ES2562663T3 - Variantes de alfa-amilasa estabilizadas frente a di- y/o multimerización, procedimiento para su producción así como agentes de lavado y de limpieza con estas variantes de alfa-amilasa - Google Patents

Abstract

Variante de α-amilasa con al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la molécula de partida, en la que en el caso de la sustitución de aminoácido un resto de aminoácido de la molécula de partida situado sobre la superficie de la molécula y que ejerce una contribución neutra o de polaridad positiva o de carga positiva al potencial electrostático de la molécula se ha sustituido con un resto de aminoácido más negativamente polar o más negativamente cargado, siendo posibles las siguientes sustituciones de aminoácido: **Tabla** y encontrándose el resto de aminoácido mencionado en una posición que pertenece a uno de los dos siguientes grupos: (A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o (B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484, en cada caso indicados en la numeración de la proteína madura de acuerdo con la SEC ID N.º 2, tratándose en el caso de la molécula de partida de la α-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en un 100 % a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID N.º 2 en las posiciones +1 a 484.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de alfa-amilasa estabilizadas frente a di- y/o multimerizacion, procedimiento para su produccion as^ como agentes de lavado y de limpieza con estas variantes de alfa-amilasa

La presente invencion se refiere a variantes de a-amilasa que estan estabilizadas mediante mutagenesis puntual de aminoacidos de superficie frente a una di- y/o multimerizacion mediada por interacciones electrostaticas, a procedimientos para su produccion a traves de mutagenesis de restos de aminoacido con una contribucion al potencial electrostatico de la molecula asf como a agentes de lavado y de limpieza con estas variantes de a-amilasa.

Las a-amilasas (E.C. 3.2.1.1) hidrolizan enlaces a-1,4-glicosfdicos internos de almidon y polfmeros similares al almidon con la formacion de dextrinas y oligosacaridos p-1,6-ramificados. Pertenecen en general a las enzimas mas importantes tecnicamente. Asp las a-amilasas se usan por ejemplo en la produccion de jarabe de glucosa, para el tratamiento de materias primas en la fabricacion de material textil, para la produccion de adhesivos o para la produccion de constituyentes de alimentos o alimentos que contienen azucar. Otro campo de uso importante es aquel como componente activo en agentes de lavado y de limpieza.

Debido a que los agentes de lavado y de limpieza presentan principalmente valores de pH alcalinos, se usan para ello en particular a-amilasas que son activas en medio alcalino. Estas se producen y se secretan por microorganismos, es decir, hongos o bacterias, sobre todos aquellos de los generos Aspergillus y Bacillus. A partir de estas enzimas naturales se proporciona entremedias una cantidad casi inmensa de variantes, que se han derivado a traves de mutagenesis y presentan ventajas espedficas en funcion del campo de uso.

Ejemplos de ello son las a-amilasas de Bacillus licheniformis, de B. amiloliquefaciens y de B. stearothermophilus asf como sus perfeccionamientos mejorados para el uso en agentes de lavado y de limpieza. La enzima de B. licheniformis puede obtenerse de la empresa Novozymes con el nombre Termamyl® y de la empresa Genencor con el nombre Purastar®ST. Productos de desarrollo de esta a-amilasa pueden obtenerse de la empresa Novozymes

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con los nombres comerciales Duramyl y Termamyl ultra, de la empresa Genencor con el nombre Purastar OxAm y de la empresa Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japon, como Keistase®. La a-amilasa de B. amiloliquefaciens se comercializa de la empresa Novozymes con el nombre BAN®, y variantes derivadas de la a-amilasa de B. stearothermophilus con los nombres BSG® y Novamyl®, asf mismo de la empresa Novozymes.

Ejemplos de a-amilasas de otros organismos son los perfeccionamientos que pueden obtenerse con los nombres comerciales Fungamyl® de la empresa Novozymes de la a-amilasa de Aspergillus niger y A. oryzae. Un producto comercial adicional es por ejemplo la Amylase-LT®.

Asf mismo se remite a la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) divulgada en la solicitud WO 02/10356 A2 y la ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa) de B. agaradherens (DSM 9948) que se describe en la solicitud Wo 02/44350 A2. Adicionalmente, por ejemplo en las solicitudes wO 03/002711 A2 y WO 03/054177 A2 se definen espacios de secuencia de a-amilasas, que podnan ser adecuadas en principio para las aplicaciones correspondientes.

Mutaciones puntuales para la mejora de la actividad de estas enzimas en el medio alcalino se describen por ejemplo en la solicitud no publicada previamente DE 10309803.8. Segun esta solicitud, son adecuadas para ello sustituciones de aminoacido en las posiciones 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 y/o 474 segun la enumeracion de la a-amilasa de B. amiloliquefaciens no procesada. Estas son en la numeracion de la a-amilasa no procesada de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; documento WO 02/10356 A2) las posiciones L13, T36, W198, S201, 1208, A235, D302, D361, H408, K416 o N476, con las siguientes sustituciones especialmente eficaces: 13P, 32A, 194R, 197P, 203L, 230V, 297D, 356D, 406R, 414S y 474Q.

Un ejemplo adicional para la mutagenesis puntual en a-amilasas es la solicitud WO 00/22103 A1. En ella se divulgan polipeptidos entre los que se divulgan tambien variantes de a-amilasa con aminoacidos de superficie mutagenizados. El objetivo de esta mutagenesis ha consistido en reducir la inmunogenicidad y/o alergenicidad procedente de estas moleculas.

Asf mismo, se describen productos de fusion de a-amilasas para su uso en agentes de lavado y de limpieza. De este modo, por ejemplo en la solicitud WO 96/23874 A1 se divulgan tubridos de las a-amilasas de Bacillus licheniformis, B. amiloliquefaciens y B. stearothermophilus. Las amilasas tubridas de este tipo pueden producirse de acuerdo con la ensenanza de esta solicitud para la determinacion de la estructura tridimensional de estas amilasas, para reconocer a traves de ella posiciones importantes para la actividad enzimatica. Las solicitudes WO 97/41213 A1 y WO 00/60059 A2 describen perfeccionamientos a este respecto, de las que se desprenden numerosas variantes de a-amilasa que estan mejoradas en cada caso con respecto a su rendimiento. Amilasas tubridas especiales de B. licheniformis y B. amiloliquefaciens se divulgan en la solicitud WO 03/014358 A2.

Otro estado de la tecnica importante lo forman las tres solicitudes de patente WO96/23873 A1, W000/60060 A2 y W001/66712 A2, que representan la base para el producto comercial Stainzyme® de la empresa Novozymes. Todas las variantes expuestas en las mismas en cada caso, que pueden obtenerse mediante mutagenesis puntual, tienen

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propiedades enzimaticas modificadas y se reivindican o se describen por lo tanto para su uso en agentes de lavado y de limpieza. El documento WO 96/23873 A1 menciona en parte en cada caso varias mutaciones puntuales en mas de 30 posiciones distintas en cuatro amilasas de tipo salvaje distintas. Estas presentaran propiedades enzimaticas modificadas con respecto a la termoestabilidad, la estabilidad frente a la oxidacion y la dependencia del calcio. Entre ellas se encuentran mutaciones puntuales en las siguientes posiciones, que estan indicadas en cada caso con referencia a la a-amilasa de Bacillus sp. NCIB 12512: sustitucion de aminoacidos oxidables en las posiciones M9, M10, M105, M202, M208, M261, M309, M382, M430 o M440, preferentemente M91L; M10L; M105L; M202L,T,F,I,V; M208L; M261L; M309L; M382L; M430L y M440L; deleciones de F180, R181, G182, T183, G184 y/o K185; asf como adicionalmente las sustituciones K269R; P260E; R124P; M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I; V206I,L,F; Y243F; K108R; K179R; K239R; K242R; K269R; D163N; D188N; D192N; D199N; D205N; D207N; D209N; E190Q; E194Q o N106D.

La solicitud WO00/60060 A2 nombra asf mismo una pluralidad de posibles sustituciones de aminoacido en 10 posiciones distintas, en concreto por medio de dos a-amilasas muy similares de dos microorganismos distintos de igual numeracion (las a-amilasas AA349 y AA4560). Estas son las siguientes variaciones de secuencia: R181* G182*, D183*, G184*; N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 1206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V

E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V

K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V

E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V: y/o R181A,N,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V. Tambien este

desarrollo tiene como trasfondo conseguir una mejora del rendimiento a traves de mutaciones.

Por ultimo, el documento WO 01/66712 A2, designa 31 posiciones de aminoacido distintas, en parte identicas a las mencionadas anteriormente, que se han mutado en una de las dos a-amilasas mencionadas en la solicitud WO 00/60060 A2 y se mejoraran tanto aspectos de rendimiento como aspectos de estabilidad. Estas son mutaciones puntuales en las siguientes posiciones: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471 y N484, a su vez definidas a traves de la a-amilasa AA560, es decir, tambien segun su numeracion. Entre ellas son ventajosas especialmente las siguientes variantes: Delta G184; Delta (R181-G182); Delta (D183- G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A,R,K; N174D; R181Q,E,K; G186R; W189R,K; N195F; M202L,T; Y298H,F; N299A; K302R, S303Q, N306G,D,R,K; R310A,K,Q,E,H,D,N; N314D; R320K; H324K; E345R,D,K,N; Y396F; R400T,K; W439R; R444K; N445K.Q; K446N; Q449E; R458K; N471E y N484Q.

Asf mismo, en esta solicitud mencionada en ultimo lugar se describen cristales polipeptfdicos, en particular aquellos de enzimas podnan mejorarse con respecto a su poder de resolucion porque en las moleculas, que se encuentran en el cristal en cuestion junto a las moleculas verdaderamente de interes y que interaccionan con las mismas, podnan mutarse aquellos aminoacidos que se encuentran dentro de una distancia de 6,0 A con respecto al peptido de interes. Esto era valido en particular para enzimas similares a Termamyl, que se encuentran en un cristal junto a otras o las mismas enzimas similares a Termamyl; en este caso especialmente para una distancia de menos de 3,5 A. Esto afectana a las posiciones 19, 20, 21, 22, 25, 28, 29, 53, 76, 84, 87, 90, 93, 94, 124, 125, 126, 128, 142, 144,

156, 157, 158, 159, 160, 161, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 193, 195, 196,

197, 209, 212, 226, 229, 256, 257, 258, 259, 280, 281,298, 299, 300, 302, 303, 304, 305, 306, 310, 311, 314, 319,

320, 321, 322, 341, 345, 405, 406, 408, 444, 447, 448, 449, 463, 464, 465, 466 y 467; o las posiciones 22, 25, 28,

76, 94, 125, 128, 158, 160, 171, 173, 174, 184, 189, 209, 226, 229, 298, 299, 302, 306, 310, 314, 320, 345, 405, 447 y 466 para la menor distancia.

A todas estas solicitudes con respecto a la mutagenesis puntual es comun que tambien se evalua el punto de vista de la estabilidad bajo el aspecto de un buen rendimiento en el campo de uso correspondiente. Puesto que la estabilidad mantenida durante el almacenamiento y el uso de las a-amilasas por ejemplo en el marco de formulaciones de agentes de lavado, lleva a un rendimiento alto y que se mantiene lo mas alto posible durante el uso correspondiente. No se describe un aumento de la estabilidad, en particular frente a una formacion de agregados, sobre todo en el transcurso del procesamiento.

Numerosas solicitudes persiguen el aumento de la estabilidad, que describen estabilizadores de enzimas especiales. Estos ingredientes adicionales provocan que una protema y/o enzima contenida en medios correspondientes se proteja especialmente durante el almacenamiento frente a danos tal como, por ejemplo, la inactivacion, desnaturalizacion o descomposicion. De este modo, los inhibidores de proteasas reversibles forman un grupo de estabilizadores. Otros, por ejemplo polioles, estabilizan frente a influencias ffsicas, tal como por ejemplo la congelacion. Otros compuestos polimericos tal como polfmeros acnlicos y/o poliamidas, estabilizan la preparacion enzimatica, entre otros, frente a oscilaciones del valor de pH. Los agentes de reduccion y antioxidantes aumentan la estabilidad de las enzimas frente a la descomposicion oxidativa.

Los compuestos de este tipo se anaden a las enzimas tanto durante la aplicacion como en el transcurso de su procesamiento, lo que es importante en particular cuando en una etapa parcial del procesamiento, por ejemplo una precipitacion, se haya separado un estabilizador previamente contenido junto con las impurezas restantes.

El estado de la tecnica para la mejora de la estabilidad de a-amilasas puede resumirse tal como sigue: a traves de mutagenesis puntual se ha desarrollado una pluralidad de variantes de a-amilasa, habiendo consistido el objetivo de estos desarrollos principalmente en mejorar las mismas con respecto a su rendimiento. En esta categona figuran

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tambien aquellas variantes que estan estabilizadas con respecto a agentes desnaturalizadores tal como agentes de blanqueo o tensioactivos, porque en su caso, respectivamente, se optimiza al rendimiento deseado de la enzima. Por lo demas, para aumentar la estabilidad o el mantenimiento de la conformacion ffsico-qmmica, se recurre principalmente a compuestos adicionales que se denominan en su totalidad como estabilizadores.

Un aspecto menos tenido en cuenta hasta el momento en el desarrollo de enzimas consiste en estabilizar las moleculas en sf de modo que ya durante su procesamiento presenten una estabilidad aumentada con respecto a la molecula de tipo silvestre. Un efecto ventajoso adicional de ello debena consistir en que esta estabilidad aumentada debena favorecer tambien al uso previsto posteriormente de la enzima en cuestion.

La necesidad de esto se muestra en particular en el caso de las a-amilasas. Al menos algunas de ellas tienden, sobre todo durante el proceso de produccion y de procesamiento a formar multimeros, concretamente en forma de agregados amorfos que precipitan de manera irreversible. De esta manera se pierden las actividades respectivas ya durante el procesamiento. Por un proceso de procesamiento se entiende todas las etapas de la produccion a gran escala, del aislamiento de la enzima en cuestion, en particular los medios de fermentacion habituales para la obtencion biotecnologica, a traves de las siguientes etapas de lavado y de separacion (por ejemplo mediante precipitacion) y la concentracion hasta el confeccionamiento, por ejemplo, la granulacion. En este caso son cnticas, en particular aquellas etapas parciales en las que la enzima en se encuentra en disoluciones con concentraciones comparativamente altas, porque, en este caso, visto desde el punto de vista estadfstico, se producen contactos mas frecuentes entre las moleculas que en el caso de concentraciones mas bajas. En cambio, la formacion de agregados puede aparecer tambien durante el almacenamiento de agentes que contienen a-amilasa o durante la aplicacion, por ejemplo, durante el uso como ingrediente activo en procesos de lavado o de limpieza.

Esta problematica puede llevar a que si bien pueden obtenerse y examinarse a-amilasas individuales a escala de laboratorio, sin embargo se oponen a una produccion a gran escala con ayuda de procedimientos habituales en general. Se habla entonces tambien de que estas enzimas tienen una baja estabilidad de proceso, con lo que se consideran las posibilidades mas diversas de procesamiento y de uso. Por ejemplo, la a-amilasa de Bacillus sp. A 77 (DSM 12368) muestra una mayor tendencia a la multimerizacion que la a-amilasa nativa de B. licheniformis. Planteamientos para la eliminacion de este tipo de inestabilidad, es decir, para la disminucion de la tendencia a la multimerizacion, hanan accesibles las enzimas de este tipo a una produccion a gran escala y con ello a los multiples campos de uso, en general solo en cantidades tecnicamente relevantes.

Se planteo por lo tanto el objetivo de estabilizar a-amilasas, y en particular la de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) en sf de modo que presenten una estabilidad aumentada en comparacion con la molecula de partida con respecto a una formacion de agregados.

Bajo un aspecto parcial de este objetivo debena determinarse en primer lugar una causa posible, basada en la estructura de las enzimas en cuestion para su tendencia a la formacion de agregados. A continuacion era valido oponerse a la misma con cambios de estructura adecuados.

Estos cambios de estructura repercutinan por un lado de manera ventajosa sobre el procesamiento, es decir, la obtencion a gran escala de estas enzimas. Por otro lado, senan ventajosas tambien para el uso de las a-amilasas, por ejemplo, en agentes de lavado y de limpieza, porque esto ina acompanado adicionalmente de una actividad constantemente elevada durante el uso.

Se consideranan soluciones especialmente ventajosas de este objetivo por lo tanto aquellas a-amilasas, que junto a la estabilidad mencionada frente a una formacion de agregados, muestren propiedades positivas adicionales con respecto a su uso previsto, en particular con respecto a su uso en agentes de lavado y de limpieza.

Esto era valido sobre todo para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). No obstante, se prefieren aquellas soluciones que puedan aplicarse a otras a-amilasas.

Como fundamento para el fenomeno, observado en particular en las a-amilasas, en particular en determinadas a- amilasas, de la formacion de agregados, en la ruta para la solucion del objetivo mencionado se tuvo en consideracion la presencia de zonas con diferente potencial electrostatico sobre la superficie de estas moleculas en su estructura nativa, globular, correctamente plegada. De este modo, por ejemplo grandes zonas de la superficie de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) estan cargadas negativamente, mientras que otras zonas en parte de gran superficie tienen un potencial electrostatico positivo o neutro. De este modo, a traves de interacciones electrostaticas entre las zonas cargadas o polarizadas de diferente manera de varias moleculas, puede producirse su yuxtaposicion y con ello una dimerizacion hasta la formacion de multfmeros. Esta interaccion puede anularse de nuevo mediante agentes de desnaturalizacion anadidos, presumiblemente solo perjudicando a la estructura globular, es decir, con el riesgo de la inactivacion irreversible. Por otro lado, esta interaccion en sf, en particular cuando las fuerzas de atraccion mutuas son suficientemente fuertes para influir en la estructura de la molecula, tambien sin intervencion desde el exterior, puede llevar a agregados inactivos de forma irreversible.

Para resolver el objetivo planteado se sigue un planteamiento de biologfa molecular. Por lo tanto, mediante esto se influye sobre las propiedades enzimaticas mediadas por la simple secuencia de aminoacidos. A este respecto se

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establecio sorprendentemente que modificaciones, es decir, mutaciones puntuales, que adaptan entre s^ el patron de carga sobre la superficie de estas moleculas, contrarrestan una formacion de agregados.

Que restos de aminoacido se encuentran “sobre la superficie de estas moleculas”, puede definirse a traves de la estructura 3D de la protema enzimatica globular, a traves de la denominada superficie de Conolly o a traves del valor de la denominada accesibilidad, es decir, la accesibilidad de disolvente (vease mas adelante). La contribucion positiva, negativa o neutra observada al potencial electrostatico de la molecula resulta a traves de las propiedades qmmicas de los respectivos restos de aminoacido bajo la influencia de los restos de aminoacido adyacentes en cada caso, en particular adyacentes situados bajo la superficie y puede calcularse tal como se expone mas adelante. La agregacion observada parece producirse en particular cuando varios restos directamente adyacentes sobre la superficie presentan la misma polaridad o carga.

Sin desear restringirse a esta teona, puede suponerse que la formacion de agregados de a-amilasa puede atribuirse al menos en un porcentaje significativo a una di- y/o multimerizacion a lo largo de zonas de superficie cargadas diferentes y/o polares de diferente manera de estas moleculas de protema. De este modo, las moleculas tienden a, de manera similar a los imanes, alinearse entre sf en una orientacion regular. Una interrupcion de la planitud de las zonas cargadas o polarizadas positivamente a favor de la carga negativa previamente reinante, estabiliza las a- amilasas por lo tanto frente a una formacion de agregados basada en la multimerizacion. Esto favorece tanto la obtencion (por ejemplo en una etapa de precipitacion) y el almacenamiento (por ejemplo en disolventes hidrofobos que fomentan una agregacion a traves de regiones polares) como el uso.

Esta suposicion se fundamenta en que la a-amilasa de B. licheniformis con una tendencia comparativamente baja a la multimerizacion, presenta un potencial de carga ampliamente negativo sobre su superficie.

Un efecto ventajoso adicional ademas de evitar la di- y/o multimerizacion, consiste en que las enzimas, consideradas desde un punto de vista estadfstico, se encuentran cada vez mas en su conformacion nativa y no se deforman a traves de las interacciones electrostaticas mencionadas, mediante lo cual se abren superficies de ataque distintas a los agentes de desnaturalizacion. Este efecto aumenta en conjunto su estabilidad, por ejemplo frente a disolventes organicos y tensioactivos, que se adicionan a traves de las zonas hidrofobas, normalmente poco accesibles al disolvente, e intentan solubilizarlas, o frente a proteasas que atacan los enlaces de amida de acido de la estructura principal situados en el interior. Tambien restos de aminoacido oxidables situados en el interior estan mejor protegidos por medio de este efecto, por ejemplo contra el oxfgeno del aire o agentes de blanqueo.

El objetivo planteado se resuelve por consiguiente mediante variantes de a-amilasa con al menos una sustitucion de aminoacido con respecto a la molecula de partida, mediante lo cual un resto de aminoacido de la molecula de partida situado sobre la superficie de la molecula y que ejerce una contribucion neutra o positivamente polar o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula se ha sustituido por un resto de aminoacido mas negativamente polar o negativamente cargado, siendo posibles las siguientes sustituciones de aminoacido:

aminoacido de partida

por

Arg (R)

K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W ,P, S, T, N, Q, E o D

Lys (K)

Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Tyr (Y)

C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Cys (C)

H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

His (H)

G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Gly (G)

A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ala (A)

V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Val (V)

L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Leu (L)

I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ile (I)

M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Met (M)

F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Phe (F)

W, P, S, T, N, Q, E o D

Trp (W)

P, S, T, N, Q, E o D

Pro (P)

S, T, N, Q, E o D

Ser (S)

T, N, Q, E o D

Thr(T)

N, Q, E o D

Asn(N)

Q, E o D

Gln (Q)

E o D

Glu (E)

D

y encontrandose el resto de aminoacido mencionado en una posicion que pertenece a uno de los dos siguientes grupos:

(A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o

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(B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484,

en cada caso indicados en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2, tratandose en el caso de la molecula de partida de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de aminoacidos es identica en un 100 % a la secuencia de aminoacidos indicada en la SEC ID N.° 2 en las posiciones +1 a 484.

Por a-amilasas en el sentido de la presente solicitud se entiende, tal como se explico al principio, las enzimas de la clase E.C. 3.2.1.1, que hidrolizan enlaces a-1,4-glicosfdicos internos de almidon y polfmeros similares a almidon con la formacion de dextrinas y oligosacaridos p-1,6-ramificados.

Variantes de a-amilasa son aquellas a-amilasas que se han derivado mediante modificaciones de ingeniena genetica en sf conocidas a partir de una molecula precursora. “Variante” es, a nivel de las protemas, el termino correspondiente a “mutante” a nivel de los acidos nucleicos. En el caso de las moleculas precursoras o moleculas de partida puede tratarse de enzimas de tipo salvaje, es decir aquellas que pueden obtenerse de fuentes naturales. Aquellas se han presentado a modo de ejemplo de manera introductoria. Puede tratarse tambien enzimas que representan en sf ya variantes, es decir que se han modificado ya con respecto a las moleculas de tipo salvaje. Por estas se entienden por ejemplo mutantes puntuales, aquellos con modificaciones de la secuencia de aminoacidos, a traves de varias posiciones o zonas contiguas mas largas, o tambien moleculas hnbridas que se componen de secciones complementarias entre sf de distintas a-amilasas de tipo salvaje. Tanto las enzimas de tipo salvaje como mutantes y enzimas hnbridas se han presentando a modo de ejemplo de manera introductoria.

Por sustituciones de aminoacido se entiende sustituciones de un aminoacido por otro aminoacido. De acuerdo con la invencion, tales sustituciones se indican con el nombre de las posiciones en las que tiene lugar la sustitucion, opcionalmente combinado con los aminoacidos en cuestion en el codigo de una letra de uso internacional. “Sustitucion en la posicion 83” significa por ejemplo que una variante en la posicion que presenta en la secuencia de una protema de referencia la posicion 83, presenta otro aminoacido. Habitualmente tales sustituciones se realizan a nivel del ADN a traves de mutaciones de pares de bases individuales (vease anteriormente). “N83D” significa por ejemplo que la enzima de referencia en la posicion 83 presenta el aminoacido asparragina, mientras que la variante considerada, en la posicion homologable con la misma, dispone del aminoacido acido aspartico. “83D” significa que cualquier aminoacido, es decir, por regla general, un aminoacido predeterminado de forma natural en una posicion, que corresponde a la posicion 83, se ha sustituido por un acido aspartico; y “N83X” significa que el aminoacido asparragina en la posicion 83 se ha sustituido, en principio, por cualquier otro aminoacido.

En principio, las sustituciones de aminoacido de acuerdo con la invencion designadas con la presente solicitud no estan limitadas a que sean las unicas sustituciones en las que la variante en cuestion se diferencia de la molecula de tipo salvaje. En el estado de la tecnica se conoce que las propiedades ventajosas de mutaciones puntuales individuales pueden complementarse entre sh Una a-amilasa optimizada con respecto a determinadas propiedades tal como la union a calcio o la estabilidad frente a tensioactivos, puede perfeccionarse de acuerdo con la invencion adicionalmente a traves de las sustituciones presentadas en el presente documento. Por lo tanto, las formas de realizacion de la presente invencion comprenden todas las variantes que ademas de otras sustituciones con respecto a la molecula de tipo salvaje tambien presentan las sustituciones de acuerdo con la invencion.

Como enzima de referencia con respecto a la numeracion de las posiciones se indica de acuerdo con la invencion la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de nucleotidos esta indicada en la SEC ID N.° 1, seguido de la secuencia de aminoacidos correspondiente en la SEC ID N.° 2. Estos datos de secuencias estan corregidos, tal como se explica en el ejemplo 1 de la presente solicitud, con respecto a la descripcion en el documento WO 02/10356 a2 en, en cada caso, dos posiciones y corresponden en esta forma, segun el estado de conocimiento actual, exactamente a los datos de secuencia que pueden obtenerse a partir de la cepa DSM 12368 depositada y que se describe en el documento WO 02/10356 A2.

Esta secuencia de aminoacidos correcta se desprende tambien de la primera lmea de la alineacion mostrada en la figura 1, que se ha creado unicamente para las partes maduras de las enzimas respectivas. Esto esta justificado porque in vivo solo la parte madura (es decir aquella con la numeracion positiva en la SEC ID N.° 2) es eficaz como a-amilasa. Para algunas enzimas tal como, por ejemplo, AA349 y AA560, se indican en la bibliograffa de patentes (documento WO 00/60060 A2) en todo caso unicamente las partes de secuencia maduras.

La superficie de la enzima comprende todos aquellos aminoacidos de la enzima plegada de forma nativa que se han dirigido al disolvente. Estos son por ejemplo en la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) los 407 aminoacidos que se exponen en detalle en el ejemplo 2.

Los aminoacidos de superficie de otras a-amilasas pueden deducirse en principio consultando la alineacion de la figura 2. Esto es valido sin embargo solo de manera aproximada. En zonas altamente conservadas y estructuralmente protegidas tal como helices a o laminas p resulta, por regla general, una buena coincidencia; en zonas mas flexibles, en particular bucles, la comparacion basada en la alineacion, es decir la estructura primaria, va acompanada de incertidumbres. Es decisiva, en todos los casos (siempre que sean conocidos), la estructura de rayos X segura, tal como se ha depositado realmente para la mayona de las a-amilasas comercialmente importantes entretanto en bancos de datos accesibles en general. Estos son por ejemplo los bancos de datos GenBank (National

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Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.) y Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Suiza;
http://www.genebio. com/sprot.html).

Si, para una molecula de interes no se hubiera determinado aun la estructura 3D (o terciaria), entonces esta puede deducirse a traves de un modelado por homologfa. En este metodo para la prediccion de estructuras de protemas, de las que no se ha resuelto aun ninguna estructura cristalina, se parte de que las protemas con estructura primaria similar tienen tambien una estructura secundaria y terciaria similar. La similitud entre dos secuencias de protema puede determinarse a traves de un algoritmo adecuado, por ejemplo BLAST, FASTA o CLUSTAL. Tales algoritmos se encuentran asf mismo disponibles a traves de bancos de datos de protemas accesibles en general; de este modo, por ejemplo GenBank y Swiss-Prot disponen de enlaces correspondientes. El banco de datos de protemas RSCB (accesible a traves del centro Max-Delbruck en Berlin, Alemania, a traves de la direccion de Internet
http://www.pdb.mdc-berlin.de/pdb; 24.8.2004) ofrece al usuario la posibilidad de encontrar, a traves de una busqueda FASTA, con respecto a una secuencia determinada, estructuras cristalinas de protemas relacionadas.

Los calculos posibles, que se construyen a partir de ello, por ejemplo con ayuda del denominado visor Swiss-Pdb, se describen en la publicacion “SWISS-Model and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling” (1997) de N. Guex y M. C. Peitsch en Electrophoresis, tomo 18, paginas 2714 a 2723. Este visor se encuentra accesible de forma gratuita a traves de la direccion de Internet
http://us.expasy.org/spdbv/ (24.8.2004) del Organisation Swiss Institute of Bioinformatics (Central Administration, Batiment Ecole de Pharmacieroom 3041, Universite de Lausanne, 1015 Lausanne, Suiza). El manual correspondiente (SwissPDB-Viewer-Manual) se encuentra disponible en la direccion de Internet
http://us.expasy.org/spdbv/text/selmenu.htm (24/8/2004). Mediante la yuxtaposicion (superimposition) de estas estructuras puede crearse ademas una estructura gma, sobre la que se modela entonces la secuencia de protemas de la a-amilasa de interes. Las etapas individuales para ello se desprenden del manual para el usuario mencionado.

