预期的方式发挥功能。例如，调控序列与编码序列有效连接，使得编码序列的表达处于调控序列的控制之下。

如本文中使用的，术语“处于转录控制之下”意指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与元件的有效连接，该元件负责起始或促进转录。

如本文中使用的，术语“处于翻译控制之下”意指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻译为多肽依赖于其与元件的有效连接，该元件负责起始或促进翻译。

如本文中使用的，“信号序列”是附着在蛋白质的N端部分的氨基酸序列，其有利于蛋白质分泌到细胞外。胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。

如本文中使用的，“生物学活性的”指序列具有特定的生物学活性，例如酶活性。在本发明的淀粉酶的情况下，该活性是α-淀粉酶活性。

如本文中使用的，“水硬度”是对水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的度量。

如本文中使用的，术语“冷水”指温度低于约25℃的水。具体而言，冷水指温度低于约20℃的水。示例性的冷水范围是从约15℃至约25℃，从约15℃至约20℃。

如本文中使用的，术语“性能指数(PI)”指变体性能与亲本或对照淀粉酶的比值。性能(即，特性)的测量包括热稳定性、清洁性能、表达水平等，根据上下文是显而易见的。

如本文中使用的，改善性能的突变被称为“上升突变(upmutation)”，对于特定的特性具有PI＞1。“中性突变”对于特定的特性具有PI＞0.5。“无害突变”对于特定的特性具有PI＞0.05。“有害突变”对于特定的特性具有PI≤0.05。“组合突变”对于至少一种特性具有PI≥0.5，且对于所有特性具有PI＞0.05。组合突变可以在同一个变体中共存，产生具有至少一种有益特性的酶。

如本文中使用的，术语“活性测量”指测量本文所述的酶活性。此类活性测量包括在pH8下的清洁性能、pH10下的清洁性能、16℃下的清洁性能、32℃下的清洁性能和使用合成底物的活性。

如本文中使用的，术语“稳定性测量”指测量本文所述的酶稳定性。此类活性测量包括在去污剂中的稳定性和热稳定性。

如本文中使用的，术语“共同配制”意指对象成分(例如酶)共存于同一液体、半固体或干燥的组合物中。

如本文中使用的，“糖化作用”淀粉至葡萄糖的酶促转化。

如本文中使用的，“糊化(gelatinization)”指通过蒸煮溶解淀粉分子形成粘稠的悬浮液。

如本文中使用的，“液化”指淀粉转化中的阶段，其中糊化的淀粉水解产生低分子量的可溶性糊精。

如本文中使用的，术语“初级液化”指料浆的温度升高或接近其糊化温度时的液化步骤。在温度升高后，将料浆通过热交换器或喷射至200-300°F的温度，例如220-235°F。在用于热交换器或喷射温度后，将料浆在该温度下保持3-10分钟的时间段。保持料浆在200-300°F的这一步骤就是初级液化。

如本文中使用的，术语“次级液化”指在初级液化(加热至200-300°F)之后的液化步骤，此时允许料浆冷却至大气温度。该冷却步骤可以是30分钟至180分钟(3小时)，例如90分钟至120分钟(2小时)。

如本文中使用的，术语“次级液化的分钟数”指从开始次级液化时至测量DE时已流逝的时间。

如本文中使用的，术语“聚合程度(DP)”指给定糖中的无水呋喃葡萄糖单位的数目。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示具有聚合度大于3的多聚物。

如本文中涉及淀粉转化时使用的，术语“终末产物”或“理想的终末产物”指从淀粉底物酶促转化成的具体的碳源来源的分子。

如本文中使用的，术语“干燥固体含量(ds)”指料浆中的总固体，以％干重表达。

如本文中使用的，术语“料浆(slurry)”指含有不可溶的固体的含水混合物。

如本文中使用的，术语“剩余的淀粉”指在发酵或酶促水解含淀粉的底物后，组合物中剩余的淀粉(可溶的或不可溶的)。

如本文中使用的，“再循环步骤”指醪液(mash)组分的循环，包括剩余的淀粉、酶和/或发酵底物(包括淀粉)的微生物。

如本文中使用的，术语“醪液”指包括了可发酵碳源(例如，糖类)的含水混合物，其可用于生产发酵产物，例如醇。术语“发酵醪”和“醪液”可互换的使用。

如本文中使用的，术语“酒糟”指不发酵的固体和水的混合物，代表从发酵的醪液中去除醇类后的剩余物。

如本文中使用的，术语“干酒精糟(DDG)”和“干酒精糟液(DDGS)”指谷类发酵的有用的副产物。

如本文中使用的，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物是凭借表达一种或多种可单独或共同将糖转化为乙醇的酶的能力来产乙醇的。

如本文中使用的，术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖生产乙醇的任何生物体或细胞。一般而言，产乙醇的细胞含有乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包括真菌微生物，如酵母。优选的酵母包括酵母(Sacchromyces)的菌株，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

如本文中涉及淀粉酶及其底物时使用的，术语“接触”指将酶置于与底物足够接近，使酶能够将底物转化为终末产物。接触可以包括混合。

如本文中使用的，术语“源自/衍生自”意指“起源自”、“基于”、“获得自”、“可获得自”或“分离自”，取决于上下文。

如本文中使用的，术语“酶促转化”一般指通过酶作用(例如，淀粉酶)对底物(例如，淀粉)的修饰。

如本文中使用的，术语“分解”指生物膜基质中的多糖的水解，该多糖将生物膜中的单个微生物细胞连接和结合在一起，从而可以从生物膜中释放并去除微生物细胞。

如本文中使用的，“样品(swatch)”是一片材料，例如织物，在该材料上施加污渍来评估组合物的清洁效率。

如本文中使用的，术语“比活”指在特定条件下，单位时间内通过酶制品转化为产物的底物摩尔数。比活表达为单位(U)/mg蛋白质。

如本文中使用的，术语“产量”指方法产生的终末产物的量，例如以浓度、体积、量或起始材料的百分比来表示。

如本文中使用的，“ATCC”指位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯，20108(ATCC)的美国典型培养物保藏中心。

如本文中使用的，“NRRL”指伊利诺伊州皮契里亚的美国农业研究服务的培养物保藏中心，是美国的农业应用研究国立中心(之前称为USDA北部区域研究实验室)。

数值范围包括定义范围的数。

一般而言，小标题是描述性的，并非旨在限制。

1.2系统命名

在本说明书和权利要求中，氨基酸残基使用常规的单字母和三字母代码。为了便于对照，通过使用下列系统命名描述本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体：

原始氨基酸：位置：取代的氨基酸。

根据系统命名，例如用丙氨酸取代242位的丝氨酸显示为：Ser242Ala或S242A。删除30位的丙氨酸显示为：Ala30^＊或A30^＊或ΔA30。插入额外的氨基酸残基，如赖氨酸，显示为：Ala30AlaLys或A30AK。

删除一段连续的氨基酸残基，例如氨基酸残基30-33，标示为(30-33)^＊或Δ(A30-N33)或Δ30-33。删除2个连续的氨基酸，如氨基酸残基R180-S181，标示为ΔRS或Δ180-181。

当相比其他α-淀粉酶，特定的α-淀粉酶含有“删除”，且在该位置产生插入时，对于36位插入天冬氨酸则标示为：^＊36Asp或^＊36D。

通过加号或减号分隔多个突变：Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S，Ala30Asp-Glu34Ser或A30N-E34S，表示30和34位的突变分别是用天冬氨酸和丝氨酸取代丙氨酸和谷氨酸。

当一个或多个可选的氨基酸残基可以取代给定位置的残基时，标示为：A30N、E或A30N或A30E。

此外，当本文鉴别的适合进行修饰的位置没有提示任何特定的修饰时，理解为可以用任何氨基酸残基取代该位置存在的氨基酸残基。因此，例如当提到30位的丙氨酸的修饰但未说明时，理解为该丙氨酸可以被删除或被任何其他的氨基酸取代，即，R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任一种。

此外，“A30X”意指任一种下列取代：A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V；或简写为：A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。

使用下列系统命名来表示非特定的亲本淀粉酶的位置上的氨基酸残基，其中，该位置根据SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶的氨基酸序列编号：例如“X30N”或“X30N、V”的情况下，变体淀粉酶的30位存在N或V之一，而亲本淀粉酶(例如，野生型或变体酶)中存在20种标准氨基酸之一。

1.3氨基酸残基的特征

带电的氨基酸包括：Asp、Glu、Arg、Lys和His。负电荷氨基酸(首先是具有最多负电的残基)是Asp和Glu。正电荷氨基酸(首先是具有最多正电的残基)是Arg、Lys和His。

中性氨基酸包括：Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr和Pro。

疏水性氨基酸残基(具有最大疏水性的残基列举在最后)包括：Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe和Trp。

亲水性氨基酸残基(具有最大亲水性的残基列举在最后)包括：Thr、Ser、Cys、Gln和Asn。

1.4同源性(同一性)

与另一种序列具有特定百分比(例如，75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽意指比对时，在比较的两条序列中相同碱基或氨基酸残基的百分比。可以使用本领域已知的任何合适的软件程序来确定比对和百分比同源性或同一性，例如CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人，(编辑)1987，增刊30，7.7.18节)。优选的程序包括Vector NTI Advance^TM 9.0(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)、GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等人，(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.，和Altschul等人，(1997)NAR 25：3389-3402)。另一个优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)，优选使用默认参数。另一种可使用的序列软件程序是在Sequence Software Package版本6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)中可获得的TFASTA Data Searching Program。

同源性可以确定为两条序列之间相同的程度，表示第一序列源自第二序列。可以通过本领域已知的计算机程序的手段适当的确定同源性，例如GCG程序包(如上所述)中提供的GAP。因此，GAP GCGv8可使用同一性的默认评分矩阵和下列默认参数：对于核酸序列比较的空位产生罚分为5.0，空位延伸罚分为0.3，对于蛋白质序列比较的空位产生罚分为3.0，空位延伸罚分为0.1.GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453的方法，产生比对和计算同一性。

可使用BASE(SEQ ID NO：2)或BASE变体与例如另一种α-淀粉酶之间的结构性比对，来鉴别具有高度同源性的其他α-淀粉酶中的等价/相应的位置，例如与AmyTS23约75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者甚至99％同源性。一种获得该结构性比对的方法是使用GCG包中的Pile Up程序，使用空位罚分的默认值，即空位产生罚分为3.0，空位延伸罚分为0.1。其他的结构性比对方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，(1987)，FEBSLETTERS 224，第149-155页)和逆向线程(reverse threading)(Huber和Torda，PROTEIN SCIENCE，第7卷，第1期，第142-149页(1998))。

图1提供了各种对照淀粉酶的成熟形式的示例性比对。对照淀粉酶包括：本文中称为AmyTS23t或BASE的截短的芽孢杆菌物种TS-23α-淀粉酶，SEQ ID NO：2(GENBANK登录号：AAA63900)；本文中称为AmyL或LAT的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，SEQ ID NO：5(GENBANK登录号：AAA22240)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(之前的芽孢杆菌α-淀粉酶AmyS，SEQ ID NO：6

(GENBANK登录号：AAA22241)；解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶BACAM，SEQ ID NO：7(GENBANK登录号：AAA22191)；本文中称为AmyG6或Amy#707的芽孢杆菌物种#707α-淀粉酶，SEQ ID NO：8(GENBANK登录号：AAA22231)；巨大芽孢杆菌(B.megaterium)α-淀粉酶AmyG5或AmyBm，SEQID NO：9(GENBANK登录号：AAK00598)；芽孢杆菌物种α-淀粉酶ALBA，SEQ ID NO：10(GENBANK登录号：CAL48155和WO2006/037484)；盐敏芽胞杆菌(B.halmapalus)淀粉酶AmyBh，SEQID NO：11(GENBANK登录号：AAE00432和美国专利5,856,164)；芽孢杆菌物种淀粉酶AA560，SEQ ID NO：12(GENBANK登录号：CAC16486和WO 2000/060060)；芽孢杆菌物种KSM-AP1378α-淀粉酶AmyKSM1378，SEQ ID NO：13(GENBANK登录号：CAD35985和EP No.1199356A)；芽孢杆菌物种pHSP-K38淀粉酶AmyK38，SEQ ID NO：14(GENBANK登录号：CAJ00040和WO 2005/045045)。使用MUSCLE 3.7多重序列比对算法(Edgar，Nucleic Acids Research，32：1792-1797，2004)比对序列。表1提供了显示图1的α-淀粉酶序列比对的百分比同一性的矩阵。表1.α-淀粉酶百分比同一性矩阵^＊

^＊顶行和左栏中的数字对应于图1的比对序列的SEQ ID NO。

1.5杂交

可以基于所讨论的α-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列，适当的制备在上文表征AmyTS23中使用的寡核苷酸探针。

测试杂交的合适条件涉及在5X SSC中预浸泡和在20％甲酰胺、5X Denhardt氏液、50mM磷酸钠、pH6.8和50mg变性的超声化小牛胸腺DNA的溶液中40℃预杂交1小时，再在补充了100mM ATP的相同溶液中40℃杂交18小时，再在2X SSC，0.2％SDS中洗涤滤膜3次，40℃下30分钟(低严格度)，优选50℃(中等严格度)，更优选65℃(高严格度)，甚至更优选75℃(非常高严格度)。关于杂交方法的更多细节可参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989。

在上下文中，“衍生自”旨在并非仅表示由所讨论的生物的菌株产生的或可产生的α-淀粉酶，而且也表示由此类菌株中分离的DNA序列编码的α-淀粉酶和在用该DNA序列转化的宿主生物体中产生的α-淀粉酶。最后，该术语旨在表示这样的α-淀粉酶，该α-淀粉酶由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码，且具有所讨论的α-淀粉酶的鉴别特征。该术语还旨在表示亲本α-淀粉酶可以是天然α-淀粉酶的变体，即作为天然α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基的修饰(插入、取代、缺失)结果的变体。

本领域技术人员将认识到本发明组合物和方法涵盖的序列也可由在严格杂交条件下与示例的碱基序列(例如SEQ ID NO：4)杂交的能力来定义。当在恰当的温度和溶液离子强度的条件下，核酸的单链形式可以与其他核酸退火时，核酸与另一核酸序列是可杂交的。杂交和洗涤条件是本领域公知的(参见例如，Sambrook(1989)，见上文，特别是第9和11章)。在一些实施方案中，严格的条件对应于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。

1.6亲本α-淀粉酶

根据本公开，任何α-淀粉酶都可用作亲本(即，骨架)α-淀粉酶。在优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的BASE(AmyTS23t)。

1.7改变的特性

下列章节描述了存在于本文所述的变体淀粉酶中的突变之间的关系，和可由其获得的理想的特性改变(相对于亲本α-淀粉酶的特性)。说明书全文详细的描述了本发明组合物和方法涵盖的变体，下列篇幅仅为概述。

如上文所述，相对于衍生自或可衍生自芽孢杆菌物种菌株α-淀粉酶的α-淀粉酶，作为组合物和方法的方面，包括相对于亲本淀粉酶具有改变的特性的变体/突变体。亲本淀粉酶是上述的亲本α-淀粉酶以及包括至少一部分α-淀粉酶(例如成熟多肽的氨基酸序列)的杂合或嵌合淀粉酶。

当BASEα-淀粉酶(SEQ ID NO：2)用作起点来讨论变体淀粉酶时，可以理解与BASEα-淀粉酶具有高度同源性的其他芽孢杆菌α-淀粉酶可作为亲本淀粉酶，而不破坏该组合物和方法的范围。这对于其他的天然芽孢杆菌α-淀粉酶是特别合适的，其中该α-淀粉酶相比BASEα-淀粉酶只包含极小的序列差异，而不包括属于本公开对象的取代、缺失或插入。

在本发明组合物和方法的第一个方面，提供了亲本芽孢杆菌物种α-淀粉酶的变体。在一些实施方案中，该α-淀粉酶变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1，2，3，4，5，7，15，16，17，18，19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，243，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，

447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位置上包含取代。除非另外指出，否则该位置是对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶(BASE)的氨基酸序列来编号的(例如，在α-淀粉酶序列比对中相同的位置，如图1提供的)。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在其他优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的任一成员至少75％(优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包含58位的酪氨酸和236位的丙氨酸。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包含243位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸。

还提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的182、183、305、320、379、407、419和475的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶，和/或该取代包含T182N、G183N、Y305Q、Q320F、P379A、Q407D、T419S和G475T(例如，BASE组合文库1的变体)组成的组中的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

此外，本公开提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的160、182、183、189、305、379和475的一个至七个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶，和/或该取代包含Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E和G475T(例如，BASE组合文库2的变体)组成的组中的一个至七个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)。

本公开提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的125、182、214、279、305、319、320和475的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶，和/或该取代包含S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、Q320N和G475R(例如，BASE组合文库3的变体)组成的组中的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

本公开提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的7、182、298、376、379、407、419和453的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶，和/或该取代包含E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S和L453W(例如，BASE组合文库4的变体)组成的组中的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)。

本公开提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自的128、178、182和185的一个至四个(例如，1、2、3或4个)位置上包含取代，且该α-淀粉酶变体在243位包含丝氨酸或谷氨酰胺。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶，和/或该取代包含N128C、K178L、T182G和A185D(例如，BASE-S1至-S32的变体)组成的组中的一个至四个(例如，1、2、3或4个)。

在其他实施方案中，本公开提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至九个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个)位置上包含取代，该α-淀粉酶变体在320位包含谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体包含：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸(例如，BASE-P1至P12变体)。

本公开还提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自125、128、178、182、183、189、279、305、319、379和475的一个至十一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)位置上包含取代，该α-淀粉酶变体在243位包含丝氨酸或谷氨酰胺，和在320位包含谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在一些优选的实施方案中，α-淀粉酶变体包含：在125位的丝氨酸或丙氨酸；在128位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸(例如，BASE-W1至W13变体)。

公开了多种示例性的α-淀粉酶变体用于要求保护的组合物和方法。下列α-淀粉酶变体是示例性的α-淀粉酶变体：BASE SEL变体、ACE-Q SEL变体、BASE组合文库1变体、BASE组合文库2变体、BASE组合文库3变体、BASE组合文库4变体、BASE-S1至S32组合变体、BASE-P1至P12组合变体、BASE-W1至W13组合变体和ACE-QK变体。然而，本公开的α-淀粉酶变体包含但不限于示例性变体，包括了在相应位置具有取代的其他芽孢杆菌物种亲本α-淀粉酶的变体。基于比对和本文提供的其他数据，可以理解在其他α-淀粉酶多肽中，即，在其他“骨架”中产生的相应取代，和所获得的淀粉酶变体预计具有与所示例的相似的特性。

