ES2843276T3 - Variantes de amilasa - Google Patents
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
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Abstract
Amilasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 67 % con SEQ ID NO: 1 y que difiere de SEQ ID NO: 1 en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos: i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1: 3, 475, 314, ii) 4, 476, 315, en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
Description
DESCRIPCIÓN
Variantes de amilasa
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de las amilasas, particularmente alfa-amilasas, y a composiciones que comprenden tales amilasas. También se describen medios y procedimientos para producir tales amilasas y usos de amilasas y composiciones que comprenden amilasas, por ejemplo, para limpiar manchas que contienen almidón, desencolado textil, licuefacción y sacarificación del almidón, horneado y preparación de cerveza. La invención también desvela medios para aumentar la pureza de la amilasa durante la fermentación, la formulación y el almacenamiento de amilasa o formulaciones que contienen amilasa.
Antecedentes
El almidón es una mezcla de amilosa, que consiste en glucosa enlazada en alfa-1-4 y amilopectina, que comprende glucosa enlazada en alfa-1-4 y glucosa enlazada en alfa-1-6. Las amilasas catalizan la ruptura de enlaces glucosídicos en amilosa, amilopectina, glucógeno y polisacáridos relacionados. Específicamente, las alfa-amilasas catalizan la escisión de la hidrólisis de enlaces (1-4)-alfa-D-glucosídicos aleatorios. Pertenecen a la familia 13 de la clasificación CAZY de glucosil hidroxilasas.
Las amilasas y, en particular, las alfa-amilasas se han usado para diferentes fines, incluyendo la limpieza de manchas que contienen almidón, particularmente en el lavado de ropa y el lavado de vajilla, desencolado textil, modificación del almidón, licuefacción y sacarificación, particularmente en la industria de la pulpa y el papel, para la producción de jarabe y en la industria de piensos, horneado y preparación de cerveza.
Para aplicaciones industriales de enzimas, la homogeneidad de los lotes de productos es importante. En particular para aquellas aplicaciones en las que las enzimas y las composiciones enzimáticas se ponen en contacto directo con seres humanos o animales, por ejemplo, en composiciones de limpieza y producción de alimentos o piensos, deben emplearse estrictas normas de control de calidad. Un objeto de dicho control de calidad es asegurarse de que no se incluyan accidentalmente sustancias adversas en la composición. Idealmente, una composición enzimática no debe comprender formas degradadas de la enzima respectiva que puedan, por ejemplo, influir en la especificidad del sustrato de la enzima o dar lugar a precipitación. Otro objeto es comprobar que la preparación enzimática analizada en los controles de calidad es representativa del lote total a vender. Además, debe establecerse si la enzima de la composición de la enzima cambiará en el tiempo entre el muestreo para el control de calidad y la venta a un cliente y/o en el tiempo hasta el uso final.
Se ha descubierto ahora que la homogeneidad de las amilasas disponibles en el mercado es insuficiente a gran escala. Particularmente, se ha descubierto inesperadamente que lo que se vende como composiciones comerciales que comprenden solo una enzima (por ejemplo, Termamyl® o Stainzyme®), es decir, una amilasa determinada por SDS-PAGE, generalmente comprende varias especies de polipéptidos que pueden separarse mediante isoelectroenfoque o cromatografía de intercambio iónico (también denominada en el presente documento "amilasa parental" y "fantasma"/"fantasmas").
Dado que la secuenciación de proteínas es engorrosa y costosa, la secuencia exacta de aminoácidos de los polipéptidos que incluyen enzimas generalmente se predice solo sobre la base de las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos que se van a producir. Sin embargo, el descubrimiento anterior de que las composiciones enzimáticas supuestamente puras, es decir, composiciones que comprenden solo una especie de polipéptido, comprenden realmente varias especies de polipéptidos requiere la conclusión de que las composiciones vendidas comprenden cantidades significativas de polipéptidos de estructura primaria, secundaria y terciaria desconocidas. Por lo tanto, a menos que se realice una secuenciación completa de proteínas de todas las especies individuales de amilasa de una composición, lo que generalmente no se hace, actualmente no es posible proporcionar suficiente información para realizar un análisis de libertad de funcionamiento adecuado por parte de los fabricantes de amilasa o de clientes de los mismos.
Sumario
El objeto general de la presente invención es aliviar, reducir o retirar los problemas descritos anteriormente. En particular, era el objeto de la presente invención proporcionar medios y procedimientos para mejorar la homogeneidad de las composiciones que comprenden una o más amilasas (también denominadas en el presente documento "composiciones de amilasa"), particularmente una o más alfa-amilasas. Además, era un objeto de la presente invención proporcionar composiciones que tuvieran una homogeneidad de polipéptidos mejorada.
De acuerdo con la presente invención se proporcionan variantes de amilasa que facilitan la producción de composiciones de amilasa que tienen una homogeneidad aumentada en comparación con las composiciones preparadas usando la amilasa de tipo silvestre correspondiente o, de manera más general, las amilasas correspondientes que no comprenden las dos o más sustituciones como se describe en el presente documento.
Particularmente, la presente invención se dirige a una amilasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 67 % con SEQ ID NO: 1 y que difiere de SEQ ID NO: 1 en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
ii) 4, 476, 315,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
En el presente documento se describen variantes de amilasa adicionales que tienen una identidad de secuencia de al menos el 65 % con SEQ ID NO: 1 y se diferencian de la misma en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
6, 95, 195,
423,
150, 226, 255, 418,
22, 106, 285, 484,
ii) 4, 476, 315,
7, 96, 196,
424,
151,227, 256, 419,
23, 107, 286, 485,
en la que las sustituciones del grupo i) se seleccionan de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente se seleccionan de cualquiera de A, G, K, R, S, T, y en la que las sustituciones del grupo ii) se seleccionan de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
La invención también proporciona composiciones de amilasa con una disposición reducida a la forma de polipéptidos fantasma como se define en el presente documento en comparación con las correspondientes composiciones de amilasa que comprenden la amilasa parental respectiva como se define en el presente documento.
También, la presente invención proporciona composiciones de amilasa que tienen una disposición reducida para formar ácido isoaspártico ("isoAsp" o "J" en lo sucesivo en el presente documento) y/o ácido isoglutámico en comparación con las composiciones de amilasa correspondientes que comprenden la amilasa parental respectiva como se define en el presente documento.
Las composiciones de amilasa proporcionadas de acuerdo con la presente invención se eligen preferentemente de composiciones de limpieza, composiciones alimenticias, composiciones de piensos, composiciones de desencolado de textiles y composiciones de tratamiento de pulpa.
También, la invención proporciona procedimientos para preparar composiciones de amilasa que tienen una homogeneidad aumentada en comparación con las composiciones de amilasa correspondientes que comprenden la amilasa original respectiva.
Además, la presente invención proporciona procedimientos para analizar la calidad de la composición de amilasa, preferentemente para la determinación de la homogeneidad del lote de la composición de amilasa.
Algunos aspectos adicionales de la invención se describen en la sección de descripción detallada, ejemplos, figuras, secuencias y reivindicaciones.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 sección madura de la alfa-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)
SEQ ID NO: 2 S707 (sección madura) Uniprot ID P19571
SEQ ID NO: 3 LAMY (sección madura) Uniprot ID O82839
SEQ ID NO: 4 Secuencia SEQ ID NO: 3 del documento US8017351
SEQ ID NO: 5 Secuencia SEQ ID NO: 8 del documento US7713723
SEQ ID NO: 6 Secuencia SEQ ID NO: 1 del documento US7629158
Breve descripción de las figuras
FIGURA 1 SDS-PAGE (A) e isoelectroenfoque (B) de alfa-amilasas. La carga total de proteína fue aproximadamente 40 |jg de cada alfa-amilasa en SDS-PAGE y 65 |jg de cada alfa-amilasa en gel de isoelectroenfoque.