Todas las exposiciones discutidas en este caso de la superficie de una enzima, es decir de la enumeracion especial de los aminoacidos de superficie de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; vease la figura 1) como los planteamientos de modelado expuestos, se basan en un calculo. A este respecto se hace rotar mediante calculo una sonda de un tamano de 1,4 A a lo largo de la superficie de la protema. Todas las posiciones que se mencionan ailf, se enumeran con respecto a la superficie de contacto con esta sonda y por lo tanto con respecto a la superficie; espacios mas estrechos, abiertos teoricamente hacia fuera, ya no se consideran a este respecto como superficie sino que se atribuyen al interior de la molecula. Segun este planteamiento, se obtiene la denominada superficie Conolly, que se ha descrito por primera vez por M.L. Connolly en el artmulo “Solvent-Accessible Surfaces of Proteins and Nucleic Acids” (1983) en Science, tomo 221, 709-713. Este procedimiento reconocido es fiable para el experto y sirve, de acuerdo con la invencion, para la definicion de la superficie de las a-amilasas.

Para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) resultaron de esta manera los 407 aminoacidos de superficie mencionados, que se exponen individualmente en el ejemplo 2.

Los restos de aminoacido situados sobre la superficie de las a-amilasas consideradas y relevantes para la invencion son aquellos que ejercen una contribucion neutra o positivamente polar o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula a un valor de pH de 7. Una contribucion de este tipo al potencial electrostatico de la molecula se define como el porcentaje del aminoacido individual con cargas mayores/iguales a cero.

El potencial electrostatico en un punto determinado de la superficie se define, recurriendo a la superficie Conolly mencionada anteriormente, como el potencial que actua sobre la sonda mencionada. Este potencial electrostatico que reina teoricamente en cada lugar de la superficie puede calcularse mediante algoritmos adecuados, para lo que se realiza de acuerdo con la invencion la siguiente reflexion:

el campo electrico ha de considerarse en principio como la suma de los campos electricos parciales generados mediante las cargas individuales. Para un calculo aprovechable, las cargas individuales se consideran, en una primera aproximacion, como cargas puntuales. El campo electrico Ei de una carga puntual Qi puede determinarse a vacio en el sitio r a traves de la siguiente ecuacion (1), en la que bo es la constante dielectrica:

imagen1

Un conjunto de N cargas da como resultado por lo tanto el siguiente campo electrico E:

(2)

tf r

El potencial de Coulomb generado a partir de aim Vc(P-i) en el punto P1 en el campo electrico E esta definido entonces del siguiente modo, representando L el espacio de coordenadas:

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imagen2

Esta ecuacion puede interpretarse en palabras de la siguiente manera: el potencial electrostatico que reina en el punto P1 esta definido como la diferencia de potencial entre un punto infinitamente distante y el punto P1. L es un vector espacial, que en la practica representa la variable de integracion del espacio. El punto Pi y, por consiguiente, tambien cada punto adicional relevante, introducido de igual manera en este calculo, se encuentra a este respecto sobre la superficie de protema. Con esta formula, ordenadores con programas informaticos adecuados para cada punto sobre la superficie de protema, pueden determinar el potencial electrostatico localizado respectivo. De este modo puede asignarse a cada resto de aminoacido una carga o polaridad correspondiente, lo que puede ilustrarse en una representacion visual por ejemplo tal como en la figura 1.

El calculo con esta ecuacion (3) da como resultado una aproximacion no exacta pero suficiente de acuerdo con la invencion del potencial electrostatico. En una primera aproximacion, la constante dielectrica 80 debe sustituirse por la constante dielectrica real 8 = 8o*8r como la constante dielectrica del medio. Este planteamiento se denomina “Screened Coulomb Potential” y se describe por S. A. Hassa y col. (2002) en el artmulo “A Critical Analysis of Continuum Electrostatics: The Screened Coulomb Potential-Implicit Solvent Model and the Study of the Alanine Dipeptide and Discrimination of Misfolded Structures of Proteins”, en Proteins, tomo 45, pagina 47. Para otros algoritmos mas exactos se encuentran en la bibliograffa varios ejemplos, tal como, por ejemplo, E. L. Mehler y col. (1991), “Electrostatic effects in proteins: comparison of dielectric and charge models”, Protein Eng., tomo 8, paginas 903 - 910, y A. Jakalian y col. (2002) “Fast, efficient generation of high-quality atomic charges. AM1-BCC model: II. Parameterization and validation” en J. Comput. Chem., tomo 16, paginas 1623 - 1641. Para la aplicacion descrita en este caso, sin embargo, estos no son necesarios, dado que, finalmente, una prediccion semicuantitativa (positiva, neutra, negativa) permite la solucion del planteamiento del objetivo.

Los aminoacidos en cuestion pueden calcularse por ejemplo a traves de un algoritmo informatico, que se encuentra disponible como modulo adicional de ya mencionado visor SwissPDB. En este, a traves de los puntos “Tools”, “Compute Molecular Surface”, y “Electrostatic potential” puede calcularse la distribucion de carga superficial de la molecula examinada, teniendose en cuenta, entre los parametros estandar, las cargas parciales de los atomos de cada aminoacido con excepcion de los atomos de hidrogeno.

De este modo, tal como esta representado en el ejemplo 2, para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) como cantidad parcial de los 407 restos de aminoacido de superficie determinados previamente se determinan 118 restos que ejercen una contribucion positiva o neutra al potencial electrostatico de la superficie.

Para designar las sustituciones permitidas en cada caso se considera que valores de polaridad o cargas tienen en sf las distintas cadenas laterales de aminoacido. Con ello resulta el siguiente orden: R, como cadena lateral de aminoacido mas basica y, por regla general, cargada positivamente, seguido de K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E y D, representando D la cadena lateral de aminoacido mas acida y que a pH neutro porta una carga negativa. A partir de aqu se explica la clasificacion designada anteriormente, pudiendo partirse de acuerdo con la invencion de que al sustituirse aminoacidos de superficie individuales, la estructura de la molecula y los efectos de carga adicionales, practicamente no desempenan papel alguno. Si una de estas cadenas laterales de aminoacido portara un porcentaje de carga ligeramente mas negativo o ligeramente mas positivo de lo que cabna esperar debido a los valores conocidos para el aminoacido libre en general, entonces se parte de acuerdo con la invencion de que una cadena lateral de aminoacido nombrada mas tarde en este orden, porta en el mismo entorno molecular un porcentaje de carga ligeramente mas negativo o ligeramente mas positivo de manera correspondiente y, en conjunto, no se modifica el orden mencionado en el presente documento de los aminoacidos permitidos para la sustitucion.

La representacion en la figura 1 muestra el patron, calculado segun el ejemplo 2, de diferentes polaridades y cargas sobre una superficie de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). El lado posterior de la molecula que no puede verse en la misma, que contiene tambien el centro activo, presenta un patron de carga continuamente negativo. A partir de esto es evidente que pueden formarse dfmeros de manera relativamente sencilla, en los que una molecula con una superficie cargada o polarizada positivamente que puede verse en la figura 1 se adiciona a la superficie situada en la parte posterior, cargada/polarizada negativamente de otra molecula y, de esta manera, bloquea su centro activo. Los dfmeros de este tipo podran reconocerse en un peso molecular el doble de alto y/o en una actividad amilasa la mitad de alta en relacion con la concentracion de protema total, en cada caso en comparacion con una solucion correspondiente con monomeros. Con la adicion creciente de otras moleculas en la misma orientacion caera adicionalmente la actividad de soluciones correspondientes, hasta que, finalmente, haya precipitado un porcentaje suficientemente agregado de las enzimas como precipitado amorfo y definitivamente se haya desnaturalizado y se haya vuelto inutilizable.

Este proceso deben atravesarlo las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion, que corresponden al numero y la localizacion de las sustituciones de acuerdo con la invencion realizadas, visto desde un punto de vista estadfstico.

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En una forma de realizacion preferida, en el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion se trata de aquellas en las que el resto de aminoacido mencionado antes de la sustitucion de aminoacido presenta una accesibilidad de al menos un 10 %, preferentemente al menos un 20 %, de manera especialmente preferente al menos un 30 %, calculandose la accesibilidad del resto de aminoacido en cuestion sobre una escala del 0 % (no accesible al disolvente) al 100 % (contenido en un pentapeptido hipotetico GGXGG).

Por la accesibilidad de un resto de aminoacido se entiende de acuerdo con la invencion como de adecuadamente se encuentra accesible en una conformacion natural de la molecula para el disolvente circundante (en la mayona de los casos agua). Para determinar esta propiedad ffsico-qmmica se considera una escala del 0 al 100 %, significando un valor del 0 % de accesibilidad que el resto en cuestion no es accesible para el disolvente, y el 100 % representa la accesibilidad posible en un pentapeptido hipotetico GGXGG.

De acuerdo con la invencion, esta propiedad de las moleculas se refleja en que un resto de aminoacido expuesto, que se despega de la superficie entra mas facilmente en contacto con otras moleculas que uno que es menos accesible para el disolvente. Por lo tanto, tales restos representan puntos de ataque preferidos para la reaccion de la presente invencion.

A traves del ya mencionado visor SwissPDB existe la posibilidad de calcular tambien estos valores para cada aminoacido de superficie de una protema globular. El calculo de la accesibilidad de los aminoacidos se produce allf a traves del punto del menu “Select --> Accessible aa”, seguido de la entrada de la accesibilidad en porcentaje. Despues se seleccionan los aminoacidos correspondientes y pueden mostrarse presionando la tecla “Return”. A este respecto es adicionalmente posible automatizar el calculo a traves de un programa de elaboracion propia, lo que es tanto mas recomendable cuanto mas aminoacidos deban incluirse en el calculo.

Tal como esta representado en el ejemplo 2, para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) se determinaron los siguientes 97 restos de aminoacido, que producen una contribucion positiva o neutra al potencial electrostatico de la superficie y, al mismo tiempo, presentan un valor para la accesibilidad de al menos el 10 %, estando indicados los valores para la accesibilidad del disolvente en cada caso en % entre parentesis detras de las posiciones mencionadas:

T5 (39), N6 (12), G7 (13), N19 (28), N22 (28), N25 (16), R26 (27), R28 (39), S29 (38), S32 (28), N33 (28), K35 (37), K37 (18), Q53 (12), K72 (27), V75 (30), R76 (24), T81 (16), R82 (22), N83 (44), Q84 (24), Q86 (18), A87 (18), T90 (30), A91 (11), K93 (32), S94 (50), N95 (19), G96 (25), Q98 (29), R118 (41), T136 (22), K142 (30), G149 (14), N150 (39), T151 (22), H152 (27), N154 (41), K156 (30), R158 (33), Y160 (20), R171 (32), Q172 (53), R176 (41), R181 (34), R218 (18), T227 (19), G229 (14), K242 (15), R247 (20), T251 (23), R254 (15), K259 (26), N260 (49), K281 (33), N283 (40), R302 (50), R310 (31), R320 (52), T323 (49), R359 (13), Y368 (12), Y372 (37), T376 (56), K383 (19), K385 (37), Q394 (20), K395 (38), G399 (16), K400 (44), Y404 (11), G417 (11), N418 (25), T419 (59), A420 (37), H421 (16), P422 (46), G435 (25), G436 (17), W439 (47), R444 (49), N445 (41), Q449 (31), V450 (24), R452 (33), R458 (24), S459 (52), G460 (32), T461 (35), T463 (40), N465 (22), A466 (37), N471 (20), S473 (10), N475 (25), G476 (31), N484 (12).

Las formas de realizacion preferidas adicionalmente para esta molecula con respecto a la accesibilidad pueden seleccionarse por medio del valor de porcentaje indicado para la accesibilidad.

Una conversion en otras a-amilasas es posible de manera aproximada a traves de un alineamiento tal como en la figura 2. Es decisiva, tal como se ha explicado ya, sin embargo la verdadera estructura tridimensional, por medio de la cual pueden realizarse, tal como se demuestra en el ejemplo para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), los correspondientes calculos para la verdadera distribucion de carga y la accesibilidad de disolventes.

En otra forma de realizacion preferida se trata en el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion de aquellas variantes de a-amilasa, en las que el resto de aminoacido mencionado se encuentra en una zona neutra o positivamente polarizada o cargada de al menos dos restos de aminoacido directamente adyacentes sobre la superficie.

Segun esto se realiza por tanto el calculo explicado anteriormente y se selecciona para la mutagenesis de acuerdo con la invencion un aminoacido tal que, adicionalmente a las propiedades mencionadas anteriormente, sea inmediatamente adyacente a un resto exactamente igual sobre la superficie, es decir que no esta rodeado exclusivamente por aquellos restos de aminoacido en los que podna realizarse tambien una sustitucion de acuerdo con la invencion.

Con ello, por tanto, se somete a una mutacion de acuerdo con la invencion un aminoacido tal que no se produzca de manera aislada, sino que sea parte de una superficie neutral o positivamente polar o cargada de la molecula. Debido a ello se rompe la disposicion a modo de superficie que puede considerarse, tal como se ha explicado anteriormente, especialmente como origen para que las a-amilasas se agreguen a traves de interacciones electrostaticas y formen multfmeros. Una polaridad o carga positiva aislada debfa ejercer, observada de manera estadfstica, una contribucion mas baja a la multimerizacion, dado que esta debfa ejercer menor accion sobre otras moleculas mediante aminoacidos adyacentes cargados mas negativamente de manera creciente. Por tanto se

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realizan preferentemente sustituciones en zonas anexas, que se presentan de manera neutra o positiva. Tales sustituciones estan representadas en negro o en blanco en el ejemplo de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) en la figura 1.

En el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion se trata de aquellas variantes de a-amilasa, en las que el resto de aminoacido que va a mutarse de acuerdo con la invencion se encuentra en una posicion que pertenece a uno de los dos siguientes grupos:

(A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o

(B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484,

en cada caso indicados en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

Tal como se describe en el ejemplo 3, pudo modelarse de manera exacta la distribucion de carga de superficie para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). A este respecto se determino que los 97 restos de aminoacidos de esta molecula situados sobre la superficie de la molecula y que ejercen una contribucion neutra o positivamente polar o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula y que presentan adicionalmente una accesibilidad de mas de un 10 % pueden asignarse segun su posicion a tres grupos. Segun esto, los restos de los grupos Ay B representan en cada caso zonas anexas de carga o polaridad neutra o positiva.

Como grupo A se designan las siguientes 63 posiciones de aminoacidos, estando indicado en cada caso el aminoacido allf existente en la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368):

T5, N6, G7, N19, N22, N25, R26, R28, S29, S32, N33, K35, K37, Q53, K72, V75, R76, T81, R82, N83, Q84, Q86, A87, T90, A91, K93, S94, N95, G96, Q98, R118, T136, K142, G149, N150, T151, H152, N154, K156, R158, Y160, R171, Q172, R181, T227, G229, R247, T251, R254, K259, N260, K281, N283, Q394, K395, G399, K400, G417, N418, T419, A420, H421, P422.

Al grupo B pertenecen las siguientes 20 posiciones:

G435, G436, W439, R444, N445, Q449, V450, R452, R458, S459, G460, T461, T463, N465, A466, N471, S473, N475, G476, N484.

Los 14 restos de aminoacido que quedan que se agrupan en el grupo C, pueden considerarse como islas neutras o positivas dentro de las zonas por lo demas cargadas o polarizadas negativas:

R176 (41), R218 (18), K242 (15), R302 (50), R310 (31), R320 (52), T323 (49), R359 (13), Y368 (12), Y372 (37), T376 (56), K383 (19), K385 (37), Y404 (11).

En el caso de los restos de aminoacido mencionados en ultimo lugar puede partirse de la base de una contribucion mas bien baja a la tendencia a la agregacion de toda la molecula. Tanto mas debieran provocar las zonas anexas A y B la multimerizacion, cuanto mas debiera ejercerse un efecto electroestatico mas fuerte que provocara la disposicion de varias moleculas, que conduce a la agregacion tal como se supone de acuerdo con la invencion con respecto a la tendencia observada. Por tanto se realizan las sustituciones de aminoacido de acuerdo con la invencion en estas zonas anexas A y/o B.

Para en principio cualquier otra a-amilasa establecida en el estado de la tecnica pueden realizarse las mismas consideraciones y calculos que en el ejemplo de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). En particular en estas posiciones concretas se indica la comparacion mas sencilla de las correspondientes secuencias de aminoacidos a traves de un alineamiento. Las respectivas a-amilasas pueden homologarse con la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). Un alineamiento de este tipo se muestra por ejemplo en la figura 2 para las a- amilasas mas importantes establecidas en el estado de la tecnica; la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2 corresponde a la lmea 1 en la figura 2. A traves de un alineamiento de este tipo pueden deducirse las posiciones preferentes para las sustituciones, mencionadas en el presente documento para la enzima de interes en cada caso, que pueden modificarse al menos de manera aproximada con igual resultado que con la enzima considerada en el presente documento. Tal como se ha explicado ya, por ultimo, es decisiva sin embargo la situacion existente de manera concreta en cada caso en la enzima respectiva.

En otra forma de realizacion preferida, en el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion se trata de aquellas variantes de a-amilasa, en las que se han realizado varias de las sustituciones de aminoacido mencionadas, preferentemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, de manera especialmente preferente entre 10 y 30 y de manera muy especialmente preferente entre 15 y 25.

Por lo tanto, la solucion del presente objetivo tiene como base la observacion de que algunas a-amilasas forman agregados amorfos, y como posible aclaracion para esto se considero la existencia de zonas mas grandes planas

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cargadas o polarizadas de distinta manera. Al mismo tiempo se conocen por el estado de la tecnica a-amilasas que presentan cargas de superficie predominantemente negativas. Por tanto es ventajoso convertir tambien mas de unicamente un resto de acuerdo con la invencion en un resto de aminoacido mas negativamente polar o negativamente cargado.

A este modo de proceder se le establece, de manera correspondiente a la naturaleza de las enzimas, un lfmite superior individual que debe determinarse opcionalmente de manera experimental. Asf, una molecula que esta saturada con muchas cargas negativas debena apartarse mucho del sustrato y debido a ello perder actividad. Ademas, demasiadas cargas pueden repercutir tambien de manera desfavorable en el plegamiento, de modo que a partir de un valor cntico se formanan muchas moleculas sin plegar y por tanto no activas.

Al menos para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) ha resultado por tanto ventajoso limitar el numero de sustituciones de acuerdo con la invencion a menos de 30, pudiendose considerar ventajoso absolutamente mas de 10. Para las a-amilasas que pueden homologarse con esto, por ejemplo aquellas de la figura 2 y en particular aquellas que en las posiciones homologas llevan asf mismo aminoacidos neutros o cargados o polarizados positivamente, ha de esperarse un resultado similar.

En otra forma de realizacion preferida, en el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion se trata de aquellas variantes de a-amilasa, en las que en al menos una a como maximo exactamente tantas otras posiciones se ha sustituido o se han sustituido uno o varios restos de aminoacido de la molecula de partida distintos situados sobre la superficie de la molecula por restos de aminoacido menos negativamente polares o negativamente cargados, siendo posibles en cada caso las siguientes sustituciones de aminoacido:

Aminoacido de partida

por

K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Arg (R)

Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Lys (K)

C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Tyr (Y)

H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Cys (C)

G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

His (H)

A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Gly (G)

V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ala (A)

L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Val (V)

I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Leu (L)

M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ile (I)

F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Met (M)

W, P, S, T, N, Q, E o D

Phe (F)

P, S, T, N, Q, E o D

Trp (W)

S, T, N, Q, E o D

Pro (P)

T, N, Q, E o D

Ser (S)

N, Q, E o D

Thr (T)

Q, E o D

Asn(N)

E o D

Gln (Q)

D

Glu (E)

Mediante esta mutacion opuesta a la verdadera invencion se atenua de nuevo el efecto de carga introducido de acuerdo con la invencion. Debido a ello se persiguen dos objetivos: por un lado tal como se ha mencionado anteriormente, en particular cuando se realizan varias mutaciones de acuerdo con la invencion (de acuerdo con la invencion se consideran especialmente convenientes hasta 30), la molecula de a-amilasa puede obtener una carga negativa en total muy fuerte, de modo que pudieran alterarse la estabilidad y la reactividad. En este sentido puede ser oportuno, en particular cuando se realizan varias mutaciones, debilitar de nuevo en total su efecto de carga.

Por otro lado se rompe debido a ello la planitud de la distribucion de carga sobre la superficie de la enzima. Esta planitud, tal como se ha explicado anteriormente, se considero como un motivo esencial para la multimerizacion. Cuando ahora con carga total constante en total o solo insignificantemente modificada se consigue una modificacion del patron de carga hacia un patron mas descompactado, ha de contarse asf mismo con una reduccion de la tendencia a la agregacion, ya que las moleculas ya no se disponen una con respecto a otra de manera automatica como imanes en orientacion regular.

Para la designacion de las sustituciones permitidas en cada caso se recurre a la consideracion explicada ya anteriormente de que valores de polaridad o cargas tienen en sf las distintas cadenas laterales de aminoacido. Debido a ello resulta exactamente el orden inverso, ya que R, como la cadena lateral de aminoacido mas basica y por regla general cargada positivamente para provocar una polaridad o carga mas bien positiva no puede sustituirse por otra, sin embargo incluso puede ponerse en el sitio de cualquier otra. Esto se aplica en correspondiente escala para K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E y D, representando D la cadena lateral de aminoacido mas acida, portando con valor de pH neutro por regla general una carga negativa y pudiendose sustituir bajo este aspecto de la invencion por cualquier otra, incluyendo E.

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En otra forma de realizacion preferida, en el caso de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion se trata de aquellas variantes de a-amilasa, en las que se ha realizado o se han realizado la sustitucion o las sustituciones realizada o realizadas para la reduccion de la variacion de carga total en la posicion o en las posiciones de aminoacidos que no pertenece o no pertenecen a las siguientes:

(A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422 o

(B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484 o

(C) 176, 218, 242, 302, 310, 320, 323, 359, 368, 372, 376, 383, 385 y 404,

en cada caso indicadas en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

En esta forma de realizacion preferida se retoma el conocimiento obtenido en la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), segun el cual estos restos de aminoacido que van a asignarse a las zonas Ay B forman zonas extensas cargadas o polarizadas neutral o positivamente y los restos mencionados en (C) forman islas cargadas o polarizadas neutral o positivamente dentro de un entorno predominantemente negativo. Dado que, tal como se ha explicado anteriormente, bajo el aspecto de la invencion considerado en el presente documento debe romperse justamente la planitud de la distribucion de carga, es especialmente conveniente seleccionar para la mutacion inversa de compensacion de carga otras posiciones distintas de las designadas en el presente documento, ya que debido a ello aumentana de nuevo las mencionadas regiones cargadas o polarizadas neutral o positivamente.

En otra forma de realizacion preferida, las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion son aquellas variantes de a-amilasa, en las que en el caso de la molecula de partida se trata de la siguiente a-amilasa: a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

Tal como se ha descrito anteriormente, se han establecido en el estado de la tecnica numerosas a-amilasas para su uso para distintos fines tecnicos. A esto pertenecen por ejemplo enzimas fungicas y bacterianas.

Para fines tecnicos son especialmente habituales aquellas a-amilasas de bacterias Gram positivas, en particular del genero Bacillus, que se adaptan a un medio alcalino, ya que presentan desde el principio propiedades favorables para estos campos de uso. De manera correspondiente a esto, la presente invencion se refiere a la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), conocida por el documento WO 02/10356 A2 y la presente solicitud.

Adicionalmente se han descrito en el estado de la tecnica numerosas variantes de a-amilasa derivadas mediante mutagenesis de aminoacidos individuales o varios en las mencionadas a-amilasas. En todas estas puede aplicarse asf mismo la presente invencion, partiendose en principio de que los respectivos efectos son aditivos. Asf debena poder mejorarse una variante de a-amilasa, que es especialmente eficaz debido a una determinada sustitucion de aminoacido en un campo de aplicacion especial, mediante la realizacion de una mutacion de acuerdo con la invencion adicionalmente a este aspecto de eficacia tambien en su tendencia a la agregacion. Preferentemente se trata por tanto de variaciones de aminoacidos, para las que se ha descrito ya una correspondiente ventaja.

Segun esto, no desempena en principio ningun papel en que orden se han realizado las respectivas sustituciones, es decir si se desarrolla un correspondiente mutante puntual de acuerdo con la invencion o en primer lugar se genera por ejemplo a partir de una molecula de tipo salvaje una variante de acuerdo con la invencion que se desarrolla de manera correspondiente a otras ensenanzas que se encuentran en el estado de la tecnica. Pueden realizarse tambien al mismo tiempo en un planteamiento de mutagenesis varias sustituciones, por ejemplo de acuerdo con la invencion y otras conjuntamente. Esta situacion se produce por ejemplo cuando una a-amilasa se desarrolla con procedimientos de mutagenesis de accion estadfstica, tal como por ejemplo mediante agentes de mutagenizacion o transposicion. Esto se aplica para cualquier tipo de modificacion de las respectivas enzimas, en particular para mutaciones puntuales, que actuan en principio independientemente entre sf.

Las a-amilasas especialmente eficaces, que pueden obtenerse mediante mutaciones puntuales se deducen por ejemplo de la solicitud WO 00/60060 A2, que describe por medio de la amilasa AA560 (la misma numeracion que la protema madura en la SEC ID N.° 2) numerosas mutaciones en las posiciones 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 216 y 269. Esta solicitud puede considerarse como desarrollo del documento WO 96/23873 A1 que habfa descrito ya la posibilidad de la mutagenesis puntual para la mejora de la eficacia en las posiciones 180, 181, 182, 183, 184 y 185. La solicitud WO 00/60059 A2 menciona otras mejoras de las enzimas designadas en el presente documento como amilasas similares a Termamyl; segun esto son las posiciones 13, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 57, 107, 108, 111, 168 y 197 (en la numeracion de la a-amilasa de B. licheniformis) puntos de partida adecuados para ello. En el caso de la molecula de partida se trata de a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

Asf se representa la invencion descrita en el presente documento en los ejemplos de la presente solicitud en particular por medio de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuyas secuencias de ADN y aminoacidos con toda probabilidad correctas estan mostradas en el protocolo de secuencias de la presente solicitud. Esta enzima de tipo salvaje tiene en comparacion con otras a-amilasas establecidas las ventajas descritas en la solicitud WO 02/10356 A2 con respecto a su uso en agentes de lavado y de limpieza. Con la ciclodextrina-glucanotransferasa de

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B. agaradherens (DSM 9948) se ha mencionado ya anteriormente otra molecula de partida que, tal como se describe en la solicitud WO 02/44350 A2, hace asf mismo especiales contribuciones a la eficacia total de agentes de lavado y de limpieza en comparacion con otras enzimas.

Las amilasas hnbridas de las a-amilasas de B. amiloliquefaciens y B. licheniformis se describen en la solicitud WO 03/014358 A2. Entre estas han mostrado las moleculas designadas con los acronimos AL34, AL76, AL112, AL256, ALA34-84, LAL19-153 o LAL19-433 eficacias especialmente ventajosas en su uso en agentes de lavado y de limpieza. Los respectivos nombres designan los elementos, de los que estan compuestas en cada caso, observados desde el extremo N-terminal, representando A la a-amilasa de B. amiloliquefaciens y representando L la a-amilasa de B. licheniformis y el siguiente numero indica el punto de transicion de una secuencia de aminoacidos en otra. Otros detalles con respecto a esto pueden deducirse de la mencionada solicitud.

Las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion son aquellas variantes de a-amilasa, en las que en el caso de la molecula de partida se trata de una a-amilasa, cuya secuencia de aminoacidos es identica en un 100 % a la secuencia de aminoacidos indicada en la SEC ID N.° 2 en las posiciones +1 a 484.

Esta a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) se describe detalladamente en la solicitud de patente internacional WO 02/10356 A2 mencionada ya varias veces. Con respecto a esto se menciona que la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos derivada de la misma de la a-amilasa que puede obtenerse de esta cepa presentan con toda probabilidad las secuencias indicadas en la SEC ID N.° 1 o 2 de la presente solicitud. Esto es una correccion con respecto a las secuencias indicadas en la solicitud WO 02/10356 A2. Tambien los ensayos descritos en aquella solicitud se han realizado con la a-amilasa nativa que puede obtenerse de esta cepa.

La secuencia de nucleotidos de acuerdo con la SEC ID N.° 1 permite al experto directamente realizar las mutaciones de acuerdo con la invencion. Quien haya preparado un ADN que codifica para a-amilasa segun el protocolo de secuencias del documento WO 02/10356 A2, en lugar de recurrir a los microorganismos depositados, puede transformar este con ayuda de procedimientos sencillos de mutagenesis puntual, tal como se mencionan tambien en los ejemplos de la presente solicitud, en una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la SEC ID N.° 1 de la presente solicitud.

Las posibilidades de cultivo del correspondiente microorganismo, la purificacion y la caracterizacion enzimatica de la a-amilasa de tipo salvaje se conocen asf mismo a partir de aquella solicitud y se resumen en el ejemplo 1 de la presente solicitud otra vez. Las variantes de esta enzima de acuerdo con la invencion pueden obtenerse y purificarse en principio de igual manera, pudiendose considerar las diferencias introducidas de acuerdo con la invencion (por ejemplo con la consideracion del punto isoelectrico (IEP)). Por ejemplo, el IEP debena desplazarse aproximadamente en el intervalo acido.

Ademas se prefieren aquellas variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion, en las que en el caso de la molecula de partida se trata de una variante de a-amilasa con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones puntuales adicionales.

Las secuencias indicadas en la SEC ID N.° 1 y 2 se diferencian, tal como se explica en el ejemplo 1, en respectivamente dos posiciones de las indicadas en el documento WO 02/10356 A2. Estas representan segun el nivel de conocimiento actual las mejores descripciones de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) y por consiguiente son puntos de partida especialmente preferentes para la introduccion de sustituciones de aminoacido de acuerdo con la invencion.

Ademas, correspondientemente a lo dicho anteriormente, puede partirse de la base de que en principio cualquier a- amilasa con mutaciones puntuales individuales, es decir deleciones, inserciones o sustituciones de aminoacidos individuales puede mejorarse con respecto a otros aspectos. Asf, tal como se ha descrito ya anteriormente, de las solicitudes WO 00/22103 A1, WO 96/23873 A1, WO 00/60060 A2 y WO 01/66712 A2 resultan las variantes de a- amilasa mutagenizadas en posiciones individuales que se han mejorado en cada caso con respecto a aspectos especiales. Dado que estas presentan en parte altos valores de homologfa con respecto a esta amilasa mostrada en la SEC ID N.° 2, es decir pueden designarse como altamente similares, ha de esperarse que puedan transferirse las sustituciones designadas en el presente documento con las mismas repercusiones ventajosas tambien sobre estas moleculas asf como de manera analoga tambien sobre otras a-amilasas. Otras posibles modificaciones pueden deducirse del estado de la tecnica, tal como esta resumido este por ejemplo en la introduccion a la presente solicitud.