1.7.1稳定性

在本文所述变体的上下文中，对于实现改变的稳定性(即，更高或更低的)，特别是改善的稳定性而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，该稳定性尤其是在高温(即，70-120℃)和/或极端pH(即，低或高pH，即，分别是pH4-6或pH8-11)条件下的，特别是在低于60ppm的游离(即，未结合，因而在溶液中)钙浓度下。可以如下文“方法”章节中该确定稳定性。

1.7.2Ca²⁺稳定性

改变的Ca²⁺稳定性意指改善了在Ca²⁺耗尽的条件下的酶的稳定性，即更高或更低的稳定性。在目前描述的变体的上下文中，对于实现改变的Ca²⁺稳定性，特别是改善的Ca²⁺稳定性(即，更高或更低的稳定性)而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，该Ca²⁺稳定性尤其是在高pH(即，pH8-10.5)条件下的。

1.7.3比活

在其他方面，对于获得表现出改变的比活的变体，特别是增加或减少的比活而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括本文所述的任何突变，该比活尤其是在10-60℃，优选20-50℃，尤其30-40℃的温度下的。可以如下文“方法”章节中该确定比活。

1.7.4氧化稳定性

该变体可具有相比亲本α-淀粉酶改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。增加的氧化稳定性在例如去污剂组合物中是有利的，而减少的氧化稳定性在用于淀粉液化的组合物中是有利的。可以如下文“方法”章节中该确定氧化稳定性。

1.7.5改变的pH特征

对于获得具有改变的pH特征的变体重要的位置和突变包括位于活性位点残基附近的氨基酸残基的突变，该pH特征特别是在特别高pH(即，pH8-10.5)或低pH(即，pH4-6)下的改善的活性。优选的突变是本文所述的。合适的测定描述在下文“方法”章节中。

1.7.6洗涤性能

对于获得在特别高pH(即，pH8-10.5)下具有改善的洗涤性能的变体重要的位置和突变包括本文所述的特定突变。可以如下文“方法”章节中该测试洗涤性能。

2、制备α-淀粉酶变体的方法

本发明组合物和方法的一个方面是制备具有特定取代、缺失、倒位、插入及其组合的本发明α-淀粉酶变体的方法。这些变体可具有有利的特征，例如，增加的pH稳定性、增加的温度稳定性、降低的Ca²⁺需求、增加的比活、增加的洗碗或洗涤性能、增加的溶解度、增加的储藏稳定性，或其组合。

向基因中引入突变和表达这些基因编码的突变多肽的若干方法是本领域已知的。在简要讨论克隆α-淀粉酶-编码DNA序列之后，将讨论在α-淀粉酶-编码序列中的特定位点产生突变的方法。

2.1克隆编码α-淀粉酶的DNA序列

使用本领域公知的各种方法，可以从产生所讨论的α-淀粉酶的任何细胞或微生物中分离编码亲本α-淀粉酶的DNA序列。首先，可以使用产生所研究的α-淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成同源的、标记寡核苷酸探针，用于从所讨论的生物体制备的基因组文库中鉴别α-淀粉酶-编码克隆。可选的，可以使用含有与已知的α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针作为鉴别α-淀粉酶-编码克隆的探针，这使用低严格度的杂交和洗涤条件。

鉴别α-淀粉酶-编码克隆的另一种方法涉及在表达载体(例如质粒)中插入基因组DNA片段，用获得的基因组DNA文库转化α-淀粉酶-阴性细菌，然后将转化的细菌在含有α-淀粉酶底物的琼脂上涂板，从而允许鉴别表达α-淀粉酶的克隆。

可选的，可以通过已建立的标准方法合成制备编码酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的phosphoamidite方法或Matthes等(1984)描述的方法。在phosphoamidite方法中，在例如自动化DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到恰当的载体中。

最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成的起源、混合的合成和cDNA起源，或混合的基因组和cDNA起源，通过根据标准技术连接合成的、基因组的或cDNA起源的片段而制备(恰当时，片段对应完整DNA序列的各部分)。还可以使用特定的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如美国专利4,683,202或R.K.Saiki等(1988)中描述的。

2.2定点诱变

一旦分离了α-淀粉酶-编码DNA序列，并鉴别出理想的突变位点，则可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有在理想的突变位点两侧的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的过程中插入突变核苷酸。在特定的方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中，产生跨接(bridging)α-淀粉酶-编码序列的DNA的单链空位。然后，将具有所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。然后，用DNA聚合酶I(Klenow片段)填满剩余的空位，使用T4连接酶连接构建体。该方法的具体实例描述在Morinaga等(1984)中。美国专利4,760,025公开了通过实施盒的最小改变，引入寡核苷酸编码的多个突变。然而，通过Morinaga方法甚至可以一次引入更多的突变，因为可以引入各种长度的多个寡核苷酸。

Nelson和Long(1989)中描述了向α-淀粉酶-编码DNA序列中引入突变的另一种方法。涉及3步法产生含有所需突变的PCR片段，该突变是通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一条引物引入的。从PCR产生的片段中，可以通过限制性内切酶切割而分离携带突变的DNA片段，并重新插入到表达质粒中。

提供变体的替代方法包括基因改组，例如WO 95/22625(AffymaxTechnologies N.V.)或WO 96/00343(Novo Nordisk A/S)所述，或者获得包含突变如所讨论的取代和/或缺失的杂交酶的其他相应技术。

2.3表达α-淀粉酶变体

通过上述方法或本领域已知的任何替代方法产生的编码α-淀粉酶变体的DNA序列，可用于使用表达载体来表达变体α-淀粉酶(即，酶)，该载体一般包括控制序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号，和任选的抑制基因或各种激活子基因。

携带编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是常规进行重组DNA程序的任何载体，载体的选择一般依赖于其将引入的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微小染色体或人工染色体。可选的，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制的载体。

在载体中，DNA序列应该与合适的启动子序列有效连接。启动子可以是任何DNA序列，在选择的宿主细胞中表现出转录活性，并可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指导编码本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体的DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中转录的合适的启动子的实例是大肠杆菌的lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪地芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、淀粉酶芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有效的启动子的实例是源自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因。

表达载体还可以包括与编码本发明组合物和方法的α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的合适的转录终止子，和在真核细胞中的多聚腺苷酸化序列。终止子和聚腺苷酸化序列可以适当的源自启动子相同的来源。

载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可以包括选择性标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性的基因，例如青霉素、卡那霉素、新霉素或四环素抗性。此外，载体可以包括曲霉选择标记，例如amdS、argB、niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或可以通过共同转化实现的选择，例如WO 91/17243中所述。

虽然在一些方面细胞内表达是有利的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时，但表达一般优选的是胞外的。一般而言，本文提及的芽孢杆菌α-淀粉酶包括允许所表达的蛋白酶分泌到培养基中的前原区或信号序列。如果需要，可以用不同的前原区或信号序列替换该前原区，通过编码各种前原区的DNA序列取代方便的实现。

本领域技术人员公知用于分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的方案，和将其插入到含有复制必需信息的合适载体中的方案(参见例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)。

包含DNA构建体或表达载体的细胞有利的用作重组产生α-淀粉酶变体的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一份或多份拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便的用编码该变体的本发明组合物和方法的DNA构建体来转化细胞。该整合一般被认为是有利的，因为DNA序列更易于稳定的维持在细胞中。可以根据常规方法，例如同源或异源重组，实施DNA构建体向宿主染色体中的整合。可选的，对于不同类型的宿主细胞，可以如上所述用表达载体转化细胞。细胞可以是高等生物的细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。

合适的细菌的实例是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。可以例如通过原生质体转化或使用感受态细胞，以本身已知的方式来实现细菌的转化。

可以有利的从酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)中选择酵母生物体，例如酿酒酵母。丝状真菌可以有利的属于曲霉属，例如米曲霉或黑曲霉。可以以本身已知的方式，用涉及原生质体形成和原生质体转化，之后再生细胞壁的方法，来转化真菌细胞。转化曲霉宿主细胞的合适方案描述在EP 238023中。

用于培养细胞的培养基可以是适合所讨论的宿主细胞生长和获得α-淀粉酶变体表达的任何常规培养基。合适的培养基可获得自商业供应商，或者可根据公开的配方制备(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)。

可以通过公知的方案从培养基中回收宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体，包括通过离心或过滤将细胞与培养基分离，和通过盐(如硫酸铵)的手段，沉淀培养基的蛋白质组分，再使用层析程序，例如离子交换层析、亲和层析等。

3.工业应用

本发明的α-淀粉酶变体具有可用于多种工业应用的有优势的性质。特别是，该酶变体可用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁去污剂组合物的成分。

该变体还可以用于淀粉加工，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见，例如美国专利3,912,590、欧洲专利申请252730和63909、WO 99/19467和WO 96/28567，此处所有的参考文献均通过引入本文作为参考)。还涉及淀粉转化目的的组合物，其除了本发明组合物和方法的变体，还包括葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和其他α-淀粉酶。

该变体还可以用于甜味剂和乙醇的产生中(参见例如通过引入本文作为参考的美国专利5,231,017)，例如从淀粉或整个谷物产生燃料乙醇、或饮用乙醇/工业乙醇。一个实例是发酵醪产生或酿造。

该变体还可以用于纺织品、织物和衣物的退浆(参见例如通过引入本文作为参考的WO 95/21247、美国专利4,643,736和EP 119,920)；以及纸浆和纸的产生。

3.1淀粉转化

常规的淀粉转化过程，例如液化和糖化过程记载于通过引入本文作为参考的例如美国专利3,912,590和欧洲专利公开252,730和63,909。降解淀粉为较低分子量的糖类成分(如糖或脂肪取代物)的淀粉转化过程包括脱支化步骤。

3.2淀粉向糖的转化

在淀粉向糖的转化的情况下，解聚淀粉。这种解聚过程可由预处理步骤和两个或三个连续步骤组成，例如液化步骤、糖化步骤，和取决于目的终点产物的可选的异构化过程。

3.3天然淀粉的预处理

天然淀粉由微观颗粒组成，其在室温下不溶于水。当加热水性淀粉料浆时，颗粒溶胀并最终破裂，向溶液中释放淀粉分子。在此“糊化”过程中，粘度会急剧升高。由于在典型的工业过程中，固体水平是30-40％，因此淀粉不得不薄化或“液化”以使其能够操作。目前这种粘度的降低大部分通过酶促降解来得到。

3.4液化

在液化步骤中，长链淀粉分子被α-淀粉酶降解成较短支链和直链的分子(麦芽糊精)。液化过程通常在105-110℃进行5-10分钟，然后在95℃，pH值在5.5-6.2之间进行1-2小时。为了在这些条件下保证最优的酶稳定性，通常加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。该处理以后，液化的淀粉会具有约10-15的“葡萄糖当量”(DE)。

3.5糖化

液化步骤后，通过添加葡糖淀粉酶(例如

L-400)和脱支酶(如异淀粉酶(美国专利4,335,208)或支链淀粉酶，将麦芽糊精转换为葡萄糖。在此步骤之前，将pH降至低于4.5的值，维持高温(高于95℃)以使液化α-淀粉酶失活，以降低称作“潘糖前体”的短链寡糖的形成，这种短链寡糖不能被分支酶正确水解。使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤进行24-72小时。

通常，当液化步骤后变性α-淀粉酶时，大约0.2-0.5％的糖化产物是分支的三糖，Glc pα1-6Glc pα1-4Glc(潘糖)，其不能被支链淀粉酶降解。如果来自液化步骤的活性淀粉酶在糖化作用中存在，即没有变性，这种糖的水平可高至1-2％，这是非常不想要的结果，因为这会大大降低糖化作用的产率。

3.6异构化

当所需的最终糖产品是例如高果糖糖浆时，葡萄糖糖浆可以转化为果糖。糖化过程之后，pH升高到6-8范围内，优选pH7.5，通过离子交换除去钙。葡萄糖糖浆然后用例如固定化的葡萄糖异构酶(例如

IGI-HF)转化为高果糖糖浆。

3.7乙醇生产

通常从全谷物产生乙醇可分为如下四个主要步骤：研磨；液化；糖化和发酵。

3.7.1研磨

碾磨谷粒打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用的两种碾磨方法是湿磨法或干磨法。在干磨法中，碾磨整个核和在该方法的剩下部分中使用。湿磨法提供胚芽和粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且，除少数例外外，在平行进行糖浆产生时使用这种方法。

3.7.2液化

在该液化过程中，通过水解将淀粉颗粒溶解为大部分具有高于4的DP的麦芽糊精。水解可以通过酸处理或用α-淀粉酶酶处理进行。酸水解用于有限的基质上。原料可以是研磨的整粒谷物或淀粉加工的侧流(副产物)。

酶促液化通常作为三步热料浆过程进行。料浆加热到60-95℃，优选80-85℃，加入酶。然后在95-140℃，优选105-125℃喷射蒸煮该料浆，冷却至60-95℃，加入更多的酶，得到最终水解。液化过程在pH4.5-6.5下进行，通常在5和6之间的pH下进行。研磨的和液化的谷物也称作醪液。

3.7.3糖化

为了产生可以被酵母菌代谢的低分子糖DP_1-3，液化中产生的麦芽糊精必须进一步水解。通常，水解通过酶促进行，通过葡糖淀粉酶，也可使用备选的α-糖苷酶或酸性α-淀粉酶。完全糖化步骤可以持续至多72小时，但是，通常仅仅进行一般40-90分钟的预糖化，然后在发酵中完全糖化(SSF)。通常在30-65℃进行糖化，一般为60℃左右，pH4.5。

3.7.4发酵

通常将来自酵母菌属物种的酵母加入到醪液中，发酵24-96小时，例如通常35-60小时。温度在26-34℃之间，通常约32℃，pH为pH3-6，优选约pH4-5。

注意到，广泛应用的方法是同时糖化和发酵(SSF)的方法，其中没有糖化的保持期，意味着酵母和酶一起加入。当进行SSF时，通常就在发酵之前在高于50℃的温度下引入预糖化步骤。

可同时或分开执行糖化和发酵步骤。

3.8蒸馏

发酵之后，蒸馏醪液以提取乙醇。根据该方法得到的乙醇可用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用中性酒精饮料；或工业乙醇。

3.9副产物

发酵剩下的谷物通常以液体或干燥形式用作动物饲料。如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的进一步的细节为本领域技术人员所公知。

3.10纸浆和纸生产

本发明的α-淀粉酶也可用于从淀粉强化的废纸和卡纸板产生木质纤维素材料，例如纸浆、纸和卡纸板，特别是当在7以上的pH下进行再次制浆时，淀粉酶通过该强化淀粉的降解促进了废料的分解。α-淀粉酶特别用于从淀粉涂层的印刷纸制备造纸纸浆的方法。该方法可以如WO 95/14807所述进行，包括下列步骤：

a)分解纸，产生纸浆；

b)在a)步骤之前、过程中或之后用淀粉降解酶处理；和

C)在a)和b)步骤之后从纸浆中分离墨水颗粒。

α-淀粉酶也可用于改性淀粉，酶促改性的淀粉与碱性填料如碳酸钙、高岭土和粘土用于造纸中。用本发明组合物和方法的α-淀粉酶，有可能在填料存在下改性淀粉，从而可以得到更简单的整合方法。

3.11纺织品、织物和衣物的退浆

本发明的α-淀粉酶也可以用于纺织品、织物或衣物的退浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶通常用作退浆过程中的辅剂，以促进含淀粉浆料的去除，该浆料在纺织过程中作为纱线上的保护性涂层起作用。纺织以后的浆料涂层的完全去除对于保证后续过程的最优结果非常重要，后续过程中织物被洗涤、漂白和染色。优选酶促淀粉分解，因为这不会对织物材料造成任何有害效果。为了减少加工成本和增加研磨处理量，退浆过程有时候与洗涤和漂白步骤联合进行。在这种情况下，非酶促助剂，如碱或氧化剂通常用来分解淀粉，因为经典的α-淀粉酶非常不适用于高pH值和漂白剂。淀粉浆料的非酶促分解会导致一些纤维破坏，因为使用了更加具有攻击性的化学品。所以，使用本发明的组合物和方法的α-淀粉酶变体将是理想的，因为它们在碱溶液中具有改善的性能。α-淀粉酶可以单独使用，或当退浆含纤维素的织物或纺织品时与纤维素酶联合使用。

退浆和漂白过程为本领域所公知。例如，该过程记载于WO95/21247，U.S.Pat.No.4,643,736和EP 119,920中，其通过引入本文作为参考，用于退浆的市售产品包括Genencor的

FLEX。

本发明还涉及使用一种或多种本发明α-淀粉酶变体处理织物(例如纺织品退浆)的组合物和方法。本领域公知，该酶可用于任何织物处理方法中，参见例如美国专利6,077,316。例如，一方面，用包括将织物与α-淀粉酶溶液接触的方法改善织物的触感和外观。一方面，在压力下用该溶液处理织物。

一方面，在纺织品纺织过程中或之后，或在退浆阶段，或一个或多个另外的织物加工步骤中使用该酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，经纱通常涂上浆料淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施用酶以除去这些浆料淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入退浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。本文还提供了包括通过α-淀粉酶的作用来酶促水解上述浆料的退浆方法。

该酶可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作为去污剂添加剂，在例如水性组合物中，使织物(包括含棉织物)退浆。α-淀粉酶也可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为产生衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理。特别是，为产生粗斜棉布牛仔服(denim jeans)，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。该酶可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退浆及为织物提供柔软度，和/或整理的方法中。淀粉酶的剂量随着方法类型而改变。较小剂量与较大剂量的同样酶相比，会需要更多的时间。然而，退浆淀粉酶存在的量没有上限，除了受溶液的物理约束控制。因此，酶的限度可以是能够溶解于溶液中的量。通常，退浆酶，例如α-淀粉酶，以织物的重量计，约0.00001％至约2％酶蛋白的量加入到处理组合物中；或以织物的重量计，约0.0001％至约1％酶蛋白的量加入到处理组合物中；或以织物的重量计，约0.001％至约0.5％酶蛋白的量加入到处理组合物中，在另一实例中，以织物的重量计，可以是约0.01％至约0.2％酶蛋白的量。