FIGURA 2 Separación cromatográfica de alfa-amilasas purificadas mediante cromatografía de intercambio catiónico (Protein-Pak Hi Res CM, Waters). A: SEQ ID NO: 1; B, C: las amilasas comerciales mencionadas anteriormente. Las soluciones madre de alfa-amilasas descritas en la sección "Procedimientos" de la descripción detallada se diluyeron 1:5 con tampón A. El volumen de inyección fue 50 j l (igual a una inyección de proteína total de aproximadamente 25 -100 jg). Tampón de partida (A): Tampón de elución MES 25 mM pH 5,4 (B): MES 25 mM pH 5,4 NaCl 0,5 M. La elución se efectuó con un gradiente lineal del 5-32 % de B en 22 min a un caudal de 1 ml/min.
FIGURA 3 Separación preparativa de alfa-amilasa SEQ ID NO: 1 mediante cromatografía de intercambio catiónico (Protein Pak Sp 8HR, waters). Cinco fracciones, F1 - F5 se recogieron como se indica en naranja. Se cargó una cantidad total de 3 mg de proteína en la columna. Tampón de partida (A): Tampón de elución MES 25 mM pH 5,4: MES 25 mM pH 5,4 NaCl 0,5 M. La elución se efectuó con un gradiente lineal del 0 - 40 % de B en 40 min.
FIGURA 4 Isoelectroenfoque de fracciones de SEQ ID NO: 1 obtenidas a partir de la separación preparativa en cromatografía de intercambio iónico, mostrada en la figura 3. Todas las muestras se ajustaron a la misma concentración de proteína (Bradford). Se cargaron 25 j l que contenían 35 jg de proteína total en el carril A, se cargaron 25 j l que contenían 12,5 jg de proteína total en todos los demás carriles. F1 - F5 = fracción 1-5 de la figura 3, A = SEQ ID NO: 1 sin tratar, M = marcador. El pl teórico de SEQ ID NO: 1 se calculó que era 6,61.
FIGURA 5 Actividades de alfa-amilasa específicas de SEQ ID NO: 1 obtenidas a partir de la separación preparativa en cromatografía de intercambio iónico, determinado por el ensayo EPS descrito en la sección "Procedimientos" de la descripción detallada. La actividad medida se dividió entre la concentración de las muestras respectivas (estimada por absorción a 280 nm) para obtener la actividad específica. Las actividades de la muestra se normalizaron a la actividad de la Fracción 5. Se realizaron cinco repeticiones. Las barras de error muestran las desviaciones estándar.
FIGURA 6 Desplazamiento del tiempo de retención de la alfa-amilasa SEQ ID NO: 1 inducido por degradación forzada como se observa en un intercambiador de cationes (Protein-Pak Hi Res CM, Waters). La fracción 5 de la figura 2 se incubó en tampón fosfato 25 mM pH 8,0 a 37 °C. La cromatografía se realizó en diferentes momentos. Se diluyeron 20 j l de la muestra incubada con 80 j l de tampón A. El volumen de inyección fue de 50 jl. La elución se efectuó con un gradiente lineal del 5-32 % de B en 22 min a un caudal de 1 ml/min.
FIGURA 7 Desplazamiento de carga en isoelectroenfoque de SEQ ID NO: 1 inducido por degradación forzada. Todas las muestras se ajustaron a la misma concentración de proteína (Bradford). Se cargaron 15 j l que contenían 50 jg de proteína total en el carril A, se cargaron 15 j l que contenían 25 jg de proteína total en todos los demás carriles. A = SEQ ID NO: 1 sin tratar, M = marcador.
FIGURA 8 Desplazamiento de carga en isoelectroenfoque de Termamyl® inducido por degradación forzada. Todas las muestras se ajustaron a la misma concentración de proteína (Bradford). Se cargaron 15 j l que contenían 50 jg de proteína total en los carriles de muestra. M = marcador.
FIGURA 9 Cromatograma de recuento de iones totales de alfa-amilasa SEQ ID NO: 1 después de la digestión con tripsina. Se muestra la fracción 5 sin tratar (rojo) y la fracción 5 después de 145 h de incubación en tampón fosfato 20 mM a pH 8/37 °C (azul). Los cromatogramas de ambas muestras parecen idénticos, excepto por la ausencia completa del péptido N-terminal (m = 3220,29 Da) en la muestra estresada y un aumento del péptido m 1 N-terminal (m = 3221,28 Da) en la muestra degradada.
FIGURA 10 Representación de posiciones dentro de SEQ ID NO: 1 que puede estar sustituido de acuerdo con la invención.
FIGURA 11 Alineación de SEQ ID NO: 1-4.
FIGURA 11a Alineación de SEQ ID NO: 1-6.
FIGURAS 12-15 Alineaciones de secuencias de amilasa preferidas, en las que cada X independientemente entre sí se selecciona de acuerdo con los correspondientes grupos anteriores i) o ii), respectivamente. Esto es, cuando X reemplaza a una N de acuerdo con SEQ ID NO: 1, X se selecciona de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente se seleccionan de cualquiera de A, G, K, R, S, T, y cuando X reemplaza un aminoácido en una posición de acuerdo con SEQ ID NO: 1 correspondiente al grupo ii), X se selecciona de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
Descripción detallada
Se ha descubierto ahora que la desamidación espontánea de amilasas es uno de los principales contribuyentes a la
falta de homogeneidad de la composición de amilasa y ya se produce en el procesamiento de fermentación y purificación posterior a la fermentación y en la formulación de amilasas.
Este descubrimiento fue sorprendente, porque hasta ahora la desamidación solo se ha considerado un factor que influye en la estabilidad de las amilasas a temperaturas superiores a 60 °C; hasta ahora no se ha considerado que la desamidación contribuya a la homogeneidad del lote de composición de amilasa, ni se ha previsto que la desamidación pueda producirse de forma significativa durante las condiciones habituales de procesamiento de fermentación y posterior a la fermentación. Por ejemplo, Tomazic y col. (J Biol. Chem 1988, 3093-3096) después de comparar la estabilidad de la amilasa de Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis a 60 °C y 95 °C concluyen que es muy probable que la desamidación contribuya a la inactivación térmica irreversible de las amilasas. Asimismo, Declerck y col. (J Mol. Biol. 2000, 1041-1057) analizan el aumento de la termoestabilidad de la amilasa de Bacillus licheniformis, es decir, su semivida a 80 °C a pH 5,6 en CaCh 0,1 mM, por sustituciones de un solo aminoácido. Los autores descubrieron tres sustituciones que aumentan la termoestabilidad de la amilasa en comparación con la forma de tipo silvestre (RS mayor o igual a 3), estando las sustituciones, en la numeración de SEQ ID NO: 1, en las posiciones 135, 195 y 214, en la que en la posición 195 la asparagina se reemplaza por fenilalanina para aumentar la termoestabilidad. De nuevo, los autores no analizan la homogeneidad del lote de amilasa ni la aparición de desamidación a temperaturas inferiores a 60 °C. La termoestabilidad de la alfa-amilasa de Bacillus sp. KR-8104 ha sido analizada por Rahimzadeh y col. (Int J Biol Macromol 2012, 1175-1182); los autores analizan la estabilidad de dicha amilasa y variantes de la misma a 65 °C y 70 °C. Los autores no investigan ni analizan la homogeneidad del lote de amilasa ni la aparición de desamidación a temperaturas inferiores a 60 °C. Por lo tanto, los documentos anteriormente mencionados no proporcionan ninguna indicación para el experto de cómo mejorar la homogeneidad del lote de amilasa. Tampoco proporcionan ningún indicio de que la desaminación pueda contribuir a la falta de homogeneidad del lote o que la desaminación se produciría de forma significativa también a temperaturas inferiores a 60 °C. En su lugar, los documentos llevan al experto en la materia a creer que la desamidación es un problema solo relevante a temperaturas superiores a 60 °C. Como los procedimientos típicos de fermentación y posteriores a la fermentación, purificación y formulación se llevan a cabo a temperaturas de 37 °C, y como el experto en la materia suele evitar temperaturas más altas para minimizar la desnaturalización aleatoria y, por tanto, la inactivación térmica, la persona experta no tenía motivos para temer que durante la fermentación, la purificación y/o formulación de amilasas, la desamidación podría ser un factor de modificación de amilasa post-traduccional de mayor impacto que los procedimientos de desnaturalización aleatoria. Por tanto, la persona experta se distrae eficazmente de la presente invención con los documentos anteriores. Es importante señalar que la desamidación no se correlaciona necesariamente con una pérdida general de actividad de amilasa.