Ademas formas de realizacion preferentes de la presente invencion son variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion con las mutaciones puntuales adicionales en una o varias de las siguientes posiciones: 5, 167, 170, 177, 202, 204, 271, 330, 377, 385 y 445, en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

Asf resulta de la solicitud de patente alemana no publicada previamente DE 10309803.8 que en las posiciones -19, 5, 167, 170, 177, 204, 271, 330, 377, 385 y/o 445 (o 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 y 474 de acuerdo con la numeracion de la a-amilasa no procesada de B. amiloliquefaciens) pueden realizarse mutaciones puntuales

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para la mejora de la actividad alcalina de a-amilasas. Preferentemente se usa la presente invencion por tanto en estas moleculas ya mejoradas.

Las variantes de a-amilasa estabilizadas frente a la oxidacion resultan de la solicitud WO 94/18314 A1, entre estas sobre todo en posicion 197 (en la numeracion de la a-amilasa de B. licheniformis), que corresponde a la posicion 202 de la a-amilasa de acuerdo con la SEC ID N.° 2. Las variantes de acuerdo con la invencion pueden estabilizarse mediante las sustituciones mencionadas en el presente documento, sobre todo en la posicion 202 adicionalmente frente a la oxidacion. Esta sustitucion es tambien por tanto especialmente interesante, ya que en el caso de M202 en la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) se trata del unico resto de metionina que es accesible con un valor de accesibilidad del 30 % para el disolvente en mas del 10 % (ejemplo comparativo 2). Mediante esto se explica su especial sensibilidad a la oxidacion asf como la relacion con la presente invencion.

Ciertas formas de realizacion preferentes de esto las representan aquellas variantes de a-amilasa, en las que en el caso de las enzimas de partida se trata de las siguientes mutaciones puntuales: 5A, 167R, 170P, 177L, 202L, 204V, 271 D, 330D, 377R, 385S y/o 445Q.

Asf se describen las variaciones de secuencias (-19P, 5A, 167R, 170P, 177L, 204V, 271 D, 330D, 377R, 385S y 445Q (o en la numeracion de la a-amilasa no procesada de B. licheniformis la sustituciones por 13P, 32A, 194R, 197P, 203L, 230V, 297D, 356D, 406R, 414S y 474Q)) en la solicitud DE 10309803.8 mencionada como sustituciones preferentes.

En el documento WO 94/18314 A1 se representa especialmente la accion estabilizadora frente a la oxidacion de la sustitucion M197L, que corresponde a la sustitucion de aminoacido M202L de acuerdo con la SEC ID N.° 2. Por consiguiente, las variantes de acuerdo con la invencion pueden estabilizarse frente a la oxidacion adicionalmente en particular mediante esta mutacion puntual.

Otro objeto de la presente invencion lo forman procedimientos para aumentar la estabilidad de una a-amilasa frente a una dimerizacion y/o multimerizacion mediada por interacciones electrostaticas, mediante lo cual al menos un resto de aminoacido de la molecula de partida situado sobre la superficie de la molecula y que ejerce una contribucion neutra o positivamente polar o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula se ha sustituido por un resto de aminoacido mas negativamente polar o negativamente cargado, siendo posibles las siguientes sustituciones de aminoacido:

Aminoacido de partida

por

Arg (R)

K, Y, C, H, G, A, V L I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Lys (K)

Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W P, S, T, N, Q, E o D

Tyr (Y)

C, H, G, A, V, L, I, M, F, W P S, T, N, Q, E o D

Cys (C)

H, G, A, V, L, I, M, F, W P S, T, N, Q, E o D

His (H)

G A, V, L, I, M, F, W, P, S T, N, Q, E o D

Gly (G)

A, V, L, I, M, F , W, P, S, T, N, Q, E o D

Ala (A)

V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Val (V)

L, I, M, F , W, P, S, T, N, Q, E o D

Leu (L)

I, M, F, W, P, S, T, N, Q E o D

Ile (I)

M F, W P S , T, N , Q, E o D

Met (M)

F, W P, S, T, N, Q , E o D

Phe (F)

W P S , T, N , Q, E o D

Trp (W)

P, S, T, N, Q, E o D

Pro (P)

S, T, N, Q, E o D

Ser (S)

T, N, Q, E o D

Thr (T)

N, Q, E o D

Asn(N)

Q E o D

Gln (Q)

E o D

Glu (E)

D

y encontrandose el resto de aminoacido mencionado en una posicion que pertenece a uno de los dos siguientes grupos:

(A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o

(B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484,

en cada caso indicados en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2, tratandose en el caso de la molecula de partida de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de aminoacidos es identica en un 100 % a la secuencia de aminoacidos indicada en la SEC ID N.° 2 en las posiciones +1 a 484.

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De acuerdo con la invencion, por la tendencia a la formacion de agregados de a-amilasa amorfos se entiende la formacion de d^eros, tnmeros o agregados de mas moleculas de a-amilasa individuales. Dado que mediante esto de la respectiva preparacion de enzimas, tal como se ha explicado anteriormente considerada macroscopicamente, se pierde una proporcion considerable de actividad, se entiende esto como un aspecto de estabilidad. Aquel procedimiento que contrarresta la agregacion, es por consiguiente uno que aumenta la estabilidad de la respectiva preparacion de enzimas con respecto a su actividad total.

El planteamiento de acuerdo con la invencion para solucionar este problema consiste, tal como se ha explicado ya igualmente, en limitar la multimerizacion mediada por interacciones electrostaticas. Esto se realiza debido a que se modifican las cargas y los portadores de polaridad situados sobre la superficie de la a-amilasa, y a decir verdad hacia polaridades menos neutras o menos positivas, es decir hacia polaridades y cargas mas bien negativas. Segun esto, tal como se ha explicado ya y tal como se retoma mas abajo otra vez, se prefieren sustituciones en determinadas regiones y determinadas posiciones.

Los procedimientos para la produccion de variantes de enzima los conoce en sf un biotecnologo. Este recurre a este respecto en particular a los acidos nucleicos que codifican para las respectivas enzimas de partida, que de manera correspondiente al aminoacido que va a introducirse se muta en el correspondiente codon.

El principio para esto se pone de manifiesto tambien por el ejemplo 3: por ejemplo con ayuda del kit QuikChange (empresa Stratagene, n.° de catalogo 200518) se sintetizan cebadores, segun el correspondiente protocolo, que cubren la zona que va a mutarse y que contienen la mutacion que va a introducirse (cebadores de apareamiento erroneo). Las secuencias de cebadores se disenan por medio de la correspondiente secuencia de nucleotidos considerando el codigo genetico universal. Segun esto, para la generacion de una carga o polaridad menos neutra o positiva, tal como se ha explicado ya anteriormente, son posibles las sustituciones de aminoacido correspondientemente escalonadas. Segun este principio se mutageniza correspondientemente de manera adecuada un vector de expresion que contiene la secuencia de a-amilasa y segun procedimientos generalmente conocidos se transforma en una cepa de expresion adecuada para la expresion de la amilasa. Dado que la variante presenta en comparacion con la molecula de partida por regla general solo algunas sustituciones, puede orientarse en el caso de la eleccion del sistema de expresion, de los procedimientos de cultivo y de los procedimientos de procesamiento con los sistemas establecidos para la molecula de partida. A este respecto ha de considerarse que de acuerdo con la invencion se modifican las propiedades electroestaticas de las a-amilasas. Una modificacion correspondiente a esto del IEP puede comprobarse por ejemplo con ayuda de un enfoque isoelectrico.

Por lo demas se aplican de manera correspondiente las afirmaciones realizadas anteriormente con respecto a las respectivas enzimas. Esto se aplica de manera correspondiente tambien para las formas de realizacion preferentes, es decir para aquellos procedimientos de acuerdo con la invencion, con los que se obtienen las variantes descritas ya anteriormente como de acuerdo con la invencion.

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos en los que el resto de aminoacido mencionado antes de la sustitucion de aminoacido presenta una accesibilidad de al menos un 10 %, preferentemente al menos un 20 %, de manera especialmente preferente al menos un 30 %, calculandose la accesibilidad del resto de aminoacido en cuestion sobre una escala del 0 % (no accesible al disolvente) al 100 % (contenido en un pentapeptido hipotetico GGXGG).

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos mas preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos en los que el resto de aminoacido mencionado se encuentra en una zona neutra o positivamente polarizada o cargada de al menos dos restos de aminoacido directamente adyacentes sobre la superficie.

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos mas preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos en los que se llevan a cabo varias de las sustituciones de aminoacido mencionadas, preferentemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, de manera especialmente preferente entre 10 y 30 y de manera muy especialmente preferente entre 15 y 25.

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos mas preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos segun los cuales en al menos una a como maximo exactamente tantas otras posiciones se ha sustituido o se han sustituido uno o varios restos de aminoacido de la molecula de partida distintos situados sobre la superficie de la molecula por restos de aminoacido menos negativamente polares o negativamente cargados, siendo posibles en cada caso las siguientes sustituciones de aminoacido:

Aminoacido de partida

por

K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Arg (R)

Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Lys (K)

C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Tyr (Y)

H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Cys (C)

G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

His (H)

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(continuacion)

Aminoacido de partida

por

A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Gly (G)

V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ala (A)

L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Val (V)

I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Leu (L)

M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Ile (I)

F, W, P, S, T, N, Q, E o D

Met (M)

W, P, S, T, N, Q, E o D

Phe (F)

P, S, T, N, Q, E o D

Trp (W)

S, T, N, Q, E o D

Pro (P)

T, N, Q, E o D

Ser (S)

N, Q, E o D

Thr (T)

Q, E o D

Asn(N)

E o D

Gln (Q)

D

Glu (E)

Segun esto es en principio insignificante si se realiza en primer lugar la sustitucion de acuerdo con la invencion o en primer lugar esta sustitucion que compensa la carga.

Entre estos se prefieren, de manera correspondiente a lo dicho anteriormente, procedimientos en los que se ha realizado la sustitucion o se han realizado la sustitucion o las sustituciones realizadas para la reduccion de la variacion de carga total en posicion o posiciones de aminoacido que no pertenece o no pertenecen a las siguientes:

(A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422 o

(B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484 o

(C) 176, 218, 242, 302, 310, 320, 323, 359, 368, 372, 376, 383, 385 y 404,

en cada caso indicadas en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos mas preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos en los que en el caso de la molecula de partida se trata de a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) y/o de una a-amilasa derivada de esto mediante mutagenesis de aminoacidos individuales o varios.

Entre estos se prefieren, de manera correspondiente a lo dicho anteriormente, procedimientos en los que en el caso de la molecula de partida se trata de una variante de a-amilasa con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones puntuales adicionales.

De manera correspondiente a lo dicho anteriormente, en el caso de los procedimientos mas preferentes de acuerdo con la invencion se trata de aquellos en los que la a-amilasa introducida es una variante de a-amilasa con las mutaciones puntuales adicionales en una o varias de las siguientes posiciones: 5, 167, 170, 177, 202, 204, 271, 330, 377, 385 y 445, en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

En el presente documento se indica tambien otra vez que en caso de mutantes como moleculas de partida que pueden usarse de acuerdo con la invencion en principio no desempena ningun papel si la sustitucion de aminoacido de acuerdo con la invencion se realiza tras o antes de la introduccion de las otras sustituciones conocidas por el estado de la tecnica.

Entre estos se prefieren, de manera correspondiente a lo dicho anteriormente, procedimientos en los que se trata de las siguientes mutaciones puntuales: 5A, 167R, 170P, 177L, 202L, 204V, 271 D, 330D, 377R, 385S y/o 445Q.

Otro objeto de la presente invencion lo forman acidos nucleicos que codifican para una de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion descritas anteriormente.

Por esto ha de entenderse tanto moleculas de ARN como tambien de ADN asf como analogos de ADN, tanto de la cadena codificante como tambien de la cadena codogenica, y a decir verdad en cualquier marco de lectura, ya que es posible aprovechar la ensenanza asociada a la invencion para realizar a traves de un correspondiente ARN interferente una regulacion de las correspondientes a-amilasas o aumentar la durabilidad de la informacion genetica, transfiriendose esta en un analogo de ADN que puede degradarse lentamente in vivo. Los acidos nucleicos brindan a la presente invencion por asf decirlo la dimension de biologfa molecular, tal como puede distinguirse en los objetos de la invencion expuestos a continuacion. Estos se prefieren correspondientemente, de manera correspondiente a lo dicho anteriormente.

Preferentemente ha de entenderse por esto moleculas de ADN, puesto que a traves de estas es posible preparar las

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variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion por medio de procedimientos de biologfa molecular en s^ conocidos y/u opcionalmente modificarlas posteriormente. Para las variantes de a-amilasas mencionadas anteriormente, establecidas en el estado de la tecnica estan depositadas las secuencias de nucleotidos en bancos de datos generalmente conocidos (por ejemplo Genbank o Swissprot; vease anteriormente) o se deducen de las publicaciones mencionadas. Estas secuencias representan puntos de partida correspondientemente preferentes para la introduccion de las mutaciones puntuales de acuerdo con la invencion.

Los puntos de partida para este acido nucleico pueden ser tambien la informacion de secuencias indicada en el protocolo de secuencias, en particular para derivados de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). Otra alternativa consiste en realizar una preparacion de ADN total de determinados microorganismos tomados en consideracion para ello y aislar los genes endogenos de a-amilasa a traves de PCR. Como cebadores pueden usarse en principio los fragmentos de secuencia 5' y 3' que van a leerse asf mismo de la SEC ID N.° 1.

Los fragmentos puros que codifican para protemas pueden mutagenizarse por ejemplo tambien a traves de una PCR, es decir pueden modificarse de acuerdo con la invencion en su secuencia. Para ello se realiza una PCR con una tasa de error estadfstica correspondiente, se clona el producto de PCR y se verifican las mutaciones introducidas mediante secuenciacion posterior.

Se prefiere con esto un acido nucleico que se deriva de un acido nucleico de acuerdo con la SEC ID N.°1, o de una variante del mismo con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones puntuales adicionales con respecto a aquellas mutaciones que conducen a una de las sustituciones de aminoacido definidas anteriormente como de acuerdo con la invencion, con lo que se quiere decir aquellas mediante las cuales se ha sustituido al menos un resto de aminoacido de la molecula de partida situado sobre la superficie de la molecula y que ejerce una contribucion neutra o positivamente polar o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula por un resto de aminoacido mas negativamente polar o negativamente cargado, considerandose la prioridad expuesta de las sustituciones de aminoacido permitidas, o las sustituciones de compensacion descritas en al menos una posicion hasta como maximo exactamente muchas otras posiciones de uno o varios otros restos de aminoacido de la molecula de partida situados sobre la superficie de la molecula por restos de aminoacido menos negativamente polares o negativamente cargados, considerandose la prioridad correspondientemente opuesta de las sustituciones de aminoacido permitidas.

Por lo tanto, tal como se ha explicado anteriormente, pueden introducirse distintas mutaciones puntuales en moleculas de a-amilasa, que pueden ejercer en principio acciones ventajosas independientemente entre sf Asf pueden realizarse sustituciones de acuerdo con la invencion en aquellas moleculas que se han mejorado en particular con respecto a aspectos especiales de eficacia, a la estabilidad o por ejemplo a la alergenicidad. A esto pertenecen en particular tambien mutaciones puntuales no de acuerdo con la invencion. Este planteamiento para la generacion finalmente de sustituciones de aminoacido de acuerdo con la invencion se basa en los correspondientes acidos nucleicos, siendo basicamente irrelevante de manera tecnica en que orden se realizan estas diversas mutaciones.

Otro objeto de la presente invencion lo forman vectores que contienen un acido nucleico de acuerdo con la invencion designado anteriormente.

Por lo tanto para tratar a los acidos nucleicos relevantes de la invencion y con ello realizar en particular los procedimientos de acuerdo con la invencion y preparar la produccion de protemas de acuerdo con la invencion se ligan estas de manera adecuada en vectores. Tales vectores asf como los correspondientes procedimientos de trabajo se describen en detalle en el estado de la tecnica. Los vectores pueden obtenerse comercialmente en gran numero y gran anchura de variacion, tanto para la clonacion como tambien para la expresion. A esto pertenecen por ejemplo vectores que se derivan de plasmidos bacterianos, de bacteriofagos o de virus, o vectores predominantemente sinteticos. Ademas se diferencian segun el tipo de celulas, en las que pueden establecerse, por ejemplo en vectores para bacterias Gram negativas, para bacterias Gram positivas, para levaduras o para eucariotas superiores. Estos forman puntos de partida adecuados por ejemplo para estudios de biologfa molecular y bioqmmicos, para la mutagenesis de los fragmentos de acido nucleico contenidos asf como para la expresion del gen en cuestion o de la correspondiente protema. En particular para la produccion de constructos para la delecion o refuerzo de la expresion, estos son practicamente indispensables (tal como se deduce del estado de la tecnica pertinente para ello).

Los vectores son especialmente adecuados para realizar variaciones de secuencia de acuerdo con la invencion, por ejemplo a traves de mutagenesis dirigida al sitio, tal como se representa esto en el ejemplo 3.

En una forma de realizacion, en el caso de vectores de acuerdo con la invencion se trata de vectores de clonacion.

Puesto que los vectores de clonacion son adecuados, ademas de para el almacenamiento, la amplificacion biologica o la seleccion del gen de interes, para su caracterizacion de biologfa molecular. Al mismo tiempo, estos representan formas transportables y con capacidad de almacenamiento de los acidos nucleicos reivindicados y son tambien puntos de partida para tecnicas de biologfa molecular que no estan unidas a celulas, tales como por ejemplo la PCR o procedimientos de mutagenesis in vitro.

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Por ejemplo puede convertirse un vector de clonacion, que porta el gen para una a-amilasa descrita en el estado de la tecnica, mediante realizacion de una mutacion de acuerdo con la invencion en un vector de clonacion de acuerdo con la invencion.

Preferentemente, en el caso de vectores de acuerdo con la invencion se trata de vectores de expresion.

Por lo tanto, los vectores de expresion de este tipo son la base para realizar los correspondientes acidos nucleicos en sistemas de produccion biologicos y con ello producir las correspondientes protemas, dado que permiten in vivo la transcripcion y traduccion, es decir la smtesis del producto genico en cuestion. Las formas de realizacion preferentes de este objeto de la invencion son vectores de expresion que llevan los elementos geneticos necesarios para la expresion, por ejemplo el promotor natural, localizado originariamente delante de este gen o un promotor de otro organismo. Estos elementos pueden estar dispuestos por ejemplo en forma de un denominado casete de expresion. Como alternativa pueden proporcionarse algunos o todos los elementos de regulacion tambien por la respectiva celula huesped. De manera especialmente preferente, los vectores de expresion estan adaptados con respecto a otras propiedades, tales como por ejemplo el numero de copias optimo, al sistema de expresion seleccionado, en particular la celula huesped (vease a continuacion).

Por regla general, la facilitacion de un vector de expresion es la mejor posibilidad de formar de manera amplificada una protema de acuerdo con la invencion preferentemente en combinacion con protemas de acuerdo con la invencion que interaccionan con esta y por consiguiente de aumentar la respectiva actividad o poner al alcance una produccion cuantitativa.

Un propio objeto de la invencion lo forman las celulas que despues de la modificacion mediante ingeniena genetica contienen uno de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion designados anteriormente.

Por lo tanto, estas celulas contienen la informacion genetica para la smtesis de una protema de acuerdo con la invencion y se usan entonces en procedimientos de acuerdo con la invencion cuando se obtienen biotecnologicamente las a-amilasas en cuestion. Entre ellas se consideran en particular aquellas celulas que se han dotado de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion segun procedimientos en sf conocidos, o las que se derivan de tales celulas. Para ello se seleccionan de manera adecuada aquellas celulas huesped que pueden cultivarse de manera comparativamente facil y/o proporcionan altos rendimientos de producto.

Estas permiten por ejemplo la amplificacion de los correspondientes genes, sin embargo tambien su mutagenesis, cuando se realiza un procedimiento de mutagenesis in vivo, o la transcripcion y la traduccion y por ultimo la produccion biotecnologica de las protemas en cuestion. Esta informacion genetica puede encontrarse o bien extracromosomicamente como elemento genetico propio, es decir en caso de bacterias en localizacion plasmfdica o puede estar integrada en un cromosoma. La eleccion de un sistema adecuado depende de las cuestiones, como por ejemplo el tipo y la duracion del almacenamiento del gen, o del organismo o el tipo de mutagenesis o seleccion. Las posibilidades de realizacion de este tipo las conoce en sf el biologo molecular.

A partir de esto se explica tambien la forma de realizacion preferente, segun la cual en una celula de este tipo el acido nucleico mencionado es parte de un vector, en particular de un vector de acuerdo con la invencion descrito anteriormente.

Por lo tanto, a esto se asocian las ventajas descritas anteriormente en la manipulacion, el almacenamiento, la expresion etc. del acido nucleico en cuestion.

Se prefiere entre estas celulas en cada caso una celula huesped, en caso de la cual se trata de una bacteria, en particular de una que secreta la variante de a-amilasa formada al medio circundante.

Por lo tanto las bacterias se caracterizan por tiempos de generacion cortos y bajas exigencias con las condiciones de cultivo. Debido a ello pueden establecerse procedimientos economicos. Ademas se dispone en el caso de bacterias en la tecnica de fermentacion de una amplia experiencia. Para una produccion especial pueden ser adecuadas las bacterias Gram negativas o Gram positivas por los mas diversos motivos que van a determinarse experimentalmente en el caso individual tales como fuentes de nutrientes, tasa de formacion de productos, tiempo necesario etc.

Una forma de realizacion adicionalmente ventajosa se refiere a que la mayor parte de a-amilasas industrialmente importantes se han hallado originariamente como enzimas que se secretan por los microorganismos en cuestion, en particular bacterias en el medio circundante. Por lo tanto in vivo se trata en la mayona de los casos de enzimas de digestion. De manera correspondiente a esto es ventajoso cuando las enzimas de acuerdo con la invencion producidas industrialmente se secretan asf mismo en el medio circundante. Por lo tanto a partir de este pueden procesarse sin disrupcion celular y con ello de manera comparativamente facil. Esto puede conseguirse por ejemplo debido a que los genes en cuestion se complementan por secuencias correspondientes (siempre que estas no esten presentes en cualquier caso) que codifican para un peptido lfder que induce a la celula en cuestion a disponerlas. Una alternativa en el caso de bacterias Gram negativas consiste por ejemplo en abrir parcialmente la membrana exterior para la liberacion de protemas, tal como se ha descrito esto por ejemplo en la solicitud WO 01/81597 A1.

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En una forma de realizacion preferida se trata de una bacteria Gram-negativa, en particular de una de los generos Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, en particular de cepas de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy especialmente se trata de derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).

Por lo tanto, estas especies y cepas estan establecidas en el estado de la tecnica para etapas de trabajo de biologfa molecular y procesos de produccion biotecnologicos. Estas se encuentran a disposicion ademas por medio de colecciones de cepas generalmente accesibles tal como la Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos celulares GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (
http://www.dsmz.de) o de fuentes comerciales. Estas pueden optimizarse ademas en la interaccion con componentes restantes que estan a disposicion asf mismo en gran numero, tal como por ejemplo vectores en relacion a las condiciones de produccion espedficas.

En el caso de bacterias Gram negativas, tales como por ejemplo E. coli, se secretan una pluralidad de protemas en el espacio periplasmatico. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. Tal como se ha mencionado, se conocen tambien procedimientos segun los cuales tambien las bacterias Gram negativas descargan las protemas expresadas.

En una forma de realizacion alternativa, no menos preferente se trata de una bacteria Gram positiva, en particular de una de los generos Bacillus, Staphilococcus o Corynebakterium, muy especialmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amiloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphilococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum, y entre ellas a su vez de manera muy especialmente preferente se trata de un derivado de B. licheniformis DSM 13.

Por lo tanto, las bacterias Gram positivas tienen la diferencia basica en comparacion con las Gram negativas de liberar protemas secretadas de inmediato en el medio nutritivo que rodea las celulas, del que pueden purificarse directamente, si se desea esto, las protemas de acuerdo con la invencion expresadas. Ademas estas son afines o identicas con la mayona de los organismos de origen para enzimas tecnicamente importantes y forman en la mayor parte de los casos incluso enzimas comparables, de modo que disponen de un uso de codon similar y su aparato de smtesis de protemas esta orientado naturalmente de manera correspondiente. La B. licheniformis DSM que caracteriza una forma de realizacion muy especialmente preferente esta ampliamente extendida asf mismo en el estado de la tecnica como cepa de produccion biotecnologica.

Otra forma de realizacion de la presente invencion la forman los procedimientos para la produccion de una variante de a-amilasa descrita anteriormente.

Los procedimientos de acuerdo con la invencion en el sentido estricto para aumentar la estabilidad de una a-amilasa frente a una multimerizacion mediada por interacciones electrostaticas se han descrito ya anteriormente. Estos designan las etapas preferentemente de biologfa molecular para generar las variantes de este tipo generalmente al principio. Los procedimientos definidos en este punto, en un sentido mas amplio asf mismo de acuerdo con la invencion son aquellos que son necesarios tecnicamente para preparar las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion en cantidades cuantitativas. Por tanto se consideran (a excepcion de la smtesis qmmica de enzimas mas bien solo teoricamente relevante) procedimientos de produccion preferentemente biotecnologicos de variantes de acuerdo con la invencion. En estos se introducen habitualmente cepas de microorganismos a las que, con aplicacion de tecnicas de biologfa molecular en sf conocidas, se les ha permitido producir variantes de a-amilasa que se han reconocido ventajosas de acuerdo con la invencion en el transcurso de la presente invencion.

El procedimiento expuesto anteriormente de acuerdo con la invencion, que se basa en particular en una mutagenesis puede introducirse por consiguiente como seccion de procedimiento caracterizadora en un procedimiento biotecnologico establecido para la produccion de a-amilasas, es decir puede combinarse con uno de este tipo.

Como deteccion para la formacion de una protema en cuestion en una cepa usada para la produccion sirve una deteccion enzimatica de las respectivas actividades enzimaticas a traves de reacciones de deteccion en sf conocidas para actividad a-amilasa. Como deteccion a nivel de biologfa molecular pueden sintetizarse las protemas representadas en el presente protocolo de secuencias segun procedimientos habituales y pueden formarse anticuerpos contra esto. Estas protemas pueden detectarse entonces por ejemplo a traves de correspondientes inmunotransferencia tipo Western. De manera especialmente preferente reaccionan estos anticuerpos ante aquellas zonas de superficie que se han modificado de acuerdo con la invencion, puesto que se proporciona de esto una capacidad de distincion en comparacion con las variantes no de acuerdo con la invencion.

El objetivo de este procedimiento consiste en alimentar las respectivas a-amilasas a sus respectivas aplicaciones. Para ello puede recurrirse a todas las etapas de procesamiento, de purificacion y de confeccion establecidas en la biotecnologfa. A esto pertenece por ejemplo el procedimiento descrito en la solicitud WO 2004/067557 A1, que se basa en una cromatograffa para el ennoblecimiento de disoluciones enzimaticas concentradas que pueden aplicarse por consiguiente tambien de manera eficaz en preparaciones de amilasa. En esto se basa la solicitud DE 10360841.9 no publicada previamente, segun la cual las respectivas disoluciones obtenidas mediante, entre otras, una etapa de cromatograffa pueden procesarse para obtener granulados de enzimas. Otros aspectos de

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procedimiento que van a combinarse asf mismo de manera ventajosa con la presente invencion se deducen de las solicitudes DE 102004021384.4 y DE 102004019528 igualmente no publicadas anteriormente, segun las cuales pueden aumentarse la estabilidad en almacenamiento y la resistencia a la abrasion de los granulados de este tipo mediante incorporacion de glicerina o 1,2-propanodiol o mediante un revestimiento especial.

Estos procedimientos se mejoran de acuerdo con la invencion, en particular en las etapas parciales en las que la preparacion de enzimas se encuentra aun en forma lfquida, debido a que la variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion contenida tiende menos a la agregacion a traves de interacciones electrostaticas y por consiguiente se produce una perdida mas baja de actividad total. Debido a ello pueden producirse por ejemplo granulados de a- amilasa que contienen una proporcion mas alta de sustancia activa.

Preferentemente, en el caso de los procedimientos de preparacion se trata de procedimientos que tienen lugar usando un acido nucleico de acuerdo con la invencion designado anteriormente, preferentemente usando un vector de acuerdo con la invencion designado anteriormente y de manera especialmente preferente usando una celula de acuerdo con la invencion designada anteriormente.

Por lo tanto mediante los mencionados acidos nucleicos, en particular los acidos nucleicos concretos indicados en el protocolo de secuencias se pone a disposicion la informacion genetica correspondientemente preferente en forma que puede aprovecharse microbiologicamente, es decir para procedimientos de produccion de ingeniena genetica. Es preferente de manera creciente la facilitacion en un vector que puede aprovecharse de manera especialmente eficaz por la celula huesped o por las propias celulas de este tipo. Los procedimientos de produccion en cuestion los conoce en sf el experto.

Las formas de realizacion de la presente invencion pueden ser, basandose en las correspondientes secuencias de acido nucleico, tambien sistemas de expresion libre de celula, en caso de los que se entiende la biosmtesis de protemas in vitro. Todos los elementos expuestos ya anteriormente pueden combinarse tambien para dar nuevos procedimientos para preparar protemas de acuerdo con la invencion. Es concebible a este respecto para cada protema de acuerdo con la invencion una pluralidad de posibilidades de combinacion de etapas de procedimiento, de modo que deben determinarse experimentalmente procedimientos optimos para cada caso individual concreto.

Ademas se prefieren aquellos procedimientos de este tipo en los que la secuencia de nucleotidos en un codon, preferentemente varios codones y de manera especialmente preferente todos los codones se ha adaptado al uso de codon de la cepa huesped, ya que la transferencia de uno de los genes mencionados en una especie menos afm puede usarse entonces de manera especialmente eficaz para la smtesis de la protema en cuestion, cuando esta esta optimizada de manera correspondiente con respecto al uso de los codones.