3.12发酵醪的产生

如上文所述，本发明的α-淀粉酶也可用于发酵醪产生过程中，其中在淀粉糖化过程中加入酶。

3.13去污剂组合物

本发明α-淀粉酶可以加入并由此成为去污剂组合物的成分。去污剂组合物可以配制成手洗或机洗的衣物去污剂组合物，适于预处理污染的织物的衣物添加剂组合物、漂洗添加的织物柔软剂组合物，用于一般的家居硬表面清洁操作的去污剂组合物，手洗或机洗的餐具洗涤组合物。

在一个实施方案中，提供了包括本文所述变体酶的去污剂添加剂。该去污剂添加剂和去污剂组合物可包含一种或多种其他酶，例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解的酶(例如另一种α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、CGT酶和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(如购自Danisco U.S.A.Inc.，Genencor Division的MANNASTAR^TM)、果胶酶、胶质裂合酶、角质酶和/或漆酶。

通常，所选酶的特性应与选择的去污剂兼容(即最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且该酶应以有效量存在。

蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性的微生物蛋白酶或胰蛋白酶样的蛋白酶或糜蛋白酶样的蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是来源于杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(记载于例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)，和记载于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例还包括但不限于美国专利RE 34,606、5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，美国专利公开号2008/0090747，以及国际专利公开号WO98/23732、WO99/20770、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 98/34946、WO95/23221、WO 92/21760和WO89/06270中记载的变体，特别是具有下列位置中一个或多个取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

示例性市售蛋白酶包括

DURAZYM^TM、

和

(购自Novozymes A/S)、

MAXACAL、

PURAFECT

和

PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM和PURAFAST^TM(购自Genencor)和BLAP^TM(购自Henkel Kommanditgesellschaft aufAktien，Duesseldorf，德国)。

在一些其他实施方案中，发现金属蛋白酶在本发明中的用途，包括但不限于WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。

脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属(Thermomyces)同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见EP 258068和EP 305216)或来自特异腐质霉(H.insolens)(如WO 96/13580所述)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种菌株SD 705(WO 95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人，(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131：253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。其他可以考虑在制剂中使用的示例性脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。市售脂肪酶包括LIPOLASE^TM和LIPOLASE ULTRA^TM(Novozymes，A/S)

聚酯酶：适宜的聚酯酶可以包含在组合物中。适宜的聚酯酶包括例如WO 01/34899和WO 01/14629中记载的那些。

淀粉酶：也可包括一种或多种其他淀粉酶(除此处所述的淀粉酶变体之外)。适宜的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌来源的淀粉酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括，例如，来自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更具体描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株。有用的α-淀粉酶的实例是在WO94/18314、WO 96/39528、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别是在下列位置中的一个或多个上有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售α-淀粉酶是DURAMYL^TM、LlQUEZYME^TM TERMAMYL^TM、NATALASE^TM、STAINZYME^TM PLUS、STAINZYME^TMULTRA、FUNGAMYL^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM(购自Genencor)。

纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。适宜的纤维素酶包括但不限于来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No.4,435,307；美国专利No.5,648,263；美国专利No.5,691,178；美国专利No.5,776,757和WO 89/09259公开的特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。里氏木霉纤维素酶的实例公开于美国专利4,689,297、美国专利No.5,814,501和美国专利No.5,324,649，以及WO 92/06221和WO92/06165中。示例性芽孢杆菌属纤维素酶公开于美国专利6,562,612中。市售纤维素酶包括

和

(NovozymesA/S)，

和

(Genencor International Inc.)和

(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：适宜的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。市售过氧化物酶包括

(Novozymes A/S)。

可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合的添加剂而在去污剂组合物中包括去污剂酶。可以将本发明的组合物和发明中的去污剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配成例如颗粒、液体、料浆等。优选去污剂添加剂制剂是：颗粒型的，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化的液体；或料浆。

可例如按照美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来产生无粉尘颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如GB 1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。

通常，去污剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、颗粒、糊或液体。液体去污剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。浓缩去污剂凝胶含有例如约30％或更少的水。

Persil，

2X coldwater和Ariel是本文所用的示例性去污剂，以测试示例性α-淀粉酶变体。本发明的α-淀粉酶变体不限于示例性组合物，因为预期它们对更广泛通用清洁组合物的出现起作用。

去污剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂一般按以重量计0.1％-60％的水平存在。在含有阴离子和非离子表面活性剂的去污剂中测试示例性α-淀粉酶变体。本文所述α-淀粉酶变体预期在含有其他在去污剂中通用的表面活性剂的组合物中具有活性。

当包括在去污剂中时，去污剂通常将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。

当包括在去污剂中时，去污剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

去污剂可含有0％-65％的去污剂增效剂或络合剂(complexingagent)，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

去污剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去污剂可含有漂白系统，这可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸盐)联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统。参见例如WO05/056782。

可使用常规的稳定剂来稳定本发明组合物和方法的去污剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)，可按照WO 92/19709和WO 92/19708所述配制该组合物。

去污剂也可含有其他常规去污剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光发光剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂或香料。

本发明α-淀粉酶可以按相当于每升洗液约0.01至约100mg酶蛋白质(例如每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质，或每升洗液约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。

本发明α-淀粉酶可另外加入到WO 97/07202所公开的去污剂制剂中，WO 97/07202通过引用而合并于此。

4.组合物和用途

本发明α-淀粉酶也可以用于与去污剂组合物和清洁有关的方法中，特别是衣物去污剂组合物；餐具去污剂组合物；硬表面清洁组合物；纺织品、织物或衣物退浆组合物；用于产生纸浆和纸、发酵醪产生、乙醇生产淀粉转化过程中的组合物等。

4.1衣物去污剂组合物和用途

本发明α-淀粉酶组合物和方法的一实施方案为衣物去污剂组合物及其使用方法。去污剂组合物可以是无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式。干燥的制剂可以是颗粒或微颗粒的形式。可以例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开的那样来产生无粉尘颗粒，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔质量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单酰甘油和二酰甘油及三酰甘油。例如英国专利1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其他酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如欧洲申请No.238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解性。参见，例如J.K.Kaushik等人，J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及Monica Conti等人，J.Chromatography757：237-245(1997)。

该组合物可包括本发明淀粉酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。备选地，该组合物可包括多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及下述其他酶。其他酶可通过属于如下属的微生物产生：曲霉属、木霉属、腐质酶属(例如特异腐质霉(H.insolens))和镰孢菌(霉)属(Fusarium)。曲霉属的示例性成员包括棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。镰孢霉属的示例性成员包括杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundinis)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)或Fusarium venenatum。

去污剂组合物可以是任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊状或液体。液体去污剂可以是水性的，通常含有至多约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。还可以是仅仅包含大约30％水的浓缩凝胶形式的去污剂组合物。酶可以用于与酶的稳定性相容的任何去污剂组合物中。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害组分。酶和尤其是α-淀粉酶不局限于洗衣和餐具洗涤应用，还可以用于表面清洁剂以及用于由淀粉或生物质产生乙醇。

去污剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。去污剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO92/06154中所述)。

去污剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶的任何组合。如上所述。

去污剂可任选地含有约1％至约65％的去污剂增效剂或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸酯、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。去污剂也可以是无增效剂的，即基本上不含去污剂增效剂。

去污剂可任选地包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去污剂可任选地含有漂白系统，可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS))联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统，其中过水解酶活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。

可使用常规的稳定剂来稳定去污剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)。可按照WO 92/19709和WO 92/19708所述配制该组合物。

去污剂也可含有其他常规去污剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光发光剂或香料。

pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

包含α-淀粉酶变体的去污剂组合物可配制成的具体形式包括：

1)具有体积密度(bulk density)为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光发光剂、光漂白剂)。

2)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

3)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的磷酸酯(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光发光剂)。

4)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

5)水性液体去污剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的磷酸酯；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光发光剂)。

6)水性结构型液体去污剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25：1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0％至5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光发光剂)。

7)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如荧光发光剂，抑泡剂、香料)。

8)颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来自丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

9)颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如，荧光发光剂、香料)。

10)水性液体去污剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶增溶剂(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光发光剂)。

11)水性液体去污剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如水溶增溶剂、分散剂、香料、荧光发光剂)。

12)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO₃·4H₂O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至3％的次要成分(例如香料、荧光发光剂)。

13)如上面组合物1)-12)所述的去污剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

14)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至5％的次要成分(例如荧光发光剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。

15)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的去污剂组合物，包括约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0至3％的次要成分(例如荧光发光剂、磷酸盐、香料)。

(16)上面1)-15)所述的去污剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白系统的替代物。

17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的去污剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的去污剂组合物，还含有锰催化剂。例如锰催化剂是Hage等人，Nature 369：637-639(1994)中记载的化合物中的一种。

19)配制成非水性去污剂液体的去污剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、增效剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该去污剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

可以以常规用于去污剂中的浓度加入一种或多种本发明α-淀粉酶。目前考虑在去污剂组合物中，可以以每升洗液对应0.00001-1.0mg(以纯酶蛋白质计算)酶的量加入α-淀粉酶或其变体。

在另一实施方案中，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入去污剂组合物中并用于家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。

例如，可以将去污剂组合物配制成手洗或机洗的衣物去污剂组合物，包括适于预处理污染的织物的衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的去污剂组合物，或者配制以用于手洗或机洗的衣物洗涤操作。

一个具体的方面，去污剂组合物可以进一步包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，除一种或多种本发明α-淀粉酶变体之外的一种或多种附加α-淀粉酶，和一种或多种其他清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。

通常，所选酶的特性应与选择的去污剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且该酶应以有效量存在。

4.2餐具去污剂组合物

本发明的α-淀粉酶也可用于餐具去污剂组合物中，包括下列例子：

1)粉末状自动餐具洗涤组合物

2)粉末状自动餐具洗涤组合物

3)粉末状自动餐具洗涤组合物

4)粉末状自动餐具洗涤组合物

5)粉末状自动餐具洗涤组合物

6)具有清洁表面活性剂系统的粉末和液体餐具洗涤组合物

7)非水性液体自动餐具洗涤组合物

8)非水性液体餐具洗涤组合物

9)触变性液体自动餐具洗涤组合物

10)液体自动餐具洗涤组合物

11)含有保护的漂白颗粒的液体自动餐具洗涤组合物

11)上面1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自动餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

12)上述1)-6)的自动餐具洗涤组合物，进一步包含锰催化剂。该锰催化剂可以是例如Hage等人，Nature 369：637-639(1994)中记载的化合物中的一种。

4.3生物膜去除组合物和用途

在另一实施方案中，提供了用于除去或分解生物膜的组合物，包括一种或多种本发明α-淀粉酶。该组合物可包括一种或多种本发明α-淀粉酶作为唯一酶活性，使其成为用于除去或分解生物膜的单组分组合物。或者，该组合物可以包括多种酶活性，例如多种淀粉酶，或者包括下列酶任意组合的酶混合物：氨肽酶、淀粉酶(β-或α-或葡糖淀粉酶)、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意组合，用于去除生物膜。具体酶是2，6-β-D-果聚糖水解酶。其他酶可通过属于如下属的微生物产生：曲霉属、木霉属、腐质酶属(例如特异腐质霉)和镰孢菌(霉)属。曲霉的示例性实例包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。镰孢霉属的实例包括杆孢状镰孢、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、F.toruloseum、拟丝孢镰孢和Fusarium venenatum。

生物膜的去除或分解组合物可以是液体或干组合物的形式。例如，α-淀粉酶可以是颗粒或微颗粒的形式或可以按照本领域已知的方法稳定化。生物膜通常存在于表面，故生物膜的分解可以通过用含有一种或多种本发明α-淀粉酶的水性介质接触表面(例如通过浸没、覆盖或喷洒表面)而实现。组合物可用于水解例如制浆和造纸工业白水中的淀渣(slime)。

α-淀粉酶的存在量可以是0.0001-10,000mg/L、0.001-1000mg/L、0.01-100mg/L、或是0.1-10mg/L。其他酶及酶变体可以以相似或更低的量存在。

该方法可以适宜地在室温至约70℃的温度进行。适宜的温度范围包括约30℃至约60℃，例如约40℃至约50℃。

用于水解生物膜的适宜pH处在约3.5至约8.5的范围内。示例性pH范围包括pH约5.5至约8，例如约6.5至约7.5。用于酶有效去除生物膜的接触时间或反应时间可以变化相当大，这取决于生物膜的特性以及用酶单独或组合其他生物膜降解酶处理表面的频率。示例性的反应时间包括约0.25至约25小时内，以及约1至约10小时，例如约2小时。

α-淀粉酶还可以与抗微生物剂组合，例如酶的或非酶的杀生物剂。酶杀生物剂可以是例如包括氧化还原酶，例如漆酶或过氧化物酶，特别是卤代过氧化物酶，和任选的增强剂，例如丁香酸烷基酯的组合物，例如国际PCT中请WO 97/42825和DK 97/1273中所描述的那样。

可以去除和/或清除生物膜的表面可以是硬表面，其定义涉及基本上微生物不能透过的任何表面。表面的实例是由金属例如不锈钢合金、塑料/合成聚合物、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、大理石、石膏及陶瓷材料制成的表面，其任选地以例如油漆、珐琅、聚合物等包覆。从而，表面可以是支持、运输、处理或接触水性溶液的系统(如供水系统、食品处理系统、冷却系统、化学处理系统或药物处理系统)的构件。该组合物和使用该组合物的方法用于木材加工系统(如制浆和/或造纸工业)中除去生物膜。因此，酶和含有酶的组合物可用于常规的就地清洗(C-I-P)系统。表面可以是系统单元(如管道、罐、泵、膜、滤器、热交换器、离心机、蒸发器、混合器、喷雾塔、阀门和反应器)的一部分。表面也可以是医学科学和工业所用的器具(如污染的内窥镜、假体装置或医学内植物)或其部分。

用于生物膜去除的组合物也可以考虑用于防止当金属表面例如管道受微生物生物膜攻击时发生的所谓生物腐蚀，即通过分解生物膜，由此防止生物膜中的微生物细胞建立起腐蚀其所附着的金属表面的生物膜环境。

抗生物膜组合物的其他应用包含口腔护理。然而表面也可以是生物来源的，例如粘膜、皮肤、牙齿、头发、指甲等。

例如，表面包含具有牙菌斑的牙齿(例如通过将酶加入到牙膏中)和污染的隐形眼镜。因此，一种或多种本发明α-淀粉酶可用在组合物中和用于制备分解人或动物牙齿菌斑的药物的方法中。另一用途是自粘膜分解生物膜，例如患有囊性纤维化的患者肺中的生物膜。

因此，本发明进一步的方面涉及口腔护理组合物，包含重组的酶，例如基本不含任何活性污染物的纯化的酶。口腔护理组合物可适当包含一定量的重组酶。

用于口腔护理组合物的其他生物膜降解酶包括但不限于口腔护理组合物中的2，6-β-D-果聚糖水解酶活性。考虑的酶活性包括下组酶中的活性：葡聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanase)；氧化酶，例如葡糖氧化酶，L-氨基酸氧化酶，过氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼伞属物种(Coprinus sp.)过氧化物酶或乳过氧化物酶，卤代过氧化物酶，特别是衍生自弯孢霉属物种(Curvularia sp.)、特别是糙壁弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis)的卤代过氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶(例如WO 95/02044中所述的酸性蛋白酶)，内切糖苷酶，脂肪酶，淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG(Novo Nordisk A/S)；抗微生物酶，以及它们的混合物。

口腔护理组合物可以具有任何适宜的物理形式(即，粉末、糊、凝胶、液体、膏、片等)。“口腔护理组合物”包括可用于维持或改善人和动物口中口腔卫生的组合物，预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙垢、预防和/或治疗牙科疾病等。口腔护理组合物的上下文中至少也包括用于清洁假牙、人工牙齿等的产品。口腔护理组合物的实例包括牙膏、牙霜、凝胶或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的漱洗制剂、口香糖、锭剂和糖果。牙膏和牙凝胶一般包括磨擦抛光材料、发泡剂、矫味剂、保湿剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/去渍剂、水和任选的另外的酶和酶组合。

漱口水，包括菌斑去除液体，一般包括水/醇溶液、香料、保湿剂、甜味剂、发泡剂、着色剂和任选的另外的酶或酶组合。

磨擦抛光材料也可以掺入到口腔护理组合物例如牙粉中。磨擦抛光材料可以包括氧化铝及其水合物，例如三水合α-氧化铝(αaluminatrihydrate)；三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如煅烧硅酸铝和硅酸铝；碳酸钙；硅酸锆；还有粉状塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛树脂；蜜胺甲醛树脂；脲甲醛树脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；氧化硅干凝胶；水凝胶和气凝胶等。同样适合作为磨料的有焦磷酸钙；水不溶性碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/或其二水合物，正磷酸二钙；磷酸三钙；羟基磷灰石颗粒等。还可以采用这些物质的混合物。

根据口腔护理组合物的不同，磨擦产品可以以重量计约0％至约70％，或约1％至约70％存在。对于牙膏，磨料含量一般处于以最终牙膏重量计10％-70％的范围内。

采用保湿剂以防止例如牙膏的水分流失。适合用于口腔护理组合物的保湿剂包括如下化合物及其混合物：甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等。保湿剂一般以重量计0％至约80％，或约5％至约70％存在于牙膏中。

二氧化硅、淀粉、黄芪胶、黄原胶、爱尔兰苔(Irish moss)提取物、藻酸盐、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素钠；聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮是帮助稳定牙粉产品的适合的增稠剂和粘合剂的实例。增稠剂在牙膏乳剂和凝胶中的存在量可以是以终产品重量计约0.1％至约20％，而粘合剂达到约0.01至约10％的程度。

可以使用阴离子、阳离子、非离子、兼性和/或两性离子表面活性剂作为发泡剂皂。这些可以以终产品重量计0％至约15％、约0.1至约13％或约0.25％至约10％的水平存在。