También, las referencias de patentes parecen carecer de cualquier indicación para mejorar la homogeneidad del lote de amilasa. En cambio, las referencias de patentes describen sustituciones, inserciones o deleciones individuales de amilasas específicas para mejorar los rasgos deseados, principalmente rendimiento de lavado y supresión de la formación de agregados, como se ejemplifica en los documentos WO2006037483 y WO2013063460. Estos documentos no analizan los procedimientos de desamidación, particularmente a temperaturas por debajo de 60 °C, y no permiten extrapolar cómo las mutaciones individuales allí desveladas deben o incluso podrían combinarse para lograr protección contra la desamidación durante la fermentación, purificación y formulación de amilasas. En particular, el experto en la materia debe tener en cuenta que una mutación en una posición de la estructura primaria de una amilasa puede reducir inesperadamente el grado de libertad de mutaciones en otras posiciones de la estructura primaria. Por lo tanto, la persona experta en general duda en combinar al azar mutaciones individuales, ya que normalmente tendría que comprobar in vitro si el resultado de mutaciones combinadas tiene el efecto deseado y no produce efectos no deseados, particularmente pérdida o disminución de actividad enzimática.
De acuerdo con la presente invención se proporcionan de esta manera variantes de amilasa que facilitan la producción de composiciones de amilasa que tienen una homogeneidad de amilasa aumentada en comparación con las composiciones preparadas usando la amilasa parental correspondiente.
Para los fines de la presente invención, se considera que una amilasa es una enzima que cataliza la hidrólisis del almidón en azúcares, y una alfa-amilasa se considera que es una enzima capaz de hidrólisis de enlaces (1-4)-alfa-D-glucosídicos aleatorios. A menos que se indique específicamente, los términos "amilasa" y "alfa-amilasa" se usan indistintamente en el presente documento. Los polipéptidos incapaces de tal catálisis de acuerdo con la invención no se consideran amilasas y/o alfa-amilasas. Particularmente, los productos de degradación de amilasas y alfa-amilasas incapaces de realizar la catálisis respectiva anteriormente mencionada no se consideran amilasas o alfa-amilasas, respectivamente.
Dentro del contexto de la presente invención, un "fantasma" o "polipéptido fantasma" de una composición es un polipéptido resultante de la desamidación de una amilasa o alfa-amilasa "parental" correspondiente añadida originalmente a la composición. En particular, los polipéptidos que incorporan isoAsp se consideran fantasmas dentro del contexto de la presente invención. Cabe señalar que la designación de un polipéptido como "fantasma" es independiente de su actividad catalítica amilasa o alfa-amilasa.
De acuerdo con la presente invención, la homogeneidad de la composición de amilasa (también llamada homogeneidad del lote de amilasa) se mide como la relación molar de fantasmas con respecto a su amilasa parental respectiva.
Al referirse a la identidad de la secuencia de aminoácidos, alineación o numeración de secuencias de aminoácidos para los fines de la presente invención, se entiende el algoritmo de alineación y puntuación de Needleman-Wunsch. La alineación y puntuación se realiza mediante la matriz BLOSUM50, una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2. El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se calcula preferentemente como el número de aminoácidos idénticos después del alineamiento por pares dividido entre el total de pares de aminoácidos obtenidos por el alineamiento; la similitud de la secuencia de aminoácidos se calcula preferentemente como el número de pares de aminoácidos después del alineamiento que tiene una puntuación de la matriz BLOSUM50 superior a 0 dividido entre el número total de pares de aminoácidos obtenidos por el alineamiento. Preferentemente, las alineaciones y puntuaciones (identidad y similitud) se calculan usando el programa MatGAT v2.0 descrito por Campanella y col., BMC Bioinformatics 2003, doi:10.1186/1471-2105-4-29. En las figuras 11, 11a, 12-15, se muestran alineaciones de secuencias de amilasa maduras variables. La secuencia superior es siempre SEQ ID NO: 1 y la numeración de las posiciones está de acuerdo con las posiciones de los aminoácidos en SEQ ID NO: 1. En cada alineación, solo aquellos aminoácidos de secuencias distintas de SEQ ID NO: 1 se indican explícitamente que difieren del aminoácido correspondiente de acuerdo con SEQ ID NO: 1; donde los aminoácidos son idénticos al aminoácido en la posición correspondiente en SEQ ID NO: 1, un punto "." Indica tal identidad de aminoácidos. Las deleciones relativas a SEQ ID NO: 1 se indican mediante "-" para cada aminoácido eliminado; las inserciones relativas a SEQ ID NO: 1 se indican mediante "-" en la secuencia de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, cuando por ejemplo SEQ ID NO: 1 de acuerdo con una figura comprende las letras "YGI—PTH", la secuencia de aminoácidos real de la amilasa de acuerdo con SEQ ID NO: 1 en esta ubicación es "YGIPTH", porque las barras "—" indican que al menos otra secuencia en esta figura tiene una inserción de tres aminoácidos en esta ubicación en comparación con SEQ ID NO: 1. Y cuando para la secuencia SEQ ID NO: 5 en esta ubicación las letras "..TKGDSQ" se dan en una figura, la secuencia de amilasa real SEQ ID NO: 5 en esta ubicación es "YGTKGDSQ", porque los puntos ".." se reemplazan por los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 - "YG" - y todos los aminoácidos restantes en el ejemplo para SEQ ID NO: 5 se detallan explícitamente en la figura; son por lo tanto diferentes de la secuencia dada para SEQ ID NO: 1 en la figura. Las secuencias de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4 también se dan en la figura 11 del documento de prioridad, con los fines de describir la invención relativa a estas secuencias, se incorpora en el presente documento dicha figura 11 y la correspondiente descripción del documento de prioridad.
Las amilasas de la presente invención generalmente se codifican mediante ácidos nucleicos que también codifican dos o tres dominios proteicos: Un dominio de señal responsable de la excreción de la amilasa, un pro-dominio para la inactivación temporal de la amilasa, y la amilasa como tal. Después de la escisión del pro-dominio (y el señal) se obtiene una amilasa madura resultante (la "amilasa como tal"). Para los fines de la presente invención, el término amilasa o alfa-amilasa se refiere a la forma madura del polipéptido. Siempre que las secuencias de aminoácidos que comprenden pro-dominios y/o pro-dominios señal se alinean con una amilasa madura tal como se indica en las secuencias de acuerdo con la presente invención, los aminoácidos de los pro-dominios y pro-dominios señal se numeran por números enteros negativos descendentes como se ejemplifica, por ejemplo, en la sección de protocolo de secuencia del documento WO2006037484.
Dentro del marco de la presente invención los aminoácidos son nucleótidos a los que se hace referencia generalmente por sus códigos de 3 letras o de 1 letra.
Particularmente, la presente invención se dirige a una amilasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 67 % con SEQ ID NO: 1 y que difiere de SEQ ID NO: 1 en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
ii) 4, 476, 315,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
También se describen en el presente documento variantes de amilasa que se prefieren de acuerdo con la invención que tienen una identidad de secuencia de al menos el 65 % con SEQ ID NO: 1 y se diferencian de la misma en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
6, 95, 195,
423,
150, 226, 255, 418,
22, 106, 285, 484,
ii) 4, 476, 315,
7, 96, 196,
424,
151,227, 256, 419,
23, 107, 286, 485,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente se seleccionan de cualquiera de A, G, K, R, S, T, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
Como se indicó anteriormente, ahora se ha descubierto que la desamidación de las amilasas se produce espontáneamente y en un grado significativo también durante los procedimientos de fermentación, purificación y formulación en los que se evita el calentamiento de composiciones que contienen amilasa a temperaturas >45 °C y generalmente no se producen durante más de 30 min, preferentemente durante menos de 15min, incluso más preferentemente durante menos de 8 min, incluso más preferentemente durante menos de 4 min y lo más preferentemente no se producen en absoluto. Por lo tanto la presente invención proporciona medios, particularmente amilasas, que reducen la formación de "fantasmas" (productos de desamidación) durante el calentamiento durante 4 min de composiciones que contienen amilasa a una temperatura de 40 °C, preferentemente durante el calentamiento durante 8 min, más preferentemente durante el calentamiento durante hasta 15 min, incluso más preferentemente durante el calentamiento durante hasta 30 min. El pH de la composición durante el tratamiento térmico no es menos de 5 y preferentemente como máximo 9, más preferido como máximo 8,5, incluso más preferido como máximo 8, incluso más preferido como máximo 7,5, incluso más preferido como máximo 7, incluso más preferido como máximo 6,5 e incluso más preferido como máximo 6.