Otro objeto propio de la invencion lo representan agentes que contienen una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion descrita anteriormente.

Con esto se considera cualquier agente en el que se aplica la a-amilasa en cuestion en cualquier forma, es decir se lleva a contacto hidrolftico deseado con su sustrato almidon o polisacarido similar a almidon o se prepara para ello. El contacto deseado tiene lugar por regla general en un medio acuoso, que esta tamponado de manera conveniente en un valor de pH correspondiente y opcionalmente contiene otros factores favorecedores. A esto pertenecen por ejemplo otras enzimas, que transforman posteriormente los inmediatos productos de reaccion, por ejemplo en cuanto a la fluidificacion del almidon para la produccion de alimentos o piensos o para una produccion de etanol. Ademas a esto pertenecen compuestos de bajo peso molecular que se incluyen por ejemplo en oligosacaridos producidos tales como ciclodextrinas, o compuestos de bajo peso molecular que solubilizan posteriormente los productos de disociacion o presentan una accion que favorece a todo el procedimiento, tales como por ejemplo tensioactivos en el contexto de una formula de agente de lavado. Puede tratarse tambien de agentes en los que debe inducirse la actividad amilolttica deseada solo con un gran retraso temporal, tal como por ejemplo en procedimientos de adhesion temporales, segun los cuales la variante de a-amilasa se anade al adhesivo en cuestion ya antes de tiempo, sin embargo se activa realmente solo tras largo tiempo mediante aumento del contenido en agua. Esto se aplica por ejemplo tambien a agentes de lavado y de limpieza que deben activarse solo tras una fase del almacenamiento en el momento de la dilucion en el bano de lavado frente al sustrato.

Una forma de realizacion de este objeto de la invencion son agentes de este tipo, en los que se trata de un agente de lavado o de limpieza.

Las propiedades de acuerdo con la invencion y los ingredientes importantes para agentes de lavado y de limpieza de este tipo se describen en detalle a continuacion. En este punto tiene lugar en primer lugar un resumen de las formas de realizacion mas importantes y por tanto especialmente preferentes de acuerdo con la invencion de agentes de lavado y de limpieza de este tipo:

- un agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion que contiene del 0,000001 por ciento en peso al 5 % en peso, en particular del 0,00001 % al 3 % en peso de la variante de a-amilasa;

- un agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion que contiene adicionalmente otras enzimas, en particular enzimas hidrolfticas u oxidorreductasas, de manera especialmente preferente otras amilasas,

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proteasas, lipasas, cutinasas, hemicelulasas, celulasas, p-glucanasas, oxidasas, peroxidasas, perhidrolasas y/o lacasas;

- un agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion, en el que la variante de a-amilasa mediante uno de los otros constituyentes del agente se estabiliza y/o se aumenta en su contribucion al poder de lavado o de limpieza del agente;

- un agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion que en conjunto es solido, preferentemente despues de una etapa de compactacion para al menos uno de los componentes contenidos, de manera especialmente preferente, que en conjunto esta compactado;

- un agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion que en conjunto es lfquido, en forma de gel o pastoso, preferentemente con encapsulacion para al menos uno de los componentes contenidos, de manera especialmente preferente con encapsulacion de al menos una de las enzimas contenidas, de manera muy especialmente preferente con encapsulacion de la variante de a-amilasa.

Otro campo de uso importantes para amilasas es aquel como componentes activos en agentes de lavado o de limpieza para la limpieza de materiales textiles o de superficies solidas, tal como por ejemplo la vajilla, suelos o aparatos de trabajo. En estas aplicaciones sirve la actividad amilolttica para disolver hidrolfticamente impurezas que contienen hidratos de carbono y en particular aquellas a base de almidon o desprenderlas de la base. A este respecto pueden aplicarse solos, en medios adecuados o tambien en agentes de lavado o de limpieza. Las condiciones que han de seleccionarse para ello, tales como por ejemplo temperatura, valor de pH, fuerza ionica, proporciones redox o influencias mecanicas, debfan optimizarse para el respectivo problema de limpieza, o sea en relacion al ensuciamiento y al material de soporte. Asf, las temperaturas habituales para los agentes de lavado y de limpieza se encuentran en intervalos de 10 °C en agentes a mano por encima de 40 °C y 60 °C hasta 95 °C en caso de agentes a maquina o en aplicaciones tecnicas. Dado que en las lavadoras y los lavavajillas modernos puede ajustarse la temperatura en la mayona de los casos sin etapas, estan incluidas tambien todas las etapas intermedias de la temperatura. Preferentemente se ajustan uno a otro los ingredientes de los agentes en cuestion. Las demas condiciones pueden disenarse a traves de las demas partes constituyentes, expuestas a continuacion, de los agentes asf mismo de manera muy espedfica con respecto al fin de limpieza en cuestion.

Los agentes de lavado y de limpieza de acuerdo con la invencion preferentes se caracterizan porque en cualquiera de las condiciones que pueden definirse de esta manera se mejora el poder de lavado o de limpieza de este agente mediante adicion de una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion en comparacion con la formula sin esta variante. Se prefieren sinergias con respecto al poder de limpieza.

Una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion puede usarse tanto en agentes para grandes consumidores o usuarios tecnicos como tambien en productos para el consumo privado, representando todas las formas de dosificacion convenientes y/o establecidas en el estado de la tecnica tambien formas de realizacion de la presente invencion. Con los agentes de lavado o de limpieza de acuerdo con la invencion se consideran por consiguiente todos los tipos de agentes de limpieza concebibles, tanto concentrados, como tambien agentes que van a usarse de manera no diluida; para su uso a escala comercial, en la lavadora o en el lavado o la limpieza a mano. A esto pertenecen por ejemplo agentes de lavado para materiales textiles, alfombras o fibras naturales, para los que se usa segun la presente invencion la denominacion agente de lavado. A esto pertenecen por ejemplo tambien agentes lavavajillas para maquinas lavavajillas o agentes lavavajillas a mano o agentes de limpieza para superficies duras tales como metal, vidrio, porcelana, ceramica, azulejos, piedra, superficies lacadas, plasticos, madera o cuero; para estos se usa segun la presente invencion la denominacion agente de limpieza. Cualquier tipo de agentes de lavado o de limpieza representa una forma de realizacion de la presente invencion, siempre que esta este enriquecida de una amilasa de acuerdo con la invencion.

Las formas de realizacion de la presente invencion comprenden todas las formas de dosificacion establecidas en el estado de la tecnica y/o todas las formas de dosificacion convenientes de los agentes de acuerdo con la invencion. A esto pertenecen por ejemplo agentes solidos, en forma de polvo, lfquidos, en forma de gel o pastosos, opcionalmente tambien de varias fases, comprimidos o no comprimidos; ademas a esto pertenecen por ejemplo: materiales extruidos, productos granulados, comprimidos o bolsitas, envasados tanto en sacos grandes como tambien en porciones.

Las a-amilasas se combinan en agentes de acuerdo con la invencion por ejemplo con ingredientes individuales o varios de los ingredientes siguientes: tensioactivos no ionicos, anionicos y/o cationicos, agentes de blanqueo, activadores de blanqueo, catalizadores de blanqueo, sustancias soporte y/o co-sustancias soporte, disolventes, espesantes, agentes secuestrantes, electrolitos, blanqueadores opticos, inhibidores del agrisado, inhibidores de la corrosion, en particular agentes protectores de plata, principios activos de liberacion de suciedad, inhibidores de la transferencia de color, inhibidores de formacion de espuma, sustancias abrasivas, colorantes, sustancias aromaticas, principios activos antimicrobianos, agente protectores UV, enzimas tales como por ejemplo proteasas, (opcionalmente otras) amilasas, lipasas, celulasas, hemicelulasas u oxidasas, estabilizadores, en particular estabilizadores de enzima, y otros componentes que se conocen por el estado de la tecnica.

Como tensioactivos no ionicos se usan preferentemente alcoholes alcoxilados, ventajosamente etoxilados, en particular primarios con preferentemente de 8 a 18 atomos de C y en promedio de 1 a 12 mol de oxido de etileno (OE) por mol de alcohol, en los que el resto alcohol puede ser lineal o preferentemente ramificado con metilo en la

posicion 2 o puede contener restos lineales y ramificados con metilo en mezcla, tal como se encuentran habitualmente en restos oxoalcohol. En particular se prefieren, sin embargo, etoxilatos de alcohol con restos lineales de alcoholes de origen natural con 12 a 18 atomos de C, por ejemplo de alcohol de coco, alcohol de palma, alcohol graso de sebo o alcohol o^lico, y en promedio de 2 a 8 OE por mol de alcohol. A los alcoholes etoxilados 5 preferentes pertenecen por ejemplo alcoholes C12-14 con 3 OE o 4 OE, alcohol Cg-11 con 7 OE, alcoholes C13-15 con 3 OE, 5 OE, 7 OE u 8 OE, alcoholes C12-18 con 3 OE, 5 OE o 7 OE y mezclas de estos, tales como mezclas de alcohol C12-14 con 3 OE y alcohol C12-18 con 5 OE. Los grados de etoxilacion indicados representan valores promedio estadfsticos que para un producto especial puede ser un numero entero o un numero quebrado. Los etoxilatos de alcohol preferentes presentan una distribucion de homologos reducida (narrow range ethoxylates, NRE). De manera 10 adicional a estos tensioactivos no ionicos pueden usarse tambien alcoholes grasos con mas de 12 OE. Los ejemplos de ello son alcohol graso de sebo con 14 OE, 25 OE, 30 OE o 40 OE.

Otra clase de tensioactivos no ionicos usados preferentemente que se usan o bien como unico tensioactivo no ionico o en combinacion con otros tensioactivos no ionicos son esteres alquilicos de acidos grasos alcoxilados, preferentemente etoxilados o etoxilados y propoxilados, preferentemente con 1 a 4 atomos de carbono en la cadena 15 de alquilo, en particular esteres metilicos de acidos grasos.

De la solicitud DE 102004020430.6 no publicada previamente se deducen agentes de limpieza, en particular agentes lavavajillas a maquina, que contienen (a) uno o varios tensioactivos no ionicos con la siguiente formula general:

R1-0-(CH2-CH2-0MCH2-CH-0V(CH2-CH2-0)y-(CH2-CH-0)*-H,

J*2 R3

en la que R1 representa un resto alquilo C6-24 o alquenilo, los grupos R2 y R3 en cada caso representan 20 determinados restos de hidrocarburo y los indices w, x, y, z en cada caso representan numeros enteros hasta 6, o un sistema tensioactivo de al menos un tensioactivo no ionico F de formula general:

R1-CH(OH)CH2O-(AO)w-(A'O)x-(A”O)y-(A”'O)z-R2

y al menos un tensioactivo no ionico G de formula general:

A1-O-(AO)w-(A'O)xA”O)y-(A”'O)z-R2

25 en las que R1 representa un resto alquilo C6-24 o alquenilo, R2 representa un resto hidrocarburo con 2 a 26 atomos de carbono, A, A', A” y A”' en cada caso representan determinados restos de hidrocarburo y w, x, y y z en cada caso representan valores hasta 25, presentando este sistema tensioactivo los tensioactivos F y G en una proporcion en peso entre 1:4 y 100:1 y como componente (b) una variante de a-amilasa especial.

Estos tensioactivos pueden combinarse en particular en agentes lavavajillas a maquina tambien con a-amilasas, que 30 corresponden a la presente invencion, en particular cuando estas presentan ademas de las sustituciones de acuerdo con la invencion aquellas que pueden deducirse de una o varias de las solicitudes WO 96/23873 A1, WO 00/60060 A2 y WO 01/66712 A2. Esto se aplica en particular para el caso de que el producto comercial que se encuentra en estas solicitudes Stainzyme ® de la empresa Novozymes se mejore en otras posiciones y se dote adicionalmente de al menos una sustitucion de acuerdo con la invencion. Por lo tanto en principio debe partirse de una accion aditiva 35 de las distintas modificaciones.

Otra clase de tensioactivos no ionicos que pueden usarse ventajosamente son los alquilpoliglicosidos (APG). Los alquilpoliglicosidos que pueden usarse cumplen la formula general RO(G)z, en la que R significa un resto alifatico de cadena lineal o ramificado, en particular ramificado con metilo en la posicion 2, saturado o insaturado con 8 a 22, preferentemente de 12 a 18 atomos de C y G es el sfmbolo que representa una unidad de glicosido con 5 o 6 40 atomos de C, preferentemente representa glucosa. El grado de glicosilacion z se encuentra a este respecto entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,0 y 2,0 y en particular entre 1,1 y 1,4. Preferentemente se usan alquilpoliglucosidos lineales, o sea alquilpoliglicosidos en los que el resto poliglicosido es un resto de glucosa y el resto alquilo es un resto n-alquilo.

Tambien pueden ser adecuados tensioactivos no ionicos del tipo de los oxidos de amina, por ejemplo oxido de N- 45 coco-alquil-N,N-dimetilamina y oxido de N-sebo-alquil-N,N-dihidroxietilamina, y de las alcanolamidas de acidos grasos. La proporcion de estos tensioactivos no ionicos se encuentra preferentemente en no mas de la de los alcoholes grasos etoxilados, en particular en no mas de la mitad de la misma.

Otros tensioactivos adecuados son amidas de acidos polihidroxigrasos de formula (II),

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R1

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R-CO-N-tZ] (II)

en la que RCO representa un resto acilo alifatico con 6 a 22 atomos de carbono, R1 representa hidrogeno, un resto alquilo o hidroxialquilo con 1 a 4 atomos de carbono y [Z] representa un resto polihidroxialquilo lineal o ramificado con 3 a 10 atomos de carbono y de 3 a 10 grupos hidroxilo. En el caso de las amidas de acidos polihidroxigrasos se trata de sustancias conocidas que pueden obtenerse habitualmente mediante aminacion reductora de un azucar reductor con amomaco, una alquilamina o una alcanolamina y posterior acilacion con un acido graso, un ester alqmlico de acido graso o un cloruro de acido graso.

Al grupo de las amidas de acidos polihidroxigrasos pertenecen tambien compuestos de formula (III),

R1-0-R2

I

R-CO-N-[Z] (Itl)

en la que R representa un resto alquilo o alquenilo lineal o ramificado con 7 a 12 atomos de carbono, R1 representa un resto alquilo lineal, ramificado o ciclico o un resto arilo con 2 a 8 atomos de carbono y R2 representa un resto alquilo lineal, ramificado o ciclico o un resto arilo o un resto oxi-alquilo con 1 a 8 atomos de carbono, prefiriendose restos alquilo C1-4 o restos fenilo y [Z] representa un resto polihidroxialquilo lineal, cuya cadena de alquilo esta sustituida con al menos dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferentemente etoxilados o propoxilados de estos restos.

[Z] se obtiene preferentemente mediante aminacion reductora de un azucar reductor, por ejemplo glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, galactosa, manosa o xilosa. Los compuestos sustituidos con N-alcoxilo o N-ariloxilo pueden convertirse en las deseadas amidas de acidos polihidroxigrasos, por ejemplo, mediante reaccion con esteres metilicos de acidos grasos en presencia de un alcoxido como catalizador.

Como tensioactivos anionicos se usan por ejemplo aquellos del tipo de los sulfonatos y sulfatos. Como tensioactivos del tipo sulfonato se tienen en consideracion a este respecto preferentemente alquil(Cg-13)bencenosulfonatos, sulfonatos de olefina, es decir mezclas de alquenosulfonatos e hidroxialcanosulfonatos asf como disulfonatos, tal como se obtienen por ejemplo a partir de monoolefinas C12-18 con doble enlace terminal o interno mediante sulfonacion con trioxido de azufre gaseoso y posterior hidrolisis alcalina o acida de los productos de sulfonacion. Son adecuados tambien los alcanosulfonatos que se obtienen a partir de alcanos C12-18 por ejemplo mediante sulfocloracion o sulfoxidacion con posterior hidrolisis o neutralizacion. Igualmente son adecuados tambien los esteres de acidos a-sulfograsos (estersulfonatos), por ejemplo los esteres metflicos a-sulfonados de los acidos grasos de coco, de semilla de palma o de sebo hidrogenados.

Otros tensioactivos anionicos adecuados son esteres de glicerina de acidos grasos sulfatados. Por esteres de glicerina de acidos grasos ha de entenderse los monoesteres, diesteres y triesteres asf como sus mezclas, tal como se obtienen en la preparacion mediante esterificacion de una monoglicerina con 1 a 3 mol de acido graso o en la transesterificacion de trigliceridos con 0,3 a 2 mol de glicerina. Los esteres de glicerina de acidos grasos sulfatados preferentes son a este respecto los productos de sulfatacion de acidos grasos saturados con 6 a 22 atomos de carbono, por ejemplo del acido capronico, acido capnlico, acido caprico, acido minstico, acido laurico, acido palmftico, acido estearico o acido behenico.

Como sulfatos de alqu(en)ilo se prefieren las sales alcalinas y en particular las sales de sodio de los semiesteres de acido sulfurico de los alcoholes grasos C12-C18, por ejemplo de alcohol graso de coco, alcohol graso de sebo, alcohol laurilico, miristilico, cetflico o estearilico o de los oxoalcoholes C10-C20 y aquellos semiesteres de alcoholes secundarios de estas longitudes de cadena. Ademas se prefieren sulfatos de alqu(en)ilo de la longitud de cadena mencionada que contienen un resto alquilo de cadena lineal sintetico, preparado en base petroqrnmica, que tienen un comportamiento de degradacion analogo a los compuestos adecuados a base de materias primas de la qmmica de grasas. Debido a intereses tecnicos de lavado se prefieren los sulfatos de alquilo C12-C16 y los sulfatos de alquilo C12-C15 asf como los sulfatos de alquilo C14-C15. Tambien son tensioactivos anionicos adecuados los 2,3- alquilsulfatos.

Tambien son adecuados los monoesteres de acido sulfurico de los alcoholes C7-21 de cadena lineal o ramificados etoxilados con 1 a 6 mol de oxido de etileno, tales como alcoholes Cg.11 ramificado con 2-metilo con en promedio 3,5 mol de oxido de etileno (OE) o alcoholes grasos C12-18 con 1 a 4 OE. Estos se usan en agentes de limpieza, debido a su alto comportamiento de formacion de espuma, solo en cantidades relativamente bajas, por ejemplo en cantidades de hasta el 5 % en peso, habitualmente del 1 % al 5 % en peso.

Otros tensioactivos anionicos adecuados son tambien las sales del acido alquilsulfosuccrnico que se designan tambien como sulfosuccinatos o como esteres de acido sulfosuccrnico y representan los monoesteres y/o diesteres

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del acido sulfosuccmico con alcoholes, preferentemente alcoholes grasos y en particular alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferentes contienen restos alcohol graso C8-18 o mezclas de estos. Los sulfosuccinatos en particular preferentes contienen un resto alcohol graso que se deriva de alcoholes grasos etoxilados, que representan tensioactivos no ionicos considerados a su vez (vease abajo la descripcion). A este respecto se prefieren especialmente a su vez sulfosuccinatos cuyos restos alcohol graso se deriven de alcoholes grasos etoxilados con distribucion de homologos reducida. Igualmente es tambien posible usar acido alqu(en)ilsuccmico con preferentemente 8 a 18 atomos de carbono en la cadena alqu(en)ilo o sus sales.

Como otros tensioactivos anionicos se tienen en consideracion en particular jabones. Son adecuados jabones de acidos grasos saturados, tales como las sales del acido laurico, acido minstico, acido palmttico, acido estearico, acido erucico hidrogenado y acido behenico as^ como en particular mezclas de jabones derivadas de acidos grasos naturales, por ejemplo acidos grasos de coco, de semilla de palma o de sebo.

Los tensioactivos anionicos incluyendo los jabones pueden encontrarse en forma de sus sales de sodio, de potasio o de amonio y como sales solubles de bases organicas, tales como mono-, di- o trietanolamina. Preferentemente, los tensioactivos anionicos se encuentran en forma de sus sales de sodio o de potasio, en particular en forma de las sales de sodio.

Los tensioactivos pueden estar contenidos en los agentes de limpieza o de lavado de acuerdo con la invencion en total en una cantidad de preferentemente el 5 % en peso al 50 % en peso, en particular del 8 % en peso al 30 % en peso, con respecto al agente acabado.

Los agentes de acuerdo con la invencion pueden contener agentes de blanqueo. Entre los compuestos que sirven como agentes de blanqueo, que proporcionan H2O2 en agua tienen especial importancia el percarbonato de sodio, el perborato de sodio tetrahidratado y el perborato de sodio monohidratado. Otros agentes de blanqueo utiles son por ejemplo peroxopirofosfatos, citratos perhidratados asf como sales peracidas que proporcionan H2O2 o peracidos, tales como persulfatos o acido persulfurico. Es util tambien el peroxohidrato de urea percarbamida, que puede describirse mediante la formula H2N-CO-NH2H2O2. En particular con el uso de los agentes para la limpieza de superficies duras, por ejemplo en lavavajillas a maquina, pueden contener estos en caso deseado tambien agentes de blanqueo del grupo de los agentes de blanqueo organicos, aunque su uso es posible en principio tambien en agentes para el lavado de materiales textiles. Los agentes de blanqueo organicos tfpicos son los peroxidos de diacilo, tales como por ejemplo peroxido de dibenzoflo. Otros agentes de blanqueo organicos tfpicos son los peroxiacidos, mencionandose como ejemplos especialmente los alquilperoxiacidos y los arilperoxiacidos. Representantes preferentes son el acido peroxibenzoico y sus derivados sustituidos en el anillo, tales como acidos alquilperoxibenzoico, sin embargo tambien pueden usarse acido peroxi-a-naftoico y monoperftalato de magnesio, los peroxiacidos alifaticos o alifaticos sustituidos, tales como acido peroxilaurico, acido peroxiestearico, acido g- ftalimidoperoxicapronico (acido ftalimidoperoxihexanoico, PAP), acido o-carboxibenzamidoperoxicapronico, acido N- nonenilamidoperadfpico y N-nonenilamidopersuccinatos, y acidos peroxidicarboxflicos alifaticos y aralifaticos, tales como acido 1,12-diperoxicarboxflico, acido 1,9-diperoxiazelaico, acido diperoxisebacico, acido diperoxibrasflico, los acidos diperoxiftalicos, acido 2-decildiperoxibutano-1,4-dioico, acido N,N-tereftaloildi(6-aminopercapronico).

El contenido de los agentes en agentes de blanqueo puede ascender a del 1 % al 40 % en peso y en particular del 10 % al 20 % en peso, usandose ventajosamente perborato monohidratado o percarbonato. Un uso sinergico de amilasa con percarbonato o de amilasa con acido percarboxflico se da a conocer con las solicitudes WO 99/63036, o WO 99/63037.

Para conseguir durante el lavado a temperaturas de 60 °C y por debajo, y en particular en el pretratamiento de la colada, una accion de blanqueo mejorada pueden contener los agentes tambien activadores de blanqueo. Como activadores de blanqueo pueden usarse compuestos que dan como resultado acidos peroxocarboxflicos alifaticos en condiciones de perhidrolisis con preferentemente 1 a 10 atomos de C, en particular de 2 a 4 atomos de C, y/o acido perbenzoico eventualmente sustituido. Son adecuadas sustancias que llevan grupos O-acilo y/o N-acilo del numero de atomos de C mencionado y/o grupos benzoflo eventualmente sustituidos. Se prefieren alquilendiaminas aciladas varias veces, en particular tetraacetiletilendiamina (TAED), derivados de triazina acilados, en particular 1,5-diacetil- 2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), glicolurilos acilados, en particular 1,3,4,6-tetraacetilglicolurilo (TAGU), N- acilimidas, en particular N-nonanoilsuccinimida (NOSI), fenolsulfonatos acilados, en particular n-nonanoil- o isononanoiloxibencenosulfonato (n- o iso-NOBS), acidos hidroxicarboxflicos acilados, tales como trietil-O-acetilcitrato (TEOC), anhudridos de acidos carboxflicos, en particular anhudrido de acido ftalico, anhudrido de acido isatoico y/o anhudrido de acido succmico, amidas de acidos carboxflicos, tales como N-metildiacetamida, glicolido, alcoholes polihidroxilados acilados, en particular triacetina, diacetato de etilenglicol, acetato de isopropenilo, 2,5-diacetoxi-2,5- dihidrofurano y los esteres enolicos conocidos por las solicitudes de patente alemanas DE 196 16 693 y DE 196 16 767 asf como sorbitol y manitol acetilado o sus mezclas descritas en la solicitud de patente europea EP 0 525 239 (SORMAN), derivados de azucar acilados, en particular pentaacetilglucosa (PAG), pentaacetilfructosa, tetraacetilxilosa y octaacetillactosa asf como glucamina o gluconolactona acetilada, opcionalmente N-alquilada, triazol o derivados de triazol y/o caprolactamas en forma de partfculas y/o derivados de caprolactama, preferentemente lactamas N-aciladas, por ejemplo N-benzoilcaprolactama y N-acetilcaprolactama. Se usan igualmente de manera preferente acilacetales y acillactamas sustituidos de manera hidrofila. Tambien pueden usarse combinaciones de activadores de blanqueo convencionales. Igualmente pueden usarse derivados de nitrilo

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tales como cianopiridinas, nitrilquats, por ejemplo N-alquilamonio-acetonitrilos, y/o derivados de cianamida. Los activadores de blanqueo preferentes son 4-(octanoiloxi)-bencenosulfonato de sodio, n-nonanoil- o isononanoiloxibencenosulfonato (n- o iso-NOBS), undecenoiloxibencenosulfonato (UDOBS), dodecanoiloxibencenosulfonato de sodio (DOBS), acido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o dodecanoiloxibencenosulfonato (OBS 12), as^ como N-metilmorfolinio-acetonitrilo (MMA). Los activadores de blanqueo de este tipo pueden estar contenidos en el intervalo de cantidades habitual del 0,01 % al 20 % en peso, preferentemente en cantidades del 0,1 % al 15 % en peso, en particular del 1 % en peso al 10 % en peso, con respecto a la composicion total.

De manera adicional a los activadores de blanqueo convencionales o en su lugar pueden estar contenidos tambien los denominados catalizadores de blanqueo. En el caso de estas sustancias se trata de sales de metales de transicion o complejos de metales de transicion que refuerzan el blanqueo tales como por ejemplo complejos de carbonilo o complejos de sales de Mn, Fe, Co, Ru o Mo. Tambien son adecuados como catalizadores de blanqueo complejos de Mn, Fe, Co, Ru, Mo, Ti, V y Cu con ligandos tipo tnpode que contienen N asf como complejos de amino de Co, Fe, Cu y Ru. De acuerdo con el documento WO 99/63038 pueden desarrollar una accion de activacion del blanqueo tambien derivados de acetonitrilo y compuestos de complejos de metales de transicion que activan el blanqueo de acuerdo con el documento WO 99/63041 en combinacion con amilasas.

Los agentes de acuerdo con la invencion contienen por regla general una o varias sustancias soporte, en particular zeolitas, silicatos, carbonatos, co-sustancias soporte organicas y (donde no se mencionen motivos ecologicos contra su uso) tambien los fosfatos. Estos ultimos son en particular ayudantes que van a usarse preferentemente en agentes de limpieza para el lavado de vajillas a maquina.

Pueden mencionarse en este caso silicatos de sodio estratificados cristalinos de formula general NaMSixO2x+ryH2O, en la que M significa sodio o hidrogeno, x es un numero de 1,6 a 4, preferentemente de 1,9 a 4,0 e y es un numero de 0 a 20 y valores preferentes para x son 2, 3 o 4. Los silicatos estratificados cristalinos preferentes de la formula indicada son aquellos en los que M representa sodio y x adopta los valores 2 o 3. En particular se prefieren tanto p- disilicatos de sodio como S-disilicatos de sodio Na2Si2Os yH2O. En el comercio se encuentran compuestos de este tipo por ejemplo con la denominacion SKS® (empresa Clariant). Asf se trata en el caso de SKS-6® predominantemente de un S-disilicato de sodio con la formula Na2Si2Os yH2O, en el caso de SKS-7® se trata predominantemente del p-disilicato de sodio. Mediante la reaccion con acidos (por ejemplo acido cftrico o acido carbonico) se produce a partir del S-disilicato de sodio kanemita NaHSi2Os yH2O, en el comercio con las denominaciones SKS-9® o SKS-10® (empresa Clariant). Puede ser ventajoso tambien usar modificaciones qrnmicas de estos silicatos estratificados. Asf puede verse influida de manera adecuada, por ejemplo, la alcalinidad de los silicatos estratificados. Los silicatos estratificados impurificados con fosfato o con carbonato presentan en comparacion con el S-disilicato de sodio morfologfas cristalinas modificadas, se disuelven mas rapidamente y muestran en comparacion con el S-disilicato de sodio una elevada capacidad de union a calcio. Pueden mencionarse especialmente los silicatos estratificados de formula total general x Na2O • y SiO2 • P2O5, en la que la proporcion de x con respecto a y corresponde a un numero de 0,35 a 0,6, la proporcion de x con respecto a z corresponde a un numero de 1,75 a 1200 y la proporcion de y con respecto a z corresponde a un numero de 4 a 2800. La solubilidad de los silicatos estratificados puede aumentarse tambien, usandose especialmente silicatos estratificados finamente divididos. Tambien pueden usarse compuestos de los silicatos estratificados cristalinos con otras sustancias constituyentes. A este respecto pueden mencionarse en particular compuestos con derivados de celulosa que presentan ventajas en la accion de disgregacion y se usan en particular en comprimidos de agentes de lavado, asf como compuestos con policarboxilatos, por ejemplo acido cftrico, o policarboxilatos polimericos, por ejemplo copoftmeros del acido acnlico.