表面活性剂在其不对α-淀粉酶施加失活效应的程度上是适宜的。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，磺化单酰甘油或具10-20个碳原子的脂肪酸的盐，脂肪酸-清蛋白缩合产物，脂肪酸酰胺和牛磺酸的盐和/或脂肪酸羟乙基磺酸酯的盐。

适宜的甜味剂包括制剂用糖精。香料例如留兰香通常以低含量存在，例如以重量计约0.01％至约5％，尤其是约0.1％至约5％。增白剂/漂白剂包括H₂O₂，且可以以终产品重量计低于约5％，或约0.25％至约4％的量添加。增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适宜的牙齿漂白酶的实例为例如WO 97/06775中描述的那些。

水通常以赋予例如牙膏可流动形式的量添加。也可以包括其他水溶性抗菌剂，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶(hexetidine)，双胍啶(alexidine)，三氯生

季铵抗菌化合物，以及水溶性的某些金属离子源，例如锌、铜、银和锡源(例如，氯化锌、氯化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)。

也可以加入能够用作为氟化物源、色素/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、防龋剂、脱敏剂等的化合物。

当生物膜降解酶用于清洁口腔时可提供若干益处。蛋白酶降解唾液蛋白质，这些蛋白质吸附在牙齿表面并形成薄膜(pellicle)，即所致菌斑的第一层。蛋白酶连同脂肪酶一起通过裂解构成细菌细胞壁和膜的结构组分的蛋白质和脂质而破坏细菌。

葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶降解细菌所产生的形成细菌粘附基质的有机主链结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑形成，而且还可以通过降解结合钙的糖类-蛋白质复合物防止矿化，从而阻止牙垢发展。

牙膏一般可以包括如下成分(以最终牙膏组合物的重量百分比计)：磨料至约70％；保湿剂：0％至约80％；增稠剂：约0.1％至约20％；粘合剂：约0.01％至约10％；甜味剂：约0.1％至约5％；发泡剂：0％至约15％；增白剂：0％至约5％；和酶：约0.0001％至约20％。

在一个具体实施方式中，牙膏具有在约6.0至约8.0范围内的pH，且包括：a)约10％至约70％的磨料；b)0％至约80％的保湿剂；c)0.1％至约20％的增稠剂；d)0.01％至约10％的粘合剂；e)约0.1％至约5％的甜味剂；f)0％至约15％的发泡剂；g)0％至约5％的增白剂和i)约0.0001％至约20％的酶。

i)中涉及的酶包括α-淀粉酶变体，单独或组合其他生物膜降解酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶，和任选地已知用于牙膏中的上述其他类型的酶等。

漱口剂一般可以包括如下成分(以最终漱口剂组合物的重量百分比计)：0％至约20％的保湿剂；0％至约2％的表面活性剂；0％至约5％的酶；0％至约20％的乙醇；0％至约2％的其他成分(例如香料，甜味剂活性成分，如氟化物)。组合物还可以含有约0％至约70％的水。

漱口剂组合物可以用适当的缓冲剂进行缓冲，例如pH约6.0至约7.5的柠檬酸钠或磷酸钠。漱口剂可以是非稀释的形式(即，用前必须稀释)。

口腔护理组合物可以利用任何口腔护理领域已知的常规方法来产生。

4.4淀粉加工组合物和用途

另一方面，包含本发明α-淀粉酶的组合物可用于淀粉液化或糖化。

在一实施方案中，该组合物用于从淀粉制备甜味剂。将淀粉转换为果糖糖浆的“传统”方法通常包括三个连续的酶促步骤：即液化步骤，之后为糖化步骤以及异构化步骤。在液化步骤中，在约5.5至约6.2的pH值、约95℃至约160℃的温度，通过为期约2个小时的α-淀粉酶作用，使淀粉降解为糊精。为了在这些条件下保证最优的酶稳定性，加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。淀粉加工用于产生醇(例如谷物液化为燃料或可饮用的醇、醇的酿造)，淀粉液化可用于甜味剂生产、蔗糖加工和其他食品相关的淀粉加工目的。其他条件可用于不同的α-淀粉酶或其变体。

液化步骤后，可以通过添加葡糖淀粉酶(例如AMG^TM)和脱支酶(如异淀粉酶或支链淀粉酶(例如

))，将糊精转换为葡萄糖。在此步骤之前，将pH降至低于约4.5的值，维持高温(高于95℃)，并使液化α-淀粉酶的活性变性。使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤通常进行约24至约72小时。

糖化步骤之后，将pH升至处于约6.0至约8.0范围的值(例如pH7.5)，并通过离子交换除去钙。然后利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如

)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。

在一实施方案中，该组合物和方法涉及液化α-淀粉酶降低的钙依赖。游离的钙的加入是充分确保α-淀粉酶的稳定性所需的；但是游离的钙强烈抑制葡萄糖异构酶的活性，并且需要利用昂贵的单元操作除去钙，达到游离钙的水平降至低于3-5ppm的程度。如果能够避免这样的操作，且液化步骤无需添加游离钙离子即能进行，则可以获得费用的节约。

可在组合物和操作中利用具有降低的钙依赖性的α-淀粉酶，其在低浓度游离钙(＜40ppm)时稳定且具有活性。这样的α-淀粉酶或其变体应当具有位于pH范围约4.5至约6.5中，或者在范围约4.5至约5.5中的最适pH。

在实验室中和工业设置中，一种或多种本发明α-淀粉酶可用于水解用于各种目的的淀粉或任何含麦芽糊精(maltodextrine)的化合物。该α-淀粉酶或可单独使用以提供特异性水解，或者与其他淀粉酶组合提供具有广谱活性的混合物。示例性应用包括从生物样品、食品、动物饲料、药物或工业样品中除去或部分或完全水解淀粉或任何含麦芽糊精的化合物。

一种或多种本发明α-淀粉酶可用于发酵过程，其中淀粉底物液化和/或糖化，以产生葡萄糖和/或麦芽糖，其适于由发酵微生物如酵母菌转化为发酵产物。这样的发酵过程包括生成用作燃料的乙醇或饮用乙醇(可饮用乙醇)的过程，产生饮料的过程、产生所需有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠)、酮类、氨基酸(如谷氨酸、谷氨酸单钠)、以及难以合成制备的更复杂的化合物(例如青霉素、四环素等抗生素)、酶、维生素(例如核黄素、维生素B₁₂、β-胡萝卜素)和激素)的过程。

待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。或者，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材料，其含有碾磨过的整个谷粒，包括非淀粉级分如胚残留物和纤维。碾磨原料如整个谷粒以打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用两种碾磨方法：湿磨法和干磨法。此外，可以使用玉米渣如碾磨过的玉米渣。

干磨的谷粒除淀粉外还将包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷射蒸煮加工这样的异质原料时，仅能实现淀粉的部分糊化。由于本发明α-淀粉酶对未糊化的淀粉具有高活性，它们应用在包括液化和/或糖化喷射蒸煮的干磨淀粉的方法中具有优势。

并且，由于本发明α-淀粉酶的优良水解活性，糖化步骤中对葡糖淀粉酶的需求也得到了极大降低，使得糖化可以在非常低水平的葡糖淀粉酶活性下进行。葡糖淀粉酶活性或者不存在，或者以不超过或甚至低于0.5AGU/gDS、或不超过或甚至低于0.4AGU/g DS、或不超过或甚至低于约0.3AGU/g DS、或者低于0.1AGU，例如不超过或甚至低于0.05AGU/g DS淀粉底物的量存在。“DS”是加入每克干固形底物的酶单位。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超过或甚至低于约0.5mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.4mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.3mg EP/g DS，或者不超过或甚至低于约0.1mg EP/g DS(例如不超过或甚至低于约0.05mg EP/g DS或者不超过或甚至低于0.02mg EP/g DS的淀粉底物)的量存在。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属物种、篮状菌属物种(Talaromyces spp.)、大纹饰孢属物种(Pachykytospora spp.)或栓菌属物种(Trametes spp.)，其中示例性的实例为黑曲霉(Aspergillus niger)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、瓣环栓菌(Trametes cingulata)和纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)。

该方法可包括a)将淀粉底物与一种或多种本发明α-淀粉酶接触，其包含具有α-淀粉酶活性的催化组件和糖类结合组件，例如第一方面中所述的多肽；b)将该淀粉底物与该酶在一定温度下孵育一段时间，在此条件下足以将至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至至少99.5％w/w的该淀粉底物转化为可发酵的糖；c)发酵，以产生发酵产物；和d)可选地回收发酵产物。在该方法的步骤b)和/或c)中，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以0.001-2.0AGU/g DS、0.01-1.5AGU/g DS、0.05-1.0AGU/g DS、0.01-0.5AGU/gDS的量存在。具有葡糖淀粉酶活性的酶可以或者不存在，或者以不超过或甚至低于0.5AGU/g DS、或不超过或甚至低于0.4AGU/g DS、或不超过或甚至低于0.3AGU/g DS、或者不超过甚至低于0.1AGU/g DS(例如不超过或甚至低于0.05AGU/g DS的淀粉底物)的量存在。酶蛋白以mg表示，具有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者以不超过或甚至低于0.5mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.4mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.3mgEP/g DS，或者不超过或甚至低于0.1mgEP/g DS(例如不超过或甚至低于0.05mgEP/g DS或者不超过或甚至低于0.02mgEP/g DS的淀粉底物)的量存在。在该方法中，步骤a)、b)、c)和/或d)可以单独执行或者同时执行。

在一些实施方案中，该方法包括：a)将淀粉底物与转化后表达一种或多种本发明α-淀粉酶的酵母接触，该α-淀粉酶包含具有α-淀粉酶活性的催化组件和糖类结合组件；b)将该淀粉底物与该酵母在一定温度下孵育一段时间，在此条件下足以将至少90％w/w的该淀粉底物转化为可发酵的糖；c)发酵，以产生乙醇；和d)可选地回收乙醇。步骤a)、b)和c)可以单独执行或者同时执行。

在一些实施方案中，该方法包括水解糊化的浆液或颗粒淀粉，特别是在低于该颗粒淀粉的初始糊化温度的温度下水解颗粒淀粉为可溶的淀粉水解产物。除了与包含具有α-淀粉酶活性的催化组件和糖类结合组件的多肽接触之外。淀粉还可以与任何一种或多种下述真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、以及一种或多种下述β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)接触。在另一方面，可将本发明α-淀粉酶与其他淀粉水解酶或脱支酶组合，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。

在一些实施方案中，该方法在低于初始糊化温度的温度实施。此类方法时常在至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或至少60℃实施。实施该方法的pH可以处于约3.0至约7.0、或约3.5至约6.0、或约4.0至约5.0的范围。一方面考虑包括发酵的方法，例如，在32℃左右(例如30-35℃)的温度，例如利用酵母产生乙醇。

另一方面，该方法包括同时进行的糖化和发酵，例如，在30-35℃(例如32℃左右)的温度，例如利用酵母产生乙醇或者利用其他适宜的发酵生物产生期望的有机化合物。

在上述发酵方法中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％，例如至少约16％乙醇。

在上述任何方面中使用的淀粉浆料可以具有约20％至约55％的干固形物颗粒淀粉，约25％至约40％的干固形物颗粒淀粉，或约30％至约35％的干固形物颗粒淀粉。在与α-淀粉酶接触后，该酶将颗粒淀粉中的可溶性淀粉以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量转化成可溶性淀粉水解物。

在另一实施方案中，α-淀粉酶包含具有α-淀粉酶活性的催化组件和糖类结合组件，被用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通过喷射蒸煮进行的糊化)。该方法可以包括发酵以产生发酵产物例如乙醇。通过发酵由含淀粉原料产生乙醇的此类方法包括：(i)用包含具有α-淀粉酶活性的催化组件和糖类结合组件的多肽，例如第一方面的多肽液化该含淀粉原料；(ii)糖化所得的液化醪液；和(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)所得的物质。任选该方法还包括回收乙醇。糖化和发酵的方法可以作为同时糖化和发酵法(SSF)实施。在发酵期间，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％，例如至少约16％乙醇。

在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特别地来自块茎、根、茎、豆类、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。还考虑的有蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。

上述组合物可用于液化和/或糖化糊化或颗粒的淀粉，和部分糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是糊化一定程度的淀粉，即，其中部分淀粉被不可逆溶胀和糊化，而部分淀粉仍然以颗粒状态存在。

上述组合物可包含以0.01-10.0AFAU/g DS或0.1-5.0AFAU/g DS或0.5-3.0AFAU/AGU或0.3-2.0AFAU/g DS的量存在的酸性α-淀粉酶变体。该组合物可用于上述任何淀粉加工中。

可添加β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，其是外切产麦芽糖淀粉酶，以催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解，由此释放麦芽糖。已经从多种植物和微生物中分离到β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，PROGRESS IN INDUSTRIALMICROBIOLOGY，15卷，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有处于40℃至65℃范围内的最适温度，以及处于约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于：来自大麦

BBA 1500、

DBA、

ME、

BBA(Genencor International Inc.)和NOVOZYM^TMWBA(Novozymes A/S)的β-淀粉酶。

还可将葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)包括在组合物中。葡糖淀粉酶来自微生物或植物。示例性葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源。示例性真菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人，EMBO J.3(5)：1097-1102(1984))或其变体，例如WO92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，55(4)：941-949(1991))或其变体或片段。

其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包含增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人，Prot.Eng.8：575-582(1995))；N182(Chen等人，Biochem.J.301：275-281(1994))；二硫键，A246C(Fierobe等人，Biochemistry，35：8698-8704(1996))；和在A435和S436位引入Pro残基(Li等人Protein Eng.10：1199-1204(1997))。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces.leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦篮状菌(Talaromyces.duponti)、嗜热篮状菌(Talaromyces.thermophilics)(美国专利No.4,587,215)。

细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。还考虑商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L、AMG 300L、SAN^TM SUPER和AMG^TM E(Novozymes)；

300(购自Genencor International Inc.)；

和

PLUS(DSM)；

G900(Enzyme Bio-Systems)；

G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。

在一些实施方案中，可以以0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/gDS(例如0.2AGU/g DS)的量加入葡糖淀粉酶。

可以任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，并且通过异淀粉酶不能攻击普鲁分支葡聚糖及其对α-极限糊精的有限作用而能够与支链淀粉酶区别开来。可以按本领域技术人员熟知的有效量加入脱支酶。

该方法的产物的确切组成取决于所应用的酶组合以及所加工的颗粒淀粉的类型。例如，可溶水解产物可以是纯度为至少约85％、至少约90％、至少约95.0％、至少约95.5％、至少约96.0％、至少约96.5％、至少约97.0％、至少约97.5％、至少约98.0％、至少约98.5、至少约99.0％或至少约99.5％的麦芽糖。备选地，可溶淀粉水解产物可以是葡萄糖，或者淀粉水解物具有至少94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5、至少99.0％或至少99.5％的DX(葡萄糖占总溶解的干固形物的百分比)。该方法可包括特制糖浆产物，例如用于产生冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐头的包含葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的特制糖浆。

两种碾磨方法是：湿磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整个谷粒。湿磨法提供胚芽和粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，当淀粉水解产物用于糖浆产生时通常使用这种方法。干磨法和湿磨法均为淀粉加工领域公知，且同等地考虑与所公开的组合物和方法一起使用。该方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同样考虑的是在具有微过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。

在一些实施方案中，将该方法的可溶淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶，以及通过是固定在固相支持物上的固定葡萄糖异构酶实现。示例性异构酶包括商品

IT(NovozymesA/S)；

IMGI和

G993，

G993(Rhodia)，

G993液体和

IGI(Genencor国际公司)。

在其他实施方案中，这些方法所产生的可溶淀粉水解产物可用于出产燃料或饮用乙醇。发酵可以与水解同时或分开/相继进行。当发酵与水解同时进行时，温度可以在30℃-35℃之间，尤其是31℃-34℃之间。该方法可以在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。还可以在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。

该方法的可溶淀粉水解产物也可以用于发酵产品的产生，其包括将所处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠。

一种或多种本发明α-淀粉酶的淀粉水解活性例如可以利用马铃薯淀粉作为底物来测定。此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，且反应后接着将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初形成黑蓝色，但是在淀粉降解期间，蓝色变弱，逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。

5.方法

5.1过滤筛选实验

下面讨论的实验可用于筛选本发明α-淀粉酶以鉴定与亲本或对照α-淀粉酶相比，在高或低pH和/或在Ca²⁺衰竭条件下具有改变的稳定性的变体。

5.2高pH滤膜实验

于37℃，将芽孢杆菌属物种库平板接种在含有10微克/毫升卡那霉素的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher &Schuell，Dassel，德国)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher &Schuell，Dassel，德国)上至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

平板接种后但是在孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有甘氨酸-NaOH缓冲液，pH8.6-10.6的容器中并室温(可在10-60℃间变化)孵育15分钟。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液(Lugol solution)对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。

5.3低钙滤膜实验

于37℃，在含有相关抗生素(例如卡那霉素或新霉素)的TY琼脂平板上的多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)上平板接种芽孢杆菌属物种库至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

平板接种后但是在孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便能够在滤膜上定位阳性变体，将带有结合变体的硝酸纤维素滤膜转移到含有碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH8.5-10，具有不同EDTA浓度(0.001mM-100mM)的容器中。将滤膜室温下孵育1小时。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5-10)的平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在室温下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。

5.4低pH滤膜实验

于37℃在含有10微克/毫升新霉素的TY琼脂平板上多层醋酸纤维素(OE 67，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)和硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)上平板接种芽孢杆菌属物种库，至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂平板上。

在平板接种后但是孵育之前用针特别标记各个滤膜夹层，以便将阳性变体定位在滤膜上，带有结合变体的硝酸纤维素滤膜被转移到含有柠檬酸盐缓冲液，pH4.5的容器中并80℃孵育20分钟(当在野生型背景(backbone)下筛选变体时)或85℃孵育60分钟(当筛选亲本α-淀粉酶的变体时)。带有菌落的醋酸纤维素滤膜在室温下储存于TY平板上，直至使用。孵育之后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的实验平板上检测残余的活性。带有硝酸纤维素滤膜的实验板以与上述滤膜夹层同样的方式标记，并在50℃下孵育2小时。去除滤膜后，用10％复方碘溶液对实验板染色。在暗蓝色背景下，降解淀粉的变体检测为白色斑点并然后在储存板上鉴定出。在与第一次筛选同样的条件下重新筛选两次阳性变体。