En el presente documento se describe que las amilasas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 65 % con SEQ ID NO: 1 son particularmente propensas a la desamidación en la posición 3 de SEQ ID NO: 1. Una amilasa purificada de SEQ ID NO: 1 se convierte eficazmente en un fantasma de la misma, es decir, tiene la posición 3 desamidada a >50 % dentro de las 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C. Los fantasmas desamidados comprenden, en la posición desamidada, isoAsp o ácido aspártico. La incorporación de isoAsp en una amilasa es particularmente desfavorable, ya que este beta aminoácido distorsiona fuertemente la estructura terciaria de la amilasa. En los dominios de hoja beta de tipo silvestre, isoAsp previene el enlace de hidrógeno directo requerido para apoyar la formación de hoja beta en el sitio de la desaminación, alterando de esta manera las propiedades superficiales del polipéptido desamidado, facilitando la agregación de fantasmas y/o la formación de agregados fantasma-amilasa y promoviendo cambios conformacionales también en la amilasa "parental" no desaminada. Además, la presencia de isoAsp generalmente está implicada en la formación de agregados de proteínas en enfermedades neurodegradativas y formación de cataratas. Por lo tanto, la incorporación de isoAsp en polipéptidos es indeseable, particularmente para aplicaciones en las que humanos o animales entran en contacto directo con polipéptidos, en particular en composiciones de limpieza, composiciones alimenticias, composiciones de piensos, composiciones de desencolado textil, composiciones para el tratamiento de la pulpa y usos correspondientes de las mismas. La presente invención permite ventajosamente reducir o evitar la formación de isoAsp y ácido isoglutámico en amilasas, aliviando o evitando de esta manera las preocupaciones anteriormente mencionadas.
Las sustituciones del grupo i) están diseñadas para retirar un sitio de desamidación potencial de acuerdo con SEQ ID NO: 1. Dentro del grupo i), se prefieren las sustituciones en la primera línea de posibles posiciones de sustitución a las sustituciones que implican solo las posiciones nominadas en la segunda línea o en las siguientes, se prefieren las sustituciones en la segunda línea sobre las sustituciones que implican solo posiciones nominadas en la tercera o siguientes líneas, etc. Por lo tanto, se prefieren las sustituciones en cualquiera de las posiciones 3, 475, 314 sobre las amilasas en las que sólo las posiciones enumeradas en la segunda o siguientes líneas del grupo i) están sustituidas de acuerdo con la invención.
Dentro del grupo de sustituciones en las posiciones 3, 475 y 314, la sustitución de acuerdo con la invención en la posición 3 son las más preferidas. Por lo tanto, una variante de amilasa de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente, en comparación con SEQ ID NO: 1, una sustitución de la posición 3 como se define anteriormente y al menos una sustitución adicional en otra posición definida en el grupo i) y/o ii) anterior.
Las amilasas de la presente invención comprenden preferentemente, en su extremo N, un motivo XXXNGTXMQ. Este motivo se ajusta al oligopéptido que comienza en la posición 3 de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, el 4o aminoácido de dicho motivo - "N" - corresponde al 6o aminoácido de SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la primera X se reemplaza por cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente por cualquiera de A, G, K, R, S, T. Los motivos preferidos son por lo tanto: AGTNGTMMQ, DGTNGTMMQ, EGTNGTMMQ, FGTNGTMMQ, GGTNGTMMQ, HGTNGTMMQ, IGTNGTMMQ, KGTNGTMMQ, LGTNGTMMQ, PGTNGTMMQ, RGTNGTMMQ, SGTNGTMMQ, TGTNGTMMQ, VGTNGTMMQ, WGTNGTMMQ, YGTNGTMMQ, siendo AGTNGTMMQ, GGTNGTMMQ, KGTNGTMMQ, RGTNGTMMQ, SGTNGTMMQ, TGTNGTMMQ particularmente preferidos. Por las razones que se describen más adelante en el presente documento, los siguientes motivos son más preferidos: AGTNGTLMQ, DGTNGTLMQ, EGTNGTLMQ, FGTNGTLMQ, GGTNGTLMQ, HGTNGTLMQ, IGTNGTLMQ, KGTNGTLMQ, LGTNGTLMQ, PGTNGTLMQ, RGTNGTLMQ, SGTNGTLMQ, TGTNGTLMQ, VGTNGTLMQ, WGTNGTLMQ, YGTNGTLMQ, siendo AGTNGTLMQ, GGTNGTLMQ, KGTNGTLMQ, RGTNGTLMQ, SGTNGTLMQ, TGTNGTLMQ aún más preferidos. En todos estos motivos, el tripéptido "TNG" puede intercambiarse por cualquiera de "VNG" y "LNG".
Las sustituciones del grupo ii) como se definen anteriormente están diseñadas específicamente para reducir la desamidación de cualquier Asn inmediatamente anterior a las posiciones enumeradas en el grupo ii). El experto en la materia entenderá que de acuerdo con la invención, mediante el intercambio de un pequeño aminoácido como se encuentra en SEQ ID NO: 1 en las posiciones indicadas en el grupo ii) para un aminoácido descrito anteriormente con respecto al grupo ii), la desamidación de un Asn precedente está estéricamente impedida. Por lo tanto, en caso de que se desee mantener un Asn particular que caiga dentro de la definición del grupo i), debería realizarse la sustitución del aminoácido C-terminal adyacente por uno de los aminoácidos citados anteriormente para el grupo ii).
El experto en la materia entiende que de acuerdo con la invención puede evitarse la desamidación mediante la sustitución de un Asn de acuerdo con el grupo i). Por lo tanto, En general, no se recomienda sustituir dos aminoácidos inmediatamente adyacentes entre sí, por ejemplo sustituyendo en la posición 3 del aminoácido por un reemplazo de acuerdo con las reglas pertinentes al grupo i) y sustituyendo adicionalmente en la posición 4 del aminoácido por un reemplazo de acuerdo con las reglas pertinentes al grupo ii).