Pueden usarse tambien silicatos de sodio amorfos con un modulo Na2O : SiO2 de 1:2 a 1:3,3, preferentemente de 1:2 a 1:2,8 y en particular de 1:2 a 1:2,6, que son de disolucion retardada y que presentan propiedades de lavado secundarias. El retardo de la disolucion con respecto a los silicatos de sodio amorfos convencionales puede haberse provocado a este respecto de distintas maneras, por ejemplo mediante tratamiento de superficie, combinacion, compactacion / consolidacion o mediante secado excesivo. En el contexto de la presente invencion se entiende por el termino "amorfo" tambien "amorfo a los rayos X". Es decir que los silicatos en experimentos de difraccion de rayos X no proporcionan reflejos de rayos X intensos, tal como son tfpicos de las sustancias cristalinas, sino, en todo caso, uno o varios maximos de la radiacion de rayos X dispersada, que presentan una amplitud de varias unidades de grados del angulo de difraccion. Sin embargo, puede llevar incluso perfectamente a propiedades de soporte especialmente adecuadas cuando las partfculas de silicato, en experimentos de difraccion de electrones, proporcionan maximos de difraccion difuminados o incluso intensos. Esto ha de interpretarse de modo que los productos presenten zonas microcristalinas del tamano de 10 a algunos cientos de nm, prefiriendose valores de hasta como maximo 50 nm y en particular de hasta como maximo 20 nm. En particular se prefieren silicatos amorfos consolidados/compactados, silicatos amorfos combinados y silicatos amorfos a los rayos X secados excesivamente.

Una zeolita finamente cristalina, sintetica y que contiene agua unida que dado el caso se puede usar es preferentemente zeolita A y/o P. Como zeolita P se prefiere especialmente zeolita MAP® (producto comercial de la empresa Crosfield). Sin embargo, son adecuadas tambien zeolita X asf como mezclas de A, X y/o P. Esta disponible en el mercado y en el contexto de la presente invencion preferentemente puede usarse por ejemplo tambien un

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producto co-cristalizado de zeolita X y zeolita A (aproximadamente el 80 % en peso de zeolita X), que se comercializa por la empresa CONDEA Augusta S.p.A. con el nombre comercial VEGOBOND AX® y que puede describirse mediante la formula

nNa2O ■ (1-n)K2O ■ AhOs (2 - 2,5)SiO2 (3,5 - 5,5) H2O.

Las zeolitas adecuadas presentan un tamano de partfcula medio inferior a 10 ^m (distribucion de volumen; procedimiento de medicion: contador Coulter) y contienen preferentemente del 18 al 22 % en peso, en particular del 20 al 22 % en peso de agua unida.

Naturalmente es tambien posible un uso de los fosfatos conocidos en general como sustancias de soporte, siempre que un uso de este tipo no tenga que evitarse por motivos ecologicos. Entre los multiples fosfatos que estan disponibles en el mercado, los fosfatos de metal alcalino tienen, con especial preferencia de trifosfato de pentasodio o e pentapotasio (tripolifosfato de sodio o de potasio), la mayor importancia en la industria de los agentes de lavado y de limpieza.

Fosfatos de metal alcalino es a este respecto la denominacion resumida para sales de metal alcalino (en particular de sodio y de potasio) de los distintos acidos fosforicos, en las que puede diferenciarse acidos metafosforicos (HPOa)n y acido ortofosforico H3PO4 junto a representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos aunan a este respecto varias ventajas en sf: actuan como vehfculos de alcalinos, impiden depositos de cal sobre piezas de maquinas o incrustaciones de cal en tejidos y contribuyen ademas al poder de limpieza.

El dihidrogenofosfato de sodio, NaH2PO4, existe como dihidrato (densidad 1,91 gcm'3, punto de fusion 60°) y como monohidrato (densidad 2,04 gcm-3). Ambas sales son polvos blancos muy facilmente solubles en agua que pierden con el calentamiento el agua de constitucion y que a 200 °C se convierten en el difosfato debilmente acido (hidrogenodifosfato disodico, Na2H2P2O7), a mayor temperatura en trimetafosfato sodico (NaaPaOg) y sal de Maddrell (vease mas adelante). El NaH2PO4 reacciona de forma acida; se produce cuando se ajusta acido fosforico con hidroxido sodico a un valor de pH de 4,5 y se pulveriza el caldo. El dihidrogenofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobasico, bifosfato de potasio, KDP), KH2PO4, es una sal blanca con la densidad 2,33 gcm-3, tiene un punto de fusion a 253° [descomposicion con formacion de polifosfato de potasio (KPO3)x] y es facilmente soluble en agua.

El hidrogenofosfato disodico (fosfato sodico secundario), Na2HPO4, es una sal cristalina incolora muy facilmente soluble en agua. Existe de forma anhidro y con 2 mol (densidad 2,066 gcm-3, perdida de agua a 95°), 7 mol (densidad 1,68 gcm-3, punto de fusion 48° con perdida de 5 H2O) y 12 mol de agua (densidad 1,52 gcm-3, punto de fusion 35° con perdida de 5 H2O), se hace anhidro a 100° y con un mayor calentamiento se convierte en el difosfato Na4P2O7. El hidrogenofosfato disodico se prepara mediante neutralizacion de acido fosforico con solucion de carbonato sodico mediante el uso de fenolftalema como indicador. El hidrogenofosfato dipotasico (fosfato de potasio secundario o dibasico), K2HPO4, es una sal blanca amorfa que es muy facilmente soluble en agua.

El fosfato trisodico, fosfato sodico terciario, Na3PO4, son cristales incoloros que presentan como dodecahidrato una densidad de 1,62 gcm-3 y un punto de fusion de 73-76 °C (descomposicion), como decahidrato (correspondiente al 19-20% de P2O5) un punto de fusion de 100 °C y en forma anhidro (correspondiente al 39-40 % de P2O5), una densidad de 2,536 gcm-3. El fosfato trisodico es facilmente soluble en agua con reaccion alcalina y se prepara mediante evaporacion de una solucion a partir de exactamente 1 mol de fosfato disodico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotasico (fosfato de potasio terciario o tribasico), K3PO4, es un polvo granular fluido blanco con la densidad 2,56 gcm-3, tiene un punto de fusion de 1340° y es facilmente soluble en agua con reaccion alcalina. Se produce, por ejemplo, con el calentamiento de escoria de Thomas con carbon y sulfato de potasio. A pesar del mayor precio, en la industria de los agentes de limpieza se prefiere a menudo los fosfatos de potasio mas facilmente solubles, por tanto, de alta eficacia, frente a los compuestos de sodio correspondientes.

El difosfato tetrasodico (pirofosfato sodico), Na4P2O7, existe en forma anhidro (densidad 2,534 gcm'3, punto de fusion 988°, tambien indicado 880°) y como decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm-3, punto de fusion 94° con perdida de agua). Ambas sustancias son cristales incoloros solubles en agua con reaccion alcalina. El Na4P2O7 se produce con el calentamiento de fosfato disodico a >200 °C o al hacer reaccionar acido fosforico con carbonato sodico en relacion estequiometrica y deshidratando la solucion mediante pulverizacion. El decahidrato forma complejos con sales de metales pesados y formadores de dureza y, por tanto, reduce la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K4P2O7, existe en forma del trihidrato y representa un polvo higroscopico incoloro con la densidad 2,33 gcm-3, que es soluble en agua, ascendiendo el valor del pH de la solucion al 1 % a 25° a 10,4.

Mediante condensacion del NaH2PO4 o del KH2PO4 se generan fosfatos de sodio y de potasio de mayor peso molecular, en los que pueden diferenciarse representantes dclicos, los metafosfatos de sodio o de potasio y tipos en forma de cadena, los polifosfatos de sodio o potasio. En particular para estos ultimos se usan multiples denominaciones: fosfatos fundidos o calcinados, sal de Graham, sal de Kurrol y sal de Maddrell. Todos los fosfatos de sodio y de potasio superiores se denominan en conjunto fosfatos condensados.

El trifosfato de pentasodio tecnicamente importante, Na5P3O-i0 (tripolifosfato de sodio), es una sal anhidro o que cristaliza con 6 H2O, no higroscopica, blanca, soluble en agua de formula general NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na con n=3.

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En 100 g de agua se disuelven a temperatura ambiente aproximadamente 17 g, a 60° aproximadamente 20 g, a 100° alrededor de 32 g de sal sin agua de constitucion; despues de calentamiento durante dos horas de la solucion a 100° se produce mediante hidrolisis aproximadamente el 8 % de ortofosfato y el 15 % de difosfato. En la preparacion de trifosfato pentasodico se hace reaccionar acido fosforico con solucion de carbonato sodico o hidroxido sodico en relacion estequiometrica y se deshidrata la solucion mediante pulverizacion. De forma similar a la sal de Graham y difosfato sodico, el trifosfato pentasodico disuelve muchos compuestos de metal insolubles (tambien jabones de cal, etc.). El trifosfato de pentapotasio, K5P3O10 (tripolifosfato de potasio), se encuentra por ejemplo en forma de una solucion al 50 % en peso (> 23% de P2O5, 25% de K2O) en el mercado. Los polifosfatos de potasio se usan ampliamente en la industria de los agentes de lavado y de limpieza. Existen ademas tambien tripolifosfatos de sodio y potasio que pueden usarse asimismo en el contexto de la presente invencion. Estos se generan por ejemplo cuando se hidroliza trimetafosfato de sodio con KOH:

(NaPO3)3 + 2 KOH ^ Naa^O™ + H2O

Estos pueden usarse de acuerdo con la invencion al igual que tripolifosfato de sodio, tripolifosfato de potasio o mezclas de ambos; tambien pueden usarse de acuerdo con la invencion mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio-potasio o mezclas de tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio-potasio o mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio-potasio.

Como cosoportes organicos se pueden usar en los agentes de lavado y limpieza de acuerdo con la invencion en particular policarboxilatos o acidos policarboxflicos, policarboxilatos polimericos, acido poliaspartico, poliacetales, dextrinas dado el caso oxidadas, otros cosoportes organicos (vease a continuacion) asf como fosfonatos. Estas clases de sustancias se describen a continuacion.

Sustancias ayudantes organicas que pueden usarse son, por ejemplo, los acidos policarboxflicos que pueden usarse en forma de sus sales de sodio, entendiendose por acidos policarboxflicos aquellos acidos carboxflicos que portan mas de una funcion acido. Por ejemplo, estos son acido cttrico, acido adfpico, acido succmico, acido glutarico, acido malico, acido tartarico, acido maleico, acido fumarico, acidos de azucar, acidos aminocarboxflicos, acido nitrilotriacetico (NTA), siempre que no deba evitarse un uso de este tipo por motivos ecologicos, asf como mezclas de los mismos. Sales preferidas son las sales de los acidos policarboxflicos tales como acido cttrico, acido adfpico, acido succmico, acido glutarico, acido tartarico, acidos de azucar y mezclas de los mismos.

Tambien pueden usarse los acidos en sf. Tienen, ademas de su efecto de soporte, tfpicamente tambien la propiedad de un componente de acidificacion y sirven, por lo tanto, tambien para el ajuste de un valor de pH menor y mas suave de agentes de lavado o de limpieza, siempre que no se desee el valor de pH que resulta debido a la mezcla de los restantes componentes. En particular han de mencionarse en este sentido acidos compatibles con el sistema y el medio ambiente, tales como acido cftrico, acido acetico, acido tartarico, acido malico, acido lactico, acido glicolico, acido succmico, acido glutarico, acido adfpico, acido gluconico y mezclas discrecionales de los mismos. Pero tambien acidos minerales, en particular acido sulfurico o bases, en particular hidroxidos de amonio o de metal alcalino pueden servir de reguladores del pH. Tales reguladores estan contenidos en los agentes de acuerdo con la invencion en cantidades de, preferentemente, no mas del 20 % en peso, en particular del 1,2 % en peso al 17 % en peso.

Como soportes son adecuados ademas policarboxilatos polimericos, estos son, por ejemplo, las sales de metal alcalino del poli(acido acnlico) o del poli(acido metacnlico), por ejemplo aquellos con un peso molecular relativo de 500 a 70 000 g/mol.

En el caso de los pesos moleculares indicados para policarboxilatos polimericos se trata, en el sentido del presente documento, de pesos moleculares promedio en peso Mw de la respectiva forma de acido, que se determinaron fundamentalmente por medio de cromatograffa de permeacion en gel (CPG), utilizandose un detector de UV. La medicion tuvo lugar a este respecto frente a un patron de poli(acido acnlico) externo, que debido a su semejanza estructural con los polfmeros sometidos a ensayo proporciona valores de peso molecular realistas. Estos datos se desvfan claramente de los datos del peso molecular en los que se usan poli(acidos estirenosulfonicos) como patron. Los pesos moleculares medidos frente a poli(acidos estirenosulfonicos) son, por norma general, claramente mayores que los pesos moleculares indicados en el presente documento.

Polfmeros adecuados son en particular poliacrilatos que presentan preferentemente un peso molecular de 2 000 a 20 000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, de este grupo pueden preferirse a su vez los poliacrilatos de cadena corta que presentan pesos moleculares de 2 000 a 10 000 g/mol y de manera especialmente preferente de 3 000 a 5 000 g/mol.

Son ademas adecuados policarboxilatos copolimericos, en particular aquellos del acido acnlico con acido metacnlico y del acido acnlico o acido metacnlico con acido maleico. Han resultado ser especialmente adecuados copolfmeros del acido acnlico con acido maleico que contienen del 50 al 90 % en peso de acido acnlico y del 50 al 10 % en peso de acido maleico. Su peso molecular relativo, con respecto a acidos libres, asciende en general a de 2 000 a 70 000 g/mol, preferentemente de 20 000 a 50 000 g/mol y en particular de 30 000 a 40 000 g/mol. Los policarboxilatos (co)polimericos pueden usarse o bien como polvo o bien como solucion acuosa. El contenido de los agentes en

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policarboxilatos (co)polimericos puede ascender a del 0,5 al 20 % en peso, en particular del 1 al 10 % en peso.

Para mejorar la solubilidad en agua, los polfmeros pueden contener tambien acidos alilsulfonicos, tales como por ejemplo acido aliloxibencenosulfonico y acido metalilsulfonico como monomero.

En particular se prefieren tambien polfmeros biologicamente degradables de mas de dos unidades monomericas distintas, por ejemplo aquellos que como monomeros contienen sales del acido acnlico y del acido maleico asf como alcohol vimlico o derivados de alcohol vimlico o que como monomeros contienen sales del acido acnlico y del acido 2-alquilalilsulfonico asf como derivados de azucar.

CopoKmeros preferidos adicionales son aquellos que como monomeros presentan preferentemente acrolema y acido acnlico/sales de acido acnlico o acrolema y acetato de vinilo.

Asimismo han de mencionarse como sustancias de soporte preferidas adicionales acidos aminodicarboxflicos polimericos, sus sales o sus sustancias precursoras. Se prefieren especialmente poli(acidos asparticos) o sus sales.

Otras sustancias de soporte adecuadas son poliacetales que pueden obtenerse mediante reaccion de dialdehndos con acidos poliolcarboxflicos, que presentan de 5 a 7 atomos de C y al menos 3 grupos hidroxilo. Poliacetales preferidos se obtienen a partir de dialdetndos tales como glioxal, glutaraldehndo, tereftalaldehndo asf como mezclas de los mismos y a partir de acidos poliolcarboxflicos tales como acido gluconico y/o acido glucoheptonico.

Otras sustancias de soporte organicas adecuadas son dextrinas, por ejemplo oligomeros o polfmeros de hidratos de carbono, que pueden obtenerse mediante hidrolisis parcial de almidones. La hidrolisis puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos habituales, por ejemplo catalizados con acido o con enzimas. Preferentemente se trata de productos de hidrolisis con pesos moleculares medios en el intervalo de 400 a 500 000 g/mol. A este respecto se prefiere un polisacarido con un equivalente de dextrosa (DE) en el intervalo de 0,5 a 40, en particular de 2 a 30, siendo DE una medida habitual del efecto reductor de un polisacarido en comparacion con dextrosa, que tiene un DE de 100. Son utiles tanto maltodextrina con un DE entre 3 y 20 como jarabe de glucosa anhidro con un DE entre 20 y 37 como tambien las denominadas dextrinas amarillas y dextrinas blancas con mayores pesos moleculares en el intervalo de 2 000 a 30 000 g/mol.

En el caso de los derivados oxidados de dextrinas de este tipo se trata de sus productos de reaccion con agentes de oxidacion, que pueden oxidar al menos una funcion alcohol del anillo de sacarido para dar la funcion acido carboxflico. Los soportes organicos particularmente preferentes para agentes de acuerdo con la invencion son almidones oxidados o sus derivados conocidos.

Tambien son cosoportes adecuados adicionales oxidisuccinatos y otros derivados de disuccinatos, preferentemente disuccinato de etilendiamina. A este respecto se usa N,N'-disuccinato de etilendiamina (EDDS) preferentemente en forma de sus sales de sodio o de magnesio. Ademas se prefieren en este contexto tambien disuccinatos de glicerina y trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de uso adecuadas se encuentran en formulaciones que contienen zeolitas y/o que contienen silicatos entre el 3 y el 15 % en peso.

Otros cosoportes organicos utiles son, por ejemplo, acidos hidroxicarboxflicos acetilados o sus sales, que pueden encontrarse tambien dado el caso en forma de lactona y que contienen al menos 4 atomos de carbono y al menos un grupo hidroxi asf como, como maximo, dos grupos acido.

Una clase de sustancias adicional con propiedades de cosoporte la representan los fosfonatos. A este respecto se trata en particular de fosfonatos de hidroxialcano o aminoalcano. Entre los fosfonatos de hidroxialcano es de particular importancia como cosoporte el 1,1-difosfonato de 1-hidroxietano (HEDP). Se usa preferentemente como sal de sodio, reaccionando la sal de disodio de forma neutra y la sal de tetrasodio de forma alcalina (pH 9). Como fosfonatos de aminoalcano se tienen en cuenta preferentemente fosfonato de etilendiaminotetrametileno (EDTMP), fosfonato de dietilentriaminopentametileno (DTPMP) asf como sus homologos superiores. Se usan preferentemente en forma de las sales de sodio que reaccionan de forma neutra, por ejemplo como sal de hexasodio del EDTMP o como sal de hepta- y octa-sodio del DTPMP. Como soporte se usa a este respecto de la clase de los fosfonatos preferentemente HEDp. Los fosfonatos de aminoalcano poseen ademas una marcada capacidad de union a metales pesados. Por consiguiente, puede preferirse, en particular cuando los agentes contienen tambien lejfa, usar fosfonatos de aminoalcano, en particular DTPMP, o mezclas de los fosfonatos mencionados.

Ademas pueden usarse todos los compuestos que pueden formar complejos con iones alcalinoterreos como cosoportes.

Las sustancias de soporte pueden estar contenidas en los agentes de acuerdo con la invencion dado el caso en cantidades de hasta el 90 % en peso. Estan contenidas preferentemente en cantidades de hasta el 75 % en peso. Los agentes de lavado de acuerdo con la invencion presentan contenidos de soporte de en particular del 5 % en peso al 50 % en peso. En agentes de acuerdo con la invencion para la limpieza de superficies duras, en particular para la limpieza a maquina de vajilla, el contenido de sustancias de soporte asciende en particular a del 5 % en peso al 88 % en peso, no empleandose en tales agentes preferentemente ningun material de soporte insoluble en agua. En una forma de realizacion preferente de agentes de acuerdo con la invencion para la limpieza en particular a

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maquina de vajilla estan contenidos del 20 % en peso al 40 % en peso de soportes organicos solubles en agua, en particular citrato de metal alcalino, del 5 % en peso al 15 % en peso de carbonato de metal alcalino y del 20 % en peso al 40 % en peso de disilicato de metal alcalino.

Los disolventes que se pueden emplear en las composiciones de lfquidas a en forma de gel de los agentes de lavado y limpieza proceden, por ejemplo, del grupo de los alcoholes mono- o polihidroxflicos, alcanolaminas o eteres de glicol, siempre que sean miscibles con agua en el intervalo de concentraciones indicado. Preferentemente, los disolventes se seleccionan de etanol, n- o i-propanol, butanoles, eter de metilo de etilenglicol, eter de etilo de etilenglicol, eter de propilo de etilenglicol, mono-n-butileter de etilenglicol, eter de metilo de dietilenglicol, eter de etilo de dietilenglicol, eter de metilo, etilo o propilo de propilenglicol, monometil- o -etileter de dipropilenglicol, monometil- o -etileter de di-isopropilenglicol, metoxi-, etoxi- o butoxitriglicol, 1-butoxietoxi-2-propanol, 3-metil-3-metoxibutanol, eter de t-butilo de propilen-glicol asf como mezclas de estos disolventes.

Los disolventes se pueden emplear en agentes de lavado y limpieza de lfquidos a en forma de gel de acuerdo con la invencion en cantidades entre el 0,1 y el 20 % en peso, pero preferentemente por debajo del 15 % en peso y en particular por debajo del 10 % en peso.

Para el ajuste de la viscosidad se pueden anadir a las composiciones de acuerdo con la invencion uno o varios espesantes o sistemas de espesantes. Estas sustancias de alto peso molecular, que se denominan tambien agentes de hinchado (hinchamiento), la mayona de las veces absorben los lfquidos y a este respecto se hinchan para convertirse, finalmente, en soluciones viscosas verdaderas o coloidales.

Son espesantes adecuados compuestos inorganicos u organicos polimericos. A los espesantes inorganicos pertenecen, por ejemplo, poliacidos silfcicos, minerales de arcilla tales como montmorillonita, zeolita, acidos silfcicos y bentonita. Los espesantes organicos proceden de los grupos de los polfmeros naturales, de los polfmeros naturales modificados y de los polfmeros completamente sinteticos. Tales polfmeros procedentes de la naturaleza son, por ejemplo, agar-agar, carragenano, tragacanto, goma arabiga, alginatos, pectinas, poliosas, harina de guar, harina de semilla de algarrobo, almidon, dextrinas, gelatina y casema. Las sustancias naturales modificadas que se usan como espesante proceden sobre todo del grupo de los almidones y las celulosas modificados. En este caso se mencionan, a modo de ejemplo, carboximetilcelulosa y otros eteres de celulosa, hidroxietil- y -propilcelulosa asf como eter de flor de harina. Son espesantes completamente sinteticos polfmeros tales como compuestos poliacnlicos y polimetacnlicos, polfmeros de vinilo, poli(acidos carboxflicos), polieteres, poliminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar contenidos en una cantidad de hasta el 5 % en peso, preferentemente del 0,05 al 2 % en peso y de forma particularmente preferente del 0,1 al 1,5 % en peso en relacion con la composicion terminada.

El agente de lavado o limpieza de acuerdo con la invencion puede contener, dado el caso, como otros ingredientes habituales secuestrantes, electrolitos y otros coadyuvantes.

Los agentes de lavado de materiales textiles de acuerdo con la invencion pueden contener como blanqueadores opticos derivados del acido diaminoestilbendisulfonico o sus sales de metal alcalino. Son adecuadas, por ejemplo, sales del acido 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfonico o compuestos estructurados del mismo modo que, en lugar del grupo morfolino, llevan un grupo dietanolamino, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Ademas pueden estar presentes blanqueadores del tipo de los difenilestirilos sustituidos, por ejemplo las sales de metal alcalino de 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilo, 4,4'-bis(4- cloro-3-sulfoestiril)-difenilo o 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-difenilo. Se pueden usar tambien mezclas de los blanqueadores opticos que se han mencionado anteriormente.

Los inhibidores de agrisado tienen la tarea de mantener suspendida en el bano la suciedad desprendida de la fibra textil. Para esto son adecuados coloides solubles en agua, la mayona de las veces de naturaleza organica, por ejemplo almidon, cola, gelatina, sales de acidos etercarboxflicos o acidos etersulfonicos de almidon o de celulosa o sales de esteres de acido sulfurico acidos de celulosa o de almidon. Para este fin son adecuadas tambien poliamidas solubles en agua que contienen grupos acidos. Ademas se pueden usar derivados de almidon diferentes de los mencionados anteriormente, por ejemplo almidones de aldehfdo. Preferentemente se emplean eteres de celulosa, tales como carboximetilcelulosa (sal de Na), metilcelulosa, hidroxialquilcelulosa y eteres mixtos, tales como metilhidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, por ejemplo, en cantidades del 0,1 al 5 % en peso en relacion con los agentes.

Para causar una proteccion frente a la corrosion de plata, en los agentes de limpieza de acuerdo con la invencion para vajilla se pueden emplear inhibidores de la corrosion de plata. Estos son conocidos por el estado de la tecnica, por ejemplo, benzotriazoles, cloruro de hierro (III) o CoSO4. Como es sabido, los inhibidores de corrosion de plata particularmente adecuados para el uso conjunto con enzimas son sales y/o complejos de manganeso, titanio, zirconio, hafnio, vanadio, cobalto o cerio en los que los metales mencionados estan presentes en uno de los niveles de oxidacion II, III, IV, V o VI. Son ejemplos de tales compuestos MnSO4, V2O5, V2O4, VO2, TOSO4, K2TiF6, K2ZrF6, Co(NO3)2, Co(NO3)3, asf como sus mezclas.

Los principios activos "de lavado facilitado" o "repelentes de suciedad" la mayona de las veces son polfmeros que

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con el uso en un agente de lavado otorgan a la fibra de ropa propiedades de repulsion de la suciedad y/o respaldan la capacidad de desprendimiento de suciedad de los restantes constituyentes del agente de lavado. Se puede observar un efecto comparable tambien en caso de su uso en agentes de limpieza para superficies duras.

Son principios activos de lavado facilitado particularmente eficaces y conocidos desde hace tiempo copoliesteres con unidades de acido dicarboxflico, alquilenglicol y polialquilenglicol. Son ejemplos de esto copolfmeros o polfmeros mixtos de poli(tereftalato de etileno) y polioxietilenglicol y agentes acidos que contienen, entre otros, un copolfmero de un acido carboxflico dibasico y un alquilen- o cicloalquilenpoliglicol. Se pueden emplear asimismo de forma ventajosa polfmeros de tereftalato de etileno y tereftalato de poli(oxido de etileno) asf como copoliesteres de etilenglicol, polietilenglicol, acido dicarboxflico aromatico y acido dicarboxflico aromatico sulfonado en determinadas relaciones molares. Ademas son conocidos poliesteres cerrados terminalmente con grupos metilo o etilo con unidades de tereftalato de etileno y/o propileno y tereftalato de poli(oxido de etileno) y agentes de lavado que contienen un polfmero de lavado facilitado de este tipo y poliesteres que, aparte de grupos oxietileno y unidades de acido tereftalico, contienen tambien unidades de etileno sustituidas asf como unidades de glicerina. Ademas son conocidos poliesteres que, aparte de grupos oxietileno y unidades de acido tereftalico, contienen grupos 1,2- propileno, 1,2-butileno y/o 3-metoxi-1,2-propileno asf como unidades de glicerina y estan cerrados con grupos terminales con grupos alquilo de C1 a C4 y poliesteres cerrados con grupo terminal al menos en parte por restos alquilo C1-4 o acilo con unidades de poli(tereftalato de propileno) y tereftalato de polioxietileno. Se conocen tambien poliesteres de lavado facilitado que contienen tereftalato cerrados con grupo terminal sulfoetileno y poliesteres de lavado facilitado preparados mediante sulfonacion de grupos terminales insaturados con unidades de tereftalato, alquilenglicol y poli-C2-4-glicol. Ademas son conocidos poliesteres acidos aromaticos con capacidad de desprendimiento de suciedad y principios activos repelentes de suciedad no polimericos para materiales de algodon con varias unidades funcionales: una primera unidad que, por ejemplo, puede ser cationica tiene capacidad de adsorcion sobre la superficie de algodon mediante interaccion electrostatica y una segunda unidad, que esta configurada de forma hidrofoba, es responsable de la permanencia del principio activo en la superficie lfmite agua/algodon.

A los inhibidores de la transferencia de color que se consideran para el empleo en agentes de lavado de materiales textiles de acuerdo con la invencion pertenecen, en particular, polivinilpirrolidonas, polivinilimidazoles, N-oxidos polimericos tales como poli-(N-oxido de vinilpiridina) y copolfmeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

En el caso del empleo en procedimientos de limpieza a maquina puede ser ventajoso anadir inhibidores de espuma a los agentes. Como inhibidores de espuma son adecuados, por ejemplo, jabones de origen natural o sintetico que presentan una elevada parte de acidos grasos C18-C24. Son inhibidores de espuma de tipo no tensioactivo adecuados, por ejemplo, organopolisiloxanos y sus mezclas con acido silfcico microfino, dado el caso silanizado, asf como parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con acido silfcico silanizado o biesteariletilendiamida. Ventajosamente se usan tambien mezclas de distintos inhibidores de espuma, por ejemplo, aquellos de silicona, parafinas o ceras. Preferentemente, los inhibidores de espuma, en particular inhibidores de espuma que contienen silicona y/o parafina, estan unidos a una sustancia de soporte granular, soluble o dispersable en agua. En particular, a este respecto se prefieren mezclas de parafinas y biesteariletilendiamidas.

Por la solicitud no publicada previamente DE 102004020430.6 se obtienen agentes de limpieza, en particular agentes para el lavado a maquina de la vajilla, que contienen un copolfmero de (i) acidos carboxflicos insaturados, (ii) monomeros que contienen grupos acido sulfonico y (iii) opcionalmente otros monomeros ionicos o no ionogenos y una variante especial de a-amilasa. Estos copolfmeros se pueden combinar tambien con a-amilasas que se corresponden con la presente invencion, en particular cuando, aparte de las sustituciones de acuerdo con la invencion, presentan aquellas que se pueden obtener de una o varias de las solicitudes WO 96/23873 A1, WO 00/60060 A2 y WO 01/66712 A2. Esto se aplica en particular para el caso en el que el producto comercial que se incluye en estas solicitudes Stainzyme® de la empresa Novozymes se mejora en otras posiciones y adicionalmente se provee de al menos una sustitucion de acuerdo con la invencion. De hecho, en principio se tiene que partir de un efecto aditivo de las distintas modificaciones.

Un agente de limpieza de acuerdo con la invencion para superficies duras ademas puede contener constituyentes de efecto abrasivo, en particular del grupo que comprende polvos de cuarzo, polvos de madera, polvos de plastico, cretas y microbolas de vidrio asf como sus mezclas. Estan contenidas sustancias abrasivas en los agentes de limpieza de acuerdo con la invencion preferentemente no por encima del 20 % en peso, en particular del 5 % en peso al 15 % en peso.