5.5二次筛选

从储存板上挑出重筛选后的阳性转化体并在二次平板筛选中检测。37℃下阳性转化体在5mL的LB+新霉素中生长22小时。各个阳性转化体和作为对照表达相应背景的克隆的芽孢杆菌属培养物在柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中于90℃下孵育，在0、10、20、30、40、60和80分钟时取样。在实验板上点3μL样品。用10％复方碘溶液对实验板染色。改善的变体视为与背景相比具有更高残余活性(在实验板上检测为晕斑)的变体。用核苷酸测序来确定该改善的变体。

5.6未纯化变体的稳定性实验

变体的稳定性可以用如下方法检测：表达要分析的变体的芽孢杆菌属培养物在10ml LB+新霉素中于37℃下生长21小时。800μL培养物与200μL柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)混合。对应于样品时间点数的多个70μL等分样品在PCR管中制备，并于在PCR仪中于70℃或90℃孵育不同时间(通常是5、10、15、20、25和30分钟)。0分钟样品不在高温下孵育。通过转移20μL样品至200μL的α-淀粉酶PNP-G7底物MPR3(Boehringer Mannheim目录号1660730)中来测定样品活性，如下面“α-淀粉酶活性测定”部分所述。结果以百分比活性(相对于0分钟时间点的活性)对时间作图，或者描述为在孵育一定时间之后残余活性百分比。

5.7α-淀粉酶变体的发酵和纯化

如下所述发酵和纯化包含相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株：将从-80℃储存的储液中取出的菌株划线接种于含有10微克/毫升卡那霉素的LB琼脂板上，37℃下过夜生长。菌落转移至500mL摇瓶中的补充有10微克/毫升新霉素的100mL PS-1培养基中。

PS-1培养基的成分

培养物在37℃下以270转/分钟振荡培养5天。4500转/分钟离心20-25分钟，从发酵液中去除细胞和细胞碎片。过滤上清得到完全清澈的溶液。浓缩滤液并在UF-过滤器(10,000MW截留膜)上洗涤，缓冲液换为20mM醋酸盐缓冲液，pH5.5。将UF-过滤液上样到S-琼脂糖F.F.上，用含0.2MNaCl的同样缓冲液阶段洗脱。用10mM Tris，pH9.0透析洗脱液，并将洗脱液上样到Q-琼脂糖F.F.，用从0到0.3M的NaCl的线性梯度以6个柱体积洗脱。收集含有活性(用Phadebas测试法测量)的级分，将pH调至pH7.5，通过0.5％W/体积活性炭处理5分钟来去除剩余的颜色。

5.8比活测定法

用

测试法(Pharmacia)测定比活，记作“活性/毫克酶”。遵循厂商的说明书(还参见下文“α-淀粉酶活性测定法”)。

5.9等电点测定法

用等电聚焦法测定pI(例如Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)。

5.10增加的稳定性测定法

在50ml丙烯管中加入10ml目的去污剂。适当稀释，以将180ppm的各α-淀粉酶吸入含有该去污剂的各个管中后测量。带有各个α-淀粉酶的去污剂涡旋30秒，然后置于RotaMix(ATR RKVS Model)上10分钟。吸取100微升含有突变酶的去污剂，以1：651稀释。突变体的初始活性用嵌段的P-硝基-苯基-麦芽糖庚糖(BlockedP-Nitro-Phenyl-Maltoheptaose(嵌段的PBNPG7))底物在Konelab，Model 20XT上检测。然后将去污剂样品在设置为37℃的恒温孵育器中孵育。在第1、2、4、7和17天取出样品，检测酶活性。

5.11α-淀粉酶活性测定法

5.11.1Phadebas测试法

以使用片作为底物的方法测定α-淀粉酶活性。Phadebas片(

淀粉酶检测，Pharmacia Diagnostic提供)含有交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。

对于每个单独测量，在含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl₂，用NaOH调至所需pH值)的管中悬浮一片。该检测在目的温度的水浴中进行。要检测的α-淀粉酶在Xml的50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释。1ml该α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。该α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。用分光光度计在620nm测量得到的蓝色溶液的吸光度是该α-淀粉酶活性的函数。

重要的是在10或15分钟(检测时间)孵育后测得的620nm吸光度处于620nm的0.2-2.0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，在活性和吸光度之间有线性关系(Lambert-beer定律)。因此酶的稀释必须调节为符合该标准。在指定条件(温度、pH、反应时间、缓冲条件)设置下，1mg的给定α-淀粉酶将水解一定量的底物而且会产生蓝色。在620nm测量颜色强度。测得的吸光度与所测定的α-淀粉酶在给定的条件设置下的比活(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)正好成比例。

5.11.2备选方法

α-淀粉酶活性用使用对-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖苷(PNP-G₇)底物的方法测定，PNP-G₇是能够被内切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中包含的α-葡糖苷酶消化该底物，释放游离的PNP分子，PNP分子是黄色的，因此能够在λ＝405nm(400-420nm)被可见分光光度法检测。含有PNP-G₇底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim产生(货号1054635)。

为了制备该试剂溶液，按照产生者的建议，10ml的底物/缓冲液加入到50ml酶/缓冲液中。将20μL样品转移至96孔微滴定板，在25℃孵育来进行该检测。加入在25℃预平衡的200μL试剂溶液。混合溶液，并预孵育1分钟，在酶标仪上4分钟内每30秒在OD 405nm测量一次吸光度。

时间相关的吸光度曲线的斜率直接与给定条件设置下所测试的α-淀粉酶的活性成比例。

5.12去污剂组合物中酶性能的测定

5.12.1美国条件

使用Terg-o-tometer(美国检测中心，Hoboken，新泽西州)以模拟美国典型洗衣条件。在20℃下用标准去污剂，如不含荧光发光剂的液体AATCC2003和/或粉末AATCC1993(美国纺织品化学和色彩协会)，测量剂量效率曲线(DEC)。然后测定相当的α-淀粉酶的相应DEC来比较本发明突变酶的污渍去除性能。40℃下重复该过程。通常，将4个CS-28稻淀粉污渍(荷兰CFT)的样品置于Terg-o-tometer的钢容器中，其中充满了1升去离子水和1.5g的液体AATCC。当使用粉末AATCC时，用分析天平(Model PM4800，Mettler InstrumentCorp.，Highstown，N.J.08520)称取1.5g该去污剂粉末，然后加入到Terg-o-tometer中。同时重复进行两次测定。除非另外说明，该测定进行12分钟，洗涤3分钟。洗涤之后，空气干燥该样品，用KonicaMinolta生产的Chroma Meter Model CR-410测定所测试样品的反射比。用适宜的统计分析处理收集的数据。

5.12.2欧洲条件

使用Launder-O-meter(Atlas公司制造，乔治亚州亚特兰大)以模拟欧洲典型洗涤条件。在40℃下用标准欧洲测试去污剂，IEC A和含漂白剂(TAED-四乙酰基乙二胺乙酸盐)和过硼酸钠的IEC A，测量目的突变酶的剂量效率曲线(DEC)。然后测定相当的突变酶的相应DEC曲线来比较本发明的突变酶的污渍去除性能。如果需要，在更高洗涤温度下重复该过程。通常，四个EMPA 161，玉米淀粉(EMPA，瑞士)样品置于钢容器中，其具有250ml含有6.8g/L IEC A去污剂或8.0g/L含有漂白剂的IEC A去污剂的去离子水。同时重复进行两次测定。除非另外说明，该测定进行45分钟，洗涤5分钟。洗涤之后，空气干燥该样品，用Chroma Meter Model CR-410测定所测试样品的反射比。用适宜的统计分析处理收集的数据。

5.12.3评估去污剂组合物的微样品方法

许多种α-淀粉酶清洁测定法是本领域已知的。示例性清洁测定法涉及样品，其是一块材料，例如其上施有污渍的织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。该样品还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于α-淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。

一些测定法可利用较大样品的较小部分，该较大样品是自样品上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其他方式自样品上取下的部分。样品可以是纺织品、纸、金属或其他适宜的材料。小样品可以在放入24孔、48孔或96孔微滴定板的孔之前或之后被污渍固着。小样品也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样品可以是直径为5/8”或0.25”的污染的织物片。定制的穿孔机经设计可以同时将96个样品递送至96孔板的所有孔中。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样品。可以想到将多孔穿孔装置用于向任何规格的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送样品。另一可想到的方法中，污染的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的、被污垢底物包覆的珠，其用于测试用于纺织品以外材料的清洁组合物。然后将一个或多个污垢包覆的珠放入含有适宜缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板的孔中或更大形式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清中检测释放的污垢。也可以通过质谱分析来进行释放的污垢的分析。进一步的微筛选测定可以是将样品(例如靛蓝染色的粗斜棉布织物)递送并固定到多孔板的孔中，并加入颗粒，例如沙子或者更大的颗粒，例如筛成包括6-8或9号规格的石粒，并振荡该多孔板，以使通过加入的颗粒对样品形成磨损。该测定可用于在石洗应用中的纤维素酶的评价中。酶的有效性可以通过颜色释放到反应缓冲液中(例如释放的靛蓝溶解于二甲基亚砜中，测量A₆₀₀的吸光度)或磨损样品的反射比测定来判定。

当例如未处理的BMI(血液/牛奶/墨水)样品在没有漂白剂的去污剂中洗涤时，大比例的墨水即使没有蛋白酶的帮助也会释放。加入蛋白酶导致墨水释放的小量增加，这种增加在大背景下难以定量。本发明的一方面提供了使人可以控制污渍的固着程度的处理方案。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样品。固着的样品的使用导致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。

在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样品是市售的(EMPA，St.Gallen，瑞士；wfk--Testgewebe GmbH，Krefeld德国；或Center for Test Materials，Vlaardingen，荷兰)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。其他检测样品包括但不限于含棉织物上的血液/牛奶/墨水(BMI)污渍，含棉织物上的菠菜污渍，或含棉织物上的草渍，和含棉织物上的巧克力/牛奶/烟灰污渍。

可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草渍或菠菜渍、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯亮兰污渍、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、牛奶和烟灰。

也可以在用酶和/或去污剂制剂孵育期间搅拌样品。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样品的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400转/分钟可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。

可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基浓度。这可以用作从样品中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果去污剂或酶样品导致异乎寻常的小肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。

另一种测定对血液/牛奶/墨水或其他污渍的洗涤性能的方式基于墨水的释放。样品上蛋白质的蛋白水解导致墨水颗粒的释放，能够通过测量洗液的吸光度来定量。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。测量波长为410nm或620nm。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯亮兰的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示例性的波长包括对于菠菜污渍或草污渍的670nm和对于明胶污渍或考马斯亮兰污渍的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。

也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜底物上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的强化的酶和/或去污剂组合物。

一方面，通过在25℃将0.3％过氧化氢施用于BMI/棉样品30分钟，或通过在60℃将0.03％过氧化氢施用于BMI/棉样品30分钟来将BMI污渍固定于棉上。从上述BMI/棉样品切下大约0.25”的小样品，置于96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的去污剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250转/分钟搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。相似地，可以对固着于棉的菠菜污渍或草渍进行检测，该污渍通过在25℃对菠菜/棉样品或草/棉样品施用0.01％戊二醛30分钟来固着。同样也可以对巧克力、牛奶和/或烟灰污渍检测。其他血液/牛奶/墨水检测和条件记载于美国专利7,122,334中(Genencor International，Inc.)。

5.13LAS敏感度测定

在40℃下将变体与不同浓度的LAS(线性烷基苯磺酸酯；Nansa1169/P)孵育10分钟。用

测量法或使用PNP-G7底物的其他方法测定残余活性。在0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液中稀释LAS。使用下列浓度：500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm和10ppm或无LAS。

在总体积10ml中，在不同的LAS缓冲液中将变体稀释至0.01-5mg/l的浓度，并在温控水浴中孵育10分钟。通过转移小等分试样至冷检测缓冲液中来停止孵育。重要的是，在活性测量期间，LAS浓度低于1ppm，以免影响该活性测量。

然后用上述测量法或其他方法，一式两份测定残余活性。减去空白后测定活性。无LAS的活性为100％。

本申请组织为多个部分，以易于阅读；但是，读者应理解在一个部分中的描述可以用于其他部分中。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被理解为限制。

为了进一步说明本发明的组合物和方法及其优势，给出了下列具体实施例。应理解的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明的组合物和方法而提供，而不应理解为以任何方式对其范围的限制。

实施例

下列实施例进一步详细的描述了本公开，其不以任何方式旨在限制要求保护的公开内容的范围。

下列缩写用于本公开的全文：AE(醇类乙氧化物)；AEO(醇类乙氧化物)；AEOS(醇类乙氧基硫酸酯)；AES(醇类乙氧基硫酸酯)；AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)；AGU(葡糖淀粉酶活性单位)；AOS(α-烯基硫酸酯)；AS(醇类硫酸酯)；BAA(解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶)；BLA(地衣芽孢杆菌或LAT)；BPNPG7(对硝基苯麦芽七糖)；BSA(牛血清白蛋白)；cDNA(互补DNA)；CMC(羧甲基纤维素)；DNA(脱氧核糖核酸)；DP3(聚合度为3个亚单位)；DPn(聚合度为n个亚单位)；DTMPA(二乙烯三胺五乙酸)；EC(进行酶分类的酶协会)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EO(环氧乙烷)；F&HC(织物和家用护理)；FAU(真菌淀粉酶单位)；GA(葡糖淀粉酶)；gpg(格令/加仑)；HFCS(高果糖玉米糖浆)；HFSS(高果糖基于淀粉的糖浆)；IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)；LAS(线性烷基苯磺酸)；LOM(Launder-O-meter)；LU(Liquiphon单位)；MTP(微量滴度板)；MW(分子量)；MWU(修饰的Wohlgemuth单位)；NOBS(壬酰氧苯磺酸)；NTA(次氮基三乙酸)；PCR(聚合酶链式反应)；PEG(聚乙二醇)；PI(性能指数)；PVA(聚乙烯醇)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；RNA(核糖核酸)；SAS(仲烷基磺酸酯)；SEL(位点评估文库)；TAED(四乙酰乙二胺)；TCA(三氯醋酸)；TSB(胰酪胨大豆肉汤)；UFC(超滤浓度)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O或DI(去离子水)；dIH₂O(去离子水，Milli-Q过滤)；ETOH(乙醇)；eq(当量)；N(正常)；DS(干固体)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl和μL(微升)；ml和mL(微升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；DO(溶解氧)；WT％(重量百分比)；w/v(重量/体积)；W/W(重量/重量)；v/v(体积/体积)；GENEART(GENEART GmbH，Regensburg，德国)；和Genencor(Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA)。

实施例1

测定法

在下列实施例中，下文所述的各种测定法用于便于阅读。指出了自下文提供的方案的任何偏离。在这些实验中，使用分光光度计测量在反应完成后形成的产物的吸光度。

A.蛋白质含量测定法

使用在37℃和80％湿度下，300转/分钟振荡生长3天的微量滴度板(MTP)中的过滤培养上清，来实施该测定法。通过高效液相色谱法，将含有50μl上清/孔的新鲜的96孔平底MTP用于该蛋白质测定。上清在含有5％乙腈和10％氯化钠的10mM磷酸钾缓冲液pH7.25中稀释3倍，分析10μl的各种稀释样品。使用装备了Swift^TM RP-all PN68-1030-041(Teledyne Isco，Inc.)柱的Agilent 1100(Hewlet Packard)HPLC。溶剂系统由水相的0.1％三氟醋酸和乙腈的0.07％三氟醋酸组成。读取222nm的吸收值，基于纯化的BASE(AmyTS23t)蛋白的标准曲线，确定样品的蛋白质浓度。

B.Ceralpha淀粉酶测定法

该α-淀粉酶测定法的原理是基于在存在过量水平的热稳定性α-葡糖苷酶的条件下，给定的寡糖(BPNPG7)成为葡萄糖和游离对硝基苯的水解。测量400nm的吸光值，其与所分析样品中的活性淀粉酶水平直接相关。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂和溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；和

3)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)。

将一瓶含有54.5mg BPNPG7底物溶解在10ml的milliQ水中。在MOPS缓冲液中稀释淀粉酶样品(发酵上清)。通过在MTP的孔中添加25μl稀释的淀粉酶溶液，之后添加25μl 5.45mg/ml BPNPG7底物溶液，来实施测定。混合溶液，并用平板密封器将微量滴度板密封，置于孵育器/振荡器(iEMS-Thermo/Labsystems)中25℃和900转/分钟下30分钟。通过添加50μl STOP缓冲液终止反应，并在MTP读板器中读取400nm波长的吸光值。使用无酶对照校正背景吸光值。

C.CS-28稻淀粉微样品测定法

该α-淀粉酶测定法的原理是基于整合到微样品中的稻淀粉水解产生橙色染料的释放。测量488nm的吸光值，在理想条件下(pH、温度和缓冲液)，其与所分析样品中的淀粉酶活性水平相关。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂和溶液是：

1)CS-28微样品(稻淀粉，有色)；

2)25mM HEPES，2mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80缓冲液，pH8.0；

3)25mM CAPS，2mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80缓冲液，pH10.0；和

4)10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％TWEEN 80(稀释缓冲液)。

1/4″环状直径的CS-28微样品是由Testmaterials中心(CFT，Vlaardingen，荷兰)递送的。在96孔微量滴度板的每个孔中垂直放置2个微样品，暴露整个个表面积(例如，不平放在孔底部)。在若干条件下测试适当浓度的淀粉酶样品(发酵上清)，在10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80溶液中预稀释：

1)pH8(25mM HEPES缓冲液)和16℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.025μg/ml；

2)pH8(25mM HEPES缓冲液)和32℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.012μg/ml；

3)pH10(25mM CAPS缓冲液)和32℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.025μg/ml；和