Además de la posición 3, otro punto caliente de desamidación de SEQ ID NO: 1 se encuentra en la posición 475 de SEQ ID NO: 1. Fue particularmente sorprendente que Asn en esta posición pudiera sustituirse ya que este Asn generalmente se conserva entre las alfa-amilasas, particularmente entre amilasas que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluso en la amilasa Termamyl© disponible en el mercado o la alfa amilasa de Bacillus licheniformis de acuerdo con Uniprot ID P06278 ("BLA"), el Asn en la posición 475 en la numeración de SEQ ID NO: 1 (posición 473 de la amilasa Termamyl©/BLA madura) está conservado. Sin embargo, al evitar la desamidación en las posiciones 3 y 475, pueden eliminarse las dos causas más importantes de reducción de la homogeneidad del lote de amilasa, por ejemplo, por sustitución en las posiciones 3 y 475, en las posiciones 4 y 475, en las posiciones 3 y 476 o en las posiciones 4 y 476 de SEQ ID NO: 1. Preferentemente, las posiciones 3 y 475 se sustituyen de acuerdo con las reglas del grupo i) dadas anteriormente. También se prefiere una amilasa madura de acuerdo con la invención que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, en la que (a) el aminoácido en la posición 475 de SEQ ID NO: 1 se sustituye de acuerdo con las reglas del grupo i), es decir, por un aminoácido seleccionado de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente seleccionado de cualquiera de A, G, K, R, S, T, en el que preferentemente la sustitución según (a) es la única sustitución de acuerdo con las reglas del grupo i), o (b) en el que el aminoácido en la posición 476 de SEQ ID NO: 1 se sustituye de acuerdo con las reglas del grupo ii), es decir, por un aminoácido seleccionado de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M, en el que preferentemente la sustitución de acuerdo con (b) es la única sustitución según las reglas del grupo ii). Por lo tanto, la invención permite proporcionar una composición que comprende una amilasa madura que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1, en la que la relación molar de dicha amilasa madura, es decir, sin desamidación en la posición 475 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, hasta el total de amilasas que comprenden una desamidación en la posición 475 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente, la composición no comprende ningún fantasma de una amilasa madura que tenga al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1,
y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
En menor grado, se prefiere prevenir la desamidación en la posición 314 de SEQ ID NO: 1, por sustitución en la posición 314 de acuerdo con el grupo i) y/o sustitución en la posición 315 de acuerdo con el grupo ii). De nuevo, el Asn en la posición 314 generalmente se conserva entre las alfa-amilasas, particularmente entre amilasas que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, por lo que fue sorprendente que esta posición pudiera ser propensa a una desamidación significativa, o pudiera sustituirse sin interferir generalmente con la actividad de la amilasa. Sin embargo, evitando la desamidación en las posiciones 3 y 315 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, y preferentemente también en la posición 475 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, se desactivan dos de los principales sitios que contribuyen a la desamidación. Por lo tanto es preferible sustituir de acuerdo con las reglas de los respectivos grupos i y/o ii), los aminoácidos en las posiciones 3 y 314, 3 y 315, 4 y 314 o 4 y 315 en la numeración de SEQ ID NO: 1.
Se prefieren particularmente las sustituciones para retirar todos los puntos calientes de desaminación mencionados anteriormente en las posiciones 3, 475 y 314 de acuerdo con SEQ ID NO: 1. Por lo tanto se prefiere sustituir de acuerdo con las reglas de los respectivos grupos i y/o ii), los aminoácidos en las posiciones 3 y 314 y 475, 4 y 314 y 475, 3 y 315 y 475, 4 y 315 y 475, 3 y 314 y 476, 4 y 314 y 476, 3 y 315 y 476, o 4 y 315 y 476. En particular, se prefieren las sustituciones triples en las posiciones 3 y 314 y 475.
Algunas mutaciones beneficiosas adicionales se describen en el documento DE102012209289A1. De acuerdo con la invención se prefiere particularmente, además de cualquiera de las sustituciones indicadas anteriormente para proporcionar una variante de amilasa que difiera de la amilasa parental correspondiente en una o más de las siguientes sustituciones:
el aminoácido de la posición 5 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por A y/o
el aminoácido de la posición 167 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por R y/o
el aminoácido de la posición 170 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por P y/o
el aminoácido de la posición 177 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por L y/o
el aminoácido de la posición 202 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por L y/o
el aminoácido de la posición 204 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por V y/o
el aminoácido de la posición 271 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por D y/o
el aminoácido de la posición 330 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por D y/o
el aminoácido de la posición 377 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por R y/o
el aminoácido de la posición 385 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por S y/o
el aminoácido de la posición 445 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por Q.
Preferentemente, las sustituciones adicionales se realizan de acuerdo con cualquiera de los patrones (1) a (39) descritos en el párrafo [0028] del documento DE 10 2012 209 289 A1, incluso más preferido las sustituciones adicionales son conforme a los patrones (10), (28), (31), (35), (38) o (39) del documento DE 102012209289 A1 e incluso más preferido las sustituciones adicionales son conforme al patrón (31) del documento DE 102012209 289 A1.
Algunas mutaciones beneficiosas adicionales son:
deleción en las posiciones 183 y 184 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y sustitución del aminoácido de la posición 118 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K y/o
el aminoácido de la posición 195 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por F y/o
el aminoácido de la posición 320 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K y/o
el aminoácido de la posición 458 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K.
Preferentemente, las mutaciones adicionales comprenden las deleciones en las posiciones 183 y 184 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, y sustitución del aminoácido de la posición 118 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K, y sustitución del aminoácido de la posición 195 de acuerdo con s Eq ID NO: 1 por F, y sustitución del aminoácido de la posición 320 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K, y sustitución del aminoácido de la posición 458 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K.
Durante la desamidación, Asn se reemplaza por Asp y/o isoAsp, en el que la relación de Asp a isoAsp es generalmente de aproximadamente al menos 1:2 o incluso 1:3. Por lo tanto, a menos que los puntos calientes de desamidación estén desactivados como se indica en el presente documento de acuerdo con la invención, la composición final que contiene amilasa contendrá cantidades significativas de beta-aminoácidos indeseables, particularmente de isoAsp. Siguiendo las enseñanzas anteriores de acuerdo con la presente invención, ahora es posible proporcionar composiciones que contienen una o más amilasas que tienen una homogeneidad mejorada con respecto a las composiciones que comprenden la amilasa de tipo silvestre correspondiente, y particularmente que tienen un contenido reducido de betaaminoácidos, particularmente de isoAsp.
La amilasa sustituida de acuerdo con la invención es una amilasa que tiene al menos el 67 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, preferentemente al menos el 68% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 74 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 87% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 92 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 94 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 97 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
Preferentemente, la amilasa sustituida de acuerdo con la invención es una amilasa que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos el 85 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 87 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 90 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 92 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 94 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 95 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 97 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 99 % de identidad de secuencia, con cualquier secuencia de aminoácidos preferida de acuerdo con los ejemplos. Se entiende que para tales secuencias, la sustitución o sustituciones beneficiosas se conservan de acuerdo con la invención.
La presente invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y proporciona además un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica una amilasa de acuerdo con la invención, en la que la secuencia está unida operativamente a un promotor.
La presente invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende el ácido nucleico
y/o el casete de expresión como se describe en el presente documento de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona una composición enzimática que comprende una o más amilasas, en la que la relación molar del total de amilasas desaminadas al total de amilasas no desamidadas es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente la composición no comprende ninguna amilasa desamidada,
y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición enzimática que comprende una o más amilasas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 67 % con SEQ ID NO: 1 y que difiere de SEQ ID NO: 1 en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
ii) 4, 476, 315,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M,
en la que las dos o más sustituciones se eligen del grupo ii) y en la que la relación molar del total de amilasas desamidadas al total de amilasas no desamidadas es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente la composición no comprende ninguna amilasa desamidada,
y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
De forma correspondiente, la presente invención proporciona una composición enzimática que comprende una o más amilasas, en la que la relación molar de amilasas que comprenden cualquiera de L-isoAsp y D-isoAsp a amilasas que no comprenden L-isoAsp y D-isoAsp es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente, la composición no comprende ninguna amilasa que comprenda cualquiera de L-isoAsp y D-isoAsp,
y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
Dicha composición enzimática como se describe anteriormente es preferentemente una composición de limpieza, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa.
Se describe en el presente documento un procedimiento para mejorar la homogeneidad del lote de amilasa, que comprende las etapas de
a) proporcionar una secuencia de aminoácidos de amilasa parental que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 % con SEQ ID NO: 1 y
b) sustituir al menos 2 posiciones de la secuencia de aminoácidos de la amilasa parental, en el que las posiciones y sustituciones se eligen independientemente de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
6, 95, 195,
423,
150, 226, 255, 418,
22, 106, 285, 484,
ii) 4, 476, 315,
7, 96, 196,
424,
151,227, 256, 419,
23, 107, 286, 485,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y preferentemente se seleccionan de cualquiera de A, G, K, R, S, T, y en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M,
c) proporcionar un microorganismo hospedador que exprese la amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos obtenida en la etapa b),
d) fermentar, usando el microorganismo hospedador de acuerdo con la etapa c), para expresar la amilasa y e) purificar la amilasa obtenida en la etapa d) y opcionalmente
f) formular la amilasa obtenida en la etapa e) en una composición de limpieza, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa.