Se anaden colorantes y fragancias a los agentes de lavado y limpieza para mejorar el aspecto estetico de los productos y poner a disposicion para el consumidor, ademas del poder de lavado y limpieza, un producto visual y sensorialmente "tfpico e inconfundible". Como aceites perfumados o fragancias se pueden usar compuestos individuales de sustancia olorosa, por ejemplo, los productos sinteticos del tipo de los esteres, eteres, aldehfdos, cetonas, alcoholes e hidrocarburos. Son compuestos de sustancias olorosas del tipo de los esteres, por ejemplo, acetato de bencilo, isobutirato de fenoxietilo, acetato de p-ferc-butilciclohexilo, acetato de linalilo, carbinilacetato de dimetilbencilo, acetato de feniletilo, benzoato de linalilo, formiato de bencilo, glicinato de etilmetilfenilo, propionato de alilciclohexilo, propionato de estiralilo y salicilato de bencilo. A los eteres pertenecen, por ejemplo, eter de benciletilo, a los aldehfdos, por ejemplo, los alcanales lineales con 8-18 atomos de C, citral, citronelal, citroneliloxiacetaldefndo,

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ciclamenaldehndo, hidroxicitronelal, lilial y bourgeonal, a las cetonas, por ejemplo, las jononas, a-isometilionona y metil-cedrilcetona, a los alcoholes anetol, citronelol, eugenol, geraniol, linalool, alcohol feniletilico y terpineol, a los hidrocarburos pertenecen principalmente los terpenos, tales como limoneno y pineno. Sin embargo, se usan preferentemente mezclas de distintas sustancias olorosas que generan conjuntamente una nota de olor agradable. Tales aceites perfumados pueden contener tambien mezclas de sustancias olorosas naturales, como se pueden obtener de fuentes vegetales, por ejemplo, aceite de pino, cftrico, jazmm, pachuli, rosas o ylang-ylang. Tambien son adecuados moscatel, aceite de salvia, aceite de manzanilla, aceite de clavel, aceite de toronjil, aceite de menta, aceite de hojas de canela, aceite de tila, aceite de enebro, aceite de vetiver, aceite de olfbano, aceite de galbano y aceite de labdano, asf como aceite de flor de naranja, neroliol, aceite de cascara de naranja y aceite de sandalo. Habitualmente, el contenido de en colorantes se encuentra por debajo del 0,01 % en peso, mientras que las fragancias pueden ser hasta el 2 % en peso de toda la formulacion.

Las fragancias pueden incluirse directamente en los agentes de lavado y limpieza, pero puede ser ventajoso tambien aplicar las fragancias sobre soportes que refuerzan la adherencia del perfume sobre el material de limpieza y proporcionan una fragancia de larga duracion mediante una liberacion de la fragancia mas lenta, particularmente de materiales textiles tratados. Como materiales de soportes de este tipo han dado buen resultado por ejemplo ciclodextrinas, pudiendo revestirse los complejos de ciclodextrina-perfume adicionalmente tambien con coadyuvantes adicionales. Otro soporte preferente para fragancias es la zeolita X descrita que, en lugar o en mezcla con tensioactivos, puede absorber tambien fragancias. Por tanto, se prefieren agentes de lavado y limpieza que contienen la zeolita X descrita y fragancias que estan absorbidas preferentemente al menos en parte en la zeolita.

Colorantes preferidos, cuya eleccion no causa dificultad alguna al experto, tienen una alta estabilidad en almacenamiento y una insensibilidad frente a los restantes ingredientes de los agentes y contra la luz asf como ninguna afinidad marcada con respecto a las fibras textiles, para no tenir las mismas.

Para combatir microorganismos, los agentes de lavado o limpieza pueden contener principios activos antimicrobianos. En este caso se diferencia, en funcion del espectro antimicrobiano y el mecanismo de accion, entre bacteriostaticos y bactericidas, fungistaticos y fungicidas, etc. Son sustancias importantes de estos grupos, por ejemplo, cloruros de benzalconio, sulfonatos de alquilarilo, halofenoles y mercuriacetato de fenol. Los terminos efecto antimicrobiano y principio activo antimicrobiano en el marco de la ensenanza de acuerdo con la invencion tienen el significado habitual en la tecnica. Los principios activos antimicrobianos adecuados estan seleccionados preferentemente de los grupos de los alcoholes, aminas, aldehfdos, acidos antimicrobianos o sus sales, esteres de acido carboxflico, amidas de acido, fenoles, derivados de fenol, difenilos, difenilalcanos, derivados de urea, acetales y formales de oxfgeno, nitrogeno, benzamidinas, isotiazolinas, derivados de ftalimida, derivados de piridina, compuestos antimicrobianos con actividad superficial, guanidinas, compuestos anfoteros antimicrobianos, quinolinas, 1,2-dibromo-2,4-dicianobutano, carbamato de yodo-2-propil-butilo, yodo, yodoforos, compuestos peroxo, compuestos halogenados asf como mezclas discrecionales de los anteriores.

A este respecto, el principio activo antimicrobiano puede estar selecccionado de etanol, n-propanol, /-propanol, 1,3- butanodiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, acido undecilenico, acido benzoico, acido salidlico, acido dihidracetico, o-fenilfenol, W-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-bencil-4-clorofenol, 2,2'-metilen-bis-(6-bromo-4- clorofenol), eter de 4,4'-diclor-2'-hidroxidifenilo (diclosan), eter de 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenilo (triclosan), clorhexidina, W-(4-clorofenil)-W-(3,4-diclorofenil)-urea, diclorhidrato de W,W'-(i,i0-decan-diildi-i-piridinil-4-iliden)-bis- (1-octanamina), W,W-Bis-(4-clorofenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamida, glucoprotaminas,

compuestos cuaternarios antimicrobianos con actividad superficial, guanidinas incluyendo las bi- y poliguanidinas, tales como, por ejemplo, diclorhidrato de 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexano), tetraclorhidrato de 1,6-di-(Ni,N-T- fenildiguanido-N5,N5')-hexano, diclorhidrato de 1,6-di-(Ni,Ni'-fenil-Ni,Ni-metildiguanido-Ns,Ns')-hexano, diclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-o-clorofenildiguanida-N5,N5')-hexano, diclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-2,6-diclorofenildiguanido-

N5,N5')hexano, diclorhidrato de i,6-di-[Ni,Ni'-beta-(p-metoxifenil)diguanido-N5,N5']-hexano, diclorhidrato de i,6-di- (Ni,Ni'-alfa-metil-beta-fenildiguanido-N5,N5')-hexano, diclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-p-nitrofenildiguanido-

N5,N5')hexano, diclorhidrato de eter de omega:omega-di-(Ni,Ni'-fenildiguanido-N5,N5')-di-n-propilo, tetraclorhidrato de eter de omega:omega'-di-(Ni,Ni'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')-di-n-propilo, tetraclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-2,4- diclorofenildiguanido-N5,N5')hexano, diclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-p-metilfenildiguanido-N5,N5')hexano,

tetraclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N5,N5')hexano, diclorhidrato de i,6-di-[Ni,Ni'-alfa-(p- clorofenil)etildiguanido-N5,N5']hexano, diclorhidrato de omega:omega-di-(Ni,Ni'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')m-xileno, diclorhidrato de i,i2-di-(Ni,Ni'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')dodecano, tetraclorhidrato de i,i0-di-(Ni,Ni'-

fenildiguanido-N5,N5')-decano, tetraclorhidrato de i,i2-di-(Ni,Ni'-fenil)diguanido-N5,N5')dodecano, diclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-o-clorofenildiguanido-N5,N5')hexano, tetraclorhidrato de i,6-di-(Ni,Ni'-o-clorofenildiguanido-N5,N5') hexano, etilen-bis-(i-tolil biguanida), etilen-bis-(p-tolil biguanida), etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), etilen-bis-(p- terc-amilfenilbiguanida), etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), etilen-bis-(fenilbiguanida), etilen-bis-(W-butilfenilbiguanida), etilen-bis (2,5-dietoxifenilbiguanida), etilen-bis (2,4-dimetilfenil biguanida), etilen-bis (o-difenil-biguanida), etilen-bis (amil naftilbiguanida mixta), W-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), trimetilen bis (o-tolilbiguanida), W-butil-trimetile-bis- (fenil biguanida) y las correspondientes tales como acetatos, gluconatos, clorhidratos, bromhidratos, citratos, bisulfitos, fluoruros, polimaleatos, sarcosinatos de W-cocosalquilo, fosfitos, hipofosfitos, perfluorooctanoatos, silicatos, sorbatos, salicilatos, maleatos, tartratos, fumaratos, etilendiamintetraacetato, iminodiacetato, cinnamato, tiocianato, arginato, piromelitato, tetracarboxibutirato, benzoato, glutarato, monofluorofosfato, perfluoropropionato asf como mezclas discrecionales de los mismos. Ademas son adecuados derivados halogenados de xileno y cresol

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tales como p-cloro-metacresol, o p-cloro-meta-xileno, as^ como principios activos antimicrobianos naturales de origen vegetal (por ejemplo de especias o hierbas), de origen animal asf como microbiano. Preferentemente se pueden emplear compuestos cuaternarios con actividad superficial de efecto antimicrobiano, un principio activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un principio activo antimicrobiano natural de origen animal, de forma extremadamente preferente al menos un principio activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende cafema, teobromina y teofilina asf como aceites esenciales tales como eugenol, timol y geraniol y/o al menos un principio activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende enzimas tales como albumina de leche, lisozima y lactoperoxidasa y/o al menos un compuesto cuaternario con actividad superficial de efecto antimicrobiano con un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos de cloro. Se pueden emplear tambien sustancias de origen microbiano, las denominadas bacteriocinas.

Los compuestos de amonio cuaternarios (CAC) adecuados como principios activos antimicrobianos presentan la formula general (R1)(R2)(R3)(R4) N+ X-, en la que R1 a R4 representan restos alquilo C1-C22 iguales o distintos, restos aralquilo C7-C28 o restos heterodclicos, formando dos, o en el caso de una inclusion aromatica tal como en la piridina, incluso tres restos junto con el atomo de nitrogeno el heterociclo, por ejemplo un compuesto de piridinio o imidazolinio y X- son iones halogeno, iones sulfato, iones hidroxido o aniones similares. Para un efecto antimicrobiano optimo, preferentemente al menos uno de los restos presenta una longitud de cadena de 8 a 18, en particular de 12 a 16 atomos de C.

Los CAC se pueden preparar mediante reaccion de aminas terciarias con agentes de alquilacion tales como, por ejemplo, cloruro de metilo, cloruro de bencilo, sulfato de dimetilo, bromuro de docecilo, pero tambien oxido de etileno. La alquilacion de aminas terciarias con un resto alquilo largo y dos grupos metilo se consigue de forma particularmente sencilla, tambien se puede llevar a cabo la cuaternizacion de aminas terciarias con dos restos largos y un grupo metilo con ayuda de cloruro de metilo en condiciones poco rigurosas. Las aminas que disponen de tres restos alquilo largos o restos alquilo sustituidos con hidroxi son menos reactivas y se cuaternizan preferentemente con sulfato de dimetilo.

Son CAC adecuados por ejemplo cloruro de benzalconio (cloruro de W-alquil-W,A/-dimetil-bencil-amonio, CAS n.° 8001-54-5), benzalconio B (cloruro de m,p-diclorobencil-dimetil-alquil-C12-amonio, CAS n.° 58390-78-6), cloruro de benzoxonio (cloruro de bencil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio), bromuro de cetrimonio (bromuro de W-hexadecil- W,W-trimetil-amonio, CAS n.° 57-09-0), cloruro de bencetonio (cloruro de W,W-dimetil-W-[2-[2-[p-(1,1,3,3- tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-bencilamonio, CAS n.° 121-54-0), cloruros de dialquildimetilamonio tales como cloruro de di-n-decil-dimetil-amonio (CaS n.° 7173-51-5-5), bromuro de didecildi-metilamonio (CAS n.° 2390-68-3), cloruro de dioctildimetil-amonio, cloruro de 1 -cetilpiridinio (CAS n.° 123-03-5) y yoduro de tiazolina (CAS n.° 15764-48-1) asf como sus mezclas. Son CAC particularmente preferentes los cloruros de benzalconio con restos alquilo Ca-C-ia, en particular cloruro de alquil-C-^-C-M-bencil-dimetil-amonio.

Los halogenuros de benzalconio y/o halogenuros de benzalconio sustituidos estan disponibles en el mercado por ^ ® J ® 1 ® 1 ejemplo como Barquat de Lonza, Marquat de Mason, Variquat de Witco/ Sherex e Hyamine de Lonza, asf como

Bardac® de Lonza. Otros principios activos antimicrobianos disponibles en el mercado son cloruro de W-(3-cloroalil)-

hexaminio tal como Dowicide® y Dowicil® de Dow, cloruro de bencetonio tal como Hyamine® 1622 de Rohm & Haas,

cloruro de metilbencetonio tal como Hyamine® 10X de Rohm & Haas, cloruro de cetilpiridinio tal como cloruro de

Cepacol de Merrell Labs.

Los principios activos antimicrobianos se emplean en cantidades del 0,0001 % en peso al 1 % en peso, preferentemente del 0,001 % en peso al 0,8 % en peso, de forma particularmente preferente del 0,005 % en peso al 0,3 % en peso y en particular del 0,01 al 0,2 % en peso.

Los agentes pueden contener absorbentes de UV (absorbedores de UV) que se aplican sobre los materiales textiles tratados y mejoran la resistencia a la luz de las fibras y/o la resistencia a la luz de otros constituyentes de la formulacion. Por absorbedores de UV se ha de entender sustancias organicas (filtros fotoprotectores) que estan en disposicion de absorber rayos ultravioletas y volver a ceder la energfa absorbida en forma de radiacion de longitud de onda mas larga, por ejemplo, calor.

Los compuestos que presentan estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos eficaces mediante desactivacion sin radiacion y derivados de la benzofenona con sustituyentes en posicion 2 y/o 4. Ademas, tambien son adecuados benzotriazoles sustituidos, acrilatos sustituidos con fenilo en posicion 3 (derivados de acido cinamico, dado el caso con grupos ciano en posicion 2), salicilatos, complejos de Ni organicos asf como sustancias naturales tales como umbeliferona y el acido urocanico propio del cuerpo. Tienen una importancia particular los derivados de bifenilo y sobre todo de estilbeno que estan disponibles en el mercado como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR de Ciba. Como absorbedores de UV-B se ha de mencionar: 3-bencilidenalcanfor o 3-bencilidennoralcanfor y sus derivados, por ejemplo 3-(4-metilbenciliden)alcanfor; derivados de acido 4-aminobenzoico, preferentemente 2- etilhexilester de acido 4-(dimetilamino)benzoico, ester de 2-octilo de acido 4-(dimetilamino)benzoico y ester de amilo de acido 4-(dimetilamino)benzoico; esteres del acido cinamico, preferentemente ester de 2-etilhexilo de acido 4- metoxicinamico, ester de propilo de acido 4-metoxicinamico, ester de isoamilo de acido 4-metoxicinamico, ester de 2-etilhexilo de acido 2-ciano-3,3-fenilcinamico (octocrilenos); esteres del acido salidlico, preferentemente ester de 2- etilhexilo de acido salidlico, ester de 4-isopropilbencilo de acido salidlico, ester de homomentilo de acido salidlico;

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derivados de la benzofenona, preferentemente 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metil- benzofenona, 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; esteres del acido benzalmalonico, preferentemente ester de di-2- etilhexilo de acido 4-metoxibenzomalonico; derivados de triazina tales como, por ejemplo, 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'- etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y octil triazona o dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); propan-1,3-diona, tal como, por ejemplo, 1-(4-terc-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propan-1,3-diona; derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano. Ademas son adecuados acido 2-fenilbencimidazol-5-sulfonico y sus sales de metal alcalino, metal alcalinoterreo, amonio, alquilamonio, alcanolamonio y glucamonio; derivados de acido sulfonico de benzofenonas, preferentemente acido 2- hidroxi-4-metoxibenzofenon-5-sulfonico y sus sales; derivados de acido sulfonico del 3-bencilidenalcanfor tales como, por ejemplo, acido 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)benceno-sulfonico y acido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfonico y sus sales.

Como filtros UV-A tfpicos se consideran, en particular, derivados del benzoilmetano, tales como, por ejemplo, 1-(4'- terc-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propan-1,3-diona, 4-terc-butil-4'-metoxidibenzoilmetano (Parsol 1789), 1-fenil-3-(4'- isopropilfenil)-propan-1,3-diona as^ como compuestos de enamina (BASF). Los filtros de UV-A y filtros de UV-B, evidentemente, se pueden emplear tambien en mezclas. Ademas de las sustancias solubles mencionadas, para este fin se consideran tambien pigmentos fotoprotectores insolubles, en concreto oxidos de metal finamente dispersos, preferentemente nanoizados o sales. Son ejemplos de oxidos de metal adecuados, en particular, oxido de cinc y dioxido de titanio y, ademas, oxidos de hierro, zirconio, silicio, manganeso, aluminio y cerio asf como sus mezclas. Como sales se pueden emplear silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los oxidos y las sales se usan en forma de los pigmentos ya para emulsiones para el cuidado de la piel y para la proteccion de la piel y la cosmetica decorativa. A este respecto, las partfculas deben presentar un diametro medio de menos de 100 nm, preferentemente entre 5 y 50 nm y en particular entre 15 y 30 nm. Pueden presentar una forma esferica, sin embargo, se pueden emplear tambien aquellas partfculas que presentan una forma elipsoidal o que difiere de otro modo de la forma esferica. Los pigmentos pueden estar presentes tambien tratados en la superficie, es decir, hidrofilizados o hidrofobizados. Los ejemplos tfpicos son dioxidos de titanio revestidos tales como, por ejemplo, dioxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex® T2000 (Merck; como agentes de revestimiento hidrofobos se consideran para esto preferentemente siliconas y de forma particularmente preferente trialcoxioctilsilano o simeticona. Preferentemente se usa oxido de cinc micronizado.

Los absorbedores de UV se usan habitualmente en cantidades del 0,01 % en peso al 5 % en peso, preferentemente del 0,03 % en peso al 1 % en peso.

Los agentes de acuerdo con la invencion para aumentar el poder de lavado o de limpieza, aparte de las variantes de acuerdo con la invencion de a-amilasa, pueden contener otras enzimas, pudiendo emplearse en principio todas las enzimas establecidas para estos fines en el estado de la tecnica. A esto pertenecen en particular proteasas, otras amilasas, lipasas, hemicelulasas, celulasas u oxidorreductasas, asf como preferentemente sus mezclas. Estas enzimas en principio son de origen natural; partiendo de las moleculas naturales estan disponibles para el empleo en agentes de lavado y limpieza variantes mejoradas que se emplean correspondientemente con preferencia. Los agentes de acuerdo con la invencion contienen enzimas preferentemente en cantidades totales de 1 x 10-8 al 5 por ciento en peso en relacion con la protema activa. La concentracion de protemas se puede determinar con ayuda de procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento de BCA (acido bicinconmico; acido 2,2'-biquinolil-4,4'- dicarboxflico) o el procedimiento de biuret (A. G. Gornall, C. S. Bardawill y M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pag. 751-766).

Entre las proteasas se prefieren aquellas del tipo subtilisina. Son ejemplo de esto las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa alcalina de Bacillus lentus, la subtilisina DY y las enzimas a asignar a las subtilasas, sin embargo, ya no a las subtilisinas en el sentido mas estricto termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7. La subtilisina Carlsberg esta disponible en una forma perfeccionada con el nombre comercial Alcalase® en la empresa Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca. Las subtilisinas 147 y 309 se comercializan con el nombre comercial Esperase® o Savinase® por la empresa Novozymes. De la proteasa de Bacillus lentus DSM 5483 (documento WO 91/02792 A1) se derivan las variantes comercializadas con la denominacion BLAP® que se describen en particular en los documentos WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 y WO 03/038082 A2. Otras proteasas que se pueden usar de distintos Bacillus sp. y B. gibsonii se obtienen de las solicitudes de patente WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 y WO 03/054184 A1.

Otras proteasas utiles son, por ejemplo, las enzimas disponibles con el nombre comercial Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® y Ovozyme® de la empresa Novozymes, con el nombre comercial Purafect®, Purafect® OxP y Properase® de la empresa Genencor, con el nombre comercial Protosol® de la empresa Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, con el nombre comercial Wuxi® de la empresa Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, con el nombre comercial Proleather® y Protease P® de la empresa Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japon y con la denominacion proteinasa K-16 de la empresa Kao Corp., Tokio, Japon.

Son ejemplos de amilasas que se pueden emplear adicionalmente de acuerdo con la invencion las a-amilasas de Bacillus licheniformis, de B. amyloliquefaciens o de B. stearothermophilus asf como sus perfeccionamientos mejorados para el empleo en agentes de lavado o limpieza. La enzima de B. licheniformis esta disponible en la empresa Novozymes con el nombre Termamyl® y en la empresa Genencor con el nombre Purastar®ST. Estan

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disponibles productos perfeccionados de esta a-amilasa en la empresa Novozymes con el nombre comercial Duramyl® y Termamyl®ultra, en la empresa Genencor con el nombre Purastar®OxAm y en la empresa Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japon como Keistase®. La a-amilasa de B. amyloliquefaciens se comercializa por la empresa Novozymes con el nombre BAN®, y variantes derivadas de la a-amilasa de B. stearothermophilus con el nombre BSG® y Novamyl®, tambien de la empresa Novozymes.

Ademas, para este fin se han de destacar la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) desvelada en la solicitud WO 02/10356 A2 y la ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa) de B. agaradherens (DSM 9948) descrita en la solicitud WO 02/44350 A2. Ademas se pueden emplear las enzimas amilolfticas que pertenecen al espacio de secuencia de las a-amilasas que se define en la solicitud WO 03/002711 A2 y las que se describen en la solicitud WO 03/054177 A2. Asimismo se pueden emplear productos de fusion de las moleculas mencionadas, por ejemplo los de la solicitud DE 10138753 A1 o mutaciones puntuales de los mismos.

Ademas son adecuados los perfeccionamientos disponibles con el nombre comercial Fungamyl® de la empresa Novozymes de la a-amilasa de Aspergillus niger y A. oryzae. Otros productos comerciales que se pueden emplear son, por ejemplo, Amylase-LT® y Stainzyme®, esta ultima tambien de la empresa Novozymes.

Los agentes de acuerdo con la invencion pueden contener lipasas o cutinasas, en particular debido a sus actividades de escision de trigliceridos, pero tambien para generar peracidos in situ a partir de precursores adecuados. A esto pertenecen por ejemplo las lipasas obtenidas originalmente de Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) o perfeccionadas, en particular aquellas con la sustitucion de aminoacidos D96L. Se comercializan, por ejemplo, por la empresa Novozymes con el nombre comercial Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® y Lipex®. Ademas se pueden emplear, por ejemplo, las cutinasas que se han aislado originalmente de Fusarium solani pisi y Humicola insolens. Se pueden obtener tambien lipasas utiles en la empresa Amano con las denominaciones Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B® o Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillis sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® y Lipase AML®. De la empresa Genencor se pueden emplear, por ejemplo, las lipasas o cutinasas cuyas enzimas de partida se han aislado originalmente de Pseudomonas mendocina y Fusarium solanii. Como otros productos comerciales importantes se han de mencionar las preparaciones comercializadas originalmente por la empresa Gist-Brocades M1 Lipase® y Lipomax® y las enzimas comercializadas por la empresa Meito Sangyo KK, Japon con el nombre Lipase MY-30®, Lipase OF®y Lipase PL®, ademas el producto Lumafast® de la empresa Genencor.

Los agentes de acuerdo con la invencion, particularmente cuando estan concebidos para el tratamiento de materiales textiles, pueden contener celulasas, dependiendo del fin como enzimas puras, como preparaciones enzimaticas o en forma de mezclas en las que los componentes individuales se complementan ventajosamente en relacion con sus distintos aspectos de rendimiento. A estos aspectos de rendimiento pertenecen, en particular, contribuciones al rendimiento de lavado primario, al rendimiento de lavado secundario del agente (efecto anti- redeposicion o inhibicion de agrisado) y avivado (efecto de tejido) hasta el ejercicio de un efecto de "lavado a piedra".

Una preparacion de celulasa rica en endoglucanasa (EG) fungica util o sus perfeccionamientos se ofrecen por la empresa Novozymes con el nombre comercial Celluzyme®. Los productos disponibles tambien en la empresa Novozymes Endolase® y Carezyme® se basan en la EG de 50 kD o la EG de 43 kD de H. insolens DSM 1800. Otros productos comerciales utiles de esta empresa son Cellusoft® y Renozyme®. La ultima se basa en la solicitud WO 96/29397 A1. Se obtienen variantes de celulasa mejoradas en cuanto al rendimiento por ejemplo por la solicitud WO 98/12307 A1. Ademas se pueden emplear las celulasas desveladas en la solicitud WO 97/14804 A1, por ejemplo, la EG desvelada allf de 20 kD de Melanocarpus, que se puede obtener de la empresa AB Enzymes, Finlandia, con el nombre comercial Ecostone® y Biotouch®. Otros productos comerciales de la empresa AB Enzymes son Econase® y Ecopulp®. Otras celulasas adecuadas de Bacillus sp. CBS 670.93 y CBS 669.93 se desvelan en el documento WO 96/34092 A2, obteniendose la de Bacillus sp. CBS 670.93 de la empresa Genencor con el nombre comercial Puradax®. Otros productos comerciales de la empresa Genencor son "Genencor detergent cellulase L" e IndiAge®Neutra.

Los agentes de acuerdo con la invencion en particular para la eliminacion de determinados ensuciamientos problematicos pueden contener otras enzimas que se compilan en el termino hemicelulasas. A esto pertenecen, por ejemplo, mananasas, xantanliasas, pectinliasas (=pectinasas), pectinesterasas, pectatliasas, xiloglucanasas (=xilanasas), pululanasas y p-glucanasas. Estan disponibles mananasas adecuadas, por ejemplo, con el nombre Gamanase® y Pektinex AR® de la empresa Novozymes, con el nombre Rohapec® B1L de la empresa AB Enzymes, con el nombre Pyrolase® de la empresa Diversa Corp., San Diego, CA, EE.UU y con el nombre Purabrite® de la empresa Genencor Int., Inc., Palo Alto, CA, EE.UU. Por ejemplo por la solicitud WO 99/06573 A1 se obtiene una p- glucanasa adecuada de un B. alcalophilus. La p-glucanasa obtenida de B. subtilis se puede obtener con el nombre Cereflo® de la empresa Novozymes.

Para aumentar el efecto de blanqueo, los agentes de lavado y limpieza de acuerdo con la invencion pueden contener oxidorreductasas, por ejemplo, oxidasas, oxigenasas, catalasas, peroxidasas, tales como halo-, cloro-,

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bromo-, lignina-, glucosa- o manganeso-peroxidasas, dioxigenasas o lacasas (fenoloxidasas, polifenoloxidasas). Como productos comerciales adecuados se ha de mencionar Denilite® 1 y 2 de la empresa Novozymes. Se hace referencia a la solicitud WO 98/45398 A1 como sistemas de ejemplo que se pueden emplear ventajosamente para una perhidrolisis enzimatica. El documento WO 2004/058955 A2 desvela por ejemplo colinoxidasas utiles para un sistema de este tipo. Se obtienen proteasas modificadas con actividad perhidrolasa marcada, que se puede emplear en este punto tambien de manera ventajosa, en particular para conseguir un leve blanqueo en agentes de lavado de materiales textiles, por la solicitud WO 2004/058961 A1. Un sistema de blanqueo enzimatico combinado que comprende una oxidasa y una perhidrolasa lo describe la solicitud DE 102004029475.5. Tambien el documento Wo 2005/056782 A2 describe otras perhidrolasas que se pueden emplear de acuerdo con la invencion. Ventajosamente se anaden adicionalmente compuestos preferentemente organicos, de forma particularmente preferente aromaticos, que interaccionan con las enzimas para reforzar (potenciadores) la actividad de las respectivas oxidorreductasas o para garantizar (mediadores) en caso de potenciales redox muy diferentes entre las enzimas oxidantes y los ensuciamientos el flujo de electrones.

Las enzimas empleadas en agentes de acuerdo con la invencion proceden originalmente de microorganismos, por ejemplo, de los generos Bacillus, Streptomyces, Humicola o Pseudomonas y/o se producen segun procedimientos biotecnologicos en sf conocidos por microorganismos adecuados, por ejemplo, por huespedes transgenicos de expresion de los generos Bacillus o por hongos filamentosos.

La purificacion de las respectivas enzimas se realiza, de forma adecuada, a traves de procedimientos en sf establecidos, por ejemplo, mediante precipitacion, sedimentacion, concentracion, filtracion de las fases lfquidas, microfiltracion, ultrafiltracion, accion de agentes qmmicos, accion desodorizante o combinaciones adecuadas de estas etapas.

Las enzimas pueden anadirse a los agentes de acuerdo con la invencion en cualquier forma establecida de acuerdo con el estado de la tecnica. A estas pertenecen por ejemplo las preparaciones solidas obtenidas mediante granulacion, extrusion o liofilizacion o, en particular en el caso de agentes lfquidos o en forma de gel, soluciones de las enzimas, de manera ventajosa en la medida de lo posible concentradas, escasas en agua y/o mezcladas con estabilizantes.

Como alternativa, las enzimas pueden encapsularse tanto para la forma de presentacion solida como para la forma de presentacion lfquida, por ejemplo mediante secado por pulverizacion o extrusion de la solucion de enzima junto con un polfmero, preferentemente natural o en forma de capsulas, por ejemplo aquellas en las que las enzimas estan encerradas tal como en un gel ngido o en aquellas del tipo nucleo-envuelta, en el que un nucleo que contiene enzima esta revestido con una capa protectora impermeable al agua, al aire y/o a productos qmmicos. En capas superpuestas pueden aplicarse adicionalmente otros principios activos, por ejemplo estabilizantes, emulsionantes, pigmentos, blanqueantes o colorantes. Las capsulas de este tipo se aplican de acuerdo con procedimientos en sf conocidos, por ejemplo mediante granulacion con vibracion o de rodillo o en procedimientos de lecho fluidizado. De manera ventajosa los granulados de este tipo, por ejemplo mediante aplicacion de agentes filmogenos polimericos, tienen poco polvo y son estables en almacenamiento gracias al revestimiento.