4)pH10(25mM CAPS缓冲液)和50℃；测定中的最终淀粉酶浓度＜0.012μg/ml。

将孵育箱/振荡器设置在理想的温度，16℃(冷储藏室或冰箱)、32℃或50℃。将微样品放置在96孔MTP的孔中。在10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％80中稀释培养上清样品20X至理想的最终浓度。向微样品-MTP的每个孔加入190μl的HEPES或CAPS缓冲液，之后向每个孔加入10μl酶溶液，获得总体积为200μl/孔。用平板密封器将MTP密封，置于孵育器/振荡器中，在理想温度下(16℃、32℃或50℃)和1150转/分钟下孵育60分钟。在适当条件下孵育后，从每个孔转移100μl溶液至新的MTP中，使用MTP分光光度计测量488nm的吸光值。含有2个微样品和缓冲液，但不含酶的对照包括在内作为背景减去。

根据空白值(在缺少酶的条件下孵育微样品后获得的)校正所获得的吸收值，所获得的吸收值是水解活性的度量。计算每个样品(变体)的性能指数(PI)。性能指数比较了相同蛋白质浓度的变体(实际值)和对照酶(理论值)的性能。使用对照酶的Langmuir等式的参数，可以计算理论值。大于1的PI(PI＞1)鉴别了更好的变体(相比对照或标准酶[例如，野生型])，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准表现差的变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不理想的变体。

D.热稳定性测定法——确定初始和剩余的活性

通过在定义的条件下的MOPS缓冲液，pH7.15中孵育淀粉酶样品，来确定淀粉酶变体相比对照淀粉酶的热稳定性。选择这样的孵育温度，使得约70％的初始对照淀粉酶活性丧失。使用Ceralpha方法确定初始和剩余的淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)10mM NaCl，10mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液(稀释缓冲液)；

3)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

4)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

5)淀粉酶培养上清，含有50-150μg/ml蛋白质。

通过在10mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％80缓冲液中稀释培养上清20X，后续在MOPS缓冲液中42X稀释的步骤，来制备“主稀释”平板。从主稀释液中，使用25μl来确定初始淀粉酶活性，使用100μl用于热孵育。将100μl样品置于用铝带密封的MTP(Greiner 655.101)中，并在65.5℃孵育60分钟，并在iEMS孵育箱中900转/分钟搅拌。孵育后，在确定剩余的淀粉酶活性之前，在冰水中冷却MTP。为了确定初始(t₀₀)和剩余的(t₆₀)活性，将25μl样品转移到含有25μl BPNPG7溶液/孔的新的MTP中，并在25℃孵育30分钟。如上述章节B该实施Ceralpha淀粉酶测定法。

如下使用剩余和初始的淀粉酶活性的比例来计算热稳定性：热稳定性＝[t_-60值]/[t_-00值]。还计算每个变体的性能指数，该性能指数比较了变体与对照(标准)的热稳定性。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴别了更好的变体(相比对照或标准酶[例如，野生型或骨架])，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准同样稳定的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准更不稳定的变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不稳定的变体。

E.热稳定性测定法——确定T₅₀值

热稳定性测定法如上文章节D所述，仅可以排列在给定条件下丧失活性的变体。在给定条件下100％稳定的变体则不能彼此区分。因而，确定T₅₀值是排列具有显著增加的热稳定性的变体的更合适的测定法，该T₅₀值是丧失50％初始活性的孵育温度。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和EppendorfMastercycler。在MOPS缓冲液中将含有淀粉酶变体的培养上清稀释1000X，如上述章节B所述使用Ceralpha淀粉酶测定法来确定初始淀粉酶活性。使用稀释的淀粉酶样品，制备含有100μl/孔的PCR平板。平板在Eppendorf Mastercycler上孵育60min，温度梯度跨60℃-80℃(单位点变体)或60℃-100℃(组合变体)。在孵育后，在确定剩余的淀粉酶活性之前，将MTP冷却至4℃。

针对孵育温度绘制剩余和初始淀粉酶活性的比例，使用下列等式拟合数据：y＝a₀+a₁/(1+(x/a₂)^a3)。之后，计算每个淀粉酶变体的T₅₀值(例如，剩余活性为50％时的温度)。因而，T₅₀值是变体的热稳定性的度量，可以相对于对照淀粉酶和相对于彼此来排列变体。

F.10％去污剂稳定性测定法

在存在10％去污剂(商业去污剂；热失活的)的定义条件下孵育后，测量对照淀粉酶及其变体的稳定性，使用Ceralpha淀粉酶测定法确定初始和剩余淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)液体去污剂(HDL商业产品，95℃下酶失活的2小时)；

3)在25mM HEPES缓冲液中10.5％去污剂，pH8.0；

4)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

5)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

6)含有50-150μg/ml的蛋白质的淀粉酶培养上清。

简而言之，将95μl的10.5％去污剂溶液转移到微量滴度板(MTP)中，并与5μl培养上清混合。移出3μl等分试样用于确定初始的淀粉酶活性。在iEMS孵育箱中40℃下用900转/分钟搅拌孵育MTP(或者，在具有更高稳定性的BASE组合变体的情况下为50℃)30分钟。孵育后，使用3μl去污剂-酶混合物测量剩余的淀粉酶活性。初始(t₀)和剩余(t₃₀)的淀粉酶活性：在122μl MOPS缓冲液中稀释3μl“去污剂-酶”混合物，之后使用上述的Ceralpha淀粉酶测定法，用25μl来确定淀粉酶活性。

如下使用剩余和初始的淀粉酶活性的比例来计算“10％去污剂”稳定性：稳定性＝[t₃₀值]/[t_-0值]。还计算每个变体的性能指数。性能指数比较了淀粉酶变体与对照淀粉酶的10％去污剂稳定性。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴别了更稳定的变体(相比对照或标准酶[例如，野生型])，而1的PI(PI＝1)则鉴别了与标准同样稳定的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴别了比标准更不稳定的变体。因而，PI鉴别优胜者，以及对某些环境下使用较不稳定的变体。

G.100％去污剂稳定性测定法——温度梯度曲线

在存在100％去污剂(商业去污剂；酶失活的)的定义条件下孵育后，测量BASE骨架和BASE变体的HDL去污剂稳定性，使用Ceralpha淀粉酶测定法确定初始和剩余淀粉酶活性。

使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP读板器(340型-Molecular Devices)；EppendorfPCR Mastercycler和iEMS孵育箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。在该测定系统中，使用的试剂溶液是：

1)对硝基苯麦芽七糖(BPNPG7)底物(Megazyme HR试剂盒)；

2)液体去污剂(HDL商业产品，95℃下热失活2小时)；

3)50mM MOPS，50mM NaCl，0.1mM CaCl₂，0.005％

80缓冲液，pH7.15；

4)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10.2(STOP缓冲液)；和

5)含有50-150μg/ml的蛋白质的淀粉酶培养上清。

在HDL去污剂中20X稀释淀粉酶培养上清，并完全混合。使用上述章节B中所述的Ceralpha淀粉酶测定法来确定初始淀粉酶活性。使用稀释的淀粉酶-HDL样品，制备含有100μl/孔的PCR平板。平板在Eppendorf Master循环仪中以跨越30℃-70℃的温度梯度孵育30min。孵育后，在如上所述确定剩余的淀粉酶活性之前，将MTP冷却至4℃。

为了计算HDL T50值，针对孵育温度绘制剩余和初始的淀粉酶活性比例，使用下列等式拟合数据：y＝a₀+a₁/(1+(x/a₂)^a3).。之后，计算每个BASE变体的T₅₀值(例如，剩余活性为50％时的温度)。因而，T₅₀值是变体的热稳定性的度量，可以相对于对照淀粉酶和相对于彼此来排列变体。

H.AAPF蛋白酶

为了确定本公开的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶活性，测量N-琥珀酰基-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对硝基苯胺(N-succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenyl-p-nitroanilide，AAPF)的水解。使用的试剂溶液是：

1)100mM Tris/HCl，pH8.6，含有0.005％

-80(Tris稀释缓冲液)；

2)100mM Tris缓冲液，pH8.6，含有10mM CaCl2和0.005％

-80(Tris/Ca缓冲液)；和

3)DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储液)(Sigma：S-7388)。

为了制备suc-AAPF-pNA工作溶液，将1ml AAPF储液添加到100ml Tris/Ca缓冲液中，充分混合至少10秒。通过向每个孔添加10μl稀释的蛋白酶溶液，之后立即添加190μl 1mg/ml AAPF-工作溶液，来实施测定。混合溶液5sec，在25℃下，MTP读板器中以动态模式(5分钟内读取20次)读取410nm的吸光值改变。蛋白酶活性表示为AU

实施例2

产生表达BASE(AmyTS23t)及其变体的枯草芽孢杆菌菌株

在该实施例中，描述了表达BASE(枯草芽孢杆菌物种TS-23α-淀粉酶的截短形式或AmyTS23t)及其变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。BASE是源自嗜碱性和嗜热性芽孢杆菌菌株物种TS-23的TS-23α-淀粉酶(AmyTS23)的截短的淀粉酶的成熟形式(Lin等人，J ApplMicrobiol，82：325-334，1997)。

AmyTS23的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ

SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN

HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW

YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV

VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE

FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK

DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY

GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG

LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS

VSIWVAKTSNVTFTVNNATTTSGQNVYVVANIPELGNWNTANAIKMNPSSYPT

WKATIALPQGKAIEFKFIKKDQAGNVIWESTSNRTYTVPFSSTGSYTASWNVP

编码AmyTS23的成熟形式的密码子修饰的核酸序列如SEQ ID

NO：3所示：

aatacggcgccgatcaacgaaacgatgatgcagtattttgaatgggatctgccgaatg

atggaacgctgtggacgaaagtcaaaaacgaagcggcgaatcttagcagcctgggaat

cacagcactttggcttccgccggcatataaaggaacgagccaaagcgatgtcggctat

ggcgtctatgatctgtatgacctgggcgaatttaaccaaaaaggcacgatccggacga

aatatggcacgaaaacacagtatatccaagcgatccaggcagcaaaagcagcaggcat

gcaagtctatgccgacgtcgtctttaatcataaagcgggagcggatggcacagaattt

gtcgatgccgtcgaagttgatccgagcaacagaaaccaagaaacgagcggcacgtatc

aaatccaagcgtggacgaaatttgattttccgggcagaggcaatacgtatagcagctt

taaatggcgctggtatcattttgacggcacggattgggatgaaagcagaaaactgaac

cggatctataaatttcggagcacgggcaaagcatgggattgggaagtcgatacggaaa

acggcaactatgactatctgatgtttgccgatctggatatggatcatccggaagtcgt

cacggaactgaaaaattggggcacgtggtatgttaatacgacgaacatcgatggcttt

agactggatgccgtcaaacatatcaaatatagcttttttccggactggctgacgtatg

tcagaaaccagacgggcaaaaacctttttgccgtcggcgaattttggagctatgacgt

caacaaacttcataactatatcacgaaaacgaacggcagcatgagcctttttgatgcc

ccgcttcataacaacttttatacggcgagcaaaagctcaggctattttgatatgagat

atctgctgaacaacacgctgatgaaagatcaaccgagcctggcagtcacactggtcga

taaccatgatacacaaccgggccaaagccttcaaagctgggtcgaaccgtggtttaaa

ccgctggcgtatgcctttatcctgacgagacaagaagggtatccttgcgtcttttatg

gcgactattatggcatcccgaaatataatatcccgggcctgaaaagcaaaatcgatcc

gctgctgatcgccagacgggattatgcctatggcacacagcgggattatatcgaccat

caggacatcatcggctggacaagagaaggcatcgatacgaaaccgaatagcggactgg

cagcactgattacagatggaccgggcggaagcaaatggatgtatgtcggcaaaaaaca

tgccggcaaagtcttttatgatctgacgggcaacagaagcgatacggtcacgatcaat

gctgatggctggggagaatttaaagtcaatggcggcagcgtttcaatctgggtcgcca

aaacgagcaatgtcacgtttacggtcaacaatgccacgacaacgagcggccaaaatgt

ctatgtcgtcgccaatatcccggaactgggcaattggaatacggcgaacgcaatcaaa

atgaacccgagcagctatccgacatggaaagcgacaatcgctctgccgcaaggaaaag

cgatcgaatttaaatttatcaaaaaagaccaggcgggcaatgttatttgggaaagcac

gagcaatagaacgtatacggtcccgtttagcagcacaggaagctatacagcgagctgg

aatgttccgtga.

通过删除编码酶的信号肽的90bp的5’序列区和编码酶的羧基端的297bp的3’序列产生BASE，得到截短的α-淀粉酶。成熟形式的BASE(AmyTS23t)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ

SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN

HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW

YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV

VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE

FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK

DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY

GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG

LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS

VSIWVAK.。

通过GENEART产生合成的DNA片段(0723013)，并含有用于在枯草芽孢杆菌中表达的密码子修饰的BASE基因，将该DNA片段作为模板DNA(SEQ ID NO：4)用于构建枯草芽孢杆菌菌株表达BASE及其变体。为了表达BASE，使用独特的PstI和HpaI限制位点，通过GENEART将BASE DNA片段克隆到pHPLT载体(Solingen等人，Extremophiles 5：333-341，2001)中。PHPLT表达载体含有地衣芽胞杆菌LAT启动子(Plat)和pUB110的其他元件(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)，包括复制子基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)。

LAT 信号肽的编码区如SEQ ID NO：15所示：atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcttcagca.。

LAT信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示：MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASA。

图2显示了pHPLT表达载体的图谱，而图3显示了含有BASE基因的pHPLT载体的图谱。由GENEART产生的、编码成熟形式的BASE(AmyTS23t)的密码子修饰的核酸序列如SEQ ID NO：4所述，具有以粗体显示的N001N-终止密码子和K484C-终止密码子：

1   tctgcagct tcagcaaac accgcgccg attaacgaa accatgatg cagtatttc gaatgggat ctgccgaac

73  gatggcacc ctgtggacc aaagtgaaa aacgaagcg gcgaacctg agcagcctg ggcattacc gcgctgtgg

145 ctgccgccg gcatataaa ggcaccagc cagagcgat gtgggctat ggcgtgtat gatctgtac gatctgggc

217 gaatttaac cagaaaggc accattcgt accaaatat ggcaccaaa acccagtat attcaggcg atccaggcg

289 gcgaaagcg gcgggtatg caggtgtat gcggatgtg gtgtttaac cataaagcg ggtgcggat ggcaccgaa

361 tttgtggat gcggtggaa gtggatccg agcaaccgt aaccaggaa accagcggc acctatcag attcaggcg

433 tggaccaaa tttgatttt cccggccgt ggcaacacc tatagcagc tttaaatgg cgctggtat cattttgat

505 ggcaccgat tgggatgaa agccgtaaa ctgaaccgc atctataaa tttcgtagc accggcaaa gcgtgggat

577 tgggaagtg gataccgaa aacggcaac tatgattac ctgatgttc gcagacctg gatatggat catccggaa

649  gtggtgacc gaactgaaa aactggggc acctggtat gtgaacacc accaacatt gatggcttt cgtctggat

721  gcggtgaaa cacatcaaa tacagcttt tttccggat tggctgacc tatgtgcgt aaccagacc ggcaaaaac

793  ctgtttgcg gtgggcgaa ttttggagc tatgatgtg aacaaactg cacaactac atcaccaaa accaacggc

865  agcatgagc ctgtttgat gcgccgctg cataacaac ttttatacc gcgagcaaa agcagcggc tattttgat

937  atgcgttat ctgctgaac aacaccctg atgaaagat cagccgagc ctggccgtg accctggtg gataaccat

1009 gatacccag ccgggccag agcctgcaa agctgggtg gaaccgtgg tttaaaccg ctggcctac gcgtttatt

1081 ctgacccgt caagagggc tatccgtgc gttttttat ggcgattat tacggcatc ccgaaatat aacattccg

1153 ggcctgaaa agcaaaatt gatccgctg ctgattgcg cgtcgtgat tatgcgtat ggcacccag cgtgattat

1225 attgatcac caggatatt attggctgg acccgtgaa ggcattgat accaaaccg aacagcggc ctggccgcg

1297 ctgattacc gatggcccg ggtggcagc aaatggatg tatgtgggc aaaaaacat gcgggcaaa gtgttttat

1369 gatctgacc ggcaaccgt agcgatacc gtgaccatt aacgcggat ggctggggt gagtttaaa gtgaacggc

1441 ggcagcgtg agcatttgg gtggcgaaa taagttaac aga.。

GENEART使用pHPLT-BASE载体DNA转化枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr)和(degU^Hy32，oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC)。如本领域已知的实施枯草芽孢杆菌的转化(WO 02/14490)。在含有心灌流琼脂(Difco，货号244400)和10mg/L新霉素硫酸酯(Sigma，货号N-1876，含有732μg新霉素/mg)的琼脂平板上，选择枯草芽孢杆菌转化体。在含有MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)、5mM CaCl₂和10mg/L新霉素的摇瓶中实施含有pHPLT-BASE GENEART载体的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长。除了从基础培养基中排除NH₄Cl₂，FeSO₄和CaCl₂以外，基本按本领域已知的制备MBD培养基(Neidhardt等人，J Bacteriol，119：736-747，1974)，使用3mMK₂HPO₄，并且在基础培养基中补充60mM尿素，75g/L葡萄糖，和1％大豆蛋白胨(soytone)。将微量营养素制备成100X储液，在1升中包含：400mg FeSO₄7H₂O，100mg MnSO₄.H₂O，100mg ZnSO₄7H₂O，50mg CuCl₂2H₂O，100mg CoCl₂6H₂O，100mg NaMoO₄2H₂O，100mg Na₂B₄O₇10H₂O，10ml的1M CaCl₂和10ml的0.5M柠檬酸钠。生长导致产生具有淀粉水解活性的分泌型BASE淀粉酶。

实施例3

产生BASE(AmyTS23t)位点评估文库

由GENEART使用专利方法(WO 2004/059556A3)实施位点评估文库(SEL)的产生。出于表达蛋白质的目的，通过PCR优化核苷酸序列的方法和装置，以及DNA分子的产生利用了属于或得到GENEART许可的技术(欧洲专利号0200362和0201184；欧洲专利号4,683,195，4,683,202和6,472,184)。利用它们的专利性GENEARTknow how和/或知识产权的基因优化、基因合成和文库产生的技术平台，通过GENEART实施构建该实施例描述的BASE SEL。GENEART产生SEL的序列变换方法概述在公司的网站上。