La secuencia de aminoácidos de la amilasa parental de acuerdo con la etapa a) puede comprender, como se indica anteriormente, un dominio señal, pro-dominio o pro-dominio señal sin afectar a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1. También, la presencia de cualquiera del dominio o dominios adicionales no influye en la enseñanza de acuerdo con la presente invención, debido a que el dominio o dominios adicionales se retiran durante la fermentación y/o purificación y/o formulación de la composición de amilasa final, de tal manera que el dominio o dominios adicionales no den lugar a "fantasmas" en la composición de amilasa obtenida después de la purificación y formulación.
La secuencia de aminoácidos de la amilasa parental de acuerdo con la etapa a) puede comprender mutaciones beneficiosas adicionales como se describe en el documento DE102012209289A1. De acuerdo con la invención se prefiere particularmente, además de cualquiera de las sustituciones indicadas anteriormente para proporcionar una variante de amilasa que difiera de la amilasa parental correspondiente en una o más de las siguientes sustituciones:
el aminoácido de la posición 5 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por A y/o
el aminoácido de la posición 167 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por R y/o
el aminoácido de la posición 170 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por P y/o
el aminoácido de la posición 177 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por L y/o
el aminoácido de la posición 202 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por L y/o
el aminoácido de la posición 204 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por V y/o
el aminoácido de la posición 271 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por D y/o
el aminoácido de la posición 330 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por D y/o
el aminoácido de la posición 377 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por R y/o
el aminoácido de la posición 385 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por S y/o
el aminoácido de la posición 445 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por Q.
Preferentemente, las sustituciones adicionales son conforme a cualquiera de los patrones (1) a (39) descritos en el párrafo [0028] del documento DE 10 2012 209 289 A1, incluso más preferido las sustituciones adicionales son conforme a los patrones (10), (28), (31), (35), (38) o (39) del documento DE 102012209289 A1 e incluso más preferido las sustituciones adicionales son conforme al patrón (31) del documento DE 102012209289 A1.
La secuencia de aminoácidos de la amilasa parental de acuerdo con la etapa a) puede comprender mutaciones beneficiosas adicionales:
deleción en las posiciones 183 y 184 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y sustitución del aminoácido de la posición 118 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K y/o
el aminoácido de la posición 195 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por F y/o
el aminoácido de la posición 320 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K y/o
el aminoácido de la posición 458 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K.
Preferentemente, las mutaciones adicionales comprenden las deleciones en las posiciones 183 y 184 de acuerdo con SEQ ID NO: 1, y sustitución del aminoácido de la posición 118 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K, y sustitución del aminoácido de la posición 195 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por F, y sustitución del aminoácido de la posición 320 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K, y sustitución del aminoácido de la posición 458 de acuerdo con SEQ ID NO: 1 por K.
La presente invención también proporciona un procedimiento para reducir el contenido de beta-aminoácidos, particularmente de isoAsp, en una composición de limpieza, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa en comparación con una composición correspondiente que comprende una amilasa parental correspondiente. Las etapas del procedimiento son las etapas
a)-f) como se describe anteriormente, en el que, como se describió anteriormente, la etapa f) es opcional.
De acuerdo con la invención también se proporciona una composición de limpieza, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa que tiene un contenido de polipéptidos (preferentemente polipéptidos de amilasa, opcionalmente también otros polipéptidos) que comprenden uno o más beta aminoácidos en dichos polipéptidos, preferentemente teniendo un contenido de polipéptidos que comprenden uno o más restos isoAsp, de como máximo el 20 % en moles de polipéptidos totales de la composición, preferentemente como máximo el 10% en moles de polipéptidos totales de la composición, más preferentemente como máximo el 5 % en moles de polipéptidos totales de la composición, más preferentemente como máximo el 2 % en moles de polipéptidos totales de la composición, y preferentemente desprovisto de beta aminoácidos, preferentemente desprovisto de restos isoAsp. "Polipéptido" en el sentido de la oración anterior es un polipéptido que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y el contenido de beta aminoácidos y preferentemente de isoAsp se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C. La persona experta entiende que la composición se prepara fácilmente formulando una composición de amilasa de acuerdo con la invención en una composición de limpieza respectiva, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa. Por lo tanto, la invención proporciona las composiciones anteriormente mencionadas y, por lo tanto, realiza los beneficios de la invención descrita anteriormente. El experto entenderá que en estas composiciones deben evitarse otras fuentes de beta aminoácidos y particularmente de isoAsp además de las amilasas de la presente invención.
Las composiciones de limpieza particularmente preferidas, composiciones alimenticias, composiciones de piensos, composiciones de desencolado de textiles y composiciones de tratamiento de pulpa se describen en los documentos DE 10 2012 209 289 A1 y WO2013063460. El experto comprenderá que las composiciones de limpieza, composiciones alimenticias, composiciones de piensos, composiciones de desencolado de textiles y composiciones de tratamiento de pulpa de acuerdo con la invención difieren de las composiciones respectivas descritas en los documentos citados en la frase anterior en que las amilasas de acuerdo con la invención del documento respectivo se reemplazan por la amilasa o amilasas de la presente invención.
Algunos procedimientos, realizaciones y ejemplos adicionales de acuerdo con la invención se describen en las siguientes secciones:
PROCEDIMIENTOS
Purificación de amilasa y cromatografía analítica de intercambio iónico
Para la purificación como se describe en la siguiente sección se usó el sistema GE Akta. La purificación y el ajuste de los inhaladores se realizaron a temperatura ambiente. Si no se indica lo contrario, todos los productos químicos son de calidad analítica.
Para la purificación de una amilasa a partir del caldo de fermentación o de los productos formulados se realizó una cromatografía de intercambio aniónico inicial (Q-Sepharose) usando un tampón TRIS que contenía CaCl2 1 mM como tampón de carga. Las muestras se desalaron si fuera necesario mediante diálisis usando tampón de carga como tampón de reservorio. La elución de la cromatografía de intercambio aniónico se realizó mediante un gradiente de sal lineal hasta NaCl 500 mM. Para permitir la unión usando el tampón de carga, el pH para la purificación dependía de la amilasa individual. Para evitar desamidaciones no deseadas se evitó un pH superior a pH 8. Las fracciones resultantes durante esta etapa así como de la otra se monitorizaron para determinar la actividad alfa-amilasa mediante el uso de un ensayo de amilasa basado en EPS de Roche Costum Biotech de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Como segunda etapa de purificación se realizó una cromatografía de interacción hidrófoba (Butil-Sepharose). Por tanto, las fracciones que contienen alfa-amilasa se suplementaron para cargarlas con sulfato de amonio hasta una concentración final del 35 %. La elución de proteínas se realizó mediante un tampón de elución que contenía MOPS 50 mM (pH 7,2) y CaCl2 1 mM. Las fracciones que contienen alfa-amilasa contenían después, según se juzga por análisis SDS-PAGE, un contenido de alfa-amilasa del 90 % proteína alfa-amilasa madura. Las muestras que contenían alfa-amilasa se combinaron y dializaron usando MES 50 mM (pH 5,4) y CaCl2 1 mM como tampón de reservorio.
Para mayor análisis y separación de variantes de carga se realizó una cromatografía analítica de intercambio iónico. Por lo tanto se utilizó un intercambiador de cationes Mono S con MES 50 mM (pH 5,4) y CaCl2 1 mM como tampón de carga. La elución se realizó mediante un tampón de elución que contenía MES 50 mM (pH 5,4), NaCl 500 mM y CaCl2 1 mM. El gradiente se ajustó para permitir una clara separación de las variantes de carga individuales. Por lo tanto, aparecieron picos individuales correspondientes a variantes de carga de la alfa-amilasa purificada.
Condiciones de desamidación forzada
Para estudios de degradación forzada, las alfa-amilasas se incubaron en condiciones específicas que favorecen la desamidación. Para inducir la desamidación forzada, las alfa-amilasas se incubaron a temperatura elevada (37 °C) en pH ligeramente alcalino (8,0) y un sistema tampón a base de fosfato. Estas condiciones se verificaron
experimentalmente para inducir procedimientos de desamidación. Los valores de pH de los tampones usados para los estudios de degradación forzada se ajustaron a temperatura ambiente (23,5 °C), pero también comprobar a 37 °C. Las muestras se incubaron en alícuotas de 1 - 5 ml de volumen en tubos de 15 ml sin agitar durante un período de tiempo determinado.