Ademas es posible confeccionar dos o varias enzimas juntas, de modo que un granulado individual presente varias actividades enzimaticas.

Una protema y/o enzima contenida en un agente de acuerdo con la invencion puede protegerse especialmente durante el almacenamiento frente a danos tales como por ejemplo inactivacion, desnaturalizacion o descomposicion por ejemplo por influencias ffsicas, oxidacion o escision proteolttica. En el caso de la obtencion microbiana de las protemas y/o enzimas se prefiere especialmente una inhibicion de la proteolisis, en particular cuando los agentes contienen tambien proteasas. Los agentes de acuerdo con la invencion preferentes pueden contener para este fin estabilizantes.

Un grupo de estabilizantes son inhibidores de proteasas reversibles. Con frecuencia se usan para esto clorhidrato de benzamidina, borax, acidos boricos, acidos boronicos o sus sales o esteres, entre ellos sobre todo derivados con grupos aromaticos, por ejemplo acidos fenilboronicos orto-sustituidos, meta-sustituidos o para-sustituidos, particularmente el acido 4-formilfenil-boronico, o las sales o esteres de los compuestos mencionados. Con este fin se emplean tambien aldehfdos de peptido, es decir, oligopeptidos con extremo C reducido, en particular los de 2 a 50 monomeros. A los inhibidores de proteasa reversibles peptfdicos pertenecen, entre otros, ovomucoide y leupeptina. Para esto son adecuados tambien inhibidores peptfdicos reversibles espedficos para la proteasa subtilisina asf como protemas de fusion de proteasas e inhibidores peptfdicos espedficos.

Otros estabilizantes de enzima son aminoalcoholes tales como mono-, di-, trietanol- y -propanolamina y mezclas de los mismos, acidos carboxflicos alifaticos hasta C12, tales como por ejemplo acido sucdnico, otros acidos dicarboxflicos o sales de los acidos mencionados. Tambien son adecuados alcoxilatos de amida de acido graso cerrados con grupos terminales para este fin. Los acidos organicos usados adecuados como soporte pueden adicionalmente estabilizar una enzima contenida, tal como se desvela en el documento WO 97/18287.

Alcoholes alifaticos inferiores, pero sobre todo polioles, tales como por ejemplo glicerol, etilenglicol, propilenglicol o

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sorbitol son estabilizantes de enzima adicionales usados con frecuencia. Tambien di-glicerinfosfato protege frente a desnaturalizacion por influencias ffsicas. Asimismo se usan sales de calcio y/o magnesio, tales como por ejemplo acetato de calcio o formiato de calcio.

Oligomeros de poliamida o compuestos polimericos tales como lignina, copolfmeros de vinilo solubles en agua o eteres de celulosa, polfmeros acnlicos y/o poliamidas estabilizan la preparacion de enzima entre otros frente a influencias ffsicas o variaciones del valor de pH. Los poffmeros que contienen poliamina-N-oxido actuan al mismo tiempo como estabilizantes de enzima y como inhibidores de la transferencia de color. Otros estabilizantes polimericos son los polioxialquilenos C8-C18 lineales. Los alquilpoliglucosidos pueden estabilizar los componentes enzimaticos del medio de acuerdo con la invencion e incluso aumentarlo con preferencia adicionalmente en su rendimiento. Los compuestos que contienen N reticulados actuan asf mismo preferentemente con funcion doble de agentes de lavado facilitado y estabilizantes de enzima. El poffmero no ionico hidrofobo estabiliza en particular una celulosa dado el caso contenida.

Los agentes de reduccion y antioxidantes aumentan la estabilidad de las enzimas frente a descomposicion oxidativa; para esto son habituales por ejemplo agentes de reduccion que contienen azufre. Otros ejemplos son sulfito de sodio y azucares reductores.

De forma particularmente preferente se usan combinaciones de estabilizantes, por ejemplo de polioles, acido borico y/o borax, la combinacion de acido borico o borato, sales reductoras y acido succmico u otros acidos dicarboxflicos o la combinacion de acido borico o borato con polioles o poliaminocompuestos y con sales reductoras. La accion de estabilizantes de peptido-aldetffdo se aumenta de manera adecuada mediante la combinacion con acido borico y/o derivados de acido borico y polioles y adicionalmente mediante el efecto adicional de cationes divalentes, tales como por ejemplo iones calcio.

Los agentes de acuerdo con la invencion en una forma de realizacion preferente estan caracterizados porque, para liberar por ejemplo los principios activos contenidos separados unos de otro en el tiempo o en el espacio, estan compuestos de mas de una fase. A este respecto se puede tratar de fases en distintos estados de agregacion, pero en particular de fases en el mismo estado de agregacion.

Los agentes de acuerdo con la invencion que estan compuestos de mas de un componente solido se pueden preparar de forma sencilla al mezclarse distintos componentes solidos, en particular polvo, granulados o extruidos, con distintos ingredientes y/o diferente comportamiento de liberacion en una forma en su totalidad suelta. La preparacion de agentes solidos de acuerdo con la invencion de una o varias fases se puede realizar de forma conocida, por ejemplo, mediante secado por pulverizacion o granulacion, anadiendose las enzimas y eventuales ingredientes sensibles a temperatura adicionales tales como, por ejemplo, agentes de blanqueo, dado el caso mas tarde por separado. Para la preparacion de agentes de acuerdo con la invencion con una elevada densidad aparente, en particular en el intervalo de 650 g/l a 950 g/l, se prefiere un procedimiento conocido por la patente europea EP 0 486 592 que presenta una etapa de extrusion. En la patente europea 0 642 576 esta descrita otra preparacion preferente con ayuda de un procedimiento de granulacion.

Las protemas se pueden emplear para agentes solidos por ejemplo en forma secada, granulada, encapsulada o encapsulada y adicionalmente secada. Se pueden anadir por separado, es decir, como fase propia, o con otros constituyentes conjuntamente en la misma fase con o sin compactacion. Si se deben procesar enzimas microencapsuladas en forma solida, entonces se puede retirar el agua con procedimientos conocidos por el estado de la tecnica de las soluciones acuosas que resultan de la preparacion, tales como secado por pulverizacion, eliminacion por centrifugado o mediante resolubilizacion. Las parffculas obtenidas de este modo tienen habitualmente un tamano de parffcula entre 50 y 200 |im.

La forma encapsulada es razonable para proteger las enzimas frente a otros constituyentes tales como, por ejemplo, agentes de blanqueo, o para posibilitar una liberacion controlada (controlled release). En funcion del tamano de estas capsulas se diferencia entre milicapsulas, microcapsulas y nanocapsulas, siendo particularmente preferentes las microcapsulas para enzimas. Otro procedimiento de encapsulacion posible consiste en que las enzimas adecuadas para el uso en agentes de lavado o limpieza, partiendo de una mezcla de la solucion enzimatica con una solucion o suspension de almidon o un derivado de almidon, se encapsulan en almidon o el derivado de almidon.

Pueden estar presentes tambien unidas entre sf al menos dos fases solidas. Asf existe una posibilidad de poner a disposicion un agente de acuerdo con la invencion solido al prensar o compactar hasta dar pastillas. Tales pastillas pueden ser mono- o polifasicas. De este modo, tambien esta forma de presentacion ofrece la posibilidad de disponer un agente de acuerdo con la invencion solido con dos fases solidas. Para la preparacion de agentes de acuerdo con la invencion en forma de pastilla que pueden ser monofasicos o multifasicos, de un color o varios colores y pueden estar compuestos en particular de una capa o de varias, preferentemente se procede de tal manera que se mezclan entre sf todos los constituyentes —dado el caso respectivamente de una capa— en una mezcladora y la mezcla se prensa mediante prensas convencionales para pastillas, por ejemplo, prensas excentricas o prensas rotativas con fuerzas de prensado en el intervalo de aproximadamente 50 a 100 kN/cm2, preferentemente de 60 a 70 kN/cm2. En particular, con pastillas multicapa puede ser ventajoso que se prense previamente al menos una capa. Esto se lleva a cabo preferentemente con fuerzas de prensado entre 5 y 20 kN/cm2, en particular de l0 a 15 kN/cm2.

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Preferentemente, una pastilla preparada de este modo presenta un peso de 10 g a 50 g, en particular de 15 g a 40 g. La forma espacial de las pastillas es discrecional y puede ser redonda, oval o angulada, siendo posibles tambien formas intermedias.

Es particularmente ventajoso que en agentes polifasicos al menos una de las fases contenga un material sensible a amilasa, en particular almidon, o este rodeada o revestida por el mismo al menos en parte. De este modo, esta fase se estabiliza mecanicamente y/o se protege frente a influencias desde el exterior y al mismo tiempo es atacada por una amilasa activa en el bano de lavado, de tal manera que se facilita la liberacion de los ingredientes.

Los agentes de acuerdo con la invencion asimismo preferentes estan caracterizados porque en su totalidad estan presentes de forma lfquida, en forma de gel o pastosa. Las protemas contenidas, preferentemente una protema de acuerdo con la invencion, se anaden a tales agentes preferentemente partiendo de una obtencion de protema llevada a cabo segun el estado de la tecnica y preparacion en solucion concentrada acuosa o no acuosa, por ejemplo, en forma lfquida, por ejemplo, como solucion, suspension o emulsion, pero tambien en forma de gel o encapsulada o como polvo secado. Tales agentes de lavado o limpieza de acuerdo con la invencion en forma de soluciones en disolventes habituales se preparan por norma general mediante simple mezcla de los ingredientes que se pueden anadir a una mezcladora automatica en sustancia o como solucion.

Una forma de realizacion de la presente invencion son los agentes lfquidos, en forma de gel o pastosos a los que se ha anadido una protema esencial para la invencion y/o una de las otras protemas contenidas y/o uno de los otros ingredientes contenidos de forma encapsulada, preferentemente en forma de microcapsulas. Entre las mismas son particularmente preferentes capsulas de material sensible a amilasa. Un uso conjunto de este tipo de materiales sensibles a amilasa y la enzima amilolttica esencial para la invencion en un agente de lavado o limpieza puede mostrar efectos de sinergia, por ejemplo, de tal manera que la enzima que escinde almidon respalda la escision de las microcapsulas y, asf, controla el proceso de liberacion de los ingredientes encapsulados, de tal manera que su liberacion no se realiza durante el almacenamiento y/o no al comienzo del procedimiento de limpieza, sino solo en un momento determinado. Sistemas complejos de agentes de lavado y limpieza con los mas diversos ingredientes y los mas diversos tipos de capsulas se pueden basar en este mecanismo, representan formas de realizacion particularmente preferentes de la presente invencion.

Se da un efecto comparable cuando los ingredientes del agente de lavado o limpieza se distribuyen en al menos dos fases diferentes, por ejemplo, dos o mas fases solidas unidas entre sf de un agente de lavado o de limpieza en forma de pastilla o distintos granulados en el interior del mismo agente en forma de polvo. Los detergentes bifasicos o polifasicos son estado de la tecnica para la aplicacion tanto en detergentes para el lavado a maquina de la vajilla como en agentes de lavado. La actividad de una enzima amilolttica en una fase activada antes es la condicion para la activacion de una fase mas tardfa cuando la misma esta rodeada por una envoltura o un revestimiento sensible a amilasa o el material sensible a amilasa representa un constituyente integral de la fase solida, durante cuya hidrolisis parcial o completa se desintegra la fase correspondiente. Por tanto, el empleo de la enzima esencial para la invencion para este fin representa una forma de realizacion preferente de la presente invencion.

Los ingredientes de agentes de lavado y limpieza pueden respaldarse de manera adecuada mutuamente en su rendimiento. El uso sinergico de amilasa e inhibidores de transferencia de color para aumentar el poder de limpieza se desvela, por ejemplo, con la solicitud WO 99/63035. Tambien es sabido que los polfmeros que se pueden emplear al mismo tiempo como cosoporte tales como, por ejemplo, alquil-poli-glucosidos, pueden estabilizar y aumentar la actividad y la estabilidad de enzimas contenidas, asf por la solicitud WO 98/45396. Asf se prefiere que una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion se modifique por uno de los otros constituyentes que se han indicado anteriormente, en particular se estabilice y/o se aumente en su contribucion al poder de lavado o de limpieza del agente. Por tanto, las formulaciones ajustadas correspondientemente para agentes de acuerdo con la invencion representan formas de realizacion particularmente preferentes de la presente invencion.

En el marco de agentes correspondientes, las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion pueden servir para la activacion de fases propias o de otras fases cuando se facilitan en solitario o junto con al menos otro principio activo con actividad de limpieza o que respalda el efecto de limpieza en un agente de lavado o de limpieza que consiste en mas de una fase. De forma correspondiente tambien pueden servir para liberar ingredientes de capsulas cuando se facilitan ellos u otro principio activo en un agente de lavado o de limpieza en forma encapsulada.

Otro objeto de la invencion lo representan procedimientos para la limpieza de materiales textiles o de superficies duras que estan caracterizados porque en al menos una de las etapas del procedimiento se activa una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion que se ha descrito anteriormente.

De hecho, en esta forma de realizacion, la invencion se realiza por el hecho de que las propiedades enzimaticas mejoradas de acuerdo con la invencion, en particular, la mayor estabilidad frente a multimerizacion, en principio favorece a cualquier procedimiento de limpieza, por ejemplo, debido a que incluso durante la aplicacion se pierde menos enzima por agregacion. Cada procedimiento de limpieza se enriquece en la correspondiente actividad cuando se anade en al menos una etapa del procedimiento. Tales procedimientos se realizan, por ejemplo, con maquinas tales como lavavajillas domesticos o lavadoras domesticas habituales. Se prefieren correspondientemente los procedimientos preferentes de acuerdo con las indicaciones que se han efectuado anteriormente.

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Ademas se prefieren tales procedimientos que estan caracterizados porque se emplea la variante de a-amilasa a traves de un agente de acuerdo con la invencion que se ha descrito anteriormente.

En particular se prefiere cualquier procedimiento que este caracterizado porque la a-amilasa se emplea en la correspondiente etapa de procedimiento en una cantidad de 0,01 mg a 400 mg por etapa de procedimiento correspondiente, preferentemente de 0,02 mg a 300 mg, de forma particularmente preferente de 0,03 mg a 100 mg.

En caso adecuado resultan a este respecto valores de concentracion de 0,0005 a 20 mg por l, preferentemente de 0,005 a 10 mg por l, de forma particularmente preferente de 0,005 a 8 mg de la protema amilolftica por l de bano de lavado. Se puede determinar la concentracion de protema con ayuda de procedimientos conocidos, por ejemplo, los procedimientos de BCA o biuret que se han mencionado anteriormente.

De forma correspondiente a las anteriores realizaciones se realiza la presente invencion tambien mediante el uso de variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion. De hecho, tambien aqu se llevan a efecto las propiedades favorables de las enzimas correspondientes. Las mismas se aplican en particular para fines de limpieza.

Por tanto, el uso de una de las variantes de a-amilasa de acuerdo con la invencion que se han descrito anteriormente para la limpieza de materiales textiles o de superficies duras representa un objeto de la invencion propio.

A este respecto se puede emplear como unico componente eficaz. Preferentemente, esto tiene lugar junto con al menos otro principio activo con actividad de limpieza o que respalda el efecto de limpieza.

Por tanto, se prefiere un uso que este caracterizado porque la variante de a-amilasa se emplea a traves de un agente de acuerdo con la invencion que se ha descrito anteriormente.

De forma adecuada, un uso de este tipo esta caracterizado porque por aplicacion, preferentemente por aplicacion en un lavavajillas o en una lavadora, se emplean de 0,01 mg a 400 mg de la variante de a-amilasa, preferentemente de 0,02 mg a 300 mg, de forma particularmente preferente de 0,03 a 100 mg.

De hecho, por esto en el bano de lavado se dan de forma adecuada los valores de concentracion que se han indicado anteriormente. Esta dosificacion se puede efectuar, en funcion del problema de limpieza, por parte del fabricante del agente o por el consumidor final.

El uso de una variante de a-amilasa de acuerdo con la invencion para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricacion de materiales textiles, en particular, para el desaprestado de algodon, representa otra forma de realizacion de la invencion.

Los materiales en bruto y productos intermedios de la produccion de materiales textiles, por ejemplo, para aquellos a base de algodon, se acaban en el marco de su produccion y procesamiento posterior con almidon para posibilitar un mejor procesamiento. Este procedimiento aplicado a hilos, a productos intermedios al igual que a materiales textiles se denomina aprestado (sizing). Para la retirada del apresto, es decir, la capa de proteccion que contiene almidon (desaprestado, desizing) son adecuadas protemas amiloltticas de acuerdo con la invencion y, de hecho, en particular debido a que estan estabilizadas durante la accion en un medio lfquido contra multimerizacion.

Los siguientes ejemplos explican adicionalmente la presente invencion.

Ejemplos

Todas las etapas de trabajo de biologfa molecular siguen procedimientos convencionales, tal como estan indicados, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, 1989, u obras pertinentes comparables. Las enzimas, cajas modulares (kits) y aparatos se emplean segun las indicaciones de los respectivos fabricantes.

Ejemplo 1

Cultivo de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)

El microorganismo Bacillus sp. A 7-7 esta depositado con el numero de deposito DSM 12368 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (
http://www.dsmz.de). Se describe en la solicitud WO 02/10356 A2. Las secuencias de ADN y de aminoacidos de la a-amilasa formada por esta especie (depositada) se diferencian en las siguientes dos posiciones de las secuencias que estan representadas en el protocolo de secuencias del documento WO 02/10356 A2: el correspondiente ADN dispone en las posiciones de acido nucleico 805-807 de acuerdo con la SEC ID N.° 1 de la presente solicitud del triple gat que codifica el aminoacido D (en la posicion de aminoacido 236) y en las posiciones 1156-1158, del triplete tat que codifica el aminoacido Y (en la posicion 353). (En la SEC ID N.° 1 o 2 del documento WO 02/10356 A2 estan indicados en los puntos correspondientes los tripletes ggt para G o tgt para C).

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A traves de procedimientos conocidos en general para la mutagenesis puntual, por ejemplo, con ayuda del kit QuickChange® de la empresa Stratagene, La Jolla, EEUU (vease mas adelante) y mediante cebadores derivados de la SEC ID N.° 1 es posible convertir esta a-amilasa en otra.

En el documento WO 02/10356 A2 se describe el cultivo de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). Un medio adecuado es medio YPSS, que contiene almidon soluble 15 g/l, extracto de levadura 4 g/l, K2HPO41 g/l y MgSO4 x 7 H2O 0,5 g/l, ajustandose el valor de pH despues del tratamiento con autoclave con solucion al 20 % de carbonato sodico a 10,3. A partir de esto se puede obtener la correspondiente a-amilasa, tal como esta representado en el documento WO 02/10356 A2. Por tanto, esta a-amilasa y las variantes derivadas de la misma se pueden preparar a traves de procedimientos conocidos en general al menos a escala de laboratorio.

Ejemplo 2

Modelado de homologia y seleccion de aminoacidos sustituibles de acuerdo con la invencion Modelado de homologia

El modelado de homologfa se llevo a cabo para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) como se representa en la descripcion a traves del banco de datos de protema RSCB (accesible a traves del Centro Max-Delbruck en Berlin, Alemania). A este respecto, en la busqueda con la secuencia de protema se hallaron las siguientes estructuras: la a-amilasa de B. licheniformis (entrada en banco de datos RCSB-PDB: 1 BLI), una a-amilasa quimerica de las de B. amyloliquefaciens y B. licheniformis en estructura nativa (1E3X, 1 E43), un complejo de acarbosa de la misma a-amilasa quimerica (1E3Z), un complejo de tris/maltotriosa de la misma a-amilasa quimerica (1E40) y una variante estabilizada cineticamente de la a-amilasa de B. licheniformis (1OB0).

Mediante superposicion (superimposicion) de estas estructuras en el SwissPDB-viewer se creo una estructura grna sobre la que se modelo despues la secuencia de protema de ALBA. A continuacion se corrigio la orientacion de las cadenas laterales en la estructura ALBA y se llevo a cabo una minimizacion de energfa. Las etapas individuales se pueden obtener del manual de usuario mencionado y se realizaron de acuerdo con los ajustes convencionales del programa.

En total, en la superficie de molecula que comprende 484 aminoacidos se encuentran los siguientes 407 aminoacidos (se definen como tales a traves de una accesibilidad de al menos 1; en cuanto a la accesibilidad: vease la descripcion y la siguiente seccion):

T5, N6, G7, T8, M9, Q11, Y12, E14, W15, Y16, L17, P18, N19, D20, G21, N22, H23, W24, N25, R26, R28, S29, D30, A31, S32, N33, K35, D36, K37, G38, I39, T40, A41, W43, P46, A47, W48, K49, G50, A51, S52, Q53, N54, D55, V56, G57, Y58, G59, A60, Y61, D62, L63, Y64, L66, G67, E68, F69, N70, Q71, K72, G73, T74, V75, R76, T77, K78, Y79, G80, T81, R82, N83, Q84, L85, Q86, A87, V89, T90, A91, K93, S94, N95, G96, Q98, V99, Y100, V103, M105, N106, H107, K108, G110, A111, D112, A113, T114, E115, W116, V117, R118, V120, E121, V122, N123, P124, S125, N126, R127, N128, Q129, E130, V131, S132, G133, D134, Y135, T136, 1137, E138, W140, K142, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, N150, T151, H152, S153, N154, F155, K156, W157, R158, W159, Y160, H161, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, L173, Q174, N175, R176, I177, Y178, K179, R181, G182, D183, G184, K185, G186, W187, W189, E190, V191, D192, T193, E194, N195, G196, N197, Y198, D199, Y200, L201, M202, Y203, I206, D207, M208, D209, H210, P211, E212, V214, N215, E216, L217, R218,

N219, V222, W223, T225, N226, T227, L228, G229, L230, D231, F233, R234, I235, G236, A237, K239, H240,

1241, K242, Y243, S244, F245, T246, R247, D248, W249, L250, T251, H252, V253, R254, N255, T256, T257, G258, K259, N260, M261, F262, A263, E266, F267, W268, K269, N270, D271, I272, G273, A274, I275, E276,

N277, S280, K281, N283, W284, N285, H286, S287, V288, F289, P292, L293, Y295, N296, L297, Y298, N299,

S301, R302, S303, G304, G305, N306, Y307, D308, M309, R310, Q311, 1312, F313, N314, G315, V318, Q319,

R320, H321, P322, T323, H324, T327, F328, V329, D330, N331, H332, D333, Q335, P336, E337, E338, A339,

L340, E341, S342, F343, E345, E346, W347, F348, K349, P350, L351, C353, L355, T356, L357, R359, D360,

Q361, G362, Y363, S365, V366, F367, Y368, D370, Y371, Y372, G373, I374, P375, T376, H377, G378, P380, A381, M382, K383, S384, K385, I386, D387, P388, L390, E391, R393, Q394, K395, Y396, Y398, G399, K400, Q401, N402, D403, Y404, L405, D406, H407, H408, N409, M410, R415, E416, G417, N418, T419, A420, H421,

P422, N423, S424, M430, D432, G433, P434, G435, G436, N437, K438, W439, Y441, G443, R444, N445, K446,

A447, G448, Q449, V450, W451, R452, D453, I454, T455, G456, N457, R458, S459, G460, T461, V462, T463, I464, N465, A466, D467, W469, N471, S473, V474, N475, G476, G477, S478, V479, V483, N484, N485.

Calculo de los restos de aminoacido de superficie con una contribucion al potencial electrostatico de toda la molecula

Al establecimiento de la estructura tridimensional le siguio un calculo de las respectivas contribuciones de los aminoacidos situados en la superficie para el potencial electrostatico de toda la molecula. Tambien este calculo se realizo como se representa en la descripcion con la correspondiente funcion del SwissPDB-viewer mencionado con parametros convencionales. Tales contribuciones se ejercen por restos de aminoacido tanto neutros como de carga negativa al igual como por aquellos que por sf mismos son neutros, pero cubren una carga situada mas en el interior

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de la molecula. Por tanto, se trata de una proyeccion de las cargas sobre la superficie de la molecula.

En la Figura 1 se muestra el resultado de esto: alK se reconoce la representacion tridimensional de la superficie de Conolly del a-amilasa de Bacillus sp A 7-7 (DSM 12368), estando resaltada la distribucion de carga y polaridad con color (blanco, gris y negro). En total, los siguientes 118 restos de aminoacido de la molecula de a-amilasa de Bacillus sp A 7-7 (DSM 12368) realizan una contribucion positiva o neutra al potencial electrostatico de la superficie:

T5, N6, G7, T8, N19, G21, N22, H23, N25, R26, R28, S29, A31, S32, N33, K35, K37, G38, K49, Q53, L66, K72, T74, V75, R76, K78, T81, R82, N83, Q84, L85, Q86, A87, V89, T90, A91, K93, S94, N95, G96, Q98, K108, R118, T136, K142, G149, N150, T151, H152, N154, K156, R158, Y160, H161, R171, Q172, R176, R181, R218, T227,

L228, G229, K242, R247, T251, R254, K259, N260, K281, N283, R302, R310, R320, T323, R359, Y368, Y372,

T376, K383, K385, R393, Q394, K395, Y398, G399, K400, Y404, M410, R415, G417, N418, T419, A420, H421,

P422, G435, G436, K438, W439, R444, N445, K446, Q449, V450, R452, R458, S459, G460, T461, V462, T463,

N465, A466, N471, S473, N475, G476, N484.

Calculo de la susceptibilidad de disolvente (accesibilidad)

Basandose en estos resultados se llevo a cabo ahora el calculo de la susceptibilidad de disolvente (accesibilidad) de los restos de aminoacido que se encuentran en la superficie que se han descrito anteriormente, que realizan una contribucion positiva o neutra a la carga o polaridad de toda la molecula. Para esto, a su vez se empleo el SwissPdb- viewer que ya se ha mencionado, conservando los parametros convencionales del programa. Por ello se establecieron los siguientes restos de aminoacido, estando indicados los valores para la accesibilidad de disolvente respectivamente en % entre parentesis detras de las posiciones mencionadas:

T5 (39), N6 (12), G7 (13), N19 (28), N22 (28), N25 (16), R26 (27), R28 (39), S29 (38), S32 (28), N33 (28), K35 (37), K37 (18), Q53 (12), K72 (27), V75 (30), R76 (24), T81 (16), R82 (22), N83 (44), Q84 (24), Q86 (18), A87 (18), T90 (30), A91 (11), K93 (32), S94 (50), N95 (19), G96 (25), Q98 (29), R118 (41), T136 (22), K142 (30), G149 (14), N150 (39), T151 (22), H152 (27), N154 (41), K156 (30), R158 (33), Y160 (20), R171 (32), Q172 (53), R176 (41), R181 (34), R218 (18), T227 (19), G229 (14), K242 (15), R247 (20), T251 (23), R254 (15), K259 (26), N260 (49), K281 (33), N283 (40), R302 (50), R310 (31), R320 (52), T323 (49), R359 (13), Y368 (12), Y372 (37), T376 (56), K383 (19), K385 (37), Q394 (20), K395 (38), G399 (16), K400 (44), Y404 (11), G417 (11), N418 (25), T419 (59), A420 (37), H421 (16), P422 (46), G435 (25), G436 (17), W439 (47), R444 (49), N445 (41), Q449 (31), V450 (24), R452 (33), R458 (24), S459 (52), G460 (32), T461 (35), T463 (40), N465 (22), A466 (37), N471 (20), S473 (10), N475 (25), G476 (31), N484 (12).

Por tanto, estos son los 97 restos de aminoacido de la molecula de a-amilasa que comprende en total 484 aminoacidos de Bacillus sp A 7-7 (DSM 12368), que realizan una contribucion positiva o neutra al potencial electrostatico de la superficie y presentan adicionalmente una accesibilidad de al menos el 10 %.

Los demas 21 aminoacidos de superficie que se habfan establecido previamente como aquellos con una contribucion neutra o positiva, pero que poseen una accesibilidad menor del 10%, son los siguientes, estando indicado el correspondiente valor a su vez entre parentesis:

T8 (2), G21 (4), H23 (2), A31 (2), G38 (6), K49 (2), L66 (2), T74 (6), K78 (6), L85 (2), V89 (1), K108 (9), H161 (1), L228 (1), R393 (5), Y398 (4), M410 (3), R415 (6), K438 (7), K446 (5), V462 (5).

Agrupacion de los restos de aminoacido cargados de forma neutra o positiva o polarizados y particularmente accesibles para el disolvente

Los 97 restos identificados con una accesibilidad de al menos el 10 % se pueden asignar segun su ubicacion en la superficie de esta a-amilasa a distintos grupos, representando las zonas relacionadas respectivamente con los grupos A y B la polaridad o carga neutra o positiva. El siguiente Grupo A comprende los 63 restos de aminoacido entre los mismos que forman una superficie relacionada con potencial electrostatico neutro o positivo (a su vez, entre parentesis la accesibilidad determinada previamente):

A) T5 (39), N6 (12), G7 (13), N19 (28), N22 (28), N25 (16), R26 (27), R28 (39), S29 (38), S32 (28), N33 (28), K35 (37), K37 (18), Q53 (12), K72 (27), V75 (30), R76 (24), T81 (16), R82 (22), N83 (44), Q84 (24), Q86 (18), A87 (18), T90 (30), A91 (11), K93 (32), S94 (50), N95 (19), G96 (25), Q98 (29), R118 (41), T136 (22), K142 (30), G149 (14), N150 (39), T151 (22), H152 (27), N154 (41), K156 (30), R158 (33), Y160 (20), R171 (32), Q172 (53), R181 (34), T227 (19), G229 (14), R247 (20), T251 (23), R254 (15), K259 (26), N260 (49), K281 (33), N283 (40), Q394 (20), K395 (38), G399 (16), K400 (44), G417 (11), N418 (25), T419 (59), A420 (37), H421 (16), P422 (46).