将pHPLT-BASE质粒DNA用作模板产生SEL。发明人预先选择在(表3-1)的位置由GENEART产生BASE SEL。用至少16种(在可能的19种中)不同的氨基酸密码子分别取代相应的DNA密码子。如本领域已知的(WO 2002/014490)，使用密码子诱变的pHPLT-BASE混合物转化感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])，产生BASE SEL。将转化混合物涂布在含有10mg/L新霉素硫酸酯的HI琼脂平板(心灌流琼脂)上。对于每个文库，挑取单克隆，并在含10mg/L新霉素选择的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，进行后续的DNA分离和基因序列分析。序列分析数据揭示每个文库最多19个BASE成熟变体。表3-2中列举了在BASE SEL中鉴别的BASE变体。为了产生供生物化学表征的BASE和BASE变体酶样品，在96孔MTP中实施BASE SEL变体的选择性生长，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例4产生BASE(AmyTS23t)组合文库

合成的BASE组合文库含有合成的BASE基因的混合物，其中特定的DNA序列替代了成熟序列中的两个或多个选定的密码子。在与Genencor的合约下，GENEART产生了4个合成的BASE组合文库，使用GENEART的专利性GENEART know how和/或知识产权的基因优化、基因合成和文库产生的技术平台。GENEART产生组合文库的先进诱变方法概述在公司的网站上。

表4-1至4-4列举了合成性BASE组合文库的成员中可能存在的取代(根据SEQ ID NO：2的BASE成熟氨基酸序列编号)。在每个文库中，靶向的BASE位置具有相等的机会仍然保留野生型(wt)或被表4-1至4-4列举的特定氨基酸取代。通过克隆pHPLT载体中的诱变BASE基因，产生pHPLT-BASE质粒DNA的变体，之后转化枯草芽孢杆菌细胞，来产生BASE组合文库。转化混合物置于含有10mg/L新霉素硫酸酯和0.5％RBB-淀粉(Sigma-Aldrich货号S7629，与Remazol Brilliant Blue R共价连接的土豆淀粉)的HI琼脂平板(心灌流琼脂)上。对于每个文库，挑取产生清晰区域的单克隆，并在含有10mg/mL新霉素的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长。为了产生供生物化学表征的BASE组合变体酶样品，在96孔MTP中实施BASE组合文库成员的选择性生长，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例5

产生BASE组合变体

在该实施例中，描述了构建表达BASE组合变体的枯草芽孢杆菌菌株。为了表达BASE组合变体，将BASE变体DNA片段克隆到pHPLT载体中，使用独特的PstI和HindIII限制位点，之后引入到枯草芽孢杆菌菌株中。如下该构建BASE DNA变体片段。对于表5-1(S1至S32)列举的每个BASE组合变体，使用表5-2和表5-3列举的引物实施PCR反应。

对于下文描述的PCR反应，使用终浓度为0.2μM DNA引物和0.1-10ng质粒DNA模板。表5-2列举了用于构建每个变体的特定pDNA模板和引物对。此外，所有的PCR反应都在50μL的体积中完成，使用Finnzymes(Finnzymes OY，Espoo，芬兰)Phusion高保真DNA聚合酶(货号F-530L)。所有的PCR反应混合物含有10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，总体积为50μL。使用MJ Research PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)如下运行PCR程序：98℃，30秒，25X(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下25秒)和最后72℃下5min。

对于BASE组合变体S1至S16，通过第三次PCR将PCR1和2产生的扩增DNA片段融合。将0.5μL等分的PCR1和PCR2扩增DNA片段添加到含有引物PstI-FW和HindIII-RV的第三次反应混合物中。纯化扩增的线性1.5kb DNA片段(

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用PstI和HindIII限制性酶消化。之后，纯化(

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)BASE组合变体DNA片段S1至S16和pHPLT pDNA(用PstI和HindIII限制性酶消化50ng/μL)，并连接。反应条件如下：4μL纯化的、PstI和HpaI消化的BASE变体片段，2μL纯化的、PstI和HindIII消化的pHPLT DNA片段，8μL T4 DNA连接酶缓冲液(

货号46300-018)，25μL去离子化高压蒸汽灭菌水，和1μL T4 DNA连接酶，1单位/μL(

货号15224-017)。在20℃实施连接反应16-20小时。

为了将连接反应混合物直接转化到枯草芽孢杆菌细胞中，使用TempliPhi试剂盒(Amersham货号25-6400)扩增连接的pHPLT-BASE变体DNA。出于该目的，将1μL连接反应混合物与TempliPhi试剂盒的5μL样品缓冲液混合，在95℃加热3分钟，以变性DNA。将反应混合物置于冰上冷却2分钟，然后简单离心。然后，加入5μL反应缓冲液和0.2μL TempliPhi试剂盒的phi29聚合酶，在MJ Research PCR机器中30℃孵育反应物4小时。在65℃下孵育，热失活phi29酶10min。

为了将BASE变体引入到枯草芽孢杆菌中，将0.1L TempliPhi扩增反应产物与500μL感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK))混合，之后在37℃剧烈振荡1小时，将100μL和500μL置于含有10mg/L新霉素硫酸酯和0.5％RBB-淀粉的心灌流琼脂(Difco货号244400)上。对于每个变体，挑取产生清晰区域的单克隆，并在含有10mg/mL新霉素选择剂的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，以进行后续的质粒DNA分离和基因序列分析。通过序列分析确定BASE组合变体的身份。如本文所述，用pHPLT-BASE S1至S16质粒DNA作为模板DNA，构建BASE组合变体S17至S32。为了产生供生物化学表征的BASE组合变体酶样品，在96孔MTP中生长BASE组合变体，在MBD培养基中37℃下68小时。

＊减号＝野生型残基

＊M＝DNA A或C；Y＝DNA C或T；R＝DNA G或A；和K＝DNAG或T。

通过使用BASE组合变体P1至P12，构建BASE组合变体W1至W13。从实施例4描述的BASE组合文库1-4中选择表5-4的P1-P12变体。对于表5-5中列举的每个BASE组合变体(W1至W32)，使用表5-6列举的引物实施PCR反应。所有的PCR反应条件都与上述用于产生BASE组合变体S1至S32的方案相似。

＊括号内显示了BASE性能变体编号。BASE P1-P12变体具有在位置Y160、T214、Q407和T149处的野生型残基。

构建BASE组合变体W1至W13的PCR示意图显示在表5-7和5-8中。变体产生始于5个PCR反应(系列A至E)，并持续2个融合PCR反应(系列F和G)。使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒(货号28106)纯化所有的PCR片段。如构建变体S1至S32所述，用PstI和HindIII消化PCR G1至G13的融合DNA片段，并连接至PstI和HindIII消化的pHPLT载体DNA中。之后，将phi29聚合酶扩增的连接混合物引入枯草芽孢杆菌中。对于每个变体，挑取产生清晰区域的单克隆，并在含有10mg/mL新霉素的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中生长，进行后续的质粒DNA分离和基因序列分析。通过序列分析确定BASE组合变体的身份。为了产生供生物化学表征的组合变体W1至W13的酶样品，在96孔MTP中选择性生长BASE组合变体，在MBD培养基中37℃下68小时。

实施例6

产生ACE(AmyTS23tΔRS)位点评估文库

在该实施例中，描述了构建表达BASE变体：BASE-ΔR180-ΔS181(也称为AmyTS23tΔRS或ACE)；和BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q(也称为AmyTS23tΔRS-S243Q，即ACE-S243Q或ACE-Q)的枯草芽孢杆菌菌株。此外，描述了产生ACE-Q位点评估文库(SEL)。

含有DNA密码子修饰的BASE基因的合成DNA片段056426(Geneart，Regensburg，德国产生)作为模板DNA。使用独特的PstI和HpaI限制位点，将该BASE DNA片段克隆到pHPLT载体中(Solingen等人，Extremophiles，5：333-341，2001)。pHPLT表达载体含有地衣芽胞杆菌LAT启动子(Plat)，后接用于克隆BASE的PstI和HpaI限制位点，和来自pUB110的其他元件(McKenzie等人，Plasmid，15：93-103，1986)，包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)。图3显示了pHPLT-BASE质粒的图谱。使用pHPLT-BASE作为模板DNA和表6-1列举的DNA引物，产生含密码子180(CGG)和181(AGC)删除的BASE DNA(BASE-ΔR180-ΔS181，也称为ACE)。由Sigma(Sigma-Aldrich Chemie B.V.，Zwijndrecht，荷兰)合成和脱盐DNA引物。

使用pHPLT-BASE模板DNA，使用引物对TS-delRS-FW/pHPLT-HpaI-RV和TS-delRS-RV/pHPLT-PstI-FW，实施两次PCR反应。为了融合2次PCR产生的片段，将1μl来自2次反应的未纯化的PCR混合物加入到第三次PCR反应中，其中加入了引物pHPLT-PstI-FW和pHPLT-HpaI-RV。纯化扩增的线性1.5kbDNA片段(使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用PstI和HpaI限制性酶消化。

对于所有所述的PCR反应，使用终浓度为0.2μM DNA引物，和0.1-10ng的DNA模板。此外，所有的PCR反应都在50μL的体积中完成，使用Finnzymes(Finnzymes OY，Espoo，芬兰)Phusion高保真DNA聚合酶(货号F-530L)。同样，所有的PCR反应混合物含有10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，产生的最终体积为50μL。使用MJ Research PTC-200 Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)如Finnzymes该实施PCR程序(98℃，30秒；30X(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下22秒/kb)和最后72℃下5min)。之后，纯化(使用

Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)BASE-ΔR180-ΔS181 DNA片段和pHPLT质粒DNA(50ng/μL，用PstI和HpaI限制性酶消化)，然后使用下列反应条件在PstI和HpaI末端连接：4μL纯化的、PstI和HpaI消化的BASE-ΔR180-ΔS181 DNA片段，2μL纯化的、PstI和HpaI消化的pHPLTDNA片段，8μL T4 DNA连接酶缓冲液(

货号46300-018)，25μL去离子化高压蒸汽灭菌水，和1μL T4 DNA连接酶，1单位/μL(货号15224-017)。在20℃实施连接反应16-20小时。

如WO 02/014490所述，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr)和(degUHy32，oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，(Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB))中，通过参考细菌转化的教导整合到本文中。在含有心灌流琼脂(Difco，货号244400)和10mg/L新霉素的琼脂平板上选择枯草芽孢杆菌转化体。在含有25ml MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)和10mg/L新霉素的摇瓶中实施含有pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181质粒的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长。这导致产生具有淀粉水解活性的分泌型BASE-ΔR180-ΔS181淀粉酶。pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181质粒在本文中也称为pHPLT-ACE。

为了产生表达BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株，使用相似的方案。使用引物ACE-S243Q-FW和pHPLT-HpaI-RV、引物ACE-S243Q-RV和pHPLT-PstI-FW，pHPLT-ACE模板DNA，来实施前2次PCR反应。引物序列列举在表6-1中。含有pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q的枯草芽孢杆菌转化体产生和分泌BASE ΔR180-ΔS181-S234Q淀粉酶，具有淀粉水解活性。图4中显示了pHPLT-BASE-ΔR180-ΔS181-S243Q质粒，也称为pHPLT-ACE-S243Q的图谱。

pHPLT-ACE-S243Q质粒DNA作为产生位点评估文库(SEL)的模板。根据成熟的BASE氨基酸序列(SEQ ID NO：2)编号选择进行ACE-Q SEL的氨基酸位置，包括：R127，Y305，Q320，P379，T419，L453和G475。用编码最多20个不同氨基酸的突变密码子替代相应的DNA密码子。该pHPLT-ACE-S243Q质粒含有独特的BglII限制位点，该位点在SEL构建的过程中被利用。用于产生文库的引物序列(商业合成和脱盐)列举在表6-2中。

为了构建ACE-Q SEL，实施3次反应：2次诱变反应在ACE-QDNA序列中引入诱变的目标密码子，第三次反应将2条PCR片段融合。诱变方法基于密码子特异性诱变方法。在该方法中，使用编码特定设计的三体DNA序列NNS((A，C，T或G)，(A，C，T或G)，(C或G))的正向和反向寡核苷酸引物，实现在特定的DNA三体中产生所有可能的突变，该三体DNA序列与待突变的密码子序列对应，并保证在目标密码子处随机整合核苷酸。表6-2的引物名称中列举的编号对应于特定的ACE-Q密码子位置(基于成熟的BASE氨基酸序列的编号)。用于构建SEL的两条额外寡核苷酸引物编码独特的BglII限制位点，和位于BglII限制位点两侧的pHPLT DNA序列。

用2步初级扩增反应开始构建每个SEL：第一步PCR使用pHPLT-BglII-FW引物和特定的ACE-Q反向诱变引物；第二步PCR使用pHPLT-BglII-RV引物和特定的ACE-Q正向诱变引物。使用Finnzymes Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，芬兰)(货号F-530L)实施在成熟ACE-Q序列中引入突变。根据产生商提供的方案实施所有的反应。初级反应的PCR条件如下。对于初级PCR1：pHPLT-BglII-FW引物和特定的ACE-Q反向诱变引物——均为1μL(10μM)，0.1-10ng的DNA模板(pHPLT-ACE-S243Q)，10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，至最终体积为50μL。对于初级PCR 2：pHPLT-BglII-RV引物和特定的ACE-Q正向诱变引物——均为1μL(10μM)，0.1-10ng的DNA模板(pHPLT-ACE-S243Q)，10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL的100％DMSO和去离子化高压蒸汽灭菌水，至最终体积为50μL。

使用PTC-200 Peltier热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)和下列程序：98℃，30秒；30X(98℃下10秒，55℃下20秒，72℃下，1分钟)和72℃下5min。对于每步SEL初级扩增反应，产生2条约2-3 kb的DNA片段，其在目标的ACE-Q密码子周围具有约30个核苷酸重叠。为了融合两条DNA片段，将1μl来自2次反应的未纯化的PCR混合物加入到第三次扩增PCR反应中，其中加入了引物pHPLT-BglII-FW和pHPLT-BglII-RV。纯化扩增的线性5.2kbDNA片段(使用Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号28106)，并用BglII限制性酶消化，在融合片段的两侧产生粘性末端。将含有35μL纯化的线性DNA片段，4μL

3缓冲液(Invitrogen，Paisley PA49RF，UK)和1μL BglII，10单位/ml(Invitrogen，PaisleyPA49RF，UK)的反应消化物在30℃孵育1小时。

为了产生ACE-Q SEL，如WO 02/014490所述，使用密码子诱变的pHPLT-ACE-S243Q连接混合物转化感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])。将转化混合物涂布在含有10mg/L新霉素硫酸酯(Sigma，货号N-1876；含有732μg新霉素/mg)的HI琼脂平板(心灌流琼脂)上。对于每个文库，挑取单克隆，并在含10mg/L新霉素选择的基于胰蛋白胨和大豆的培养液的液体培养基中生长，进行后续的质粒DNA分离和ACE-Q基因变体的DNA序列分析。由BaseClear B.V.(Leiden，荷兰)实施DNA序列分析。序列分析数据揭示每个文库最多18个ACE-Q变体。表6-3中列举了在7个ACE-Q SEL中鉴别的所有ACE-Q变体。为了产生供生物化学表征的ACE-Q变体酶样品，在96孔MTP中进行ACE-Q SEL成员的选择性生长，在MBD培养基(基于MOPS的定义培养基)中37℃下68小时。

实施例7

BASE变体的性能指数值

在该实施例中，描述了确定BASE及其变体的清洁性能(在pH10/32℃、pH10/50℃、pH8/16℃和pH8/32℃的CS-28微样品测定法)、去污剂稳定性、热稳定性、BPNPG7淀粉酶活性和HPLC蛋白质浓度(目标特性的测试)的实验结果。结果是使用实施例1的方法获得的。如全文所述，BASE变体的功能性定量为性能指数(PI)，其是变体与亲本蛋白质的性能比例。表10-1显示了用于特性测试的多种BASE变体的PI值。指出了在多个氨基酸位置引入的突变。将小于或等于0.05的性能指数调整为0.05。对于每种HPLC蛋白质PI小于或等于0.05的变体，所有的值调整为0.05。此外，对于两次稳定性测量，如果稳定性测定中的初始活性的PI小于或等于0.05，则将相关的稳定性PI调整为0.05。表7-1提供了具有可组合突变的BASE变体的性能指数，其在本文中定义为这样的突变，该突变在变体中对于至少一种特性的PI值≥0.5，且对于所有的特性PI值＞0.05。

出现在表3-2中、但在表7-1中缺失的BASE SEL成员的其他821种突变较不适合包括在亲本α-淀粉酶的组合变体中。天然α-淀粉酶的同样的残基也被认为存在于性能低下的天然α-淀粉酶中(其中该残基位于与该821种非可组合突变相同的对应于SEQ ID NO：2的位置上)，因而是诱变的候选对象。由此，本公开提供了用于产生具有理想的特性组合的变体α-淀粉酶的详细方案。

实施例8

α-淀粉酶中的限制性和非限制性位置

描述了确定BASE及其变体的洗涤性能(在pH10/32℃、pH10/50℃、pH8/16℃和pH8/32℃的CS-28微样品测定法)、去污剂稳定性、热稳定性、BPNPG7淀粉酶活性和HPLC蛋白质浓度(目标特性的测试)的实验结果。结果是使用实施例1所述的方法获得的。如全文所述，BASE变体的功能性定量为性能指数(PI)，其是变体与亲本或对照淀粉酶的性能比例。下述各种术语用于描述该突变：上升突变具有PI＞1；中性突变具有PI＞0.5；无害突变具有PI＞0.05；有害突变具有PI≤0.05；可组合突变是该突变使变体具有对于至少一种特性的PI≥0.5，且对于所有特性＞0.05。可组合突变是可以组合使蛋白质对一种或多种理想特征产生恰当PI的突变。

突变发生的位置如下分类：非限制性位置对至少一种特征具有≥20％的中性突变；限制性位置对于活性和稳定性具有＜20％的中性突变。表8-1显示了限制性位置，其中检测到20％关于活性和稳定性的中性突变(PI＞0.5)。表8-2显示了非限制性位置，其中检测到关于至少一种测试特性≥20％的中性突变(PI＞0.5)。％＝满足中性突变定义的所评估变体的百分比。