Digestión de alfa-amilasas para análisis de EM
Las muestras de alfa-amilasa se precipitaron mezclándolas con TCA al 50 % hasta una concentración final de TCA al 12,5% (v/v). Los volúmenes de muestra se eligieron dependiendo de la concentración real de alfa-amilasa para obtener un sedimento de proteína de al menos 100 |jg (concentración de proteína medida por absorción a 280 nm). Las muestras se centrifugaron durante 5 min a 14.000 rpm a 4 °C. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos de proteína se lavaron dos veces con 1 ml de una solución de etanol/éter dietílico 1:1 (v/v).
Para la digestión, todas las proteasas se compraron a Roche en calidad de grado de secuenciación.
Para la digestión con endoproteasa tripsina, se disolvieron 25 jg de tripsina (grado de secuenciación) en 2 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 8,0 y se mezcla suavemente. Se añadieron 150 j l de la solución de tripsina al sedimento de alfa-amilasa (equivale a 1,875 jg de tripsina por 150 jg de proteína). La digestión se realizó durante 4 h a 37 °C sin agitar.
Para la digestión con endoproteasa Lys-C, se disolvieron 5 jg de Lys-C (grado de secuenciación) en 1,5 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 8,0 y se mezcla suavemente. Se añadieron 150 j l de la solución de Lys-C al sedimento de alfaamilasa (equivale a 0,5 jg de Lys-C por 150 jg de proteína). La digestión se realizó durante 4 h a 37 °C sin agitar.
Para la digestión con endoproteasa Asp-N, se disolvieron 2 jg de Asp-N (grado de secuenciación) en 1,5 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 8,0 y se mezcla suavemente. Se añadieron 150 j l de la solución de Asp-N al sedimento de alfaamilasa (equivale a 0,2 jg de Asp-N por 150 jg de proteína). La digestión se realizó durante 4 h a 37 °C sin agitar.
Las muestras se almacenaron durante un máximo de dos días a 4 °C antes de realizar el análisis CL-EM.
SDS-PAGE
Las muestras de a-amilasa se precipitaron con TCA al 50% hasta un volumen final de TCA al 12,5% (v/v). Los volúmenes de muestra se eligieron dependiendo de la concentración real de a-amilasa pero con al menos 50 jg de proteína total (concentración de proteína medida por absorción a 280 nm). Las muestras se centrifugaron durante 5 min a 14.000 rpm a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y el sedimento de proteína se lavó dos veces con 1 ml de una solución de etanol/éter dietílico 1:1 (v/v). Después de secar, los gránulos de proteína se disolvieron en al menos 50 j l de tampón de muestra SDS (4 % de SDS, 2 % de DTT, Tris 80 mM, 0,1 %, de azul de bromofenol, pH 6,8) y se calentó a 95 °C durante 15 minutos.
Se realizó SDS-PAGE en geles Novex NuPAGE® 4-12% Bis-Tris en una cámara de electroforesis de mini célula Novex XCell SureLock®, junto con una fuente de alimentación Pharmacia Biotech EPS 3501 XL. Se usó tampón de ejecución MES SDS NuPAGE®. Los ajustes para SDS-PAGE son 150 V, 90 mA, 15 W, 40 min, temperatura no regulada. Se mezclaron 15 j l de muestra de proteína con 45 j l de tampón de muestra SDS (4 % de SDS, 2 % de DTT, Tris 80 mM, 0,1 %, de azul de bromofenol, pH 6,8) y se calentó a 95 °C durante 15 minutos. Las concentraciones de proteína y la cantidad de carga de proteína por carril estaban en el intervalo de 20 a 40 jg de proteína. El peso molecular de la proteína se estimó usando 5 j l de marcador BioRad Precision Plus Protein™ como referencia.
El isoelectroenfoque se realizó en una cámara de electroforesis horizontal Pharmacia Biotech Multiphor II acoplada con una unidad de alimentación de electroforesis Pharmacia Biotech EPS 3500 XL. La temperatura de la cámara de electroforesis se reguló mediante un circulador de refrigeración Huber Ministate 230. Las muestras se aplicaron al lado anódico de los geles de enfoque vertical SERVA pH 3-10 (N.° de catálogo: 43327.01) usando piezas de aplicación de muestra de 1 cm2 de Pharmacia Biotech. 15 j l de mezcla líquida SERVA lEF-Marker pH 3-10 (N.° de catálogo: 39212), diluido 1:5 con agua se usó como marcador de pl en todos los geles. Los ajustes de la fuente de alimentación para el procedimiento de enfoque son
Etapa de voltaje establecido [V] Corriente Configuración [mA] Conjunto de [W] Tiempo alimentación [min] Temperatura [C°]
Preenfoque (sin muestra) 1000 50 10 20 no
regulado Entrada de muestra 500 30 10 30 10
Enfoque 1500 18 20 90 10
Afilado de bandas 2000 15 25 30 10
Ejemplos
Se prefieren las siguientes alfa-amilasas maduras de acuerdo con la invención debido a su tendencia reducida o
anulada a la desamidación durante las condiciones normales de almacenamiento como se describe anteriormente: Las amilasas que comprenden o consisten en cualquiera de las secuencias SEQ-A.1 a SEQ-A.16, secuencias SEQ-B.1 a SEQ-B.16, secuencias SEQ-C.1 a SEQ-C.16 y secuencias SEQ-D.1 a SEQ-D.33 de acuerdo con las Figuras 12-16, en las que cada X independientemente de cualquier otro X en la misma secuencia se define como se explica en la descripción de la figura anterior. También se prefieren las amilasas de al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6 y que comprende una sustitución según el grupo i) en las posiciones 475 y 314 de acuerdo con SEQ ID NO: 1.
Como se ha descrito anteriormente, las amilasas también se prefieren de acuerdo con la invención que comprenden, además de cualquiera de las secuencias de esta sección "Ejemplos", uno o más dominios adicionales, por ejemplo, un propéptido y/o un péptido señal.
Los ejemplos relacionados con la preparación y el uso de composiciones y amilasas de acuerdo con la presente invención:
Composición detergente [% en peso]
FAEOS 5%
C12/147 EO 12 %
APG 2%
Ácidos grasos C12-18 5%
Glicerina 5%
Tinopal ® CBS-X 0,1 %
Citrato 1%
Poliacrilato 2%
Proteasa
Amilasa
Agua hasta el 100 %
Una composición de detergente para ropa incorporado que tiene
la siguiente formulación:
% en Peso
Alquilbencenosulfonato lineal 23,00
Tensioactivo catiónico (cloruro de alquil C12-14 dimetil hidroxietil amonio) 0,80
Tripolifosfato sódico 14,50
Carbonato sódico 17,50
Silicato sódico 7,00
Sulfato sódico 28,52
Carboximetilcelulosa sódica 0,37
Fluorescentes 0,19
Enzimas (proteasa, lipasa, amilasa) 0,94
Color azul, perfume 0,44
Humedad, etc. 6,92
continuación
En una realización de la presente invención, (A) una amilasa de acuerdo con la invención, preferentemente teniendo una secuencia como se indica anteriormente en esta sección de ejemplo, es un componente de una composición para el cuidado de la ropa que comprende adicionalmente al menos un tensioactivo aniónico (B) y al menos un mejorador (C).
Algunos ejemplos de tensioactivos aniónicos (B) adecuados son metales alcalinos y sales de amonio de alquil C8-C12 sulfatos, de éter sulfatos de alcohol graso C12-C18, de poliéter sulfatos de alcohol graso C12-C18, de semiésteres de ácido sulfúrico de alquilfenoles C4-C12 etoxilados (etoxilación: 3 a 50 moles de óxido de etileno/mol), de ácidos alquilsulfónicos C12-C18, de ésteres de alquilo C12-C18 de sulfo ácido graso, por ejemplo de ésteres metílicos de sulfo ácidos grasos C12-C18, de ácidos alquilarilsulfónicos C10-C18, preferentemente de ácidos alquilbencenosulfónicos n-C10-C18, de alcoxicarboxilatos de alquilo C10-C18 y de jabones tales como por ejemplo ácidos carboxílicos C8-C24. Se da preferencia a las sales de metales alcalinos de los compuestos mencionados anteriormente, en particular preferentemente las sales de sodio.