El siguiente Grupo B comprende los 20 restos de aminoacido que forman una segunda superficie relacionada con potencial electrostatico neutro o positivo:

(B) G435 (25), G436 (17), W439 (47), R444 (49), N445 (41), Q449 (31), V450 (24), R452 (33), R458 (24), S459 (52), G460 (32), T461 (35), T463 (40), N465 (22), A466 (37), N471 (20), S473 (10), N475 (25), G476 (31), N484 (12).

El siguiente Grupo C comprende los 14 restos de aminoacido restantes que no se pueden asignar a ninguna de estas dos superficies de mayor tamano, sino que aparecen de manera aislada:

(C) R176 (41), R218 (18), K242 (15), R302 (50), R310 (31), R320 (52), T323 (49), R359 (13), Y368 (12), Y372 (37), T376 (56), K383 (19), K385 (37), Y404 (11).

5 En particular de los aminoacidos que pertenecen a los Grupos A y B se puede asumir que sus contribuciones a una carga de superficie relacionada contribuyen a la tendencia observada a di- y/o multimerizacion mediada por carga y/o polaridad y, por tanto, a la agregacion.

Ejemplo 3

Mutagenesis dirigida

10 Las posiciones establecidas en el anterior ejemplo sirven para la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) como punto de partida para mutaciones puntuales a traves de mutagenesis dirigida, es decir, para la introduccion de otro aminoacido para la correspondiente posicion o posiciones. Se lleva a cabo, por ejemplo, con ayuda del kit QuikChange (empresa Stratagene, n.° de cat. 200518) segun el protocolo correspondiente. Los cebadores se pueden disenar mediante las secuencias de ADN y aminoacidos indicadas en la SEC ID N.°: 1, modificandose el 15 respectivo codon de manera correspondiente al aminoacido que se debe introducir. En este caso, para la generacion de una polaridad o carga menos neutra o positiva, es decir, para la introduccion de una polaridad o carga mas bien negativa, son posibles las siguientes sustituciones de aminoacidos:

Aminoacido de partida

por

Arg (R)

K, Y, C, H, G, A, V, L , I, M, F, W, P, S, T, jZ P m O D

Lys (K)

Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q o LU d

Tyr (Y)

C, H, G, A, V, L, I, M, F, W P, S, T, N, Q, Q o LU

Cys (C)

H, G, A, V, L, I, M, F, W P S, T, N, Q, E o D

His (H)

G A, V, L, I, M, F, W, P, S T, N, Q, E o D

Gly (G)

A, V, L, I, M, F , W, P, S, T, N, Q, E o D

Ala (A)

V, L, I, M, F , W, P, S, T, N, Q, E o D

Val (V)

L, I, M, F , W, P, S, T, N, Q, E o D

Leu (L)

I, M, F, W, P, S, T, N, Q E o D

Ile (I)

M F, W P S , T, N, Q, E o D

Met (M)

F, W P S, T, N, Q, E o D

Phe (F)

W P S , T, N o LU O D

Trp (W)

P, S, T, N, Q, E o D

Pro (P)

S, T, N, Q, E o D

Ser (S)

T, N, Q, E o D

Thr (T)

N, Q, E o D

Asn(N)

Q E o D

Gln (Q)

E o D

Glu (E)

D

Para esto, por tanto, el codon en la secuencia genica de la correspondiente a-amilasa se sustituye por un codon del 20 aminoacido que se debe introducir. Segun este principio de manera adecuada se mutageniza correspondientemente un vector de expresion que contiene la secuencia de a-amilasa y segun procedimientos conocidos en general se introduce mediante transformacion en una cepa de expresion, en el presente ejemplo en B. subtilis.

Ejemplo 4

Obtencion y purificacion de las mutantes de amilasa

El cultivo de cepas de B. subtilis positivas a amilasa se realiza en el medio YPSS mencionado en el Ejemplo 1. Esta forma de proceder asf como la purificacion de la enzima formada por estas cepas se realiza de acuerdo con la 5 descripcion en el documento WO 02/103562 A2. A partir de esto se obtiene tambien la determinacion de la actividad amilolttica de la enzima purificada de acuerdo con el denominado procedimiento DNS. A continuacion, la actividad que se puede determinar de este modo sirve como parametro para la estabilidad de la enzima en condiciones respectivamente distintas.

Determinacion de la formacion de agregados

10 La formacion de multfmeros y la precipitacion se comprobaron mediante el enturbiamiento de una solucion que contiene amilasa con un contenido de amilasa de al menos 5 mg/ml mediante espectrometna con una longitud de onda de 600 nm. Los mutantes de acuerdo con la invencion muestran una menor tendencia a la formacion de precipitado despues de incubacion de 16 horas en la concentracion de al menos 5 mg/ml de protema en tampon o medio de cultivo a 25 °C, que se manifiesta en un menor aumento de la absorcion a 600 nm.

15 Descripcion de las figuras

Figura 1: representacion de la distribucion de carga y polaridad en la superficie de Conolly de la a-amilasa de

Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

La representacion se creo con ayuda del Swiss-Pdb-viewer (Swiss Institute of Bioinformatics;
http://us.expasy. org/spdbv/; detalles: vease texto).

20 Codificacion de color:

gris: carga o polarizacion negativa

blanco: carga o polarizacion neutra negro: carga o polarizacion positiva

La superficie posterior de la molecula que no se puede ver en esta representacion, que contiene tambien el centro activo, presenta de forma continua un patron de carga negativa.

Figura 2: alineamiento de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; SEC ID N.° 2) con las otras a-amilasas

mas importantes del estado de la tecnica, respectivamente a lo largo de la zona de la protema madura, 25 es decir, en las posiciones 32 a 516 de acuerdo con la SEC ID N.° 2.

El recuento individual se puede seguir mediante el numero de posicion indicado al comienzo de cada lmea detras del respectivo nombre para el primer aminoacido mostrado en cada caso:

Allf significan:

A 7-7: a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; SEC ID N.° 2)

S707: a-amilasa de Bacillus sp. n.° 707

LAMY: a-amilasa de Bacillus sp. KSM-AP1378

BAA: a-amilasa de B. amyloliquefaciens

BLA: a-amilasa de B. licheniformis

BStA: a-amilasa de B. stearothermophilus

MK716: a-amilasa de Bacillus sp. MK716

TS-23: a-amilasa de Bacillus sp. TS-23

K38: a-amilasa de Bacillus KSM-K38

30 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

<120> Variantes de alfa-amilasa estabilizadas frente a di- y/o multimerizacion, procedimiento para su produccion 35 asf como agentes de lavado y de limpieza con estas variantes de alfa-amilasa

5

10

15

20

25

30

<130> H 06466 PCT <150> DE102004047776.0 <151> <160>2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211>1554 <212> ADN

<213> Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)

<220>

<221> gen <222> (1)..(1554)

<223> Alfa-Amilasa

<220>

<221> CDS <222> (1)..(1551)

<223>

<220>

<221> mat_peptide <222> (100)..()

<223>

<400> 1

atg acg atg aga aaa cgt aaa aat gga tta ate agt att eta ttg gca 48

Mat Thr Met Arg Lys Arg Lys Asn Gly Leu He Ser lie Leu Leu Ala

-30 -25 -20

ttt ttg ttg gta ett aca tea ata cct ttt act tea gca aac gta gaa 96

Phe Leu' Leu Val Leu Thr Ser lie Pro Phe Thr Ser Ala Asn Val Glu

-15 -10 . -5

gca cac cat aat ggc aca aat gga aca atg atg caa tat ttt gaa tgg 144

Ala His His Asn Gly Thr. Asn Gly Thr Met Met Gin Tyr Phe Glu Trp

-11 5 10 .15

tat ttg cca aat gac ggt aat cat tgg aat aga tta aga tea gat gca 192

Tyr Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala

20 25 30

agt aat ett aaa gat aaa ggg att aca geg gtt tgg att cca cet get 240

Ser Asn Leu Lys Asp Lys Gly He Thr Ala Val Trp lie Pro Pro Ala

Claims (43)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Variante de a-amilasa con al menos una sustitucion de aminoacido con respecto a la molecula de partida, en la que en el caso de la sustitucion de aminoacido un resto de aminoacido de la molecula de partida situado sobre la superficie de la molecula y que ejerce una contribucion neutra o de polaridad positiva o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula se ha sustituido con un resto de aminoacido mas negativamente polar o mas negativamente cargado, siendo posibles las siguientes sustituciones de aminoacido:

   Aminoacido de partida

   por

   Arg (R)

   K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Lys (K)

   Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Tyr (Y)

   C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Cys (C)

   H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   His (H)

   G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Gly (G)

   A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Ala (A)

   V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Val (V)

   L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Leu (L)

   I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Ile (I)

   M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Met (M)

   F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Phe (F)

   W, P, S, T, N, Q, E o D

   Trp (W)

   P, S, T, N, Q, E o D

   Pro (P)

   S, T, N, Q, E o D

   Ser (S)

   T, N, Q, E o D

   Thr (T)

   N, Q, E o D

   Asn(N)

   Q, E o D

   Gln (Q)

   E o D

   Glu (E)

   D

   y encontrandose el resto de aminoacido mencionado en una posicion que pertenece a uno de los dos siguientes grupos:

   (A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o

   (B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471,473, 475, 476 y 484,

   en cada caso indicados en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2, tratandose en el caso de la molecula de partida de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de aminoacidos es identica en un 100 % a la secuencia de aminoacidos indicada en la SEC ID N.° 2 en las posiciones +1 a 484.
2. 2. Variante de a-amilasa de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el resto de aminoacido mencionado antes de la sustitucion de aminoacido presenta una accesibilidad de al menos un 10 %, preferentemente de al menos un 20 %, de manera especialmente preferente de al menos un 30 %, calculandose la accesibilidad del resto de aminoacido en cuestion sobre una escala del 0 % al 100 %, significando un valor del 0 % de accesibilidad que el resto en cuestion no es accesible para el disolvente, y el 100 % representa la accesibilidad posible en un pentapeptido hipotetico GGXGG.
3. 3. Variante de a-amilasa de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, encontrandose el resto de aminoacido mencionado en una zona neutra o positivamente polarizada o cargada de al menos dos restos de aminoacido directamente adyacentes sobre la superficie.
4. 4. Variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que se han realizado varias de las sustituciones de aminoacido mencionadas, preferentemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, de manera especialmente preferente entre 10 y 30 y de manera muy especialmente preferente entre 15 y 25.
5. 5. Variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que para la reduccion de la variacion de carga total en al menos una a como maximo exactamente tantas otras posiciones como las del grupo

   (A) o (B) se ha sustituido o se han sustituido uno o varios restos de aminoacido de la molecula de partida situados sobre la superficie de la molecula con restos de aminoacido menos negativamente polares o menos negativamente cargados, siendo posibles en cada caso las siguientes sustituciones de aminoacido:

   5

   10

   15

   20

   25

   Aminoacido de partida

   por

   K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Arg (R)

   Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Lys (K)

   C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Tyr (Y)

   H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Cys (C)

   G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   His (H)

   A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Gly (G)

   V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Ala (A)

   L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Val (V)

   I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Leu (L)

   M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Ile (I)

   F, W, P, S, T, N, Q, E o D

   Met (M)

   W, P, S, T, N, Q, E o D

   Phe (F)

   P, S, T, N, Q, E o D

   Trp (W)

   S, T, N, Q, E o D

   Pro (P)

   T, N, Q, E o D

   Ser (S)

   N, Q, E o D

   Thr (T)

   Q, E o D

   Asn(N)

   E o D

   Gln (Q)

   D

   Glu (E)

6. 6. Variante de a-amilasa de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la sustitucion o las sustituciones realizadas para la reduccion de la variacion de carga total se ha realizado o se han realizado en una posicion o en posiciones de aminoacido que no pertenece o no pertenecen a las siguientes:

   (A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422 o

   (B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484 o

   (C) 176, 218, 242, 302, 310, 320, 323, 359, 368, 372, 376, 383, 385 y 404,

   en cada caso indicadas en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.
7. 7. Variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que en el caso de la molecula de

   partida se trata de una variante de a-amilasa con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11

   mutaciones puntuales adicionales.
8. 8. Variante de a-amilasa de acuerdo con la reivindicacion 7 con las mutaciones puntuales adicionales en una o varias de las siguientes posiciones: 5, 167, 170, 177, 202, 204, 271, 330, 377, 385 y 445, en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.
9. 9. Variante de a-amilasa de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que se trata de las siguientes mutaciones puntuales: 5A, 167R, 170P, 177L, 202L, 204V, 271D, 330D, 377R, 385S y/o 445Q.
10. 10. Procedimiento para aumentar la estabilidad de una a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) frente a una dimerizacion y/o multimerizacion mediada por interacciones electrostaticas, mediante lo cual al menos un resto de aminoacido de la molecula de partida situado sobre la superficie de la molecula y que ejerce una contribucion neutra o de polaridad positiva o de carga positiva al potencial electrostatico de la molecula se ha sustituido con un resto de aminoacido mas negativamente polar o mas negativamente cargado, siendo posibles las siguientes sustituciones de aminoacido:

    aminoacido de partida

    por

    Arg (R)

    K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Lys (K)

    Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Tyr (Y)

    C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Cys (C)

    H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    His (H)

    G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Gly (G)

    A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Ala (A)

    V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Val (V)

    L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Leu (L)

    I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Ile (I)

    M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Met (M)

    F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    5

    10

    15

    20

    25

    (continuacion)

    aminoacido de partida

    por

    Phe (F)

    W, P, S, T, N, Q, E o D

    Trp (W)

    P, S, T, N, Q, E o D

    Pro (P)

    S, T, N, Q, E o D

    Ser (S)

    T, N, Q, E o D

    Thr (T)

    N, Q, E o D

    Asn(N)

    Q, E o D

    Gln (Q)

    E o D

    Glu (E)

    D

    y encontrandose el resto de aminoacido mencionado en una posicion que pertenece a uno de los dos siguientes grupos:

    (A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422; o

    (B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484,

    en cada caso indicados en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2, tratandose en el caso de la molecula de partida de la a-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), cuya secuencia de aminoacidos es identica en un 100 % a la secuencia de aminoacidos indicada en la SEC ID N.° 2 en las posiciones +1 a 484.
11. 11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el resto de aminoacido mencionado antes de la sustitucion de aminoacido presenta una accesibilidad de al menos un 10 %, preferentemente de al menos un 20 %, de manera especialmente preferente de al menos un 30 %, calculandose la accesibilidad del resto de aminoacido en cuestion sobre una escala del 0 % al 100 %, significando un valor del 0 % de accesibilidad que el resto en cuestion no es accesible para el disolvente, y el 100 % representa la accesibilidad posible en un pentapeptido hipotetico GGXGG.
12. 12. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el resto de aminoacido mencionado se encuentra en una zona neutra o positivamente polarizada o cargada de al menos dos restos de aminoacido directamente adyacentes sobre la superficie.
13. 13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que se realizan varias de las sustituciones de aminoacido mencionadas, preferentemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, de manera especialmente preferente entre 10 y 30 y de manera muy especialmente preferente entre 15 y 25.
14. 14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 13, segun el cual para la reduccion de la variacion de carga total en al menos una a como maximo exactamente tantas otras posiciones como las del grupo (A) o (B) se ha sustituido o se han sustituido uno o varios restos de aminoacido de la molecula de partida situados sobre la superficie de la molecula distintos con restos de aminoacido menos negativamente polares o menos negativamente cargados, siendo posibles en cada caso las siguientes sustituciones de aminoacido:

    aminoacido de partida

    por

    K, Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Arg (R)

    Y, C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Lys (K)

    C, H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Tyr (Y)

    H, G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Cys (C)

    G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    His (H)

    A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Gly (G)

    V, L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Ala (A)

    L, I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Val (V)

    I, M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Leu (L)

    M, F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Ile (I)

    F, W, P, S, T, N, Q, E o D

    Met (M)

    W, P, S, T, N, Q, E o D

    Phe (F)

    P, S, T, N, Q, E o D

    Trp (W)

    S, T, N, Q, E o D

    Pro (P)

    T, N, Q, E o D

    Ser (S)

    N, Q, E o D

    Thr (T)

    Q, E o D

    Asn(N)

    E o D

    Gln (Q)

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    (continuacion)

    aminoacido de partida

    por

    D

    Glu (E)

15. 15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que la sustitucion o las sustituciones realizadas para la reduccion de la variacion de carga total se realiza o se realizan en una posicion o en posiciones de aminoacido que no pertenece o no pertenecen a las siguientes:

    (A) 5, 6, 7, 19, 22, 25, 26, 28, 29, 32, 33, 35, 37, 53, 72, 75, 76, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 90, 91, 93, 94, 95, 96, 98, 118, 136, 142, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 158, 160, 171, 172, 181, 227, 229, 247, 251, 254, 259, 260, 281, 283, 394, 395, 399, 400, 417, 418, 419, 420, 421 y 422 o

    (B) 435, 436, 439, 444, 445, 449, 450, 452, 458, 459, 460, 461, 463, 465, 466, 471, 473, 475, 476 y 484 o

    (C) 176, 218, 242, 302, 310, 320, 323, 359, 368, 372, 376, 383, 385 y 404,

    en cada caso indicadas en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.
16. 16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 15, en el que en el caso de la molecula de partida se trata de una variante de a-amilasa con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones puntuales adicionales.
17. 17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que la a-amilasa introducida es una variante de a- amilasa con las mutaciones puntuales adicionales en una o varias de las siguientes posiciones: 5, 167, 170, 177, 202, 204, 271, 330, 377, 385 y 445, en la numeracion de la protema madura de acuerdo con la SEC ID N.° 2.
18. 18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que se trata de las siguientes mutaciones puntuales: 5A, 167R, 170P, 177L, 202L, 204V, 271D, 330D, 377R, 385S y/o 445Q.
19. 19. Acido nucleico que codifica una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9.
20. 20. Acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 19, que se deriva de un acido nucleico de acuerdo con la SEC ID N.° 1, o de una variante del mismo con, con preferencia creciente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones puntuales adicionales con respecto a aquellas mutaciones que llevan a una de las sustituciones de aminoacido designadas con las reivindicaciones 1 o 6.
21. 21. Vector que contiene un acido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 19 o 20, preferentemente un vector de clonacion o un vector de expresion.
22. 22. Celula que despues de modificacion mediante ingeniena genetica contiene uno de los acidos nucleicos designados en las reivindicaciones 19 o 20.
23. 23. Celula de acuerdo con la reivindicacion 22, en la que el acido nucleico mencionado es parte de un vector, en particular de un vector de acuerdo con la reivindicacion 21.
24. 24. Celula de acuerdo con las reivindicaciones 22 o 23, en la que se trata de una bacteria, en particular de una que secreta la variante de a-amilasa formada al medio circundante.
25. 25. Celula de acuerdo con la reivindicacion 24, en donde se trata de una bacteria Gram negativa, en particular de una de los generos Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, en particular de cepas de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy especialmente se trata de derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).
26. 26. Celula de acuerdo con la reivindicacion 24, en donde se trata de una bacteria Gram positiva, en particular de una de los generos Bacillus, Staphylococcus o Corynebacterium, muy especialmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum, y entre ellas a su vez de manera muy especialmente preferente se trata de un derivado de B. licheniformis DSM 13.
27. 27. Procedimiento de produccion biotecnologico para la produccion de una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9.
28. 28. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 27, con el uso de un acido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 o 20, de manera especialmente preferente con el uso de un vector de acuerdo con la reivindicacion 21, de manera muy especialmente preferente con el uso de una celula de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 a 26.
29. 29. Agente que contiene una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35
30. 30. Agente de acuerdo con la reivindicacion 29, en donde se trata de un agente de lavado o de limpieza.
31. 31. Agente de lavado o de limpieza de acuerdo con la reivindicacion 30, que contiene del 0,000001 por ciento en peso al 5 % en peso, en particular del 0,00001 al 3 % en peso de la variante de a-amilasa.
32. 32. Agente de lavado o de limpieza de acuerdo con las reivindicaciones 30 o 31, que contiene adicionalmente otras enzimas, en particular enzimas hidrolfticas u oxidorreductasas, de manera especialmente preferente otras amilasas, proteasas, lipasas, cutinasas, hemicelulasas, celulasas, p-glucanasas, oxidasas, peroxidasas, perhidrolasas y/o lacasas.
33. 33. Agente de lavado o de limpieza de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 32, en el que la variante de a- amilasa, mediante uno de los otros constituyentes del agente se estabiliza y/o aumenta su contribucion al poder de lavado o de limpieza del agente.
34. 34. Agente de lavado o de limpieza de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 33, que en conjunto es solido, preferentemente despues de una etapa de compactacion para al menos uno de los componentes contenidos, de manera especialmente preferente, que en conjunto esta compactado.
35. 35. Agente de lavado o de limpieza de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 34, que en conjunto es lfquido, en forma de gel o pastoso, preferentemente con encapsulacion para al menos uno de los componentes contenidos, de manera especialmente preferente con encapsulacion de al menos una de las enzimas contenidas, de manera muy especialmente preferente con encapsulacion de la variante de a-amilasa.
36. 36. Procedimiento para la limpieza de materiales textiles o de superficies duras, en el que al menos a una de las etapas de procedimiento se anade una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 y se activa.
37. 37. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 36, en el que la variante de a-amilasa se usa por medio de un agente de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 35.
38. 38. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 36 o 37, en el que la a-amilasa en la etapa de procedimiento en cuestion se usa en una cantidad de 0,01 mg a 400 mg por etapa de procedimiento correspondiente, preferentemente de 0,02 mg a 300 mg, de manera especialmente preferente de 0,03 mg a 100 mg.
39. 39. Uso de una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para la limpieza de materiales textiles o de superficies duras.
40. 40. Uso de acuerdo con la reivindicacion 39, en el que la variante de a-amilasa se usa por medio de un agente de acuerdo con una de las reivindicaciones 30 a 35.
41. 41. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 39 o 40, en el que por aplicacion, preferentemente por aplicacion en una maquina lavavajillas o en una lavadora, se usan de 0,01 mg a 400 mg de la variante de a-amilasa, preferentemente de 0,02 mg a 300 mg, de manera especialmente preferente de 0,03 mg a 100 mg.
42. 42. Uso de una variante de a-amilasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricacion de material textil, en particular para el desaprestado de algodon.

    imagen1

    Gris oscuro: zona negativa

    Resto

    individualizado con potencial positivo

    Blanco y negro:

    zona neutra o positiva

    relacionada

    •' 1 . . 50

    A 7-7 (1) -hhngtngtmmqyfewylpndgnhwnrlrsdasnlkdkgitavwippawk

    S707 . (1) -HHNGTNGTMMQY FEWY LPN DGNHWNRLNS DASNLKSKGITAVWIP PAW K

    LAMY (1) -HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDAANLKSKGITAVWIPPAWK

    ■ BAA (1) VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYK

    BLA (1) ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYK

    BStA (1) --AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYK

    MK716 (1) —AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYK .

    TS-23 (1) ANTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYK

    K38. U) --ADGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAAALSDAGITAIWIPPAYK

    . 51 . 100

    (50) GASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRNQLQAAVTALKSNGIQV.

    (50) GASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQAAVTSLKNNGIQV {50) GTSQNDVGYGAYDLY DLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQGAVTSLKNNGIQV (46) GLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQV

    (48) GTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINV

    (49) GTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGAVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQV ' (49) GTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGAVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQV

    (51) . GTSQSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQV (49) GNSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINV

    101 ■ ’ . 150

    A 7-7 (100) YGDWMNHKGGADATEWVRAVEVNPSNRNQEVSGDYTIEAWTKFDFPGRG

    S707 (100) YGDVVMNHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVTGEYTIEAWTRFDFPGRG

    LAMY (100) YGDVVMNHKGGADGTEMVNAVEVNRSNRNQEISGEYTIEAWTKFDFPGRG ‘ BAA (96) Y.GDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQ1KAWTDFRFPGRG BLA (98) YGPVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHRIKAWTHFHFPGRG BStA (99) YADWFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRG MK716 (99) YADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRG

    TS-23 (101) YADVVFNHKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRG

    K38 " (99) YGDVVMNHKMGADFTEAVQAVQVNPTNRWQDISGAYTIDAWTGFDFSGRN .

    ISl 200

    A 7-7 (150) N T H SN FKW RW Y H FDGV DW DQS RQLQN RIYKFRGDGKGWDWEVDTENGNYD

    S707 (150) NTHSSFKWRWYHFDGVDWDQSRRLNNRIYKFRGHGKAWDWEVDTENGNYD

    LAMY (150) NTHSNFKWRWYHFDGTDWDQSRQLQNKIYKFRGTGKAWDWEVDIENGNYD ‘ BAA (146) NTYSDFKWHWYHFDGADWDESRK-ISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYD BLA (148) STYSDFKWHWYHFDGTDWDESRK-LNRIYKFQG—KAWDWEVSNENGNYD BStA (149) NTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRK-LSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYD MK716 (149) NTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRK-LSRXYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYD

    TS-23 (151) NTYSSFKWRWYHFDGTDWDESRK-LNRIYKFRSTGKAWDWEVDTEHGNY-D

    K38 (149) NAYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQ-ENHIFRFAN—TNWNWRVDEENGNYD

    A 7-7 S707 LAMY BAA BLA . BStA MK716 TS-23 . K38

    . 201 . 250

    A 7-7 (200) YLMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDW

    S707 (200) ylmyadidmdhpevvnelrnwgvwytntlgldgfridavkhikysftrdw

    LAMY (200) YLMYADIDMDHPEVINELRNWGVWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSYTRDW BAA (195) YLMYADVDYDHPDWAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKESFLRDW BLA (195) YLMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDW BStA (198) YLMYADLDMDHPEVVTELKSWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDH MK716 (198)- YLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDW

    TS-23 (200) YLMFADLDMDHPEVVTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDW

    K38 (196) YLLGSNIDFSHPEVQDELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDW

    251 - . . 300

    A 7-7 (250) LTHVRNTTGKNM FAVAEFW KN DIGAIENYLSKTNWNHSVFDVP LH YNLYN

    S707 (250) INHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLQKTNWNHSVFDVPLHYNLYN

    LAMY (250) LTHVRNTTGKPMFAVAEFWKNDLAAIENYLNKTSWNHSVFDVPLHYNLYN BAA (245) VQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQA BLA (245) VNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHA BStA (248) LSDVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNY1MKTNGTMSLFDAPLHNKFYT MK716 (248) LSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLRMKFYT

    TS-23 (250) LTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYT

    K38 (246) VRHQBNEADQDLFVVGEYWKDDVGALEFYLDEMNWEMSLFDVPLNYNFYR
43. 301 . • 350

    A 7-7 (300) ASRSGGNYDMRQIFNGTVVQRHPTHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFK

    S707 (300) ASKSGGNYDMRNIFNGTWQRHPSHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFK

    LAMY (300) ASNSGGYFDMRNILNGSVVQKHPIHAVTFVDNHDSQPGEALESFVQSWFK BAA (295) ASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFK BLA (295) ASTQGGGYDMRkLLNSTWSKHPLKAVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFK BStA (298) ASKSGGTFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFK MK716, (298) ASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQFTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFK

    TS-23 (300) ASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFK

    K38 (296) ASQQGGSYDMRNILRGSLVEAHFMHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFK

    351 400

    A 7-7 (350) PLAYALTLTRDQGYPSVFYGDYYGIPTHG---VPAMKSKIDPILEARQKY

    S707 (350) P LAY ALT LT REQGY P S VFYGDYYGIPTHG—-VPAMRS KIDPILEARQKY

    LAMY (350) PLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG---VPSMKSKIDPLLQARQTY

    BAA (345) PLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEY BLA (345) PLAY AFILTRESGY PQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQY

    BStA (348) P LAY AFILTRQEGY PC VF Y G DYYGIPQYN---1PSLKSKIDPLLIARRDY

    MK716 (348) PLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---1 PSLKSKI DPLLIARRDY

    TS-23 (350) PLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYN—-IPGLKSKIDPLLIARRDY

    K38 (346) PLAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDN---ISAKKDMIDELLDARQNY

    . . 401 . 4SO

    A 7-7 (397) AYGKQNDYLDHHNMIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDGPGGNKWMYVGRNK

    S707 (397) AYGKQNDYLDHHNIIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDGAGGSKWMFVGRNK

    LAMY (397) AYGTQHDYFDHHDIIGWTREGDSSHPNSGLATIMSDGPGGNKWMYVGKHK BAA .(395) AYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKN BLA . (395) AYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQN BStA (395) AYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQH MK716, (395) AYGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQH

    TS-23 (397) AYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTRPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKKH

    ' K38 (393) AYGTQHDYFDHWDWGWTREGSSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGRQN

    451 ' ■ . ’ - 500 ‘

    A 7-7. (447) AGQVWRD1TGNRSGTVTINADGMGNFSVNGGSVSIWVNN——-------

    ' S707 (447) AGQVWSDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK--------.

    LAMY .(447) AGQVWRDITGNRSGTVTINADGWGNFTVNGGAVSVWVKQ---—,------

    BAA (445) • AGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK———------

    BLA (445) AGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR-----------

    BStA (445) agkvfydltgwrsdtvtinsdgwgeFkvnggsvsvwvprkttvstiawsi

    MK716 (445) AGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRRPVN-------

    TS-23' (447) AGKVFYDLTGNRSDTVTXNADGWGEFKVNGGSVSIWVAKTSNVTFTVNNA K38 (443) AGQTWTDLTGNNGASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ-----------

    501

    550

    A 7-7 S707 LAMY . BAA BLA BStA MK716 TS-23 K38

    (486)

    (486)

    (486)

    (484)

    (484)

    (495)

    (488)

    (497)

    (482)

    TTRPWTDEFVRWTEPRLVAWP--------------------------------

    TTTSGQNVYWANIPELGNWNTANAIKMNPSSYPTWKATIALPQGKAIEF

    551

    588

    A 7-7 S707 - LAMY BAA BLA BStA MK716 TS-23 K38

    (486)

    (486)

    (486)

    (484)

    (484)

    (516)

    (488)

    (547)

    (482)

    KFIKKDQAGNVIWESTSNRTYTVPFSSTGSYTASWNVP