一般而言，不应该突变限制性位置，因为对于任何特征，在这些位置上都仅有极少数取代是中性的。当必须改变这类位置时，它们要求氨基酸取代是保守性取代。例如，在58位的2种突变是可组合的，即A58G和A58T，而236位的2种突变是可组合的，即Y236F和Y236W。非限制性位置是最合适用于构建组合文库的位置，因为它们具有大量的可组合突变。因为同源蛋白质共享相同的结构，因此，限制性位置在所有的同源淀粉酶中都是限制性的，因其对于蛋白质的结构和/或功能是重要的。如本公开所示，只有通过测试可能的氨基酸突变和测量一种该蛋白质(例如，α-淀粉酶)的特性，才可以鉴别出限制性位置。应注意，两个限制位点在图1的序列比对中是保守的，但保守本身并非位置是否是限制性的指标。例如，Q71、K72和G73在序列比对中都是保守的，但所有三个位置都具有一些比亲本的活性、稳定性或两者更好的突变。对每种特性具有大于20％中性突变的非限制性位置一般是组合突变的非常好的选择。在α-淀粉酶中，198个测试位置中有115个位置满足该标准。

实施例9

ACE-Q淀粉酶变体的去污剂稳定性

在存在10％去污剂(商业去污剂；失活的)的定义条件下，70℃孵育后，测量ACE-Q(ACE-S243Q)淀粉酶变体的去污剂稳定性，如实施例1所述，使用Ceralpha方法(BPNPG7)确定初始和剩余淀粉酶活性。氨基酸残基的编号对应于BASE α-淀粉酶。表9-1的结果显示为每种变体相对于ACE α-淀粉酶的性能指数(PI)。

表9-1 PI≥0.5的ACE-Q变体的去污剂稳定性

上述及下述表格中：position位置；variant变体

所示变体是SEL数据鉴别出得可组合突变。只显示了PI≥0.5的变体。可以组合这些突变产生稳定性和活性的理想组合。

实施例10ACE-Q变体的清洁性能

如实施例1所述，在pH8/16℃、pH8/32℃、pH10/32℃和pH10/50℃这四种不同的条件下，使用CS28微样品测量ACE-Q(ACE-S243Q)淀粉酶变体的洗涤性能。氨基酸残基的编号对应于BASE α-淀粉酶的编号。表10-1至10-4中的结果显示为每种变体相对于ACE α-淀粉酶的性能指数(PI)。

表10-1 PI≥0.5的ACE-Q变体(118)的CS-28，pH8，16℃洗涤性能

表10-2 PI≥0.5的ACE-Q变体(118)的CS-28，pH8，32℃洗涤性能

表10-3 PI≥0.5的ACE-Q变体(87)的CS-28，pH10，32℃洗涤性能

表10-4 PI≥0.5的ACE-Q变体(73)的CS-28，pH10，50℃洗涤性能

实施例11

BASE单突变变体的热稳定性

从SEL筛选中选择了BASE的23个单突变变体在热失活的100％Persil(Henkel)HDL中进行精确的T_50％确定。商业去污剂的热失活发挥破坏任何酶组分的活性的作用，同时保留非酶组分的特性。选择基于热稳定性和10％Persil HDL稳定性测定中改善的性能指数，如SEL筛选中实施的。表11-1中列举了在100％Persil HDL中选定的变体及其各自的T_50％值。

实施例12

BASE组合变体的热稳定性

如实施例5所述，选择BASE对照淀粉酶的5个位置(N128C，K178L，T182G，A185D和S243Q)来构建组合文库。在该组合文库的32个可能的变体中(命名为BASE-S1至BASE-S32)，在热失活的Persil HDL中测定30个变体的稳定性。表12-1列举了相对野生型BASE(对照淀粉酶)、ACE和ACE-S243Q淀粉酶变体，这些变体、其各自的突变和在Persil HDL中测量的T_50％。

结果显示，ACE和ACE-S243Q相比WT BASE具有显著增加的热稳定性。此外，若干组合变体也表现出显著增加的热稳定性，6个变体(BASE-S26，BASE-S20，BASE-S31，BASE-S12，BASE-S27，BASE-S28)表现出超过50％的稳定性增加。

实施例13

BASE组合变体的清洁性能和热稳定性

如实施例5所述，构建13个组合的BASE变体，整合了性能增强突变和稳定性增强突变。测定α-淀粉酶变体BASE-W1至BASE-W13在两种不同条件(pH8，16℃和pH8，32℃)下对CS28微样品的清洁性能(PI或性能指数)，和在MOPS缓冲液和100％Persil HDL中测定热稳定性(T_50％)，如表13-1所示。

＊BASE-W10变体进一步包含F202Y取代。

结果显示，若干组合变体相比WT BASE表现出显著增加的清洁性能和去污剂稳定性。3种变体，BASE-W9，BASE-W10和BASE-W11，在低温清洁中表现出3倍以上的改善，与此同时表现出1.75倍以上的改善的去污剂稳定性。

实施例14

BASE变体W9、W10、W11和ACE-QK的清洁性能

在洗衣去污剂应用中测试BASE变体W9、W10和W11，和ACE-QK的洗涤性能。在launder-o-meter实验中，使用购自当地超市的热失活的Ariel去污剂(Proctor and Gamble)，在棉花上对CFT CS-28稻淀粉(Center for Testmaterials BV，Vlaardingen，荷兰)和在棉花上对EMPA161淀粉(Test materials AG，St.Gallen，瑞士)测量污渍去除。在Brother Hi-Speed微波炉中，90℃至100℃失活Ariel去污剂8分钟。允许去污剂冷却至低于50℃，然后在微波炉中再次加热7min。重复该步骤1次。

在处理之前和之后，使用Tristimulus Minolta Meter CR-400光学反射测量EMPA样品。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，并与未洗涤污垢(洗涤前)与未污染织物的差异相比，按百分比污渍去除指数(％SRI)表示污渍的清洁。

在launder-o-meter中30℃进行洗涤处理。洗涤时间是45分钟(15分钟达到30℃，然后在30℃下30分钟)，用冷自来水漂洗5分钟时间。将水硬度调节至8.5°GH，并使用4.5ml/L热失活Ariel。污垢负载包括2ea.EMPA 161和2CFT CS-28样品/烧杯+6颗钢球。在洗涤处理后，离心干燥所有的样品，再空气干燥，并如上所述读取光学反射率。对照包括基准的商业酶。图5显示了该结果。

一般而言，BASE变体存在的量是相比对照从约0.05至约0.5ppm改善的性能，BASE变体的相对性能遵循模式W10＞W11＞W9＞ACE-Q。

实施例15

BASE变体X8C、W10EK和ACE-QK的清洁性能

使用Terg-o-tometer，在洗衣去污剂应用中测试BASE变体BASE-X8C(即W11-T131I-T165I)、BASE-W10EK(即，BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)和ACE-S243Q-G475K(即，ACE-QK)的洗涤性能。在16℃进行性能评估。污垢负载包括2ea.CS-28稻淀粉(Centerfor Testmaterials BV，Vlaardingen，荷兰)、2ea.AS-10色素油牛奶(CFT，荷兰)、2ea.EMPA 161玉米淀粉、2ea.EMPA 160巧克力奶油和2ea.EMPA 163粥(EMPA Testmaterials AG，St.Gallen，瑞士)样品/Terg-o-tometer的烧杯，烧杯填充了1L的DI水。水硬度调节为6格令/加仑，使用1.0ml/L热失活的Great Value(Walmart)去污剂。洗涤时间为15分钟。在洗涤处理后，离心干燥所有的样品，再空气干燥。

在处理之前和之后，设定为D65(6500°K)标准照明，使用MinoltaReflectometer Chroma Meter Model CR-410(Konica Minolta)通过光学反射率测量每个污渍。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，按污渍去除指数(SRI)表示污渍的清洁。图6中显示了EMPA 160样品的清洁结果。所有的测试BASE变体相比对照都表现出有效的清洁。

实施例16

BASE变体和枯草杆菌蛋白酶之间的洗涤应用协同作用

在完整规模的洗衣应用中，对巧克力奶油玷污的EMPA 160和粥玷污的EMPA 163样品测量BASE和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L；BPN′Swissprot登录号P00782)之间对污渍去除的协同作用。在缓冲的5mM HEPES(Sigma，H4034)pH8.0和热失活的

2X冷水型去污剂(Proctor & Gamble，Cincinnati，Ohio)中测试EMPA 160和EMPA 163样品的污渍去除。商业去污剂的热失活发挥破坏酶组分的活性同时保留非酶组分的特性的作用。通过将预称重的液体去污剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴2小时来实施热失活。去污剂购自当地超市。未加热和加热的去污剂都在去污剂溶解的5分钟内进行测定，以精确的确定无效的百分比。通过AAPF和Ceralpha测定法测试酶活性。

设定为D65(6500°K)标准照明，使用Minolta Reflectometer CR-410测量在处理前后测量EMPA样品的光学反射率。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，并与未洗涤污垢(洗涤前)与未污染织物的差异相比，按百分比污渍去除指数(％SRI)表示污渍的清洁。在Kenmore洗衣机中进行44L洗涤处理。使用“冷水自动温度(Cold Auto Temperature)”设定装填洗衣机，并使用15,000gpg 3∶1 Ca∶Mg水硬度储液将水硬度调节至6gpg。加入

冷水失活的去污剂(43.12g)，并将温度调节至32℃。加入枯草杆菌蛋白酶至终浓度0.6ppm，加入ACE淀粉酶至终浓度0.1ppm。每种洗涤条件使用4个样品，并加入漂白的棉花双面针织布作为压载物，提供40g/L总织物负载。洗涤条件如下：含二次漂洗(3min)的正常循环(15.5min)，洗涤/漂洗温度为89.6°F/32℃，和快速甩干。在洗涤后，在低热下机器干燥样品，并如上所述读取光学反射率。

如图7A所示，ACE α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中产生协同的清洁效应。用ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α-淀粉酶和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L变体)进行相似的洗衣应用协同测试。如图7B所示，ACE-S243Q-G475K(ACE-QK)α-淀粉酶和BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中产生协同的清洁效应，提示BASE变体和蛋白酶可以在洗衣应用中组合用于更优异的清洁。

实施例17

BASE变体和枯草杆菌蛋白酶的剂量效应

使用Terg-o-tometer产生选定浓度的ACE-S243Q和枯草杆菌蛋白酶(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L；BPN′Swissprot登录号P00782)的剂量效应曲线。在20℃和40℃都进行性能评估。一般而言，将2ea样品的CS-28稻淀粉(Center for Testmaterials BV，Vlaardingen，荷兰)、AS-10色素油牛奶(CFT of Holland)、EMPA 161玉米淀粉、EMPA160巧克力奶油，和EMPA 16粥(EMPA Testmaterials AG，St.Gallen，瑞士)置于Terg-o-tometer的不锈钢容器中，该容器中装有1L的DI水和1.0g商业

(Sun Products，购自美国)洗衣去污剂或4.5g OMO^TM(Unilever，购自丹麦)洗衣去污剂。同时运行两个重复。除非另外指出，该测试进行12分钟，并漂洗样品3分钟。在洗涤后，将样品空气干燥。

在处理之前和之后，设定为D65(6500°K)标准照明，使用MinoltaReflectometer Chroma Meter Model CR-410(Konica Minolta)测量每个污渍的光学反射率。如CIE-LAB彩色空间定义的，将L、a、b值的差异转化为总色差(dE)。通过采用洗涤之前和之后的色差之间的比例，按污渍去除指数(SRI)表示污渍的清洁。

表17-1所示结果证实，BASE变体和蛋白酶的组合对一些技术性清洁污垢产生了显著的清洁益处。这些数据证实，使用BASE变体和蛋白酶的组合获得了独一无二的清洁益处。

表17-1：含蛋白酶的ACE-S243Q的清洁性能

如上所述，进一步在EMPA 160和EMPA 163样品上测试其他的BASE变体(即，BASE-X8C(即，W11-T131I-T165I)、BASE W10EK(即，BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K)和ACE-S243Q-G475K(即，ACE-QK))与BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶的洗衣应用协同效应。图8(BASE-X8C)、图9(BASE W10EK)和图10(ACE-QK)显示了该结果。这些数据证实使用BASE变体与蛋白酶组合获得独一无二的清洁益处。

本说明书中提及的所有专利和出版物是发明所属领域的技术人员的水平指标。本领域技术人员可以容易的理解，本发明很适于实施所提及的目标并获得该结果和优势，以及其他本文内在的属性。本文描述的组合物和方法代表优选实施方案，是示例性的，并非旨在限制本发明的范围。在不脱离发明的范围和精神的条件下，可以对本文公开的发明进行多种取代和修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。

本文说明性描述的发明可以适当地在缺少本文未具体公开的任何要素或限制的情况下实施。所使用的术语和表述用于描述而非限制，这些术语和表述的使用并不旨在排除该特征的任何等同物或其部分，而是应该认识到，在要求保护的本发明范围内可以有多种修改。因此，应该理解，尽管通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可应用本文所公开概念的修饰和变体，这些修饰和变体均认为落入所附权利要求书所限定的本发明范围之内。

本文已经宽泛并一般性地描述了发明。落入一般性公开范围内的任何较小种类和亚类也都构成发明的一部分。这包含对本发明的一般性描述，其前提或反面限制为从该类中去除任何主题，无论所去除的内容是否在本文中具体描述。

本领域技术人员易于理解，本公开及其内在可良好的适应进行所提及的目标，和获得所提及的结果和优势。所有专利和出版物都引入本文作为参考，就像每个出版物都具体并单独引入本文作为参考。然而，任何出版物的引用都不认为是承认其是本发明的现有技术。

已描述了本发明的示例性实施方案，可以对最接近的实施方案进行多种修饰，这对本领域普通技术人员是显而易见的，并且此类修饰旨在落入本发明的范围内。

Claims (38)

1.分离的α-淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的α-淀粉酶的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37，50，51，52，53，54，55，56，59，60，70，71，72，73，75，78，83，87，90，91，93，94，95，104，105，107，108，110，112，113，116，118，125，126，128，129，130，131，134，136，138，142，144，147，149，150，152，154，156，158，160，161，162，165，166，168，169，170，172，174，177，178，182，183，185，189，192，195，197，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，236，237，246，250，254，255，257，264，267，269，270，272，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，447，448，451，453，459，465，470、475、476、483和484的一个或多个位置上包含取代；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且

其中一个或多个位置上的天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.0，且活性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

2.权利要求1的分离的α-淀粉酶变体，其在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401和438的一个或多个位置上包含取代，并且其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数＞1.5和稳定性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

3.权利要求1的分离的α-淀粉酶变体，其在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数＞1.5和活性测量的性能指数＞1.0的α-淀粉酶变体。

4.权利要求1的分离的α-淀粉酶变体，其在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代。

5.分离的α-淀粉酶变体，其在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476和483的一个或多个位置上包含取代，其中所述位置对应于SEQ IDNO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去污剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一中有益效果。

6.分离的α-淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的α-淀粉酶的成熟形式，并且在选自5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483和484的一个或多个位置上包含取代；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且

其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了下述α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体在pH8下的活性、pH10下的活性、16℃下的活性、32℃下的活性的性能指数值为0.5或更高，在去污剂中的稳定性或热稳定性的性能指数值为0.5或更高。

7.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述不同氨基酸残基选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y，条件是所述不同氨基酸残基与天然出现的氨基酸残基不同。

8.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其进一步包含在对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的243位上的取代。

9.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其进一步包含在对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的180位和/或181位上的缺失。

10.前述权利要求中任一项的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，所述亲本α-淀粉酶具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少75％相同的氨基酸序列。

11.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少75％的序列同一性。

12.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少80％的序列同一性。

13.前述权利要求中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少90％的序列同一性。

14.前述权利要求中任一项的α-淀粉酶变体，其中所述变体在选自对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去污剂稳定性。

15.权利要求1的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体包含：

(a)在125位的丙氨酸，

在128位的半胱氨酸，

在131位的异亮氨酸，

在165位的异亮氨酸，

在178位的亮氨酸，

在182位的甘氨酸，

在202位的酪氨酸，

在305位的精氨酸，

在319位的苏氨酸，或

在475位的精氨酸；

(b)取代N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和选自S125A、T131I、T165I、F202Y和D319T的至少一种其他的取代；或

(c)取代

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K，

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K；

其中所述变体任选还包含在243位上的取代，和/或在180位和/或181位上的缺失；和

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

16.权利要求1的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体包含475位上的取代。

17.权利要求16的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体包含475位上的精氨酸。

18.权利要求16或17的α-淀粉酶变体，其还包含在243位上的取代，和/或在180位和/或181位上的缺失。

19.分离的α-淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37、50、51、52、53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483和484的一个或多个位置上包含取代；

其中所述位置对应于SEQ ID NO：2所示的对照α-淀粉酶的氨基酸序列编号。

20.权利要求1或19的α-淀粉酶变体，其中所述在一个或多个位置上的取代是在1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个位置上的取代。

21.权利要求1或19的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。

22.权利要求19的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，所述亲本α-淀粉酶具有与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14组成的组的成员至少75％相同的氨基酸序列。

23.分离的核酸，其编码前述权利要求中任一项的α-淀粉酶变体。

24.表达载体，其包含权利要求23的分离的核酸，所述分离的核酸与启动子有效组合。

25.宿主细胞，其包含权利要求24的表达载体。

26.清洁组合物，其包含前述权利要求中任一项的α-淀粉酶变体。

27.权利要求26的清洁组合物，其进一步包含至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。

28.权利要求27的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是蛋白酶。

29.权利要求28的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。

30.权利要求29的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’或其变体。

31.权利要求30的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’Y217L或其变体。

32.清洁织物或硬表面的方法，其包括将织物或硬表面与权利要求26的清洁组合物接触。

33.权利要求32的方法，其中所述清洁组合物进一步包含至少一种表面活性剂。

34.权利要求32或33的方法，其中所述清洁组合物进一步包含至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。

35.权利要求34的方法，其中所述至少一种其他酶是蛋白酶。

36.权利要求35的方法，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。

37.权利要求36的方法，其中所述至少一种其他酶是BPN’Y217L枯草杆菌蛋白酶。

38.权利要求37的方法，其中所述α-淀粉酶变体包含取代：

N128C+K178L+T182G+F202Y+S243Q+Y305R+D319T+G475K，

S125A+N128C+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K，或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K。

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