En una realización de la presente invención, los tensioactivos aniónicos (B) se seleccionan de ácidos alquilbencenosulfónicos n-C10-C18 y de polietersulfatos de alcoholes grasos, que, dentro del contexto de la presente invención, son en particular semiésteres de ácido sulfúrico de alcanoles C12-C18 etoxilados (etoxilación: 1 a 50 moles de óxido de etileno/mol), preferentemente de alcanoles n-C12-C18.
Algunos ejemplos de mejoradores (C) son agentes complejantes, en lo sucesivo en el presente documento también denominados agentes complejantes (C), compuestos de intercambio iónico y agentes precipitantes (C). Algunos ejemplos de mejoradores (C) son citrato, fosfatos, silicatos, carbonatos, fosfonatos, aminocarboxilatos y policarboxilatos.
Los ejemplos de agentes complejantes (C) ("secuestrantes") se seleccionan de agentes complejantes tales como, pero no limitados a citrato, fosfatos, fosfonatos, silicatos y derivados de etilen amina seleccionados de etilendiaminotetraacetato, pentaacetato de dietilen pentamina, diacetato de metilglicina y diacetato de glutamina. Los agentes complejantes (C) se describirán con más detalle a continuación.
Algunos ejemplos de agentes precipitantes (C) son carbonato de sodio y carbonato de potasio.
En una realización de la presente invención, el uso de acuerdo con la invención comprende el uso de amilasa (A) junto con al menos una enzima adicional (D). Las enzimas útiles son, por ejemplo, una o más lipasas, hidrolasas, proteasas, celulasas, hemicelulasas, fosfolipasas, esterasas, pectinasas, lactasas y peroxidasas y combinaciones de al menos dos de los tipos anteriores de los anteriores.
Las composiciones de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más agentes blanqueadores (E) (blanqueadores).
Los blanqueadores (E) preferidos se seleccionan de perborato sódico, anhidro o, por ejemplo, como el monohidrato o como el tetrahidrato o los llamados dihidratos, percarbonato sódico, anhidro o, por ejemplo, como el monohidrato y persulfato sódico, donde el término "persulfato" en cada caso incluye la sal del perácido H2SO5 y también el peroxodisulfato.
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más catalizadores de blanqueo. Los catalizadores de blanqueo pueden seleccionarse de catalizadores de blanqueo basados en oxaziridinio, sales de metales de transición potenciadores del blanqueo o complejos de metales de transición tales como, por ejemplo, complejos de manganeso-, hierro-, cobalto-, rutenio- o molibdeno-salen o complejos de carbonilo. Los complejos de
manganeso, hierro, cobalto, rutenio, molibdeno; titanio, vanadio y cobre con ligandos de trípode que contienen nitrógeno y también los complejos de cobalto-, hierro-, cobre- y rutenio-amina también pueden usarse como catalizadores de blanqueo.
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más activadores de blanqueo, por ejemplo tetraacetil etilendiamina, tetraacetilmetilendiamina, tetraacetilglicolurilo, tetraacetilhexilendiamina, fenolsulfonatos acilados tales como, por ejemplo, n-nonanoilo o isononanoiloxibenceno sulfonatos, sales de N-metilmorfolinioacetonitrilo ("sales de MMA"), sales de acetonitrilo de trimetilamonio, N-acilimidas tales como, por ejemplo, N-nonanoilsuccinimida, 1,5-diacetil-2,2-dioxohexahidro-1,3,5-triazina ("DADHT") o quats de nitrilo (sales de acetonitrilo de trimetilamonio).
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden comprender uno o más inhibidores de la corrosión. En el presente caso, esto debe entenderse como que incluye aquellos compuestos que inhiben la corrosión del metal. Algunos ejemplos de inhibidores de corrosión adecuados son los triazoles, en particular benzotriazoles, bisbenzotriazoles, aminotriazoles, alquilaminotriazoles, también derivados de fenol tales como, por ejemplo, hidroquinona, pirocatecol, hidroxihidroquinona, ácido gálico, floroglucinol o pirogalol.
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden comprender al menos un tensioactivo adicional, seleccionado de tensioactivos no iónicos y tensioactivos anfóteros.
Tensioactivos no iónicos
Algunos ejemplos de tensioactivos son en particular tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos no iónicos preferidos son alcoholes alcoxilados y alcoholes grasos alcoxilados, copolímeros de di- y multibloques de óxido de etileno y óxido de propileno y productos de reacción de sorbitán con óxido de etileno u óxido de propileno, adicionalmente etoxilatos de alquilfenol, alquilglicósidos, amidas de ácidos grasos polihidroxilados (glucamidas) y los denominados óxidos de amina.
Algunos tensioactivos no iónicos adecuados adicionales se seleccionan de copolímeros di- y multibloques, compuestos por óxido de etileno y óxido de propileno. Algunos tensioactivos no iónicos adecuados adicionales se seleccionan de ésteres de sorbitán etoxilados o propoxilados. Son igualmente adecuados óxidos de amina tales como óxido de laurildimetilamina ("óxido de lauramina") o etoxilatos de alquilfenol o alquilpoliglicósidos o polihidroxiamidas de ácidos grasos (glucamidas). En los documentos EP-A 0851 023 y DE-A 19819187 puede encontrarse un resumen de otros tensioactivos no iónicos adecuados.
También pueden estar presentes mezclas de dos o más tensioactivos no iónicos diferentes. Algunos ejemplos de tensioactivos anfóteros son C12-C18-alquilbetaínas y sulfobetaínas. Algunos ingredientes opcionales adicionales pueden ser, pero no se limitan a, modificadores de viscosidad, tensioactivos catiónicos, agentes potenciadores o reductores de espuma, perfumes, colorantes, abrillantadores ópticos, agentes inhibidores de la transferencia de tintes y conservantes.
Claims (8)
1. Amilasa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 67 % con SEQ ID NO: 1 y que difiere de SEQ ID NO: 1 en dos o más sustituciones, independientemente seleccionadas de los siguientes grupos:
i) posiciones en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 1:
3, 475, 314,
ii) 4, 476, 315,
en la que cada sustitución del grupo i) se selecciona independientemente de cualquiera de A, D, E, F, G, H, I, K, L, P, R, S, T, V, W, Y, y
en la que cada sustitución del grupo ii) se selecciona independientemente de cualquiera de F, Y, L, I, W, R, E, M.
2. Ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
3. Casete de expresión que comprende una secuencia que codifica una amilasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia está unida operativamente a un promotor.
4. Célula hospedadora recombinante que comprende el ácido nucleico y/o el casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Composición enzimática que comprende una o más amilasas de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que las dos o más sustituciones se eligen del grupo ii) y en la que la relación molar del total de amilasas desamidadas al total de amilasas no desamidadas es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente la composición no comprende ninguna amilasa desamidada y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
6. Composición enzimática que comprende una o más amilasas de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que la relación molar de amilasas que comprenden cualquiera de L-isoAsp y D-isoAsp a amilasas que no comprenden cualquiera de L-isoAsp y D-isoAsp es
- como máximo 1:1,
- preferentemente <1:2,
- más preferentemente <1:5,
- lo más preferentemente, la composición no comprende ninguna amilasa que comprenda cualquiera de L-isoAsp y D-isoAsp,
y en la que la relación se determina después de 24 h de almacenamiento en tampón fosfato acuoso 20 mM a pH 8 y 37 °C.
7. Composición enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 5 o 6, en la que la composición es una composición de limpieza, composición alimenticia, composición de pienso, composición de desencolado textil o composición de tratamiento de pulpa.
8. Procedimiento de tratamiento de sustancias que contienen almidón, preferentemente para limpiar tejidos de manchas que contienen almidón, que comprende exponer la sustancia, preferentemente el tejido tejido o no tejido manchado, a una composición enzimática de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para permitir que la amilasa comprendida en la composición escinda enlaces glucosídicos.
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